CN115094030B - 一种临床级高纯度外泌体纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种临床级高纯度外泌体纯化方法，涉及外泌体纯化技术领域。本发明基于切向流过滤法和尺寸排阻色谱法结合的方法进行外泌体纯化，可用来制备符合临床要求的高纯度外泌体。本发明所述纯化方法，凭借物理原理实现天然外泌体的浓缩及纯化，期间不引入任何外源物质，最终天然外泌体产物存在于注射用生理盐水中，符合临床应用要求。

Description

一种临床级高纯度外泌体纯化方法
技术领域
本发明属于外泌体纯化技术领域，具体涉及一种临床级高纯度外泌体纯化方法。
背景技术
外泌体(Exosome)是纳米尺寸30-150nm的细胞外囊泡(EV)，在细胞间通讯中发挥重要作用，能够通过自分泌、旁分泌、内分泌和/或近分泌细胞信号传导模式调节受体细胞的行为。外泌体可由多种细胞类型自然产生，是将蛋白质、脂质、DNA、microRNA和mRNA转移到临近细胞或更远端细胞的一种天然载体。外泌体在癌症进展、血管生成、转移性生态位形成、器官特异性转移、肿瘤微环境重塑、免疫抑制等方面扮演重要角色，受到了相当大的关注。
一方面，天然外泌体和工程化外泌体已经被确定在许多不同的疾病模型中发挥重要作用，例如神经退行性疾病、癌症和创伤愈合。同时，外泌体凭借其抗炎活性被用于COVID-19的治疗，潜力巨大。此外，作为生物分子的天然载体，利用外泌体作为稳定和靶向药物的递送***是另一重要开发方向。
另一方面，外泌体代表具有更高稳定性的组织特异性分子，可以作为疾病特异性生物标志物。可以从少量的生物体液和临床样本中分离出外泌体，患者体液中的外泌体已成为生物标志物开发的有希望的来源。同时，由于外泌体的释放和组成可以受环境因素的调节，因此它们也可以作为疾病状态和治疗结果的标志物。
外泌体因其在病理生物学过程中的作用而受到极大关注，并且正在被探索作为疾病诊断和治疗的工具。随着其临床应用潜力的增加，优化其分离方法以获得最大产量、纯度和测定重现性已变得势在必行。因此，目前已经开发了基于不同原理的各种分离方法用于外泌体分离。
外泌体分离的主要挑战之一是消除纳米级污染物，包括无细胞核酸和脂蛋白，它们会干扰外泌体生物标志物的准确性。超速离心是目前外泌体分离的主要技术，是行业内机构和人员认可的外泌体分离和鉴定的金标准方法。尽管如此，超速离心技术获得的外泌体仍不符合临床应用所需的标准，主要限制是其可实现的外泌体纯度、产量、完整性和加工时间长。因此，需要开发创新技术，以在效率、纯度、产量、速度和稳健性方面改进外泌体纯化。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种临床级高纯度外泌体纯化方法，基于切向流过滤法和尺寸排阻色谱法结合的外泌体纯化方法，以制备符合临床要求的高纯度外泌体。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种高纯度外泌体纯化方法，包括以下步骤：对经培养的外泌体分泌细胞的上清液，依次进行TFF切向流纯化和尺寸排阻色谱法纯化；
所述上清液包括基于RoosterNourishTM-MSC-XF间充质干细胞扩增培养基和RoosterCollectTM-EV外泌体富集培养基在2D培养条件或3D生物反应器培养体系下收集的细胞上清液。
优选的，所述上清液进行纯化前，还包括于4℃ 3000g离心1h，去除杂质。
优选的，所述TFF切向流纯化的设备含有中空纤维模块。
优选的，所述中空纤维模块中的中空纤维的孔径为200nm。
优选的，在进行所述尺寸排阻色谱法纯化前，还包括外泌体的浓缩。
优选的，所述浓缩包括采用包含聚砜中空纤维的滤芯进行，所述含聚砜中空纤维的孔径为20nm。
优选的，所述尺寸排阻色谱法纯化包括利用填充有多孔凝胶颗粒的SEC色谱柱进行。
优选的，所述尺寸排阻色谱法纯化所使用的洗脱液为PBS。
本发明还提供了利用上述纯化方法制备得到的外泌体在制备临床外泌体试剂中的应用。
优选的，在制备所述临床外泌体试剂前，还包括将制备得到的外泌体的溶剂置换为生理盐水。
有益效果：本发明提供了一种临床级高纯度外泌体纯化方法，是一种基于切向流过滤法和尺寸排阻色谱法结合的外泌体纯化方法，可用来制备符合临床要求的高纯度外泌体。本发明在上游的TFF切向流纯化过程中，不同孔隙率的生物膜，可以分离不同分子量的颗粒，进而去除残留的颗粒污染物，将外泌体溶剂培养基置换为NaCl Buffer的同时稳定高效的分离和浓缩特定粒径范围的外泌体。本发明所述外泌体样本初始的高纯度高浓度解决了SEC工艺流程中容易被非外泌体颗粒污染的限制，减少了高丰度蛋白的污染，实现外泌体的精细纯化，保证了此工艺流程终末的外泌体纯度和产量。本发明所述纯化方法，凭借物理原理实现天然外泌体的浓缩及纯化，期间不引入任何外源物质，最终天然外泌体产物存在于注射用生理盐水中，符合临床应用要求。
附图说明
图1为TFF-MV结构示意图；
图2为TFF-MV纯化时外泌体上样过程示意图；
图3为TFF-MV切向流过滤示意图；
图4为TFF-MV清洗残留颗粒示意图；
图5为TFF-Easy的结构示意图；
图6为EV浓缩时外泌体上样过程示意图；
图7为TFF-Easy切向流浓缩示意图；
图8为回收浓缩样本前操作示意图；
图9为回收浓缩外泌体示意图；
图10为2D环境纯化前后外泌体NTA检测结果；
图11为3D环境纯化前后外泌体NTA检测结果；
图12为2D/3D环境纯化前后外泌体电镜检测结果；
图13为2D/3D环境纯化前后外泌体Western Blot检测结果；图中，1.3D纯化前样品；2.3D-TFF-MV纯化后样品；3.3D-TFF-Easy纯化后样品；4.3D-SEC纯化后样品；5.2D-SEC纯化后样品；6.2D-TFF-Easy纯化后样品；7.2D-纯化前样品；
图14为2D/3D环境纯化前后外泌体NanoView检测亚群组成；
图15为2D环境纯化前后外泌体特定亚群粒径分布；
图16为3D环境纯化前后外泌体特定亚群粒径分布；
图17为2D环境纯化前后外泌体特定亚群荧光强度对比；
图18为3D环境纯化前后外泌体特定亚群荧光强度对比；
图19为低样品吸附的改性聚醚砜膜中空纤维切向流过滤原理示意图；
图20为Exo-spinTM-EX04尺寸排阻色谱法纯化外泌体示意图，1.柱温平衡；2.保护剂吸弃；3.柱床平衡；4.浓缩样品添加；5.纯化后的外泌体洗脱
具体实施方式
本发明提供了一种临床级高纯度外泌体纯化方法，包括以下步骤：对经培养的外泌体受体细胞的上清液，依次进行TFF切向流纯化和尺寸排阻色谱法纯化；
所述上清液包括基于RoosterNourishTM-MSC-XF间充质干细胞扩增培养基和RoosterCollectTM-EV外泌体富集培养基在2D培养条件或3D生物反应器培养体系下收集的细胞上清液。
本发明所述TFF是一种使用切向流过表面的过滤方法，避免形成滤饼。过滤器具有最佳孔径，可以去除小尺寸的蛋白质杂质，并且可以有效地分离和浓缩外泌体。由于形成滤饼的可能性较低，因此比传统过滤更不容易堵塞。
本发明所述尺寸排阻色谱(SEC)优选可根据流体力学体积分离样本中的组分；SEC通常使用Sepharose CL-2B或类似的固定柱进行，其中馏分使用PBS洗脱；SEC简单，稳健且可扩展，不需要昂贵的设备，并且可以在温和的洗脱条件下使用，适用于多种应用场景。此外，SEC还是一种用于下游蛋白质组学分析的有效外泌体分离方法。
本发明对于用来纯化的外泌体来源存有限定，为基于RoosterNourishTM-MSC-XF间充质干细胞扩增培养基和RoosterCollectTM-EV外泌体富集培养基在T-1752D培养条件和FiberCell 3D生物反应器培养体系下收集的细胞上清液，本发明在外泌体进行纯化前，优选还包括在4℃、3000g条件下离心1h，去除杂质，进行精细纯化前的预处理。本发明优选采用FiberCell 3D培养体系下获得的外泌体进行后续的纯化，如在实施例中以间充质干细胞(MSC)为外泌体供体细胞，将所述MSC在FiberCell低颗粒培养基体系内获得外泌体，FiberCell材质本身即是一类具有一定孔隙截留率的真空纤维柱，内部通道内的样本不会受到外部培养基循环体系的大分子污染，保证了初始样本的纯度。
本发明在进行上述预处理后，进行TFF切向流纯化，所述TFF切向流纯化的设备中优选含有中空纤维(HollowFiber)模块。本发明所述HollowFiber的来源优选包括HansaBioMed公司的TFF-MV和TFF-Easy，或德国赛多利斯的中空纤维模块的GREEN、Steamer、Reuse系列不同孔径和膜截留能力的产品，其中空纤维切向流过滤(TFF)模块在各种上游和下游工艺单元操作中可提供高性能的分离，包括细胞收集、澄清、灌流、洗滤和浓缩。它们特点是由低样品吸附的改性聚醚砜膜(m-PES)制成，稳定提供高样品处理通量和高样品回收，分离原理基于样本溶液在通过改性聚醚砜膜孔径时对不同大小分子的截留(图19)，实施例中以TFF-MV和TFF-Easy为例进行说明，但是不能仅将其认定为本发明的全部保护范围。
本发明所述TFF-MV的结构如图1所示，TFF-MV是一种含有聚砜中空纤维的滤芯(200nm孔)，可从小型EV或其他不同来源流体(细胞培养基，尿液，血浆，血清)中分离中型/大型细胞外囊泡。小型EV、蛋白质和其他可溶性分子通过中空纤维孔(渗透)，而中/大型EV是浓缩在渗余物中。大型EV可以很容易通过过滤筒中的注射器进行收集。TFF-MV是无菌的。一旦使用过滤器可以通过Beta辐照灭菌，不可对TFF-MV进行高压灭菌，室温存储。在本发明中，利用所述TFF-MV对EV进行过滤时，优选包括过滤进样、切向流过滤、洗涤残留的小颗粒细胞外泌体和小型EV的富集。
本发明实施例中，所述过滤进样优选包括：从样品注入喷嘴上卸下螺钉；在喷嘴中***注射器过滤器，该设备与多种过滤器类型兼容，要使用的过滤器的大小取决于用户，实施例中选用0.22μm；取装有样品的注射器A并***过滤器顶部；在切向流过滤喷嘴(图1中位置2)中***一个干净的空注射器；将阀门3旋转到图2中箭头指示的位置；通过推动注射器A的活塞将样品注入过滤器，样品通过过滤器，填充注射器B。
本发明实施例中，所述切向流过滤优选包括：将阀门3旋转到图3所示的位置；取下盖子打开渗透喷嘴4b；在位置4b的喷嘴下方设置一个渗透收集管，如图3所示；交替向上和向下推动注射器B和C，开始过滤过程；渗透液开始流向收集管，而中型/大型EV分离在滞留物中；继续过滤过程，直到注射器完全排空并且不再有渗透液流动；将新的干净注射器(C)***位置5。
在本发明实施例中，所述洗涤残留的小颗粒细胞外泌体，优选包括：在位置3关闭液流阀的同时，断开样品注射器B；重新连接PBS注射器B，启用位置3的液流阀并用PBS清洗过滤器，直到注射器完全排空，以去除残留的较小颗粒(图4)。重复该步骤一次。
在本发明实施例中，所述小型EV的富集优选包括使用HBM-LS TFF-Easy过滤含有小EV、可溶性蛋白质和其他物质的渗透液以进一步浓缩小分子颗粒，浓缩样品将使用尺寸排阻色谱柱进一步纯化用于下游应用和分析。
本发明优选采用TFF-Easy进行外泌体纯化及浓缩，且TFF-Easy的结构优选如图5所示，与图2所示装置外部相同，区别在于滤芯孔径不同，TFF-Easy是一种包含聚砜中空纤维(20nm孔)的滤芯，可在EV纯化之前浓缩和去除稀释基质(细胞条件培养基、尿液等)中的小蛋白质和分子。水和小分子(<20nm)通过中空纤维孔，而EV则集中在滞留物中；可以使用注射器从滤芯中轻松回收EV。TFF-Easy无菌提供。一旦使用过滤器可以采用Beta辐照灭菌。不要对TFF-Easy进行高压灭菌。将设备存放在室温下。
本发明实施例中进行所述浓缩时，优选包括过滤进样、切向流过滤和浓缩EV的回收。
本发明所述过滤进样，优选包括：从样品注入喷嘴(图5中位置1)上卸下螺钉；在喷嘴中***注射器过滤器。该设备与多种过滤器类型兼容。用户可根据需要选择过滤孔的尺寸。为了保留所有EV子类型，建议使用过滤孔径为0.22μm；用注射器A取出样品并***过滤器顶部；将一个干净的空注射器***切向流过滤喷嘴(图5中位置2)；将阀门旋转到图6中3箭头指示的位置；通过推动注射器A的活塞将样品注入过滤器；样品通过过滤器，填充注射器B。
本发明所述切向流过滤，优选包括：将阀门3旋转到图7所示的位置；打开渗透喷嘴，卸下螺丝；将新的干净注射器(C)***位置5；在位置4的喷嘴下方设置2个渗透物收集管，如图7所示；交替向上和向下推动注射器B和C，开始浓缩过程；继续浓缩过程，直到获得所需的体积；渗透液开始流向收集管，而注射器中的滞留液包含浓缩的EV。
本发明所述浓缩EV的回收，优选包括：为了收集浓缩EV，将浓缩产品推入注射器B；将液流阀6旋转到图8所示的位置，然后断开注射器C；将空气装入注射器C；将液流阀6旋转到图9所示的位置；***注射器C并向设备中注入空气，然后拉起注射器B的活塞，以收集所有剩余体积的浓缩样品；将阀门3旋转到图9右侧箭头所示位置并断开注射器B；将浓缩样品收集在干净的试管中。
本发明在所述浓缩后，进行尺寸排阻色谱法(Size exclusion chromatographySEC)纯化，所述SEC纯化优选包括利用填充有多孔凝胶颗粒的SEC色谱柱进行。本发明所述SEC尺寸排阻色谱柱优选包括Cell Guidance Systems公司的EXO-spin系列产品，或iZON公司的qEVsingle，qEVoriginal，qEV1，qEV2，qEV10，qEV100等产品及配套外泌体自动化提取设备Izon Automatic Fraction Collector；或其他类似产品，实施例中以EXO-spin系列产品为例进行说明，但是不能仅将其认定为本发明的全部保护范围。
本发明所述SEC优选为一种依据颗粒大小分离溶液中颗粒的方法，色谱柱采用稳定的多孔凝胶颗粒填充。当将含有外泌体的溶液加入到SEC色谱柱中，小分子因可通过凝胶颗粒的孔隙，而较大的分子不能通过，导致同一柱子内，小颗粒的运动路径比大颗粒要长，流穿所需时间更长，进而实现大小差异颗粒的物理分离。因此，不同阶段的洗脱液将包含不同大小的颗粒，首先洗脱的是较大的外泌体颗粒，而后是较小的蛋白质和脂质颗粒。常规基于SEC的外泌体纯化需要沉淀步骤，但本发明的技术方案中，基于Fiber Cell低囊泡培养体系的外泌体生产工艺，外泌体样本原始浓度高，同时保证了极低的体系内囊泡污染，将浓缩后样本直接使用SEC色谱柱进行纯化，避免了沉淀剂对外泌体终样品的影响。
本发明实施例中，利用EXO-spin进行所述SEC纯化时，优选包括Exo-spinTM-EX04色谱柱预处理和外泌体纯化步骤(图20)。
本发明所述Exo-spinTM-EX04色谱柱预处理，优选包括：将色谱柱在室温下孵育15min以平衡柱温；取下底部出口塞子后取下上端螺帽，将Exo-spin色谱柱至于废液收集管内部或上方；使用移液器将色谱柱顶端防腐剂缓冲液吸弃，立即进行下一步以防止柱床干燥；柱顶端加入10mL PBS平衡柱缓冲液，让PBS缓冲液在重力作用下流过柱基质，不要离心，缓冲液通过后进入废液收集管中，吸弃；重复上述步骤，进行2次色谱柱PBS缓冲液冲洗预处理。
本发明所述外泌体纯化，优选包括：当色谱柱平衡后，小心地将1mL经TFF浓缩后的外泌体浓缩样品注入柱顶部；将色谱柱放入废液管中，让纯化样本在重力作用下排出；将2mL PBS注入色谱柱的顶部，让PBS在重力作用下排入废液管并丢弃；将色谱柱放入一个新的50mL收集管中，再次加入3～5mL PBS，让PBS在重力作用下排出，收集此含有外泌体的洗脱液；使用3mL PBS洗脱可以最大限度地提高外泌体纯度，使用5mL PBS洗脱可以最大限度地提高外泌体产量；纯化第一次加载的1mL样品后，需用PBS冲洗色谱柱以去除色谱柱中的游离蛋白质，随后可在同一色谱柱上纯化更多样品。对于大于1mL的样品，迭代加载允许加载最多5mL的样品体积；对纯化后的样本可进行囊泡浓度测试、外泌体鉴定及下游应用。
本发明所述高通量纯化方法，流程操作简单，无需高速离心步骤即可实现外泌体的纯化，同时保证产物的低污染，更为重要的是，纯化工艺基于物理原理，过程温和，可保存原始样本中的完整外泌体。
本发明还提供了利用上述纯化方法制备得到的外泌体在制备临床外泌体试剂中的应用。
本发明在制备所述临床外泌体试剂前，优选还包括将制备得到的外泌体的溶剂置换为生理盐水。在本发明实施例中，纯化后定量的外泌体保存在含有0.2％BSA的PBS中，可再次使用TFF-Easy中的方法进行缓冲液的置换，将缓冲液置换为生理盐水，即可用于临床实验。
下面结合实施例对本发明提供的一种高通量外泌体纯化方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例
选择同一亲本来源P5代脐带间充质干细胞分别在2D T-175细胞培养瓶以及3DFiber Cell体系，使用Rooster NourishTM-MSC-XF间充质干细胞扩增培养基进行细胞扩增和Rooster CollectTM-EV Pro外泌体富集培养基进行外泌体富集，收获2D和3D培养条件下各自的细胞上清液作为纯化原始样本进行外泌体的精细纯化。
其中，2D培养条件在Rooster NourishTM-MSC-XF间充质干细胞扩增培养基培养细胞达到85％汇合度时，使用D-PBS清洗4次，更换新的Rooster CollectTM-EV Pro培养基培养48小时，收集上清液。3D培养选用更换为Rooster CollectTM-EV Pro培养基后收获期第6天的细胞上清液。
上清液在纯化前均在4℃、16000×g条件下离心1h后使用。
(一)2D和3D环境收获的外泌体均能实现高倍的富集
外泌体粒径分析方法为纳米颗粒跟踪分析(Nanoparticle tracking Analysis，NTA)，其原理是对每个颗粒的布朗运动进行追踪和分析，结合Stockes-Einstein方程式计算出纳米颗粒的流体力学直径和浓度。NTA技术已被外泌体研究领域认可为外泌体表征手段之一。相较于其他表征方式，NTA技术的样本处理更简单、更能保证外泌体原始状态、检测速度更快。
分别使用NTA测试了2D和3D环境纯化前后外泌体的浓度数据，结果显示，2D收获外泌体纯化前浓度为1.1E+9 particles/mL，纯化后浓度为2.0E+10 particles/mL，实现了约18倍纯化和浓缩(图10)；3D收获外泌体纯化前浓度为4.2E+10 particles/mL，纯化后浓度为5.9E+11 particles/mL，实现了约14倍纯化和浓缩(图11)。
(二)纯化后外泌体经电镜测试均有显著的外泌体结构
外泌体是细胞释放的许多不同的纳米级囊泡，可以根据它们的形态和大小分布进行区分。因为小于300nm的颗粒在光学方法中是不可见的，需要电子显微镜对外泌体产品形态进行表征。结果显示2D/3D培养条件下纯化前后均有环状结构特征明显的外泌体(图12)。
(三)纯化后外泌体经Western Blot测试均有特异性蛋白的表达
Western blot检测样本中CD63、CD81、TSG101、β-actin的表达情况。结果说明，2D/3D培养条件下，纯化前和纯化各个阶段收集液均有外泌体标志物蛋白的表达(图13)。
(四)纯化前后外泌体经NanoView测试后外泌体亚群组成未有显著变化。
作为生物药物开发，需要对纯化前后外泌体的亚群进行分析，以保证纯化工艺进行外泌体纯化的过程中，初始样品和纯化后样品的外泌体亚群组份和占比处于稳定状态。
使用NanoView全自动外泌体荧光检测分析***测试了2D/3D环境纯化前后外泌体的亚群组成。结果如下：
(1)CD63/CD81/CD9捕获通道内显示的2D/3D外泌体亚群组成在纯化前后并未发生显著变化，证明初始样本经过此纯化工艺并不影响外泌体亚群组成(图14)。
同样通过分析不同通道内捕获的外泌体表面标志物荧光和其粒径分布的变化，显示的2D/3D外泌体特定亚群的粒径在纯化前后并未发生显著变化，证明初始样本经过此纯化工艺并不影响外泌体亚群粒径分布(图15，图16)；
随后通过对不同通道内捕获的外泌体荧光进行可视化，显示的2D外泌体特定亚群的荧光强度占比在纯化前后并未发生显著变化，3D外泌体特定亚群的荧光强度各捕获通道内CD63/CD81/CD9的组合共表达的占比在纯化前后有显著差异，证明此纯化工艺对2D条件获得的外泌体亚群组成影响较小，对3D条件获得的外泌体亚群组成有一定影响，原因可能是3D条件获得的外泌体浓度较高，高浓度囊泡样本随机捕获检测结果更能反应出终产物的成份组成，结合上述2D/3D外泌体特定亚群的粒径在纯化前后并未发生显著变化的结果，证明此纯化工艺不会引起2D/3D环境纯化前后外泌体的主要成份的稳定性，高浓度样本的亚群检测更能反应出外泌体的复杂的多标记物共表达的亚群组成。(图17，图18)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种高纯度外泌体纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：对经培养的外泌体分泌细胞的上清液，依次进行TFF切向流纯化和尺寸排阻色谱法纯化；
所述上清液包括基于RoosterNourish™-MSC-XF间充质干细胞扩增培养基和RoosterCollectTM -EV外泌体富集培养基在2D培养条件或3D生物反应器培养体系下收集的细胞上清液；
所述TFF切向流纯化的设备含有中空纤维模块，所述中空纤维模块中的中空纤维的孔径为200nm；
所述尺寸排阻色谱法纯化包括利用填充有多孔凝胶颗粒的SEC色谱柱进行，所述尺寸排阻色谱法纯化所使用的洗脱液为PBS；
在进行所述尺寸排阻色谱法纯化前，还包括外泌体的浓缩，所述浓缩包括采用包含聚砜中空纤维的滤芯进行，所述聚砜中空纤维的孔径为20 nm。
2.根据权利要求1所述纯化方法，其特征在于，所述上清液进行纯化前，还包括于4℃3000g离心1h，去除杂质。
3.利用权利要求1或2所述纯化方法制备得到的外泌体在制备临床外泌体试剂中的应用。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，在制备所述临床外泌体试剂前，还包括将制备得到的外泌体的溶剂置换为生理盐水。
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