JP7303314B2 - Ｇｐｒｃ５ｄキメラ抗原受容体及びそれを発現する細胞 - Google Patents

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Description

（配列表）
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出済みであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれている配列表を含む。当該ＡＳＣＩＩのコピーは、２０２０年１月９日に作成され、ＪＢＩ６０４３ＷＯＰＣＴ１＿ＳＬ．ｔｘｔの名称であり、１５０，００２バイトのサイズである。
（発明の分野）
本発明は、ＧＰＲＣ５Ｄ単鎖可変フラグメントを含むＧＰＲＣ５Ｄ標的化キメラ抗原受容体（chimeric antigen receptors、ＣＡＲ）、及びＣＡＲを発現する遺伝子操作されたＧＰＲＣ５Ｄ標的化免疫細胞に関する。また、ＣＡＲをコードする核酸及び発現ベクター、当該ベクターを含む組み換え細胞、並びにＧＰＲＣ５Ｄ標的化ＣＡＲを発現する遺伝子操作された免疫細胞を含む組成物も提供される。ＣＡＲ及び遺伝子操作された免疫細胞を作製する方法、並びに癌を含む状態を治療するために遺伝子操作された免疫細胞を使用する方法も提供される。
Ｔ細胞療法では、特定の腫瘍関連抗原に対する特異性を高めるために遺伝子改変され単離されたＴ細胞を利用する。遺伝子改変は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又は外因性Ｔ細胞受容体の発現を伴い、Ｔ細胞上に新たな抗原特異性を提供し得る。キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）は、腫瘍免疫反応を誘導することができる。ＣＡＲ－Ｔ細胞を利用したより良好な癌療法が必要とされている。
本明細書に開示されるのは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、例えば、Ｇタンパク質共役型受容体、Ｇタンパク質共役型受容体ファミリーＣグループ５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）、ＣＡＲを含む細胞、ＣＡＲをコードするベクター（例えば、組み換え発現ベクター）、及びＣＡＲをコードする核酸分子を標的とするＣＡＲ、ＣＡＲを作製する方法、組成物、ポリペプチド、タンパク質、核酸、宿主細胞、細胞集団、並びに開示されたＣＡＲを使用して障害（例えば、癌）を治療する方法である。
一態様では、本開示は、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む、ＣＡＲを提供し、本細胞外抗原結合ドメインは、
配列番号６６のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号６７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、
配列番号５８のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号５９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、
配列番号３９のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号４０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、
配列番号４２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号４３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、又は
配列番号４５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号４６のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含み、
細胞外抗原結合ドメインは、ＧＰＲＣ５Ｄ抗原に結合する。
一実施形態では、
細胞外抗原結合ドメインは、配列番号６６のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号６７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含み、配列番号６９のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号７０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号７１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を更に含む、
細胞外抗原結合ドメインは、配列番号５８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号５９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含み、配列番号６１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を更に含む、
細胞外抗原結合ドメインは、配列番号３９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号４０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含み、配列番号４８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４９のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を更に含む、
細胞外抗原結合ドメインは、配列番号４２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号４３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含み、配列番号５１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を更に含む、又は
細胞外抗原結合ドメインは、配列番号４５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号４６のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含み、配列番号５４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を更に含む。
一実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号７３、６５、１、３、及び５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（light chain variable region、ＬＣＶＲ）、又は配列番号７２、６４、２、４、及び６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（heavy chain variable region、ＨＣＶＲ）、又は配列番号７３、６５、１、３、及び５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲと、配列番号７２、６４、２、４、及び６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲとの組み合わせを含む。
一実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、
配列番号７３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び配列番号７２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
配列番号６５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び配列番号６４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
配列番号１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
配列番号３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、又は
配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
一実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、軽鎖可変領域と重鎖可変領域との間にリンカーポリペプチドを含む。
一実施形態では、リンカーポリペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号７８、７７、７５、７６、８、９、１０、２４、２５、及び２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、シグナルポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、シグナルポリペプチドは、配列番号１１のアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー９（ＣＤ１３７）成分、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３ゼータ鎖（ＣＤ３ｚ）成分、分化クラスタ（ＣＤ２７）成分、分化クラスタスーパーファミリーメンバー（例えば、ＣＤ２８又は誘導性Ｔ細胞共刺激因子（inducible T-cell co-stimulator、ＩＣＯＳ）など）成分、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるポリペプチド成分を含む。
一実施形態では、ＣＤ１３７成分は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、ＣＤ３ｚ成分は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８ａ膜貫通領域（ＣＤ８Ａ－ＴＭ）ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８ａ－ＴＭポリペプチドは、配列番号１５のアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、ＣＡＲは、膜貫通ドメインを細胞外抗原結合ドメインに連結するヒンジ領域を更に含む。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、ＣＤ８ａヒンジ領域である。いくつかの実施形態では、ＣＤ８ａヒンジ領域は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号８２、８１、８０、７９、１７、１８、１９、２０、２１、及び２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、本開示のＣＡＲは、配列番号８６、８５、８３、８４、２７、２８、２９、３０、３１及び３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
一態様では、本開示は、本明細書に記載のＣＡＲを発現する単離されたリンパ球を提供する。いくつかの実施形態では、リンパ球は、Ｔリンパ球である。いくつかの実施形態では、Ｔリンパ球は、ナイーブＴ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔリンパ球は、記憶幹Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔリンパ球は、中央記憶Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔリンパ球は、ＣＤ４＋である。いくつかの実施形態では、Ｔリンパ球は、ＣＤ８＋である。いくつかの実施形態では、Ｔリンパ球は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋である。
一態様では、本開示は、本明細書に記載のＣＡＲのいずれかをコードする単離された核酸分子を提供する。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号９０、８９、８７、８８、３３、３４、３５、３６、３７、及び３８からなる群から選択される核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号９０、８９、８７、８８、３３、３４、３５、３６、３７又は３８のヌクレオチド配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、本開示は、核酸分子を含むベクターを提供する。一実施形態では、本開示は、核酸分子を発現する細胞を提供する。
一態様では、本開示は、記載される１つ又は２つ以上のＣＡＲを発現する有効量のリンパ球と、医薬的に許容される賦形剤とを含む、組成物、例えば、医薬組成物を提供する。
一態様では、本開示は、治療方法で使用するための本開示によるＣＡＲを提供する。
一態様では、本開示は、治療方法で使用するための本開示によるリンパ球を提供する。一態様では、本開示は、治療方法で使用するための本開示による組成物、例えば、医薬組成物を提供する。
一態様では、本開示は、癌を治療する方法で使用するための本開示によるＣＡＲを提供する。一態様では、本開示は、癌を治療する方法で使用するための本開示によるリンパ球を提供する。一態様では、本開示は、癌を治療する方法で使用するための本開示による組成物、例えば、医薬組成物を提供する。一実施形態では、癌は、膀胱癌、転移性膀胱癌、食道癌、非小細胞肺腺癌、非小細胞肺扁平上皮癌、前立腺癌、尿路上皮癌、小細胞肺癌、子宮内膜癌、胆管癌、肝細胞癌、肉腫、扁平上皮起源の固形腫瘍、肺癌、胃癌、結腸癌、肝細胞癌、腎細胞癌、膀胱尿路上皮癌、転移性黒色腫、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、頭頸部癌、膵臓癌、神経膠腫、神経膠芽腫、非ホジキンリンパ腫（non-Hodgkin’s lymphoma、ＮＨＬ）、急性リンパ性白血病（acute lymphocytic leukemia、ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（chronic lymphocytic leukemia、ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（chronic myelogenous leukemia、ＣＭＬ）、くすぶり型多発性骨髄腫（smoldering multiple myeloma、ＳＭＭ）、多発性骨髄腫（multiple myeloma、ＭＭ）、急性骨髄性白血病（acute myeloid leukemia、ＡＭＬ）、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。一実施形態では、治療される癌は、多発性骨髄腫である。
一態様では、本開示は、癌を有する対象を治療する方法を提供し、本方法は、記載される１つ又は２つ以上のＣＡＲを発現する治療有効量のリンパ球を、それを必要とする対象に投与することを含み、それにより、リンパ球は対象における癌細胞の死滅を誘導する。一実施形態では、癌は、膀胱癌、転移性膀胱癌、食道癌、非小細胞肺腺癌、非小細胞肺扁平上皮癌、前立腺癌、尿路上皮癌、小細胞肺癌、子宮内膜癌、胆管癌、肝細胞癌、肉腫、扁平上皮起源の固形腫瘍、肺癌、胃癌、結腸癌、肝細胞癌、腎細胞癌、膀胱尿路上皮癌、転移性黒色腫、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、頭頸部癌、膵臓癌、神経膠腫、神経膠芽腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、くすぶり型多発性骨髄腫（ＳＭＭ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。一実施形態では、対象において治療される癌は、多発性骨髄腫である。
一態様では、癌細胞の標的化死滅の方法が開示される。該方法は、癌細胞を、記載される１つ又は２つ以上のＣＡＲを発現するリンパ球と接触させることを含み、それにより、リンパ球は癌細胞の死滅を誘導する。いくつかの実施形態では、癌細胞は、肺癌細胞、胃癌細胞、結腸癌細胞、肝細胞癌細胞、腎細胞癌細胞、膀胱尿路上皮癌細胞、転移性黒色腫細胞、乳癌細胞、卵巣癌細胞、子宮頸癌細胞、頭頸部癌細胞、膵臓癌細胞、神経膠腫細胞、神経膠芽腫細胞、及び非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）細胞、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）細胞、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）細胞、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞、くすぶり型多発性骨髄腫（ＳＭＭ）細胞、多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞、並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される。一実施形態では、癌細胞は、多発性骨髄腫細胞である。
前述は、以下の付属の図面に示される例示的実施形態のより詳細な説明から明らかとなるであろう。
図１－１、図１－２は、ｍＲＮＡなし（ｍｏｃｋ）、又はα－ＧＰＲＣ５Ｄ ｓｃＦｖ ＣＡＲ若しくはアイソタイプ対照ＣＡＲのいずれかを発現する１０μｇのｍＲＮＡでエレクトロポレーションされた初代ヒト汎Ｔ細胞のフローサイトメトリ分析を示す。エレクトロポレーションから２４時間後、ビオチン化Ｌ－タンパク質及びストレプトアビジンコンジュゲートＰＥを用いた染色後のフローサイトメトリによって、ＣＡＲの表面発現を測定した。白抜きのヒストグラムはｍｏｃｋであり、塗りつぶされた灰色のヒストグラムは、ＣＡＲ－Ｔ集団である。 （上記の通り。） 図２－１、図２－２は、多発性骨髄腫細胞株と共培養され一過性にトランスフェクションされた汎Ｔ細胞のフローサイトメトリ分析を示す。一過性トランスフェクションの２４時間後、初代汎Ｔ細胞を蛍光増殖色素（Cell Trace Violet、ＣＴＶ）で標識し、次いで、多発性骨髄腫細胞株Ｈ９２９と共培養した。共培養４日後、細胞をＣＤ８＋ＣＤ４集団上で事前にゲーティングし、ＣＡＲ－Ｔ上の活性化マーカーＣＤ２５及びＣＤ７１の表面発現を、単独又はα－ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズの存在下で培養したＴ細胞と比較した。 （上記の通り。） ＣＡＲ発現ｍＲＮＡで一過性にトランスフェクションされ、様々な骨髄腫細胞株と共培養された初代汎Ｔ細胞のサイトカインプロファイル分析を示す。ＣＡＲ発現ｍＲＮＡで２４時間前に一過性にトランスフェクションした初代汎Ｔ細胞を、標的抗原ＧＰＲＣ５Ｄを発現する様々な骨髄腫細胞株と１：１の比で、高（＋＋＋）、中（＋＋）、低（＋）又は陰性（－）レベルで共培養した。共培養１６時間後、上清を採取し、共培養からの上清のＭｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）によるサイトカインプロファイル分析を行った。 図４－１、図４－２は、ＣＡＲ発現ｍＲＮＡで一過性にトランスフェクションされ、自己末梢血単核球（peripheral blood mononuclear cells、ＰＢＭＣ）及び多発性骨髄腫細胞株と共培養された初代汎Ｔ細胞のサイトカインプロファイル分析を示す。ＣＡＲ発現ｍＲＮＡとの一過性トランスフェクションの２４時間後、初代汎Ｔ細胞を自己ＰＢＭＣ及び多発性骨髄腫細胞株Ｈ９２９と（１：１：１比で）共培養した。共培養１６時間後、上清を採取した。３つの集団全て（ＣＡＲ－Ｔ、Ｈ９２９，自己ＰＢＭＣ）を含有する共培養物からの上清のＭＳＤによるサイトカインプロファイル分析を、ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＰＢＭＣ、又はＨ９２９を含まない対照共培養物と、単独で培養された細胞の各集団と比較した。 （上記の通り。） 図５－１、図５－２、図５－３は、ＧＰＲＣ５Ｄ発現骨髄腫細胞に対するＣＡＲ－Ｔ細胞における細胞傷害の潜在能力のフローサイトメトリ分析を示す。初代汎Ｔ細胞（前述の３つのＣＡＲのうちの１つを一過性に発現する）を、示されたエフェクタ：標的（Ｅ：Ｔ）比で、蛍光標識された骨髄腫細胞株、ＭＭ１Ｒ、Ｈ９２９、及びＫ５６２と８時間共培養した。この時点で、共培養物を生存性色素で染色した。死滅率は、ＣＡＲ－Ｔ細胞なしで培養された生存標的の数に対する共培養物中に残存する生存（生存性色素陰性）標的（ＣＴＶ陽性）細胞の絶対数の比率である。 （上記の通り。） （上記の通り。） ＧＰＲＣ５Ｄ発現骨髄腫細胞に対するＣＡＲ－Ｔ細胞における細胞傷害の潜在能力のフローサイトメトリ分析を示す。原発性多発性骨髄腫患者のＴ細胞（前述の２つのＣＡＲのうちの１つを一過性に発現する）を、示されたエフェクタ：標的（Ｅ：Ｔ）比で、蛍光標識された骨髄腫細胞株ＭＭ．１Ｓ又は対照ＧＰＲＣ５ｄ－陰性細胞株ＫＧ－１と４８時間共培養した。この時点で、共培養物を生存性色素で染色した。細胞傷害率（細胞死を示す）を、生存性色素に対して陽性に染色された蛍光標識細胞の割合として判定した。 図７－１、図７－２、図７－３は、α－ＧＰＲＣ５Ｄ－ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖能のフローサイトメトリ分析の結果を示す。蛍光標識された汎Ｔ細胞（α－ＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲ又はアイソタイプＣＡＲ対照を一過性に発現する）をＥ：Ｔ比１にて、Ｈ９２９と４日間共培養した。希釈された蛍光標識（ＣＴＶ）を有する生存（生存性色素陰性）ＣＡＲ－Ｔ細胞の絶対数として、増殖を測定した。Ｈ９２９に応答した増殖を、α－ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ刺激の４日後のＣＡＲ－Ｔ増殖、及び単独で培養されたＣＡＲ－Ｔ（刺激制御なし）と比較した。 （上記の通り。） （上記の通り。） フローサイトメトリによって測定した、健康なドナーＴ細胞におけるＧＰＲＣ５Ｄ－ＣＡＲ発現の百分率を示す棒グラフを示す。影付きの灰色のバーは、非形質導入（ｍｏｃｋ）細胞におけるバックグラウンドのＣＡＲ検出を表す。黒色バーは、形質導入ＣＡＲ－Ｔ細胞中のＧＰＲＣ５Ｄ ＧＣ５Ｂ６８０－Ｎ６８Ｓ－ＬＨを示す。示される値は、６人の健康なドナーの平均±ＳＤを表す。 ＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲ－Ｔ細胞上のＣＤ４、ＣＤ８、及び記憶マーカーの発現を示すデータを示す。棒グラフを示し、データは、ＧＰＲＣ５Ｄ ＧＣ５Ｂ６８０－Ｎ６８Ｓ－ＬＨ ＣＡＲがＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞の両方においてフローサイトメトリによって検出されたこと、及びＣＤ４／ＣＤ８比率が非形質導入集団とあまり異ならなかったことを集合的に示している。図９Ａは、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋細胞のそれぞれによって構成される、Ｍｏｃｋ（非形質導入）細胞集団の百分率を示す。図９Ｂ～図９Ｃはそれぞれ、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋細胞のそれぞれによって構成されるＣＡＲ－細胞（ＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲを発現しない形質導入細胞）の百分率、並びにＣＤ８＋及びＣＤ４＋細胞のそれぞれによって構成されるＣＡＲ＋細胞（ＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲを発現する形質導入細胞）の百分率を示す。図９Ａ～図９Ｃに示される値は、６人の健康なドナーの平均±ＳＤを表す。図９Ｂに示される値は、６人の健康なドナーの平均±ＳＤを表す。 ＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲ－Ｔ細胞上のＣＤ４、ＣＤ８、及び記憶マーカーの発現を示すデータを示す。図９Ｄは、１人のドナーから調製されたフローサイトグラムを示しており、表面マーカー（ＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ６２Ｌ）を使用した、ＣＡＲ－Ｔ集団における示された異なる記憶集団の選択のためのゲーティングストラテジーを示している。図９Ｅ及び図９Ｆは、ＧＰＲＣ５Ｄ ＧＣ５Ｂ６８０－Ｎ６８Ｓ－ＬＨが、主に、ＴＮ／ＳＣＭ及びＴＣＭ上で発現したことを示す棒グラフを示す。これらには、増殖能、生存、及び治療有効性が増加したことが示されている。図９Ｅ～図９Ｆに示される値は、６人の健康なドナーの平均±ＳＤを表す。 ＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲ－Ｔ毒性を示す散乱プロットを示す。ＧＰＲＣ５Ｄ ＧＣ５Ｂ６８０－Ｎ６８Ｓ－ＬＨ又は非形質導入（Ｍｏｃｋ）Ｔ細胞を、様々なＥ：Ｔ比にて、ルシフェラーゼ導入遺伝子を含有するＧＰＲＣ５Ｄ＋ＭＭ．１Ｓ細胞又はＧＰＲＣ５Ｄ－Ｋ５６２細胞に添加した。ＣＡＲ－Ｔは、６人の健康なドナーから作製された。値は、６時間の平均±ＳＤとして表される。比溶解率（percent specific lysis）は、（ｉ）６又は２４時間のＣＡＲ－Ｔの存在下で、腫瘍細胞中のルシフェラーゼシグナルを、同じ時点で、腫瘍細胞内のルシフェラーゼシグナルで除算し、１００を乗算し、（ｉｉ）１００からその数を減算することによって計算した。式は、１００－［（ＣＡＲ－Ｔ＋腫瘍発光／平均腫瘍単独発光）×１００］である。点線は、ゼロに等しい比溶解率を表す。陰性溶解は、細胞成長を示す。 ＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲ－Ｔ毒性を示す散乱プロットを示す。ＧＰＲＣ５Ｄ ＧＣ５Ｂ６８０－Ｎ６８Ｓ－ＬＨ又は非形質導入（Ｍｏｃｋ）Ｔ細胞を、様々なＥ：Ｔ比にて、ルシフェラーゼ導入遺伝子を含有するＧＰＲＣ５Ｄ＋ＭＭ．１Ｓ細胞又はＧＰＲＣ５Ｄ－Ｋ５６２細胞に添加した。ＣＡＲ－Ｔは、６人の健康なドナーから作製された。値は、２４時間の平均±ＳＤとして表される。比溶解率（percent specific lysis）は、（ｉ）６又は２４時間のＣＡＲ－Ｔの存在下で、腫瘍細胞中のルシフェラーゼシグナルを、同じ時点で、腫瘍細胞内のルシフェラーゼシグナルで除算し、１００を乗算し、（ｉｉ）１００からその数を減算することによって計算した。式は、１００－［（ＣＡＲ－Ｔ＋腫瘍発光／平均腫瘍単独発光）×１００］である。点線は、ゼロに等しい比溶解率を表す。陰性溶解は、細胞成長を示す。 示されたＥ：Ｔ比で添加されたＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害が、ＧＰＲＣ５Ｄ＋Ｈ９２９、ＭＭ．１Ｓ、ＭＭ．１Ｒ、ＭＯＬＰ－２、及びＥＪＭ細胞又はＧＰＲＣ５Ｄ－Ｋ５６２細胞を使用して評価されたことを示す散乱プロットを示す。ＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、全てのＧＰＲＣ５Ｄ＋細胞株に対して細胞傷害を示した。 示されたＥ：Ｔ比で添加されたＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害が、ＧＰＲＣ５Ｄ＋Ｈ９２９、ＭＭ．１Ｓ、ＭＭ．１Ｒ、ＭＯＬＰ－２、及びＥＪＭ細胞又はＧＰＲＣ５Ｄ－Ｋ５６２細胞を使用して評価されたことを示す散乱プロットを示す。ＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、全てのＧＰＲＣ５Ｄ＋細胞株に対して細胞傷害を示した。 示されたＥ：Ｔ比で添加されたＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害が、ＧＰＲＣ５Ｄ＋Ｈ９２９、ＭＭ．１Ｓ、ＭＭ．１Ｒ、ＭＯＬＰ－２、及びＥＪＭ細胞又はＧＰＲＣ５Ｄ－Ｋ５６２細胞を使用して評価されたことを示す散乱プロットを示す。ＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、全てのＧＰＲＣ５Ｄ＋細胞株に対して細胞傷害を示した。 示されたＥ：Ｔ比で添加されたＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害が、ＧＰＲＣ５Ｄ＋Ｈ９２９、ＭＭ．１Ｓ、ＭＭ．１Ｒ、ＭＯＬＰ－２、及びＥＪＭ細胞又はＧＰＲＣ５Ｄ－Ｋ５６２細胞を使用して評価されたことを示す散乱プロットを示す。ＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、全てのＧＰＲＣ５Ｄ＋細胞株に対して細胞傷害を示した。 示されたＥ：Ｔ比で添加されたＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害が、ＧＰＲＣ５Ｄ＋Ｈ９２９、ＭＭ．１Ｓ、ＭＭ．１Ｒ、ＭＯＬＰ－２、及びＥＪＭ細胞又はＧＰＲＣ５Ｄ－Ｋ５６２細胞を使用して評価されたことを示す散乱プロットを示す。ＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、全てのＧＰＲＣ５Ｄ＋細胞株に対して細胞傷害を示した。 示されたＥ：Ｔ比で添加されたＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害が、ＧＰＲＣ５Ｄ＋Ｈ９２９、ＭＭ．１Ｓ、ＭＭ．１Ｒ、ＭＯＬＰ－２、及びＥＪＭ細胞又はＧＰＲＣ５Ｄ－Ｋ５６２細胞を使用して評価されたことを示す散乱プロットを示す。ＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、全てのＧＰＲＣ５Ｄ＋細胞株に対して細胞傷害を示した。 ３：１のＥ：Ｔ比においてＫ５６２細胞の存在下での、非形質導入（ｍｏｃｋ）又はＧＣ５Ｂ６８０－Ｎ６８Ｓ－ＬＨ細胞による表面ＣＤ２５発現レベル（％ＣＤ２５）を示す棒グラフを示す。ＣＡＲ－Ｔは、６人の健康なドナーから作製された。データは平均±ＳＤとして表される。 図１３－１、図１３－２、図１３－３は、ＧＣ５Ｂ６８０－Ｎ６８Ｓ－ＬＨが、ＧＰＲＣ５Ｄ＋標的細胞（Ｈ９２９又はＭＭ．１Ｓ）又は陽性対照（作動薬ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ）の存在下で特異的に増殖し、標的細胞の非存在下又はＧＰＲＣ５Ｄ－細胞（Ｋ５６２）の存在下では増殖しないことを示すフローサイトグラムを示す。ＣＥＬＬＴＲＡＣＥ Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）（Ｘ軸）を使用して細胞増殖を測定した。抗イディオタイプ抗体（Ｙ軸）を使用して、ＣＡＲ＋事象を検出した。 （上記の通り。） （上記の通り。） ＣＡＲ－Ｔ（ＧＣ５Ｂ６８０－Ｎ６８Ｓ－ＬＨ）細胞中で、ＧＰＲＣ５Ｄ＋細胞株Ｈ９２９と共に２４時間インキュベーションされた切断カスパーゼ３／７レベルのレベルが、対照（スタウロスポリン、ＧＰＲＣ５Ｄ－Ｋ５６２細胞、又は単独）と比較して変化のないことを示す棒グラフである。Ｅ：Ｔ比１：２を、Ｈ９２９及びＫ５６２細胞に使用した。ＣＡＲ－は、ＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲを発現しない形質導入細胞を表す。ＣＡＲ＋は、ＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲを発現する形質導入細胞を表す。 実施例１５による、ＮＳＧ－Ｂ２Ｍマウスにおいて確立されたＭＭ．１ＳヒトＭＭ異種移植片におけるＧＰＲＣ５Ｄ指向性ＣＡＲ－Ｔ細胞の効果を実証するグラフを示す。ＧＣ５Ｂ６８０－Ｎ６８Ｓ－ＬＨ、ＧＣ５Ｂ６８０－Ｎ６８Ｓ－ＨＬ、ＧＣ５Ｂ８３－Ｎ２４Ｔ－Ｎ３１Ｓ－ＬＨ、及びＧＣ５Ｂ８３－Ｎ２４Ｔ－Ｎ３１Ｓ－ＨＬ、ＧＰＲＣ５Ｄ指向性ＣＡＲ－Ｔ、Ｍｏｃｋ、非形質導入ＣＡＲ－Ｔ、ＰＢＳ、リン酸緩衝生理食塩水、ＮＳＧ、非肥満糖尿病重症複合免疫不全ガンマ、Ｂ２Ｍ、ベータ－２ミクログロブリン、ＭＭ、多発性骨髄腫。群の腫瘍体積は、平均±ＳＥＭとしてグラフ化されている。腫瘍細胞を０日目に移植し、１×１０６のＣＡＲ＋Ｔ細胞を１３日目に移植した。記号「＊」は、２６日目のＰＢＳ対照との有意差を示す（ｐ≦０．０５、ｎ＝１０／群）。 実施例１６による、播種性Ｈ９２９ヒトＭＭ異種移植片を有するＮＳＧマウスの生存期間に対するＧＣ５Ｂ６８０－Ｎ６８Ｓ－ＬＨの効果を実証するグラフを示す。ＧＣ５Ｂ６８０－Ｎ６８Ｓ－ＬＨ、ＧＣ５Ｂ６８０－Ｎ６８Ｓ－ＨＬ、ＧＣ５Ｂ８３－Ｎ２４Ｔ－Ｎ３１Ｓ－ＬＨ、及びＧＣ５Ｂ８３－Ｎ２４Ｔ－Ｎ３１Ｓ－ＨＬ、ＧＰＲＣ５Ｄ指向性ＣＡＲ－Ｔ、Ｍｏｃｋ、非形質導入ＣＡＲ－Ｔ、ＰＢＳ、リン酸緩衝生理食塩水、ＮＳＧ、非肥満糖尿病重症複合免疫不全ガンマ、ＭＭ、多発性骨髄腫。腫瘍細胞を０日目に移植した。１×１０６のＣＡＲ＋Ｔ細胞を９日目に移植した。記号「＊」は、１１１日目のＰＢＳ対照との有意差を示す。
例示的実施形態の記述が以下に続く。
本開示は、Ｇタンパク質共役型受容体Ｇタンパク質共役型受容体ファミリーＣグループ５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、かかるＣＡＲを含む細胞、並びに本明細書に記載のＣＡＲを使用した癌（例えば、血液悪性腫瘍及び固形腫瘍）を治療する方法を提供する。
本発明のＣＡＲは、ＧＰＲＣ５Ｄ（例えば、配列番号５７のアミノ酸配列を有するヒトＧＰＲＣ５Ｄポリペプチド又はそのフラグメント）に対する抗原特異性を有する。本明細書で使用するとき、「抗原特異性を有する」及び「抗原特異的応答を誘発する」という句は、ＣＡＲが抗原に特異的に結合し、抗原を免疫学的に認識することができ、その結果、ＣＡＲのＧＰＲＣ５Ｄ抗原への結合により免疫応答を誘発することを意味する。抗原特異性及び標的細胞を認識する能力についてＣＡＲを試験する方法は、当技術分野で知られている。
本開示はまた、関連する核酸、組み換え発現ベクター、宿主細胞、細胞集団、抗体、又はその抗原結合部分、及び本発明のＣＡＲに関する医薬組成物も提供する。
本発明のいくつかの態様は、例示のみを目的とした例を参照して、以下に記載される。本発明の完全な理解を提供するために、多数の具体的な詳細、関係、及び方法が記載されていることを理解されたい。しかしながら、当業者であれば、本発明は、具体的な詳細のうちの１つ若しくは２つ以上を伴わずに実施することができる、又は他の方法、プロトコル、試薬、細胞株、及び動物で実施することができることを容易に認識するであろう。いくつかの行為は、異なる順序で、及び／又は他の行為若しくは事象と同時に生じ得るため、本発明は、例示される行為又は事象の順序によって限定されない。更に、本発明による手法を実施するために、例示された全ての行為、ステップ、又は事象が必要とされるわけではない。本明細書に記載される又は参照される技術及び手順のうちの多くは、当業者によって十分に理解されており、従来の手法を使用して一般的に用いられている。
別途定義のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語、表記、及び他の科学用語、又は専門用語は、本発明が関係する当業者によって通常理解される意味を有することを意図している。場合によっては、通常理解される意味を有する用語は、明確にするため及び／又は即座に参照できるように本明細書に定義され、本明細書におけるかかる定義を含めることは、当該技術分野において概ね理解されているものと実質的な違いを表すと必ずしも解釈されるべきではない。通常使用される辞書で定義されているような用語は、関連技術の文脈におけるそれらの意味と一致する意味を有するものとして、及び／又は本明細書において別様に定義されているものとして解釈する必要があることが更に理解されるであろう。
本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態のみを説明するためであり、限定することを意図しない。本明細書で使用される場合、文脈により別途明確に示されない限り、冠詞「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、複数の指示物を含むものと理解されたい。
キメラ抗原受容体
本発明は、概して、所望のキメラ抗原受容体を安定して発現するように遺伝子改変されたＴ細胞の使用に関する。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、Ｔ細胞シグナル伝達ドメインに結合された抗体（ｓｃＦｖ）の抗原結合ドメインを含有する人工的に構築されたハイブリッドタンパク質又はポリペプチドである。ＣＡＲの特性には、非ＭＨＣ制限様式で選択された標的に向かってＴ細胞特異性及び反応性をリダイレクトし、モノクローナル抗体の抗原結合特性を利用する能力が含まれ得る。非ＭＨＣ制限抗原認識により、ＣＡＲを発現するＴ細胞は、抗原プロセシングとは無関係に抗原を認識することができるため、腫瘍回避の主要なメカニズムを迂回する。更に、Ｔ細胞において発現される場合、ＣＡＲは、内因性Ｔ細胞受容体（T cell receptor、ＴＣＲ）アルファ及びベータ鎖と有利に二量体化しない。
本明細書に記載のＣＡＲは、少なくとも細胞外抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、以下に定義された刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメイン（本明細書では「細胞質シグナル伝達ドメイン」とも称される）と、を含む組み換えポリペプチド構築物を提供する。ＣＡＲを発現するＴ細胞は、本明細書では、ＣＡＲ Ｔ細胞、ＣＡＲ－Ｔ細胞、又はＣＡＲ修飾Ｔ細胞と称され、これらの用語は、本明細書において互換的に使用される。細胞は、その表面上に抗体結合ドメインを安定して発現するように遺伝子改変することができ、ＭＨＣ非依存性の新規抗原特異性を付与する。
場合によっては、特異的抗体の抗原認識ドメインをＣＤ３－ゼータ鎖又はＦｃγＲＩタンパク質の細胞内ドメインと組み合わせて単一のキメラタンパク質にするＣＡＲを安定して発現するように、Ｔ細胞は遺伝子改変されている。一実施形態では、刺激分子は、Ｔ細胞受容体複合体に関連するゼータ鎖である。
「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、本用語が本明細書において使用されるとき、分子の細胞内部分を指す。これは、タンパク質の機能的部分であり、セカンドメッセンジャを生成することにより定められたシグナル伝達経路を介して細胞活動を調節するために細胞内で情報を伝達することによって作用する、又はかかるメッセンジャに応答することによりエフェクタとして機能することによって作用する。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲ含有細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）の免疫エフェクタ機能を促進するシグナルを生成する。例えばＣＡＲ－Ｔ細胞における免疫エフェクタ機能の例としては、細胞溶解活性及びヘルパー活性（サイトカインの分泌を含む）が挙げられる。
一実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。一次細胞内シグナル伝達ドメインの例としては、一次刺激又は抗原依存性シミュレーションに関与する分子に由来するものが挙げられる。一実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激細胞内ドメインを含み得る。共刺激細胞内シグナル伝達ドメインの例としては、共刺激シグナル又は抗原非依存性刺激に関与する分子に由来するものが挙げられる。例えば、ＣＡＲ－Ｔの場合、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞受容体の細胞質配列を含み得、共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、共受容体又は共刺激分子から細胞質配列を含み得る。
一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ又はＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。一次細胞質シグナル伝達配列を含有するＩＴＡＭの例としては、ＣＤ３－ゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、並びにＣＤ６６ｄ ＤＡＰ１０及びＤＡＰ１２に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
一次細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、ＣＤ３－ゼータ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ３９ ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、Ｆｃイプシロン受容体Ｉガンマ鎖（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃＲベータ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ５、ＣＤ２２６、又はＣＤ７９Ｂのシグナル伝達ドメインに由来し得る。
「ゼータ」又は代替的に「ゼータ鎖」、「ＣＤ３－ゼータ」又は「ＴＣＲ－ゼータ」という用語は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＧ３６６６４．１として提供されるタンパク質、又は非ヒト種、例えば、ネズミ、ウサギ、霊長類、マウス、げっ歯類、サル、類人猿などからの同等の残基として定義され、「ゼータ刺激ドメイン」又は代替的に「ＣＤ３－ゼータ刺激ドメイン」又は「ＴＣＲ－ゼータ刺激ドメイン」は、Ｔ細胞活性化に必要な初期シグナルを機能的に伝達するために十分なゼータ鎖の細胞質ドメインからのアミノ酸残基として定義される。一態様では、ゼータの細胞質ドメインは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＧ３６６６４．１の残基５２～１６４、又はその機能的オルソログである、非ヒト種、例えば、マウス、げっ歯類、サル、類人猿などに由来する同等の残基を含む。
好ましい実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ刺激ドメインを含む。一態様では、「ゼータ刺激ドメイン」又は「ＣＤ３ゼータ刺激ドメイン」は、配列番号１３として提供される配列である。
「共刺激分子」という用語は、Ｔ細胞上の同族結合パートナーを指し、共刺激リガンドと特異的に結合することにより、Ｔ細胞による共刺激応答（例えば、限定するものではないが、増殖）を媒介する。共刺激分子は、効率的な免疫応答に必要な抗原受容体又はそのリガンド以外の細胞表面分子である。共刺激分子としては、ＭＨＣクラス１分子、ＢＴＬＡ及びＴｏｌｌリガンド受容体、並びにＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、ＢＴＬＡ、ＧＩＴＲ、ＣＤ２２６、ＨＶＥＭ、及びＺＡＰ７０が挙げられるが、これらに限定されない。
共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内部分であり得る。共刺激分子は、以下のタンパク質ファミリー、すなわち、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、及び活性化ＮＫ細胞受容体で表すことができる。かかる分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＣＤ１６０、Ｂ７－Ｈ３、及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどが挙げられる。
細胞内シグナル伝達ドメインは、それが由来する分子の細胞内部分全体、又は天然の細胞内シグナル伝達ドメイン全体、又はそれらの機能的フラグメントを含み得る。
「４－１ＢＢ」という用語は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＡ６２４７８．２として提供されるアミノ酸配列を有するＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバー、又は非ヒト種、例えば、マウス、げっ歯類、サル、類人猿などの同等の残基を指し、「４－１ＢＢ共刺激ドメイン」は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＡ６２４７８．２のアミノ酸残基２１４～２５５、又は非ヒト種、例えば、マウス、げっ歯類、サル、及び類人猿などに由来する同等の残基として定義される。
一態様では、「４－１ＢＢ共刺激ドメイン」は、配列番号１２として提供される配列、又は非ヒト種、例えば、マウス、げっ歯類、サル、及び類人猿などに由来する同等の残基である。
いくつかの実施形態では、細胞質シグナル伝達ドメインは、本明細書で定義される少なくとも１つの共刺激分子に由来する１つ又は２つ以上の機能的シグナル伝達ドメインを更に含む。一実施形態では、共刺激分子は、４－１ＢＢ（すなわち、ＣＤ１３７）、ＣＤ２７、ＣＤ３－ゼータ及び／又はＣＤ２８から選択される。ＣＤ２８は、Ｔ細胞共刺激において重要なＴ細胞マーカーである。ＣＤ２７は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーであり、共刺激免疫チェックポイント分子として機能する。４－１ＢＢは、Ｔ細胞に強力な共刺激シグナルを伝達し、分化を促進し、Ｔリンパ球の長期生存期間を向上させる。ＣＤ３－ゼータは、ＴＣＲと会合してシグナルを生成し、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（immunoreceptor tyrosine-based activation motifs、ＩＴＡＭ）を含有する。
好ましい実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激細胞内シグナル伝達ドメインを含み、共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、４－１ＢＢ共刺激ドメインである。好ましい実施形態では、４－１ＢＢ共刺激ドメインは、配列番号１２として提供される配列である。
一実施形態では、ＣＡＲ内のドメインの１つに自然に関連する膜貫通ドメインが使用される。別の実施形態では、膜貫通ドメインを、アミノ酸置換によって選択又は修飾し、同じ又は異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへのかかるドメインの結合を回避して、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えることができる。一例の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α膜貫通ドメインである。
一実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ８αヒンジドメインを含むヒンジドメインを含む。
一実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ８αヒンジドメイン及びＣＤ８α膜貫通ドメインを含む。
一実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ８αヒンジドメインを含むヒンジドメインと、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、及びＣＤ３－ゼータを含む細胞内シグナル伝達ドメインと、を含む。
本明細書に記載のＣＡＲは、少なくとも細胞外抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、例えば以下に定義された刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメイン（本明細書では「細胞質シグナル伝達ドメイン」とも称される）と、を含む組み換えポリペプチド構築物を提供する。
一実施形態では、ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメインと、膜貫通ドメインと、刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインと、を含むキメラ融合タンパク質を含む。一実施形態では、ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメインと、膜貫通ドメインと、共刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメイン及び刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインと、を含むキメラ融合タンパク質を含む。一実施形態では、ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメインと、膜貫通ドメインと、１つ又は２つ以上の共刺激分子に由来する少なくとも２つの機能的シグナル伝達ドメイン及び刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインと、を含むキメラ融合タンパク質を含む。
本発明のＣＡＲは、ＣＤ２８及び／若しくは４－１ＢＢシグナル伝達ドメインをそれ自体が含むように、又は本発明のＣＡＲの文脈において有用な他の任意の所望の細胞質ドメインと組み合わせるように設計することができる。一実施形態では、ＣＡＲの細胞質ドメインは、ＣＤ３－ゼータのシグナル伝達ドメインを更に含み得る。例えば、ＣＡＲの細胞質ドメインとしては、ＣＤ３－ゼータ、４－１ＢＢ、及びＣＤ２８シグナル伝達モジュール、並びにこれらの組み合わせが挙げられ得るが、これらに限定されない。
好ましい実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ８αヒンジドメインと、ＣＤ８α膜貫通ドメインと、ＣＤ３－ゼータのシグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインと、を含む。
好ましい実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ８αヒンジドメインと、ＣＤ８α膜貫通ドメインと、ＣＤ３－ゼータのシグナル伝達ドメイン及び４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインと、を含む。
したがって、本発明は、ＣＡＲ Ｔ細胞、及び養子療法のためのそれらの使用方法を提供する。
本開示は、本明細書に記載のＣＡＲ、核酸、ポリペプチド、及びタンパク質の変異体（例えば機能的変異体）を更に提供する。「変異体」は、例えば、置換、挿入、又は欠失といった１つ又は２つ以上の改変によって参照ポリペプチド又は参照ポリヌクレオチドと異なるポリペプチド又はポリヌクレオチドを指す。本明細書で使用するとき、「機能的変異体」という用語は、親ＣＡＲ、ポリペプチド、又はタンパク質と実質的又は著しい配列同一性又は類似性を有するＣＡＲ、ポリペプチド、又はタンパク質を指し、これらの機能的変異体は、変異体であるＣＡＲ、ポリペプチド、又はタンパク質の生物活性を保持する。機能的変異体は、例えば、本明細書に記載のＣＡＲ、ポリペプチド、又はタンパク質（親ＣＡＲ、ポリペプチド、又はタンパク質）の変異体を包含し、親ＣＡＲ、ポリペプチド、又はタンパク質とほぼ同程度、同程度、又はより高い程度で標的細胞を認識する能力を保持する。親ＣＡＲ、ポリペプチド、又はタンパク質に関して、機能的変異体は、例えば、親ＣＡＲ、ポリペプチド、又はタンパク質に対して、アミノ酸配列が少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又はそれ以上同一であり得る。
本明細書では、ポリペプチドの構造は、列挙された参照配列（所与の配列番号を有する）との％配列同一性に基づいて定義された場所にある。これに関連して、２つのアミノ酸配列間の％配列同一性は、最適な方法でアラインメントされたこれらの２つの配列を比較することによって判定することができ、比較されるアミノ酸配列は、これらの２つの配列間における最適なアラインメントのために参照配列に対して付加又は欠失を含み得る。同一性の百分率は、２つの配列間のアミノ酸残基が同一である同一位置の数を判定し、この同一の位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で同一位置で除算し、得られた結果に１００を乗算し、これら２つの配列間における同一性の百分率を得るようにすることにより計算される。典型的には、比較ウィンドウは、比較される配列の全長に対応する。例えば、ＢＬＡＳＴプログラム、「ＢＬＡＳＴ ２配列」（Ｔａｔｕｓｏｖａ ｅｔ ａｌ、「Ｂｌａｓｔ ２配列－タンパク質及びヌクレオチド配列を比較するための新しいツール」、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．１７４：２４７－２５０）を使用することが可能であり、サイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｂｌ２．ｈｔｍｌで入手可能であり、使用されるパラメータは、デフォルト（具体的には、パラメータ「オープンギャップペナルティ」：５、及び「エクステンションギャップペナルティ」：２；選択されたマトリックスは、例えば、プログラムによって提案されるマトリックス「ＢＬＯＳＵＭ ６２」）で指定されているパラメータであり、比較される２つの配列間における同一性の百分率は、プログラムによって直接計算される。クエリ配列の参照配列に対する配列同一性の判定は、当業者の能力の範囲内であり、ＢＬＡＳＴ（商標）などの市販の分析ソフトウェアを使用して実行することができる。
機能的変異体は、例えば、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する親ＣＡＲ、ポリペプチド、又はタンパク質のアミノ酸配列を含み得る。別の実施形態では、機能的変異体は、少なくとも１つの非保存的アミノ酸置換を有する親ＣＡＲ、ポリペプチド、又はタンパク質のアミノ酸配列を含み得る。この場合、非保存的アミノ酸置換は、機能的変異体の生物活性を抑制又は阻害しない場合がある。非保存的アミノ酸置換により、機能的変異体の生物活性を向上させることができ、その結果、機能的変異体の生物活性は、親ＣＡＲ、ポリペプチド、又はタンパク質と比較して増加する。
本発明のＣＡＲのアミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換であり得る。保存的アミノ酸置換は、当該技術分野において既知であり、特定の物理的及び／又は化学的特性を有する１つのアミノ酸を、同じ又は類似の化学的又は物理的特性を有する別のアミノ酸と交換するアミノ酸置換を含む。例えば、保存的アミノ酸置換は、別の酸性アミノ酸で置換された酸性アミノ酸（例えば、Ａｓｐ又はＧｌｕ）、非極性側鎖を有する別のアミノ酸で置換された非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｖａｌなど）、別の塩基性アミノ酸で置換された塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇなど）、極性側鎖を有する別のアミノ酸で置換された極性側鎖を有するアミノ酸（Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒなど）等であり得る。
ＣＡＲ、ポリペプチド、又はタンパク質は、特定のアミノ酸配列又は本明細書に記載の配列から本質的に構成され得、その結果、他の構成成分、例えば、他のアミノ酸は、機能的変異体の生物活性を実質的に変化させない。
本開示の実施形態のＣＡＲ、ポリペプチド、及びタンパク質（機能的部分及び機能的変異体を含む）は、任意の長さであり得る、すなわち、任意の数のアミノ酸を含み得る。但し、その条件は、ＣＡＲ、ポリペプチド、又はタンパク質（又は機能的部分若しくはその機能的変異体）が、それらの生物活性、例えば、抗原に特異的に結合する能力、宿主内の疾患細胞（例えば、癌細胞）を検出する能力、又は宿主内の疾患を治療若しくは予防する能力などを保持することである。例えば、ポリペプチドは、約５０～約５０００個のアミノ酸長、例えば、約５０、約７０、約７５、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、約２００、約２２５、約２５０、約２７５、約３００、約３２５、約３５０、約３７５、約４００、約４２５、約４５０、約４７５、約５００、約５２５、約５５０、約５７５、約６００、約６２５、約６５０、約６７５、約７００、約７２５、約７５０、約７７５、約８００、約８２５、約８５０、約８７５、約９００、約９２５、約９５０、約９７５、約１０００又はそれ以上のアミノ酸の長さであり得る。本発明のポリペプチドはまた、オリゴペプチドも含む。
本発明の実施形態のＣＡＲ、ポリペプチド、及びタンパク質（本発明の機能的部分及び機能的変異体を含む）は、１つ又は２つ以上の天然に存在するアミノ酸の代わりに合成アミノ酸を含むことができる。かかる合成アミノ酸は、当該技術分野において既知であり、例としては、アミノシクロヘキサンカルボン酸、ノルロイシン、α－アミノｎ－デカン酸、ホモセリン、Ｓ－アセチルアミノメチル－システイン、トランス－３－及びトランス－４－ヒドロキシプロリン、４－アミノフェニルアラニン、４－ニトロフェニルアラニン、α－（２－アミノ－２－ノルボルナン）－カルボン酸、α，γ－ジアミノ酪酸、α，β－ジアミノプロピオン酸、ホモフェニルアラニン、４－クロロフェニルアラニン、４－カルボキシフェニルアラニン、β－フェニルセリンβ－ヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、α－ナフチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、Ｎ’－ベンジル－Ｎ’－メチル－リジン、Ｎ’，Ｎ’－ジベンジル－リジン、６－ヒドロキシリジン、オルニチン、α－アミノシクロペンタンカルボン酸、α－アミノシクロヘキサンカルボン酸、α－アミノシクロヘプタンカルボン酸、インドリン－２－カルボン酸、１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－３－カルボン酸、アミノアルドン酸、アミノアルドン酸モノアミド、及びα－ｔｅｒｔ－ブチルグリシンが挙げられる。
本発明の実施形態のＣＡＲ、ポリペプチド、及びタンパク質（機能的部分及び機能的変異体を含む）は、翻訳後修飾を受けることができる。これらは、グリコシル化、エステル化、Ｎ－アシル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化、エステル化、例えば、ジスルフィド架橋を介して環化するか、又は酸付加塩に変換することができる。いくつかの実施形態では、これらは、二量体化若しくは重合、又はコンジュゲートされている。
本発明の実施形態のＣＡＲ、ポリペプチド、及び／又はタンパク質（機能的部分及びその機能的変異体を含む）は、当該技術分野において既知の方法によって得ることができる。ポリペプチド及びタンパク質をデノボ合成する好適な方法は、参考文献、例えばＣｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｆｍｏｃ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ，２０００；Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ａｎａｌｙｓｉｓ，ｅｄ．Ｒｅｉｄ，Ｒ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，２０００；ａｎｄ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ，ｅｄ．Ｗｅｓｔｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ，２００１に記載されている。また、ポリペプチド及びタンパク質は、標準的な組み換え方法を使用して本明細書に記載の核酸を使用して、組み換えにより産生され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．２００１；及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ，１９９４．を参照されたい。更に、本発明のＣＡＲ、ポリペプチド、及びタンパク質（機能的部分及びその機能的変異体を含む）の一部は、植物、細菌、昆虫、哺乳動物などの供給源から単離及び／又は精製することができる。単離及び精製の方法は、当該技術分野において既知である。代替的に、本明細書に記載のＣＡＲ、ポリペプチド、及び／又はタンパク質（機能的部分及びその機能的変異体を含む）は、商業的に合成することができる。この点において、ＣＡＲ、ポリペプチド、及びタンパク質は、合成、組み換え、単離、及び／又は精製することができる。
本明細書に記載のポリペプチドを生成するために利用される組み換え核酸を生成するために使用することができる修飾ヌクレオチドの例としては、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、５－ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４－アセチルシトシン、５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、Ｎ６－置換アデニン、７－メチルグアニン、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、ベータ－Ｄ－マンノシルケオシン、５”－メトキシカルボキシメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、ウィブトキソシン（wybutoxosine）、シュードウラシル、クエオシン、ベータ－Ｄ－ガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、１－メチルグアニン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、３－（３－アミノ－３－Ｎ－２－カルボキシプロピル）ウラシル、及び２，６－ジアミノプリンが挙げられるが、これらに限定されない。
核酸は、ＣＡＲ、ポリペプチド若しくはタンパク質、又は機能的部分若しくはその機能的変異体のいずれかをコードする、任意の単離又は精製されたヌクレオチド配列を含み得る。代替的に、ヌクレオチド配列は、配列のいずれかに縮重したヌクレオチド配列、又は縮重配列の組み合わせを含み得る。
本発明のいくつかの実施形態はまた、単離又は精製された核酸を提供し、本核酸は、本明細書に記載される核酸のいずれかのヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列、又は本明細書に記載される核酸のいずれかのヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列は、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし得る。「高ストリンジェンシー条件」は、ヌクレオチド配列が、非特異的ハイブリダイゼーションよりも優れた検出可能な量で標的配列（本明細書に記載される核酸のいずれかのヌクレオチド配列）に特異的にハイブリダイズすることを意味する。高ストリンジェンシー条件としては、正確に相補的な配列を有するポリヌクレオチド、又は散らばったミスマッチをほんのわずか含むポリヌクレオチドを、ヌクレオチド配列とマッチしたいくつかの小領域（例えば、３～１２塩基）を偶然有するランダム配列から識別する条件が挙げられる。かかる相補的な小領域は、１４～１７又はそれ以上の塩基の完全長相補体よりも容易に融解され、高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションにより、それらが容易に識別可能となる。比較的高いストリンジェンシー条件としては、例えば、低塩及び／又は高温条件（約５０～７０℃の温度の約０．０２～０．１ＭのＮａＣｌ又は同等のものによって提供される等）が挙げられる。かかる高ストリンジェンシー条件は、どちらかといえば、ヌクレオチド配列とテンプレート鎖又は標的鎖との間のミスマッチがほとんど許容されず、本明細書に記載のＣＡＲのいずれかの発現を検出するために特に好適である。条件は、漸増量のホルムアミドの添加によって、よりストリンジェントになり得ることが、概ね理解される。
一実施形態では、本発明の核酸は、組み換え発現ベクターに組み込むことができる。本開示は、本発明の核酸のいずれかを含む組み換え発現ベクターを提供する。本明細書で使用するとき、「組み換え発現ベクター」という用語は、宿主細胞によるｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドの発現を可能にする、遺伝的に改変されたオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド構築物を意味し、この場合、構築物は、ｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ベクターは、細胞内でｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドを発現させるために十分な条件下で、細胞と接触させられる。本明細書に記載のベクターは、全体として天然には存在しない。しかしながら、ベクターの一部は、天然に存在し得る。記載される組み換え発現ベクターは、ＤＮＡ及びＲＮＡ（一本鎖又は二本鎖であり得、合成されるか、又は一部が天然のソースから得られ得、天然、非天然又は改変されたヌクレオチドを含有し得る）を含むがこれらに限定されない、任意のタイプのヌクレオチドを含み得る。組み換え発現ベクターは、天然に存在するヌクレオチド間結合、若しくは天然に存在しないヌクレオチド間結合、又は両方のタイプの結合を含み得る。天然に存在しない又は改変されたヌクレオチド又はヌクレオチド間結合は、ベクターの転写又は複製を阻害しない。
一実施形態では、本発明の組み換え発現ベクターは、任意の好適な組み換え発現ベクターであり得、任意の好適な宿主を形質転換又はトランスフェクションするために使用され得る。好適なベクターとしては、プラスミド及びウイルスなどの繁殖及び増殖のため、若しくは発現のため、又は両方のために設計されたベクターが挙げられる。ベクターは、ｐＵＣシリーズ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｌｅｎ Ｂｕｒｎｉｅ，Ｍｄ．）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔシリーズ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）、ｐＥＴシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ｐＧＥＸシリーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、及びｐＥＸシリーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）からなる群から選択され得る。λＧＴ１０、λＧＴ１１、λＥＭＢＬ４、及びλＮＭ１１４９、λＺａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などのバクテリオファージベクターを使用することができる。植物発現ベクターの例としては、ｐＢＩ０１、ｐＢＩ０１．２、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１．３、及びｐＢＩＮ１９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。動物発現ベクターの例としては、ｐＥＵＫ－Ｃｌ、ｐＭＡＭ、及びｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。組み換え発現ベクターは、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター、例えば、ガンマレトロウイルスベクターであり得る。
一実施形態では、本発明の組み換え発現ベクターは、例えば、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（上記）及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（上記）に記載の標準的な組み換えＤＮＡ技術を使用して調製される。環状又は線状である発現ベクターの構築物は、原核又は真核の宿主細胞において機能する複製系を含有するように調製され得る。複製系は、例えば、ＣｏｌＥｌ、ＳＶ４０、２μプラスミド、λ、ウシ乳頭腫ウイルスなどに由来し得る。
組み換え発現ベクターは、適宜、ベクターがＤＮＡベースであるかＲＮＡベースであるかを考慮して、ベクターが導入される宿主のタイプ（例えば、細菌、植物、真菌、又は動物）に特異的な、転写及び翻訳の開始及び終止コドンなどの調節配列を含み得る。
組み換え発現ベクターは、形質転換又はトランスフェクションされた宿主の選択を可能にする１つ又は２つ以上のマーカー遺伝子を含み得る。マーカー遺伝子は、殺生物剤耐性（例えば、抗生物質、重金属などに対する耐性）、栄養要求性宿主における原栄養を提供するための補完などを含む。記載される発現ベクターに好適なマーカー遺伝子としては、例えば、ネオマイシン／Ｇ４１８耐性遺伝子、ヒスチジノールｘ耐性遺伝子、ヒスチジノール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、及びアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。
組み換え発現ベクターは、ＣＡＲ、ポリペプチド、若しくはタンパク質（機能的部分及びその機能的変異体を含む）をコードするヌクレオチド配列に、又はＣＡＲ、ポリペプチド、若しくはタンパク質をコードするヌクレオチド配列に相補的であるか若しくはそれにハイブリダイズするヌクレオチド配列に、作動可能に連結された天然の又は標準のプロモーターを含み得る。プロモーターの選択（例えば、強い、弱い、組織特異的、誘導性、及び発生特異的）は、当業者の技術範囲内である。同様に、ヌクレオチド配列をプロモーターと組み合わせることも当業者の技術の範囲内である。プロモーターは、非ウイルスプロモーター又はウイルスプロモーター、例えば、サイトメガロウイルス（cytomegalovirus、ＣＭＶ）プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、又はネズミ幹細胞ウイルスの長い末端反復に見出されるプロモーターであり得る。
組み換え発現ベクターは、一過性の発現のため、安定な発現のため、又はその両方のために設計され得る。また、組み換え発現ベクターは、構成的発現又は誘導性発現のために作製され得る。
更に、組み換え発現ベクターは、自殺遺伝子を含むように作製され得る。本明細書で使用するとき、「自殺遺伝子」という用語は、自殺遺伝子を発現する細胞を死に至らしめる遺伝子を指す。自殺遺伝子は、遺伝子を発現する細胞に対し薬剤（例えば、薬物）に対する感受性を付与し、細胞が薬剤と接触したとき又は薬剤に曝露されたときに細胞を死に至らしめる遺伝子であり得る。自殺遺伝子は、当該技術分野において既知であり、例えば、単純ヘルペスウイルス（Herpes Simplex Virus、ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（thymidine kinase、ＴＫ）遺伝子、シトシンダミナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、及びニトロレダクターゼが挙げられる。
本発明の範囲内には、ＣＡＲ、ポリペプチド、若しくはタンパク質（その機能的部分又は変異体のいずれかを含む）宿主細胞、核酸、組み換え発現ベクター、宿主細胞集団、又は抗体、若しくはその抗原コンジュゲート部分のいずれかを含むコンジュゲート（例えば、バイオコンジュゲート）が含まれる。コンジュゲート、並びにコンジュゲートの合成方法は、概ね、当該技術分野において既知である（例えば、Ｈｕｄｅｃｚ，Ｆ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９８：２０９－２２３（２００５）ａｎｄ Ｋｉｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｏｒｇ Ｃｈｅｍ．４４（１５）：５４０５－５４１５（２００５）を参照されたい）。
本発明の一実施形態は、本発明のＣＡＲのエピトープに結合する、例えば特異的に結合する抗体又はその抗原結合部分を更に提供する。
抗体は、当該技術分野において既知の任意のタイプの免疫グロブリンであり得る。免疫グロブリンは、５つの主要クラス、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭに割り当てられ得る。ＩｇＡ及びＩｇＧは、アイソタイプＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４として更に細かく分類される。脊椎動物種の抗体軽鎖も、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいてカッパ（κ）及びラムダ（λ）の２つのタイプの一方に割り当てられ得る。抗体は、任意のクラス又はアイソタイプのものであり得る。
抗体は、ネズミ、ヒト、ヒト化及びキメラモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体、ポリクローナル、抗原結合フラグメント、二重特異性又は多重特異性抗体、単量体、二量体、四量体又は多量体抗体、一本鎖抗体、ドメイン抗体、並びに必要とされる特異性の抗原結合部位を含む任意の他の修飾された立体配置の免疫グロブリン分子を含む、免疫グロブリン分子を含む。抗体は、天然に存在する抗体、例えば、哺乳動物（例えば、ネズミ、霊長類、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ、ニワトリ、ハムスター、ヒトなど）から単離及び／又は精製された抗体であり得る。代替的に、抗体は、遺伝子操作された（例えば、遺伝的に操作された）抗体であり得る。
「ヒト抗体」は、ヒト対象に投与されるときに、最小の免疫応答を有するように最適化された抗体を意味する。ヒト抗体の可変領域は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する。ヒト抗体が定常領域又は定常領域の一部を含む場合、当該定常領域もヒト免疫グロブリン配列に由来する。ヒト抗体は、ヒト抗体の可変領域がヒト生殖細胞系列免疫グロブリン又は再編成された免疫グロブリン遺伝子を使用する系から得られた場合、ヒト起源の配列に「由来する」重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。かかる例示的な系は、ファージにディスプレイされたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリ、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座を保有するトランスジェニック非ヒト動物、例えばマウス又はラットを含む。「ヒト抗体」は、典型的には、ヒト抗体及びヒト免疫グロブリン遺伝子座を得るために使用した系の違い、フレームワーク若しくはＣＤＲへの体細胞変異の導入若しくは置換の意図的な導入、又はこれらの両方により、ヒトで発現した免疫グロブリンと比較したときにアミノ酸の違いを含有する。典型的には、「ヒト抗体」は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン又は再編成された免疫グロブリン遺伝子によってコードされているアミノ酸配列に対して、アミノ酸配列が少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である。場合によっては、「ヒト抗体」は、例えばＫｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９６：５７－８６に記載されるヒトフレームワーク配列分析から得られたコンセンサスフレームワーク配列、又は例えばＳｈｉ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３９７：３８５－９６及び国際公開第ＷＯ２００９／０８５４６２号に記載される、ファージ上に提示されたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリに組み込まれた合成ＨＣＤＲ３を含有し得る。少なくとも１つのＣＤＲが非ヒト種に由来する抗体は、「ヒト抗体」の定義には含まれない。
「ヒト化抗体」は、少なくとも１つのＣＤＲが非ヒト種に由来し、少なくとも１つのフレームワークがヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体を意味する。ヒト化抗体は、フレームワークに置換を含むことができるため、フレームワークは、発現したヒト免疫グロブリン又はヒト免疫グロブリン生殖細胞系列遺伝子配列の厳密なコピーではない場合がある。
典型的には、ヒト化抗体は、非ヒト種に由来する抗原結合部位を有し、可変領域フレームワークがヒト免疫グロブリン配列に由来する。ヒト抗体は、フレームワーク及び抗原結合部位の両方がヒト起源の配列に由来する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を有する。
また、抗体は、ＣＡＲの機能的部分に対して任意のレベルの親和性又は結合活性を有し得る。いくつかの実施形態では、抗体は、ある範囲の親和性（ＫＤ）でＧＰＲＣ５Ｄ抗原に結合することができる。本発明による一実施形態では、及び以下に列挙される付番された実施形態のうちの各実施形態及び全実施形態のうちのいくつかの実施形態において、当業者により実施される表面プラズモン共鳴又は結合平衡除外（Ｋｉｎｅｘａ）法によって判定されるように、抗体は、高い親和性で、例えば、約１０－７Ｍ以下のＫＤで、例えば、限定はしないが、１～９．９（又は１、２、３、４、５、６、７、８、若しくは９などの、これに収まる任意の範囲若しくは値）×１０－８Ｍ、１０－９Ｍ、１０－１０Ｍ、１０－１１Ｍ、１０－１２Ｍ、１０－１３Ｍ、１０－１４Ｍ、１０－１５Ｍ、又はこれに収まる任意の範囲若しくは値のＫＤで、ＧＰＲＣ５Ｄ抗原に結合する。親和性の１つの例は、１×１０－８Ｍ以下である。親和性の別の１つの例は、１×１０－９Ｍ以下である。
ＣＡＲの任意の機能的部分に結合する能力について抗体を試験する方法は、当該技術分野において既知であり、任意の抗体－抗原結合アッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ（radioimmunoassay、ＲＩＡ）、ウエスタンブロット、酵素結合免疫吸着アッセイ（enzyme-linked immunosorbent assay、ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降、及び競合阻害アッセイなどが挙げられる。
抗体を作製する好適な方法は、当該技術分野において既知である。例えば、標準的なハイブリドーマ法は、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５，５１１－５１９（１９７６），Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（ｅｄｓ．），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ（１９８８）、及びＣ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（２００１）に記載されている。代替的に、他の方法、例えば、ＥＢＶ－ハイブリドーマ法（Ｈａｓｋａｒｄ ａｎｄ Ａｒｃｈｅｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，７４（２），３６１－６７（１９８４），ａｎｄ Ｒｏｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１２１，１４０－６７（１９８６））、及びバクテリオファージベクター発現系（例えば、Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６，１２７５－８１（１９８９）を参照されたい）などが当該技術分野において既知である。更に、非ヒト動物において抗体を産生する方法は、例えば、米国特許第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号及び同第５，７１４，３５２号、並びに米国特許出願公開第２００２／０１９７２６６（Ａ１）号に記載されている。
ファージディスプレイを使用して、抗体を生成することもできる。これに関して、抗体の抗原結合可変（Ｖ）ドメインをコードするファージライブラリーは、標準的な分子生物学及び組み換えＤＮＡ技術を使用して生成することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（上記）、及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（上記）を参照されたい）。所望の特異性を有する可変領域をコードするファージは、所望の抗原（すなわち、ＧＰＲＣ５Ｄ）への特異的結合のために選択され、選択された可変ドメインを含む完全又は部分的な抗体が再構成される。再構成された抗体をコードする核酸配列は、ハイブリドーマ産生に使用される骨髄腫細胞などの好適な細胞株に導入され、モノクローナル抗体の特性を有する抗体が細胞によって分泌される（例えば、Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．（上記）、Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．（上記）、及び米国特許第６，２６５，１５０号を参照されたい）。
抗体は、特定の重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子のトランスジェニックであるトランスジェニックマウスによって産生され得る。かかる方法は、当該技術分野において既知であり、例えば、上記の米国特許第５，５４５，８０６号及び同第５，５６９，８２５号、並びにＪａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．（上記）に記載されている。
ヒト化抗体を生成する方法は、当該技術分野において既知であり、例えば、Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．（上記）、米国特許第５，２２５，５３９号、同第５，５８５，０８９号及び同第５，６９３，７６１号、欧州特許第０２３９４００（Ｂ１）号、並びに英国特許第２１８８６３８号に記載されている。ヒト化抗体はまた、米国特許第５，６３９，６４１号及びＰｅｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２３５，９５９－９７３（１９９４）に記載の抗体リサーフェシング技術を使用して生成することもできる。
本明細書で使用するとき、抗体は、多鎖又は単鎖、又は無傷の免疫グロブリンであり得、天然の供給源又は組み換えの供給源に由来し得る。抗体は、免疫グロブリン分子の四量体であり得る。
いくつかの実施形態では、抗体は、二重特異性抗体である。「二重特異性」は、同じ抗原内の２つの異なる抗原、又は２つの異なるエピトープに特異的に結合する、抗体などの分子を意味する。二重特異性分子は、他の関連抗原、例えば、ヒト又はサル、例えば、Ｍａｃａｃａ ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ（カニクイザル、ｃｙｎｏ）又はＰａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓなどの、他の種（ホモログ）の同じ抗原に対して交差反応性を有し得るか、あるいは２つ又はそれ以上の異なる抗原間で共有されるエピトープに結合し得る。既存の抗体のＶＬ及び／若しくはＶＨ領域、又は本明細書に記載されるようにして新たに特定されたＶＬ及びＶＨ領域は、遺伝子操作を受けて二重特異性の完全長抗体にされてもよい。かかる二重特異性抗体は、以下に記載されるもの等の技術を使用して、二重特異性抗体を形成するように、抗体Ｆｃ中のＣＨ３相互作用を調節することにより製造され得る：米国特許第７，６９５，９３６号、国際特許公開第ＷＯ０４／１１１２３３号、米国特許公開第Ｕ５２０１０／００１５１３３号、米国特許公開第ＵＳ２００７／０２８７１７０号、国際特許公開第ＷＯ２００８／１１９３５３号、米国特許公開第ＵＳ２００９／０１８２１２７号、米国特許公開第ＵＳ５２０１０／０２８６３７４号、米国特許公開第ＵＳ２０１１／０１２３５３２号、国際特許公開第ＷＯ２０１１／１３１７４６号、国際特許公開第ＷＯ２０１１／１４３５４５号、又は米国特許公開第ＵＳ２０１２／０１４９８７６号。例えば、本発明の二重特異性抗体は、国際公開第ＷＯ２０１１／１３１７４６号に記載された方法に従って、ｉｎ ｖｉｔｒｏで無細胞環境下、２種類の単一特異性ホモ二量体抗体のＣＨ３領域中に非対称な突然変異を導入し、ジスルフィド結合を異性化させる還元条件下において、２種類の親単一特異性ホモ二量体抗体から二重特異性ヘテロ二量体抗体を形成することにより生成されてもよい。この方法において、第１の単一特異性二価抗体及び第２の単一特異性二価抗体は、ヘテロ二量体の安定性を促進するＣＨ３ドメインにおいてある特定の置換を有するように遺伝子操作されるが、これらの抗体は、ヒンジ領域におけるシステインがジスルフィド結合を異性化させるために十分な還元条件下において共にインキュベーションされ、それにより、Ｆａｂアーム交換により二重特異性抗体が生成される。インキュベーション条件は、最適には、非還元条件に戻され得る。使用され得る還元剤の例は、２－メルカプトエチルアミン（２－ＭＥＡ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリスリトール（ＤＴＥ）、グルタチオン、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、Ｌ－システイン、及びベータ－メルカプトエタノールであり、好ましくは、２－メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトール、及びトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンからなる群から選択される還元剤である。例えば、少なくとも２０℃の温度において、少なくとも２５ｍＭの２－ＭＥＡの存在下又は少なくとも０．５ｍＭのジチオスレイトールの存在下で、ｐＨ５～８、例えば、ｐＨ７．０又はｐＨ７．４において、少なくとも９０分のインキュベーションが使用されてもよい。
「抗体フラグメント」という用語は、親の完全長抗体の抗原結合特性を保持する、無傷の抗体又はその組み換え変異体の少なくとも１つの部分を指す。例えば、認識及び結合（例えば、抗原などの標的に対する抗体フラグメントの特異的結合）を付与するために十分である、抗原結合ドメイン（例えば、無傷の抗体の抗原決定可変領域）を指す。「抗原結合フラグメント」は、免疫グロブリン分子の一部を指す。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖフラグメント、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、線状抗体、ｓｄＡｂなどの単一ドメイン抗体（ＶＬ又はＶＨのいずれか）、ラクダＶＨＨドメイン、並びに抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
「ｓｃＦｖ」という用語は、軽鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体フラグメントと、重鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体フラグメントと、を含むタンパク質を指す。いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、短い柔軟なポリペプチドリンカーを介して連続的に連結され、単鎖ポリペプチドとして発現することができ、ｓｃＦｖは、その元となった無傷の抗体の特異性を保持する。指定されない限り、本明細書で使用するとき、ｓｃＦｖは、ＶＬ及びＶＨ可変領域をいずれかの順序で有してもよく、例えば、ポリペプチドのＮ末端及びＣ末端の終端に関して、ｓｃＦｖは、ＶＬ－リンカー－ＶＨを含んでもよく、又はＶＨ－リンカー－ＶＬを含んでもよい。
本発明の一実施形態はまた、本明細書に記載の抗体のいずれかの抗原結合部分を提供する。抗原結合部分は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｄｓＦｖ、ｓＦｖ、ダイアボディ、及びトリアボディなどの少なくとも１つの抗原結合部位を有する任意の部分であり得る。
いくつかの実施形態では、抗原結合フラグメントは、重鎖相補性決定領域（heavy chain complementarity determining regions、ＨＣＤＲ）１、２、及び／若しくは３、軽鎖相補性決定領域（light chain complementarity determining regions、ＬＣＤＲ）１、２、及び／若しくは３、重鎖可変領域（ＶＨ）、又は軽鎖可変領域（ＶＬ）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、及びＦｖフラグメント、並びに１つのＶＨドメイン又は１つのＶＬドメインのいずれかを含む（例えば、それらからなる）ドメイン抗体（ｄＡｂ）である。ＶＨドメイン及びＶＬドメインは、リンカー、例えば、合成リンカーを介して一緒に連結され得る。
「相補性決定領域（Complementarity determining regions、ＣＤＲ）」は、抗体における抗原結合部位である。ＣＤＲは、様々な用語を使用して定義され得る：（ｉ）ＶＨ内に３つ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）及びＶＬ内に３つ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列多様性に基づいている（Ｗｕ ａｎｄ Ｋａｂａｔ，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １３２：２１１－５０，１９７０；Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１）。（ｉｉ）ＶＨ内に３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及びＶＬ内に３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）の「超可変性領域」、「ＨＶＲ」、又は「ＨＶ」は、Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９６：９０１－１７，１９８７）により定義されるとおり、構造において超可変性である、抗体可変ドメインの領域を指す。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ＿ｉｍｇｔ＿ｏｒｇ）は、抗原結合部位についての標準的番号及び定義を提供する。ＣＤＲ、ＨＶ、及びＩＭＧＴ概要説明の対応が、Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ Ｃｏｍｐａｒａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７：５５－７７，２００３に記載されている。本明細書で使用されている「ＣＤＲ」、「ＨＣＤＲ１」、「ＨＣＤＲ２」、「ＨＣＤＲ３」、「ＬＣＤＲ１」、「ＬＣＤＲ２」、及び「ＬＣＤＲ３」という用語は、本明細書において別途記載のない限り、上掲のＫａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、又はＩＭＧＴにより記載されている方法のいずれかにより定義されるＣＤＲを含む。
また、抗体又はその抗原結合部分は、例えば、放射性同位体、フルオロフォア（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（fluorescein isothiocyanate、ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（phycoerythrin、ＰＥ））、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、及び元素粒子（例えば、金粒子）などの検出可能な標識を含むように修飾され得る。
本開示によって提供されるのは、本明細書に記載のＣＡＲ、ポリペプチド、又はタンパク質（機能的部分及びその機能的変異体を含む）のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸である。
抗体又はその抗体フラグメントを含むＣＡＲの一部は、様々な形態で存在してもよく、その場合、抗原結合ドメインは、例えば、単一ドメイン抗体フラグメント（ｓｄＡｂ）、ｓｃＦｖ及びヒトキメラ抗体又はヒト化抗体などの連続するポリペプチド鎖の一部として発現される（Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９９９、Ｉｎ：Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．；Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９８９、Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｈｏｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３；Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６）。一態様では、本発明のＣＡＲ組成物の抗原結合ドメインは、抗体フラグメントを含む。一態様では、ＣＡＲは、ｓｃＦｖを含む抗体フラグメントを含む。
「組み換え抗体」という用語は、例えば、バクテリオファージ又は酵母発現系によって発現される抗体などの組み換えＤＮＡ技術を使用して生成される抗体を指す。用語は、抗体をコードするＤＮＡ分子の合成によって生成され、このＤＮＡ分子が抗体タンパク質、又は抗体を特定するアミノ酸配列を発現する抗体を意味すると解釈されるべきであり、その場合、ＤＮＡ又はアミノ酸配列は、利用可能であり当該技術分野において既知である組み換えＤＮＡ又はアミノ酸配列技術を使用して得られる。
「抗原」という用語は、免疫応答を引き起こす分子を指す。この免疫応答には、抗体産生、又は特定の免疫学的コンピテント細胞の活性化、あるいはその両方が含まれ得る。当業者は、実質的に全てのタンパク質又はペプチドを含む任意の高分子が抗原として機能し得ることを理解するであろう。更に、抗原は、組み換え又はゲノムＤＮＡに由来し得る。当業者であれば、任意のＤＮＡが、免疫応答を誘発するタンパク質をコードするヌクレオチド配列又は部分ヌクレオチド配列を含むことにより、本明細書中でその用語が使用されるとおりの「抗原」をコードすることを理解するであろう。更に、当業者であれば、抗原は、遺伝子の完全長ヌクレオチド配列によってのみコードされる必要はないことを理解するであろう。本開示が、２つ以上の遺伝子の部分的ヌクレオチド配列の使用を含むがこれに限定されないこと、及びこれらのヌクレオチド配列が、様々な組み合わせで配置されて、所望の免疫応答を誘発するポリペプチドをコードすることは明らかである。
一態様では、本開示は、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを提供し、本細胞外抗原結合ドメインは、ＧＰＲＣ５Ｄ抗原に結合する。
一態様では、本開示は、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを提供し、本細胞外抗原結合ドメインは、
配列番号６６のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号６７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、
配列番号５８のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号５９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、
配列番号３９のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号４０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、
配列番号４２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号４３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、又は
配列番号４５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号４６のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含み、
細胞外抗原結合ドメインは、ＧＰＲＣ５Ｄ抗原に結合する。
一態様では、本開示は、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを提供し、本細胞外抗原結合ドメインは、
配列番号６６のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号６７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、を含み、細胞外抗原結合ドメインは、ＧＰＲＣ５Ｄ抗原に結合する。
一態様では、本開示は、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを提供し、本細胞外抗原結合ドメインは、
配列番号５８のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号５９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、を含み、細胞外抗原結合ドメインは、ＧＰＲＣ５Ｄ抗原に結合する。
一態様では、本開示は、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを提供し、本細胞外抗原結合ドメインは、
配列番号３９のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号４０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、を含み、細胞外抗原結合ドメインは、ＧＰＲＣ５Ｄ抗原に結合する。
一態様では、本開示は、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを提供し、本細胞外抗原結合ドメインは、
配列番号４２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号４３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、を含み、細胞外抗原結合ドメインはＧＰＲＣ５Ｄ抗原に結合する。
一態様では、本開示は、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを提供し、本細胞外抗原結合ドメインは、配列番号４５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号４６のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含み、
細胞外抗原結合ドメインは、ＧＰＲＣ５Ｄ抗原に結合する。
一実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、
配列番号６６のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号６７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含み、配列番号６９のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号７０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号７１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を更に含む、細胞外抗原結合ドメイン、
配列番号５８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号５９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含み、配列番号６１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を更に含む、細胞外抗原結合ドメイン、
配列番号３９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号４０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含み、配列番号４８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４９のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を更に含む、細胞外抗原結合ドメイン、
配列番号４２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号４３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含み、配列番号５１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を更に含む、細胞外抗原結合ドメイン、又は
配列番号４５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号４６のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含み、配列番号５４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を更に含む、細胞外抗原結合ドメイン、を含む。
一態様では、本開示は、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを提供し、本細胞外抗原結合ドメインは、
配列番号６６、配列番号５８、配列番号３９、配列番号４２、及び配列番号４５、並びにこれらの保存的修飾からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１を含み、細胞外抗原結合ドメインは、ＧＰＲＣ５Ｄ抗原に結合する。
一態様では、本開示は、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを提供し、本細胞外抗原結合ドメインは、
配列番号６７、配列番号５９、配列番号４０、配列番号４３、及び配列番号４６、並びにこれらの保存的修飾からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２を含み、細胞外抗原結合ドメインは、ＧＰＲＣ５Ｄ抗原に結合する。
一態様では、本開示は、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを提供し、本細胞外抗原結合ドメインは、
配列番号６８、配列番号６０、配列番号４１、配列番号４４、及び配列番号４７、並びにこれらの保存的修飾からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含み、細胞外抗原結合ドメインは、ＧＰＲＣ５Ｄ抗原に結合する。
一態様では、本開示は、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを提供し、本細胞外抗原結合ドメインは、
配列番号６６、配列番号５８、配列番号３９、配列番号４２、及び配列番号４５、並びにこれらの保存的修飾からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、
配列番号６７、配列番号５９、配列番号４０、配列番号４３、及び配列番号４６、並びにこれらの保存的修飾からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び、
配列番号６８、配列番号６０、配列番号４１、配列番号４４、及び配列番号４７、並びにこれらの保存的修飾からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、を含み、
細胞外抗原結合ドメインは、ＧＰＲＣ５Ｄ抗原に結合する。
一態様では、本開示は、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを提供し、本細胞外抗原結合ドメインは、
配列番号６９、配列番号５４、配列番号４８、配列番号５１、及び配列番号５４、並びにこれらの保存的修飾からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１を含み、細胞外抗原結合ドメインは、ＧＰＲＣ５Ｄ抗原に結合する。
一態様では、本開示は、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを提供し、本細胞外抗原結合ドメインは、
配列番号７０、配列番号５５、配列番号４９、配列番号５２、及び配列番号５５、並びにこれらの保存的修飾からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２を含み、細胞外抗原結合ドメインは、ＧＰＲＣ５Ｄ抗原に結合する。
一態様では、本開示は、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを提供し、本細胞外抗原結合ドメインは、
配列番号７１、配列番号５６、配列番号５０、配列番号５３、及び配列番号５６、並びにこれらの保存的修飾からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含み、細胞外抗原結合ドメインは、ＧＰＲＣ５Ｄ抗原に結合する。
一態様では、本開示は、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを提供し、本細胞外抗原結合ドメインは、
配列番号６９、配列番号５４、配列番号４８、配列番号５１、及び配列番号５４、並びにこれらの保存的修飾からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号７０、配列番号５５、配列番号４９、配列番号５２、及び配列番号５５、並びにこれらの保存的修飾からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び、
配列番号７１、配列番号５６、配列番号５０、配列番号５３、及び配列番号５６、並びにこれらの保存的修飾からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含み、細胞外抗原結合ドメインは、ＧＰＲＣ５Ｄ抗原に結合する。
一態様では、本開示は、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを提供し、本細胞外抗原結合ドメインは、
配列番号６６、配列番号５８、配列番号３９、配列番号４２、及び配列番号４５、並びにこれらの保存的修飾からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、
配列番号６７、配列番号５９、配列番号４０、配列番号４３、及び配列番号４６、並びにこれらの保存的修飾からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び、
配列番号６８、配列番号６０、配列番号４１、配列番号４４、及び配列番号４７、並びにこれらの保存的修飾からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、及び、
配列番号６９、配列番号５４、配列番号４８、配列番号５１、及び配列番号５４、並びにこれらの保存的修飾からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号７０、配列番号５５、配列番号４９、配列番号５２、及び配列番号５５、並びにこれらの保存的修飾からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び、
配列番号７１、配列番号５６、配列番号５０、配列番号５３、及び配列番号５６、並びにこれらの保存的修飾からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、を含み、
細胞外抗原結合ドメインは、ＧＰＲＣ５Ｄ抗原に結合する。
一態様では、本開示は、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを提供し、本細胞外抗原結合ドメインは、
配列番号６６のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号６７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含み、配列番号６９のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号７０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号７１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を更に含む。
一態様では、本開示は、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを提供し、本細胞外抗原結合ドメインは、
配列番号５８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号５９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含み、配列番号６１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を更に含む。
一態様では、本開示は、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを提供し、本細胞外抗原結合ドメインは、
配列番号３９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号４０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含み、配列番号４８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４９のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を更に含む。
一態様では、本開示は、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを提供し、本細胞外抗原結合ドメインは、
配列番号４２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号４３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含み、配列番号５１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を更に含む。
一態様では、本開示は、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを提供し、本細胞外抗原結合ドメインは、
配列番号４５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号４６のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含み、配列番号５４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を更に含む。
一実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号７３、６５、１、３、及び５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、又は配列番号７２、６４、２、４、及び６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、又は配列番号７３、６５、１、３、及び５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲと、配列番号７２、６４、２、４、及び６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲとの組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号７３、６５、１、３又は５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む。いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号７３、６５、１、３、又は５のいずれか１つと少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む。いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号７３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む。いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号７３と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む。いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号６５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む。いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号６５と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む。いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む。いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号１と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む。いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む。いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号３と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む。いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む。いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号５と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む。
いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号７２、６４、２、４、又は６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む。いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号７２、６４、２、４、又は６のいずれか１つと少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む。いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号７２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む。いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号７２と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む。いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む。いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号６４と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む。いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号２と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む。いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む。いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号４と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む。いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号６と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む。
一実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号７３のアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号７２のアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、を含む。
一実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号６５のアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号６４のアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、を含む。
一実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号２のアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、を含む。
一実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号４のアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、を含む。
一実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号６のアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、を含む。
一実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号７３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号７２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、を含む。
一実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号６５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号６４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、を含む。
一実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを含む。
一実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを含む。
一実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを含む。
本明細書において、ＶＨドメインのアミノ酸配列が所与の参照ＶＨ配列と１００％未満の配列同一性を示す実施形態では、それでも、参照配列のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と同一である重鎖ＣＤＲを含み得、一方で、フレームワーク領域内のアミノ酸配列の変異を示す。同様に、ＶＬドメインのアミノ酸配列が所与の参照配列と１００％未満の配列同一性を示す実施形態では、それでも、参照配列のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３と同一である軽鎖ＣＤＲを含み得、一方で、フレームワーク領域内のアミノ酸配列の変異を示す。同様に、本開示のＣＡＲのｓｃＦｖ又は細胞外ドメインは、所与の参照ＶＨ配列と１００％未満の配列同一性を示す場合、それでも、参照配列のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３と同一である重鎖ＣＤＲ、及び参照配列のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３と同一である軽鎖ＣＤＲを含み得、一方で、フレームワーク領域内のアミノ酸配列の変異を示す。
一実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、軽鎖可変領域と重鎖可変領域との間にリンカーポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号７８、７７、７５、７６、８、９、１０、２４、２５及び２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むｓｃＦｖであり、ＧＰＲＣ５Ｄポリペプチド（例えば、配列番号５７のアミノ酸配列を有するヒトＧＰＲＣ５Ｄポリペプチド又はそのフラグメント）に特異的に結合するｓｃＦｖである。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端まで、ＶＨ、リンカー、及びＶＬ（ＶＨ－リンカー－ＶＬ）を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端まで、ＶＬ、リンカー、及びＶＨ（ＶＬ－リンカー－ＶＨ）を含む。
組み換え発現系において、リンカーはペプチドリンカーであり、任意の天然に存在するアミノ酸を含み得る。リンカーに含まれ得る例示的なアミノ酸は、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ及びＴｈｅである。リンカーは、ＧＰＲＣ５Ｄへの結合などの所望の活性を保持するように、互いに正しい立体構造を形成するように、ＶＨ及びＶＬを連結するために十分な長さを有する必要がある。
リンカーは、約５～５０個のアミノ酸長であり得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、約１０～４０個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、約１０～３５個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、約１０～３０個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、約１０～２５個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、約１０～２０個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、約１５～２０個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは６個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは７個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは８個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは９個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは１０個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは１１個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは１２個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは１３個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは１４個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは１５個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは１６個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは１７個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは１８個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは１９個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは２０個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは２１個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは２２個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは２３個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは２４個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは２５個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは２６個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは２７個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは２８個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは２９個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは３０個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは３１個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは３２個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは３３個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは３４個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは３５個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは３６個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは３７個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは３８個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは３９個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは４０個のアミノ酸長である。使用され得る例示的なリンカーは、Ｇｌｙリッチリンカー、Ｇｌｙ及びＳｅｒ含有リンカー、Ｇｌｙ及びＡｌａ含有リンカー、Ａｌａ及びＳｅｒ含有リンカー、並びに及び他の柔軟なリンカーである。
一実施形態では、リンカーポリペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列を含む。
他のリンカー配列は、免疫グロブリン重鎖又は軽鎖アイソタイプに由来する免疫グロブリンヒンジ領域、ＣＬ又はＣＨ１の部分を含み得る。使用され得る例示的なリンカーを表１に示す。追加のリンカーは、例えば、国際公開第ＷＯ２０１９／０６０６９５号に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一実施形態では、リンカーポリペプチドは、配列番号９１～１２３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
Figure 0007303314000001
一実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号７８、７７、７５、７６、８、９、１０、２４、２５、及び２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号７８、７７、７５、７６、８、９、１０、２４、２５及び２６のいずれか１つと少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号７８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号７８と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号７７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号７７と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号７５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号７５と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号７６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号７６と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号８と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号９と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１０と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号２４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号２４と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号２５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号２５と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、配列番号２６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号２６と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。
一実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、シグナルポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、シグナルポリペプチドは、配列番号１１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号１１と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。
一態様では、本開示は、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを提供し、本細胞外抗原結合ドメインは、配列番号８２、８１、８０、７９、１７、１８、１９、２０、２１、及び２２からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。配列番号８２、８１、８０、７９、１７、１８、１９、２０、２１及び２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む細胞外抗原結合ドメインを有するＣＡＲの別の特徴は、細胞外抗原結合ドメインがＧＰＲＣ５Ｄ抗原に結合することである。
一実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー９（ＣＤ１３７）成分、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３ゼータ鎖（ＣＤ３ｚ）成分、分化クラスタ（ＣＤ２７）成分、分化クラスタスーパーファミリーメンバー（例えば、ＣＤ２８又は誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）など）成分、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるポリペプチド成分を含む。
一実施形態では、ＣＤ１３７成分は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１３７成分は、配列番号１２と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。
一実施形態では、ＣＤ３ｚ成分は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ｚ成分は、配列番号１３と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ１３７成分及びＣＤ３ｚ成分を含む。
一実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１４と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。
ＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ８の膜貫通ドメイン、Ｔ細胞受容体のα、β、若しくはζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ－１（ＣＤＩ ｌａ、ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４－１ ＢＢ（ＣＤ１３７）、４－１ ＢＢＬ、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦＩ）、ＣＤ１６０、ＣＤ１ ９、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒ ａ、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤＩ Ｉｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤＩ ｌａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤＩ ｌｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤＩ ｌｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１ ８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（触覚）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ ＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙｌ０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、及び／又はＮＫＧ２Ｃに由来し得る。
一実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８ａ膜貫通領域（ＣＤ８Ａ－ＴＭ）ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８ａ－ＴＭポリペプチドは、配列番号１５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８ａ－ＴＭポリペプチドは、配列番号１５と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。
一実施形態では、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のα、β又はζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、又はＣＤ１５４の膜貫通領域を少なくとも含む。別の実施形態では、膜貫通ドメインは、ζ、η、又はＦｃεＲ１γ、及び－β、ＭＢ１（Ｉｇα）、Ｂ２９又はＣＤ３－γ、ζ、又はηの膜貫通ドメインを少なくとも含む。別の実施形態では、膜貫通ドメインは合成であり、例えば、ロイシン及びバリン、フェニルアラニンのトリプレット、又はトリプトファンなどの疎水性の残基を主に含む。
一実施形態では、ＣＡＲは、膜貫通ドメインを細胞外抗原結合ドメインに連結するヒンジ領域を更に含む。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、ＣＤ８ａヒンジ領域である。いくつかの実施形態では、ＣＤ８ａヒンジ領域は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８ａヒンジ領域は、配列番号１６と少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９８、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号１２４）を含む、又はＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号１２４）と少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９８、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、配列ＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号１２５）を含む、又はＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号１２５）と少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９８、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、配列ＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＣＰＲＣＰ（ＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰ）３（配列番号１２６）を含む、又はＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＣＰＲＣＰ（ＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰ）３（配列番号１２６）と少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９８、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、配列ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰ（配列番号１２７）を含む、又はＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰ（配列番号１２７）と少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９８、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメイン、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む。かかる一実施形態では、ヒンジ領域はＣＤ８αヒンジ領域であり、膜貫通ドメインはＣＤ８α－ＴＭドメインであり、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３－ゼータドメイン及び４－１ＢＢ／ＣＤ１３７ドメインを含む。かかる一実施形態では、ヒンジ領域は、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤ８αヒンジ領域であり、膜貫通ドメインは、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤ８α－ＴＭドメインであり、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３－ゼータドメイン及び４－１ＢＢ／ＣＤ１３７ドメインを含み、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号８２、８１、８０、７９、１７、１８、１９、２０、２１、及び２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号８２、８１、８０、７９、１７、１８、１９、２０、２１、及び２２のいずれか１つと少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号８２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号８２と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号８１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号８１と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号８０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号８０と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号７９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号７９と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号１７と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号１８と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号１９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号１９と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号２０と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号２１と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号２２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号２２と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。
一実施形態では、本開示のＣＡＲは、配列番号８６、８５、８３、８４、２７、２８、２９、３０、３１及び３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲは、配列番号８６、８５、８３、８４、２７、２８、２９、３０、３１、及び３２のいずれか１つと、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲは、配列番号８６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲは、配列番号８６と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲは、配列番号８５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲは、配列番号８５と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲは、配列番号８３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲは、配列番号８３と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲは、配列番号８４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲは、配列番号８４と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲは、配列番号２７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲは、配列番号２７と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲは、配列番号２８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲは、配列番号２８と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲは、配列番号２９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲは、配列番号２９と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲは、配列番号３０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲは、配列番号３０と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲは、配列番号３１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲは、配列番号３１と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲは、配列番号３２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲは、配列番号３２と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、シグナルペプチドを含み得る。ある特定の実施形態では、シグナルペプチドは、ＣＡＲ配列のＮ末端にある。ある特定の実施形態では、シグナルペプチドは、ＣＡＲ配列のＣ末端にある。ある特定の実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号１１のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。
ＣＡＲ構築物及びＣＡＲを発現する免疫応答性細胞
一態様では、本開示は、本明細書に記載のＣＡＲをコードする単離された核酸分子を提供する。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号９０、８９、８７、８８、３３、３４、３５、３６、３７、及び３８からなる群から選択される核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号９０、８９、８７、８８、３３、３４、３５、３６、３７又は３８のヌクレオチド配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号９０の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号９０のヌクレオチド配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号８９の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号８９のヌクレオチド配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号８７の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号８７のヌクレオチド配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号８８の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号８８のヌクレオチド配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号３３の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号３３のヌクレオチド配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号３４の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号３４のヌクレオチド配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号３５の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号３５のヌクレオチド配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号３６の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号３６のヌクレオチド配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号３７の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号３７のヌクレオチド配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号３８の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号３８のヌクレオチド配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。
「コード（すること）」という用語は、ヌクレオチドの定義された配列（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ及びｍＲＮＡ）又はアミノ酸の定義された配列のいずれかを有する、生物学的プロセスにおける他のポリマー及び高分子の合成のためのテンプレートとして機能する、遺伝子、ｃＤＮＡ、又はｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特異的配列の固有の特性、並びにそれから生じる生物学的特性を指す。したがって、細胞又は他の生物系において、遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写及び翻訳がタンパク質を生成する場合、その遺伝子、ｃＤＮＡ、又はＲＮＡは、タンパク質をコードする。ヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であるコード鎖と、遺伝子又はｃＤＮＡの転写のテンプレートとして使用される非コード鎖はどちらも、その遺伝子又はｃＤＮＡのタンパク質又は他の産物をコードするとして言及され得る。
別途記載のない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの縮重型であるヌクレオチド配列、及び同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列全てを包含する。タンパク質又はＲＮＡをコードするヌクレオチド配列という句はまた、いくつかの場合においてそのタンパク質をコードするヌクレオチド配列がイントロンを含有し得る程度にイントロンを包含し得る。
「単離された」という用語は、組み換え細胞などの分子が産生される系の他の成分から実質的に分離及び／又は精製された分子の均質な集団（例えば、合成ポリヌクレオチド又は合成ポリペプチド）に加えて、少なくとも１つの精製又は単離工程に供されたタンパク質を指す。「単離された」は、他の細胞材料及び／又は化学物質を実質的に含まない分子を指し、より高い純度、例えば８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の純度まで単離された分子を包含する。
いくつかの実施形態では、本開示は、記載される核酸分子（例えば、配列番号９０、８９、８７、８８、３３、３４、３５、３６、３７、又は３８）を含む発現ベクターを提供する。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号９０、８９、８７、８８、３３、３４、３５、３６、３７又は３８のヌクレオチド配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。
いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号９０の核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号９０のヌクレオチド配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号８９の核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号８９のヌクレオチド配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号８７の核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号８７のヌクレオチド配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号８８の核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号８８のヌクレオチド配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号３３の核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号３３のヌクレオチド配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号３４の核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号３４のヌクレオチド配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号３５の核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号３５のヌクレオチド配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号３６の核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号３６のヌクレオチド配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号３７の核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号３７のヌクレオチド配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号３８の核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号３８のヌクレオチド配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。
記載された核酸分子は、配列番号８６、８５、８３、８４、２７、２８、２９、３０、３１及び３２からなる群から選択される配列を有するアミノ酸、又はこれらの変異体をコードする。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号８６のアミノ酸配列をコードする核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号８６のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号８５のアミノ酸配列をコードする核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号８５のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号８３のアミノ酸配列をコードする核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号８３のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号８４のアミノ酸配列をコードする核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号８４のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号２７のアミノ酸配列をコードする核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号２８のアミノ酸配列をコードする核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、配列番号２８のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号２９のアミノ酸配列をコードする核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号２９のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号３０のアミノ酸配列をコードする核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、配列番号３０のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号３１のアミノ酸配列をコードする核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号３２のアミノ酸配列をコードする核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸分子を含む。
本明細書では、核酸分子の構造は、列挙された参照配列（所与の配列番号を有する）と％配列同一性に基づいて適切に定義されている。これに関連して、核酸分子に関する％配列同一性は、少なくとも２つの異なる核酸配列間の類似性を指す。２つの比較された配列の両方の位置が同じ塩基によって占められている場合、例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれの位置がアデニンによって占められている場合、分子はその位置で同一であり、２つの配列間における同一性の割合は、２つの配列によって共有される位置での一致又は相同である数の関数であり、比較された位置の数で除算し、１００を乗算したものである。例えば、２つの配列の１０個の位置のうち６個が一致又は相同である場合、２つの配列は６０％同一（又は相同）である。例として、ＤＮＡ配列ＡＴＴＧＣＣ及びＴＡＴＧＧＣは、５０％の同一性（又は相同性）を共有する。概ね、２つの配列がアライメントされて最大相同性を与える場合に比較が行われる。それぞれの同一性パーセントは、標準的なアラインメントアルゴリズム、例えば、Ａｌｔｓｈｕｌ ｅｔ ａｌ．によって記載されるＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（（１９９０）Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０）；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．のアルゴリズム（（１９７０）Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４－５３）；又はＭｅｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．のアルゴリズム（（１９８８）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．４：１１－１７）によって判定することができる。パラメータのセットは、ギャップペナルティが１２、ギャップ伸長ペナルティが４、フレームシフトギャップペナルティが５のＢｌｏｓｕｍ６２スコアリングマトリックスであり得る。２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＭｅｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ（（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ ４：１１－１７）のアルゴリズムを使用して、ＰＡＭ１２０重み付き残基表を使用してギャップ長ペナルティ１２及びギャップペナルティ４で、判定することができる。同一性パーセントは、通常、同様の長さの配列を比較することによって計算される。
「発現ベクター」という用語は、発現させるヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列を含む組み換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現に十分なシス作用エレメントを含み、発現のための他のエレメントは、宿主細胞によって、又はｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系において供給され得る。発現ベクターとしては、組み換えポリヌクレオチドを組み込んだコスミド、プラスミド（例えば、裸の、又はリポソームに含有されるもの）、及びウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）を含む、当該技術分野において既知の全てのベクターが挙げられる。
一実施形態では、本開示は、本明細書に記載の核酸分子を発現する細胞を提供する。一実施形態では、本開示は、本開示のＣＡＲを発現する細胞を提供する。一実施形態では、本開示のＣＡＲは、配列番号８６、８５、８３、８４、２７、２８、２９、３０、３１及び３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲは、配列番号８６、８５、８３、８４、２７、２８、２９、３０、３１及び３２のいずれか１つと、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号８６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号８５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号８３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号８４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号３０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号３１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号３２のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号８６と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号８５と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号８３と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号８４と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２７と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２８と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２９と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号３０と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号３１と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号３２と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。
一態様では、本開示は、本明細書に記載のＣＡＲを含む単離された免疫応答性細胞を提供する。いくつかの実施形態では、単離された免疫応答性細胞は、ＣＡＲで形質導入される、例えば、ＣＡＲは、免疫応答性細胞の表面上に構成的に発現される。ある特定の実施形態では、単離された免疫応答性細胞は、少なくとも１つの共刺激リガンドで更に形質導入され、免疫応答性細胞が少なくとも１つの共刺激リガンドを発現するようにする。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの共刺激リガンドは、４－１ＢＢＬ、ＣＤ４８、ＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＯＸ４０Ｌ、ＴＮＦＲＳＦ１４、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、単離された免疫応答性細胞は、少なくとも１つのサイトカインで更に形質導入され、免疫応答性細胞が少なくとも１つのサイトカインを分泌するようにする。ある特定の実施形態では、少なくともサイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－２１、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、単離された免疫応答性細胞は、Ｔリンパ球（Ｔ細胞）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、調節性Ｔ細胞、ヒト胚性幹細胞、リンパ系前駆細胞、Ｔ細胞前駆細胞、及びリンパ系細胞が分化する可能性のある多能性幹細胞からなる群から選択される。
ＣＡＲをコードする本発明の核酸配列は、「トランスフェクション」、「形質転換」、又は「形質導入」によって細胞に導入され得る。本明細書で使用するとき、「トランスフェクション」、「形質転換」、又は「形質導入」は、物理的又は化学的方法を使用することによって、宿主細胞への１つ又は２つ以上の外因性ポリヌクレオチドを導入することを指す。多くのトランスフェクション技術は、当該技術分野において既知であり、例えば、リン酸カルシウムＤＮＡ共沈殿法（例えば、Ｍｕｒｒａｙ Ｅ．Ｊ．（ｅｄ．），Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）を参照）；ＤＥＡＥ－デキストラン法；エレクトロポレーション法；カチオン性リポソーム媒介性トランスフェクション法；タングステン粒子促進微小粒子衝撃法（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，３４６：７７６－７７７（１９９０））；及びリン酸ストロンチウムＤＮＡ共沈殿法（Ｂｒａｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，７：２０３１－２０３４（１９８７））が挙げられる。ファージベクター又はウイルスベクターは、好適なパッケージング細胞中の感染性粒子の成長後、宿主細胞に導入することができ、これらの多くは市販されている。
一実施形態では、本開示のＣＡＲ Ｔ細胞は、所望のＣＡＲ、例えば、抗ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＤ８αヒンジ及び膜貫通ドメイン、並びにヒト４－１ＢＢ及びＣＤ３－ゼータシグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを含むレンチウイルスベクターを、細胞に導入することによって生成され得る。本発明のＣＡＲ Ｔ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで複製することができ、持続的な腫瘍制御につながる可能性のある長期持続性をもたらす。
本発明の実施形態は、本明細書に記載の組み換え発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞を更に提供する。本明細書で使用するとき、「宿主細胞」という用語は、組み換え発現ベクターを含有し得る任意のタイプの細胞を指す。宿主細胞は、真核細胞、例えば、植物、動物、若しくは藻類、真菌であり得るか、又は、原核細胞、例えば、細菌若しくは原生動物であり得る。宿主細胞は、培養細胞又は初代細胞であり得る、すなわち、生物、例えば、ヒトから直接単離され得る。宿主細胞は、接着細胞又は浮遊細胞、すなわち、懸濁物中で増殖する細胞であり得る。好適な宿主細胞は、当該技術分野において既知であり、例えば、ＤＨ５α大腸菌細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、サルＶＥＲＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３細胞などが挙げられる。組み換え発現ベクターを増幅又は複製する目的で、宿主細胞は、原核細胞、例えば、ＤＨ５α細胞であり得る。組み換えＣＡＲ、ポリペプチド、又はタンパク質を産生する目的で、宿主細胞は、哺乳動物細胞であり得る。宿主細胞はヒト細胞であり得る。宿主細胞は、任意の細胞タイプのものであり得る、任意の組織タイプに由来し得、任意の発達段階のものであり得るが、宿主細胞は末梢血リンパ球（peripheral blood lymphocyte、ＰＢＬ）であり得る。宿主細胞はＴ細胞であり得る。
本明細書の目的のために、Ｔ細胞は、培養Ｔ細胞（例えば、初代Ｔ細胞）、又は培養Ｔ細胞株（例えば、Ｊｕｒｋａｔ、ＳｕｐＴ１など）からのＴ細胞、又は哺乳動物から得られたＴ細胞など、任意のＴ細胞であり得る。哺乳動物から得られる場合、Ｔ細胞は、多数の供給源（骨髄、血液、リンパ節、胸腺、又は他の組織若しくは体液を含むが、これらに限定されない）から得ることができる。Ｔ細胞はまた、濃縮又は精製され得る。Ｔ細胞は、ヒトＴ細胞であり得る。Ｔ細胞は、ヒトから単離されたＴ細胞であり得る。Ｔ細胞は、任意のタイプのＴ細胞であり得、任意の発達段階のもの（ＣＤ４＋／ＣＤ８＋二重陽性Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞（例えば、Ｔｈ１及びＴｈ２細胞）、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、末梢血白血球（ＰＢＬ）、腫瘍浸潤細胞、記憶Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞などが含まれるが、これらに限定されない）であり得る。Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞又はＣＤ４＋Ｔ細胞であり得る。
Ｔ細胞はまた、「ＮＫＴ細胞」を含み得る。ＮＫＴ細胞は、半不変のαβＴ細胞受容体を発現するＴ細胞の特殊な集団を指すが、ＮＫ１．１などのＮＫ細胞に通常関連する様々な分子マーカーも発現する。ＮＫＴ細胞としては、ＮＫ１．１＋及びＮＫ１．１－、並びにＣＤ４＋、ＣＤ４－、ＣＤ８＋、及びＣＤ８細胞が挙げられる。ＮＫＴ細胞のＴＣＲは、ＭＨＣ Ｉ様分子ＣＤ Ｉｄによって提示される糖脂質抗原を認識するという点で独特である。ＮＫＴ細胞は、炎症又は免疫寛容のいずれかを促進するサイトカインを産生する能力により、保護効果又は有害効果のいずれかを有し得る。また、「ガンマデルタＴ細胞（γδＴ細胞）」も含まれる。ガンマデルタＴ細胞は、それらの表面に異なるＴＣＲを有するＴ細胞の小さなサブセットの特殊な集団を指し、ＴＣＲがα及びβ－ＴＣＲ鎖と表記される２つの糖タンパク質鎖から構成されるＴ細胞の大部分とは異なる。γδＴ細胞におけるＴＣＲは、γ鎖及びδ鎖から構成される。γδＴ細胞は、免疫監視及び免疫調節において役割を果たすことができ、ＩＬ－１７の重要な供給源であること、及び活発なＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導することが見出された。また、異常又は過剰な免疫応答を抑制し、免疫寛容における役割を果たすＴ細胞を指す「調節性Ｔ細胞」又は「Ｔｒｅｇ」も含まれる。Ｔｒｅｇ細胞は、典型的には、転写因子Ｆｏｘｐ３陽性ＣＤ４＋Ｔ細胞であり、また、ＩＬ－１０産生ＣＤ４＋Ｔ細胞である転写因子Ｆｏｘｐ３陰性調節性Ｔ細胞も含み得る。
Ｔ細胞株は、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）、及びＧｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＤＳＭＺ）から入手可能であり、例えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ－１５２）、Ｓｕｐ－Ｔｌ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１９４２）、ＲＰＭＩ ８４０２細胞（ＤＳＭＺ ＡＣＣ－２９０）、Ｋａｒｐａｓ ４５細胞（ＤＳＭＺ ＡＣＣ－５４５）、及びこれらの誘導体が挙げられる。
別の実施形態では、宿主細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。ＮＫ細胞は、先天性免疫系において役割を果たす細胞傷害性リンパ球の一種である。ＮＫ細胞は、大顆粒リンパ球として定義され、Ｂリンパ球及びＴリンパ球を更に生み出すリンパ球系共通前駆細胞から分化された第３のタイプの細胞を構成する（例えば、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（２００１）を参照されたい）。ＮＫ細胞は、骨髄、リンパ節、脾臓、扁桃腺、及び胸腺において分化及び成熟する。成熟後、ＮＫ細胞は、特徴的な細胞傷害性顆粒を有する大きなリンパ球として循環する。ＮＫ細胞は、一定の異常細胞（例えば、一定の腫瘍細胞及びウイルス感染細胞など）を認識して死滅させることができ、細胞内病原体に対する先天性免疫防御において重要であると考えられる。Ｔ細胞に関して上述したように、ＮＫ細胞は、任意のＮＫ細胞（培養ＮＫ細胞、例えば、初代ＮＫ細胞、又は培養ＮＫ細胞株からのＮＫ細胞、又は哺乳動物から得られるＮＫ細胞など）であり得る。哺乳動物から得られる場合、ＮＫ細胞は、多数の供給源（血液、骨髄、リンパ節、胸腺、又は他の組織若しくは体液を含むが、これらに限定されない）から得ることができる。ＮＫ細胞はまた、濃縮又は精製され得る。ＮＫ細胞は、好ましくはヒトＮＫ細胞（例えば、ヒトから単離される）である。ＮＫ細胞株は、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手可能であり、例えば、ＮＫ－９２細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２４０７）、ＮＫ９２ＭＩ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２４０８）、及びこれらの誘導体が挙げられる。
本明細書に記載の少なくとも１つの宿主細胞を含む細胞集団も提供される。細胞集団は、少なくとも１つの他の細胞、例えば、組み換え発現ベクターのいずれも含まない宿主細胞（例えば、Ｔ細胞）、又はＴ細胞以外の細胞（例えば、Ｂ細胞、マクロファージ、赤血球、好中球、肝細胞、内皮細胞、上皮細胞、筋細胞、脳細胞など）に加えて、記載される組み換え発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞を含む不均質な集団であり得る。代替的に、細胞集団は、実質的に均質な集団であり得、この場合、その集団は、組み換え発現ベクターを含む宿主細胞を主に含む（例えば、本質的にそれらからなる）。集団はまた、細胞のクローン集団であり得、この場合、集団の全ての細胞が組み換え発現ベクターを含む単一の宿主細胞のクローンであり、そのため、集団の全ての細胞は組み換え発現ベクターを含む。一実施形態では、細胞集団は、本明細書に記載の組み換え発現ベクターを含む宿主細胞を含むクローン集団である。
医薬組成物／投与
本開示の実施形態では、ＣＡＲ発現細胞は、組成物、例えば、ＣＡＲ発現細胞及び医薬的に許容される担体を含む好適な医薬組成物で提供され得る。一態様では、本開示は、記載される１つ又は２つ以上のＣＡＲを発現する有効量のリンパ球及び医薬的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。本開示の医薬組成物は、ＣＡＲ発現細胞、例えば、本明細書に記載されるような複数のＣＡＲ発現細胞を、１つ又は２つ以上の医薬的又は生理学的に許容される担体、賦形剤、又は希釈剤と組み合わせて含み得る。医薬的に許容される担体は、対象に対して無毒性である有効成分以外の医薬組成物中の成分であり得る。
医薬的に許容される担体としては、緩衝液、賦形剤、安定剤、又は防腐剤が挙げられ得るが、これらに限定されない。医薬的に許容される担体の例は、生理学的に適合性の溶剤、分散媒体、コーティング剤、抗菌及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延剤などであり、例えば、塩、緩衝液、抗酸化剤、糖類、水性若しくは非水性担体、防腐剤、湿潤剤、界面活性剤、若しくは乳化剤、又はこれらの組み合わせである。医薬組成物中の医薬的に許容される担体の量は、担体の活性及び製剤の所望の特性、例えば、安定性及び／又は最小酸化に基づいて実験的に判定され得る。
かかる組成物は、酢酸、クエン酸、ギ酸、コハク酸、リン酸、炭酸、リンゴ酸、アスパラギン酸、ヒスチジン、ホウ酸、トリス緩衝液、ＨＥＰＰＳＯ、ＨＥＰＥＳ、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液；グルコース、マンノース、スクロース又はデキストラン、マンニトールなどの炭水化物；タンパク質；グリシンなどのポリペプチド又はアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡ又はグルタチオンなどのキレート剤；アジュバント（例えば水酸化アルミニウム）；抗菌剤及び抗真菌剤；並びに防腐剤を含み得る。
本開示の組成物は、非経口投与又は経口（non-parenteral）投与の様々な手段のために製剤化され得る。一実施形態では、組成物は、注入又は静脈内投与向けに製剤化され得る。本明細書に開示される組成物は、例えば、無菌液体調製物（例えば、等張水溶液、乳剤、懸濁液、分散液、又は粘性組成物）として提供することができ、これらは、望ましいｐＨに緩衝され得る。経口投与に好適な製剤としては、液体溶液、カプセル剤、サッシェ剤、タブレット剤、ドロップ剤、及びトローチ剤、適切な液体及び乳剤中の粉末液体懸濁液を挙げることができる。
医薬組成物に関して本明細書で使用するとき、「医薬的に許容される」という用語は、動物及び／又はヒトにおける使用について、連邦政府若しくは州政府の規制機関によって承認されているか、又は米国薬局方若しくは他の一般に認められている薬局方に列挙されていることを意味する。
一態様では、本開示は、癌を有するか又は癌を有するリスクがある対象の治療のために、リンパ球注入を使用して、ＣＡＲを発現する遺伝子改変Ｔ細胞を投与することに関する。少なくとも１つの実施形態では、自己リンパ球注入が治療に使用される。自己ＰＢＭＣは、治療を必要とする対象から収集され、本明細書に記載され当該技術分野において既知の方法を使用して、Ｔ細胞を活性化及び増殖して、次いで対象に注入して戻される。
一態様では、本開示は、概して、癌を発症するリスクのある対象の治療に関する。本発明はまた、対象における化学療法及び／又は免疫療法により著しい免疫抑制がもたらされ、それによって癌を発症する対象のリスクを増加させる、悪性腫瘍又は自己免疫疾患を治療することも含む。一態様では、本開示は、癌を予防する方法を提供し、本方法は、記載される１つ又は２つ以上のＣＡＲを発現するリンパ球の量を、それを必要とする対象に投与することを含む。
一態様では、本開示は、癌を有する対象を治療する方法を提供し、本方法は、記載される１つ又は２つ以上のＣＡＲを発現する治療有効量のリンパ球を、それを必要とする対象に投与することを含み、それにより、リンパ球は対象における癌細胞の死滅を誘導又は調節する。
別の態様では、本開示は、癌を有する対象における腫瘍量を低減する方法を提供し、本方法は、記載される１つ又は２つ以上のＣＡＲを発現する治療有効量のリンパ球を、それを必要とする対象に投与することを含み、それにより、リンパ球は対象における癌細胞の死滅を誘導する。別の態様では、本開示は、癌を有する対象の生存期間を増加させる方法を提供し、本方法は、記載される１つ又は２つ以上のＣＡＲを発現する治療有効量のリンパ球を、それを必要とする対象に投与することを含み、それにより、対象の生存期間が長くなる。概ね、ＣＡＲを発現するリンパ球により、対象における癌細胞の死滅が誘導され、対象における腫瘍／癌細胞の低減又は根絶がもたらされる。標的化され得る転移性病変を含む、癌の非限定的なリストには、肺癌、胃癌、結腸癌、肝細胞癌、腎細胞癌、膀胱尿路上皮癌、転移性黒色腫、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、頭頸部癌、膵臓癌、神経膠腫、神経膠芽腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、くすぶり型多発性骨髄腫（ＳＭＭ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、及びこれらの組み合わせが含まれる。一実施形態では、対象において治療される癌は、多発性骨髄腫である。
一態様では、本明細書に記載の方法は、癌性状態（例えば、ＭＭ又はリンパ腫などの血液癌に発展するリスクがある意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症（monoclonal gammopathy of undetermined significance、ＭＧＵＳ）、及び白血病などの血液癌に発展するリスクのある骨髄異形成症候群など）に発展するリスクがある非癌性状態の治療に適用可能である。
一態様では、癌を有する対象を治療する方法が提供される。該方法は、ＧＰＲＣ５Ｄ抗原に結合する細胞外抗原結合ドメインを有するＣＡＲを発現する治療有効量のリンパ球を、それを必要とする対象に投与することを含み、それにより、リンパ球は対象における癌細胞の死滅を誘導する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＣＡＲは、配列番号８６、８５、８３、８４、２７、２８、２９、３０、３１及び３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
一態様では、癌細胞の標的化死滅の方法が開示される。該方法は、癌細胞を、記載される１つ又は２つ以上のＣＡＲを発現するリンパ球と接触させることを含み、それにより、リンパ球は癌細胞の死滅を誘導する。標的化され得る転移性癌細胞を含む癌細胞の非限定的なリストには、肺癌細胞、胃癌細胞、結腸癌細胞、肝細胞癌細胞、腎細胞癌細胞、膀胱尿路上皮癌細胞、転移性黒色腫細胞、乳癌細胞、卵巣癌細胞、子宮頸癌細胞、頭頸部癌細胞、膵臓癌細胞、神経膠腫細胞、神経膠芽腫細胞、及び非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）細胞、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）細胞、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）細胞、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞、くすぶり型多発性骨髄腫（ＳＭＭ）細胞、多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞、及びこれらの組み合わせが含まれる。一実施形態では、癌細胞は、多発性骨髄腫細胞である。
本開示の医薬組成物は、治療される（又は予防される）疾患に適切な方法で投与され得る。投与の量及び頻度は、対象の状態、対象の疾患のタイプと重症度などの要因によって判定されるが、適切な投与量は臨床試験によって判定され得る。
「処置する」又は「処置」という用語は、所望されない生理的変化若しくは疾患を遅延する（減らす）こと、又は処置中に有益な若しくは所望される臨床的結果をもたらすことが目的である、治療的処置を指す。有益な若しくは所望の臨床転帰としては、検出可能又は検出不可能であるかどうかにかかわらず、症状の緩和、疾患の程度の軽減、安定した（すなわち、悪化しない）疾患状態、疾患の進行の遅延又は鈍化、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解（部分的又は全体的であるかどうかにかかわらず）が挙げられる。「治療」はまた、対象が治療を受けていない場合に予想される生存期間と比較して、生存期間を延長させることを意味し得る。治療を必要とする対象としては、所望されない生理的変化又は疾患をすでに有している対象、並びに生理的変化又は疾患を有しやすい傾向がある対象が含まれる。
本明細書において互換的に使用される「治療有効量」又は「有効量」は、必要な投薬量及び期間で、所望される治療結果を得るために有効な量を指す。治療有効量は、個体の病態、年齢、性別、及び体重などの要因、並びに個体において所望の応答を誘発する治療薬又は治療薬の組み合わせの能力によって様々であってよい。有効な治療剤又は治療剤の組み合わせの指標の例としては、例えば、患者の健康状態の改善、腫瘍量の減少、腫瘍の成長の停止若しくは鈍化、及び／又は体内の他の場所への癌細胞の転移の不在が含まれる。
本明細書で使用するとき、「対象」という用語は、動物を指す。「対象」及び「患者」という用語は、対象に関して本明細書で互換的に使用されてもよい。したがって、「対象」は、患者として、疾患、又は疾患の予防のために治療されるヒトを含む。
本明細書に記載の方法は、任意の分類に属する動物対象を治療するために使用され得る。かかる動物の例としては、哺乳動物が挙げられる。哺乳動物としては、ネズミ目（マウス及びハムスターなど）の哺乳動物、及びウサギ目（ウサギなど）の哺乳動物が挙げられるが、これらに限定されない。哺乳動物は、ネコ科動物（ネコ）及びイヌ科動物（イヌ）を含む食肉目からのものであり得る。哺乳動物は、ウシ亜科動物（ウシ）及びイノシシ科動物（ブタ）を含む偶蹄目、又はウマ科動物（ウマ）を含む奇蹄目からのものであり得る。哺乳動物は、サル目、セボイド（Ceboid）目、若しくはシモイド（Simoid）目（サル）、又は真猿亜目（ヒト及び類人猿）であり得る。一実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。
治療有効量が示される場合、投与される本開示の組成物の正確な量は、対象の年齢、体重、腫瘍サイズ、感染又は転移の程度、及び状態における個々の差異を考慮して、医師によって判定され得る。本明細書に記載のＴ細胞を含む医薬組成物は、これらの範囲内の全ての整数値を含む、約１０４～約１０１０細胞／ｋｇ体重、場合によっては約１０５～約１０６細胞／ｋｇ体重の投与量で投与され得ることが概ね述べられ得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＴ細胞を含む医薬組成物は、約１０６細胞／体重ｋｇの投与量で投与され得る。Ｔ細胞組成物はまた、これらの投与量で複数回投与され得る。細胞は、免疫療法において通常に知られている注入技術を使用することによって投与することができる（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ Ｍｅｄ．３１９：１６７６，１９８８を参照）。
本発明の実施形態の文脈において有用な送達システムは、徐放性、遅延放出、及び持続性放出送達システムを含み得、Ｔ細胞組成物の送達が、治療される部位の感作の前に、そしてそれを引き起こすために十分な時間で行われるようにする。組成物は、他の治療剤又は療法と併用することができる。かかるシステムは、組成物の反復投与を回避することにより、対象及び医師に対する利便性を高めることができ、本発明における特定の組成物の実施形態に対して特に好適であり得る。
多くのタイプの放出送達システムが利用可能であり、当業者に既知である。これらには、ポリ（ラクチド－グリコリド）、コポリオキサレート、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、及びポリ無水物などのポリマーベースシステムが含まれる。前述の薬物含有ポリマーのマイクロカプセルは、例えば、米国特許第５，０７５，１０９号に記載されている。送達システムとしては、コレステロール、コレステロールエステル、及び脂肪酸などのステロール、又はモノ－ジ－グリセリド及びトリ－グリセリドなどの中性脂肪を含む脂質である非ポリマーシステム；シラスティック（sylastic）システム；ペプチドベースのシステム；ヒドロゲル放出システム；ワックスコーティング；従来の結合剤及び賦形剤を使用した圧縮錠剤；部分的に融合した埋め込みなども挙げられる。具体的な例としては、（ａ）マトリックス内に活性組成物が含有される形の侵食システム（例えば、米国特許第４，４５２，７７５号；同第４，６６７，０１４号；同第４，７４８，０３４号；及び同第５，２３９，６６０号に記載されたものなど）並びに（ｂ）活性成分がポリマーから制御された速度で透過する拡散システム（例えば、米国特許第３，８５４，４８０号及び同第３，８３２，２５３．号に記載されたものなど）が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、ポンプベースのハードウェア送達システムを使用することができ、その一部は埋め込みに適合されている。
特定の態様では、活性化Ｔ細胞を対象に投与し、その後、血液を再採取し（又はアフェレーシスを実施し）、本開示によるＴ細胞を活性化し、これらの活性化及び増殖したＴ細胞を対象に再注入することが望ましい場合がある。このプロセスは、数週間ごとに複数回実行することができる。特定の態様では、Ｔ細胞は、１０ｃｃ～４００ｃｃの採血から活性化され得る。特定の態様では、Ｔ細胞は、２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃ、又は１００ｃｃの採血から活性化される。
ＣＡＲ－Ｔ細胞及び組成物の投与は、任意の方法、例えば、非経口投与又は経口投与（エアロゾル吸入、注射、注入、経口摂取、輸血、埋め込み、又は移植を含む）によって実施することができる。例えば、本明細書に記載されるＣＡＲ－Ｔ細胞及び組成物は、経動脈、皮内、皮下、腫瘍内、髄内、節内、筋肉内経路で、静脈内（ｉ．ｖ．）注射によって、又は腹腔内経路で患者に投与され得る。一態様では、本開示の組成物は、ｉ．ｖ．注射によって投与される。一態様では、本開示の組成物は、皮内注射又は皮下注射によって対象に投与される。Ｔ細胞の組成物は、例えば、腫瘍、リンパ節、組織、器官、又は感染部位に直接注射することができる。
投与は、自己投与又は非自己投与であり得る。例えば、Ｇタンパク質共役型受容体（例えば、ＧＰＲＣ５Ｄ）特異的ＣＡＲを発現する免疫応答性細胞は、１つの対象から得られ、同じ対象又は異なる対象に投与され得る。本開示の末梢血由来Ｔ細胞、又は増殖Ｔ細胞（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏ由来）は、例えば、静脈内注射、局所注射、全身注射、カテーテル投与、又は非経口投与を介して投与することができる。
特定の実施形態では、対象は白血球アフェレーシスを受けることができ、その場合、白血球は、ｅｘ ｖｉｖｏで収集、濃縮、又は枯渇されて、対象となる細胞、例えば、Ｔ細胞を選択及び／又は単離する。これらの単離されたＴ細胞は、当該技術分野において既知の方法によって増殖させることができ、本開示の１つ又は２つ以上のＣＡＲ構築物が導入され得るように処理され、それによってＣＡＲ－Ｔ細胞を作製することができる。それを必要とする対象は、その後、高用量化学療法と、それに続く末梢血幹細胞移植による標準的な治療を受ける場合がある。特定の態様では、移植後又は移植と同時に、対象は、増殖したＣＡＲ－Ｔ細胞の注入を受ける。一態様では、増殖した細胞は、手術の前又は後に投与される。
悪性腫瘍を有する患者に投与される投与量は、治療される疾患を緩和するか、又は少なくとも部分的に阻止するために十分な量である（「治療有効量」）。対象に投与される上記治療の投与量は、治療される状態の正確な性質及び治療のレシピエントによって変化する。ヒト投与のための投与量のスケーリングは、当該技術分野において概ね受け入れられている慣行に従って実行することができる。
本発明のＣＡＲＴ Ｔ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏでのＴ細胞増殖を受けることができ、血中及び骨髄中で長期間にわたって高レベルで持続するＧＰＲＣ５Ｄ特異的記憶細胞を定着させることができる。いくつかの例では、対象に注入された本発明のＣＡＲ Ｔ細胞は、進行した化学療法抵抗性癌を有する対象において、ｉｎ ｖｉｖｏで癌細胞（例えば、白血病細胞）を排除することができる。
一実施形態では、本開示のＣＡＲは、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を使用して、Ｔ細胞に導入され、対象（例えば、ヒト）に、本開示のＣＡＲ－Ｔ細胞を初回投与して、ＣＡＲ－Ｔ細胞を１回又は２回以上後続投与する。その場合、１回又は２回以上の後続投与は、前回の投与後の１５日未満、例えば、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、又は２日で投与される。一実施形態では、ＣＡＲ－Ｔ細胞を対象（例えば、ヒト）に１週間に２回以上投与する、例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞を１週間に２、３、又は４回投与する。一実施形態では、対象に、ＣＡＲ－Ｔ細胞を１週間に２回以上投与し（例えば、１週間に２、３又は４回投与）（本明細書ではサイクルとも称される）、その後、ＣＡＲ－Ｔ細胞投与がない週が続き、続いて、ＣＡＲ－Ｔ細胞を１回又は２回以上の追加投与する（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞を１週間に２回以上投与）。別の実施形態では、対象に、ＣＡＲ－Ｔ細胞を２サイクル以上で投与し、各サイクル間の時間は、１０、９、８、７、６、５、４、又は３日未満である。一実施形態では、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、１週間に３回の投与のために、１日おきに投与される。一実施形態では、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、少なくとも２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、又はそれ以上の週にわたって投与される。
一実施形態では、投与は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間、１ヶ月、５週間、６週間、７週間、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、又はそれ以上後に繰り返され得る。治療を繰り返すことも可能であり、長期にわたる投与も同様に可能である。反復投与は、同じ投与量、又は異なる投与量であってもよい。
ＣＡＲ－Ｔ細胞は、例えば、１週間に１回、６ヶ月又はそれ以上の期間などの維持療法によって、本発明の方法で投与することができる。
一実施形態では、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、レンチウイルスなどのレンチウイルスウイルスベクターを使用して生成される。かかるウイルスベクターで生成されたＣＡＲ－Ｔ細胞は、安定したＣＡＲ発現を一般的に有する。
一実施形態では、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、形質導入後４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５日間、ＣＡＲベクターを一過性に発現する。ＣＡＲの一過性発現は、ＲＮＡ ＣＡＲベクターの送達によって影響を受け得る。一実施形態では、ＣＡＲ ＲＮＡは、エレクトロポレーションによってＴ細胞に形質導入される。
一過性のＣＡＲ療法（ＲＮＡ形質導入によって生成されるものなど）の過程で患者が抗ＣＡＲ抗体応答を生成するリスクが高い場合、ＣＡＲ Ｔ注入の中断は、１０～１４日を超えてはならない。
本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞は、他の既知の薬剤及び療法と組み合わせて使用することができる。本明細書で使用するとき、「組み合わせて」投与されるとは、対象の治療の過程中に、２つ（又はそれ以上）の異なる治療が対象に送達されること、例えば、対象が癌と診断された後、その癌が治癒される若しくは排除される前、又は他の理由で治療が中止される前に、２つ又はそれ以上の治療が送達されることを意味する。いくつかの実施形態では、１つの治療の送達は、第２の開始の送達が開始されるときにも依然として起こるため、投与に関して重複がある。これは、本明細書において「同時」又は「同時送達」と称されることがある。他の実施形態では、１つの治療の送達は、もう１つの治療の送達が始まる前に終了する。いずれかの場合のいくつかの実施形態では、併用投与のため、治療はより効果的である。例えば、第２の治療はより効果的であり、例えば、同等の効果が、第２の治療が少なくても見られるか、又は第２の治療が、第１の治療なく第２の治療が施される場合に見られるよりも、症状を大幅に軽減するか、又は第１の治療と同様の状況が見られる。いくつかの実施形態では、送達は、障害に関連する症状又は他のパラメータの軽減が、他の治療なしで送達される１つの治療から観察される軽減よりも大きくなるようなものである。２つの治療の効果は、部分的に相加的であるか、全体的に相加的であるか、又は相加的を超えるものであり得る。送達は、送達された第１の治療の効果が、第２の送達時に依然として検出可能であるようなものであり得る。
一実施形態では、因子などの他の治療剤は、ＣＡＲ－Ｔ細胞の前、後、又は一緒に（同時に）投与され得、例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、並びに他のインターロイキン）、Ｇ－、Ｍ－及びＧＭ－ＣＳＦなどのコロニー刺激因子、並びにインターフェロン（例えば、γ－インターフェロン）が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞及び少なくとも１つの追加の治療剤は、同時に、同じ若しくは別個の組成物で、又は連続して投与することができる。連続投与の場合、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞を最初に投与し、次に追加の薬剤を投与するか、又は投与の順序を逆にすることができる。
更なる実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞は、手術、放射線、化学療法、免疫抑制剤、例えば、メトトレキサート、シクロスポリン、アザチオプリン、ミコフェノール酸、及びＦＫ５０６、抗体、又は他の免疫除去剤（immunoablative agent）、例えば、抗ＣＤ３抗体若しくは他の抗体療法薬、サイトシン（cytoxin）、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン、及び放射線と組み合わせて治療レジメンで使用することができる。
一実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞は、化学療法剤と組み合わせて使用することができる。例えば、化学療法剤としては、アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシン（例えば、リポソームドキソルビシン））、ビンシンアルカロイド（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン）、アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、ダカルバジン、メルファラン、イホスファミド、テモゾロミド）、免疫細胞抗体（例えば、アレムツザマブ、ゲムツズマブ、リツキシマブ、トシツモマブ）、代謝拮抗剤（例えば、葉酸拮抗剤、ピリミジン類似体、プリン類似体、及びアデノシンデアミナーゼ阻害剤（例えばフルダラビン）を含む）ｍＴＯＲ阻害剤、ＴＮＦＲグルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ）作動薬、プロテアソーム阻害剤（例えば、アクラシノマイシンＡ、グリオトキシン又はボルテゾミブ）、免疫調節薬例えば、サリドマイド又はサリドマイド誘導体（例えば、レナリドミド）が挙げられるが、これらに限定されない。
併用療法での使用が検討されている化学療法剤の非網羅的なリストには、アナストロゾール（Ａｒｉｍｉｄｅｘ（登録商標））、ビカルタミド（Ｃａｓｏｄｅｘ（登録商標））、ブレオマイシン硫酸塩（Ｂｌｅｎｏｘａｎｅ（登録商標））、ブスルファン（Ｍｙｌｅｒａｎ（登録商標））、ロイコボリンカルシウム、メルファラン（Ａｌｋｅｒａｎ（登録商標））、６－メルカプトプリン（Ｐｕｒｉｎｅｔｈｏｌ（登録商標））、メトトレキサート（Ｆｏｌｅｘ（登録商標））、ミトキサトロン（Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ（登録商標））、マイロターグ、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））、フェニックス（Ｙｔｔｒｉｕｍ９０／ＭＸ－ＤＴＰＡ）、ペントスタチン、カルムスチンインプラントを含むポリフェプロサン２０（Ｇｌｉａｄｅｌ（登録商標））、ダクチノマイシン（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ、Ｃｏｓｍｅｇａｎ）、ダウノルビシン塩酸塩（Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ（登録商標））、ダウノルビシンクエン酸塩リポソーム注射剤（ＤａｕｎｏＸｏｍｅ（登録商標））、デキサメタゾン、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））、ドキソルビシン塩酸塩（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標）、Ｒｕｂｅｘ（登録商標））、エトポシド（Ｖｅｐｅｓｉｄ（登録商標））、ブスルファン注射剤（Ｂｕｓｕｌｆｅｘ（登録商標））カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））、Ｎ４－ペントキシカルボニル－５－デオキシ－５－フルオロシチジン、カルボプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（登録商標））、カルムスチン（ＢｉＣＮＵ（登録商標））、クロラムブシル（Ｌｅｕｋｅｒａｎ（登録商標））、シスプラチン（Ｐｌａｔｉｎｏｌ（登録商標））、クラドリビン（Ｌｅｕｓｔａｔｉｎ（登録商標））、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）又はＮｅｏｓａｒ（登録商標））、シタラビン、シトシンアラビノシド（Ｃｙｔｏｓａｒ－Ｕ（登録商標））、シタラビンリポソーム注射剤（ＤｅｐｏＣｙｔ（登録商標））、ダカルバジン（ＤＴＩＣ－Ｄｏｍｅ（登録商標））リン酸フルダラビン（Ｆｌｕｄａｒａ（登録商標））、５－フルオロウラシル（Ａｄｒｕｃｉｌ（登録商標））、Ｅｆｕｄｅｘ（登録商標））、フルタミド（Ｅｕｌｅｘｉｎ（登録商標））、テザシチビン、ゲムシタビン（ジフルオロデオキシシチジン）、ヒドロキシ尿素（Ｈｙｄｒｅａ（登録商標））、イダルビシン（Ｉｄａｍｙｃｉｎ（登録商標））、イホスファミド（ＩＦＥＸ（登録商標））、イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（登録商標））、Ｌ－アスパラギナーゼ（ＥＬＳＰＡＲ（登録商標））、タモキシフェンクエン酸塩（Ｎｏｌｖａｄｅｘ（登録商標））、テニポシド（Ｖｕｍｏｎ（登録商標））、６－チオグアニン、チオテパ、チラパザミン（Ｔｉｒａｚｏｎｅ（登録商標））、注射用トポテカン塩酸塩（Ｈｙｃａｍｐｔｉｎ（登録商標））、ビンブラスチン（Ｖｅｌｂａｎ（登録商標））、ビンクリスチン（Ｏｎｃｏｖｉｎ（登録商標））、及びビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））が含まれる。
アルキル化剤の例としては、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、スルホン酸アルキル、ニトロソ尿素及びトリアゼン：ウラシルマスタード（Ａｍｉｎｏｕｒａｃｉｌ Ｍｕｓｔａｒｄ（登録商標）、Ｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎａｃｉｌ（登録商標）、Ｈａｅｍａｎｔｈａｍｉｎｅ（登録商標）、Ｎｏｒｄｏｐａｎ（登録商標）、Ｕｒａｃｉｌ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｍｕｓｔａｒｄ（登録商標）、Ｕｒａｃｉｌｌｏｓｔ（登録商標）、Ｕｒａｃｉｌｍｏｓｔａｚａ（登録商標）、Ｕｒａｍｕｓｔｉｎ（登録商標）、Ｕｒａｍｕｓｔｉｎｅ（登録商標））、クロルメチン（Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ（登録商標））、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）、Ｎｅｏｓａｒ（登録商標）、Ｃｌａｆｅｎ（登録商標）、Ｅｎｄｏｘａｎ（登録商標）、Ｐｒｏｃｙｔｏｘ（登録商標）、Ｒｅｖｉｍｍｕｎｅ（商標））、イホスファミド（Ｍｉｔｏｘａｎａ（登録商標））、メルファラン（Ａｌｋｅｒａｎ（登録商標））、クロラムブシル（Ｌｅｕｋｅｒａｎ（登録商標））、ピポブロマン（Ａｍｅｄｅｌ（登録商標）、Ｖｅｒｃｙｔｅ（登録商標））、トリエチレンメラミン（Ｈｅｍｅｌ（登録商標）、Ｈｅｘｙｌｅｎ（登録商標）、Ｈｅｘａｓｔａｔ（登録商標））、Ｄｅｍｅｔｈｙｌｄｏｐａｎ（登録商標）、Ｄｅｓｍｅｔｈｙｌｄｏｐａｎ（登録商標）、トリエチレンチオホスホラミン、テモゾロミド（Ｔｅｍｏｄａｒ（登録商標））、チオテパ（Ｔｈｉｏｐｌｅｘ（登録商標））、ブスルファン（Ｂｕｓｉｌｖｅｘ（登録商標）、Ｍｙｌｅｒａｎ（登録商標））、カルムスチン（ＢｉＣＮＵ（登録商標））、ロムスチン（ＣｅｅＮＵ（登録商標））、ストレプトゾシン（Ｚａｎｏｓａｒ（登録商標））、及びダカルバジン（ＤＴＩＣ－Ｄｏｍｅ（登録商標））が挙げられるが、これらに限定されない。アルキル化剤の更なる例としては、オキサリプラチン（Ｅｌｏｘａｔｉｎ（登録商標））；メルファラン（Ｌ－ＰＡＭ、Ｌ－サルコリシン、及びフェニルアラニンマスタード、Ａｌｋｅｒａｎ（登録商標）としても知られている）；アルトレタミン（ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）、Ｈｅｘｙｌｅｎ（登録商標）としても知られている）；カルムスチン（ＢｉＣＮＵ（登録商標））；ベンダムスチン（Ｔｒｅａｎｄａ（登録商標））；ブスルファン（Ｂｕｓｕｌｆｅｘ（登録商標）及びＭｙｌｅｒａｎ（登録商標））；カルボプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（登録商標））；テモゾロミド（Ｔｅｍｏｄａｒ（登録商標）及びＴｅｍｏｄａｌ（登録商標））；ダクチノマイシン（アクチノマイシン－Ｄ、Ｃｏｓｍｅｇｅｎ（登録商標）としても知られる）；ロムスチン（ＣＣＮＵ、ＣｅｅＮＵ（登録商標）としても知られる）；シスプラチン（ＣＤＤＰ、Ｐｌａｔｉｎｏｌ（登録商標）及びＰｌａｔｉｎｏｌ（登録商標）－ＡＱとしても知られる）；クロラムブシル（Ｌｅｕｋｅｒａｎ（登録商標））；シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）及びＮｅｏｓａｒ（登録商標））；ダカルバジン（ＤＴＩＣ、ＤＩＣ及びイミダゾールカルボキサミド、ＤＴＩＣ－Ｄｏｍｅ（登録商標）としても知られている）；アルトレタミン（ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）、Ｈｅｘｙｌｅｎ（登録商標）としても知られている）；イホスファミド（Ｉｆｅｘ（登録商標））；プレドヌムスチン；プロカルバジン（Ｍａｔｕｌａｎｅ（登録商標））；メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード、ムスチン及びメクロレタミン塩酸塩、Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ（登録商標）としても知られている）；ストレプトゾシン（Ｚａｎｏｓａｒ（登録商標））；チオテパ（チオホスホアミド、ＴＥＳＰＡ及びＴＳＰＡ、Ｔｈｉｏｐｌｅｘ（登録商標）としても知られている）；シクロホスファミド（Ｅｎｄｏｘａｎ（登録商標）、Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）、Ｎｅｏｓａｒ（登録商標）、Ｐｒｏｃｙｔｏｘ（登録商標）、Ｒｅｖｉｍｍｕｎｅ（登録商標））；及びベンダムスチンＨＣｌ（Ｔｒｅａｎｄａ（登録商標））が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で有用な免疫調節薬の例としては、例えば、アフツズマブ（Ｒｏｃｈｅ（登録商標）から入手可能）；ペグフィルグラスチム（Ｎｅｕｌａｓｔａ（登録商標））、レナリドミド（ＣＣ－５０１３、Ｒｅｖｌｉｍｉｄ（登録商標））；サリドマイド（Ｔｈａｌｏｍｉｄ（登録商標））、アクチミド（ＣＣ４０４７）、及びＩＲＸ－２（インターロイキン１、インターロイキン２、及びインターフェロンγを含むヒトサイトカインの混合物、ＣＡＳ ９５１２０９－７１－５、ＩＲＸ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓから入手可能）が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態では、対象に、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤を投与することができる。例えば、一実施形態では、薬剤は、阻害分子を阻害する薬剤であり得る。阻害分子、例えば、Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｄｅａｔｈ １（ＰＤ１）は、いくつかの実施形態において、免疫エフェクタ応答を展開するＣＡＲ発現細胞の能力を低下させることができる。阻害分子の例としては、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、及びＴＧＦＲベータが挙げられる。
例示的実施形態の記述が以下に続く。
実施形態１．細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、細胞外抗原結合ドメインが、
配列番号６６のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号６７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、
配列番号５８のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号５９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、
配列番号３９のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号４０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、
配列番号４２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号４３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、又は
配列番号４５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号４６のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３
を含み、
細胞外抗原結合ドメインが、抗Ｇタンパク質受容体ファミリーＣグループ５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）抗原に結合する、
キメラ抗原受容体。
実施形態２．
配列番号６６のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号６７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む、細胞外抗原結合ドメインが、配列番号６９のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号７０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号７１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を更に含む、
配列番号５８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号５９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む、細胞外抗原結合ドメインが、配列番号６１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を更に含む、
配列番号３９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号４０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む、細胞外抗原結合ドメインが、配列番号４８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４９のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を更に含む、
配列番号４２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号４３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む、細胞外抗原結合ドメインが、配列番号５１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を更に含む、又は
配列番号４５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号４６のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む、細胞外抗原結合ドメインが、配列番号５４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を更に含む、
実施形態１に記載のＣＡＲ。
実施形態３．細胞外抗原結合ドメインが、配列番号７３、６５、１、３、及び５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、又は配列番号７２、６４、２、４、及び６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、又は配列番号７３、６５、１、３、及び５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲと、配列番号７２、６４、２、４、及び６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲとの組み合わせを含む、実施形態１又は２に記載のＣＡＲ。
実施形態４．細胞外抗原結合ドメインが、
配列番号７３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び配列番号７２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
配列番号６５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び配列番号６４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
配列番号１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
配列番号３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、又は
配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、を含む、
実施形態１～３に記載のＣＡＲ。
実施形態５．細胞外抗原結合ドメインが、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む、実施形態１～４に記載のいずれか１つに記載のＣＡＲ。
実施形態６．ｓｃＦｖが、軽鎖可変領域と重鎖可変領域との間にリンカーポリペプチドを含む、実施形態５に記載のＣＡＲ。
実施形態７．リンカーポリペプチドが、配列番号７のアミノ酸配列を含む、実施形態６に記載のＣＡＲ。
実施形態８．ｓｃＦｖが、配列番号７８、７７、７５、７６、８、９、１０、２４、２５、及び２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態５～７のいずれか１つに記載のＣＡＲ。
実施形態９．細胞外抗原結合ドメインが、シグナルポリペプチドを含む、実施形態１～８に記載のいずれか１つに記載のＣＡＲ。
実施形態１０．シグナルポリペプチドが、配列番号１１のアミノ酸配列を含む、実施形態９に記載のＣＡＲ。
実施形態１１．細胞内シグナル伝達ドメインが、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー９（ＣＤ１３７）成分、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３ゼータ鎖（ＣＤ３ｚ）成分、分化クラスタ（ＣＤ２７）成分、分化クラスタスーパーファミリーメンバー成分、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるポリペプチド成分を含む、実施形態１～１０のいずれか１つに記載のＣＡＲ。
実施形態１２．ＣＤ１３７成分が、配列番号１２のアミノ酸配列を含む、実施形態１１に記載のＣＡＲ。
実施形態１３．ＣＤ３ｚ成分が、配列番号１３のアミノ酸配列を含む、実施形態１１記載のＣＡＲ。
実施形態１４．細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号１４のアミノ酸配列を含む、実施形態１１に記載のＣＡＲ。
実施形態１５．膜貫通ドメインが、ＣＤ８ａ膜貫通領域（ＣＤ８Ａ－ＴＭ）ポリペプチドを含む、実施形態１～１４に記載のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
実施形態１６．ＣＤ８ａ－ＴＭポリペプチドが、配列番号１５のアミノ酸配列を含む、実施形態１５に記載のＣＡＲ。
実施形態１７．膜貫通ドメインを細胞外抗原結合ドメインに連結するヒンジ領域を更に含む、実施形態１～１６に記載のいずれか１つに記載のＣＡＲ。
実施形態１８．ヒンジ領域が、ＣＤ８ａヒンジ領域である、実施形態１７に記載のＣＡＲ。
実施形態１９．ＣＤ８ａヒンジ領域が、配列番号１６のアミノ酸配列を含む、実施形態１８に記載のＣＡＲ。
実施形態２０．細胞外抗原結合ドメインが、配列番号８２、８１、８０、７９、１７、１８、１９、２０、２１及び２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１～１９に記載のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
実施形態２１．ＣＡＲが、配列番号８６、８５、８３、８４、２７、２８、２９、３０、３１及び３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１～２０のいずれか１つに記載のＣＡＲ。
実施形態２２．実施形態１～２１のいずれか１つに記載のＣＡＲを発現する単離されたリンパ球。
実施形態２３．リンパ球が、Ｔリンパ球である、実施形態２２に記載の単離されたリンパ球。
実施形態２４．実施形態１～２１のいずれか１つに記載のＣＡＲをコードする単離された核酸分子。
実施形態２５．核酸分子が、配列番号９０、８９、８７、８８、３３、３４、３５、３６、３７、及び３８からなる群から選択される核酸配列を含む、実施形態２４に記載の単離された核酸分子。
実施形態２６．核酸分子が、配列番号９０、８９、８７、８８、３３、３４、３５、３６、３７及び３８のヌクレオチド配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるヌクレオチド配列を含む、実施形態２４に記載の単離された核酸分子。
実施形態２７．実施形態２４～２６のいずれか１つに記載の核酸分子を含む、ベクター。
実施形態２８．実施形態２４～２６のいずれか１つに記載の核酸分子を発現する細胞。
実施形態２９．実施形態２２～２３のいずれか１つに記載の有効量のリンパ球を含む、医薬組成物。
実施形態３０．実施形態２２～２３のいずれか１つに記載の有効量のリンパ球及び医薬的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
実施形態３１．治療に使用するための、実施形態１～２１のいずれか１つに記載のＣＡＲ、又は実施形態２９若しくは３０に記載の医薬組成物。
実施形態３２．癌を有する対象を治療する方法で使用するための、実施形態１～２１のいずれか１つに記載のＣＡＲ、又は実施形態２９若しくは３０に記載の医薬組成物。
実施形態３３．癌を有する対象を治療する方法であって、
治療有効量の実施形態２２～２３のいずれか１つに記載のリンパ球を、それを必要とする対象に投与することを含み、それにより、リンパ球が対象における癌細胞の死滅を誘導する、方法。
実施形態３４．癌が、肺癌、胃癌、結腸癌、肝細胞癌、腎細胞癌、膀胱尿路上皮癌、転移性黒色腫、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、頭頸部癌、膵臓癌、神経膠腫、神経膠芽腫、及び非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、くすぶり型多発性骨髄腫（ＳＭＭ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される、実施形態３３に記載の方法、又は実施形態３２に記載の方法で使用するためのＣＡＲ若しくは医薬組成物。
実施形態３５．癌が多発性骨髄腫である、実施形態３３若しくは３４に記載の方法、又は実施形態３２若しくは３４に記載の方法で使用するためのＣＡＲ若しくは医薬組成物。
実施形態３６．癌細胞の標的化死滅の方法であって、
癌細胞を、実施形態２２～２３のいずれか１つに記載のリンパ球と接触させることを含み、それにより、リンパ球が癌細胞の死滅を誘導する、方法。
実施形態３７．癌細胞が、肺癌、胃癌、結腸癌、肝細胞癌、腎細胞癌、膀胱尿路上皮癌、転移性黒色腫、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、頭頸部癌、膵臓癌、神経膠腫、神経膠芽腫、及び他の固形腫瘍、並びに非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、くすぶり型多発性骨髄腫（ＳＭＭ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、及び他の液体腫瘍、並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される、実施形態３６に記載の方法。
実施形態３８．癌細胞が、多発性骨髄腫細胞である、実施形態３６又は３７に記載の方法。
実施形態３９．対象における癌の存在を検出する方法であって、
（ａ）対象から得られた細胞サンプルを請求項１に記載のＣＡＲと接触させることにより、ＣＡＲ－細胞複合体を形成すること、及び、
（ｂ）複合体を検出することを含み、複合体の検出が、対象における癌の存在を示す、
方法。好ましくは、実施形態は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施される。
本明細書にて開示した実施形態のいくつかを更に説明するために、以下の実施例を提供する。これらの実施例は、例示を目的とするものであって、本開示の実施形態を制限するものではない。
実施例１：ＧＰＲＣ５Ｄ ｓｃＦｖ ＣＡＲの発現
ｍＲＮＡなし（Ｍｏｃｋ）又はα－ＧＰＲＣ５Ｄ ｓｃＦｖ ＣＡＲ若しくはアイソタイプ対照ＣＡＲのいずれかを発現する１０μｇのｍＲＮＡで、初代ヒト汎Ｔ細胞を、エレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの２４時間後、ビオチン化Ｌタンパク質及びストレプトアビジンコンジュゲートＰＥで染色した後のフローサイトメトリによって、ＣＡＲ表面発現を測定した。（図１）。ＣＡＲ発現率を、プロテインＬで染色することによって判定した。発現率は、ＣＡＲ Ａ、ＣＡＲ Ｂ、ＣＡＲ Ｃ、及びアイソタイプＣＡＲに対して、それぞれ９５、８８、７０、及び６７％陽性であると判定された。ＭｏｃｋＴ細胞はエレクトロポレーションのみを行ったが、細胞にｍＲＮＡは添加されなかった。ＭｏｃｋＴ細胞は、予想されるように、いかなるＣＡＲ構造も発現しなかった。これらのデータは、Ｔ細胞がＣＡＲ構造を高度に発現していることを示していた。白抜きのヒストグラムはＭｏｃｋであり、塗りつぶされた灰色のヒストグラムは、ＣＡＲ－Ｔ集団である。
ＧＰＲＣ５Ｄ標的化ＣＡＲ構築物の各構成要素のアミノ酸配列は、表２に示すとおりであった。
Figure 0007303314000002
Figure 0007303314000003
実施例２：抗原刺激ＣＡＲ－Ｔ細胞における活性化マーカーの誘導
一過性トランスフェクションの２４時間後、初代汎Ｔ細胞をＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）蛍光増殖色素で標識し、次いで、多発性骨髄腫細胞株Ｈ９２９と共培養した。共培養４日後、細胞をＣＤ８＋ＣＤ４集団上で事前にゲーティングし、ＣＡＲ－Ｔ上の活性化マーカーＣＤ２５及びＣＤ７１の表面発現を、単独又はα－ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズの存在下で培養したＴ細胞と比較した。（図２）。図１と同じＣＡＲ Ｔ細胞を、ＧＰＲＣ５Ｄ抗原発現－Ｈ９２９細胞に対するＴ細胞活性化応答について分析した。エレクトロポレーションの４日後、ＣＡＲ Ａ及びＣＡＲ Ｂは、Ｔ細胞活性化応答の増加を示した。これは、Ｈ９２９細胞との培養に応答してＣＤ２５及びＣＤ７１発現の増加によって示される。比較すると、Ｍｏｃｋ及びＣＡＲ Ｃ発現細胞は、Ｈ９２９細胞に応答して、Ｔ細胞活性化の低下を示した。陰性対照として、ＧＰＲＣ５Ｄ又はＴ細胞抗原がいずれも存在しない状態で同じ細胞を増殖させ、ＣＤ２５又はＣＤ７１の最小限の増加を示した。陽性対照として、Ｍｏｃｋ、ＣＡＲ Ａ、ＣＡＲ Ｂ、及びＣＡＲ Ｃ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８ビーズと共培養した。４つの細胞集団のそれぞれは、ＣＤ２５及びＣＤ７１発現において同様の増加を示した。全体的に、これらのデータは、ＣＡＲ Ａ及びＣＡＲ Ｂ細胞が、ＧＰＲＣ５Ｄ発現Ｈ９２９細胞に対して最大のＴ細胞活性化応答を示したことを示す。
実施例３：抗原刺激ＣＡＲ－Ｔ細胞のサイトカインプロファイリング
ＣＡＲ発現ｍＲＮＡで２４時間前に一過性にトランスフェクションした初代汎Ｔ細胞を、標的抗原ＧＰＲＣ５Ｄを発現する様々な骨髄腫細胞株と１：１の比で、高（＋＋＋）、中（＋＋）、低（＋）又は陰性（－）レベルで共培養した。共培養１６時間後、上清を採取し、共培養からの上清のＭｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）によるサイトカインプロファイル分析を行った。（図３）。ＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲ－Ｔ細胞からの上清は、炎症誘発性サイトカインＩＮＦ－γ、ＴＮＦ－α、又はＩＬ－２の増加を示した。炎症誘発性サイトカインのそれぞれの増加は、ＧＰＲＣ５Ｄ発現のそれぞれであり、細胞株は、ＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲ－Ｔ細胞と共培養された。ＭＭ．１Ｓとの共培養は、最も高いＩＮＦ－γ及びＴＮＦ－α発現をもたらしたが、ＫＭＳ１１細胞との共培養は、最も高いＩＬ－２レベルをもたらした。Ｋ５６２細胞株を陰性対照として使用し、非ＧＰＲＣ５Ｄ発現細胞株を有する基本的なバックグラウンドサイトカインレベルを実証した。
ＣＡＲ発現ｍＲＮＡとの一過性トランスフェクションの２４時間後、初代汎Ｔ細胞を、自己末梢血単核球（ＰＢＭＣ）及び多発性骨髄腫細胞株Ｈ９２９と共培養した（１：１：１比で）。共培養１６時間後、上清を採取した。３つの集団全て（ＣＡＲ－Ｔ、Ｈ９２９，自己ＰＢＭＣ）を含有する共培養物からの上清のＭＳＤによるサイトカインプロファイル分析を、ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＰＢＭＣ、又はＨ９２９を含まない対照共培養物と、単独で培養された細胞の各集団と比較した。（図４）。図３と同様に、Ｍｏｃｋ、ＣＡＲ－Ｔ Ａ、ＣＡＲ－Ｔ Ｂ、ＣＡＲ－Ｔ Ｃ、又はアイソタイプＣＡＲ－Ｔ細胞を、Ｈ９２９及び／又は自己ＰＢＭＣと共培養した。Ｈ９２９細胞をＰＢＭＣと共培養したとき、ＴＮＦ－α及びＩＬ－２の増加は、ＣＡＲ－Ｔ Ａ及びＣＡＲ－Ｔ Ｂ細胞で観察された。ＣＡＲ－Ｔ Ｃ細胞をＨ９２９及びＰＢＭＣと共培養した場合、限定的ないし検出不可能（limited-to-no detectable）なレベルのＩＮＦ－γ放出が観察された。全体的に、ＣＡＲ－Ｔ Ｃ細胞は、サイトカイン放出の減少を示し、図２のＴ細胞活性化マーカーの減少と一致している。ＣＡＲ－Ｔ、Ｈ９２９、及びＰＢＭＣ細胞を、陰性対照として単独で培養し、バックグラウンドサイトカインレベルを示した。
実施例４：ＧＰＲＣ５Ｄ発現腫瘍細胞株の標的化細胞傷害：高／低／非発現ＧＰＲＣ５Ｄ標的細胞株
ＧＰＲＣ５Ｄ発現骨髄腫細胞に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害の潜在能力をフローサイトメトリによって評価した。初代汎Ｔ細胞（前述の３つのＣＡＲのうちの１つを一過性に発現する）を、示されたエフェクタ：標的（Ｅ：Ｔ）比で、蛍光標識された骨髄腫細胞株、ＭＭ１Ｒ、Ｈ９２９、及びＫ５６２と８時間共培養した。この時点で、共培養物を生存性色素で染色した。死滅率は、ＣＡＲ－Ｔ細胞なしで培養された生存標的の数に対する共培養物中に残存する生存（生存性色素陰性）標的（ＣＴＶ陽性）細胞の絶対数の比率である。（図５）。ＣＡＲ Ａ、ＣＡＲ Ｂ、ＣＡＲ Ｃ、アイソタイプＣＡＲ、及びＭｏｃｋＴ細胞を、ＧＰＲＣ５Ｄ＋細胞株ＭＭ１Ｒ及びＨ９２９又はＧＰＲＣ５Ｄ－Ｋ５６２細胞と８時間共培養した。様々なエフェクタ対標的比を分析し、ＣＡＲ Ａ、ＣＡＲ Ｂ、及びＣＡＲ Ｃ細胞が、ＭＭ１Ｒ細胞の細胞傷害を誘導できることが示された。細胞傷害の増加は、より高いエフェクタ対標的比と相関していた。アイソタイプ対照及びＭｏｃｋ対照は、対照として含まれ、約２０～３０％の細胞傷害を示した。同様に、ＣＡＲ Ａ及びＣＡＲ Ｂ細胞は、Ｈ９２９細胞の細胞傷害を誘導した。ＣＡＲ Ａ及びＣＡＲ Ｂ細胞は、アイソタイプ及びＭｏｃｋ細胞と同様の細胞傷害活性を示した。これらのデータは、ＣＡＲ Ａ細胞及びＣＡＲ Ｂ細胞の、ＭＭ１Ｒ及びＨ９２９細胞に対する特異性を示しているが、Ｋ５６２細胞（ＧＰＲＣ５Ｄ）に対する特異性は示していない。
実施例５：ＧＰＲＣ５Ｄ発現腫瘍細胞株の標的化細胞傷害：多発性骨髄腫患者由来Ｔ細胞
ＧＰＲＣ５Ｄ発現骨髄腫細胞に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害の潜在能力をフローサイトメトリによって評価した。原発性多発性骨髄腫患者のＴ細胞（前述の２つのＣＡＲのうちの１つを一過性に発現する）を、示されたエフェクタ：標的（Ｅ：Ｔ）比で、蛍光標識された骨髄腫細胞株ＭＭ．１Ｓ又は対照ＧＰＲＣ５Ｄ－陰性細胞株ＫＧ－１と４８時間共培養した。この時点で、共培養物を生存性色素で染色した。細胞傷害率を、細胞死を示す、生存性色素に対して陽性に染色された蛍光標識細胞の割合として判定した。（図６）。ＧＣ５Ｂ８１＿ＬＨ又はＧＣ５Ｂ４８３＿ＬＨのいずれかで形質導入された原発性多発性骨髄腫患者のＴ細胞は両方とも、ＭｏｃｋＴ細胞と比較して、エフェクタ細胞の量が増加したＧＰＲＣ５Ｄ＋ＭＭ．１Ｓ細胞の細胞傷害を誘導した。ＧＰＲＣ５Ｄ－ＫＧ－１細胞株と共培養した場合、ＧＣ５Ｂ８１＿ＬＨ又はＧＣ５Ｂ４８３＿ＬＨ ＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲ－Ｔ細胞では観察可能な細胞傷害は存在しなかった。これらのデータは、ＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲで形質導入された多発性骨髄腫Ｔ細胞により、ＧＰＲＣ５Ｄ＋細胞の死滅は誘発し得るが、ＧＰＲＣ５Ｄ細胞の死滅は誘発し得ないことを示している。
実施例６：α－ＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗原刺激増殖応答
Α－ＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖能をフローサイトメトリによって評価した。蛍光標識された汎Ｔ細胞（α－ＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲ又はアイソタイプＣＡＲ対照を一過性に発現する）を、１エフェクタ：１標的の比でＨ９２９と４日間共培養した。希釈された蛍光標識（ＣＴＶ）を有する生存（生存性色素陰性）ＣＡＲ－Ｔ細胞の絶対数として、増殖を測定した。Ｈ９２９に応答した増殖を、α－ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ刺激の４日後のＣＡＲ－Ｔ増殖、及び単独で培養されたＣＡＲ－Ｔ（刺激制御なし）と比較した。（図７）。Ｍｏｃｋ、アイソタイプＣＡＲ、ＣＡＲ－Ｔ Ａ、ＣＡＲ－Ｔ Ｂ、及びＣＡＲ－Ｔ Ｃ細胞を、ＧＰＲＣ５Ｄ＋Ｈ９２９細胞、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズと、又は刺激なしで共培養した。４日後、ＣＤ４及びＣＤ８集団を総生存数について分析し、ＧＰＲＣ５Ｄ抗原に応答して細胞の増殖能を反映した。ＣＤ４集団では、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを陽性対照として使用し、全ての細胞集団は、刺激なしと比較して、ＣＤ４事象の増加を示した。ＣＡＲ－Ｔ Ａ及びＣＡＲ－Ｔ Ｂ細胞のみが、アイソタイプ及びＭｏｃｋと比較して、Ｈ９２９細胞に応答して、活発な数の増加を示した。ＣＤ８集団でも、同様の結果が観察された。しかしながら、ＣＡＲ－Ｔ Ｃは、Ｈ９２９細胞に応答した増殖の応答を示さなかった。まとめると、これらのデータは、ＣＡＲ－Ｔ Ａ及びＣＡＲ－Ｔ Ｂ細胞が、ＧＰＲＣ５Ｄ＋Ｈ９２９細胞に応答して増殖することを示している。
実施例７：健康なドナーＴ細胞におけるＧＰＲＣ５Ｄ－ＣＡＲの発現
Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｔ細胞ＴＲＡＮＳＡＣＴシステムを使用して、６つの初代ヒト汎Ｔ細胞を活性化及び増殖させた。活性化から２４時間後、Ｔ細胞に、ＧＰＲＣ５Ｄ ＧＣ５Ｂ６８０－Ｎ６８Ｓ－ＬＨ ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列（配列番号９０）を含むレンチウイルスで形質導入した。細胞を１２日間増殖させ、６日目と１０日目にフローサイトメトリによって、市販のウサギ抗ヒトＨ＋Ｌ検出抗体を使用して表面ＣＡＲ発現を測定した。結果を図８に示す。データは６人の健康なドナーからの平均±ＳＤを表している。黒色バー（ＧＣＢ６８００－Ｎ６８Ｓ－ＬＨ）のすぐ左側にある灰色の網掛けのバー（Ｍｏｃｋ）は、非形質導入（Ｍｏｃｋ）細胞で市販の抗体を使用したバックグラウンドＣＡＲ検出を表している。黒色バーは、ＧＰＲＣ５Ｄ ＧＣ５Ｂ６８０－Ｎ６８Ｓ－ＬＨで形質導入されたＣＡＲ－Ｔ細胞を表している。
実施例８；ＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲ－Ｔ細胞でのＣＤ４、ＣＤ８、及び記憶マーカーの発現
６人の健康なドナーからの汎Ｔ細胞に、ＧＰＲＣ５Ｄ ＧＣ５Ｂ６８０－Ｎ６８Ｓ－ＬＨ ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列（ＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲ；配列番号９０）を含むレンチウイルスを形質導入した。Ｍｏｃｋ（非形質導入）細胞及び形質導入細胞［表面ＣＡＲを有する細胞（ＣＡＲ発現又はＣＡＲ＋）及び表面ＣＡＲを有さない細胞（ＣＡＲ非発現又はＣＡＲ－）を含む「Ｔ細胞プール」］を、表面ＣＤ４（ＣＤ４＋）を有する細胞の比率、及び表面ＣＤ８（ＣＤ８＋）を有する細胞の比率について評価した。データを図９Ａ～図９Ｃに示す。図９Ｃのデータは、予想されるように、ＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲが、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方において検出されたことを示している。図９Ａ～図９Ｃはまた、ＣＤ４：ＣＤ８比が、ＣＡＲ＋細胞、ＣＡＲ－細胞、及びＭｏｃｋ細胞を含む、評価された全ての細胞集団間で類似していたことを示している。
ＣＡＲ－Ｔ集団のＴ細胞サブタイプを、２つの表面マーカーＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ６２Ｌを使用して判定し、４つの記憶細胞集団、すなわち、エフェクタ記憶ＲＡ＋Ｔ細胞（ＴＥＭＲＡ＋）、エフェクタ記憶細胞ＴＥＭ、ナイーブＴ細胞及び記憶幹細胞ＴＮ／ＳＣＭ、並びに中央記憶Ｔ細胞（ＴＣＭ）を区別した。データを図９Ｄ～図９Ｆに示す。図９Ｄは、１人のドナーサンプルを表すフローサイトグラムであり、２つの表面マーカーを使用して４つの異なる記憶集団を識別するためのゲーティングストラテジーを強調している。図９Ｅ及び図９Ｆは、ＧＰＲＣ５Ｄ ＧＣ５Ｂ６８０－Ｎ６８Ｓ－ＬＨが、ＴＮ／ＳＣＭ及びＴＣＭ細胞で主に発現したことを示しており、これにより、高い増殖能、生存、及び治療有効性を有することが分かる。
実施例９：６時間及び２４時間でのＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲ－Ｔ細胞傷害のアッセイ
６人の健康なドナーの１人からのＧＰＲＣ５Ｄ ＧＣ５Ｂ６８０－Ｎ６８Ｓ－ＬＨ形質導入Ｔ細胞、又は非形質導入（Ｍｏｃｋ）Ｔ細胞を、様々なＥ：Ｔ比にて、（ｉ）ルシフェラーゼ導入遺伝子を含むＧＰＲＣ５Ｄ＋ＭＭ．１Ｓ腫瘍細胞の培養物、又は（ｉｉ）ルシフェラーゼ導入遺伝子を含むＧＰＲＣ５Ｄ－Ｋ５６２腫瘍細胞の培養物に添加した。細胞傷害を、各Ｅ：Ｔ比にて、インキュベーションの６時間後又は２４時間後で評価した。データは、６時間の時点については図１０Ａに、２４時間の時点については図１０Ｂに示されている。比溶解率は、（ｉ）６又は２４時間のＣＡＲ－Ｔの存在下で、インキュベーションされた腫瘍細胞中のルシフェラーゼシグナルを、同じ時点で、インキュベーションされた腫瘍細胞内のルシフェラーゼシグナルで除算し、１００を乗算し、（ｉｉ）１００からその数を減算することによって計算した。式は、１００－［（ＣＡＲ－Ｔ＋腫瘍発光／平均腫瘍単独発光）］×１００である。点線は、ゼロ溶解を強調している。陰性溶解は、細胞成長を示す。
実施例１０：４８時間でのＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲ－Ｔ細胞傷害のアッセイ
ＧＰＲＣ５Ｄ ＧＣ５Ｂ６８０－Ｎ６８Ｓ－ＬＨに形質導入及び非形質導入（Ｍｏｃｋ）Ｔ細胞を健康なドナーから調製した。（ｉ）ＧＰＲＣ５Ｄ ＧＣ５Ｂ６８０－Ｎ６８Ｓ－ＬＨ形質導入Ｔ細胞又は（ｉｉ）形質導入（Ｍｏｃｋ）Ｔ細胞のいずれかを、様々なＥ：Ｔ比にて、ＧＰＲＣ５Ｄ＋Ｈ９２９、ＧＰＲＣ５Ｄ＋ＭＭ．１Ｓ、ＧＰＲＣ５Ｄ＋ＭＭ．１Ｒ、ＧＰＲＣ５Ｄ＋ＭＯＬＰ－２、ＧＰＲＣ５Ｄ＋ＥＪＭ及びＧＰＲＣ５Ｄ－Ｋ５６２細胞と標識された、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）に添加した。４８時間のインキュベーション後、細胞を生存／死滅色素で染色し、死滅細胞及びＣＦＳＥ＋細胞の百分率（細胞傷害％）について評価した。細胞傷害率を、対数変換されたｘ軸（Ｅ：Ｔ比）に対して、４パラメータの非線形回帰カーブフィットでプロットした。データは、図１１Ａ～図１１Ｆにおいて平均±ＳＤとして示されている。Ｍｏｃｋ陰性対照Ｔ細胞は、ＥＪＭ以外の全てのＧＰＲＣ５Ｄ＋細胞株においてある程度の細胞傷害を誘導したが、ＧＰＲＣ５Ｄ ＧＣ５Ｂ６８０－Ｎ６８Ｓ－ＬＨ細胞よりも程度は低くなった（特により高いＥ：Ｔ比において）。理論に束縛されるものではないが、細胞傷害の低下は、同種異系応答から生じる可能性が高い。加えて、ＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲ細胞の細胞傷害は、細胞株によって異なった。
実施例１１：４８時間でのＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲ－Ｔ活性化のアッセイ
ＧＰＲＣ５Ｄ ＧＣ５Ｂ６８０－Ｎ６８Ｓ－ＬＨに形質導入及び非形質導入（Ｍｏｃｋ）Ｔ細胞を健康なドナーから調製した。ＧＰＲＣ５Ｄ ＧＣ５Ｂ６８０－Ｎ６８Ｓ－ＬＨ形質導入又は非形質導入（Ｍｏｃｋ）Ｔ細胞を、３：１のＥ：Ｔ比にて、ＧＰＲＣ５Ｄ＋Ｈ９２９、ＧＰＲＣ５Ｄ＋ＭＭ．１Ｓ、ＧＰＲＣ５Ｄ＋ＭＯＬＰ－２、ＧＰＲＣ５Ｄ＋ＥＪＭ、及びＧＰＲＣ５Ｄ－Ｋ５６２細胞で標識された、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）に添加した。４８時間のインキュベーション後、細胞を、生存／死滅色素、抗ＣＤ２５、抗ＣＤ３、及び抗ＣＡＲ視覚マーカーで染色した。次いで、細胞を、表面ＣＤ２５発現について評価した。データは、図１２で平均±ＳＤとして表されている。図１２に示すように、１３％未満のバックグラウンド表面ＣＤ２５発現が、Ｍｏｃｋ細胞で観察された（すなわち、活性化なし）。対照的に、ＧＣ５Ｂ６８０－Ｎ６８Ｓ－ＬＨ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ２５発現レベルの上昇によって示されるように、ＧＰＲＣ５Ｄ＋細胞株の存在下で活性化された。（ｉ）Ｍｏｃｋ及び（ｉｉ）ＧＣ５Ｂ６８０－Ｎ６８Ｓ－ＬＨ ＣＡＲ－Ｔ細胞のみの両方で、Ｋ５６２細胞とのインキュベーション又は単独でのインキュベーションで、低レベルの表面ＣＤ２５発現が観察された。
実施例１２：ＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲ－Ｔ多機能性のアッセイ
ＧＣ５Ｂ６８０－Ｎ６８Ｓ－ＬＨ形質導入（ＣＡＲ－Ｔ）細胞を、ＰＭＡ／イオノマイシン（陽性対照として）、ＧＰＲＣ５Ｄ＋細胞株Ｈ９２９（Ｈ９２９）、ＧＰＲＣ５Ｄ－Ｋ５６２（Ｋ５６２）細胞（ＣＦＳＥ－標識）、又は単独で１８時間インキュベーションした。細胞をＥ：Ｔ比１：２にてインキュベーションし、その場合、Ｈ９２９又はＫ５６２細胞の存在下でインキュベーションした。次いで、細胞を、生存／死滅色素、抗ＣＤ３、及び抗イディオタイプで、最初に表面染色した後、抗ＩＦＮ－γ、抗ＩＬ－２、及び抗ＴＮＦ－αで、固定、透過処理、及び細胞内染色を行った。次に、染色された細胞をフローサイトメトリによって分析した。個々のサイトカインレベルの百分率を、ブール（階層）ゲーティングを使用して、フローサイトグラムの分析に続いて計算し、その百分率が、以下の表３～６に示されている。また、表３～表６では、各群の多機能サイトカイン放出のレベルが灰色で強調され、平均の合計が表示されている。
Figure 0007303314000004
Figure 0007303314000005
Figure 0007303314000006
Figure 0007303314000007
実施例１３：ＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲ－Ｔ増殖のアッセイ
ＧＣ５Ｂ６８０－Ｎ６８Ｓ－ＬＨ細胞を、１人のドナーからの細胞を使用して調製した。（ｉ）ＧＣ５Ｂ６８０－Ｎ６８Ｓ－ＬＨ形質導入細胞及び（ｉｉ）Ｍｏｃｋ細胞を、ＧＰＲＣ５Ｄ＋細胞（ＭＭ．１Ｓ及びＨ９２９）の存在下又は非存在下でインキュベーションした。Ｍｏｃｋ（非形質導入）細胞を陰性対照として使用した。細胞内のＣＥＬＬＴＲＡＣＥ Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）色素濃度の希釈の程度をアッセイすることにより、６日間のインキュベーション後に、細胞増殖の程度を測定した。量は図１３のグラフのＸ軸で表されている。抗イディオタイプ抗体を使用してＣＡＲ＋細胞を染色した。染色の程度は、図１３のグラフのＹ軸によって表されている。
図１３に示すように、Ｍｏｃｋ及びＣＴＶ標識ＣＡＲ Ｔ細胞は、単独で、又はＧＰＲＣ５Ｄ－Ｋ５６２細胞の存在下で、ＣＴＶ色素の低希釈からゼロ希釈まで見られるように、細胞増殖はほとんど又は全く示されなかった。作動薬ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（陽性対照として機能する）は、予測されるように、評価された全てのＴ細胞集団の増殖をもたらした。ＣＡＲ－Ｔ細胞をＧＰＲＣ５Ｄ＋標的細胞（Ｈ９２９又はＭＭ．１Ｓ）と共にインキュベーションした場合、増殖は主に、表面にＧＣ５Ｂ６８０－Ｎ６８Ｓ－ＬＨを発現している形質導入細胞（ＣＡＲ＋）に集中した（図１３のグラフに示される）。この結果、ＧＣ５Ｂ６８０－Ｎ６８Ｓ－ＬＨ細胞の増殖は、ＧＰＲＣ５Ｄ＋標的細胞の存在下で増強されることが示唆されている。図１３に示されるデータは、他のドナーから調製された細胞を使用して行われた同様の観察結果を表している。
実施例１４：ＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲ－Ｔ増殖のアッセイ
ＧＣ５Ｂ６８０－Ｎ６８Ｓ－ＬＨ（ＣＡＲ－Ｔ）細胞を、陽性対照スタウロスポリン、ＧＰＲＣ５Ｄ＋Ｈ９２９細胞、ＧＰＲＣ５Ｄ－Ｋ５６２細胞、又は単独で２４時間インキュベーションした。Ｅ：Ｔ比１：２を、ＧＣ５Ｂ６８０－Ｎ６８Ｓ－ＬＨ（ＣＡＲ－Ｔ）細胞と、Ｈ９２９又はＫ５６２細胞とのインキュベーションに使用した。次いで、細胞を、生存／死滅色素、抗ＣＤ３、抗イディオタイプ、及び抗切断カスパーゼ３／７色素で染色した。染色した細胞をフローサイトメトリによって分析した。データは、図１４のグラフで表される。図１４に示すように、スタウロスポリンは、ＣＡＲ＋及びＣＡＲ－Ｔ細胞集団の両方において、切断カスパーゼ３／７染色を誘導した。また、２４時間の時点の４時間後に開始して５０～６５％の陽性細胞が存在した。ＣＡＲ＋Ｔ細胞集団及びＣＡＲ－Ｔ細胞集団のいずれも、陰性対照インキュベーション（Ｋ５６２及びＣＡＲＴ単独）とＨ９２９の存在下でのインキュベーションとの間で、カスパーゼ３／７レベルの有意差を示した。
実施例１５：ＮＳＧ－Ｂ２Ｍマウスにおける確立されたＭＭ．１ＳヒトＭＭ異種移植片に対するＧＣ５Ｂ６８０－Ｎ６８Ｓ－ＬＨ、ＧＣ５Ｂ６８０－Ｎ６８Ｓ－ＨＬ、ＧＰ５Ｂ８３＿Ｎ２４Ｔ＿Ｎ３１Ｓ－ＬＨ、及びＧＰ５Ｂ８３＿Ｎ２４Ｔ＿Ｎ３１Ｓ－ＨＬの有効性のアッセイ
ＧＣ５Ｂ６８０－Ｎ６８Ｓ－ＬＨ（配列番号８６）、ＧＣ５Ｂ６８０－Ｎ６８Ｓ－ＨＬ（配列番号８５）、ＧＰ５Ｂ８３＿Ｎ２４Ｔ＿Ｎ３１Ｓ－ＬＨ（配列番号８４）、及びＧＰ５Ｂ８３＿Ｎ２４Ｔ＿Ｎ３１Ｓ－ＨＬ（配列番号８３）形質導入Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）の抗腫瘍有効性を、確立された皮下（ｓｃ）ＭＭ．１Ｓヒト多発性骨髄腫（ＭＭ）異種移植モデルで、女性ＮＳＧ Ｂ２ｍ（代替的に、ＮＯＤ－ｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｎｕｌｌ Ｂ２ｍｎｕｌｌ、又はＮＯＤ－ｓｃｉｄガンマＢ２ｍと称される）において評価した。（ｉ）ＧＣ５Ｂ６８０－Ｎ６８Ｓ－ＬＨ、（ｉｉ）ＧＣ５Ｂ６８０－Ｎ６８Ｓ－ＨＬ、（ｉｉｉ）ＧＰ５Ｂ８３＿Ｎ２４Ｔ＿Ｎ３１Ｓ－ＬＨ、又は（ｉｖ）ＧＰ５Ｂ８３＿Ｎ２４Ｔ＿Ｎ３１Ｓ－ＨＬ ＣＡＲ－Ｔ細胞を、１ｘ１０６のＣＡＲ＋細胞又は５ｘ１０６のＣＡＲ＋細胞の投与量で、静脈内（ｉｖ）にて１３日目に合計１回投与した。ＭＭ．１Ｓ異種移植片保有マウスの３群、すなわち、（ｉ）ＰＢＳで処置したマウス、（ｉｉ）Ｍｏｃｋ形質導入を受けたマウス、及び（ｉｉｉ）ＧＰＲＣ５Ｄで形質導入されたマウスを評価した。ＳＣ（皮下）ＭＭ．１Ｓ異種移植片を有するマウスの３群のデルタ腫瘍成長阻害率（％ΔＴＧＩ）を、以下の式を使用して腫瘍移植後２６日目に計算した：（［（ＴＶｃ－ＴＶｃ０）－（ＴＶｔ－ＴＶｔ０）］／（ＴＶｃ－ＴＶｃ０））×１００、式中、「ＴＶｃ」は所与の対照群の平均腫瘍量であり、「ＴＶｃ０」は所与の対照群の平均初期腫瘍量であり、「ＴＶｔ」は処置群の平均腫瘍量であり、「ＴＶｔ０」は処置群の平均初期腫瘍量である。
統計的有意性は、Ｒの線形混合効果分析を使用して計算され、処置及び時間は固定効果、動物はランダム効果として計算された。個々の縦方向の応答軌跡が線形でない場合、対数変換（基数１０）を実施した。この統計モデルから得られた情報を使用して、ＰＢＳ対照群又はＭｏｃｋ形質導入群との対を処置比較した。Ｐ値は、＜０．０５の場合に統計的に有意であると見なした。
表７及び図１５に概要が示されるように、４つ全てのＧＰＲＣ５Ｄ指向性ＣＡＲ－Ｔ構築物は、ＰＢＳ及びＭｏｃｋＣＡＲ－Ｔ対照と比較して、１×１０６及び５×１０６のＣＡＲ＋Ｔ細胞投与量レベルの両方で統計的に有意な％ΔＴＧＩを誘導した。完全な反応（触知可能な腫瘍を伴わない完全な腫瘍退縮）は、腫瘍移植後４７日目に評価された。
Figure 0007303314000008
 有意ではない（ｎｓ）と記載されている場合を除き、ＰＢＳ及びＭｏｃｋＣＡＲ－Ｔ対照に対してｐ＜０．０５。
ＣＲ＝完全な応答
実施例１６ ＮＳＧマウスにおける播種性Ｈ９２９ ＩＶヒトＭＭ異種移植片に対するＧＣ５Ｂ６８０－Ｎ６８Ｓ－ＬＨ、ＧＣ５Ｂ６８０－Ｎ６８Ｓ－ＨＬ、ＧＰ５Ｂ８３＿Ｎ２４Ｔ＿Ｎ３１Ｓ－ＬＨ、及びＧＰ５Ｂ８３＿Ｎ２４Ｔ＿Ｎ３１Ｓ－ＨＬの有効性
ＧＣ５Ｂ６８０－Ｎ６８Ｓ－ＬＨ（配列番号８６；配列番号９０のヌクレオチドによってコードされる）、ＧＣ５Ｂ６８０－Ｎ６８Ｓ－ＨＬ（配列番号８５；配列番号８９のヌクレオチドによってコードされる）、ＧＰ５Ｂ８３＿Ｎ２４Ｔ＿Ｎ３１Ｓ－ＬＨ（配列番号８４；配列番号８８のヌクレオチドによってコードされる）、及びＧＰ５Ｂ８３＿Ｎ２４Ｔ＿Ｎ３１Ｓ－ＨＬ（配列番号８３；配列番号８７のヌクレオチドによりコードされる）形質導入Ｔ細胞の有効性を、雌ＮＳＧ（商標）（代替的に、ＮＯＤ ｓｃｉｄガンマ）又はＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪと称される）マウスにおいて、播種性（ｉｖ）Ｈ９２９ヒトＭＭモデルで評価した。この実施例では、ＧＣ５Ｂ６８０－Ｎ６８Ｓ－ＬＨ、ＧＣ５Ｂ６８０－Ｎ６８Ｓ－ＨＬ、ＧＰ５Ｂ８３＿Ｎ２４Ｔ＿Ｎ３１Ｓ－ＬＨ、又はＧＰ５Ｂ８３＿Ｎ２４Ｔ＿Ｎ３１Ｓ－ＨＬ発現（ＣＡＲ＋）Ｔ細胞を、腫瘍移植後９日目に１×１０６のＣＡＲ＋細胞又は５ｘ１０６のＣＡＲ＋細胞の投与量で静脈内にて単回投与した。
生存期間評価を実施し、様々な試験日における生存率を試験日に対してプロットした。過剰な播種性腫瘍量の後肢麻痺又は他の臨床徴候を、死亡の代替エンドポイントとして使用した。生存期間中央値は、カプラン・マイヤー生存分析を使用して判定した。ＩＬＳ率（％ＩＬＳ）は、処置群と対照群の生存期間中央値の差として定義され、ＩＬＳ＝（［ＭＳｔ－ＭＳｃ］／ＭＳｃ）×１００として計算した。式中、「ＭＳｃ」は所与の対照群の生存期間中央値であり、「ＭＳｔ」は所与の処置群の生存期間中央値である。有害な一般徴候（潰瘍性腫瘍、体重減少など）又は処置とは関係のない死亡が原因で、代替エンドポイントに到達できなかった動物は、生存期間評価では除外した。生存率を、カプラン・マイヤー曲線を使用してグラフで表し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン７．０）を使用してログランク（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）試験により評価した。
ＰＢＳで処置した対照マウスでは、腫瘍移植後５２日目（ＣＡＲ＋注射後４３日）までに生存期間中央値が５０％に達した。ＭｏｃｋＣＡＲ－Ｔ細胞処置マウスの腫瘍移植後４４日目（ＣＡＲ－Ｔ注射後３５日）までに生存期間中央値が５０％に達した。１ｘ１０６の投与量で投与されたＧＣ５Ｂ６８０－Ｎ６８Ｓ－ＬＨ ＣＡＲ＋細胞で処置されたマウスでは、１１１日目（ＣＡＲ－Ｔ注射後１０２日）の後に生存期間中央値が５０％に達した。それぞれ１ｘ１０６細胞の投与量で投与されたＧＣ５Ｂ６８０－Ｎ６８Ｓ－ＨＬ ＣＡＲ＋細胞で処置されたマウスでは、６３．５日目（ＣＡＲ－Ｔ注射後５４．５日）に生存期間中央値が５０％に達した。１ｘ１０６細胞の投与量で投与されたＧＰ５Ｂ８３＿Ｎ２４Ｔ＿Ｎ３１Ｓ－ＬＨ ＣＡＲ＋細胞で処置されたマウスでは、９３．５日目（ＣＡＲ－Ｔ注射後８４．５日）に生存期間中央値が５０％に達した。１ｘ１０６細胞の投与量で投与されたＧＰ５Ｂ８３＿Ｎ２４Ｔ＿Ｎ３１Ｓ－ＨＬ ＣＡＲ＋細胞で処置されたマウスでは、１１１日目（ＣＡＲ－Ｔ注射後１０２日）の後に生存期間中央値が５０％に達した。寿命の増加率（ＩＬＳ）を、カプラン・マイヤー曲線を介して評価し、ログランクマンテルコックス検定によって評価した。
以下に考察され、表８及び図１６に概説されるように、４つ全てのＧＰＲＣ５Ｄ指向性ＣＡＲ－Ｔ構築物は、ＰＢＳ及びＭｏｃｋＣＡＲ－Ｔ対照と比較して、１ｘ１０６の投与量レベルで統計的に有意な％ＩＬＳを誘発した。１１１日目までに生存した動物をＣＲと見なした。
Figure 0007303314000009
 有意ではない（ｎｓ）と記載されている場合を除き、ＰＢＳ及びＭｏｃｋＣＡＲ－Ｔ対照に対してｐ＜０．０５。
ＣＲ＝完全な応答
腫瘍移植後５２日目に開始したＰＢＳ－処置対照群において、進行性腫瘍疾患の負荷に関連する有害な一般徴候が観察されたが、腫瘍移植後４８日目に開始したＭｏｃｋ形質導入群又はＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲ－Ｔ処置群で発症した移植片対宿主病の一般徴候が観察された。
本明細書で引用する全ての特許、公開特許、及び引用文献による教示は、あらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる。
例示的実施形態について具体的に示し、記載してきたが、当業者らは、添付の特許請求の範囲に包含される実施形態の範囲から逸脱することなく、形態及び詳細における様々な変更を行い得ることを理解する。
配列表
軽鎖配列１（ＧＣ５Ｂ４８３）（配列番号１）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＲＳＮＷＰＬＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
重鎖配列１（ＧＣ５Ｂ４８３）（配列番号２）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＩＳＣＫＧＳＧＹＳＦＴＳＹＦＩＧＷＶＲＱＭＰＧＫＧＬＥＷＭＧＩＩＹＰＧＫＳＤＴＲＹＳＰＳＦＱＧＱＶＴＩＳＡＤＫＳＩＳＴＡＹＬＱＷＳＳＬＫＡＳＤＴＡＭＹＹＣＡＲＶＹＳＦＧＧＲＨＫＡＬＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
軽鎖配列２（ＧＣ５Ｂ８１）（配列番号３）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＹＳＴＰＬＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
重鎖配列２（ＧＣ５Ｂ８１）（配列番号４）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＩＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＳＲＷＲＧＹＫＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
軽鎖配列３（ＧＣ５Ｂ５９６）（配列番号５）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＡＴＨＶＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＮＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＮＲＹＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
重鎖配列３（ＧＣ５Ｂ５９６）（配列番号６）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＴＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＬＩＮＰＹＮＳＤＴＮＹＡＱＫＬＱＧＲＶＴＭＴＴＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＶＡＬＲＶＡＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
リンカーポリペプチド配列（配列番号７）
ＧＴＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴ
ｓｃＦｖ配列１（ＧＣ５Ｂ４８３）（配列番号８）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＲＳＮＷＰＬＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＧＴＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＩＳＣＫＧＳＧＹＳＦＴＳＹＦＩＧＷＶＲＱＭＰＧＫＧＬＥＷＭＧＩＩＹＰＧＫＳＤＴＲＹＳＰＳＦＱＧＱＶＴＩＳＡＤＫＳＩＳＴＡＹＬＱＷＳＳＬＫＡＳＤＴＡＭＹＹＣＡＲＶＹＳＦＧＧＲＨＫＡＬＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ｓｃＦｖ配列２（ＧＣ５Ｂ８１）（配列番号９）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＹＳＴＰＬＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＧＴＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＩＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＳＲＷＲＧＹＫＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ｓｃＦｖ配列３（ＧＣ５Ｂ５９６）（配列番号１０）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＡＴＨＶＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＮＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＮＲＹＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＧＴＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＴＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＬＩＮＰＹＮＳＤＴＮＹＡＱＫＬＱＧＲＶＴＭＴＴＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＶＡＬＲＶＡＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
シグナル配列（配列番号１１）
ＭＡＷＶＷＴＬＬＦＬＭＡＡＡＱＳＩＱＡ
ＣＤ１３７配列（配列番号１２）
ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ
ＣＤ３ｚ配列（配列番号１３）
ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＫＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ
細胞内シグナル伝達ドメイン（配列番号１４）
ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＫＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ
ＣＤ８ａ－ＴＭ配列（配列番号１５）
ＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣ
ＣＤ８ａヒンジ配列（配列番号１６）
ＴＳＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤ
細胞外結合ドメイン（ＧＣ５Ｂ４８３）（配列番号１７）
ＭＡＷＶＷＴＬＬＦＬＭＡＡＡＱＳＩＱＡＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＲＳＮＷＰＬＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＧＴＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＩＳＣＫＧＳＧＹＳＦＴＳＹＦＩＧＷＶＲＱＭＰＧＫＧＬＥＷＭＧＩＩＹＰＧＫＳＤＴＲＹＳＰＳＦＱＧＱＶＴＩＳＡＤＫＳＩＳＴＡＹＬＱＷＳＳＬＫＡＳＤＴＡＭＹＹＣＡＲＶＹＳＦＧＧＲＨＫＡＬＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
細胞外結合ドメイン（ＧＣ５Ｂ８１）（配列番号１８）
ＭＡＷＶＷＴＬＬＦＬＭＡＡＡＱＳＩＱＡＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＹＳＴＰＬＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＧＴＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＩＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＳＲＷＲＧＹＫＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
細胞外結合ドメイン（ＧＣ５Ｂ５９６）（配列番号１９）
ＭＡＷＶＷＴＬＬＦＬＭＡＡＡＱＳＩＱＡＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＡＴＨＶＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＮＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＮＲＹＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＧＴＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＴＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＬＩＮＰＹＮＳＤＴＮＹＡＱＫＬＱＧＲＶＴＭＴＴＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＶＡＬＲＶＡＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
細胞外結合ドメイン（ＧＣ５Ｂ４８３）（配列番号２０）
ＭＡＷＶＷＴＬＬＦＬＭＡＡＡＱＳＩＱＡＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＩＳＣＫＧＳＧＹＳＦＴＳＹＦＩＧＷＶＲＱＭＰＧＫＧＬＥＷＭＧＩＩＹＰＧＫＳＤＴＲＹＳＰＳＦＱＧＱＶＴＩＳＡＤＫＳＩＳＴＡＹＬＱＷＳＳＬＫＡＳＤＴＡＭＹＹＣＡＲＶＹＳＦＧＧＲＨＫＡＬＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＴＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＲＳＮＷＰＬＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
細胞外結合ドメイン（ＧＣ５Ｂ８１）（配列番号２１）
ＭＡＷＶＷＴＬＬＦＬＭＡＡＡＱＳＩＱＡＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＩＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＳＲＷＲＧＹＫＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＴＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＹＳＴＰＬＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
細胞外結合ドメイン（ＧＣ５Ｂ５９６）（配列番号２２）
ＭＡＷＶＷＴＬＬＦＬＭＡＡＡＱＳＩＱＡＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＴＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＬＩＮＰＹＮＳＤＴＮＹＡＱＫＬＱＧＲＶＴＭＴＴＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＶＡＬＲＶＡＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＴＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＡＴＨＶＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＮＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＮＲＹＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
ｓｃＦｖ配列４（ＧＣ５Ｂ４８３）（配列番号２４）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＩＳＣＫＧＳＧＹＳＦＴＳＹＦＩＧＷＶＲＱＭＰＧＫＧＬＥＷＭＧＩＩＹＰＧＫＳＤＴＲＹＳＰＳＦＱＧＱＶＴＩＳＡＤＫＳＩＳＴＡＹＬＱＷＳＳＬＫＡＳＤＴＡＭＹＹＣＡＲＶＹＳＦＧＧＲＨＫＡＬＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＴＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＲＳＮＷＰＬＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
ｓｃＦｖ配列５（ＧＣ５Ｂ８１）（配列番号２５）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＩＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＳＲＷＲＧＹＫＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＴＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＹＳＴＰＬＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
ｓｃＦｖ配列６（ＧＣ５Ｂ５９６）（配列番号２６）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＴＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＬＩＮＰＹＮＳＤＴＮＹＡＱＫＬＱＧＲＶＴＭＴＴＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＶＡＬＲＶＡＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＴＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＡＴＨＶＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＮＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＮＲＹＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
ｐＤＲ００００７４４９０ ＧＣ５Ｂ４８３－ＬＨ－ＣＡＲ配列（配列番号２７）
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ｐＤＲ００００７４４９０ ＧＣ５Ｂ４８３－ＬＨ－ＣＤＳのＤＮＡ配列（配列番号３３）
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ｐＤＲ００００７４４８８ ＧＣ５Ｂ５９６－ＬＨ－ＣＤＳのＤＮＡ配列（配列番号３５）
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ｐＤＲ００００７４４８３ ＧＣ５Ｂ４８３－ＨＬ－ＣＤＳのＤＮＡ配列（配列番号３６）
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ｐＤＲ００００７４４８２ ＧＣ５Ｂ８１－ＨＬ－ＣＤＳのＤＮＡ配列（配列番号３７）
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ｐＤＲ００００７４４８１ ＧＣ５Ｂ５９６－ＨＬ－ＣＤＳのＤＮＡ配列（配列番号３８）
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＡＧＣＧＧＡＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＣＧＣＣＡＧＣＧＴＧＡＡＧＧＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＴＡＣＡＧＣＴＴＣＡＣＣＧＧＣＴＡＣＡＣＣＡＴＧＡＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＣＣＡＧＧＣＣＣＣＡＧＧＣＣＡＧＧＧＡＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＣＣＴＧＡＴＣＡＡＣＣＣＡＴＡＣＡＡＣＡＧＣＧＡＣＡＣＣＡＡＣＴＡＣＧＣＣＣＡＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＧＣＧＴＧＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＣＣＧＡＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＣＧＣＡＧＣＣＴＧＣＧＣＡＧＣＧＡＣＧＡＣＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＣＧＣＧＴＧＧＣＣＣＴＧＣＧＣＧＴＧＧＣＣＣＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＡＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＡＧＣＡＧＣＧＧＴＡＣＡＧＡＧＧＧＣＡＡＧＴＣＴＡＧＴＧＧＡＡＧＴＧＧＴＡＧＣＧＡＡＡＧＴＡＡＧＡＧＴＡＣＣＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＡＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣＧＣＣＡＧＣＧＴＧＧＧＣＧＡＣＣＧＣＧＴＴＡＣＡＡＴＡＡＣＴＴＧＴＡＡＡＧＣＡＡＧＣＣＡＡＡＡＴＧＴＴＧＣＴＡＣＴＣＡＣＧＴＣＧＧＡＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＡＡＡＧＣＣＡＧＧＣＡＡＧＧＣＣＣＣＡＡＡＧＣＧＣＣＴＧＡＴＣＴＡＣＡＧＣＧＣＣＡＧＣＴＡＣＣＧＣＴＡＣＡＧＣＧＧＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＣＧＣＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＡＣＣＴＧＣＡＧＣＣＡＧＡＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＣＧＣＴＡＣＣＣＡＴＡＣＡＣＣＴＴＣＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧＡＣＴＡＧＴＡＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＡＣＧＣＣＣＴＣＣＣＡＣＣＣＣＴＧＣＴＣＣＴＡＣＡＡＴＡＧＣＡＴＣＣＣＡＧＣＣＣＴＴＧＴＣＡＣＴＴＣＧＣＣＣＣＧＡＡＧＣＡＴＧＣＡＧＡＣＣＡＧＣＣＧＣＡＧＧＣＧＧＴＧＣＴＧＴＧＣＡＴＡＣＣＣＧＡＧＧＡＣＴＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＴＧＣＧＡＣＡＴＣＴＡＣＡＴＣＴＧＧＧＣＣＣＣＡＣＴＧＧＣＣＧＧＣＡＣＣＴＧＣＧＧＣＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＧＣＣＴＧＧＴＧＡＴＣＡＣＣＣＴＧＴＡＣＴＧＣＡＡＧＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＧＡＡＧＣＴＧＣＴＧＴＡＣＡＴＣＴＴＣＡＡＧＣＡＧＣＣＡＴＴＣＡＴＧＣＧＣＣＣＡＧＴＧＣＡＧＡＣＣＡＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＣＧＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＣＣＧＣＴＴＣＣＣＡＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＧＣＧＧＣＴＧＣＧＡＧＣＴＧＣＧＣＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＧＣＣＧＣＡＧＣＧＣＣＧＡＣＧＣＣＣＣＡＧＣＣＴＡＣＡＡＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＣＣＡＧＣＴＧＴＡＣＡＡＣＧＡＧＣＴＧＡＡＣＣＴＧＧＧＣＣＧＣＣＧＣＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＡＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＡＧＣＧＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＣＣＣＡＧＡＧＡＴＧＧＧＣＧＧＣＡＡＧＣＣＡＣＧＣＣＧＣＡＡＧＡＡＣＣＣＡＣＡＧＧＡＧＧＧＣＣＴＧＴＡＣＡＡＣＧＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＧＧＡＣＡＡＧＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＣＣＴＡＣＡＧＣＧＡＧＡＴＣＧＧＣＡＴＧＡＡＧＧＧＣＧＡＧＣＧＣＣＧＣＣＧＣＧＧＣＡＡＧＧＧＣＣＡＣＧＡＣＧＧＣＣＴＧＴＡＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＴＡＣＧＡＣＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＡＣＣＡＣＧＣ
ＨＣＤＲ１（ＧＣ５Ｂ８１）（配列番号３９）
ＧＧＴＦＳＳＹ
ＨＣＤＲ２（ＧＣ５Ｂ８１）（配列番号４０）
ＥＳＲＷＲＧＹＫＬＤＹ
ＨＣＤＲ３（ＧＣ５Ｂ８１）（配列番号４１）
ＩＰＩＦＧＴ
ＨＣＤＲ１（ＧＣ５Ｂ４８３）（配列番号４２）
ＧＹＳＦＴＳＹ
ＨＣＤＲ２（ＧＣ５Ｂ４８３）（配列番号４３）
ＹＰＧＫＳＤ
ＨＣＤＲ３（ＧＣ５Ｂ４８３）（配列番号４４）
ＶＹＳＦＧＧＲＨＫＡＬＦＤＹ
ＨＣＤＲ１（ＧＣ５Ｂ５９６）（配列番号４５）
ＧＹＳＦＴＧＹ
ＨＣＤＲ２（ＧＣ５Ｂ５９６）（配列番号４６）
ＮＰＹＮＳＤ
ＨＣＤＲ３（ＧＣ５Ｂ５９６）（配列番号４７）
ＶＡＬＲＶＡＬＤＹ
ＬＣＤＲ１（ＧＣ５Ｂ８１）（配列番号４８）
ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ
ＬＣＤＲ２（ＧＣ５Ｂ８１）（配列番号４９）
ＡＡＳＳＬＱＳ
ＬＣＤＲ３（ＧＣ５Ｂ８１）（配列番号５０）
ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ
ＬＣＤＲ１（ＧＣ５Ｂ４８３）（配列番号５１）
ＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡ
ＬＣＤＲ２（ＧＣ５Ｂ４８３）（配列番号５２）
ＤＡＳＮＲＡＴ
ＬＣＤＲ３（ＧＣ５Ｂ４８３）（配列番号５３）
ＱＱＲＳＮＷＰＬＴ
ＬＣＤＲ１（ＧＣ５Ｂ５９６）（配列番号５４）
ＫＡＳＱＮＶＡＴＨＶＧ
ＬＣＤＲ２（ＧＣ５Ｂ５９６）（配列番号５５）
ＳＡＳＹＲＹＳ
ＬＣＤＲ３（ＧＣ５Ｂ５９６）（配列番号５６）
ＱＱＹＮＲＹＰＹＴ
ヒトＧＰＲＣ５Ｄポリペプチド（配列番号５７）
ＭＹＫＤＣＩＥＳＴＧＤＹＦＬＬＣＤＡＥＧＰＷＧＩＩＬＥＳＬＡＩＬＧＩＶＶＴＩＬＬＬＬＡＦＬＦＬＭＲＫＩＱＤＣＳＱＷＮＶＬＰＴＱＬＬＦＬＬＳＶＬＧＬＦＧＬＡＦＡＦＩＩＥＬＮＱＱＴＡＰＶＲＹＦＬＦＧＶＬＦＡＬＣＦＳＣＬＬＡＨＡＳＮＬＶＫＬＶＲＧＣＶＳＦＳＷＴＴＩＬＣＩＡＩＧＣＳＬＬＱＩＩＩＡＴＥＹＶＴＬＩＭＴＲＧＭＭＦＶＮＭＴＰＣＱＬＮＶＤＦＶＶＬＬＶＹＶＬＦＬＭＡＬＴＦＦＶＳＫＡＴＦＣＧＰＣＥＮＷＫＱＨＧＲＬＩＦＩＴＶＬＦＳＩＩＩＷＶＶＷＩＳＭＬＬＲＧＮＰＱＦＱＲＱＰＱＷＤＤＰＶＶＣＩＡＬＶＴＮＡＷＶＦＬＬＬＹＩＶＰＥＬＣＩＬＹＲＳＣＲＱＥＣＰＬＱＧＮＡＣＰＶＴＡＹＱＨＳＦＱＶＥＮＱＥＬＳＲＡＲＤＳＤＧＡＥＥＤＶＡＬＴＳＹＧＴＰＩＱＰＱＴＶＤＰＴＱＥＣＦＩＰＱＡＫＬＳＰＱＱＤＡＧＧＶ
ＨＣＤＲ１（ＧＰ５Ｂ８３）（配列番号５８）
ＧＧＳＬＳＳＳＳＹ
ＨＣＤＲ２（ＧＰ５Ｂ８３）（配列番号５９）
ＹＹＳＧＮ
ＨＣＤＲ３（ＧＰ５Ｂ８３）（配列番号６０）
ＨＶＧＹＳＹＧＲＲＦＷＹＦＤＬ
ＬＣＤＲ１（ＧＰ５Ｂ８３）（配列番号６１）
ＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡ
ＬＣＤＲ２（ＧＰ５Ｂ８３）（配列番号６２）
ＤＡＳＮＲＡＴ
ＬＣＤＲ３（ＧＰ５Ｂ８３）（配列番号６３）
ＱＱＲＳＮＷＰＰＴ
重鎖配列（ＧＰ５Ｂ８３）（配列番号６４）
ＱＬＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＬＳＳＳＳＹＷＷＧＷＴＲＱＰＰＧＲＧＬＥＷＩＧＴＭＹＹＳＧＮＩＹＹＮＰＳＬＱＳＲＡＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＨＶＧＹＳＹＧＲＲＦＷＹＦＤＬＷＧＲＧＴＬＶＴＶＳＳ
軽鎖配列（ＧＰ５Ｂ８３）（配列番号６５）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＲＳＮＷＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
ＨＣＤＲ１（ＧＣ５Ｂ６８０）（配列番号６６）
ＧＦＳＬＴＮＩＲＭ
ＨＣＤＲ２（ＧＣ５Ｂ６８０）（配列番号６７）
ＦＳＮＤＥ
ＨＣＤＲ３（ＧＣ５Ｂ６８０）（配列番号６８）
ＭＲＬＰＹＧＭＤＶ
ＬＣＤＲ１（ＧＣ５Ｂ６８０）（配列番号６９）
ＲＳＳＱＳＬＶＨＳＤＧＮＴＹＬＳ
ＬＣＤＲ２（ＧＣ５Ｂ６８０）（配列番号７０）
ＫＩＳＮＲＦＦ
ＬＣＤＲ３（ＧＣ５Ｂ６８０）（配列番号７１）
ＭＱＡＴＱＦＰＨＴ
重鎖配列（ＧＣ５Ｂ６８０）（配列番号７２）
ＱＶＴＬＫＥＳＧＰＶＬＶＫＰＴＥＴＬＴＬＴＣＴＶＳＧＦＳＬＴＮＩＲＭＳＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＡＨＩＦＳＮＤＥＫＳＹＳＳＳＬＫＳＲＬＴＩＳＲＤＴＳＫＳＱＶＶＬＴＬＴＮＶＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＲＭＲＬＰＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
軽鎖配列（ＧＣ５Ｂ６８０）（配列番号７３）
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＳＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＤＧＮＴＹＬＳＷＬＱＱＲＰＧＱＰＰＲＬＬＩＹＫＩＳＮＲＦＦＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＡＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＭＱＡＴＱＦＰＨＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
リンカーポリペプチド配列（配列番号７４）
ＧＧＳＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴＧＧＳ
ｓｃＦｖ配列（ＧＰ５Ｂ８３－ＨＬ）（配列番号７５）
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ｓｃＦｖ配列（ＧＰ５Ｂ８３－ＬＨ）（配列番号７６）
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ｓｃＦｖ配列（ＧＣ５Ｂ６８０－ＨＬ）（配列番号７７）
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ｓｃＦｖ配列（ＧＣ５Ｂ６８０－ＬＨ）（配列番号７８）
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細胞外結合ドメイン（ＧＰ５Ｂ８３－ＨＬ）（配列番号７９）
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細胞外結合ドメイン（ＧＰ５Ｂ８３－ＬＨ）（配列番号８０）
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細胞外結合ドメイン（ＧＣ５Ｂ６８０－ＨＬ）（配列番号８１）
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細胞外結合ドメイン（ＧＣ５Ｂ６８０－ＬＨ）（配列番号８２）
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ＧＰ５Ｂ８３－ＨＬ－ＣＡＲ配列（配列番号８３）
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ＧＰ５Ｂ８３－ＬＨ－ＣＡＲ配列（配列番号８４）
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ＧＣ５Ｂ６８０－ＨＬ－ＣＡＲ配列（配列番号８５）
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ＧＣ５Ｂ６８０－ＬＨ－ＣＡＲ配列（配列番号８６）
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ｐＤＲ００００８４４５４ ＧＰ５Ｂ８３－ＨＬ配列のＤＮＡ配列（配列番号８７）
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ＧＰ５Ｂ８３－ＬＨ配列のＤＮＡ配列（配列番号８８）
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ＧＣ５Ｂ６８０－ＨＬ配列のＤＮＡ配列（配列番号８９）
ＡＴＧＧＣＴＴＧＧＧＴＧＴＧＧＡＣＣＴＴＧＣＴＡＴＴＣＣＴＧＡＴＧＧＣＡＧＣＴＧＣＣＣＡＡＡＧＴＡＴＡＣＡＧＧＣＣＣＡＡＧＴＡＡＣＡＣＴＣＡＡＧＧＡＧＡＧＣＧＧＡＣＣＡＧＴＣＴＴＧＧＴＧＡＡＡＣＣＡＡＣＴＧＡＧＡＣＣＴＴＧＡＣＴＴＴＧＡＣＡＴＧＴＡＣＴＧＴＡＡＧＴＧＧＣＴＴＣＡＧＣＣＴＴＡＣＣＡＡＣＡＴＣＡＧＧＡＴＧＴＣＡＧＴＡＴＣＴＴＧＧＡＴＡＡＧＧＣＡＡＣＣＡＣＣＴＧＧＣＡＡＧＧＣＡＣＴＣＧＡＡＴＧＧＣＴＧＧＣＡＣＡＣＡＴＣＴＴＴＴＣＴＡＡＣＧＡＣＧＡＡＡＡＡＴＣＣＴＡＴＴＣＴＴＣＣＡＧＴＣＴＣＡＡＡＡＧＴＣＧＣＣＴＴＡＣＣＡＴＣＡＧＣＣＧＡＧＡＴＡＣＣＡＧＴＡＡＧＡＧＴＣＡＡＧＴＡＧＴＴＣＴＴＡＣＡＴＴＧＡＣＣＡＡＴＧＴＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＧＡＴＡＣＡＧＣＣＡＣＡＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＡＣＧＡＡＴＧＣＧＧＣＴＴＣＣＡＴＡＣＧＧＣＡＴＧＧＡＴＧＴＡＴＧＧＧＧＡＣＡＧＧＧＡＡＣＴＡＣＴＧＴＴＡＣＣＧＴＴＡＧＴＴＣＣＧＧＣＧＧＣＴＣＣＧＡＧＧＧＣＡＡＧＡＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＡＧＡＧＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＧＡＣＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＡＡＣＡＣＣＴＣＴＴＡＧＴＡＧＴＣＣＴＧＴＡＡＣＴＣＴＣＧＧＡＣＡＧＣＣＡＧＣＴＴＣＡＡＴＡＴＣＴＴＧＴＣＧＣＴＣＡＡＧＴＣＡＡＴＣＣＣＴＣＧＴＣＣＡＴＴＣＣＧＡＣＧＧＣＡＡＣＡＣＣＴＡＣＣＴＣＴＣＴＴＧＧＣＴＣＣＡＡＣＡＧＡＧＡＣＣＣＧＧＣＣＡＧＣＣＴＣＣＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＡＴＣＴＡＣＡＡＡＡＴＣＡＧＴＡＡＣＡＧＧＴＴＣＴＴＣＧＧＣＧＴＣＣＣＴＧＡＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＡＧＣＡＧＧＴＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＣＴＴＧＡＡＧＡＴＡＡＧＴＡＧＡＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＣＧＴＡＧＧＣＧＴＣＴＡＴＴＡＴＴＧＴＡＴＧＣＡＡＧＣＴＡＣＣＣＡＡＴＴＣＣＣＡＣＡＴＡＣＡＴＴＣＧＧＣＣＡＡＧＧＣＡＣＴＡＡＡＴＴＧＧＡＡＡＴＡＡＡＡＡＣＴＡＧＴＡＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＡＣＧＣＣＣＴＣＣＣＡＣＣＣＣＴＧＣＴＣＣＴＡＣＡＡＴＡＧＣＡＴＣＣＣＡＧＣＣＣＴＴＧＴＣＡＣＴＴＣＧＣＣＣＣＧＡＡＧＣＡＴＧＣＡＧＡＣＣＡＧＣＣＧＣＡＧＧＣＧＧＴＧＣＴＧＴＧＣＡＴＡＣＣＣＧＡＧＧＡＣＴＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＴＧＣＧＡＣＡＴＣＴＡＣＡＴＣＴＧＧＧＣＣＣＣＡＣＴＧＧＣＣＧＧＣＡＣＣＴＧＣＧＧＣＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＧＣＣＴＧＧＴＧＡＴＣＡＣＣＣＴＧＴＡＣＴＧＣＡＡＧＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＧＡＡＧＣＴＧＣＴＧＴＡＣＡＴＣＴＴＣＡＡＧＣＡＧＣＣＡＴＴＣＡＴＧＣＧＣＣＣＡＧＴＧＣＡＧＡＣＣＡＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＣＧＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＣＣＧＣＴＴＣＣＣＡＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＧＣＧＧＣＴＧＣＧＡＧＣＴＧＣＧＣＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＧＣＣＧＣＡＧＣＧＣＣＧＡＣＧＣＣＣＣＡＧＣＣＴＡＣＡＡＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＣＣＡＧＣＴＧＴＡＣＡＡＣＧＡＧＣＴＧＡＡＣＣＴＧＧＧＣＣＧＣＣＧＣＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＡＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＡＧＣＧＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＣＣＣＡＧＡＧＡＴＧＧＧＣＧＧＣＡＡＧＣＣＡＣＧＣＣＧＣＡＡＧＡＡＣＣＣＡＣＡＧＧＡＧＧＧＣＣＴＧＴＡＣＡＡＣＧＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＧＧＡＣＡＡＧＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＣＣＴＡＣＡＧＣＧＡＧＡＴＣＧＧＣＡＴＧＡＡＧＧＧＣＧＡＧＣＧＣＣＧＣＣＧＣＧＧＣＡＡＧＧＧＣＣＡＣＧＡＣＧＧＣＣＴＧＴＡＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＴＡＣＧＡＣＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＡＣＣＡＣＧＣＴＧＡ
ＧＣ５Ｂ６８０－ＬＨ配列のＤＮＡ配列（配列番号９０）
ＡＴＧＧＣＴＴＧＧＧＴＧＴＧＧＡＣＣＴＴＧＣＴＡＴＴＣＣＴＧＡＴＧＧＣＡＧＣＴＧＣＣＣＡＡＡＧＴＡＴＡＣＡＧＧＣＣＧＡＣＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＡＡＣＡＣＣＴＣＴＴＡＧＴＡＧＴＣＣＴＧＴＡＡＣＴＣＴＣＧＧＡＣＡＧＣＣＡＧＣＴＴＣＡＡＴＡＴＣＴＴＧＴＣＧＣＴＣＡＡＧＴＣＡＡＴＣＣＣＴＣＧＴＣＣＡＴＴＣＣＧＡＣＧＧＣＡＡＣＡＣＣＴＡＣＣＴＣＴＣＴＴＧＧＣＴＣＣＡＡＣＡＧＡＧＡＣＣＣＧＧＣＣＡＧＣＣＴＣＣＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＡＴＣＴＡＣＡＡＡＡＴＣＡＧＴＡＡＣＡＧＧＴＴＣＴＴＣＧＧＣＧＴＣＣＣＴＧＡＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＡＧＣＡＧＧＴＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＣＴＴＧＡＡＧＡＴＡＡＧＴＡＧＡＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＣＧＴＡＧＧＣＧＴＣＴＡＴＴＡＴＴＧＴＡＴＧＣＡＡＧＣＴＡＣＣＣＡＡＴＴＣＣＣＡＣＡＴＡＣＡＴＴＣＧＧＣＣＡＡＧＧＣＡＣＴＡＡＡＴＴＧＧＡＡＡＴＡＡＡＡＧＧＣＧＧＣＴＣＣＧＡＧＧＧＣＡＡＧＡＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＡＧＡＧＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＣＡＡＧＴＡＡＣＡＣＴＣＡＡＧＧＡＧＡＧＣＧＧＡＣＣＡＧＴＣＴＴＧＧＴＧＡＡＡＣＣＡＡＣＴＧＡＧＡＣＣＴＴＧＡＣＴＴＴＧＡＣＡＴＧＴＡＣＴＧＴＡＡＧＴＧＧＣＴＴＣＡＧＣＣＴＴＡＣＣＡＡＣＡＴＣＡＧＧＡＴＧＴＣＡＧＴＡＴＣＴＴＧＧＡＴＡＡＧＧＣＡＡＣＣＡＣＣＴＧＧＣＡＡＧＧＣＡＣＴＣＧＡＡＴＧＧＣＴＧＧＣＡＣＡＣＡＴＣＴＴＴＴＣＴＡＡＣＧＡＣＧＡＡＡＡＡＴＣＣＴＡＴＴＣＴＴＣＣＡＧＴＣＴＣＡＡＡＡＧＴＣＧＣＣＴＴＡＣＣＡＴＣＡＧＣＣＧＡＧＡＴＡＣＣＡＧＴＡＡＧＡＧＴＣＡＡＧＴＡＧＴＴＣＴＴＡＣＡＴＴＧＡＣＣＡＡＴＧＴＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＧＡＴＡＣＡＧＣＣＡＣＡＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＡＣＧＡＡＴＧＣＧＧＣＴＴＣＣＡＴＡＣＧＧＣＡＴＧＧＡＴＧＴＡＴＧＧＧＧＡＣＡＧＧＧＡＡＣＴＡＣＴＧＴＴＡＣＣＧＴＴＡＧＴＴＣＣＡＣＴＡＧＴＡＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＡＣＧＣＣＣＴＣＣＣＡＣＣＣＣＴＧＣＴＣＣＴＡＣＡＡＴＡＧＣＡＴＣＣＣＡＧＣＣＣＴＴＧＴＣＡＣＴＴＣＧＣＣＣＣＧＡＡＧＣＡＴＧＣＡＧＡＣＣＡＧＣＣＧＣＡＧＧＣＧＧＴＧＣＴＧＴＧＣＡＴＡＣＣＣＧＡＧＧＡＣＴＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＴＧＣＧＡＣＡＴＣＴＡＣＡＴＣＴＧＧＧＣＣＣＣＡＣＴＧＧＣＣＧＧＣＡＣＣＴＧＣＧＧＣＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＧＣＣＴＧＧＴＧＡＴＣＡＣＣＣＴＧＴＡＣＴＧＣＡＡＧＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＧＡＡＧＣＴＧＣＴＧＴＡＣＡＴＣＴＴＣＡＡＧＣＡＧＣＣＡＴＴＣＡＴＧＣＧＣＣＣＡＧＴＧＣＡＧＡＣＣＡＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＣＧＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＣＣＧＣＴＴＣＣＣＡＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＧＣＧＧＣＴＧＣＧＡＧＣＴＧＣＧＣＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＧＣＣＧＣＡＧＣＧＣＣＧＡＣＧＣＣＣＣＡＧＣＣＴＡＣＡＡＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＣＣＡＧＣＴＧＴＡＣＡＡＣＧＡＧＣＴＧＡＡＣＣＴＧＧＧＣＣＧＣＣＧＣＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＡＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＡＧＣＧＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＣＣＣＡＧＡＧＡＴＧＧＧＣＧＧＣＡＡＧＣＣＡＣＧＣＣＧＣＡＡＧＡＡＣＣＣＡＣＡＧＧＡＧＧＧＣＣＴＧＴＡＣＡＡＣＧＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＧＧＡＣＡＡＧＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＣＣＴＡＣＡＧＣＧＡＧＡＴＣＧＧＣＡＴＧＡＡＧＧＧＣＧＡＧＣＧＣＣＧＣＣＧＣＧＧＣＡＡＧＧＧＣＣＡＣＧＡＣＧＧＣＣＴＧＴＡＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＴＡＣＧＡＣＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＡＣＣＡＣＧＣＴＧＡ
リンカー配列（配列番号９１）
ＧＧＳＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴＧＧＳ
リンカー配列（配列番号９２）
ＧＧＧＳＧＧＧＳ
リンカー配列（配列番号９３）
ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ
リンカー配列（配列番号９４）
ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ
リンカー配列（配列番号９５）
ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ
リンカー配列（配列番号９６）
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
リンカー配列（配列番号９７）
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
リンカー配列（配列番号９８）
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
リンカー配列（配列番号９９）
ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ
リンカー配列（配列番号１００）
ＩＲＰＲＡＩＧＧＳＫＰＲＶＡ
リンカー配列（配列番号１０１）
ＧＫＧＧＳＧＫＧＧＳＧＫＧＧＳ
リンカー配列（配列番号１０２）
ＧＧＫＧＳＧＧＫＧＳＧＧＫＧＳ
リンカー配列（配列番号１０３）
ＧＧＧＫＳＧＧＧＫＳＧＧＧＫＳ
リンカー配列（配列番号１０４）
ＧＫＧＫＳＧＫＧＫＳＧＫＧＫＳ
リンカー配列（配列番号１０５）
ＧＧＧＫＳＧＧＫＧＳＧＫＧＧＳ
リンカー配列（配列番号１０６）
ＧＫＰＧＳＧＫＰＧＳＧＫＰＧＳ
リンカー配列（配列番号１０７）
ＧＫＰＧＳＧＫＰＧＳＧＫＰＧＳＧＫＰＧＳ
リンカー配列（配列番号１０８）
ＧＫＧＫＳＧＫＧＫＳＧＫＧＫＳＧＫＧＫＳ
リンカー配列（配列番号１０９）
ＳＴＡＧＤＴＨＬＧＧＥＤＦＤ
リンカー配列（配列番号１１０）
ＧＥＧＧＳＧＥＧＧＳＧＥＧＧＳ
リンカー配列（配列番号１１１）
ＧＧＥＧＳＧＧＥＧＳＧＧＥＧＳ
リンカー配列（配列番号１１２）
ＧＥＧＥＳＧＥＧＥＳＧＥＧＥＳ
リンカー配列（配列番号１１３）
ＧＧＧＥＳＧＧＥＧＳＧＥＧＧＳ
リンカー配列（配列番号１１４）
ＧＥＧＥＳＧＥＧＥＳＧＥＧＥＳＧＥＧＥＳ
リンカー配列（配列番号１１５）
ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ
リンカー配列（配列番号１１６）
ＰＲＧＡＳＫＳＧＳＡＳＱＴＧＳＡＰＧＳ
リンカー配列（配列番号１１７）
ＧＴＡＡＡＧＡＧＡＡＧＧＡＡＡＧＡＡＧ
リンカー配列（配列番号１１８）
ＧＴＳＧＳＳＧＳＧＳＧＧＳＧＳＧＧＧＧ
リンカー配列（配列番号１１９）
ＧＫＰＧＳＧＫＰＧＳＧＫＰＧＳＧＫＰＧＳ
リンカー配列（配列番号１２０）
ＧＳＧＳ
リンカー配列（配列番号１２１）
ＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰ
リンカー配列（配列番号１２２）
ＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰ
リンカー配列（配列番号１２３）
ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＡＫＥＡＡＡＡＫＥＡＡＡＡＫＡＡＡ
ヒンジ配列（配列番号１２４）
ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ
ヒンジ配列（配列番号１２５）
ＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰ
ヒンジ配列（配列番号１２６）
ＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＣＰＲＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰ
ヒンジ配列（配列番号１２７）
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰ

以下に、本願の当初の特許請求の範囲に記載の発明を列挙する。
［発明１］
細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、
前記細胞外抗原結合ドメインが、
配列番号６６のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号６７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、
配列番号５８のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号５９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、
配列番号３９のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号４０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、
配列番号４２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号４３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、又は
配列番号４５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号４６のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３
を含み、
前記細胞外抗原結合ドメインが、抗Ｇタンパク質受容体ファミリーＣグループ５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）抗原に結合する、
前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
［発明２］
配列番号６６のアミノ酸配列を有する前記重鎖ＣＤＲ１、配列番号６７のアミノ酸配列を有する前記重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６８のアミノ酸配列を有する前記重鎖ＣＤＲ３を含む、前記細胞外抗原結合ドメインが、配列番号６９のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号７０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号７１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を更に含む、
配列番号５８のアミノ酸配列を有する前記重鎖ＣＤＲ１、配列番号５９のアミノ酸配列を有する前記重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６０のアミノ酸配列を有する前記重鎖ＣＤＲ３を含む、前記細胞外抗原結合ドメインが、配列番号６１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を更に含む、
配列番号３９のアミノ酸配列を有する前記重鎖ＣＤＲ１、配列番号４０のアミノ酸配列を有する前記重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４１のアミノ酸配列を有する前記重鎖ＣＤＲ３を含む、前記細胞外抗原結合ドメインが、配列番号４８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４９のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を更に含む、
配列番号４２のアミノ酸配列を有する前記重鎖ＣＤＲ１、配列番号４３のアミノ酸配列を有する前記重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４４のアミノ酸配列を有する前記重鎖ＣＤＲ３を含む、前記細胞外抗原結合ドメインが、配列番号５１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を更に含む、又は
配列番号４５のアミノ酸配列を有する前記重鎖ＣＤＲ１、配列番号４６のアミノ酸配列を有する前記重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４７のアミノ酸配列を有する前記重鎖ＣＤＲ３を含む、前記細胞外抗原結合ドメインが、配列番号５４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を更に含む、
発明１に記載のＣＡＲ。
［発明３］
前記細胞外抗原結合ドメインが、配列番号７３、６５、１、３、及び５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、又は配列番号７２、６４、２、４、及び６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、又は配列番号７３、６５、１、３、及び５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲと、配列番号７２、６４、２、４、及び６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲとの組み合わせを含む、発明１又は２に記載のＣＡＲ。
［発明４］
前記細胞外抗原結合ドメインが、
配列番号７３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び配列番号７２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
配列番号６５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び配列番号６４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
配列番号１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
配列番号３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、又は
配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、
発明１～３のいずれか一つに記載のＣＡＲ。
［発明５］
前記細胞外抗原結合ドメインが、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む、発明１～４のいずれか一つに記載のＣＡＲ。
［発明６］
前記ｓｃＦｖが、前記軽鎖可変領域と前記重鎖可変領域との間にリンカーポリペプチドを含む、発明５に記載のＣＡＲ。
［発明７］
前記リンカーポリペプチドが、配列番号７のアミノ酸配列を含む、発明６に記載のＣＡＲ。
［発明８］
前記ｓｃＦｖが、配列番号７８、７７、７５、７６、８、９、１０、２４、２５、及び２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、発明５～７のいずれか一つに記載のＣＡＲ。
［発明９］
前記細胞外抗原結合ドメインが、シグナルポリペプチドを含む、発明１～８のいずれか一つに記載のＣＡＲ。
［発明１０］
前記シグナルポリペプチドが、配列番号１１のアミノ酸配列を含む、発明９に記載のＣＡＲ。
［発明１１］
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー９（ＣＤ１３７）成分、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３ゼータ鎖（ＣＤ３ｚ）成分、分化クラスタ（ＣＤ２７）成分、分化クラスタスーパーファミリーメンバー成分、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、ポリペプチド成分を含む、発明１～１０のいずれか一つに記載のＣＡＲ。
［発明１２］
前記ＣＤ１３７成分が、配列番号１２のアミノ酸配列を含む、発明１１に記載のＣＡＲ。
［発明１３］
前記ＣＤ３ｚ成分が、配列番号１３のアミノ酸配列を含む、発明１１記載のＣＡＲ。
［発明１４］
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号１４のアミノ酸配列を含む、発明１１に記載のＣＡＲ。
［発明１５］
前記膜貫通ドメインが、ＣＤ８ａ膜貫通領域（ＣＤ８Ａ－ＴＭ）ポリペプチドを含む、発明１～１４のいずれか一つに記載のＣＡＲ。
［発明１６］
前記ＣＤ８ａ－ＴＭポリペプチドが、配列番号１５のアミノ酸配列を含む、発明１５に記載のＣＡＲ。
［発明１７］
前記膜貫通ドメインを前記細胞外抗原結合ドメインに連結するヒンジ領域を更に含む、発明１～１６のいずれか一つに記載のＣＡＲ。
［発明１８］
前記ヒンジ領域が、ＣＤ８ａヒンジ領域である、発明１７に記載のＣＡＲ。
［発明１９］
前記ＣＤ８ａヒンジ領域が、配列番号１６のアミノ酸配列を含む、発明１８記載のＣＡＲ。
［発明２０］
前記細胞外抗原結合ドメインが、配列番号８２、８１、８０、７９、１７、１８、１９、２０、２１、及び２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、発明１～１９のいずれか一つに記載のＣＡＲ。
［発明２１］
前記ＣＡＲが、配列番号８６、８５、８３、８４、２７、２８、２９、３０、３１、及び３２からなる群から選択される、アミノ酸配列を含む、発明１～２０のいずれか一つに記載のＣＡＲ。
［発明２２］
発明１～２１のいずれか一つに記載のＣＡＲを発現する、単離されたリンパ球。
［発明２３］
前記リンパ球が、Ｔリンパ球である、発明２２に記載の単離されたリンパ球。
［発明２４］
前記Ｔリンパ球が、ナイーブＴ細胞である、発明２３に記載の単離されたリンパ球。
［発明２５］
前記Ｔリンパ球が、記憶幹Ｔ細胞である、発明２３に記載の単離されたリンパ球。
［発明２６］
前記Ｔリンパ球が、中央記憶Ｔ細胞である、発明２３に記載の単離されたリンパ球。
［発明２７］
前記Ｔリンパ球が、ＣＤ４＋である、発明２３～２６のいずれか一つに記載の単離されたリンパ球。
［発明２８］
前記Ｔリンパ球が、ＣＤ８＋である、発明２３～２６のいずれか一つに記載の単離されたリンパ球。
［発明２９］
前記Ｔリンパ球が、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋である、発明２３～２６のいずれか一つに記載の単離されたリンパ球。
［発明３０］
発明１～２９のいずれか一つに記載のＣＡＲをコードする、単離された核酸分子。
［発明３１］
前記核酸分子が、配列番号９０、８９、８７、８８、３３、３４、３５、３６、３７、及び３８からなる群から選択される、核酸配列を含む、発明３０に記載の単離された核酸分子。
［発明３２］
前記核酸分子が、配列番号９０、８９、８７、８８、３３、３４、３５、３６、３７、及び３８のヌクレオチド配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるヌクレオチド配列を含む、発明３０に記載の単離された核酸分子。
［発明３３］
発明３０～３２のいずれか一つに記載の核酸分子を含む、ベクター。
［発明３４］
発明３０～３２のいずれか一つに記載の核酸分子を発現する、細胞。
［発明３５］
発明２２～２９のいずれか一つに記載の有効量のリンパ球を含む、医薬組成物。
［発明３６］
発明２２～２９のいずれか一つに記載の有効量のリンパ球と、医薬的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
［発明３７］
治療において使用するための、発明１～２１のいずれか一つに記載のＣＡＲ、又は発明３５若しくは３６に記載の医薬組成物。
［発明３８］
癌を有する対象を治療する方法において使用するための、発明１～２１のいずれか一つに記載のＣＡＲ、又は発明３５若しくは３６に記載の医薬組成物。
［発明３９］
癌を有する対象を治療する方法であって、
治療有効量の発明２２～２９のいずれか一つに記載のリンパ球を、治療を必要とする対象に投与することを含み、それにより、前記リンパ球が、前記対象における癌細胞の死滅を誘導する、
前記方法。
［発明４０］
前記癌が、肺癌、胃癌、結腸癌、肝細胞癌、腎細胞癌、膀胱尿路上皮癌、転移性黒色腫、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、頭頸部癌、膵臓癌、神経膠腫、神経膠芽腫、及び非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、くすぶり型多発性骨髄腫（ＳＭＭ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される、発明３９に記載の方法、又は発明３８に記載の方法において使用するための前記ＣＡＲ若しくは前記医薬組成物。
［発明４１］
前記癌が、多発性骨髄腫である、発明３９若しくは４０に記載の方法、又は発明３８若しくは４０に記載の方法において使用するための前記ＣＡＲ若しくは前記医薬組成物。
［発明４２］
癌細胞の標的化死滅の方法であって、
前記癌細胞を、発明２２～２９のいずれか一つに記載のリンパ球と接触させることを含み、それにより、前記リンパ球が、前記癌細胞の死滅を誘導する、
前記方法。
［発明４３］
前記癌細胞が、肺癌、胃癌、結腸癌、肝細胞癌、腎細胞癌、膀胱尿路上皮癌、転移性黒色腫、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、頭頸部癌、膵臓癌、神経膠腫、神経膠芽腫、及び非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、くすぶり型多発性骨髄腫（ＳＭＭ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される、発明４２に記載の方法。
［発明４４］
前記癌細胞が、多発性骨髄腫細胞である、発明４２に記載の方法。
［発明４５］
対象における癌の存在を検出する方法であって、
（ａ）前記対象から得られた細胞サンプルを発明１に記載のＣＡＲと接触させることにより、ＣＡＲ－細胞複合体を形成すること、及び
（ｂ）前記複合体を検出することを含み、該複合体の検出が、前記対象における癌の存在を示す、
前記方法。

Claims (42)

  1. 細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、
    前記細胞外抗原結合ドメインが、
    （ａ）配列番号７３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び配列番号７２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、又は
    （ｂ）配列番号６５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び配列番号６４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
    を含み、
    前記細胞外抗原結合ドメインが、Ｇタンパク質受容体ファミリーＣグループ５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）抗原に結合する、
    前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
  2. 前記細胞外抗原結合ドメインが、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む、請求項１に記載のＣＡＲ。
  3. 前記ｓｃＦｖが、前記軽鎖可変領域と前記重鎖可変領域との間にリンカーポリペプチドを含む、請求項２に記載のＣＡＲ。
  4. 前記リンカーポリペプチドが、配列番号７のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のＣＡＲ。
  5. 前記ｓｃＦｖが、配列番号７８、７７、７５、及び７６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２～４のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  6. 前記細胞外抗原結合ドメインが、シグナルポリペプチドを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  7. 前記シグナルポリペプチドが、配列番号１１のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載のＣＡＲ。
  8. 前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー９（ＣＤ１３７）成分、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３ゼータ鎖（ＣＤ３ｚ）成分、分化クラスタ（ＣＤ２７）成分、分化クラスタスーパーファミリーメンバー成分、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、ポリペプチド成分を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  9. 前記ＣＤ１３７成分が、配列番号１２のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載のＣＡＲ。
  10. 前記ＣＤ３ｚ成分が、配列番号１３のアミノ酸配列を含む、請求項８記載のＣＡＲ。
  11. 前記細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号１４のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載のＣＡＲ。
  12. 前記膜貫通ドメインが、ＣＤ８ａ膜貫通領域（ＣＤ８Ａ－ＴＭ）ポリペプチドを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  13. 前記ＣＤ８ａ－ＴＭポリペプチドが、配列番号１５のアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載のＣＡＲ。
  14. 前記膜貫通ドメインを前記細胞外抗原結合ドメインに連結するヒンジ領域を更に含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  15. 前記ヒンジ領域が、ＣＤ８ａヒンジ領域である、請求項１４に記載のＣＡＲ。
  16. 前記ＣＤ８ａヒンジ領域が、配列番号１６のアミノ酸配列を含む、請求項１５記載のＣＡＲ。
  17. 前記細胞外抗原結合ドメインが、配列番号８２、８１、８０、及び７９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  18. 前記ＣＡＲが、配列番号８６、８５、８３、及び８４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  19. 請求項１～１８のいずれか一項に記載のＣＡＲを発現する、単離されたリンパ球。
  20. 前記リンパ球が、Ｔリンパ球である、請求項１９に記載の単離されたリンパ球。
  21. 前記Ｔリンパ球が、ナイーブＴ細胞である、請求項２０に記載の単離されたリンパ球。
  22. 前記Ｔリンパ球が、記憶幹Ｔ細胞である、請求項２０に記載の単離されたリンパ球。
  23. 前記Ｔリンパ球が、中央記憶Ｔ細胞である、請求項２０に記載の単離されたリンパ球。
  24. 前記Ｔリンパ球が、ＣＤ４＋である、請求項２０～２３のいずれか一項に記載の単離されたリンパ球。
  25. 前記Ｔリンパ球が、ＣＤ８＋である、請求項２０～２３のいずれか一項に記載の単離されたリンパ球。
  26. 前記Ｔリンパ球が、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋である、請求項２０～２３のいずれか一項に記載の単離されたリンパ球。
  27. 請求項１～１８のいずれか一項に記載のＣＡＲをコードする、単離された核酸分子。
  28. 前記核酸分子が、配列番号９０、８９、８７、及び８８からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項２７に記載の単離された核酸分子。
  29. 前記核酸分子が、配列番号９０、８９、８７、又は８８のヌクレオチド配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項２７に記載の単離された核酸分子。
  30. 請求項２７～２９のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、ベクター。
  31. 請求項２７～２９のいずれか一項に記載の核酸分子を発現する、細胞。
  32. 請求項１９～２６のいずれか一項に記載の有効量のリンパ球を含む、医薬組成物。
  33. 請求項１９～２６のいずれか一項に記載の有効量のリンパ球と、医薬的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
  34. 治療において使用するための、請求項１～１８のいずれか一項に記載のＣＡＲ、請求項１９～２６のいずれか一項に記載のリンパ球、又は請求項３２若しくは３３に記載の医薬組成物。
  35. 癌を有する対象を治療する方法において使用するための、請求項１～１８のいずれか一項に記載のＣＡＲ、請求項１９～２６のいずれか一項に記載のリンパ球、又は請求項３２若しくは３３に記載の医薬組成物。
  36. 癌を有する対象を治療する方法において使用するための、請求項１９～２６のいずれか一項に記載のリンパ球、又は請求項３２又は３３に記載の医薬組成物であって、
    前記方法は、治療有効量の前記リンパ球又は医薬組成物を、該治療を必要とする対象に投与することを含み、それにより、前記リンパ球又は医薬組成物が、前記対象における癌細胞の死滅を誘導する、
    前記リンパ球又は医薬組成物。
  37. 前記癌が、肺癌、胃癌、結腸癌、肝細胞癌、腎細胞癌、膀胱尿路上皮癌、転移性黒色腫、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、頭頸部癌、膵臓癌、神経膠腫、神経膠芽腫、及び非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、くすぶり型多発性骨髄腫（ＳＭＭ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３５に記載の方法において使用するための前記ＣＡＲ、前記リンパ球、若しくは前記医薬組成物、又は請求項３６に記載の方法において使用するための前記リンパ球、若しくは前記医薬組成物。
  38. 前記癌が、多発性骨髄腫である、請求項３５若しくは３７に記載の方法において使用するための前記ＣＡＲ、前記リンパ球、若しくは前記医薬組成物、又は請求項３６若しくは３７に記載の方法において使用するための前記リンパ球、若しくは前記医薬組成物。
  39. 癌細胞の標的化死滅のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、
    前記癌細胞を、請求項１９～２６のいずれか一項に記載のリンパ球と接触させることを含み、それにより、前記リンパ球が、前記癌細胞の死滅を誘導する、
    前記方法。
  40. 前記癌細胞が、肺癌、胃癌、結腸癌、肝細胞癌、腎細胞癌、膀胱尿路上皮癌、転移性黒色腫、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、頭頸部癌、膵臓癌、神経膠腫、神経膠芽腫、及び非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、くすぶり型多発性骨髄腫（ＳＭＭ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記癌細胞が、多発性骨髄腫細胞である、請求項４０に記載の方法。
  42. 対象における癌の存在を検出する方法において使用するための、請求項１～１８のいずれか一項に記載のＣＡＲであって、前記方法は、
    （ａ）前記対象から得られた細胞サンプルを請求項１～１８のいずれか一項に記載のＣＡＲと接触させることにより、ＣＡＲ－細胞複合体を形成すること、及び
    （ｂ）前記複合体を検出することを含み、該複合体の検出が、前記対象における癌の存在を示す、
    前記ＣＡＲ。
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