JP7284518B2 - テロメア結合タンパク質を阻害する化合物、及びそれを含むテロメア結合タンパク質阻害剤 - Google Patents

テロメア結合タンパク質を阻害する化合物、及びそれを含むテロメア結合タンパク質阻害剤 Download PDF

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Description

本発明は、テロメア結合タンパク質を阻害する化合物、及びそれを含むテロメア結合タンパク質阻害剤に関する。
ヒトの染色体ＤＮＡの末端には、テロメアとよばれる５’－ＴＴＡＧＧＧ－３’の繰り返し配列からなる二本鎖ＤＮＡが存在する。テロメアの最末端は、３’末端が突出しており、Ｇテイルと呼ばれる７５～３００塩基の一本鎖ＤＮＡ部分が形成されている。通常、Ｇテイルは、テロメア延長酵素であるテロメラーゼがアクセスする場合やＤＮＡの複製時以外は、ループを形成して保護された状態となっている（例えば、非特許文献１参照）。
従来から、テロメアのうち大部分を占める２本鎖部分は、細胞***が繰り返される度に短くなり、これが細胞老化に関与することが知られている。また、近年、二本鎖テロメアＤＮＡには結合しないがＧテイルには結合するタンパク質であるＰＯＴ１やそれらに結合するタンパク質ＰＩＰ１などが発見された。さらに、テロメアのＧテイルが、２本鎖部分とは全く異なる機能、例えば、下記のように細胞死の直接的シグナルや様々な細胞応答等に関係していることが明らかになってきた。
テロメアにはそれに結合するテロメア結合タンパク質が存在し、該テロメア結合タンパク質は、ＴＲＦ１（Ｔｅｌｏｍｅｒｅ ｒｅｐｅａｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）及びＴＲＦ２等が知られているが、癌細胞では、ＴＲＦ２がないと、Ｇテイルのループ形成ができなくなり、Ｇテイルの短縮が起こることが明らかとなっている（例えば、非特許文献２参照）。この場合、テロメア全長には変化が見られないにもかかわらず、Ｇテイルの短縮がみられ、さらには染色体末端の融合を引き起こしている。正常細胞の場合も、ＴＲＦ２の機能を細胞内で消失させるとＧテイルの短縮がおこり細胞増殖が停止して、老化することが知られている（例えば、非特許文献２参照）。この場合も、テロメア全長は変化しないことから、Ｇテイルの短縮が老化の引き金になっていると考えられている。
上記ＴＲＦ１やＴＲＦ２のみならず、ＡＴＭ、ＮＢＳ１、ＭＲＮなど様々なタンパク質がＧテイルのループ形成に要求されることが分かってきている。様々なＤＮＡ傷害剤や放射線によるＤＮＡの傷害に感受性のシグナルでは、テロメアの短縮が見られなくてもＧテイルの短縮がみられる。これは、ＤＮＡの修復に必要なタンパク質（ＡＴＭ、ＮＢＳ１及びＭＲＮなど）がリクルートされてくることからも明らかである。ＡＴＭは、血管拡張性疾患の原因遺伝子、ＮＢＳ１は、ナイミーヘン症候群の原因遺伝子である。なお、ナイミーヘン症候群は、高発ガン性、免疫不全、染色体不安定性、放射線感受性を特徴とする稀な常染色体劣性遺伝疾患である。これらのタンパク質がＧテイルにリクルートされることは、上記各疾患との関わりを示している。実際に、Ｇテイルのループののり付けとして機能しているＴＲＦ２の機能を阻害すると、ＡＴＭに依存したアポトーシスが誘導される（例えば、非特許文献３参照）。
さらに、Ｇテイルに特異的に作用する抗癌剤は、テロメアの短縮を伴わずにＧテイルの短縮を引き起こし、癌細胞を死に至らしめることも分かってきている（例えば、非特許文献４参照）。これらの結果から、ＤＮＡ障害をもたらす薬剤やストレスが、Ｇテイルを介して細胞にシグナルを伝え、様々な細胞応答を引き起こしているものと考えられる。また、多くの癌で変異が知られている癌抑制遺伝子産物ｐ５３は、Ｇテイルに結合していることもわかっており（例えば、非特許文献５参照）、癌及び老化に伴う疾患でもＧテイルの変化がシグナルとなっていることが明らかである。
特許第５６５２８５０号公報
グリフィス・ジェイ・ディー，コミュー・エル，ローゼンフィールド・エス，スタンセル・アール・エム，ビアンチ・エー，モス・エイチ及びデ・ランジェ・ティ(Griffith JD，Comeau L，Rosenfield S，Stansel RM，Bianchi A，Moss H and de Lange T.），Cell: 97(1999)，503-14. ファン・スティーンセル・ビィ，スモゴルゼウスカ・エイ及びデ・ランジェ・ティ．（van Steensel B，Smogorzewska A and de LangeT.），92(1998)，Cell :401-13. カールセダー・ジェイ，ブロッコリ・ディ，ダイ・ワイ，ハーディ・エス及びデ・ランジェ・ティ．（Karlseder J，Broccoli D，Dai Y，Hardy S and de Lange T.），Science: 283(1999)，1321-5. ゴメス・ディー，パテルスキ・アール，レマルテリュー・ティー，シン‐ヤ・ケイ，メルグニージェイ・エル及びリュオウ・ジェイ・エフ．（Gomez D，Paterski R，Lemarteleur T，Shin-Ya K，Mergny JL and Riou JF.），J Biol Chem:279(2004)，41487-94. スタンセル・アール・エム，サブラマニアン・ディー及びグリフィス・ジェイ・ディー．（Stansel RM，Subramanian D and Griffith JD.），J Biol Chem: 277(2002)，11625-8.
上述のように、テロメア結合タンパク質がＧテイルの維持に重要であるため、テロメア結合タンパク質を阻害することが種々の疾患の診断や治療薬開発などに利用できる可能性があると考えられる。しかしながら、テロメア結合タンパク質を阻害するような化合物は知られていない。
本発明は、前記の問題に鑑みてなされたものであり、その目的は、テロメア結合タンパク質を阻害する化合物を得ることにあり、また、当該化合物を疾患の診断や治療等に適用できるようにすることにある。
前記の目的を達成するために、本発明者らは、鋭意研究の結果、テロメア結合タンパク質を阻害する化合物を見出して本発明を完成した。
具体的に、本発明に係る化合物は、下記化学式で示される化合物であることを特徴とする。
Figure 0007284518000001
上記化学式中において、
Ｒ１は、酸素又は硫黄であり、
Ｒ２～Ｒ６は、互いに独立して、水素、炭素原子数が１～６のアルキル基、炭素原子数が１～６のアルコキシ基、炭素原子数が１～６のアシル基及びニトロ基から選択される。
また、本発明に係る化合物は、上記化学式中において、
Ｒ１は、酸素又は硫黄であり、
Ｒ２及びＲ４は、互いに独立して、水素又はニトロ基であり、
Ｒ３は、水素、ニトロ基、メチル基、メトキシ基又はブチル基であり、
Ｒ５は、水素、メチル基、メトキシ基又はアセチル基であり、
Ｒ６は、水素又はブチル基であることが好ましい。
また、本発明に係る化合物は、下記化学式のいずれかで示されることがより好ましい。
Figure 0007284518000002

本発明に係る化合物によると、テロメア結合タンパク質がテロメアＤＮＡに結合することを阻害できるため、Ｇテイルにおけるループ形成を阻害できる。その結果、Ｇテイルの短縮を促すことができて、細胞老化や細胞死を誘導することができる。従って、本発明に係る化合物は、細胞老化や細胞死を誘導する試薬として利用できる可能性があり、さらには、癌等の種々の疾患の治療薬開発等への応用の可能性もある。
本発明に係るテロメア結合タンパク質阻害剤は、上記化合物のいずれかを含むことを特徴とする。
本発明に係るテロメア結合タンパク質阻害剤において、テロメア結合タンパク質は、例えばＴＲＦ１、ＴＲＦ２又はＰＯＴ１等である。
本発明に係るテロメア結合タンパク質阻害剤によると、上記化合物を含むため、上述の通り、テロメア結合タンパク質がテロメアＤＮＡに結合することを阻害できる。このため、Ｇテイルにおけるループ形成を阻害でき、Ｇテイルの短縮を促すことができて、細胞老化や細胞死を誘導することができる。
以上から、本発明に係る上記化合物は、癌の治療や予防に利用できると考えられ、このため、本発明は上記の化合物を含む癌の治療又は予防用医薬組成物に関し、癌の治療又は予防用医薬組成物を製造するための上記化合物の使用にも関する。さらに、本発明は、上記の化合物を癌患者の癌を治療又は予防するために投与することを含む方法にも関する。
本発明に係る化合物、及びそれを含むテロメア結合タンパク質阻害剤によると、テロメア結合タンパク質がテロメアＤＮＡに結合することを阻害できるため、Ｇテイルにおけるループ形成を阻害できる。その結果、Ｇテイルの短縮を促すことができて、細胞老化や細胞死を誘導することができる。
本発明の実施例におけるＤＳＥ－ＦＲＥＴアッセイを説明するための図である。 本発明の実施例におけるＤＳＥ－ＦＲＥＴアッセイを説明するための図である。 本発明に係る化合物である化合物＃１９８によるＴＲＦ２のテロメア結合阻害効果を検討したクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイの結果を示す図である。（ａ）はＣｈＩＰアッセイの結果を示すメンブレンの写真であり、（ｂ）は（ａ）に示す結果について、画像解析ソフトを用いてシグナルを定量し、１０％ｉｎｐｕｔに対するＴＲＦ２抗体による免疫沈降物中のテロメアＤＮＡ量を算出した結果を示すグラフである。 本発明に係る化合物である化合物＃１９８によるＴＲＦ２のテロメア結合阻害効果を検討した蛍光免疫染色試験の結果を示す図である。（ａ）は蛍光顕微鏡で得られた写真であり、（ｂ）は（ａ）示す結果について、画像解析ソフトを用いて核内のＴＲＦ２ｆｏｃｉ数を計測した結果を示すグラフである。 本発明に係る化合物である化合物＃１９８によるＴＲＦ２のテロメア結合阻害効果を検討したテロメアＦＩＳＨ試験の結果を示す図である。（ａ）は蛍光顕微鏡で得られた写真であり、（ｂ）は（ａ）示す結果について、画像解析ソフトを用いてテロメアに局在している５３ＢＰ１（ＴＩＦ）を計測した結果を示すグラフである。 本発明に係る化合物である化合物＃１９８による細胞のアポトーシスの誘導効果を検討したＦＡＣＳ試験の結果を示す図である。 本発明に係る化合物である化合物＃１９８による細胞のアポトーシスの誘導効果を検討したウエスタンブロット試験の結果を示す図である。 本発明に係る化合物である化合物＃１９８による細胞増殖抑制効果を検討した細胞増殖試験の結果を示す図である。 本発明に係る化合物である化合物＃１９８による細胞増殖抑制効果を検討したコロニーフォーメーションアッセイの結果を示す図である。（ａ）は各条件での培養プレートを示す写真であり、（ｂ）は（ａ）に示す結果からコロニー数を計測した結果を示すグラフである。
以下、本発明を実施するための形態を図面に基づいて説明する。以下の好ましい実施形態の説明は、本質的に例示に過ぎず、本発明、その適用方法或いはその用途を制限することを意図するものではない。
本実施形態に係る化合物は、テロメア結合タンパク質を阻害する化合物である。また、本実施形態に係る化合物は、下記化学式で示される。
Figure 0007284518000003
なお、上記化学式中において、
Ｒ１は、酸素又は硫黄であり、
Ｒ２～Ｒ６は、互いに独立して、水素、炭素原子数が１～６のアルキル基、炭素原子数が１～６のアルコキシ基、炭素原子数が１～６のアシル基及びニトロ基から選択される。
また、本実施形態に係る化合物は、上記化学式中において、
Ｒ１は、酸素又は硫黄であり、
Ｒ２及びＲ４は、互いに独立して、水素又はニトロ基であり、
Ｒ３は、水素、ニトロ基、メチル基、メトキシ基又はブチル基であり、
Ｒ５は、水素、メチル基、メトキシ基又はアセチル基であり、
Ｒ６は、水素又はブチル基であることが好ましい。
本実施形態において、テロメア結合タンパク質は、例えばＴＲＦ１、ＴＲＦ２及びＰＯＴ１等である。また、本実施形態において、上記化合物は、特に当該テロメア結合タンパク質がテロメアに結合することを阻害する。
本実施形態における化合物はこのような特徴を有するため、テロメア結合タンパク質阻害剤に利用することもでき、さらに、癌の治療又は予防用の医薬組成物に利用することもできる。
以下に、本発明に係る化合物、及びそれを含むテロメア結合タンパク質を詳細に説明するための実施例を示す。
まず、ＤＳＥ－ＦＲＥＴアッセイ（上記特許文献１の特に第一の態様を参照）を用いて、テロメア結合タンパク質を阻害する化合物をスクリーニングした。なお、候補化合物には、独立行政法人産業技術総合研究所が保有する化合物ライブラリーの１２２１２種の化合物を用いた。ＤＳＥ－ＦＲＥＴアッセイの原理は特許文献１に記載されているが、以下にも簡単に説明する。
特許文献１に示すように、ＤＳＥ－ＦＲＥＴアッセイは、二つの核酸二本鎖部分（核酸二本鎖Ａ及び核酸二本鎖Ｂ）がそれらの末端配列において互いに結合してなる複合体（核酸二本鎖複合体）の構造変化により生じる新たな核酸二本鎖の量を測定することを特徴とする方法である。本願の図１に示すように、核酸二本鎖Ａは、核酸一本鎖である核酸Ａ１と核酸一本鎖である核酸Ａ２とからなり、かつ、末端配列において核酸二本鎖Ｂと結合し得る核酸二本鎖である。核酸二本鎖Ｂは、核酸一本鎖である核酸Ｂ１と核酸一本鎖である核酸Ｂ２とからなり、かつ、末端配列において核酸二本鎖Ａと結合し得る核酸二本鎖である。
核酸Ａ１、核酸Ａ２、核酸Ｂ１、核酸Ｂ２はそれぞれ、以下のように設計することができる。
・核酸Ａ１：第一のヌクレオチド配列および第二のヌクレオチド配列（末端配列）を有する核酸一本鎖。
・核酸Ａ２：第一のヌクレオチド配列に対応する配列および第三のヌクレオチド配列（末端配列）を有する核酸一本鎖。
・核酸Ｂ１：第二のヌクレオチド配列に対応する配列（末端配列）および第四のヌクレオチド配列を有する核酸一本鎖。
・核酸Ｂ２：第三のヌクレオチド配列に対応する配列（末端配列）および第四のヌクレオチド配列に対応する配列を有する核酸一本鎖。
核酸Ａ１、核酸Ａ２、核酸Ｂ１及び核酸Ｂ２の具体的な構造の一態様は、本願の図１に示すとおりである。
核酸Ａ１、核酸Ａ２、核酸Ｂ１、核酸Ｂ２については、核酸結合タンパク質の結合部位を有するように設計される。本実施例では、テロメア結合タンパク質のテロメア配列への結合及びその阻害を評価することを目的とするため、上記核酸結合タンパク質の結合部位は、テロメア結合タンパク質、特にＴＲＦ２の結合配列とした。配列の詳細は後に説明する。
当該方法は、核酸二本鎖間の構造変化が、核酸結合タンパク質の結合により阻害されることを利用するものである。核酸Ａ１及び核酸Ａ２で構成された核酸二本鎖Ａと、核酸Ｂ１及び核酸Ｂ２で構成された核酸二本鎖Ｂがそれらの末端配列において互いに結合してなる核酸二本鎖複合体は、鎖交換反応により構造変化をする。具体的に、図２（ａ）に示す核酸二本鎖Ａ及び核酸二本鎖Ｂの末端配列が互いに結合する核酸二本鎖複合体が、鎖交換反応により図２（ｂ）に示す構造に変化し、さらに図２（ｃ）に示す構造に変化する。なお、図２（ａ）～（ｃ）の構造変化は可逆的変化である。図２（ｃ）に示す構造から、さらに鎖交換反応が進行することにより、図２（ｄ）に示すように、核酸Ａ１及び核酸Ｂ１で構成された核酸二本鎖Ｃと、核酸Ａ２及び核酸Ｂ２で構成された核酸二本鎖Ｄとが生成される。なお、図２（ｃ）から（ｄ）への構造変化は不可逆反応である。これに対して、核酸結合タンパク質（テロメア結合タンパク質）が核酸二本鎖Ａ又は核酸二本鎖Ｂのいずれかに結合すると上記構造変化は阻害される。具体的に、図２（ｅ）に示すように、核酸二本鎖Ａ及び核酸二本鎖Ｂで構成された核酸二本鎖複合体に核酸結合タンパク質が結合した場合、図２（ｆ）に示すように鎖交換反応によって、ある程度の構造変化が進むものの、タンパク質が結合した部分においてタンパク質が鎖交換反応を阻害する。よって、この部分において鎖交換反応が中断されて、その結果、図２（ｇ）に示す構造には変化することができない。
従って、核酸二本鎖Ａ、Ｂと、核酸二本鎖Ｃ、Ｄとの量を測定することによって、上記鎖交換反応による構造変化の程度、すなわち、テロメア配列へのテロメア結合タンパク質の結合の程度を測定することができる。このような測定は、核酸二本鎖を標識することにより容易に行うことができる。以下の方法に限られないが、例えば核酸Ａ１の５’末端を蛍光物質で標識し、核酸Ｂ１の３’末端を消光物質で標識し、当該蛍光物質の蛍光強度を測定することによって、テロメア配列へのテロメア結合タンパク質の結合程度の測定が可能となる。
例えば、核酸Ａ１のうち、５’末端を蛍光物質で標識し、核酸Ｂ１のうち、３’末端は前記蛍光物質を消光する物質で標識した場合、図２（ａ）に示すように核酸二本鎖Ａ、Ｂにより核酸二本鎖複合体が形成されている時は蛍光を発する。一方、鎖交換反応が進行し、図２（ｂ）、（ｃ）に示すように、核酸Ａ１の５’末端と核酸Ｂ１の３’末端とが近づく、すなわち蛍光物質と消光物質とが近づくに従って、蛍光強度が低減する。さらに、鎖交換反応が進行し、図２（ｄ）に示すように、最終産物である核酸二本鎖Ｃ及び核酸二本鎖Ｄを形成すると、核酸Ｂ１の標識によって消光される。このため、蛍光値を測定することにより、容易に核酸二本鎖複合体と、核酸二本鎖Ｃ及び核酸二本鎖Ｄの量を測定することができる。なお、蛍光物質及び消光物質で標識する位置の組合せは、上記位置の組合せに限らず、鎖交換反応の進行で蛍光物質と消光物質との距離が近接する又は離間する位置であればよい。また、消光物質と蛍光物質は入れ替えることもできる。
以上の通り、ＴＲＦ２結合部位を有する上記核酸のいずれかにＴＲＦ２が結合しない場合（結合が阻害されている場合）は、上記鎖交換反応が進行して蛍光物質と消光物質の位置が近接することにより消光され、一方、ＴＲＦ２が結合する場合は、上記鎖交換が進行せず、蛍光物質と消光物質とが離間しているため蛍光が発せられる。すなわち、本方法によると、蛍光強度により、ＴＲＦ２の結合又はその阻害の程度を測定することが可能となる。
以下に、本実施例で行ったＤＳＥ－ＦＲＥＴアッセイの方法及び結果を説明する。
まず、上記核酸Ａ２に対応する合成オリゴヌクレオチドＴＬＭ－０６と、５’末端をＦＡＭ（蛍光物質）で標識した上記核酸Ａ１に対応する合成オリゴヌクレオチドＴＬＭ－０１－５Ｆとを、２０μＬの二本鎖形成溶液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ７．９）、５０ｍＭ ＫＣｌ、３０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、２．５ｍＭ ＤＴＴ、１０％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．０５％ ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ－６３０）中に混合した。その後、加熱変性とアニーリングによって末端に一本鎖を持つ上記核酸二本鎖Ａに対応する二本鎖Ｔ０１Ｆ／０６を調製した。Ｔ０１Ｃ／０６はＴＲＦ２結合配列を持つ。また、上記核酸Ｂ２に対応する合成オリゴヌクレオチドＴＬＭ－０５と、３’末端をＤａｂｃｙｌ（消光物質）で標識した上記核酸Ｂ１に対応する合成オリゴヌクレオチドＴＬＭ－０２－３Ｄとを、２０μＬの二本鎖形成溶液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ７．９）、５０ｍＭ ＫＣｌ、３０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、２．５ｍＭ ＤＴＴ、１０％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．０５％ ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ－６３０）中に混合した。その後、加熱変性とアニーリングによって末端に一本鎖を持つ上記核酸二本鎖Ｂに対応する二本鎖Ｔ０２Ｄ／０５を調製した。Ｔ０２Ｄ／０５はＴＲＦ２結合配列を持つ。合成オリゴヌクレオチドは全て２０ｐｍｏｌ使用した。なお、以後すべての標識については、日本バイオサービス社に合成を依頼して作製されたものを使用した。
加熱変性とアニーリングは以下の温度条件で行った。
95℃ 120秒 - 90℃ 30秒 - 85℃ 90秒 - 80℃ 90秒 - 77℃ 90秒 - 75℃ 90秒 - 72℃ 90秒 - 70℃ 90秒 - 67℃ 90秒 - 65℃ 90秒 - 62℃ 90秒 - 60℃ 90秒 - 57℃ 90秒 - 55℃ 90秒 - 52℃ 90秒 - 50℃ 90秒 - 47℃ 90秒 - 45℃ 90秒 - 42℃ 90秒 - 40℃ 90秒 - 37℃ 90秒 - 35℃ 90秒 - 32℃ 90秒 - 30℃ 90秒。
使用した配列は以下の通りである。なお、下線を引いた部分はＴＲＦ２結合配列であり、小文字の部分は核酸複合体を形成した際に一本鎖となる配列である。
ＴＬＭ－０１－５Ｆ：
5’ FAM- AGTTGAGTTAGGGTTAGGGT TAGGGTTAGG GCAGGcggtg tctcgctcgc 3’（配列番号１）
ＴＬＭ－０２－３Ｄ：
5’ gcgagcgagacaccgCCTGC CCTAACCCTA ACCCTAACCC TAACTCAACT -Dabcyl 3’（配列番号２）
ＴＬＭ－０５：
5’AGTTGAGTTA GGGTTAGGGT TAGGGTTAGG GCAGGcacca caccattccc 3’（配列番号３）
ＴＬＭ－０６：
5’gggaatggtg tggtgCCTGC CCTAACCCTA ACCCTAACCC TAACTCAACT 3’（配列番号４）
１００ｆｍｏｌのＴ０１Ｆ／０６と５０μＭの候補化合物を反応溶液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ ｐＨ７．９、１５０ｍＭ ＫＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＤＴＴ、１０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．０５％ ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ－６３０、２０μＬ）中に混合して、２５℃で３０分間反応させた。その後、Ｔ０１Ｆ／０６に、１００ｆｍｏｌのＴ０２Ｄ／０５をそれぞれ加えて５０μＬとした後、２５℃で１２０分間反応させた。Ｃｙ３の蛍光値の測定は、蛍光プレートリーダーＥｎＶｉｓｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ ｅｌｍｅｒ社）を用いた。
候補化合物のスクリーニングの結果、検出された蛍光強度が大きく、すなわち、ＴＲＦ２がその結合部位に結合することを阻害する化合物として下記化学式をもつ化合物＃１０が得られた。
Figure 0007284518000004
また、得られた化合物＃１０の構造に基づいて、これと類似する構造を有する化合物を合成し、上記スクリーニングを行った。その結果、検出された蛍光強度が大きく、ＴＲＦ２がその結合部位に結合することを阻害する化合物は以下の表１に示すとおりである。なお、候補化合物を反応溶液に混合していないコントロールの場合の蛍光強度を基準として、各化合物を反応溶液に混合した場合の蛍光強度の低減率を阻害率として算出した。
Figure 0007284518000005

Figure 0007284518000006


Figure 0007284518000007
上記表１に示した化合物は、下記化学式を共通の骨格として有していることが分かる。
Figure 0007284518000008
なお、上記化学式中において、
Ｒ１は、酸素又は硫黄であり、
Ｒ２及びＲ４は、互いに独立して、水素又はニトロ基であり、
Ｒ３は、水素、ニトロ基、メチル基、メトキシ基又はブチル基であり、
Ｒ５は、水素、メチル基、メトキシ基又はアセチル基であり、
Ｒ６は、水素又はブチル基である。
また、上記各化合物は、通常の合成法にて合成されるものである。例として、以下に化合物＃１９８の合成方法を示す。
Figure 0007284518000009
その他の化合物においても、当業者であれば上記化合物＃１９８の合成法の部分的変更、すなわち原料であるアミノフェノール誘導体およびハロゲン化アリールとして適当な置換其を有するものを用いることによって容易に合成可能である。例えば化合物＃２０７では、上記化合物＃１９８の合成法のうち［化６］中の２から３への合成を、２，４，６‐トリニトロクロロベンゼンの代わりに４-ヨードアニソールを用いることは、当業者には容易に想到可能である。
ここで、本実施例で用いた他の化合物の具体的な合成法を以下に示す。
Figure 0007284518000010

Figure 0007284518000011


Figure 0007284518000012
次に、上記スクリーニングの結果において、比較的に高いＴＲＦ２の阻害効果が認められた化合物＃１９８を用いて、ＴＲＦ２の阻害効果についてさらに検討した。そのために、ＴＲＦ２抗体を用いたクロマチン免疫沈降試験（ＣｈＩＰアッセイ）を行った。その方法及び結果を以下に説明する。
ＨｅＬａ１．２．１１細胞に化合物＃１９８（２０μＭ）又はコントロールとしてのＤＭＳＯを２４時間処理後、１％ホルムアルデヒドで固定した。その後、細胞をＬｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒ（１％ＳＤＳ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０））で溶かし、超音波によりクロマチンを断片化した。その後、ＴＲＦ２抗体（ｓａｎｔａｃｒｕｚ社，ｓｃ－８５２８）又はｎｏｒｍａｌｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（ｓａｎｔａｃｒｕｚ、ｓｃ－２０２５）を用いてクロマチン免疫沈降を行い、Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋ メンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ社、ＲＰＮ８２Ｂ）にＤＮＡを吸着後、ＤＩＧ標識テロメアプローブ（Ｄｉｇｏｌｉｇｏ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｔａｉｌｉｎｇｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ社、０３ ３５３ ５８３９１０）を用いて、１００ｐｍｏｌの３’－（ＣＣＣＴＡＡ）４－５’オリゴヌクレオチドの３’末端に、Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎを標識したもの）を反応させ、ルミノアナライザー（ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ社、ＬＡＳ４０００）にてシグナルを検出した。画像解析ソフトＩｍａｇｅＪを用いてシグナルを定量し、１０％ｉｎｐｕｔに対するＴＲＦ２抗体による免疫沈降物中のテロメアＤＮＡ量を算出した。その結果を図３に示す。なお、図３（ａ）はＨｙｂｏｎｄＮ＋ メンブレンの写真であり、（ｂ）は上記シグナル定量をしてテロメアＤＮＡ量を算出した結果を示すグラフである。
図３に示すように、ＤＭＳＯを用いたコントロールと比較して、化合物＃１９８を処理した場合ではテロメアＤＮＡの検出は５０％以下に抑制された。この結果から、化合物＃１９８によって、ＴＲＦ２がテロメアＤＮＡに結合することが阻害されることが示唆される。
次に、化合物＃１９８の処理の有無によるＴＲＦ２の細胞内局在を蛍光免疫染色法で検討した。その方法及び結果を以下に説明する。
８ｗｅｌｌ組織培養用カルチャースライド（松波硝子工業、ｓｃｓ－００８）に播種したＨｅＬａ１．２．１１細胞に化合物＃１９８（２０μＭ）又はコントロールとしてのＤＭＳＯを２４時間処理した。その後、ＰＢＳ（－）で２回洗浄し、０．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（ＷＡＫＯ社，５９１－１２１９１）／ＰＢＳ（－）を氷上で２分間処理し、４％ パラホルムアルデヒド（ＭＥＲＣＫ社，１．０４００５．１０００）／ＰＢＳ（－）を室温で１５分間処理した後、ＰＢＳ（－）で２回洗浄した。さらに０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００／ＰＢＳ（－）を氷上で１０分間処理した後、ＰＢＳ（－）で５回洗浄した。次に、３％ＢＳＡ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳ（－）で２００倍希釈したＴＲＦ２抗体（Ｎｏｖｕｓ社、ＮＢ１００－５６５０６）を３７℃で１時間反応させた後、ＰＢＳ（－）で２回洗浄した。次に、３％ＢＳＡ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳ（－）で５００倍希釈したＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８ Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ａ１１００１）を室温で４５分間反応させ、ＰＢＳ（－）で３回洗浄し、０．２５μｇ／ｍＬのＤＡＰＩ（同仁化学研究所、３４０－０７９７１）を室温で５分間反応させ、ＰＢＳ（－）で３回洗浄した。スライドガラスを封入後、蛍光顕微鏡（Ｚｗｉｓｓ社、Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００Ｍ）にて観測した。画像解析ソフトＣｏｌｕｍｂｕｓを用いて核内のＴＲＦ２ｆｏｃｉ数を計測した。その結果を図４に示す。なお、図４（ａ）は、蛍光顕微鏡を用いて得られた細胞の写真であり、図４（ａ）において、白い四角の領域を拡大したもの「Ｅｎｌａｒｇｅｄ」で示し、「Ｅｎｌａｒｇｅｄ」中の矢印は核外に存在するＴＲＦ２を示す。図４（ｂ）は、蛍光顕微鏡を用いて核内のＴＲＦ２ｆｏｃｉ数を計測し、コントロールを１．００としたときのＴＲＦ２ｆｏｃｉ数の割合を示すグラフである。
図４に示すように、ＤＭＳＯで処理されたコントロールでは、ＤＡＰＩにより染まった核内にＴＲＦ２が存在し、ＴＲＦ２が核内のＤＮＡに結合していると考えられる。一方、化合物＃１９８により処理された細胞では、ＴＲＦ２の多くが細胞の核の外側に存在している。この結果から、化合物＃１９８によってＴＲＦ２が核内でＤＮＡのＴＲＦ２結合部位に結合することを阻害することが示唆される。
次に、テロメアＦＩＳＨ法を用いて、テロメア異常における化合物＃１９８の影響について検討した。具体的に、テロメアにおいて異常が生じると、テロメアにおける５３ＢＰ１の局在を特徴とするＴＩＦ（ｔｅｌｏｍｅｒｅ－ｉｎｄｕｃｅｄＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｆｏｃｉ）が生じることが知られているため、テロメアＦＩＳＨ法を用いて、化合物＃１９８がテロメアにおける５３ＢＰ１の局在化に影響するか否かを検討した。以下にその方法及び結果を説明する。
８ｗｅｌｌ組織培養用カルチャースライドに播種したＨｅＬａ１．２．１１細胞に化合物 ＃１９８（１０μＭ）又はコントロールとしてのＤＭＳＯを２４時間処理した。その後、ＰＢＳ（－）で２回洗浄し、０．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（ＷＡＫＯ社，５９１－１２１９１）／ＰＢＳ（－）を氷上で２分間処理し、４％パラホルムアルデヒド（ＭＥＲＣＫ社，１．０４００５．１０００）／ＰＢＳ（－）を室温で１５分間処理した。その後、ＰＢＳ（－）で２回洗浄し、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００／ＰＢＳ（－）を氷上で１０分間処理した後、ＰＢＳ（－）で５回洗浄した。次に、Ｂｌｏｃｋｉｎｇｓｏｌｕｔｉｏｎ （１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ，３％ ｇｏａｔｓｅｒｕｍ，０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００， １ｍＭＥＤＴＡ ｐＨ８．０）を室温で３０分間処理し、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎで１０００倍に希釈した５３ＢＰ１抗体（Ｎｏｖｕｓ，ＮＢ１００－３０４）を３７℃で１時間反応させた後、ＰＢＳ（－）で２回洗浄した。次に、Ｂｌｏｃｋｉｎｇｓｏｌｕｔｉｏｎで５００倍に希釈したＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ＲａｂｂｉｔＩｇＧ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ａ１１００８）を室温で４５分間反応させ、ＰＢＳ（－）で３回洗浄し、４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ（－）を室温で５分間処理し、ＰＢＳ（－）で２回洗浄した。その後、７０％，９５％，１００％ＥｔＯＨを順に３，２，２分間処理した。風乾後、Ｃｙ－３標識３’－（ＣＣＣＴＡＡ）４－５’プローブ（ＰＡＮＡＧＥＮＥ社，Ｆ１００２）を８０℃で３分間反応させた。その後、ｗａｓｈｉｎｇｓｏｌｕｔｉｏｎ（７０％ｆｏｒｍａｍｉｄｅ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ７．２）） で洗浄し、ＰＢＳ（－）で３回洗浄後、０．２５μｇ／ｍＬのＤＡＰＩを室温で５分間反応させ、さらにＰＢＳ（－）で３回洗浄した。スライドガラスを封入後、蛍光顕微鏡（Ｚｗｉｓｓ社、Ａｘｉｏｖｅｒｔ２００Ｍ）にて観測した。画像解析ソフトＣｏｌｕｍｂｕｓを用いてテロメアに局在している５３ＢＰ１（ＴＩＦ）を計測した。核１個あたりＴＩＦが４個以上あったものをＴＩＦ陽性細胞とした。その結果を図５に示す。なお、図５（ａ）は蛍光顕微鏡を用いて得られた細胞の写真であり、矢印はテロメアと５３ＢＰ１との共局在が見られる部分を示す。図５（ｂ）は、蛍光顕微鏡を用いてその共局在が生じている、すなわちＴＩＦが生じている細胞数を計測し、その割合を算出した結果を示すグラフである。
図５に示すように、コントロールでは、テロメアと５３ＢＰ１との共局在はほとんど見られなかったが、化合物＃１９８で処理した細胞では、テロメアと５３ＢＰ１との共局在が認められた。すなわち、化合物＃１９８で処理した細胞では、ＴＩＦが生じており、テロメアに異常が生じていると考えられる。これは、化合物＃１９８がＴＲＦ２のテロメアへの結合を阻害していることに起因していると考えられる。
上記の通り、化合物＃１９８がテロメア異常を促すと考えられる。ここで、テロメア異常は細胞老化や細胞死に関連することが知られているため、化合物＃１９８により細胞のアポトーシスを引き起こすか否かについてＦＡＣＳを利用して検討した。その方法及び結果を以下に説明する。
ＨｅＬａ１．２．１１細胞を２０μＭの化合物＃１９８又はＤＭＳＯで４８時間処理した後に、上清ごと細胞を１５ｍＬチューブに回収し、１０００ｒｐｍで３分間遠心し、上清を取り除いた。５ｍｌのＰＢＳ（－）で細胞を再懸濁し１０００ｒｐｍで３分遠心し、上清を除いた。５００μｌの１×Ｂｉｎｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒ（ＭＢＬ社、４６９５－３００） で細胞を再懸濁し、このうち９０μｌを５ｍＬチューブ（ＢＤＦａｌｃｏｎ社、３５２０５２）へ移し、１０μｌのＡｎｎｅｘｉｎＶ－ＦＩＴＣ（ＭＢＬ社、４７００－１００）を加え染色した。遮光した状態で１５分インキュベートし、解析を行った。Ｃｅｌｌｓｏｒｔｅｒ（ＳＯＮＹ社、ＳＨ－８００）にてＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性細胞を検出した。結果を図６に示す。
図６に示すように、ＤＭＳＯ処理したコントロールと比較して、化合物＃１９８で処理した場合では多くの細胞がＡｎｎｅｘｉｎＶ陽性であった。すなわち、化合物＃１９８によって細胞のアポトーシスが誘導されることが示唆される。
さらに、別の方法により化合物＃１９８によって細胞のアポトーシスが誘導されることを証明するために、アポトーシスの極めて重要な因子として知られている切断型カスパーゼ３の発現が化合物＃１９８により促進されるか否かをウエスタンブロット法によって解析した。その方法及び結果を以下に説明する。
ＨｅＬａ１．２．１１細胞を２０μＭの化合物＃１９８又はＤＭＳＯで４８時間処理した後に、上清と共に細胞を１５ｍＬチューブに回収し、１０００ｒｐｍで３分間遠心し、上清を取り除いた。細胞ペレットを２×Ｓａｍｐｌｅｂｕｆｆｅｒ（１１７ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．８），１３％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，３．７％ＳＤＳ，２００ｍＭ ＤＴＴ，０．００４％Ｂｒｏｍｏ Ｐｈｅｎｏｌ Ｂｌｕｅ）で溶解し、９５℃で５分間熱変性を行った。８％アクリルアミドゲルに１０μｇのサンプルをＲｕｎｎｉｎｇｂｕｆｆｅｒ（２５ ｍＭ Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎｅ、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ）中、定電圧（１２０Ｖ）で泳動した。その後、ＰＶＤＦメンブレンフィルター Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ－Ｐ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）に転写し、抗原抗体反応を用いて目的のタンパクを検出した。用いた抗体は一次抗体にＢ－ａｃｔｉｎ（ＳＩＧＭＡ社、Ａ５４４１）又はＣｌｅａｖｅｄｃａｓｐａｓｅ３（ＣＳＴ社、Ｄ１７５）、二次抗体にＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ標識Ｇｏａｔ抗マウス／抗ラビット二次抗体（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１１１－０３５－００３／１１５－０３５－００３）を用い、シグナルの検出はルミノアナライザー （ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ社、ＬＡＳ４０００）を用いて検出した。その結果を図７に示す。
図７に示すように、ＤＭＳＯを処理したコントロールでは、切断型カスパーゼ３はほぼ見られなかったが、一方、化合物＃１９８を処理した細胞では切断型カスパーゼ３が検出された。この結果から、化合物＃１９８によって、切断型カスパーゼ３の生成が促進され、すなわち細胞のアポトーシスが誘導されると考えられる。
次に、化合物＃１９８の細胞増殖に対する影響を検討した。その方法及び結果を以下に示す。
ＨｅＬａ１．２．１１細胞を１×１０４ｃｅｌｌｓ／３５ｍｍｄｉｓｈで播種し、その翌日に、化合物＃１９８（５μＭ、１０μＭ、２０μＭ）又はコントロールとしてのＤＭＳＯを処理し（処理日を１日目とする）、１日目、３日目、５日目及び７日目に細胞を計数した。その結果を図８に示す。
図８に示すように、化合物＃１９８の処理濃度依存的に、細胞増殖が抑制された。
また、＃１９８以外における上記各候補化合物によるＨｅＬａ１．２．１１細胞の増殖に対する抑制効果を上記と同様に測定し、ＩＣ５０を算出した結果を以下の表２に示す。
Figure 0007284518000013
表２に示すように、化合物＃１９８以外の候補化合物も細胞増殖の抑制効果を奏することが明らかである。
次に、ＨｅＬａ１．２．１１細胞を１×１０３ｃｅｌｌｓ／１００ｍｍｄｉｓｈに播種した翌日に化合物＃１９８（５～２０μＭ）又はコントロールとしてのＤＭＳＯを処理し、播種してから１０日後、形成されたコロニーを１００％ＥｔＯＨで固定後、４％ギムザ染色液（武藤化学株式会社、１５００－２）／ＰＢＳ（－）を用いて染色し、計測した。その結果を図９に示す。なお、図９（ａ）は上記ギムザ染色をしたプレートの写真を示し、図９（ｂ）コロニーの生成割合を算出した結果を示すグラフである。
図９に示すように、化合物＃１９８の処理濃度依存的にコロニーの生成が抑制された。
以上、各実施例の結果から、本発明に係る化合物は、テロメア結合タンパク質のテロメア結合を阻害し、その結果、テロメアにおけるＧテイル形成を阻害して、Ｇテイルを短縮させると考えられる。これにより、本発明に係る化合物は、細胞の増殖抑制及びアポトーシスの誘導を引き起こすと考えられる。従って、本発明に係る化合物は、細胞老化や細胞死を誘導する試薬として利用できる可能性があり、さらには、癌等の種々の疾患の治療薬開発等への応用の可能性もある。

Claims (13)

  1. 下記化学式で示される化合物であって、
    Figure 0007284518000014
     上記化学式中において、
    Ｒ１は、酸素であり、
    Ｒ２～Ｒ６は、互いに独立して、水素、炭素原子数が１～６のアルキル基、炭素原子数が１～６のアルコキシ基、炭素原子数が１～６のアシル基、及びニトロ基のうちから選択されることを特徴とする化合物。
  2. 上記化学式中において、
    Ｒ１は、酸素であり、
    Ｒ２及びＲ４は、互いに独立して、水素又はニトロ基であり、
    Ｒ３は、水素、ニトロ基、メチル基、メトキシ基又はブチル基であり、
    Ｒ５は、水素、メチル基、メトキシ基又はアセチル基であり、
    Ｒ６は、水素又はブチル基である、
    ことを特徴とする請求項１に記載の化合物。
  3. Figure 0007284518000015
     上記化学式のいずれかで示されることを特徴とする請求項２に記載の化合物。
  4. 下記化学式で示される化合物を含むテロメア結合タンパク質がテロメアに結合することを阻害するためのテロメア結合タンパク質阻害剤であって、
    Figure 0007284518000016
     上記化学式中において、
    Ｒ１は、酸素又は硫黄であり、
    Ｒ２～Ｒ６は、互いに独立して、水素、炭素原子数が１～６のアルキル基、炭素原子数が１～６のアルコキシ基、炭素原子数が１～６のアシル基、及びニトロ基のうちから選択される、テロメア結合タンパク質阻害剤。
  5. 上記化学式中において、
    Ｒ１は、酸素又は硫黄であり、
    Ｒ２及びＲ４は、互いに独立して、水素又はニトロ基であり、
    Ｒ３は、水素、ニトロ基、メチル基、メトキシ基又はブチル基であり、
    Ｒ５は、水素、メチル基、メトキシ基又はアセチル基であり、
    Ｒ６は、水素又はブチル基である、請求項４に記載のテロメア結合タンパク質阻害剤。
  6. Figure 0007284518000017
     上記化学式のいずれかで示される化合物を含む請求項４に記載のテロメア結合タンパク質阻害剤。
  7. 前記テロメア結合タンパク質は、ＴＲＦ１、ＴＲＦ２又はＰＯＴ１であることを特徴とする請求項４に記載のテロメア結合タンパク質阻害剤。
  8. 下記化学式で示される化合物を含む癌の治療又は予防用医薬組成物であって、
    Figure 0007284518000018
     上記化学式中において、
    Ｒ１は、酸素又は硫黄であり、
    Ｒ２～Ｒ６は、互いに独立して、水素、炭素原子数が１～６のアルキル基、炭素原子数が１～６のアルコキシ基、炭素原子数が１～６のアシル基、及びニトロ基のうちから選択される、癌の治療又は予防用医薬組成物。
  9. 上記化学式中において、
    Ｒ１は、酸素又は硫黄であり、
    Ｒ２及びＲ４は、互いに独立して、水素又はニトロ基であり、
    Ｒ３は、水素、ニトロ基、メチル基、メトキシ基又はブチル基であり、
    Ｒ５は、水素、メチル基、メトキシ基又はアセチル基であり、
    Ｒ６は、水素又はブチル基である、請求項８に記載の医薬組成物。
  10. Figure 0007284518000019
     上記化学式のいずれかで示される化合物を含む請求項８に記載の医薬組成物。
  11. 癌の治療又は予防用医薬組成物を製造するための化合物の使用であって、
    Figure 0007284518000020
     上記化学式中において、
    Ｒ１は、酸素又は硫黄であり、
    Ｒ２～Ｒ６は、互いに独立して、水素、炭素原子数が１～６のアルキル基、炭素原子数が１～６のアルコキシ基、炭素原子数が１～６のアシル基、及びニトロ基のうちから選択される、化合物の使用。
  12. 上記化学式中において、
    Ｒ１は、酸素又は硫黄であり、
    Ｒ２及びＲ４は、互いに独立して、水素又はニトロ基であり、
    Ｒ３は、水素、ニトロ基、メチル基、メトキシ基又はブチル基であり、
    Ｒ５は、水素、メチル基、メトキシ基又はアセチル基であり、
    Ｒ６は、水素又はブチル基である、
    ことを特徴とする請求項１１に記載の使用。
  13. Figure 0007284518000021
     上記化合物は上記化学式のいずれかで示される化合物である請求項１１に記載の使用。
JP2020508284A 2018-03-20 2019-03-14 テロメア結合タンパク質を阻害する化合物、及びそれを含むテロメア結合タンパク質阻害剤 Active JP7284518B2 (ja)

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城間 喜智 他，ＤＳＥ－ＦＲＥＴ ａｓｓａｙを用いたテロメア結合タンパク質阻害剤開発と機能解析，日本生化学会大会，2017年，２Ｐ－１４３５
城間 喜智 他，ＤＳＥ－ＦＲＥＴ法を用いて得られたテロメア結合タンパク質ＴＲＦ２阻害剤，第２０回日本がん分子標的治療学会学術集会プログラム・抄録集，2016年，Ｐ２４－２
城間 喜智 他，テロメア結合タンパク質ＴＲＦ２の結合阻害剤ががん細胞に及ぼす影響，第７６日本癌学会学術総会抄録集，2017年，Ｊ－３１１９
城間 喜智，ＤＳＥ－ＦＲＥＴ法を用いたテロメア結合タンパク質 ＴＲＦ２阻害剤の探索，第１９回日本がん分子標的治療学会学術集会プログラム・抄録集，2015年，Ｐ３－３

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