JP7284518B2 - Compound that inhibits telomere-binding protein, and telomere-binding protein inhibitor containing the same - Google Patents

Compound that inhibits telomere-binding protein, and telomere-binding protein inhibitor containing the same Download PDF

Info

Publication number
JP7284518B2
JP7284518B2 JP2020508284A JP2020508284A JP7284518B2 JP 7284518 B2 JP7284518 B2 JP 7284518B2 JP 2020508284 A JP2020508284 A JP 2020508284A JP 2020508284 A JP2020508284 A JP 2020508284A JP 7284518 B2 JP7284518 B2 JP 7284518B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
group
hydrogen
telomere
compound
nucleic acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2020508284A
Other languages
Japanese (ja)
Other versions
JPWO2019181714A1 (en
Inventor
栄俊 田原
喜智 城間
敬 武田
道子 佐々木
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hiroshima University NUC
Original Assignee
Hiroshima University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hiroshima University NUC filed Critical Hiroshima University NUC
Publication of JPWO2019181714A1 publication Critical patent/JPWO2019181714A1/en
Application granted granted Critical
Publication of JP7284518B2 publication Critical patent/JP7284518B2/en
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C217/00—Compounds containing amino and etherified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C217/78—Compounds containing amino and etherified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having amino groups and etherified hydroxy groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of the same carbon skeleton
    • C07C217/80—Compounds containing amino and etherified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having amino groups and etherified hydroxy groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of the same carbon skeleton having amino groups and etherified hydroxy groups bound to carbon atoms of non-condensed six-membered aromatic rings
    • C07C217/82—Compounds containing amino and etherified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having amino groups and etherified hydroxy groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of the same carbon skeleton having amino groups and etherified hydroxy groups bound to carbon atoms of non-condensed six-membered aromatic rings of the same non-condensed six-membered aromatic ring
    • C07C217/92—Compounds containing amino and etherified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having amino groups and etherified hydroxy groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of the same carbon skeleton having amino groups and etherified hydroxy groups bound to carbon atoms of non-condensed six-membered aromatic rings of the same non-condensed six-membered aromatic ring the nitrogen atom of at least one of the amino groups being further bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/135—Amines having aromatic rings, e.g. ketamine, nortriptyline
    • A61K31/136—Amines having aromatic rings, e.g. ketamine, nortriptyline having the amino group directly attached to the aromatic ring, e.g. benzeneamine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C225/00—Compounds containing amino groups and doubly—bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton, at least one of the doubly—bound oxygen atoms not being part of a —CHO group, e.g. amino ketones
    • C07C225/22—Compounds containing amino groups and doubly—bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton, at least one of the doubly—bound oxygen atoms not being part of a —CHO group, e.g. amino ketones having amino groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of the carbon skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C323/00—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups
    • C07C323/23—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups, bound to the same carbon skeleton
    • C07C323/31—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups, bound to the same carbon skeleton having the sulfur atom of at least one of the thio groups bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring of the carbon skeleton
    • C07C323/33—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups, bound to the same carbon skeleton having the sulfur atom of at least one of the thio groups bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring of the carbon skeleton having at least one of the nitrogen atoms bound to a carbon atom of the same non-condensed six-membered aromatic ring
    • C07C323/35—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups, bound to the same carbon skeleton having the sulfur atom of at least one of the thio groups bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring of the carbon skeleton having at least one of the nitrogen atoms bound to a carbon atom of the same non-condensed six-membered aromatic ring the thio group being a sulfide group
    • C07C323/37—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups, bound to the same carbon skeleton having the sulfur atom of at least one of the thio groups bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring of the carbon skeleton having at least one of the nitrogen atoms bound to a carbon atom of the same non-condensed six-membered aromatic ring the thio group being a sulfide group the sulfur atom of the sulfide group being further bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Description

本発明は、テロメア結合タンパク質を阻害する化合物、及びそれを含むテロメア結合タンパク質阻害剤に関する。 The present invention relates to compounds that inhibit telomere binding proteins and telomere binding protein inhibitors containing the same.

ヒトの染色体ＤＮＡの末端には、テロメアとよばれる５’－ＴＴＡＧＧＧ－３’の繰り返し配列からなる二本鎖ＤＮＡが存在する。テロメアの最末端は、３’末端が突出しており、Ｇテイルと呼ばれる７５～３００塩基の一本鎖ＤＮＡ部分が形成されている。通常、Ｇテイルは、テロメア延長酵素であるテロメラーゼがアクセスする場合やＤＮＡの複製時以外は、ループを形成して保護された状態となっている（例えば、非特許文献１参照）。 At the end of human chromosomal DNA, there is a double-stranded DNA consisting of a repeated 5'-TTAGGG-3' sequence called telomere. The extreme end of the telomere has a protruding 3' end, forming a single-stranded DNA portion of 75 to 300 bases called a G tail. Normally, the G tail forms a loop and is protected except when accessed by telomerase, which is a telomere elongation enzyme, or during DNA replication (see, for example, Non-Patent Document 1).

従来から、テロメアのうち大部分を占める２本鎖部分は、細胞***が繰り返される度に短くなり、これが細胞老化に関与することが知られている。また、近年、二本鎖テロメアＤＮＡには結合しないがＧテイルには結合するタンパク質であるＰＯＴ１やそれらに結合するタンパク質ＰＩＰ１などが発見された。さらに、テロメアのＧテイルが、２本鎖部分とは全く異なる機能、例えば、下記のように細胞死の直接的シグナルや様々な細胞応答等に関係していることが明らかになってきた。 It is conventionally known that the double-stranded portion, which occupies the majority of telomeres, shortens each time cell division is repeated, and that this is involved in cellular senescence. In recent years, POT1, a protein that does not bind to double-stranded telomere DNA but binds to G tails, and PIP1, a protein that binds to them, have been discovered. Furthermore, it has become clear that the telomere G-tail is involved in functions completely different from those of the double-stranded portion, such as direct signaling of cell death and various cellular responses as described below.

テロメアにはそれに結合するテロメア結合タンパク質が存在し、該テロメア結合タンパク質は、ＴＲＦ１（Ｔｅｌｏｍｅｒｅ ｒｅｐｅａｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）及びＴＲＦ２等が知られているが、癌細胞では、ＴＲＦ２がないと、Ｇテイルのループ形成ができなくなり、Ｇテイルの短縮が起こることが明らかとなっている（例えば、非特許文献２参照）。この場合、テロメア全長には変化が見られないにもかかわらず、Ｇテイルの短縮がみられ、さらには染色体末端の融合を引き起こしている。正常細胞の場合も、ＴＲＦ２の機能を細胞内で消失させるとＧテイルの短縮がおこり細胞増殖が停止して、老化することが知られている（例えば、非特許文献２参照）。この場合も、テロメア全長は変化しないことから、Ｇテイルの短縮が老化の引き金になっていると考えられている。 There is a telomere-binding protein that binds to the telomere, and the telomere-binding protein is known to include TRF1 (Telomere repeat binding factor) and TRF2. is not possible, resulting in shortening of the G tail (see, for example, Non-Patent Document 2). In this case, shortening of the G tail is observed, and fusion of the chromosome ends is caused, although no change is observed in the total length of the telomere. In the case of normal cells as well, it is known that when the function of TRF2 is lost in the cells, G-tail shortening occurs, cell proliferation stops, and senescence occurs (see, for example, Non-Patent Document 2). In this case as well, since the total length of telomeres does not change, it is believed that the shortening of the G tail is the trigger for aging.

上記ＴＲＦ１やＴＲＦ２のみならず、ＡＴＭ、ＮＢＳ１、ＭＲＮなど様々なタンパク質がＧテイルのループ形成に要求されることが分かってきている。様々なＤＮＡ傷害剤や放射線によるＤＮＡの傷害に感受性のシグナルでは、テロメアの短縮が見られなくてもＧテイルの短縮がみられる。これは、ＤＮＡの修復に必要なタンパク質（ＡＴＭ、ＮＢＳ１及びＭＲＮなど）がリクルートされてくることからも明らかである。ＡＴＭは、血管拡張性疾患の原因遺伝子、ＮＢＳ１は、ナイミーヘン症候群の原因遺伝子である。なお、ナイミーヘン症候群は、高発ガン性、免疫不全、染色体不安定性、放射線感受性を特徴とする稀な常染色体劣性遺伝疾患である。これらのタンパク質がＧテイルにリクルートされることは、上記各疾患との関わりを示している。実際に、Ｇテイルのループののり付けとして機能しているＴＲＦ２の機能を阻害すると、ＡＴＭに依存したアポトーシスが誘導される（例えば、非特許文献３参照）。 It has been found that not only TRF1 and TRF2 but also various proteins such as ATM, NBS1, and MRN are required for G-tail loop formation. Signals sensitive to DNA damage by various DNA-damaging agents or radiation show G-tail shortening even in the absence of telomere shortening. This is also evident from the fact that proteins (ATM, NBS1, MRN, etc.) necessary for DNA repair are recruited. ATM is the causative gene of vasodilatation disease, and NBS1 is the causative gene of Nijmegen's syndrome. Nijmegen syndrome is a rare autosomal recessive genetic disease characterized by high carcinogenicity, immunodeficiency, chromosomal instability, and radiation sensitivity. Recruitment of these proteins to the G tail indicates their involvement in the above diseases. Indeed, inhibition of the function of TRF2, which functions as G-tail loop glue, induces ATM-dependent apoptosis (see, for example, Non-Patent Document 3).

さらに、Ｇテイルに特異的に作用する抗癌剤は、テロメアの短縮を伴わずにＧテイルの短縮を引き起こし、癌細胞を死に至らしめることも分かってきている（例えば、非特許文献４参照）。これらの結果から、ＤＮＡ障害をもたらす薬剤やストレスが、Ｇテイルを介して細胞にシグナルを伝え、様々な細胞応答を引き起こしているものと考えられる。また、多くの癌で変異が知られている癌抑制遺伝子産物ｐ５３は、Ｇテイルに結合していることもわかっており（例えば、非特許文献５参照）、癌及び老化に伴う疾患でもＧテイルの変化がシグナルとなっていることが明らかである。 Furthermore, it has been found that anticancer agents that specifically act on the G tail cause cancer cell death by shortening the G tail without shortening the telomere (see, for example, Non-Patent Document 4). These results suggest that drugs and stresses that cause DNA damage transmit signals to cells via the G tail, causing various cellular responses. In addition, it is known that the tumor suppressor gene product p53, which is known to be mutated in many cancers, binds to the G tail (see, for example, Non-Patent Document 5). It is clear that the change in is a signal.

特許第５６５２８５０号公報Japanese Patent No. 5652850

グリフィス・ジェイ・ディー，コミュー・エル，ローゼンフィールド・エス，スタンセル・アール・エム，ビアンチ・エー，モス・エイチ及びデ・ランジェ・ティ(Griffith JD，Comeau L，Rosenfield S，Stansel RM，Bianchi A，Moss H and de Lange T.），Cell: 97(1999)，503-14.Griffith Jay Dee, Comeau L, Rosenfield S, Stansel RM, Bianchi A, Mos H and De Lange Thi (Griffith JD, Comeau L, Rosenfield S, Stansel RM, Bianchi A, Moss H and de Lange T.), Cell: 97 (1999), 503-14. ファン・スティーンセル・ビィ，スモゴルゼウスカ・エイ及びデ・ランジェ・ティ．（van Steensel B，Smogorzewska A and de LangeT.），92(1998)，Cell :401-13.Van Steensel By, Smogorzewska Ai and De Lange Ti. (van Steensel B, Smogorzewska A and de Lange T.), 92 (1998), Cell: 401-13. カールセダー・ジェイ，ブロッコリ・ディ，ダイ・ワイ，ハーディ・エス及びデ・ランジェ・ティ．（Karlseder J，Broccoli D，Dai Y，Hardy S and de Lange T.），Science: 283(1999)，1321-5.Karlseder Jay, Broccoli Di, Dai Wai, Hardy S and De Lange Ti. (Karlseder J, Broccoli D, Dai Y, Hardy S and de Lange T.), Science: 283 (1999), 1321-5. ゴメス・ディー，パテルスキ・アール，レマルテリュー・ティー，シン‐ヤ・ケイ，メルグニージェイ・エル及びリュオウ・ジェイ・エフ．（Gomez D，Paterski R，Lemarteleur T，Shin-Ya K，Mergny JL and Riou JF.），J Biol Chem:279(2004)，41487-94.Gomez Dee, Paterski Earl, Remalterieu Thi, Shin-Ya Kei, MelgunyJ L and Ryuou J F. (Gomez D, Paterski R, Lemarteleur T, Shin-Ya K, Mergny JL and Riou JF.), J Biol Chem: 279 (2004), 41487-94. スタンセル・アール・エム，サブラマニアン・ディー及びグリフィス・ジェイ・ディー．（Stansel RM，Subramanian D and Griffith JD.），J Biol Chem: 277(2002)，11625-8.Stansel R.M., Subramanian Dee and Griffith J.D. (Stansel RM, Subramanian D and Griffith JD.), J Biol Chem: 277 (2002), 11625-8.

上述のように、テロメア結合タンパク質がＧテイルの維持に重要であるため、テロメア結合タンパク質を阻害することが種々の疾患の診断や治療薬開発などに利用できる可能性があると考えられる。しかしながら、テロメア結合タンパク質を阻害するような化合物は知られていない。 As described above, since telomere-binding proteins are important for maintaining the G tail, inhibition of telomere-binding proteins may be useful for diagnosis of various diseases, development of therapeutic agents, and the like. However, no compounds are known that inhibit telomere binding proteins.

本発明は、前記の問題に鑑みてなされたものであり、その目的は、テロメア結合タンパク質を阻害する化合物を得ることにあり、また、当該化合物を疾患の診断や治療等に適用できるようにすることにある。 The present invention has been made in view of the above problems, and an object of the present invention is to obtain a compound that inhibits telomere-binding protein, and to enable the compound to be applied to diagnosis, treatment, etc. of diseases. That's what it is.

前記の目的を達成するために、本発明者らは、鋭意研究の結果、テロメア結合タンパク質を阻害する化合物を見出して本発明を完成した。 In order to achieve the above object, the present inventors have made intensive research and found a compound that inhibits telomere binding protein, thereby completing the present invention.

具体的に、本発明に係る化合物は、下記化学式で示される化合物であることを特徴とする。 Specifically, the compound according to the present invention is characterized by being a compound represented by the following chemical formula.

Figure 0007284518000001

上記化学式中において、
Ｒ１は、酸素又は硫黄であり、
Ｒ２～Ｒ６は、互いに独立して、水素、炭素原子数が１～６のアルキル基、炭素原子数が１～６のアルコキシ基、炭素原子数が１～６のアシル基及びニトロ基から選択される。
Figure 0007284518000001
In the above chemical formula,
R 1 is oxygen or sulfur,
R 2 to R 6 are each independently selected from hydrogen, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, an acyl group having 1 to 6 carbon atoms and a nitro group; selected.

また、本発明に係る化合物は、上記化学式中において、
Ｒ１は、酸素又は硫黄であり、
Ｒ２及びＲ４は、互いに独立して、水素又はニトロ基であり、
Ｒ３は、水素、ニトロ基、メチル基、メトキシ基又はブチル基であり、
Ｒ５は、水素、メチル基、メトキシ基又はアセチル基であり、
Ｒ６は、水素又はブチル基であることが好ましい。In the above chemical formula, the compound according to the present invention is
R 1 is oxygen or sulfur,
R 2 and R 4 are independently of each other hydrogen or a nitro group;
R 3 is hydrogen, a nitro group, a methyl group, a methoxy group or a butyl group,
R5 is hydrogen, methyl group, methoxy group or acetyl group,
R6 is preferably hydrogen or a butyl group.

また、本発明に係る化合物は、下記化学式のいずれかで示されることがより好ましい。 Moreover, the compound according to the present invention is more preferably represented by any one of the following chemical formulas.

Figure 0007284518000002
Figure 0007284518000002


本発明に係る化合物によると、テロメア結合タンパク質がテロメアＤＮＡに結合することを阻害できるため、Ｇテイルにおけるループ形成を阻害できる。その結果、Ｇテイルの短縮を促すことができて、細胞老化や細胞死を誘導することができる。従って、本発明に係る化合物は、細胞老化や細胞死を誘導する試薬として利用できる可能性があり、さらには、癌等の種々の疾患の治療薬開発等への応用の可能性もある。 The compounds according to the present invention can inhibit the binding of telomere-binding proteins to telomere DNA, thereby inhibiting loop formation in the G tail. As a result, shortening of the G tail can be promoted, and cell senescence and cell death can be induced. Therefore, the compound according to the present invention may be used as a reagent that induces cell senescence or cell death, and may also be applied to the development of therapeutic agents for various diseases such as cancer.

本発明に係るテロメア結合タンパク質阻害剤は、上記化合物のいずれかを含むことを特徴とする。 The telomere binding protein inhibitor according to the present invention is characterized by containing any one of the above compounds.

本発明に係るテロメア結合タンパク質阻害剤において、テロメア結合タンパク質は、例えばＴＲＦ１、ＴＲＦ２又はＰＯＴ１等である。 In the telomere-binding protein inhibitor according to the present invention, the telomere-binding protein is, for example, TRF1, TRF2 or POT1.

本発明に係るテロメア結合タンパク質阻害剤によると、上記化合物を含むため、上述の通り、テロメア結合タンパク質がテロメアＤＮＡに結合することを阻害できる。このため、Ｇテイルにおけるループ形成を阻害でき、Ｇテイルの短縮を促すことができて、細胞老化や細胞死を誘導することができる。 Since the telomere-binding protein inhibitor according to the present invention contains the above compound, it can inhibit the binding of telomere-binding protein to telomere DNA, as described above. Therefore, it can inhibit loop formation in the G tail, promote shortening of the G tail, and induce cell senescence and cell death.

以上から、本発明に係る上記化合物は、癌の治療や予防に利用できると考えられ、このため、本発明は上記の化合物を含む癌の治療又は予防用医薬組成物に関し、癌の治療又は予防用医薬組成物を製造するための上記化合物の使用にも関する。さらに、本発明は、上記の化合物を癌患者の癌を治療又は予防するために投与することを含む方法にも関する。 From the above, it is considered that the above compounds according to the present invention can be used for the treatment or prevention of cancer. It also relates to the use of the above compounds for the manufacture of a pharmaceutical composition for. Further, the present invention also relates to methods comprising administering a compound as described above to treat or prevent cancer in a cancer patient.

本発明に係る化合物、及びそれを含むテロメア結合タンパク質阻害剤によると、テロメア結合タンパク質がテロメアＤＮＡに結合することを阻害できるため、Ｇテイルにおけるループ形成を阻害できる。その結果、Ｇテイルの短縮を促すことができて、細胞老化や細胞死を誘導することができる。 The compounds according to the present invention and telomere-binding protein inhibitors containing the same can inhibit the binding of telomere-binding proteins to telomere DNA, thereby inhibiting loop formation in the G tail. As a result, shortening of the G tail can be promoted, and cell senescence and cell death can be induced.

本発明の実施例におけるＤＳＥ－ＦＲＥＴアッセイを説明するための図である。FIG. 4 is a diagram for explaining the DSE-FRET assay in Examples of the present invention; 本発明の実施例におけるＤＳＥ－ＦＲＥＴアッセイを説明するための図である。FIG. 4 is a diagram for explaining the DSE-FRET assay in Examples of the present invention; 本発明に係る化合物である化合物＃１９８によるＴＲＦ２のテロメア結合阻害効果を検討したクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイの結果を示す図である。（ａ）はＣｈＩＰアッセイの結果を示すメンブレンの写真であり、（ｂ）は（ａ）に示す結果について、画像解析ソフトを用いてシグナルを定量し、１０％ｉｎｐｕｔに対するＴＲＦ２抗体による免疫沈降物中のテロメアＤＮＡ量を算出した結果を示すグラフである。FIG. 4 shows the results of a chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay for examining the telomere binding inhibitory effect of TRF2 by compound #198, which is a compound of the present invention. (a) is a photograph of the membrane showing the results of the ChIP assay, (b) is the result shown in (a), the signal was quantified using image analysis software, and the immunoprecipitate with TRF2 antibody for 10% input It is a graph showing the results of calculating the amount of telomere DNA. 本発明に係る化合物である化合物＃１９８によるＴＲＦ２のテロメア結合阻害効果を検討した蛍光免疫染色試験の結果を示す図である。（ａ）は蛍光顕微鏡で得られた写真であり、（ｂ）は（ａ）示す結果について、画像解析ソフトを用いて核内のＴＲＦ２ｆｏｃｉ数を計測した結果を示すグラフである。FIG. 19 shows the results of a fluorescent immunostaining test for examining the telomere binding inhibitory effect of TRF2 by compound #198, which is a compound according to the present invention. (a) is a photograph obtained with a fluorescence microscope, and (b) is a graph showing the results of measuring the number of TRF2foci in the nucleus using image analysis software for the results shown in (a). 本発明に係る化合物である化合物＃１９８によるＴＲＦ２のテロメア結合阻害効果を検討したテロメアＦＩＳＨ試験の結果を示す図である。（ａ）は蛍光顕微鏡で得られた写真であり、（ｂ）は（ａ）示す結果について、画像解析ソフトを用いてテロメアに局在している５３ＢＰ１（ＴＩＦ）を計測した結果を示すグラフである。FIG. 2 shows the results of a telomere FISH test in which the telomere binding inhibitory effect of TRF2 by compound #198, which is a compound according to the present invention, was investigated. (a) is a photograph obtained with a fluorescence microscope, and (b) is a graph showing the results of measuring 53BP1 (TIF) localized at telomeres using image analysis software for the results shown in (a). be. 本発明に係る化合物である化合物＃１９８による細胞のアポトーシスの誘導効果を検討したＦＡＣＳ試験の結果を示す図である。FIG. 2 is a diagram showing the results of a FACS test examining the cell apoptosis-inducing effect of compound #198, which is a compound of the present invention. 本発明に係る化合物である化合物＃１９８による細胞のアポトーシスの誘導効果を検討したウエスタンブロット試験の結果を示す図である。FIG. 2 is a diagram showing the results of a Western blot test examining the cell apoptosis-inducing effect of compound #198, which is a compound of the present invention. 本発明に係る化合物である化合物＃１９８による細胞増殖抑制効果を検討した細胞増殖試験の結果を示す図である。FIG. 2 shows the results of a cell proliferation test in which the cell proliferation inhibitory effect of compound #198, which is a compound of the present invention, was examined. 本発明に係る化合物である化合物＃１９８による細胞増殖抑制効果を検討したコロニーフォーメーションアッセイの結果を示す図である。（ａ）は各条件での培養プレートを示す写真であり、（ｂ）は（ａ）に示す結果からコロニー数を計測した結果を示すグラフである。FIG. 2 shows the results of a colony formation assay in which the cell growth inhibitory effect of compound #198, which is a compound of the present invention, was investigated. (a) is a photograph showing a culture plate under each condition, and (b) is a graph showing the results of counting the number of colonies from the results shown in (a).

以下、本発明を実施するための形態を図面に基づいて説明する。以下の好ましい実施形態の説明は、本質的に例示に過ぎず、本発明、その適用方法或いはその用途を制限することを意図するものではない。 EMBODIMENT OF THE INVENTION Hereinafter, the form for implementing this invention is demonstrated based on drawing. The following description of preferred embodiments is merely exemplary in nature and is not intended to limit the invention, its application or its uses.

本実施形態に係る化合物は、テロメア結合タンパク質を阻害する化合物である。また、本実施形態に係る化合物は、下記化学式で示される。 A compound according to this embodiment is a compound that inhibits telomere binding protein. Further, the compound according to this embodiment is represented by the following chemical formula.

Figure 0007284518000003

なお、上記化学式中において、
Ｒ１は、酸素又は硫黄であり、
Ｒ２～Ｒ６は、互いに独立して、水素、炭素原子数が１～６のアルキル基、炭素原子数が１～６のアルコキシ基、炭素原子数が１～６のアシル基及びニトロ基から選択される。
Figure 0007284518000003
In the above chemical formula,
R 1 is oxygen or sulfur,
R 2 to R 6 are each independently selected from hydrogen, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, an acyl group having 1 to 6 carbon atoms and a nitro group; selected.

また、本実施形態に係る化合物は、上記化学式中において、
Ｒ１は、酸素又は硫黄であり、
Ｒ２及びＲ４は、互いに独立して、水素又はニトロ基であり、
Ｒ３は、水素、ニトロ基、メチル基、メトキシ基又はブチル基であり、
Ｒ５は、水素、メチル基、メトキシ基又はアセチル基であり、
Ｒ６は、水素又はブチル基であることが好ましい。In the above chemical formula, the compound according to the present embodiment is
R 1 is oxygen or sulfur,
R 2 and R 4 are independently of each other hydrogen or a nitro group;
R 3 is hydrogen, a nitro group, a methyl group, a methoxy group or a butyl group,
R5 is hydrogen, methyl group, methoxy group or acetyl group,
R6 is preferably hydrogen or a butyl group.

本実施形態において、テロメア結合タンパク質は、例えばＴＲＦ１、ＴＲＦ２及びＰＯＴ１等である。また、本実施形態において、上記化合物は、特に当該テロメア結合タンパク質がテロメアに結合することを阻害する。 In this embodiment, telomere-binding proteins are, for example, TRF1, TRF2 and POT1. In addition, in this embodiment, the compound particularly inhibits binding of the telomere-binding protein to telomeres.

本実施形態における化合物はこのような特徴を有するため、テロメア結合タンパク質阻害剤に利用することもでき、さらに、癌の治療又は予防用の医薬組成物に利用することもできる。 Since the compound of the present embodiment has such characteristics, it can be used as a telomere-binding protein inhibitor and also as a pharmaceutical composition for treating or preventing cancer.

以下に、本発明に係る化合物、及びそれを含むテロメア結合タンパク質を詳細に説明するための実施例を示す。 Examples are given below to describe in detail the compounds according to the present invention and telomere-binding proteins containing the same.

まず、ＤＳＥ－ＦＲＥＴアッセイ（上記特許文献１の特に第一の態様を参照）を用いて、テロメア結合タンパク質を阻害する化合物をスクリーニングした。なお、候補化合物には、独立行政法人産業技術総合研究所が保有する化合物ライブラリーの１２２１２種の化合物を用いた。ＤＳＥ－ＦＲＥＴアッセイの原理は特許文献１に記載されているが、以下にも簡単に説明する。 First, compounds that inhibit telomere binding proteins were screened using the DSE-FRET assay (see especially the first aspect of Patent Document 1 above). As the candidate compounds, 12212 kinds of compounds in the compound library owned by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology were used. The principle of the DSE-FRET assay is described in US Pat.

特許文献１に示すように、ＤＳＥ－ＦＲＥＴアッセイは、二つの核酸二本鎖部分（核酸二本鎖Ａ及び核酸二本鎖Ｂ）がそれらの末端配列において互いに結合してなる複合体（核酸二本鎖複合体）の構造変化により生じる新たな核酸二本鎖の量を測定することを特徴とする方法である。本願の図１に示すように、核酸二本鎖Ａは、核酸一本鎖である核酸Ａ１と核酸一本鎖である核酸Ａ２とからなり、かつ、末端配列において核酸二本鎖Ｂと結合し得る核酸二本鎖である。核酸二本鎖Ｂは、核酸一本鎖である核酸Ｂ１と核酸一本鎖である核酸Ｂ２とからなり、かつ、末端配列において核酸二本鎖Ａと結合し得る核酸二本鎖である。 As shown in Patent Document 1, the DSE-FRET assay uses a complex (nucleic acid duplex This is a method characterized by measuring the amount of new nucleic acid double strands generated by structural change of the main-strand complex). As shown in FIG. 1 of the present application, the nucleic acid double strand A consists of a nucleic acid single strand nucleic acid A1 and a nucleic acid single strand nucleic acid A2, and binds to the nucleic acid double strand B at the terminal sequence. It is the resulting nucleic acid double strand. The nucleic acid double strand B is composed of a nucleic acid single strand nucleic acid B1 and a nucleic acid single strand nucleic acid B2, and is a nucleic acid double strand capable of binding to the nucleic acid double strand A at the terminal sequence.

核酸Ａ１、核酸Ａ２、核酸Ｂ１、核酸Ｂ２はそれぞれ、以下のように設計することができる。
・核酸Ａ１：第一のヌクレオチド配列および第二のヌクレオチド配列（末端配列）を有する核酸一本鎖。
・核酸Ａ２：第一のヌクレオチド配列に対応する配列および第三のヌクレオチド配列（末端配列）を有する核酸一本鎖。
・核酸Ｂ１：第二のヌクレオチド配列に対応する配列（末端配列）および第四のヌクレオチド配列を有する核酸一本鎖。
・核酸Ｂ２：第三のヌクレオチド配列に対応する配列（末端配列）および第四のヌクレオチド配列に対応する配列を有する核酸一本鎖。Nucleic acid A1, nucleic acid A2, nucleic acid B1, and nucleic acid B2 can each be designed as follows.
• Nucleic acid A1: a nucleic acid single strand having a first nucleotide sequence and a second nucleotide sequence (terminal sequence).
• Nucleic acid A2: a nucleic acid single strand having a sequence corresponding to the first nucleotide sequence and a third nucleotide sequence (terminal sequence).
• Nucleic acid B1: a nucleic acid single strand having a sequence corresponding to a second nucleotide sequence (terminal sequence) and a fourth nucleotide sequence.
• Nucleic acid B2: a nucleic acid single strand having a sequence corresponding to the third nucleotide sequence (terminal sequence) and a sequence corresponding to the fourth nucleotide sequence.

核酸Ａ１、核酸Ａ２、核酸Ｂ１及び核酸Ｂ２の具体的な構造の一態様は、本願の図１に示すとおりである。 One aspect of specific structures of nucleic acid A1, nucleic acid A2, nucleic acid B1 and nucleic acid B2 is as shown in FIG. 1 of the present application.

核酸Ａ１、核酸Ａ２、核酸Ｂ１、核酸Ｂ２については、核酸結合タンパク質の結合部位を有するように設計される。本実施例では、テロメア結合タンパク質のテロメア配列への結合及びその阻害を評価することを目的とするため、上記核酸結合タンパク質の結合部位は、テロメア結合タンパク質、特にＴＲＦ２の結合配列とした。配列の詳細は後に説明する。 Nucleic acid A1, nucleic acid A2, nucleic acid B1, and nucleic acid B2 are designed to have binding sites for nucleic acid binding proteins. In this example, the binding site of the nucleic acid binding protein was the binding sequence of the telomere binding protein, particularly TRF2, for the purpose of evaluating the binding of the telomere binding protein to the telomere sequence and its inhibition. The details of the array will be explained later.

当該方法は、核酸二本鎖間の構造変化が、核酸結合タンパク質の結合により阻害されることを利用するものである。核酸Ａ１及び核酸Ａ２で構成された核酸二本鎖Ａと、核酸Ｂ１及び核酸Ｂ２で構成された核酸二本鎖Ｂがそれらの末端配列において互いに結合してなる核酸二本鎖複合体は、鎖交換反応により構造変化をする。具体的に、図２（ａ）に示す核酸二本鎖Ａ及び核酸二本鎖Ｂの末端配列が互いに結合する核酸二本鎖複合体が、鎖交換反応により図２（ｂ）に示す構造に変化し、さらに図２（ｃ）に示す構造に変化する。なお、図２（ａ）～（ｃ）の構造変化は可逆的変化である。図２（ｃ）に示す構造から、さらに鎖交換反応が進行することにより、図２（ｄ）に示すように、核酸Ａ１及び核酸Ｂ１で構成された核酸二本鎖Ｃと、核酸Ａ２及び核酸Ｂ２で構成された核酸二本鎖Ｄとが生成される。なお、図２（ｃ）から（ｄ）への構造変化は不可逆反応である。これに対して、核酸結合タンパク質（テロメア結合タンパク質）が核酸二本鎖Ａ又は核酸二本鎖Ｂのいずれかに結合すると上記構造変化は阻害される。具体的に、図２（ｅ）に示すように、核酸二本鎖Ａ及び核酸二本鎖Ｂで構成された核酸二本鎖複合体に核酸結合タンパク質が結合した場合、図２（ｆ）に示すように鎖交換反応によって、ある程度の構造変化が進むものの、タンパク質が結合した部分においてタンパク質が鎖交換反応を阻害する。よって、この部分において鎖交換反応が中断されて、その結果、図２（ｇ）に示す構造には変化することができない。 The method utilizes the fact that structural changes between nucleic acid double strands are inhibited by the binding of nucleic acid binding proteins. A nucleic acid double-stranded complex in which a nucleic acid double strand A composed of nucleic acid A1 and nucleic acid A2 and a nucleic acid double strand B composed of nucleic acid B1 and nucleic acid B2 are bound to each other at their terminal sequences Structural changes occur due to exchange reactions. Specifically, the nucleic acid double-stranded complex in which the terminal sequences of the nucleic acid double strand A and the nucleic acid double strand B shown in FIG. Then, the structure changes to that shown in FIG. 2(c). Note that the structural changes in FIGS. 2(a) to (c) are reversible changes. From the structure shown in FIG. 2(c), further strand exchange reaction proceeds to form a nucleic acid double strand C composed of nucleic acid A1 and nucleic acid B1, nucleic acid A2 and nucleic acid C as shown in FIG. 2(d) A nucleic acid double strand D composed of B2 is generated. Note that the structural change from FIG. 2(c) to (d) is an irreversible reaction. In contrast, when a nucleic acid-binding protein (telomere-binding protein) binds to either the nucleic acid double strand A or the nucleic acid double strand B, the above structural change is inhibited. Specifically, as shown in FIG. As shown, the strand exchange reaction causes some degree of structural change, but the protein inhibits the strand exchange reaction at the protein-bound portion. Therefore, the strand exchange reaction is interrupted at this portion, and as a result, the structure shown in FIG. 2(g) cannot be changed.

従って、核酸二本鎖Ａ、Ｂと、核酸二本鎖Ｃ、Ｄとの量を測定することによって、上記鎖交換反応による構造変化の程度、すなわち、テロメア配列へのテロメア結合タンパク質の結合の程度を測定することができる。このような測定は、核酸二本鎖を標識することにより容易に行うことができる。以下の方法に限られないが、例えば核酸Ａ１の５’末端を蛍光物質で標識し、核酸Ｂ１の３’末端を消光物質で標識し、当該蛍光物質の蛍光強度を測定することによって、テロメア配列へのテロメア結合タンパク質の結合程度の測定が可能となる。 Therefore, by measuring the amounts of the nucleic acid double strands A and B and the nucleic acid double strands C and D, the degree of structural change due to the strand exchange reaction, that is, the degree of binding of the telomere-binding protein to the telomere sequence can be measured. Such measurements can be easily performed by labeling the nucleic acid double strands. Although not limited to the following method, for example, the 5' end of nucleic acid A1 is labeled with a fluorescent substance, the 3' end of nucleic acid B1 is labeled with a quenching substance, and the fluorescence intensity of the fluorescent substance is measured to determine the telomere sequence. It is possible to measure the degree of binding of telomere binding proteins to.

例えば、核酸Ａ１のうち、５’末端を蛍光物質で標識し、核酸Ｂ１のうち、３’末端は前記蛍光物質を消光する物質で標識した場合、図２（ａ）に示すように核酸二本鎖Ａ、Ｂにより核酸二本鎖複合体が形成されている時は蛍光を発する。一方、鎖交換反応が進行し、図２（ｂ）、（ｃ）に示すように、核酸Ａ１の５’末端と核酸Ｂ１の３’末端とが近づく、すなわち蛍光物質と消光物質とが近づくに従って、蛍光強度が低減する。さらに、鎖交換反応が進行し、図２（ｄ）に示すように、最終産物である核酸二本鎖Ｃ及び核酸二本鎖Ｄを形成すると、核酸Ｂ１の標識によって消光される。このため、蛍光値を測定することにより、容易に核酸二本鎖複合体と、核酸二本鎖Ｃ及び核酸二本鎖Ｄの量を測定することができる。なお、蛍光物質及び消光物質で標識する位置の組合せは、上記位置の組合せに限らず、鎖交換反応の進行で蛍光物質と消光物質との距離が近接する又は離間する位置であればよい。また、消光物質と蛍光物質は入れ替えることもできる。 For example, when the 5′ end of nucleic acid A1 is labeled with a fluorescent substance and the 3′ end of nucleic acid B1 is labeled with a substance that quenches the fluorescent substance, two nucleic acids are formed as shown in FIG. Fluorescence is emitted when strands A and B form a nucleic acid double-stranded complex. On the other hand, as the strand exchange reaction progresses and the 5′ end of nucleic acid A1 and the 3′ end of nucleic acid B1 approach as shown in FIGS. , the fluorescence intensity decreases. Furthermore, when the strand exchange reaction proceeds to form the final product, nucleic acid double strand C and nucleic acid double strand D, as shown in FIG. 2(d), they are quenched by the label of nucleic acid B1. Therefore, the amounts of the nucleic acid double-stranded complex, the nucleic acid double-strand C and the nucleic acid double-strand D can be easily measured by measuring the fluorescence value. The combination of positions to be labeled with the fluorescent substance and the quencher is not limited to the combination of positions described above, and may be any position where the distance between the fluorescent substance and the quencher approaches or separates as the strand exchange reaction progresses. Also, the quenching substance and the fluorescent substance can be interchanged.

以上の通り、ＴＲＦ２結合部位を有する上記核酸のいずれかにＴＲＦ２が結合しない場合（結合が阻害されている場合）は、上記鎖交換反応が進行して蛍光物質と消光物質の位置が近接することにより消光され、一方、ＴＲＦ２が結合する場合は、上記鎖交換が進行せず、蛍光物質と消光物質とが離間しているため蛍光が発せられる。すなわち、本方法によると、蛍光強度により、ＴＲＦ２の結合又はその阻害の程度を測定することが可能となる。 As described above, when TRF2 does not bind to any of the above nucleic acids having a TRF2 binding site (when the binding is inhibited), the strand exchange reaction proceeds and the positions of the fluorescent substance and the quenching substance are close to each other. On the other hand, when TRF2 binds, the strand exchange does not proceed, and fluorescence is emitted because the fluorescent substance and the quenching substance are separated. That is, according to this method, it is possible to measure the degree of TRF2 binding or its inhibition based on fluorescence intensity.

以下に、本実施例で行ったＤＳＥ－ＦＲＥＴアッセイの方法及び結果を説明する。 The method and results of the DSE-FRET assay performed in this example are described below.

まず、上記核酸Ａ２に対応する合成オリゴヌクレオチドＴＬＭ－０６と、５’末端をＦＡＭ（蛍光物質）で標識した上記核酸Ａ１に対応する合成オリゴヌクレオチドＴＬＭ－０１－５Ｆとを、２０μＬの二本鎖形成溶液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ７．９）、５０ｍＭ ＫＣｌ、３０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、２．５ｍＭ ＤＴＴ、１０％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．０５％ ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ－６３０）中に混合した。その後、加熱変性とアニーリングによって末端に一本鎖を持つ上記核酸二本鎖Ａに対応する二本鎖Ｔ０１Ｆ／０６を調製した。Ｔ０１Ｃ／０６はＴＲＦ２結合配列を持つ。また、上記核酸Ｂ２に対応する合成オリゴヌクレオチドＴＬＭ－０５と、３’末端をＤａｂｃｙｌ（消光物質）で標識した上記核酸Ｂ１に対応する合成オリゴヌクレオチドＴＬＭ－０２－３Ｄとを、２０μＬの二本鎖形成溶液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ７．９）、５０ｍＭ ＫＣｌ、３０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、２．５ｍＭ ＤＴＴ、１０％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．０５％ ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ－６３０）中に混合した。その後、加熱変性とアニーリングによって末端に一本鎖を持つ上記核酸二本鎖Ｂに対応する二本鎖Ｔ０２Ｄ／０５を調製した。Ｔ０２Ｄ／０５はＴＲＦ２結合配列を持つ。合成オリゴヌクレオチドは全て２０ｐｍｏｌ使用した。なお、以後すべての標識については、日本バイオサービス社に合成を依頼して作製されたものを使用した。 First, a synthetic oligonucleotide TLM-06 corresponding to the above nucleic acid A2 and a synthetic oligonucleotide TLM-01-5F corresponding to the above nucleic acid A1 labeled with FAM (fluorescent substance) at the 5′ end were mixed in 20 μL of a double strand. It was mixed into a forming solution (10 mM HEPES-NaOH (pH 7.9), 50 mM KCl, 30 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 2.5 mM DTT, 10% Glycerol, 0.05% IGEPAL CA-630). After that, a double strand T01F/06 corresponding to the nucleic acid double strand A having a single strand at the end was prepared by heat denaturation and annealing. T01C/06 has a TRF2 binding sequence. Further, a synthetic oligonucleotide TLM-05 corresponding to the above nucleic acid B2 and a synthetic oligonucleotide TLM-02-3D corresponding to the above nucleic acid B1 labeled with Dabcyl (quencher) at the 3′ end were added to 20 μL of a double strand. It was mixed into a forming solution (10 mM HEPES-NaOH (pH 7.9), 50 mM KCl, 30 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 2.5 mM DTT, 10% Glycerol, 0.05% IGEPAL CA-630). After that, a double strand T02D/05 corresponding to the nucleic acid double strand B having a single strand at the end was prepared by heat denaturation and annealing. T02D/05 has a TRF2 binding sequence. 20 pmol of all synthetic oligonucleotides were used. Hereafter, for all the labels, those prepared by requesting synthesis from Japan Bio Service Co., Ltd. were used.

加熱変性とアニーリングは以下の温度条件で行った。
95℃ 120秒 - 90℃ 30秒 - 85℃ 90秒 - 80℃ 90秒 - 77℃ 90秒 - 75℃ 90秒 - 72℃ 90秒 - 70℃ 90秒 - 67℃ 90秒 - 65℃ 90秒 - 62℃ 90秒 - 60℃ 90秒 - 57℃ 90秒 - 55℃ 90秒 - 52℃ 90秒 - 50℃ 90秒 - 47℃ 90秒 - 45℃ 90秒 - 42℃ 90秒 - 40℃ 90秒 - 37℃ 90秒 - 35℃ 90秒 - 32℃ 90秒 - 30℃ 90秒。Heat denaturation and annealing were performed under the following temperature conditions.
95℃ 120 seconds - 90℃ 30 seconds - 85℃ 90 seconds - 80℃ 90 seconds - 77℃ 90 seconds - 75℃ 90 seconds - 72℃ 90 seconds - 70℃ 90 seconds - 67℃ 90 seconds - 65℃ 90 seconds - 62℃ 90 seconds - 60℃ 90 seconds - 57℃ 90 seconds - 55℃ 90 seconds - 52℃ 90 seconds - 50℃ 90 seconds - 47℃ 90 seconds - 45℃ 90 seconds - 42℃ 90 seconds - 40℃ 90 seconds - 37℃ 90 seconds - 35℃ 90 seconds - 32℃ 90 seconds - 30℃ 90 seconds.

使用した配列は以下の通りである。なお、下線を引いた部分はＴＲＦ２結合配列であり、小文字の部分は核酸複合体を形成した際に一本鎖となる配列である。
ＴＬＭ－０１－５Ｆ：
5’ FAM- AGTTGAGTTAGGGTTAGGGT TAGGGTTAGG GCAGGcggtg tctcgctcgc 3’（配列番号１）
ＴＬＭ－０２－３Ｄ：
5’ gcgagcgagacaccgCCTGC CCTAACCCTA ACCCTAACCC TAACTCAACT -Dabcyl 3’（配列番号２）
ＴＬＭ－０５：
5’AGTTGAGTTA GGGTTAGGGT TAGGGTTAGG GCAGGcacca caccattccc 3’（配列番号３）
ＴＬＭ－０６：
5’gggaatggtg tggtgCCTGC CCTAACCCTA ACCCTAACCC TAACTCAACT 3’（配列番号４）The sequences used are as follows. The underlined part is the TRF2 binding sequence, and the lower case part is the sequence that becomes single-stranded when the nucleic acid complex is formed.
TLM-01-5F:
5' FAM- AGTTGAG TTAGGGTTAGGGT TAGGGTTAGG CAGGcggtg tctcgctcgc 3' (SEQ ID NO: 1)
TLM-02-3D:
5′ gcgagcgagacaccgCCTG C CCTAACCCTA ACCTAACCC TAA CTCAACT-Dabcyl 3′ (SEQ ID NO: 2)
TLM-05:
5' AGTTGAG TTA GGGTTAGGGT TAGGGTTAGG G CAGGcacca caccattccc 3' (SEQ ID NO: 3)
TLM-06:
5' gggaatggtg tggtgCCTG C CCTAACCCTA ACCCTAACC TAA CTCAACT 3' (SEQ ID NO: 4)

１００ｆｍｏｌのＴ０１Ｆ／０６と５０μＭの候補化合物を反応溶液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ ｐＨ７．９、１５０ｍＭ ＫＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＤＴＴ、１０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．０５％ ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ－６３０、２０μＬ）中に混合して、２５℃で３０分間反応させた。その後、Ｔ０１Ｆ／０６に、１００ｆｍｏｌのＴ０２Ｄ／０５をそれぞれ加えて５０μＬとした後、２５℃で１２０分間反応させた。Ｃｙ３の蛍光値の測定は、蛍光プレートリーダーＥｎＶｉｓｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ ｅｌｍｅｒ社）を用いた。 100 fmol of T01F/06 and 50 μM of candidate compound in reaction solution (10 mM HEPES-NaOH pH 7.9, 150 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 5 mM DTT, 10% glycerol, 0.05% IGEPAL CA-630, 20 μL) Mixed and allowed to react for 30 minutes at 25°C. After that, 100 fmol of T02D/05 was added to each of T01F/06 to make 50 μL, and then reacted at 25° C. for 120 minutes. The fluorescence value of Cy3 was measured using a fluorescence plate reader EnVision (Perkin Elmer).

候補化合物のスクリーニングの結果、検出された蛍光強度が大きく、すなわち、ＴＲＦ２がその結合部位に結合することを阻害する化合物として下記化学式をもつ化合物＃１０が得られた。 As a result of screening candidate compounds, compound #10 having the following chemical formula was obtained as a compound that exhibits a high fluorescence intensity, that is, inhibits the binding of TRF2 to its binding site.

Figure 0007284518000004
Figure 0007284518000004

また、得られた化合物＃１０の構造に基づいて、これと類似する構造を有する化合物を合成し、上記スクリーニングを行った。その結果、検出された蛍光強度が大きく、ＴＲＦ２がその結合部位に結合することを阻害する化合物は以下の表１に示すとおりである。なお、候補化合物を反応溶液に混合していないコントロールの場合の蛍光強度を基準として、各化合物を反応溶液に混合した場合の蛍光強度の低減率を阻害率として算出した。 Further, based on the structure of the obtained compound #10, a compound having a similar structure was synthesized and screened as described above. As a result, compounds with high fluorescence intensity detected and inhibiting the binding of TRF2 to its binding site are shown in Table 1 below. Based on the fluorescence intensity of the control in which the candidate compound was not mixed in the reaction solution, the reduction rate of the fluorescence intensity when each compound was mixed in the reaction solution was calculated as the inhibition rate.

Figure 0007284518000005


Figure 0007284518000006


Figure 0007284518000007
Figure 0007284518000005

Figure 0007284518000006


Figure 0007284518000007

上記表１に示した化合物は、下記化学式を共通の骨格として有していることが分かる。 It can be seen that the compounds shown in Table 1 above have the following chemical formula as a common skeleton.

Figure 0007284518000008

なお、上記化学式中において、
Ｒ１は、酸素又は硫黄であり、
Ｒ２及びＲ４は、互いに独立して、水素又はニトロ基であり、
Ｒ３は、水素、ニトロ基、メチル基、メトキシ基又はブチル基であり、
Ｒ５は、水素、メチル基、メトキシ基又はアセチル基であり、
Ｒ６は、水素又はブチル基である。
Figure 0007284518000008
In the above chemical formula,
R 1 is oxygen or sulfur,
R 2 and R 4 are independently of each other hydrogen or a nitro group;
R 3 is hydrogen, a nitro group, a methyl group, a methoxy group or a butyl group,
R5 is hydrogen, methyl group, methoxy group or acetyl group,
R6 is hydrogen or a butyl group.

また、上記各化合物は、通常の合成法にて合成されるものである。例として、以下に化合物＃１９８の合成方法を示す。 Moreover, each of the above compounds is synthesized by a normal synthesis method. As an example, a method for synthesizing compound #198 is shown below.

Figure 0007284518000009
Figure 0007284518000009

その他の化合物においても、当業者であれば上記化合物＃１９８の合成法の部分的変更、すなわち原料であるアミノフェノール誘導体およびハロゲン化アリールとして適当な置換其を有するものを用いることによって容易に合成可能である。例えば化合物＃２０７では、上記化合物＃１９８の合成法のうち［化６］中の２から３への合成を、２，４，６‐トリニトロクロロベンゼンの代わりに４-ヨードアニソールを用いることは、当業者には容易に想到可能である。 Other compounds can be easily synthesized by those skilled in the art by partially modifying the synthesis method for compound #198, that is, by using aminophenol derivatives and aryl halides having suitable substituents as starting materials. is. For example, in compound #207, the synthesis of 2 to 3 in [Chem. It can be easily conceived by those skilled in the art.

ここで、本実施例で用いた他の化合物の具体的な合成法を以下に示す。 Here, specific synthesis methods of other compounds used in this example are shown below.

Figure 0007284518000010


Figure 0007284518000011


Figure 0007284518000012
Figure 0007284518000010

Figure 0007284518000011


Figure 0007284518000012

次に、上記スクリーニングの結果において、比較的に高いＴＲＦ２の阻害効果が認められた化合物＃１９８を用いて、ＴＲＦ２の阻害効果についてさらに検討した。そのために、ＴＲＦ２抗体を用いたクロマチン免疫沈降試験（ＣｈＩＰアッセイ）を行った。その方法及び結果を以下に説明する。 Next, the TRF2 inhibitory effect was further examined using compound #198, which was found to have a relatively high TRF2 inhibitory effect in the above screening results. Therefore, a chromatin immunoprecipitation test (ChIP assay) using TRF2 antibody was performed. The method and results are described below.

ＨｅＬａ１．２．１１細胞に化合物＃１９８（２０μＭ）又はコントロールとしてのＤＭＳＯを２４時間処理後、１％ホルムアルデヒドで固定した。その後、細胞をＬｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒ（１％ＳＤＳ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０））で溶かし、超音波によりクロマチンを断片化した。その後、ＴＲＦ２抗体（ｓａｎｔａｃｒｕｚ社，ｓｃ－８５２８）又はｎｏｒｍａｌｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（ｓａｎｔａｃｒｕｚ、ｓｃ－２０２５）を用いてクロマチン免疫沈降を行い、Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋ メンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ社、ＲＰＮ８２Ｂ）にＤＮＡを吸着後、ＤＩＧ標識テロメアプローブ（Ｄｉｇｏｌｉｇｏ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｔａｉｌｉｎｇｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ社、０３ ３５３ ５８３９１０）を用いて、１００ｐｍｏｌの３’－（ＣＣＣＴＡＡ）４－５’オリゴヌクレオチドの３’末端に、Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎを標識したもの）を反応させ、ルミノアナライザー（ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ社、ＬＡＳ４０００）にてシグナルを検出した。画像解析ソフトＩｍａｇｅＪを用いてシグナルを定量し、１０％ｉｎｐｕｔに対するＴＲＦ２抗体による免疫沈降物中のテロメアＤＮＡ量を算出した。その結果を図３に示す。なお、図３（ａ）はＨｙｂｏｎｄＮ＋ メンブレンの写真であり、（ｂ）は上記シグナル定量をしてテロメアＤＮＡ量を算出した結果を示すグラフである。HeLa1.2.11 cells were treated with compound #198 (20 μM) or DMSO as a control for 24 hours and then fixed with 1% formaldehyde. After that, the cells were lysed with Lysisbuffer (1% SDS, 10 mM EDTA (pH 8.0), 50 mM Tris-HCl (pH 8.0)), and chromatin was fragmented by ultrasound. Thereafter, chromatin immunoprecipitation was performed using TRF2 antibody (santacruz, sc-8528) or normalmouse IgG (santacruz, sc-2025), DNA was adsorbed to Hybond N + membrane (Amersham, RPN82B), and DIG-labeled telomere probe (100 pmol of 3′-(CCCTAA) 4-5 ′ oligonucleotide labeled with Digoxigenin at the 3′ end using Digoligo nucleotide Tailing kit (Roche, 03 353 583910)) was reacted with a luminometer (ImageQuant The signal was detected with LAS4000, Inc.). Signals were quantified using image analysis software ImageJ, and the amount of telomere DNA in the immunoprecipitate with TRF2 antibody against 10% input was calculated. The results are shown in FIG. FIG. 3(a) is a photograph of the HybondN+ membrane, and FIG. 3(b) is a graph showing the results of the above signal quantification to calculate the amount of telomeric DNA.

図３に示すように、ＤＭＳＯを用いたコントロールと比較して、化合物＃１９８を処理した場合ではテロメアＤＮＡの検出は５０％以下に抑制された。この結果から、化合物＃１９８によって、ＴＲＦ２がテロメアＤＮＡに結合することが阻害されることが示唆される。 As shown in FIG. 3, the detection of telomeric DNA was suppressed to 50% or less when treated with compound #198 compared to the control using DMSO. This result suggests that compound #198 inhibits the binding of TRF2 to telomeric DNA.

次に、化合物＃１９８の処理の有無によるＴＲＦ２の細胞内局在を蛍光免疫染色法で検討した。その方法及び結果を以下に説明する。 Next, the intracellular localization of TRF2 in the presence or absence of compound #198 treatment was examined by fluorescence immunostaining. The method and results are described below.

８ｗｅｌｌ組織培養用カルチャースライド（松波硝子工業、ｓｃｓ－００８）に播種したＨｅＬａ１．２．１１細胞に化合物＃１９８（２０μＭ）又はコントロールとしてのＤＭＳＯを２４時間処理した。その後、ＰＢＳ（－）で２回洗浄し、０．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（ＷＡＫＯ社，５９１－１２１９１）／ＰＢＳ（－）を氷上で２分間処理し、４％ パラホルムアルデヒド（ＭＥＲＣＫ社，１．０４００５．１０００）／ＰＢＳ（－）を室温で１５分間処理した後、ＰＢＳ（－）で２回洗浄した。さらに０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００／ＰＢＳ（－）を氷上で１０分間処理した後、ＰＢＳ（－）で５回洗浄した。次に、３％ＢＳＡ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳ（－）で２００倍希釈したＴＲＦ２抗体（Ｎｏｖｕｓ社、ＮＢ１００－５６５０６）を３７℃で１時間反応させた後、ＰＢＳ（－）で２回洗浄した。次に、３％ＢＳＡ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳ（－）で５００倍希釈したＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８ Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ａ１１００１）を室温で４５分間反応させ、ＰＢＳ（－）で３回洗浄し、０．２５μｇ／ｍＬのＤＡＰＩ（同仁化学研究所、３４０－０７９７１）を室温で５分間反応させ、ＰＢＳ（－）で３回洗浄した。スライドガラスを封入後、蛍光顕微鏡（Ｚｗｉｓｓ社、Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００Ｍ）にて観測した。画像解析ソフトＣｏｌｕｍｂｕｓを用いて核内のＴＲＦ２ｆｏｃｉ数を計測した。その結果を図４に示す。なお、図４（ａ）は、蛍光顕微鏡を用いて得られた細胞の写真であり、図４（ａ）において、白い四角の領域を拡大したもの「Ｅｎｌａｒｇｅｄ」で示し、「Ｅｎｌａｒｇｅｄ」中の矢印は核外に存在するＴＲＦ２を示す。図４（ｂ）は、蛍光顕微鏡を用いて核内のＴＲＦ２ｆｏｃｉ数を計測し、コントロールを１．００としたときのＴＲＦ２ｆｏｃｉ数の割合を示すグラフである。 HeLa1.2.11 cells seeded on an 8-well tissue culture culture slide (Matsunami Glass Co., scs-008) were treated with compound #198 (20 μM) or DMSO as a control for 24 hours. Thereafter, the cells were washed twice with PBS(-), treated with 0.25% TritonX-100 (WAKO, 591-12191)/PBS(-) for 2 minutes on ice, and treated with 4% paraformaldehyde (MERCK, 1. 04005.1000)/PBS(-) at room temperature for 15 minutes and then washed twice with PBS(-). Furthermore, after treatment with 0.5% TritonX-100/PBS(-) on ice for 10 minutes, the cells were washed 5 times with PBS(-). Next, TRF2 antibody (Novus, NB100-56506) diluted 200-fold with 3% BSA/0.05% Tween/PBS(-) was reacted at 37°C for 1 hour, and then twice with PBS(-). washed. Next, AlexaFluor 488 Goat anti-mouse IgG (invitrogen, A11001) diluted 500-fold with 3% BSA/0.05% Tween/PBS(-) was reacted at room temperature for 45 minutes and washed three times with PBS(-). Then, 0.25 μg/mL DAPI (Dojindo Laboratories, 340-07971) was reacted at room temperature for 5 minutes and washed with PBS(-) three times. After sealing the slide glass, it was observed with a fluorescence microscope (Zwiss, Axiovert 200M). The number of TRF2foci in the nucleus was measured using image analysis software Columbus. The results are shown in FIG. In addition, FIG. 4(a) is a photograph of cells obtained using a fluorescence microscope. indicates TRF2 present outside the nucleus. FIG. 4(b) is a graph showing the TRF2foci number in the nucleus measured using a fluorescence microscope, and showing the ratio of the TRF2foci number to the control as 1.00.

図４に示すように、ＤＭＳＯで処理されたコントロールでは、ＤＡＰＩにより染まった核内にＴＲＦ２が存在し、ＴＲＦ２が核内のＤＮＡに結合していると考えられる。一方、化合物＃１９８により処理された細胞では、ＴＲＦ２の多くが細胞の核の外側に存在している。この結果から、化合物＃１９８によってＴＲＦ２が核内でＤＮＡのＴＲＦ２結合部位に結合することを阻害することが示唆される。 As shown in FIG. 4, in the DMSO-treated control, TRF2 was present in the DAPI-stained nucleus, suggesting that TRF2 binds to DNA in the nucleus. In contrast, in cells treated with compound #198, much of TRF2 is present outside the nucleus of the cells. This result suggests that compound #198 inhibits binding of TRF2 to the TRF2 binding site of DNA in the nucleus.

次に、テロメアＦＩＳＨ法を用いて、テロメア異常における化合物＃１９８の影響について検討した。具体的に、テロメアにおいて異常が生じると、テロメアにおける５３ＢＰ１の局在を特徴とするＴＩＦ（ｔｅｌｏｍｅｒｅ－ｉｎｄｕｃｅｄＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｆｏｃｉ）が生じることが知られているため、テロメアＦＩＳＨ法を用いて、化合物＃１９８がテロメアにおける５３ＢＰ１の局在化に影響するか否かを検討した。以下にその方法及び結果を説明する。 Next, the telomere FISH method was used to examine the effect of compound #198 on telomere abnormalities. Specifically, it is known that TIF (telomere-induced DNA damage foci) characterized by the localization of 53BP1 in telomeres occurs when an abnormality occurs in telomeres. It was examined whether it affects the localization of 53BP1 at telomeres. The method and results are described below.

８ｗｅｌｌ組織培養用カルチャースライドに播種したＨｅＬａ１．２．１１細胞に化合物 ＃１９８（１０μＭ）又はコントロールとしてのＤＭＳＯを２４時間処理した。その後、ＰＢＳ（－）で２回洗浄し、０．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（ＷＡＫＯ社，５９１－１２１９１）／ＰＢＳ（－）を氷上で２分間処理し、４％パラホルムアルデヒド（ＭＥＲＣＫ社，１．０４００５．１０００）／ＰＢＳ（－）を室温で１５分間処理した。その後、ＰＢＳ（－）で２回洗浄し、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００／ＰＢＳ（－）を氷上で１０分間処理した後、ＰＢＳ（－）で５回洗浄した。次に、Ｂｌｏｃｋｉｎｇｓｏｌｕｔｉｏｎ （１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ，３％ ｇｏａｔｓｅｒｕｍ，０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００， １ｍＭＥＤＴＡ ｐＨ８．０）を室温で３０分間処理し、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎで１０００倍に希釈した５３ＢＰ１抗体（Ｎｏｖｕｓ，ＮＢ１００－３０４）を３７℃で１時間反応させた後、ＰＢＳ（－）で２回洗浄した。次に、Ｂｌｏｃｋｉｎｇｓｏｌｕｔｉｏｎで５００倍に希釈したＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ＲａｂｂｉｔＩｇＧ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ａ１１００８）を室温で４５分間反応させ、ＰＢＳ（－）で３回洗浄し、４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ（－）を室温で５分間処理し、ＰＢＳ（－）で２回洗浄した。その後、７０％，９５％，１００％ＥｔＯＨを順に３，２，２分間処理した。風乾後、Ｃｙ－３標識３’－（ＣＣＣＴＡＡ）４－５’プローブ（ＰＡＮＡＧＥＮＥ社，Ｆ１００２）を８０℃で３分間反応させた。その後、ｗａｓｈｉｎｇｓｏｌｕｔｉｏｎ（７０％ｆｏｒｍａｍｉｄｅ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ７．２）） で洗浄し、ＰＢＳ（－）で３回洗浄後、０．２５μｇ／ｍＬのＤＡＰＩを室温で５分間反応させ、さらにＰＢＳ（－）で３回洗浄した。スライドガラスを封入後、蛍光顕微鏡（Ｚｗｉｓｓ社、Ａｘｉｏｖｅｒｔ２００Ｍ）にて観測した。画像解析ソフトＣｏｌｕｍｂｕｓを用いてテロメアに局在している５３ＢＰ１（ＴＩＦ）を計測した。核１個あたりＴＩＦが４個以上あったものをＴＩＦ陽性細胞とした。その結果を図５に示す。なお、図５（ａ）は蛍光顕微鏡を用いて得られた細胞の写真であり、矢印はテロメアと５３ＢＰ１との共局在が見られる部分を示す。図５（ｂ）は、蛍光顕微鏡を用いてその共局在が生じている、すなわちＴＩＦが生じている細胞数を計測し、その割合を算出した結果を示すグラフである。HeLa1.2.11 cells seeded on 8-well tissue culture culture slides were treated with compound #198 (10 μM) or DMSO as a control for 24 hours. Thereafter, the cells were washed twice with PBS(-), treated with 0.25% TritonX-100 (WAKO, 591-12191)/PBS(-) for 2 minutes on ice, and treated with 4% paraformaldehyde (MERCK, 1. 04005.1000)/PBS(-) for 15 minutes at room temperature. Thereafter, the cells were washed twice with PBS(-), treated with 0.5% TritonX-100/PBS(-) on ice for 10 minutes, and then washed five times with PBS(-). Next, Blocking solution (1 mg/ml BSA, 3% goatserum, 0.1% Triton X-100, 1 mM EDTA pH 8.0) was treated at room temperature for 30 minutes, and 53BP1 antibody (Novus, NB100 -304) was reacted at 37° C. for 1 hour and then washed twice with PBS(-). Next, Alexa Fluor488 Goat anti-Rabbit IgG (invitrogen, A11008) diluted 500 times with Blocking solution was reacted at room temperature for 45 minutes, washed three times with PBS (-), and 4% paraformaldehyde/PBS (-) was added at room temperature. for 5 minutes and washed twice with PBS(-). After that, 70%, 95%, and 100% EtOH were treated sequentially for 3, 2, and 2 minutes. After air-drying, a Cy-3-labeled 3'-(CCCTAA) 4-5 ' probe (PANAGENE, F1002) was reacted at 80°C for 3 minutes. After that, wash with washing solution (70% formamide, 10 mM Tris-HCl (pH 7.2)), wash with PBS (-) three times, react with 0.25 μg/mL DAPI at room temperature for 5 minutes, and further PBS Washed with (-) three times. After sealing the slide glass, it was observed with a fluorescence microscope (Zwiss, Axiovert 200M). 53BP1 (TIF) localized at telomeres was measured using image analysis software Columbus. Cells with 4 or more TIFs per nucleus were defined as TIF-positive cells. The results are shown in FIG. In addition, FIG. 5(a) is a photograph of cells obtained using a fluorescence microscope, and arrows indicate portions where colocalization of telomeres and 53BP1 is observed. FIG. 5(b) is a graph showing the results of counting the number of cells in which the colocalization occurred, that is, the number of cells in which TIF occurred using a fluorescence microscope, and calculating the ratio.

図５に示すように、コントロールでは、テロメアと５３ＢＰ１との共局在はほとんど見られなかったが、化合物＃１９８で処理した細胞では、テロメアと５３ＢＰ１との共局在が認められた。すなわち、化合物＃１９８で処理した細胞では、ＴＩＦが生じており、テロメアに異常が生じていると考えられる。これは、化合物＃１９８がＴＲＦ２のテロメアへの結合を阻害していることに起因していると考えられる。 As shown in FIG. 5, colocalization of telomeres and 53BP1 was hardly observed in the control, but colocalization of telomeres and 53BP1 was observed in the cells treated with compound #198. In other words, it is considered that the cells treated with compound #198 have TIF and have abnormal telomeres. This is probably due to compound #198 inhibiting the binding of TRF2 to telomeres.

上記の通り、化合物＃１９８がテロメア異常を促すと考えられる。ここで、テロメア異常は細胞老化や細胞死に関連することが知られているため、化合物＃１９８により細胞のアポトーシスを引き起こすか否かについてＦＡＣＳを利用して検討した。その方法及び結果を以下に説明する。 As noted above, compound #198 is believed to promote telomere abnormalities. Since telomere abnormalities are known to be associated with cell senescence and cell death, FACS was used to examine whether compound #198 induces cell apoptosis. The method and results are described below.

ＨｅＬａ１．２．１１細胞を２０μＭの化合物＃１９８又はＤＭＳＯで４８時間処理した後に、上清ごと細胞を１５ｍＬチューブに回収し、１０００ｒｐｍで３分間遠心し、上清を取り除いた。５ｍｌのＰＢＳ（－）で細胞を再懸濁し１０００ｒｐｍで３分遠心し、上清を除いた。５００μｌの１×Ｂｉｎｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒ（ＭＢＬ社、４６９５－３００） で細胞を再懸濁し、このうち９０μｌを５ｍＬチューブ（ＢＤＦａｌｃｏｎ社、３５２０５２）へ移し、１０μｌのＡｎｎｅｘｉｎＶ－ＦＩＴＣ（ＭＢＬ社、４７００－１００）を加え染色した。遮光した状態で１５分インキュベートし、解析を行った。Ｃｅｌｌｓｏｒｔｅｒ（ＳＯＮＹ社、ＳＨ－８００）にてＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性細胞を検出した。結果を図６に示す。 After HeLa1.2.11 cells were treated with 20 μM compound #198 or DMSO for 48 hours, the cells together with the supernatant were collected in a 15 mL tube, centrifuged at 1000 rpm for 3 minutes, and the supernatant was removed. The cells were resuspended in 5 ml of PBS(-), centrifuged at 1000 rpm for 3 minutes, and the supernatant was removed. Cells were resuspended with 500 μl of 1×Binding buffer (MBL, 4695-300), 90 μl of this was transferred to a 5 mL tube (BD Falcon, 352052), and 10 μl of AnnexinV-FITC (MBL, 4700-100) was added. dyed. Analysis was performed after incubating for 15 minutes in the dark. Annexin V-positive cells were detected with a Cellsorter (SH-800, SONY). The results are shown in FIG.

図６に示すように、ＤＭＳＯ処理したコントロールと比較して、化合物＃１９８で処理した場合では多くの細胞がＡｎｎｅｘｉｎＶ陽性であった。すなわち、化合物＃１９８によって細胞のアポトーシスが誘導されることが示唆される。 As shown in Figure 6, more cells were AnnexinV positive when treated with Compound #198 compared to DMSO treated controls. That is, it is suggested that compound #198 induces cell apoptosis.

さらに、別の方法により化合物＃１９８によって細胞のアポトーシスが誘導されることを証明するために、アポトーシスの極めて重要な因子として知られている切断型カスパーゼ３の発現が化合物＃１９８により促進されるか否かをウエスタンブロット法によって解析した。その方法及び結果を以下に説明する。 Furthermore, in order to demonstrate that compound #198 induces cell apoptosis by another method, we investigated whether compound #198 promotes the expression of cleaved caspase-3, which is known to be a critical factor in apoptosis. was analyzed by Western blotting. The method and results are described below.

ＨｅＬａ１．２．１１細胞を２０μＭの化合物＃１９８又はＤＭＳＯで４８時間処理した後に、上清と共に細胞を１５ｍＬチューブに回収し、１０００ｒｐｍで３分間遠心し、上清を取り除いた。細胞ペレットを２×Ｓａｍｐｌｅｂｕｆｆｅｒ（１１７ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．８），１３％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，３．７％ＳＤＳ，２００ｍＭ ＤＴＴ，０．００４％Ｂｒｏｍｏ Ｐｈｅｎｏｌ Ｂｌｕｅ）で溶解し、９５℃で５分間熱変性を行った。８％アクリルアミドゲルに１０μｇのサンプルをＲｕｎｎｉｎｇｂｕｆｆｅｒ（２５ ｍＭ Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎｅ、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ）中、定電圧（１２０Ｖ）で泳動した。その後、ＰＶＤＦメンブレンフィルター Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ－Ｐ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）に転写し、抗原抗体反応を用いて目的のタンパクを検出した。用いた抗体は一次抗体にＢ－ａｃｔｉｎ（ＳＩＧＭＡ社、Ａ５４４１）又はＣｌｅａｖｅｄｃａｓｐａｓｅ３（ＣＳＴ社、Ｄ１７５）、二次抗体にＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ標識Ｇｏａｔ抗マウス／抗ラビット二次抗体（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１１１－０３５－００３／１１５－０３５－００３）を用い、シグナルの検出はルミノアナライザー （ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ社、ＬＡＳ４０００）を用いて検出した。その結果を図７に示す。 After HeLa1.2.11 cells were treated with 20 μM compound #198 or DMSO for 48 hours, the cells were collected together with the supernatant into a 15 mL tube, centrifuged at 1000 rpm for 3 minutes, and the supernatant was removed. The cell pellet was dissolved with 2×Samplebuffer (117 mM Tris-HCl (pH 6.8), 13% Glycerol, 3.7% SDS, 200 mM DTT, 0.004% Bromo Phenol Blue) and heat denatured at 95° C. for 5 minutes. gone. 10 μg of sample was run on an 8% acrylamide gel in a running buffer (25 mM Tris, 192 mM Glycine, 0.1% (w/v) SDS) at constant voltage (120 V). After that, it was transferred to a PVDF membrane filter Immobilon-P (MILLIPORE), and the target protein was detected using antigen-antibody reaction. The antibodies used were B-actin (SIGMA, A5441) or Cleavedcaspase3 (CST, D175) as the primary antibody, and Peroxidase-labeled Goat anti-mouse/anti-rabbit secondary antibody (Jackson Immuno Research, 111-035-003/ 115-035-003), and signals were detected using a luminoanalyzer (ImageQuant, LAS4000). The results are shown in FIG.

図７に示すように、ＤＭＳＯを処理したコントロールでは、切断型カスパーゼ３はほぼ見られなかったが、一方、化合物＃１９８を処理した細胞では切断型カスパーゼ３が検出された。この結果から、化合物＃１９８によって、切断型カスパーゼ３の生成が促進され、すなわち細胞のアポトーシスが誘導されると考えられる。 As shown in FIG. 7, almost no cleaved caspase-3 was found in DMSO-treated controls, whereas cleaved caspase-3 was detected in compound #198-treated cells. From this result, it is considered that compound #198 promotes the production of cleaved caspase-3, that is, induces cell apoptosis.

次に、化合物＃１９８の細胞増殖に対する影響を検討した。その方法及び結果を以下に示す。 Next, the effect of compound #198 on cell proliferation was examined. The method and results are shown below.

ＨｅＬａ１．２．１１細胞を１×１０４ｃｅｌｌｓ／３５ｍｍｄｉｓｈで播種し、その翌日に、化合物＃１９８（５μＭ、１０μＭ、２０μＭ）又はコントロールとしてのＤＭＳＯを処理し（処理日を１日目とする）、１日目、３日目、５日目及び７日目に細胞を計数した。その結果を図８に示す。HeLa1.2.11 cells were seeded at 1×10 4 cells/35 mmdish, and the next day, treated with compound #198 (5 μM, 10 μM, 20 μM) or DMSO as a control (treatment day is day 1). Cells were counted on days 1, 3, 5 and 7. The results are shown in FIG.

図８に示すように、化合物＃１９８の処理濃度依存的に、細胞増殖が抑制された。 As shown in FIG. 8, cell proliferation was inhibited in a concentration-dependent manner treated with compound #198.

また、＃１９８以外における上記各候補化合物によるＨｅＬａ１．２．１１細胞の増殖に対する抑制効果を上記と同様に測定し、ＩＣ５０を算出した結果を以下の表２に示す。 In addition, the inhibitory effect of each candidate compound other than #198 on HeLa1.2.11 cell proliferation was measured in the same manner as described above, and the results of calculating IC50 are shown in Table 2 below.

Figure 0007284518000013
Figure 0007284518000013

表２に示すように、化合物＃１９８以外の候補化合物も細胞増殖の抑制効果を奏することが明らかである。 As shown in Table 2, it is clear that candidate compounds other than compound #198 also exert an inhibitory effect on cell proliferation.

次に、ＨｅＬａ１．２．１１細胞を１×１０３ｃｅｌｌｓ／１００ｍｍｄｉｓｈに播種した翌日に化合物＃１９８（５～２０μＭ）又はコントロールとしてのＤＭＳＯを処理し、播種してから１０日後、形成されたコロニーを１００％ＥｔＯＨで固定後、４％ギムザ染色液（武藤化学株式会社、１５００－２）／ＰＢＳ（－）を用いて染色し、計測した。その結果を図９に示す。なお、図９（ａ）は上記ギムザ染色をしたプレートの写真を示し、図９（ｂ）コロニーの生成割合を算出した結果を示すグラフである。Next, the day after HeLa1.2.11 cells were seeded on 1×10 3 cells/100 mmdish, compound #198 (5 to 20 μM) or DMSO as a control was treated, and 10 days after seeding, formed colonies was fixed with 100% EtOH, stained with 4% Giemsa staining solution (Muto Kagaku Co., Ltd., 1500-2)/PBS(-), and measured. The results are shown in FIG. FIG. 9(a) shows a photograph of the Giemsa-stained plate, and FIG. 9(b) is a graph showing the result of calculating the colony formation rate.

図９に示すように、化合物＃１９８の処理濃度依存的にコロニーの生成が抑制された。 As shown in FIG. 9, colony formation was inhibited in a dose-dependent manner with compound #198.

以上、各実施例の結果から、本発明に係る化合物は、テロメア結合タンパク質のテロメア結合を阻害し、その結果、テロメアにおけるＧテイル形成を阻害して、Ｇテイルを短縮させると考えられる。これにより、本発明に係る化合物は、細胞の増殖抑制及びアポトーシスの誘導を引き起こすと考えられる。従って、本発明に係る化合物は、細胞老化や細胞死を誘導する試薬として利用できる可能性があり、さらには、癌等の種々の疾患の治療薬開発等への応用の可能性もある。 From the results of each example described above, it is considered that the compounds of the present invention inhibit telomere binding of telomere-binding proteins and, as a result, inhibit G-tail formation at telomeres to shorten the G-tail. Accordingly, the compounds of the present invention are considered to induce cell growth inhibition and apoptosis. Therefore, the compound according to the present invention may be used as a reagent that induces cell senescence or cell death, and may also be applied to the development of therapeutic agents for various diseases such as cancer.

Claims (13)

下記化学式で示される化合物であって、
Figure 0007284518000014
 上記化学式中において、
Ｒ１は、酸素であり、
Ｒ２～Ｒ６は、互いに独立して、水素、炭素原子数が１～６のアルキル基、炭素原子数が１～６のアルコキシ基、炭素原子数が１～６のアシル基、及びニトロ基のうちから選択されることを特徴とする化合物。 A compound represented by the following chemical formula,
Figure 0007284518000014
 In the above chemical formula,
R 1 is oxygen;
R 2 to R 6 are each independently hydrogen, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, an acyl group having 1 to 6 carbon atoms, and a nitro group; A compound characterized in that it is selected from 上記化学式中において、
Ｒ１は、酸素であり、
Ｒ２及びＲ４は、互いに独立して、水素又はニトロ基であり、
Ｒ３は、水素、ニトロ基、メチル基、メトキシ基又はブチル基であり、
Ｒ５は、水素、メチル基、メトキシ基又はアセチル基であり、
Ｒ６は、水素又はブチル基である、
ことを特徴とする請求項１に記載の化合物。 In the above chemical formula,
R 1 is oxygen;
R 2 and R 4 are independently of each other hydrogen or a nitro group;
R 3 is hydrogen, a nitro group, a methyl group, a methoxy group or a butyl group,
R5 is hydrogen, methyl group, methoxy group or acetyl group,
R 6 is hydrogen or a butyl group,
2. The compound of claim 1, characterized in that:
Figure 0007284518000015
 上記化学式のいずれかで示されることを特徴とする請求項２に記載の化合物。
Figure 0007284518000015
 3. A compound according to claim 2, represented by any of the above formulas. 下記化学式で示される化合物を含むテロメア結合タンパク質がテロメアに結合することを阻害するためのテロメア結合タンパク質阻害剤であって、
Figure 0007284518000016
 上記化学式中において、
Ｒ１は、酸素又は硫黄であり、
Ｒ２～Ｒ６は、互いに独立して、水素、炭素原子数が１～６のアルキル基、炭素原子数が１～６のアルコキシ基、炭素原子数が１～６のアシル基、及びニトロ基のうちから選択される、テロメア結合タンパク質阻害剤。 A telomere-binding protein inhibitor for inhibiting binding of a telomere-binding protein to telomeres, comprising a compound represented by the following chemical formula:
Figure 0007284518000016
 In the above chemical formula,
R 1 is oxygen or sulfur,
R 2 to R 6 are each independently hydrogen, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, an acyl group having 1 to 6 carbon atoms, and a nitro group; A telomere binding protein inhibitor selected from 上記化学式中において、
Ｒ１は、酸素又は硫黄であり、
Ｒ２及びＲ４は、互いに独立して、水素又はニトロ基であり、
Ｒ３は、水素、ニトロ基、メチル基、メトキシ基又はブチル基であり、
Ｒ５は、水素、メチル基、メトキシ基又はアセチル基であり、
Ｒ６は、水素又はブチル基である、請求項４に記載のテロメア結合タンパク質阻害剤。 In the above chemical formula,
R 1 is oxygen or sulfur,
R 2 and R 4 are independently of each other hydrogen or a nitro group;
R 3 is hydrogen, a nitro group, a methyl group, a methoxy group or a butyl group,
R5 is hydrogen, methyl group, methoxy group or acetyl group,
5. The telomere binding protein inhibitor of claim 4, wherein R6 is hydrogen or a butyl group.
Figure 0007284518000017
 上記化学式のいずれかで示される化合物を含む請求項４に記載のテロメア結合タンパク質阻害剤。
Figure 0007284518000017
 5. The telomere binding protein inhibitor according to claim 4, comprising a compound represented by any one of the above chemical formulas. 前記テロメア結合タンパク質は、ＴＲＦ１、ＴＲＦ２又はＰＯＴ１であることを特徴とする請求項４に記載のテロメア結合タンパク質阻害剤。 5. The telomere binding protein inhibitor according to claim 4, wherein the telomere binding protein is TRF1, TRF2 or POT1. 下記化学式で示される化合物を含む癌の治療又は予防用医薬組成物であって、
Figure 0007284518000018
 上記化学式中において、
Ｒ１は、酸素又は硫黄であり、
Ｒ２～Ｒ６は、互いに独立して、水素、炭素原子数が１～６のアルキル基、炭素原子数が１～６のアルコキシ基、炭素原子数が１～６のアシル基、及びニトロ基のうちから選択される、癌の治療又は予防用医薬組成物。 A pharmaceutical composition for treating or preventing cancer, comprising a compound represented by the following chemical formula:
Figure 0007284518000018
 In the above chemical formula,
R 1 is oxygen or sulfur,
R 2 to R 6 are each independently hydrogen, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, an acyl group having 1 to 6 carbon atoms, and a nitro group; A pharmaceutical composition for treating or preventing cancer, which is selected from 上記化学式中において、
Ｒ１は、酸素又は硫黄であり、
Ｒ２及びＲ４は、互いに独立して、水素又はニトロ基であり、
Ｒ３は、水素、ニトロ基、メチル基、メトキシ基又はブチル基であり、
Ｒ５は、水素、メチル基、メトキシ基又はアセチル基であり、
Ｒ６は、水素又はブチル基である、請求項８に記載の医薬組成物。 In the above chemical formula,
R 1 is oxygen or sulfur,
R 2 and R 4 are independently of each other hydrogen or a nitro group;
R 3 is hydrogen, a nitro group, a methyl group, a methoxy group or a butyl group,
R5 is hydrogen, methyl group, methoxy group or acetyl group,
9. The pharmaceutical composition of Claim 8, wherein R6 is hydrogen or a butyl group.
Figure 0007284518000019
 上記化学式のいずれかで示される化合物を含む請求項８に記載の医薬組成物。
Figure 0007284518000019
 9. The pharmaceutical composition according to claim 8, comprising a compound represented by any of the above chemical formulas. 癌の治療又は予防用医薬組成物を製造するための化合物の使用であって、
Figure 0007284518000020
 上記化学式中において、
Ｒ１は、酸素又は硫黄であり、
Ｒ２～Ｒ６は、互いに独立して、水素、炭素原子数が１～６のアルキル基、炭素原子数が１～６のアルコキシ基、炭素原子数が１～６のアシル基、及びニトロ基のうちから選択される、化合物の使用。 Use of a compound for manufacturing a pharmaceutical composition for treating or preventing cancer,
Figure 0007284518000020
 In the above chemical formula,
R 1 is oxygen or sulfur,
R 2 to R 6 are each independently hydrogen, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, an acyl group having 1 to 6 carbon atoms, and a nitro group; Use of compounds selected from 上記化学式中において、
Ｒ１は、酸素又は硫黄であり、
Ｒ２及びＲ４は、互いに独立して、水素又はニトロ基であり、
Ｒ３は、水素、ニトロ基、メチル基、メトキシ基又はブチル基であり、
Ｒ５は、水素、メチル基、メトキシ基又はアセチル基であり、
Ｒ６は、水素又はブチル基である、
ことを特徴とする請求項１１に記載の使用。 In the above chemical formula,
R 1 is oxygen or sulfur,
R 2 and R 4 are independently of each other hydrogen or a nitro group;
R 3 is hydrogen, a nitro group, a methyl group, a methoxy group or a butyl group,
R5 is hydrogen, methyl group, methoxy group or acetyl group,
R 6 is hydrogen or a butyl group,
12. Use according to claim 11, characterized in that:
Figure 0007284518000021
 上記化合物は上記化学式のいずれかで示される化合物である請求項１１に記載の使用。
Figure 0007284518000021
 12. Use according to claim 11, wherein said compound is a compound represented by any of the above chemical formulae.
JP2020508284A 2018-03-20 2019-03-14 Compound that inhibits telomere-binding protein, and telomere-binding protein inhibitor containing the same Active JP7284518B2 (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2018052087 2018-03-20
JP2018052087 2018-03-20
PCT/JP2019/010480 WO2019181714A1 (en) 2018-03-20 2019-03-14 Compound which inhibits telomere-binding protein, and telomere-binding protein inhibitor containing same

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPWO2019181714A1 JPWO2019181714A1 (en) 2021-04-08
JP7284518B2 true JP7284518B2 (en) 2023-05-31

Family

ID=67987628

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2020508284A Active JP7284518B2 (en) 2018-03-20 2019-03-14 Compound that inhibits telomere-binding protein, and telomere-binding protein inhibitor containing the same

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20210024455A1 (en)
JP (1) JP7284518B2 (en)
WO (1) WO2019181714A1 (en)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023182897A1 (en) * 2022-03-25 2023-09-28 Politechnika Gdańska Inhibitors of interactions between trf1-tin2 or trf2-tin2 telomeric proteins for use in anticancer therapy

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001072592A (en) 1999-07-01 2001-03-21 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Telomerase inhibitor
WO2001030771A1 (en) 1999-10-28 2001-05-03 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Thiazolidinedione derivatives
WO2002044120A1 (en) 2000-11-29 2002-06-06 Karo Bio Ab Compounds active at the glucocorticoid receptor iii
JP2004524349A (en) 2001-03-23 2004-08-12 アベンティス・ファーマ・ソシエテ・アノニム Chemical derivatives and their use as anti-telomerase agents
WO2009093667A1 (en) 2008-01-22 2009-07-30 Hiroshima University Nucleic acid-binding protein assay method and kit
JP2012507504A (en) 2008-10-31 2012-03-29 アンスティテュ・キュリ Poly-heteroaryl derivatives for the treatment of cancer

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH07238066A (en) * 1994-02-28 1995-09-12 Green Cross Corp:The Benzenesulfonic acid derivative, its production and use
WO2017115753A1 (en) * 2015-12-28 2017-07-06 コニカミノルタ株式会社 Bridged compound, organic electroluminescence element material, organic electroluminescence element, display device, and illumination device

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001072592A (en) 1999-07-01 2001-03-21 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Telomerase inhibitor
WO2001030771A1 (en) 1999-10-28 2001-05-03 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Thiazolidinedione derivatives
WO2002044120A1 (en) 2000-11-29 2002-06-06 Karo Bio Ab Compounds active at the glucocorticoid receptor iii
JP2004524349A (en) 2001-03-23 2004-08-12 アベンティス・ファーマ・ソシエテ・アノニム Chemical derivatives and their use as anti-telomerase agents
WO2009093667A1 (en) 2008-01-22 2009-07-30 Hiroshima University Nucleic acid-binding protein assay method and kit
JP2012507504A (en) 2008-10-31 2012-03-29 アンスティテュ・キュリ Poly-heteroaryl derivatives for the treatment of cancer

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Database REGISTRY，2001年，RN 352638-37-0，Retrieved from STN international [online] ;retrieved on 24 April 2019
城間 喜智 他，ＤＳＥ－ＦＲＥＡＴ ａｓｓａｙを応用して得られたＴＲＦ２－ｔｅｌｏｍｅｒｅ ＤＮＡ結合阻害剤，第２１回日本がん分子標的治療学会学術集会プログラム・抄録集，2017年，Ｗ７－５
城間 喜智 他，ＤＳＥ－ＦＲＥＴ ａｓｓａｙを用いたテロメア結合タンパク質阻害剤開発と機能解析，日本生化学会大会，2017年，２Ｐ－１４３５
城間 喜智 他，ＤＳＥ－ＦＲＥＴ法を用いて得られたテロメア結合タンパク質ＴＲＦ２阻害剤，第２０回日本がん分子標的治療学会学術集会プログラム・抄録集，2016年，Ｐ２４－２
城間 喜智 他，テロメア結合タンパク質ＴＲＦ２の結合阻害剤ががん細胞に及ぼす影響，第７６日本癌学会学術総会抄録集，2017年，Ｊ－３１１９
城間 喜智，ＤＳＥ－ＦＲＥＴ法を用いたテロメア結合タンパク質 ＴＲＦ２阻害剤の探索，第１９回日本がん分子標的治療学会学術集会プログラム・抄録集，2015年，Ｐ３－３

Also Published As

Publication number Publication date
WO2019181714A1 (en) 2019-09-26
JPWO2019181714A1 (en) 2021-04-08
US20210024455A1 (en) 2021-01-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Alekseyenko et al. Ectopic protein interactions within BRD4–chromatin complexes drive oncogenic megadomain formation in NUT midline carcinoma
Gogola et al. Selective loss of PARG restores PARylation and counteracts PARP inhibitor-mediated synthetic lethality
Liu et al. Circular RNA DOCK1 promotes bladder carcinoma progression via modulating circDOCK1/hsa‐miR‐132‐3p/Sox5 signalling pathway
Zhang et al. Breast cancer metastasis suppressor OTUD1 deubiquitinates SMAD7
Bunch et al. Transcriptional elongation requires DNA break-induced signalling
Nguyen et al. A small molecule inhibitor of the BLM helicase modulates chromosome stability in human cells
Xie et al. miR-106a promotes growth and metastasis of non-small cell lung cancer by targeting PTEN
Singh et al. MiCEE is a ncRNA-protein complex that mediates epigenetic silencing and nucleolar organization
Vennegaard et al. Allergic contact dermatitis induces upregulation of identical microRNAs in humans and mice
Yong et al. Ribosomal proteins RPS11 and RPS20, two stress-response markers of glioblastoma stem cells, are novel predictors of poor prognosis in glioblastoma patients
Sen et al. Fibronectin induces matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) in human laryngeal carcinoma cells by involving multiple signaling pathways
Yan et al. MicroRNA 199a-5p induces apoptosis by targeting JunB
US20170137418A1 (en) Small molecular probes, processes and use thereof
Isozaki et al. Therapy-induced APOBEC3A drives evolution of persistent cancer cells
Bambouskova et al. New regulatory roles of galectin-3 in high-affinity IgE receptor signaling
Wang et al. RETRACTED ARTICLE: microRNA-769 is downregulated in colorectal cancer and inhibits cancer progression by directly targeting cyclin-dependent kinase 1
JP7284518B2 (en) Compound that inhibits telomere-binding protein, and telomere-binding protein inhibitor containing the same
Qiu et al. MYC regulation of D2HGDH and L2HGDH influences the epigenome and epitranscriptome
Laliotis et al. RETRACTED ARTICLE: AKT3-mediated IWS1 phosphorylation promotes the proliferation of EGFR-mutant lung adenocarcinomas through cell cycle-regulated U2AF2 RNA splicing
Kim et al. The SET domain Is essential for Metnase functions in replication restart and the 5’end of SS-overhang cleavage
EP2726869B1 (en) Somatic mutations in atrx in brain cancer
Sommer et al. Applying a high-throughput fluorescence polarization assay for the discovery of chemical probes blocking La: RNA interactions in vitro and in cells
Scionti et al. TERRA G-quadruplex stabilization as a new therapeutic strategy for multiple myeloma
Jiang et al. Post-GWAS functional analysis identifies CUX1 as a regulator of p16INK4a and cellular senescence
Ren et al. MDM2 inhibition is synthetic lethal with PTEN loss in colorectal cancer cells via the p53-dependent mechanism

Legal Events

Date Code Title Description
A529 Written submission of copy of amendment under article 34 pct

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A5211

Effective date: 20200907

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20220302

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20220304

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20230307

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230324

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20230509

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20230512

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7284518

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150