JP7280695B2 - Ｎｕｃ‐１０３１の単一異性体がリッチな組成物及びその製造方法並びに用途 - Google Patents

Description

本発明はＮＵＣ‐１０３１の単一異性体がリッチな組成物及びその製造方法、この組成物の用途、並びにこの組成物及び少なくとも一種の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物に関し、本発明はさらに、結晶形態の化合物Ｓ_P‐１及びその製造方法に関する。

ＮＵＣ‐１０３１は、ＮｕＣａｎａ ＢｉｏＭｅｄ会社によって開発されたゲムシタビンプロドラッグであり、末期固形腫瘍、膵臓癌、乳癌などの癌の治療薬として、現在、第２相臨床試験中である。ＮＵＣ‐１０３１はＣＡＳが８４０５０６‐２９‐８であり、下記の式１で表される構造を有し、Ｒ_P‐１とＳ_P‐１という２つの単一異性体を有する。

ＷＯ２００５０１２３２７の明細書第７０頁には、ＮＵＣ‐１０３１の具体的な構造及び製造方法が記載されている。具体的には、溶媒としてＴＨＦ／ピリジンを用いて、ＮＭＩの存在下で、ゲムシタビンとベンジル－（ベンゾイル－Ｌ－アラニン）－クロロホスフェートを１：３のモル比で２時間反応させて粗生成物を得、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、ジクロロメタン／メタノール（９５：５）で溶出することで、泡状固体を得たが、収率は僅か１６％であった。

ＷＯ２０１４０７６４９０Ａ１には、下記のＮＵＣ‐１０３１の製造方法が記載されている。

３’－Ｂｏｃ保護ゲムシタビン（１００ｍｇ）を２モル当量のフェニル（ベンジル－Ｌアラニン）クロロホスフェート（１５０ｍｇ）と反応させ、０．５モル当量のトリス（アセチルアセトナト）鉄（５６ｍｇ）を触媒として、１．５モル当量のＤＩＰＥＡ（５５μＬ）を塩基として、１０ｍｌのＴＨＦを反応溶媒として用いて、窒素雰囲気下、室温で２４時間反応させ、収率は４５％であり、異性体Ｒ_P：Ｓ_Pは３：１であった。

Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＰｒｏＴｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｔｏ Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ：Ａ Ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ｏｖｅｒｃｏｍｅ ｔｈｅ Ｋｅｙ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ Ｌｅａｄｓ ｔｏ ａ Ｎｅｗ Ａｇｅｎｔ（ＮＵＣ‐１０３１）ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｖｏｌｕｍｅ ５７、Ｉｓｓｕｅ ４、Ｐａｇｅｓ １５３１‐１５４２）という文献には、ジクロロメタンを溶媒として用いて、ＴＦＡの存在下で下記の式の化合物５ｆからヒドロキシ保護基を脱離させ、最後にシリカゲルカラムで精製してＮＵＣ－１０３１を製造する方法が記載され、収率は７０％であり、異性体の含有量はそれぞれ４８％、５２％であった。

これまでの先行技術には、ＮＵＣ‐１０３１の単一異性体の製造方法に関する報告はなかった。ＮＵＣ‐１０３１の分子構造中のキラルＰの２つのエナンチオマーは構造が非常に類似し、極性が非常に近いので、高純度の単一異性体をＮＵＣ－１０３１異性体混合物から単離することは非常に困難になり、特に精製プロセスにおいて純度と収率を両立させることはさらに困難である。本発明者らは、当業界の通常の晶析、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、Ｃ１８結合シリカの逆相分取クロマトグラフィー、球状シリカゲルの順相分取クロマトグラフィー、キラルカラム分離などの種々の方法によってＮＵＣ－１０３１を精製しようと試みたが、いずれも、９０％以上の純度を有する単一異性体を単離することはできなかった。

当業界で公知されているように、通常、キラル化合物を薬物として使用する場合、異性体の立体配置と薬理学の関係は、以下のように分けることができる。（１）薬物の薬理学的効果は、完全に、又は主として、エナンチオマーのうちの１つによりもたらされる。例えば、（Ｓ）－ナプロキセンは、Ｒ異性体より３５倍も強力な鎮痛効果を有する。（２）２つの異性体は全く反対の薬理学的効果を有する。例えば、ピケナドールの右旋性異性体はオピオイド受容体のアゴニストであるが、その左旋性異性体はオピオイド受容体のアンタゴニストである。（３）異性体の１つは重篤な有害反応を有する。例えば、駆虫薬であるテトライミダゾールの嘔吐反応はそのＤ－体によりもたらされる。（４）薬理学的効果の一つは高い立体選択性を有するが、他の薬理学的効果は、立体選択性が低いか、又は立体選択性を有しない。例えば、鎮咳薬であるメトルファンの中毒性は主にそのＬ－体によりもたらされるが、鎮咳効果は両方の強さが同等である。（５）２つのエナンチオマーは薬理学的効果は異なるが、薬物に併用したほうが有利である。例えば、抗高血圧薬であるネビボロールのＤ－体はβ受容体遮断薬であり、Ｌ－体は末梢血管の抵抗を低減でき、そして心臓への保護効果がある。

ＮＵＣ‐１０３１分子は複数のキラル原子を有することが知られている。ＮＵＣ‐１０３１から単一異性体を単離し、それらの生物学的活性を別々に研究し、ＮＵＣ‐１０３１の薬理学的効果、毒性や副作用又は有害反応等を検討することにより、より良い活性、より小さな毒性や副作用を有する同じような薬物を開発することは非常に重要である。臨床研究のニーズを満足できる高純度の単一異性体の製造、及びＮＵＣ‐１０３１の薬理学的活性において重要な役割を果たす単一異性体の特定は現在でも、当業界で早急な解決が望まれている課題である。

上述した課題を解決するために、本発明の第１の側面は化合物Ｓ_P‐１リッチな組成物を提供する。

本発明の第２の側面は前記組成物の製造方法を提供する。

本発明の第３の側面は癌治療薬を製造するための前記組成物の使用を提供する。

本発明の第４の側面はさらに、前記組成物を含む医薬組成物を提供する。

本発明の第５の側面はさらに、結晶形態の化合物Ｓ_P‐１及びその製造方法を提供する。

第１の側面では、本発明は、組成物における化合物Ｓ_P‐１の純度が９０％以上であり、かつ組成物における化合物Ｓ_P‐１と化合物Ｒ_P‐１の重量比が９０：１０の値以上である化合物Ｓ_P‐１リッチな組成物を提供する。用語「純度」とは、前記組成物における化合物Ｓ_P‐１の重量百分率を指す。

さらに、前記組成物において、化合物Ｓ_P‐１の純度は９７％以上であり、かつ前記組成物における化合物Ｓ_P‐１と化合物Ｒ_P‐１の重量比は９７：３の値以上である。

さらに、前記組成物において、化合物Ｓ_P‐１の純度は９９％以上であり、かつ前記組成物における化合物Ｓ_P‐１と化合物Ｒ_P‐１の重量比は９９：１の値以上である。

第２の側面では、本発明は、
（１）化合物６１５０１ｈと化合物６１５０１ｇを塩基性条件下で反応させた後、化合物６１５０１ｆとさらに反応させて、化合物６１５０２を作製する工程、

（２）化合物６１５０２を晶析することによって、化合物６１５０１ｂを単離する工程、

（３）化合物６１５０１ｂと化合物６１５０１ｃを反応させて、化合物６１５０１ａを作製する工程、及び

（４）化合物６１５０１ａのヒドロキシ保護基を脱離させ、化合物Ｓ_P‐１リッチな組成物を得る工程、

を含む上記いずれかの組成物の製造方法を提供する。

上記方法において、工程（１）では、好ましくは、反応を窒素雰囲気下で行い、化合物６１５０１ｈを適切な溶媒（例えばジクロロメタン、イソプロパノール、ＤＭＦ、ジオキサン等）に加え、適切な温度（好ましくは‐８０℃）で、化合物６１５０１ｇ及び適切なアルカリ成分（例えばトリエチルアミン、ＤＩＰＥＡ、ＮＭＭ、ピリジン、ピペリジン）を加え、滴下完了後、好ましくは室温で一晩反応させた後、反応液に化合物６１５０１ｆ及び適切なアルカリ成分（例えばトリエチルアミン、ＤＩＰＥＡ、ＮＭＭ、ピリジン、ピペリジン）を加え、反応終了後、溶媒を留去し、酢酸エチル及び水により抽出して分離することで、目的化合物６１５０２を得る。

工程（２）では、工程（１）で得られた化合物をさらに晶析し、異性体６１５０１ｂを単離する。好ましくは、晶析溶媒は酢酸エチルと石油エーテルであり、さらに好ましくは、化合物６１５０２を酢酸エチルに加えて撹拌し、その後、石油エーテルを徐々に滴下し、結晶を析出することで、目的化合物６１５０１ｂを得る。ここで、化合物６１５０２と酢酸エチルとの重量体積比は２：５～４：５であることが好ましい。前記重量体積比において、重量の単位はｇであり、体積の単位はｍｌである。酢酸エチルと石油エーテルの体積比は１：４～１：６又は１：３である。

上記工程（３）では、好ましくは、窒素雰囲気下、適切な溶媒（例えばテトラヒドロフラン、ジクロロメタン）及び適切な温度（例えば‐１０℃～５℃、好ましくは０℃）条件において、化合物６１５０１ｃをグリニャール試薬（例えばtert-ブチルマグネシウムクロリド、好ましくはtert-ブチルマグネシウムクロリドのテトラヒドロフラン溶液）と接触させ、約０．５～３時間反応させた後、工程（２）で単離した化合物６１５０１ｂを加え、反応終了まで反応させる。反応液に水を加え、そして酢酸エチルで抽出することで、粗化合物６１５０１ａを得る。上記粗生成物は、晶析、カラムクロマトグラフィー等の常法によりさらに精製することができる。好ましくはジクロロメタン‐メタノールを溶離液として用いて、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製する。

上記工程（４）では、好ましくは、窒素雰囲気下、適切な溶媒（例えばジクロロメタン、酢酸エチル）及び適切な温度（例えば‐１０℃～５℃、好ましくは０℃）条件において、触媒としての酸（例えばトリフルオロ酢酸、塩化水素／酢酸エチル）により、化合物６１５０１ａのヒドロキシ保護基を脱離させ、反応終了後、弱塩基性水溶液（例えば飽和重炭酸ナトリウム溶液）及び有機溶媒（例えば酢酸エチル）を加え、有機層を分離し、濃縮、乾燥させて、粗化合物Ｓ_P‐１を得る。さらに好ましくは、例えばシリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて、ジクロロメタン‐メタノールを溶離液として、上述の粗生成物を精製する。

さらに、上記方法の工程（３）における前記化合物６１５０１ｃは、化合物６１５０１ｄから作製される。

より好ましくは、適切な溶媒（例えばテトラヒドロフラン、ジクロロメタン、イソプロパノール又はこれと水との混合溶液）中で、塩基性（例えば炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム等）条件下で、化合物６１５０１ｄをジ-tert-ブチルジカーボネートと反応させることで得られる。

本発明の第３の側面は、癌の治療薬を製造するための前記組成物の使用を提供する。さらに、前記癌として、膵臓癌、末期固形腫瘍、卵巣腫瘍、非小細胞肺癌、乳癌、膀胱癌、子宮頸癌、中皮腫、食道癌、胃癌、直腸癌、肝臓癌、胆管癌、鼻咽頭癌、精巣癌、リンパ腫または頭頸部癌が挙げられる。より好ましくは、前記癌は、膵臓癌、末期固形腫瘍、卵巣腫瘍、乳癌を含む。

本発明の第４の側面はさらに、前記組成物を含む医薬組成物を提供する。前記医薬組成物は、本発明で提供する化合物Ｓ_P‐１リッチな組成物及び少なくとも一種の薬学的に許容される賦形剤を含む。

前記医薬組成物は、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、吸入、直腸、および局所（頬側または舌下など）の投与を含む経口または非経口の投与が可能である。

そのうち、経口投与のための医薬組成物は、錠剤、カプセル、顆粒剤または懸濁剤を含む。経口投与のための錠剤は、本発明で提供する医薬組成物を活性成分として含むとともに、１種以上の薬学的に許容される賦形剤、例えば希釈剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、甘味料、香味剤、着色料および防腐剤を含んでもよい。コーンスターチおよびアルギン酸が崩壊剤として使用される場合、適切な不活性希釈剤としては、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カルシウムおよびラクトースが挙げられる。結合剤としては、デンプンおよびゼラチンが挙げられる。潤滑剤は、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクであってもよく。前記錠剤は、胃における吸収を遅延させるために、グリセロールモノステアレートまたはグリセロールジステアレートでコーティングしてもよい。

経口投与のためのカプセル剤としては、硬質カプセルおよび軟質カプセルが挙げられる。硬質カプセルは、活性成分としての本発明で提供する医薬組成物と、固体希釈剤とを含む。軟質カプセルは、活性成分としての本発明で提供する医薬組成物と、水又は油（例えば、ピーナッツ油、流動パラフィンまたはオリーブ油）とを含む。

直腸投与のための坐剤は、坐剤の基剤がココアバターまたはサリチル酸塩であってもよい。

膣内投与のための製剤は、活性成分である組成物と、当業界で公知の一般的な担体とを含む、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォームまたはスプレーの形態である。

静脈内、腹腔内、皮下および筋肉内投与のための剤形に使用される場合、本発明で提供する組成物は通常、滅菌溶液または滅菌懸濁液であり、且つ適切なｐＨおよび浸透圧を有する。このような製剤の調製については、当業界で公知の一般的な方法に従って調製すればよい。

前記組成物の投与量は０．１～３００ｍｇ／ｋｇ体重／日であり、好ましくは０．５ｍｇ／ｋｇ体重／日であり、より好ましい適切な投与量は１～５０ｍｇ／ｋｇ体重／日であり、さらに好ましくは１～５０ｍｇ／ｋｇ体重／日である。１日２回、３回、４回又は５回に分けて間隔をもって投与することが好ましい。好ましくは活性成分１０～１５００ｍｇ、さらに好ましくは活性成分２０～１０００ｍｇ、最も好ましくは活性成分５０～７００ｍｇを１つの投与量単位として含む。

別の側面として、本発明は結晶形態の化合物Ｓ_P‐１、特に実質的純粋な結晶形態を提供する。好ましくは、前記結晶形態は、水を含有しないか、または実質的に含有しないことを特徴とする。さらに、前記結晶形態の化合物Ｓ_P‐１は、ａ＝１１．３６Å、ｂ＝３４．８４Å、ｃ＝１５．１２Åの単位格子を有し、体積が５５５４ųである。新規結晶形の鑑定に資するために、本発明はＸ線回折分析データ及これらのデータの測定条件を以下のとおり提供する。

結晶形態の化合物Ｓ_P‐１は、本発明の上述の方法又は具体的な実施例に記載の方法により製造された化合物Ｓ_P‐１を溶媒、例えば低級アルコール及び水からなる溶媒に加え、系温度を３０～５０℃から０～５℃に徐々に降下させることで、棒状単結晶を得るという方法により作製できる。好ましくは前記低級アルコールはＣ_1~3アルコール（例えばメタノール、エタノール、プロパノール又はイソプロパノール）であり、さらに好ましくは、前記低級アルコールはエタノールである。低級アルコールと水の使用量比は１：３（ｖ／ｖ）であることが好ましい。

別の側面として、本発明はさらに、前記結晶形態の化合物Ｓ_P‐１と、少なくとも一種の薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。結晶形態の化合物Ｓ_P‐１は、例えば膵臓癌、末期固形腫瘍、卵巣腫瘍、非小細胞肺癌、乳癌、膀胱癌、子宮頸癌、中皮腫、食道癌、胃癌、直腸癌、肝臓癌、胆管癌、鼻咽頭癌、精巣癌、リンパ腫または頭頸部癌等、ＮＵＣ‐１０３１の公知の適応症と同じ適応症の治療に使用できる。前記結晶形態の化合物Ｓ_P‐１と、少なくとも一種の薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物は、任意の従来の経路、例えば経口（錠剤やカプセルなど）、または鼻や肺投与（吸入）などによって投与することができる。

本発明で提供する化合物Ｓ_P‐１リッチな組成物は、ＢｘＰＣ‐３、ＭＩＡ ＰａＣａ‐２及びＯＶＣＡＲ‐３腫瘍細胞に対する強い細胞毒性効果を示し、ＩＣ₅₀値が約０．０１ｎＭ～０．０５ｎＭの範囲であり、体外腫瘍細胞増殖抑制効果が化合物Ｒ_P‐１の約１０倍である。ゲムシタビン、化合物Ｒ_P‐１に比べて、本発明で提供する化合物Ｓ_P‐１リッチな組成物は、より良い体内抗腫瘍活性を有する。薬物動態学的評価の結果によれば、本発明で提供する化合物Ｓ_P‐１リッチな組成物は、腫瘍組織活性代謝産物ｄＦｄＣＴＰの濃度が化合物Ｒ_P‐１より顕著に高い。

また、本発明で提供する組成物は、単一異性体Ｓ_P‐１の含有量が高いものとして、臨床におけるＮＵＣ‐１０３１の薬理学的活性への更なる研究、及び今後の良好な活性および低い副作用を有する新規な抗癌剤の開発のために原料基礎を提供する。また、本発明者らは独創的に、第１段階の反応終了後から単一異性体の単離を行うため、異性体混合物及び／又はラセミ体から単一異性体を単離する従来の方法に比べて、原料を大幅に節約できる。さらに、第１段階の反応の異性体分離は、晶析法により行うため、操作が簡便であり、従来のキラルカラムによる分離に比べて、コストを大幅に節約できる。また、本発明で提供する製造方法の全体の経路は、操作が簡単で、設備への要求が低く、高純度の製品を取得できるため、工業生産に適する。

さらに、本発明は、提供する化合物Ｓ_P‐１を構造分析し、前記化合物の化学構造を確認し、単結晶分析により、リン原子Ｐ１（Ｓ）と、Ｃ９（Ｓ）、Ｃ１８（Ｒ）、Ｃ１９（Ｒ）、Ｃ２１（Ｒ）の絶対配置を確認した。本発明は新規な化合物Ｓ_P‐１の結晶も提供した。

図１は、実施例２の方法で作製された化合物６１５０１ｂのＨＰＬＣ分析スペクトルを示すものである。図中、化合物６１５０１ｂのＨＰＬＣ純度は１００．０％であり、ピークデータは下記＜データ１＞のとおりである。 図２は、実施例５の方法で作製された化合物Ｓ_P‐１のＨＰＬＣ分析スペクトルを示すものである。図中、化合物Ｓ_P‐１のＨＰＬＣ純度は１００．０％であり、ピークデータは下記＜データ２＞のとおりである。 図３は、実施例５の方法で作製された化合物Ｓ_P‐１の³¹Ｐ‐ＮＭＲスペクトルを示すものである。図中、δ_Pは３．６４である。 図４は、実施例５の方法で作製された化合物Ｓ_P‐１の¹Ｈ‐ＮＭＲスペクトルを示すものである。 図５は、比較例２の方法で作製された化合物１の³¹Ｐ‐ＮＭＲスペクトルを示すものである。図中、δ_Pは３．８１、３．６４である。 図６は、化合物Ｓ_P‐１単結晶の顕微鏡写真を示すものである。 図７は、化合物Ｓ_P‐１単結晶のシミュレーションＸＲＰＤと単結晶の反射ＸＲＰＤの比較を示すものである。 図８は、化合物Ｓ_P‐１単結晶のセルを示すものである。 図９は、化合物Ｓ_P‐１の三次元構造を示すものである。 図１０は、化合物Ｓ_P‐１の三次元構造を示すものである。 図１１は、比較例２において化合物１を作製するために使用した化合物６１５０２のＨＰＬＣスペクトルを示すものである。その異性体６１５０１ｅと６１５０１ｂの比率は２６．２５％：７２．０３％である。 図１２は、比較例２の方法により製造された化合物１のＨＰＬＣスペクトルを示すものである。その異性体Ｒ_P‐１とＳ_P‐１の比率は１０．８２％：８９．１８％であり、ピークデータは下記＜データ３＞のとおりである。 図１３は、化合物Ｓ_P‐１、化合物Ｒ_P‐１及びＮＵＣ‐１０３１の体外腫瘍細胞増殖抑制効果のＩＣ₅₀値の測定結果を示すものである。 図１４は、ヒト膵臓癌のマウス皮下移植モデルにおける化合物Ｓ_P‐１、化合物Ｒ_P‐１及びＮＵＣ‐１０３１の薬力学的評価を示すものである。 図１５は、被験薬である化合物Ｓ_P‐１及び化合物Ｒ_P‐１の単回投与後の、ＭＩＡ ＰａＣａ‐２ヒト膵臓癌のマウス皮下移植モデルにおける薬物動態学的評価を示すものである。

＜データ１＞

＜データ２＞

＜データ３＞

以下には、実施例により本発明の内容をさらに解釈・説明するが、これらの実施例は本発明を説明するためのものにすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。下記実施例において具体的な条件を明記しない実験方法は、通常の条件又はメーカーの推奨条件で実施する。別段の説明がない限り、すべての百分率、比率、割合又は部数は重量によるものである。

単結晶試料の顕微鏡写真は、上海測維社製のステレオ顕微鏡ＰＸＳ９‐Ｔにより室温で撮影したものである。単結晶回折データは、Ｂｒｕｋｅｒ Ｄ８ ＡＤＶＡＮＣＥ単結晶回折装置（Ｍｏ Ｋα、λ＝０．７１０７３Å）により１２３（２）Ｋで取得したものである。

本発明の試験実施例に記載の化合物Ｒ_P‐１とは、化合物Ｒ_P‐１の質量百分率が９５％以上である化合物Ｒ_P‐１リッチな組成物を指す。使用する化合物Ｓ_P‐１とは、化合物Ｓ_P‐１の質量百分率が９０％以上であり、好ましくは９９％以上である本発明に記載の化合物Ｓ_P‐１リッチな組成物を指す。化合物Ｒ_P‐１は、化合物Ｓ_P‐１と同じような製造方法により取得できるが、化合物６１５０２の異性体分離後に化合物６１５０１ｅを得、化合物６１５０１ｂの代わりに化合物６１５０１ｅをその後の反応に用いて、化合物Ｒ_P‐１を得る点で相違する。

本発明における重量体積百分率の単位は、当業者に周知されているものであり、例えば、１００ｍｌの溶液中の溶質の重量を指す。別段の定義がない限り、本明細書で使用する全ての専門用語および科学用語は、当業者に周知されているものと同じ意味を有する。さらに、本明細書の記載と同様又は等価な任意の方法および材料はいずれも、本発明の方法に使用できる。本明細書に記載の好ましい実施方法および材料は、例示のためのものにすぎない。

本発明において、化合物Ｓ_P‐１の純度はＨＰＬＣ法により測定する。ＨＰＬＣは、カラム：オクタデシルシラン結合シリカを充填剤として使用するもの（ＹＭＣ‐ｈｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ Ｃ１８カラム、１５０ｍｍ×４．６ｍｍ ３μｍ）、移動相：０．１％リン酸‐メタノール（１０～５０：９０～５０）、流量１．０ ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長２７２ｎｍの条件で行う。

本発明の中間体化合物である６１５０１ｂの純度もＨＰＬＣ法により測定する。ＨＰＬＣは、カラム：ＹＭＣ ｈｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ １５０×４．６ｍｍ、３μｍ；移動相：４０％～８５％メタノール、２‰リン酸／水、実行時間４６ｍｉｎ、グラジエント溶離、必要に応じて移動相の溶媒比率を調整し、流速１．０ ｍｌ／ｍｉｎの条件で行う。

実施例１ 化合物６１５０２の作製

‐８０℃で６１５０１ｈ ２０ｇのジクロロメタン溶液６０ｍｌに６１５０１ｇ ２０．６ｇを加え、続いてトリエチルアミン１９．３ｇの溶液（２０ｍｌジクロロメタン希釈）を加えた。混合物を室温で一晩撹拌した。混合物に６１５０１ｆを加え、続いてトリエチルアミン１９．３ｇの溶液（２０ｍｌジクロロメタン希釈）を加え、混合物を室温で４ｈ撹拌した。混合物を直接脱溶媒し、残渣を酢酸エチル２００ｍｌ及び水４００ｍｌに溶解した。酢酸エチルを分離した後、酢酸エチル（２＊１００ｍｌ）で水相を２回洗い、１回につき酢酸エチル１００ｍｌを用いた。酢酸エチル相を併合し、酢酸エチル相を食塩水で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。酢酸エチルを留去して、目的化合物６１５０２を得、これを次の精製に直接使用した。

実施例２ 化合物６１５０１ｂの作製

化合物６１５０２ １２０ｇを酢酸エチル２４０ｍｌに溶かし、撹拌し続け、室温で石油エーテル７２０ｍｌを徐々に滴下し、結晶が析出した後、ろ液をろ過により除去することで、化合物６１５０１ｂを合計４９．５ｇ得た。収率は４１．２％であり、ＨＰＬＣ純度は１００．０％である（図１参照）。

実施例３ 化合物６１５０１ｃの作製

室温で化合物６１５０１ｄ ２０ｇとテトラヒドロフラン２００ｍｌ及び水１００ｍｌとの混合溶液に炭酸ナトリウム３５．４ｇを加え、続いてジ-tert-ブチルジカーボネート１７．５ｇを加え、反応終了まで室温で撹拌し続けた。酢酸エチル（３＊２００ｍｌ）により混合物を３回抽出し、１回につき酢酸エチル２００ｍｌを用いた。酢酸エチルを併合し、食塩水で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去した後シリカゲルクロマトグラフィー（２．５％～１０％メタノール／ジクロロメタン）により残渣を精製し、化合物６１５０１ｃ １８ｇを得た。収率は６７％である。

実施例４ 化合物６１５０１ａの作製

０℃で化合物６１５０１ｃ ５ｇのテトラヒドロフラン２５ｍｌ溶液に濃度１．０ｍｏｌ／Ｌのtert-ブチルマグネシウムクロリド溶液４１．２８ｍｌを加え、１ｈ撹拌して反応させた後、実施例２で得られた化合物６１５０１ｂ １２．４２ｇを加え、反応終了まで室温で撹拌し続けた。混合物に塩化アンモニウム飽和水溶液２５０ｍｌを加え、酢酸エチル（３＊２５０ｍｌ）により水相を３回抽出し、１回につき酢酸エチル２５０ｍｌを用いた。酢酸エチル相を併合し、食塩水で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、脱溶媒した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（移動相：メタノール／ジクロロメタン（メタノールの比率を２．５％から５％に上昇）、グラジエント溶離）により精製することで、化合物６１５０１ａ ６．７ｇを得た。収率は７１．３％であり、ＨＰＬＣ純度は９５．１％である。

実施例５ 化合物Ｓ_P‐１の作製

０℃で化合物６１５０１ａ ６．７ｇのジクロロメタン３３．５ｍｌ溶液にトリフルオロ酢酸２０．１ｍｌを加え、反応終了まで保温して撹拌した。混合物を脱溶媒した後、重炭酸ナトリウム溶液１５０ｍｌを加え、酢酸エチルで３回抽出し、１回につき酢酸エチル１５０ｍｌを用いた。酢酸エチル相を併合し、食塩水で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。脱溶媒した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（移動相：メタノール／ジクロロメタン（メタノールの比率を２．５％から１０％に上昇）、グラジエント溶離）により精製することで、化合物Ｓ_P‐１ ４．１ｇを得た。収率は７２％であり、ＨＰＬＣ純度は１００．０％である（図２参照）。³¹Ｐ‐ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、ＭｅＯＤ）：δ_P３．６４．（図３参照）。¹Ｈ‐ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＭｅＯＤ）：δ_H：７．５６、７．５２（２ｄ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ‐６）、７．３８‐７．３３（ｍ、７Ｈ、ＡｒＨ）、７．２６‐７．１９（ｍ、３Ｈ、ＡｒＨ）、６．２５（ａｐｐａｒｅｎｔ ｑ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ‐１’）、５．８８、５．８４（２×ｄ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ‐５）、５．１８‐５．１２（ｍ、２Ｈ、ＯＣＨ₂Ｐｈ）、４．４９‐４．４２（ｍ、１Ｈ、Ｈ‐５’）、４．３８‐４．３１（ｍ、１Ｈ、Ｈ‐５’）、４．２５‐４．１８（ｍ、１Ｈ、Ｈ‐３’）、４．０７‐４．０１（ｍ、２Ｈ、Ｈ‐４’、ＣＨＣＨ₃）、１．３８（ａｐｐａｒｅｎｔ ｔ、Ｊ＝８．５Ｈｚ、３Ｈ、ＣＨＣＨ₃）（図４参照）。

実施例６ 化合物Ｓ_P‐１の作製

０℃で化合物６１５０１ａ ２ｇの酢酸エチル１０ｍｌ溶液に塩化水素／酢酸エチル（７ｍｏｌ／Ｌ ６ｍｌ）を加え、反応終了まで保温して撹拌した。溶媒を留去した後、重炭酸ナトリウム溶液５０ｍｌを加え、酢酸エチルで３回抽出し、１回につき酢酸エチル５０ｍｌを用いた。酢酸エチル相を併合し、食塩水で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。有機溶媒を留去した後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（移動相：メタノール／ジクロロメタン（メタノールの比率を２．５％から１０％に上昇）、グラジエント溶離）により精製することで、化合物Ｓ_P‐１ １２２５ｍｇを得た。収率は７０％であり、ＨＰＬＣ純度は９９．２１％である。³¹Ｐ‐ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、ＭｅＯＤ）：δ_P ３．６４．；¹Ｈ‐ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＭｅＯＤ）：δ_H：７．５６、７．５２（２ｄ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ‐６）、７．３８‐７．３３（ｍ、７Ｈ、ＡｒＨ）、７．２６‐７．１９（ｍ、３Ｈ、ＡｒＨ）、６．２５（ａｐｐａｒｅｎｔ ｑ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ‐１’）、５．８８、５．８４（２×ｄ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ‐５）、５．１８‐５．１２（ｍ、２Ｈ、ＯＣＨ₂Ｐｈ）、４．４９‐４．４２（ｍ、１Ｈ、Ｈ‐５’）、４．３８‐４．３１（ｍ、１Ｈ、Ｈ‐５’）、４．２５‐４．１８（ｍ、１Ｈ、Ｈ‐３’）、４．０７‐４．０１（ｍ、２Ｈ、Ｈ‐４’、ＣＨＣＨ₃）、１．３８（ａｐｐａｒｅｎｔ ｔ、Ｊ＝８．５Ｈｚ、３Ｈ、ＣＨＣＨ₃）。

実施例７ 結晶形態の化合物Ｓ_P‐１の作製
実施例５で得られた化合物Ｓ_P‐１をエタノール／水（１／３、ｖ／ｖ）系に加え、５０℃から０．０１℃／ｍｉｎの速度で５℃まで徐々に降温させ、棒状単結晶を得た（図６参照）。得られた単結晶をＸＲＰＤ測定した結果は図７に示すとおりであり、単結晶のセルパターンは図８に示すとおりである。単結晶分析により、化合物Ｓ_P‐１分子の絶対配置が、リン原子Ｐ１（Ｓ）と、Ｃ９（Ｓ）、Ｃ１８（Ｒ）、Ｃ１９（Ｒ）、Ｃ２１（Ｒ）であることを確認し、三次元構造は図９、１０に示すとおりである。

実施例８ 結晶形態の化合物Ｓ_P‐１の作製
実施例６で得られた化合物Ｓ_P‐１をエタノール／水（１／３、ｖ／ｖ）系に加え、３０℃から０℃まで徐々に降温させ、実施例７と同じ結晶形態の化合物Ｓ_P‐１を得た。

比較例１：化合物１の作製

（１）化合物６１５０１２ａの作製
０℃で化合物６１５０１ｃ ２ｇのテトラヒドロフラン１０ｍｌ溶液にtert-ブチルマグネシウムクロリド溶液（１．０ｍｏｌ／Ｌ、１６ｍｌ）を加え、１ｈ撹拌して反応させた後、化合物６１５０２ ５ｇ（異性体６１５０１ｅと６１５０１ｂの比率が２６．２５％：７２．０３％で、図１１参照）を加え、反応終了まで室温で撹拌し続けた。混合物に水５０ｍｌを加え、酢酸エチル（３＊１００ｍｌ）により水相を３回抽出し、１回につき酢酸エチル１００ｍｌを用いた。酢酸エチル相を併合し、食塩水で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、脱溶媒した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：メタノール／ジクロロメタン２．５％～５％グラジエント溶離）により精製することで、化合物６１５０１２ａ １．９ｇを得、収率は５３％である。

（２）化合物１の作製
０℃で化合物６１５０１２ａ ３．９８ｇのジクロロメタン１０ｍｌ溶液にトリフルオロ酢酸１２ｍｌを加え、反応終了まで保温して撹拌した。混合物を脱溶媒した後、重炭酸ナトリウム溶液１００ｍｌを加え、酢酸エチルで３回抽出し、１回につき酢酸エチル８０ｍｌを用いた。酢酸エチル相を併合し、食塩水で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。脱溶媒した後、複数回のシリカゲルカラムクロマトグラフィー（移動相：メタノール／ジクロロメタン（メタノールの比率を２．５％から１０％に上昇）、グラジエント溶離）により精製し、１．１ｇの化合物１を得、ＨＰＬＣ純度は１００％であり、異性体Ｒ_P‐１とＳ_P‐１の比率は１０．８２％：８９．１８％である（図１２参照）。³¹Ｐ‐ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、ＭｅＯＤ）では、δ_Pは３．８１、３．６４であり、δ_P３．８１は異性体Ｒ_P‐１における³¹Ｐの吸収位置で、δ_P３．６４は異性体Ｓ_P‐１における³¹Ｐの吸収位置である。

薬理学的活性の測定
実施例９ 体外腫瘍細胞増殖抑制のＩＣ₅₀値の測定
ＣＴＧ法により、ＢｘＰＣ‐３、ＭＩＡ ＰａＣａ‐２及びＯＶＣＡＲ‐３腫瘍細胞系における化合物Ｓ_P‐１、化合物Ｒ_P‐１及びＮＵＣ‐１０３１の５０％細胞増殖抑制濃度（ＩＣ₅₀）を測定した。

指数増殖期の細胞を回収し、Ｖｉ‐Ｃｅｌｌ ＸＲ細胞カウンターにより生存細胞数を測定した。各細胞に対応する培地により細胞懸濁液を３．３３×１０⁴／ｍｌ又は５．５６×１０⁴／ｍｌまで調整した。９６ウェル細胞培養プレートの各ウェル毎に細胞懸濁液９０μｌを加え、最終細胞濃度はＢｘＰＣ‐３、ＭＩＡ ＰａＣａ‐２ ３０００細胞／ウェル、ＯＶＣＡＲ‐３ ５０００細胞／ウェルであった。ＤＭＳＯにより各試験化合物を溶解して１０ｍＭのストック溶液とした。ストック溶液及びＤＭＳＯを用いて３．１６×シリーズの勾配希釈液を調製した。その後、それぞれ培地で１００倍に希釈した。最後に、各細胞の１ウェルあたりにそれ相応の１０倍濃度の溶液１０μｌをそれぞれ注入し、１つの薬物濃度を３ウェル繰り返し（化合物の調製方法及び試料添加設計：ＩＣ₅₀実験ウェルプレートの試料添加設計を参照）、最終測定に用いた試験化合物及び対照化合物の濃度範囲は次頁の化合物の調製方法及び試料添加設計を参照する。試験化合物及び対照化合物は、１ウェルあたりのＤＭＳＯ最終濃度が０．１％となるように希釈した。３７℃、５％ＣＯ₂のインキュベータ内で７２時間（ＢｘＰＣ‐３、ＭＩＡＰａＣａ‐２）又は９６時間（ＯＶＣＡＲ‐３）培養した。７２又は９６時間の薬物処置後、ＣＴＧのマニュアルに従い、各ウェル毎に、予め溶かして室温まで平衡したＣＴＧ溶液５０μｌ（１／２培養体積）を注入し、マイクロプレート発振器で２分混合し、室温で１０分放置した後、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ２１０４プレートリーダーにより蛍光信号値を測定した。

細胞生存率は、Ｖ_sample／Ｖ_{vehicle control}×１００％の式で計算した。式中、Ｖ_sampleは薬物処置組の読取値であり、Ｖ_{vehicle control}は溶媒対照組の平均値である。ソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５．０により、Ｓ型投与量-生存率の曲線を、非線形回帰モデルを用いてプロットし、ＩＣ₅₀値を計算した。３つの細胞系における試験化合物の細胞増殖ＩＣ₅₀の結果を下記の表１に示す。

表１：３つの細胞系における試験化合物の細胞増殖ＩＣ₅₀の結果

上述した実験結果によれば、化合物Ｓ_P‐１、化合物Ｒ_P‐１及びＮＵＣ‐１０３１は、ＢｘＰＣ‐３、ＭＩＡ ＰａＣａ‐２及びＯＶＣＡＲ‐３腫瘍細胞に対して、いずれも強い細胞毒性を示し、ＩＣ₅₀値は約０．０１ｎＭ～１ｎＭの範囲にある。化合物Ｓ_P‐１の体外腫瘍細胞増殖抑制効果は、化合物Ｒ_P‐１の約１０倍であり、図１３からも明らかである。

実施例１０ ヒト膵臓癌のマウス皮下移植モデルにおける試験薬の化合物Ｓ_P‐１、化合物Ｒ_P‐１及びＮＵＣ‐１０３１の薬力学的評価
細胞培養：ＭＩＡ ＰａＣａ‐２細胞は、１０％ウシ胎仔血清及び２．５％ＨＳのＤＭＥＭ培養液中で培養した。指数増殖期のＭＩＡ ＰａＣａ‐２細胞を回収し、ヌードマウスの皮下腫瘍接種のための適切な濃度になるようにＰＢＳ再懸濁した。
動物のモデリングとグループ分け：ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス、メス、６‐８週（腫瘍細胞接種時のマウスの予想週齢）、１８～２２ｇ、上海霊暢生物科技有限公司より購入し、合計５２匹（４０匹＋３０％の余剰）のマウスを必要とした。１グループが８匹となるように、５つのグループに分けた。すべての実験マウスをバリアシステム内で飼育し、少なくとも７日間事前に環境に適応させた。各マウスに３×１０⁶個のＭＩＡ ＰａＣａ‐２細胞を右背部に皮下接種し、細胞を１：１のＰＢＳおよびマトリゲルに再懸濁した（０．１ｍｌ／匹）。腫瘍の成長を定期的に観察し、腫瘍が平均１５０～２００ｍｍ³の大きさまで成長した時に、腫瘍の大きさ及びマウスの体重に応じて、ランダムにグループを選んで試験薬を投与した。詳細な投与方法、投与量及び投与経路を表２に示す。

表２ ＭＩＡ ＰａＣａ‐２動物モデルにおける試験薬の投与経路、投与量及びレジメン

［備考］
ｉ．ｐ．：腹腔内注射
ＢＩＷ：週２回投与

実験観察の指標及び計算
相対的腫瘍抑制率ＴＧＩ（％）は、ＴＧＩ％＝（１‐Ｔ／Ｃ）×１００％である。Ｔ／Ｃ％は相対的な腫瘍増殖率であり、すなわち、ある時点における、対照グループに対する治療グループの相対的な腫瘍体積又は腫瘍重量の百分率である。ＴとＣはそれぞれ、治療グループと対照グループの、ある特定の時点における相対的腫瘍体積（ＲＴＶ）又は腫瘍重量（ＴＷ）である。

計算式は下記のとおりである。
Ｔ／Ｃ％＝Ｔ_RTV／Ｃ_RTV×１００％
（Ｔ_RTV：処置グループの平均ＲＴＶ；Ｃ_RTV：溶媒対照グループの平均ＲＴＶ；ＲＴＶ＝Ｖ_t／Ｖ₀。Ｖ₀はグループ分け時の上記動物の腫瘍体積であり、Ｖ_tは処置後の上記動物の腫瘍体積である）。
又はＴ／Ｃ％＝Ｔ_TW／Ｃ_TW×１００％
（Ｔ_TW：治療グループの実験終了時の平均腫瘍重量；Ｃ_TW：溶媒対照グループの実験終了時の平均腫瘍重量）。

実験結果：
ゲムシタビンを週に２回、４週連続して投与した結果、腫瘍に対する良好な抑制効果が観察され、相対的腫瘍抑制率は５５％に達した。ゲムシタビンと同じモル量の化合物Ｓ_P‐１、化合物Ｒ_P‐１、ＮＵＣ‐１０３１を週に２回、４週連続して投与した結果、ＴＧＩ（％）はそれぞれ７９％、２２％、５４％であった。つまり、化合物Ｓ_P‐１は、化合物Ｒ_P‐１よりも優れる体内抗腫瘍活性を示している（図１４参照）。

実施例１１ ＭＩＡ ＰａＣａ‐２ヒト膵臓癌のマウス皮下移植モデルにおける試験薬の化合物Ｓ_P‐１及び化合物Ｒ_P‐１の単回投与後の薬物動態学的評価

細胞培養：ＭＩＡ ＰａＣａ‐２細胞は、１０％ウシ胎仔血清及び２．５％ＨＳのＤＭＥＭ培養液中で培養した。指数増殖期のＭＩＡ ＰａＣａ‐２細胞を回収し、ヌードマウスの皮下腫瘍接種のための適切な濃度になるようにＰＢＳ再懸濁した。
動物のモデリングとグループ分け：ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス、メス、６～８週（腫瘍細胞接種時のマウスの予想週齢）、１８～２２ｇ、上海霊暢生物科技有限公司より購入し、合計４７匹（３６匹＋３０％の余剰）のマウスを必要とした。１グループが６匹となるように、６つのグループに分けた。すべての実験マウスをバリアシステム内で飼育し、少なくとも７日間、事前に環境に適応させた。各マウスに３×１０⁶個のＭＩＡ ＰａＣａ‐２細胞を右背部に皮下接種し、細胞を１：１のＰＢＳおよびマトリゲルに再懸濁した（０．１ｍｌ／匹）。腫瘍の成長を定期的に観察し、腫瘍が平均２００～２５０ｍｍ³の大きさまで成長した時に、腫瘍の大きさ及びマウスの体重に応じて、ランダムにグループを選んで試験薬を投与した。詳細な投与方法、投与量及び投与経路を表３に示す。

表３ ＭＩＡ ＰａＣａ‐２動物モデルにおける試験薬の投与経路、投与量及びレジメン

［備考］
ｉ．ｐ．：腹腔内注射
ＢＩＷ：週２回投与

投与から０．５ｈ、２ｈ及び２４ｈ後にそれぞれ腫瘍組織を採取した。腫瘍を採取した後、直ちに液体窒素中で急速凍結した。腫瘍重量を秤量し、２０％メタノール／水氷浴で１：５のホモジナイゼーション比となるようにでホモジナイズし、ＬＣ‐ＭＳ／ＭＳにより、腫瘍組織中の活性代謝物であるｄＦｄＣＴＰの濃度を測定した。

実験結果：
１１０ｍｇ／ｋｇの化合物Ｓ_P‐１と化合物Ｒ_P‐１を腹腔内注射した実験結果は図１５に示す。化合物Ｓ_P‐１を腹腔内注射してから０．５、２、２４時間後の腫瘍組織活性代謝物ｄＦｄＣＴＰの濃度はそれぞれ１２．０、５．９７、０．５０４μｇ／ｇであり、化合物Ｒ_P‐１を腹腔内注射してから０．５、２、２４時間後の腫瘍組織活性代謝物ｄＦｄＣＴＰの濃度はそれぞれ３．０３、１．６７、０．１５７μｇ／ｇであった。化合物Ｓ _P ‐１を投与してから０．５、２、２４ｈ後の腫瘍組織活性代謝物ｄＦｄＣＴＰの濃度はそれぞれ化合物Ｒ_P‐１の３．９６倍、３．５７倍、３．２１倍であった（図１５参照）。

Claims (8)

1. 組成物における化合物Ｓ_P‐１の純度が９９％以上であり、かつ組成物における化合物Ｓ_P‐１と化合物Ｒ_P‐１の重量比が９９：１の値以上である、化合物Ｓ_P‐１リッチな組成物の製造方法であって、
   

   

   化合物６１５０１ｂと化合物６１５０１ｃを反応させて、化合物６１５０１ａを作製する工程、及び、
   

   

   
   化合物６１５０１ａのヒドロキシ保護基を脱離させ、化合物Ｓ_P‐１を得る工程、および
   

   

   さらに、低級アルコール及び水からなる溶媒中で、化合物Ｓ_P‐１を晶析させる工程、
   を含むことを特徴とし、化合物Ｓ_P‐１は、α＝９０°、β＝１１１．８５７（４）°、γ＝９０°の角度において、ａ＝１１．３６Å、ｂ＝３４．８４Å、ｃ＝１５．１２Åで、体積が５５５４ųである格子を有する結晶である、組成物の製造方法。
2. さらに、化合物６１５０２を晶析することによって、化合物６１５０１ｂを単離する工程
   

   

   
   を含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物の製造方法。
3. さらに、化合物６１５０１ｈと化合物６１５０１ｇを塩基性条件下で反応させた後、化合物６１５０１ｆとさらに反応させて、化合物６１５０２を作製する工程
   

   

   
   を含むことを特徴とする、請求項２に記載の組成物の製造方法。
4. 前記化合物６１５０１ｃは、化合物６１５０１ｄから作製されることを特徴とする請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
   

   
5. 晶析溶媒は、酢酸エチル／石油エーテルであることを特徴とする請求項２に記載の方法。
6. 化合物６１５０２と酢酸エチルとの重量体積比は２：５～４：５であり、酢酸エチルと石油エーテルの体積比は１：４～１：６であることを特徴とする請求項５に記載の方法。
7. 前記低級アルコール及び水からなる溶媒は、１部のＣ _1-3 アルコールと３部の水からなることを特徴とする請求項１に記載の方法。
8. 膵臓癌、末期固形腫瘍、卵巣腫瘍、非小細胞肺癌、乳癌、膀胱癌、子宮頸癌、中皮腫、食道癌、胃癌、直腸癌、肝臓癌、胆管癌、鼻咽頭癌、精巣癌、リンパ腫または頭頸部癌を含む癌の治療薬の製造に用いることを特徴とする請求項１～７のいずれか１項に記載の化合物Ｓ_P‐１リッチな組成物の製造方法。

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