JP7278777B2 - 骨髄由来サプレッサー細胞のターゲティングにより癌を処置する方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2016年5月25日出願の米国仮出願62/341,587に基づく優先権を、35 U.S.C. § 119(e)の下に主張し、それを全体として引用により本明細書に包含させる。
ここに記載する発明は、リンカーを介して薬物に結合した葉酸受容体結合リガンドを含む化合物を1以上使用して、癌を処置する方法に関する。より具体的に、ここに記載する発明は、骨髄由来サプレッサー細胞を標的とするようにリンカーを介して薬物に結合した葉酸受容体結合リガンドを含む化合物を1以上使用して、癌を処置する方法に関する。
放射線療法、化学療法およびホルモン療法などの抗癌テクノロジーの顕著な進歩にもかかわらず、米国で癌はなお心疾患に続く死亡原因の第2位のままである。ほとんどの場合、癌は、マイトマイシン、パクリタキセルおよびカンプトテシンなどの高度に強力な薬物を利用する化学療法で処置される。多くの場合、これらの化学療法剤は用量反応性効果を示し、腫瘍阻害は薬物用量に比例する。それ故に、積極的投与レジメンが新生物処置に使用されているが、高用量化学療法は癌細胞に対する乏しい選択性および正常細胞への毒性により妨げられる。腫瘍特異性の欠如は、化学療法が乗り越える必要がある多くの障害の1つである。
ここに記載する発明の各実施態様は、適用可能であれば、任意の他のここに記載する実施態様と組み合わせ得ることが理解される。例えば、概要および/またはここに記載する番号付けした条項における実施態様の何れかまたは任意の適用可能なそれらの組み合わせを、本特許明細書の説明的実施態様の詳細な記載の章において記載する実施態様の何れかと組み合わせ得る。
1. 宿主動物にリンカーを介して薬物に結合した葉酸受容体結合リガンドを含む化合物の1以上の治療有効量を投与することを含む、葉酸受容体陰性癌を処置する方法であって、ここで、骨髄由来サプレッサー細胞を阻害または枯渇させる、方法。
Fmoc-Glu-OtBuはAAPPTEC Inc.から購入した。4-クロロ-3-ニトロキノリンはMatrix Scientific Inc.から購入した。Fmoc-8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸はPolyPeptide Inc.から購入した。N10-(トリフルオロアセチル)プテロイン酸、ツブリシンはEndocyte Inc.から購入した。固相合成モニターキットはANASPEC Inc.から購入した。2,2-ジメチルオキシラン、水酸化アンモニウム、二炭酸ジ-tert-ブチル、トリフルオロ酢酸、トルエン、2-プロパノール、メタノール、Pd/C、1,2-ジアミノエタントリチル(ポリマー結合樹脂)、トリエチルアミン、塩化バレリル、酢酸エチル、ヘキサン、Na2SO4、酸化カルシウム、ジクロロメタン、3-クロロペルオキシ安息香酸、イソシアン酸ベンゾイル、H-cys(Trt)-2-クロロトリチル樹脂、ナトリウムメトキシド、ジメチルアミノピリジン、アセトニトリル、DMSO、4-クロロ-3-ニトロ-a,a,a-トリフルオロトルエン、ヒドラジン水和物、エタノール、Na2CO3、NaHCO3、濃HCl、エーテル、トリクロロメチルクロロホルメート、塩化スルフリル、2-メルカプトピリジン、2-メルカプトエタノール、DMF、PyBOP、DIPEA、エタンジチオール、トリイソプロピルシラン、20%ピペリジンDMF溶液、4-クロロ-3-ニトロ-a,a,a-トリフルオロトルエン、ヒドラジン水和物、5,15-DPP、レシキモド、2,4-ジアミノ-6-ヒドロキシピリミジン、N-アセチル-5-ヒドロキシトリプタミン、メトトレキサート、エベロリムス、ザイモサン、MnCl2、L-アルギニン、ダルベッコリン酸緩衝化食塩水(PBS)、クロストリジウム・ヒストリチカム(clostridium histolyticum)からのコラゲナーゼ、ウシ膵臓からのデオキシリボヌクレアーゼI、ウシ精巣由来ヒアルロニダーゼ、ウシ血清アルブミン(BSA)、グリシン、ナトリウムアジド、OPD基質はSigmaから購入した。水素、アルゴン、窒素の圧縮ガスは、Indiana Oxygen Companyから購入した。BEZ235、PF-04691502、GDC-0980、ワートマニン、BLZ945、レナリドマイド、NLG919、AS1517499およびBIRB796はSelleckchemから購入した。AMTはTocris Bioscienceから購入した。CL307、CpGおよびポリICはInvivoGen Inc.から購入した。グリース試薬はLifetechnology Inc.から購入した。10%Triton X-100はPierce Inc.から購入した。プロテアーゼ阻害剤はResearch Products Internationalから購入した。QuantiChromTM尿素アッセイキットはBioAssay Systemsから購入した。マウスIL-10培地および抗マウスFITCアルギナーゼはR&D Systemsから購入した。RPMI 1640培地、葉酸欠損RPMI 1640培地はGibco Inc.から購入した。ペニシリンストレプトマイシン溶液(50×)、L-グルタミン(200mM)、2.21mM EDTA含有0.25%トリプシン(1×)はCorning Inc.から購入した。胎児ウシ血清(FBS)はAAtlanta biologicals Inc.から購入した。動物用葉酸欠損餌はEnvigo Inc.から購入した。マウス葉酸受容体-β抗体(F3IgG2a)は、NIHのディミトロフ博士から恵与された。マウスFcブロッカー(CD16/CD32)、抗マウスFITC-CD11b、抗マウスPE-F4/80、抗マウスPE-Gr1、抗マウスPE-CD4、抗マウスFITC-CD8、7-AAD生存能染色溶液、赤血球溶解緩衝液(10×)はBiolegend Inc.から購入した。固定可能生存能色素eFluor(登録商標)660はeBioscience, Inc.から購入した。PierceTM16%ホルムアルデヒド(w/v)(無メタノール)はThermo Fischer Scientificから購入した。イソフルランはVetOne Inc.から購入した。Andy FluorTM647 NHSエステル(スクシンイミジルエステル)はApplied Bioprobesから購入した。マウスGM-CSFはMiltenyi Biotec Inc.から購入した。葉酸-ツブリシンは、文献法により製造した(例えばWO2014/062697に記載の方法参照)。抗ヒトAPC-CD33抗体はBiolegend Inc.から購入した。ヒトT細胞培養培地(TexMACS培地)、ヒトIL-2はMiltenyi Biotechから購入した。ヒトT細胞単離キット(ヒトT細胞富化キット)はSTEMMCELLから購入した。Ficoll-PaqueTM PlusはGE Healthcareから購入した。6-チオグアニンおよびメチレンブルーはSigmaから購入した。
実施例1:細胞培養および動物飼育
葉酸受容体を発現しない4T1細胞は、Endocyte Inc.から提供された。細胞を完全RPMI 1640培地(10%胎児ウシ血清、1%ペニシリンストレプトマイシンおよび2mM L-グルタミン添加RPMI 1640培地)で、37℃で加湿95%空気、5%CO2雰囲気下培養した。細胞培地に3~4日毎に2.21mM EDTA含有0.25%トリプシンを添加した。6~8週齢の雌balb/cマウスをEnvigo Inc.から得た。動物を、通常の齧歯類餌または葉酸欠損餌で飼育し、試験期間中標準12時間明暗サイクルの無菌環境に置いた。全ての動物処理は、NIHガイドラインに従ってパーデュー動物飼育利用委員会(Purdue Animal Care and Use Committee)により承認された。
4T1固形腫瘍モデル:6~8週齢の雌balb/cマウスを、2週間葉酸欠損餌で飼育した。腫瘍移植前、マウスの左体側を電動トリマーで除毛した。50μL完全RPMI 1640培地に懸濁した5万4T1細胞を、***脂肪体近くに皮下にインプラントした。処置を、腫瘍体積が約20~50mm3に達した6日目に開始した。FR+ TAM/MDSCの特徴付けのために、腫瘍を、300~500mm3の体積になったとき、消化させた。細胞表面タンパク質への損傷を最小にする腫瘍消化が開発された。消化カクテルは、10mL無血清葉酸欠損RPMI 1640培地中1mg/mL コラゲナーゼIV、0.1mg/mL ウシ***由来ヒアルロニダーゼおよび0.2mg/mL デオキシリボヌクレアーゼIからなった。穏やかに振盪させながら1時間、37℃で消化後、消化反応を10%熱不活性化FBS含有葉酸欠損RPMI 1640培地の添加により停止させ、破壊された腫瘍を40μmセルストレーナーを通して、個々の細胞を取得した。単離細胞を遠沈させて消化カクテルを除き、氷上で、5分、5~10mL 赤血球溶解緩衝液(1×)に再懸濁させた。30~40mLのPBSを添加して、細胞溶解反応を停止させた。細胞を遠沈して上清を除去し、2%FBS含有PBSであった流動染色(flow staining)培地に再懸濁した。細胞を計数し、次いでフローサイトメトリー染色に備えた。
細胞表面マーカー染色:固形腫瘍モデルまたは腹膜腫瘍モデルから得た単一細胞懸濁液を、先に記載のとおり調製した。100μL流動染色培地中の100万細胞を、5分、氷上で0.7μL マウスFcブロッカーとインキュベートした。MDSC(CD11b、Gr1)、TAM(CD11b、F4/80)および葉酸受容体-β(F3IgG2a)の表面マーカーを、Fcブロッカーとインキュベーション後に添加した。表1および2は、表面マーカー染色に使用した抗体の体積を記載した。1時間時間、氷上でインキュベーション後、細胞を500μL PBSで洗浄し、200μL流動染色培地に再懸濁した。死/生存細胞マーカー(3μLの7-AADまたは1μLのBV421死/生存)を各サンプルに添加し、暗所で室温でインキュベートした。15分後、細胞を、洗浄せずに、BD Accuri C6TMフローサイトメーターを使用して分析した(表1染色)。1回洗浄を表2の染色について行い、細胞をBD Forteassaフローサイトメーターを使用して分析した。結果を図5および図6に示す。図5および図6に示すとおり、固形4T1腫瘍におけるマウスMDSCおよびTAM集団は、それぞれCD11b+Gr1+およびCD11b+F4/80+マーカーにより確認できる。これらの2集団の細胞をゲーティング後、FR-β発現は、これら2集団の大部分で観察できた(MDSCで61.2%およびTAMで95%)。
腹膜モデルから単離した細胞を10ng/mL マウスGM-CSF添加完全RPMI 1640培地に再懸濁し、96ウェルプレートに播種した。表2に挙げる種々の濃度のスクリーニング薬物を同培地に溶解し、300μL培地中50万の細胞を含む各ウェルに添加した。薬物を添加しない300μL培地中50万細胞を含むウェルを未処置対照として維持した。3つのさらなるウェルに、細胞および薬物を含まない300μL培地を入れ、背景対照として維持した。次いで、細胞を37℃で加湿95%空気、5%CO2雰囲気で24時間~48時間インキュベートした。インキュベーションの最後に、上清をIL-10 ELISAおよび一酸化窒素アッセイのために取得した。細胞を300μL PBSで2回洗浄し、次いで、アルギナーゼアッセイに備えた。
アルギナーゼ活性を、I.M. Corraliza, M.L. Campo, G. Soler, M. Modolell, ‘Determination of arginase activity in macrophages: a micromethod', Journal of Immunological Methods 174 (1994) 231-235に記載のとおり、細胞可溶化物から測定した。すなわち、96ウェルプレートで単離TAM/MDSCを種々の薬物とインビトロインキュベーションした後、細胞を300μL PBSで2回洗浄した。次いで、細胞を30分、室温でプロテアーゼ阻害剤(1×)含有100μLの0.1%Triton X-100で溶解させた。続いて、50μLの可溶化物溶液を新しいV型96ウェルプレートに移した。50μLのアルギナーゼ活性化溶液(10mM MnCl2/50mM Tris・Cl(pH7.5)を細胞可溶化物に添加した。10分、56℃での加熱により、酵素を活性化した。アルギニン加水分解を、25μLの活性化溶液を、25μLのアルギナーゼ基質溶液(0.5M L-アルギニン(pH9.7))と37℃で60分、穏やかに振盪しながらインキュベートすることにより実施した。室温に冷却後、次いで10μLの反応溶液を90μLのPBSで希釈した。10μLのこの希釈溶液を、96ウェル平底透明プレートに移した。200μLの尿素試薬を各ウェルに添加した。室温暗所で10分インキュベーション後、尿素濃度を、プレートリーダーにより520nmで測定した。結果を図7、図11、図12、図15および図24に示す。
種々の化合物とのインビトロインキュベーション後のTAM/MDSCによるIL-10産生を、R&D SystemsによるマウスIL-10培地ELISAに添付のプロトコールに従うELISAアッセイにより決定した。簡潔には、高親和性96ウェルプレートをウェルあたり100μLの希釈捕捉抗体で、PBS中作業濃度4μg/mLで担体タンパク質非存在下に被覆した。プレートを密閉し、一夜、室温でインキュベートした。各ウェルを吸引し、噴出ボトルを使用して、400μLの洗浄緩衝液(PBS中0.05%Tween(登録商標)20、pH7.2~7.4)で3回洗浄した。最後の洗浄後、残った洗浄緩衝液を、プレートを裏返し、清潔なペーパータオルに軽打することにより除いた。プレートを300μLの試薬希釈剤(PBS中1%BSA、pH7.2~7.4)を各ウェルに添加することにより遮断し、室温で1時間インキュベートした。吸引/洗浄を先に記載したのと同じ方法で3回繰り返した。プレートを、サンプル添加に備えた。TAM/MDSCインビトロスクリーニングからの100μLのサンプル上清を各ウェルに添加した。プレートをアドヒシブストリップで覆い、2時間、室温でインキュベートした。先に記載した吸引/洗浄方法を3回繰り返した。試薬希釈剤中300ng/mL濃度の100μLの検出抗体を各ウェルに添加した。プレートを新たなアドヒシブストリップで覆い、2時間、室温でインキュベートした。先に記載した吸引/洗浄方法を3回繰り返した。ストレプトアビジン-HRP(試薬希釈剤中1~40希釈)の100μLの作業希釈を、各ウェルに添加した。プレートを覆い、20分、室温暗所でインキュベートした。先に記載した吸引/洗浄方法を3回繰り返した。200μLの基質溶液(20mLのDI水中OPDの銀および金錠剤の1バッグ)を、各ウェルに添加した。プレートを20分、室温で暗所でインキュベートした。50μLの停止溶液(3M HCl)を、各ウェルに添加した。プレートを穏やかに軽打して、徹底的な混合を確実にした。IL-10濃度は、492nmでマイクロプレートリーダーにより決定した光学密度に比例する。結果を図8および図13に示す。
一酸化窒素産生を、グリース試薬を用いて、Je-In Youn, Srinivas Nagaraj, Michelle Collazo, and Dmitry I. Gabrilovich, ‘Subsets of Myeloid-Derived Suppressor Cells in Tumor Bearing Mice', J Immunol. 2008 Oct 15; 181(8): 5791-5802に記載のとおり測定した。簡潔には、種々の薬物とのTAM/MDSCのインビトロインキュベーション後、各ウェルからの50μLの上清を96ウェル平底透明プレートに移した。20μLのグリース試薬および30μLのDI水を、50μLの上清の各ウェルに添加した。反応溶液を暗所で室温で30分維持し、その後プレートリーダー測定した。548nmの吸光度は、TAM/MDSCにより産生される一酸化窒素濃度に相関する。結果を図9、図10、図11および図14に示す。
値間の統計的有意を、スチューデントのt検定で試験した。全データは平均±SDとして示した。p≦0.05の確率値を有意と見なした。
M1対M2マクロファージ比(F4/80+CD86+:F4/80+CD206+)を、未処置対照、FA-TLR7アゴニスト、FA-PI3K阻害剤、FA-ツブリシンおよび組み合わせの群ならびに競合群で試験した。
MDSC集団(CD11b+Gr1+)を、未処置対照、FA-TLR7アゴニスト、FA-PI3K阻害剤、FA-ツブリシンおよび組み合わせの群ならびに競合群で試験した。
CD4およびCD8T細胞集団のパーセンテージを、未処置対照、FA-TLR7アゴニスト、FA-PI3K阻害剤、FA-ツブリシン、組み合わせの群ならびに競合群において4T1固形腫瘍から単離した生存細胞で試験した(図27参照)。
FA-TLR7Aの用量試験を、4T1固形腫瘍モデルで、2マウス/群で実施した。種々の用量のFA-TLR7Aを、週5日、腫瘍インプラント(皮下、5万細胞/マウス)6日目から開始して、i.v.注射することにより処置を実施した。処置を2週間続けた。腫瘍体積を毎日測定した。この試験から、葉酸受容体-βを介してTLR7アゴニストでTAM/MDSCをターゲティングすることにより、腫瘍増殖が、特に5nmol、10nmolおよび20nmolの群で遅延したことが見られる。結果を図16および17に示す。
図23は、治療群の処置最終日の平均腫瘍体積を示す。
健常ドナーからのヒトPBMCを次の標準法に従う密度勾配遠心分離により単離した。
血液をPBS(1:2希釈)で希釈した。15mlのFicollを50mlチューブに移した。35mlの希釈血液をFicoll培地に注意深く載せた。チューブを、400gで30分、24℃でブレーキをかけずに遠心分離した。遠心分離器停止後、チューブを、層を壊すことなく、遠心分離器から注意深く出した。PBMCをチューブから注意深く取り、新しい50mLコニカルチューブに移した。単離PBMCをPBSで洗浄し、300gで10分遠心分離した。上清を傾捨した。ペレットをもう一回PBSで洗浄し、200gで15分遠心分離した。単離PBMCを血球計数板で計数した。
ヒトPBMCを、実施例13に記載のとおり密度勾配遠心分離により単離した。単離PBMCを、5×107細胞/ml濃度で、15mlチューブ中、2%FBSおよび1mM EDTAを含む1mlのPBSに差異懸濁した。ヒトT細胞富化キットの50μLのカクテル溶液を懸濁液に添加した。細胞を、10分、RTでインキュベートした。50μLの磁気ビーズ(ヒトT細胞富化キット)を添加し、5分、RTでインキュベートした。T細胞および磁気ビーズ含有チューブを、5分、RTで磁気内に入れた。上清は負に選択されたヒトT細胞を含み、これを集め、計数した。単離T細胞を50U/mlのIL-2と、1×106細胞/ml密度で3日間培養した。次いで細胞溶液をピペットで十分混合し、次に磁石の隣に5分置いて、ビーズを除いた。懸濁液を取得し、これは抑制アッセイ用活性化ヒトT細胞を含んだ。
4T1細胞を移植したBalb/cマウスを、腫瘍サイズが50mm3に達したとき、2週間(7日/週)、3群のFA-コンジュゲートで処置した。2週間処置後、動物を屠殺し、肺を5mlのコラゲナーゼIV PBS溶液(1mg/ml)で2時間、37℃で消化させた。懸濁液を70μmセルストレイナーを通して、単一細胞懸濁液を得た。細胞を60μMの6-チオグアニンを含む10mlの完全RPMI-1640培地と、10~14日間共培養した。培地を培養の最後に除去した。細胞を5mlのメタノールで5分、室温で固定し、DI水で1回洗浄した。5mlのメチレンブルー(0.03%、v/v)を添加して、細胞を5分、室温で染色した。水で洗浄後、細胞を転移評価のために、空気乾燥した。
Balb/cマウスに5×104細胞s.q.でインプラントした。FA-コンジュゲートによる処置を、腫瘍サイズが約50mm3に達したときに開始し、2週間、7日/週で続けた。腫瘍を、サイズが150~200mm3に達したとき、外科的に摘出した。動物生存をモニターした。
実施例1:TLR7アゴニスト(TLR7A)の合成
TLR7アゴニスト(TLR7A)を、Nikunj M. Shukla, Cole A. Mutz, Subbalakshmi S. Malladi, Hemamali J. Warshakoon, Rajalakshmi Balakrishna, and Sunil A. David, ‘Regioisomerism-dependent TLR7 agonism and antagonism in an imidazoquinoline; Structure-Activity Relationships in Human Toll-Like Receptor 7-Active Imidazoquinoline Analogues', J Med Chem. 2012 Feb 9; 55(3): 1106-1116により報告されたスキーム1の方法により合成した。
2,2-ジメチルオキシラン(0.1g、1.388mmol)を、水酸化アンモニウムの20mL氷***液に滴下した。反応混合物を12時間、室温で撹拌した。溶媒を減圧下除去し、残留物をメタノールに溶解した。二炭酸ジ-tert-ブチル(0.75g、3.47mmol)を反応混合物に添加し、4時間撹拌した。混合物をカラムクロマトグラフィー(24%EtOAc/ヘキサン)を使用して精製して、tert-ブチル2-ヒドロキシ-2-メチルプロピルカルバメートを得た。純粋tert-ブチル2-ヒドロキシ-2-メチルプロピルカルバメートを5mLのトリフルオロ酢酸に溶解し、35分撹拌した。溶媒を減圧下除去して、1-アミノ-2-メチルプロパン-2-オールをトリフルオロ酢酸塩1’として得た。1H NMR 500 MHz (500 MHz, CDCl3, δ in ppm): δ 8.62 (s, 2H), 3.02 (d, 2H), 2.06-2.04 (m, 2H), 1.37-1.34 (s, 6H)
1-アミノ-2-メチルプロパン-2-オールのトリフルオロ酢酸塩(化合物1’)(450mg、2.4mmol)を4-クロロ-3-ニトロキノリン(化合物1)(250mg、1.2mmol)およびEt3N(0.5ml、3mmol)のトルエンおよび2-プロパノールの4:1混合物中の溶液に添加した。混合物を70℃で半時間、固体が沈殿を始めるまで加熱した。次いで反応混合物を冷却し、濾過し、トルエン/2-プロパノール(7:3)、エーテルおよび冷水で洗浄した。残留物を80℃で乾燥させて、2-メチル-1-(3-ニトロキノリン-4-イルアミノ)プロパン-2-オール(化合物2)を得た。LCMS: [M+H]+ m/z = 261
2-メチル-1-(3-ニトロキノリン-4-イルアミノ)プロパン-2-オール(化合物2)(450mg、1.72mmol)をメタノールに溶解し、水素バルーンで触媒としてのPd/Cを用いて、4時間水素化した。次いで溶液をセライトを使用して濾過し、溶媒を減圧下蒸発させて、1-(3-アミノキノリン-4-イルアミノ)-2-エチルプロパン-2-オール(化合物3)を得た。LCMS: [M+H]+ m/z = 231. 1H NMR 500 MHz (CDCl3, δ in ppm): δ 8.12 (s, 1H), 7.61-7.58 (m, 1H), 7.48-7.40 (m, 2H), 4.90 (s, 2H), 3.47 (2H), 1.35-1.21 (s, 6H)
化合物3(100mg、0.43mmol)の無水THF溶液に、トリエチルアミン(66mg、0.65mmol)および塩化バレリル(62mg、0.52mmol)を添加した。次いで反応混合物を6~8時間撹拌し、減圧下溶媒を除去した。残留物をEtOAcに溶解し、水および塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥させて、中間体アミド化合物を得た。これをMeOHに溶解し、酸化カルシウムを添加し、マイクロ波で110℃で1時間加熱した。次いで溶媒を除去し、残留物をカラムクロマトグラフィー(9%MeOH/ジクロロメタン)を使用して精製して、化合物4(58mg)を得た。化合物4のMeOH:ジクロロメタン:クロロホルム(0.1:1:1)の溶媒混合物中の溶液に、3-クロロペルオキシ安息香酸(84mg、0.49mmol)を添加し、溶液を45~50℃で40分還流した。次いで溶媒を除去し、残留物をカラムクロマトグラフィー(20%MeOH/ジクロロメタン)を使用して精製して、オキシド誘導体(55mg)を得た。次いでこれを無水ジクロロメタンに溶解し、イソシアン酸ベンゾイル(39mg、0.26mmol)を添加し、45℃で15分加熱した。次いで溶媒を減圧下除去し、残留物を無水MeOHに溶解し、過剰のナトリウムメトキシドを添加した。次いで反応混合物を80℃で1時間加熱した。溶媒を減圧下除去し、残留物をカラムクロマトグラフィー(11%MeOH/ジクロロメタン)を使用して精製して、化合物5を得た。LCMS: [M+H]+ m/z = 312. 1H NMR 500 MHz (CDCl3, δ in ppm): δ 8.16-8.15 (d, 1H), 7.77-7.46 (d, 1H), 7.46-7.43 (m, 1H), 7.33-7.26 (m, 1H), 3.00-2.97 (m, 2H), 1.84-1.78 (m, 2H), 1.47-1.41 (m, 2H), 1.36 (s, 6H), 0.98-0.95 (m, 3H)
ヘテロ二機能性ジスルフィドリンカー(化合物7)を、Satyam A., ‘Design and synthesis of releasable folate-drug conjugates using a novel heterobifunctional disulfide-containing linker', Bioorg. Med. Chem. Lett. 2008 Jun 1;18(11):3196-9により記載された方法に従い、スキーム2に示すとおり、合成した。
塩化スルフリル(25mLの塩化メチレン中1M溶液)を、撹拌中の2-メルカプトピリジン(2.5g、22.5mmol)の25mLの乾燥塩化メチレン溶液に、窒素雰囲気下、0~5℃で20分かけて添加した。黄色固体が析出した。混合物を室温で2時間撹拌し、回転蒸発により濃縮し、こうして得た顆粒状固体を50mLの乾燥塩化メチレンに溶解し、氷浴で冷却した。この撹拌中の懸濁液に、0~5℃で、窒素雰囲気下、2-メルカプトエタノール(1.7mL、24.2mmol)の30mLの乾燥塩化メチレン溶液を5分かけて添加した。最初に、懸濁液は溶解して、透明溶液を形成した。しかしながら、15~20分以内に、淡黄色顆粒状固体が沈殿し初めた。混合物を室温で一夜撹拌した。沈殿を濾過し、HPLCグレード塩化メチレンで洗浄し、真空デシケーターで数時間乾燥させた。化合物(化合物6)の遊離塩基は、その塩酸塩の塩化メチレン中の懸濁液と、わずかに当モル量を超えるジメチルアミノピリジンを混合し、混合物を、短シリカゲルカラムおよび溶離剤として5%メタノールの塩化メチレンを使用して取得することができる。化合物6(遊離塩基、1g、5.4mmolの10mLのアセトニトリル溶液を、2分かけて、撹拌中のBTBC(2.5g、5.7mmol)の50mLのアセトニトリル溶液に、室温で添加した。得られた混合物を室温で38時間撹拌した。混合物を減圧下濃縮し、残留物を酢酸エチル(50mL)および1N NaHCO3(25mL)に分配した。有機層を分離し、1N NaHCO3(10mL)でさらに洗浄し、乾燥させ(無水Na2SO4)、濾過し、減圧下濃縮して、化合物7を得た。LCMS: [M+H]+ m/z = 416. 1H NMR 500 MHz (CDCl3, δ in ppm): δ 8.38-8.32 (m, 3H), 8.09-8.07 (m, 1H), 7.77-7.75 (m, 1H), 7.70-7.69 (m, 1H), 7.14-7.13 (m, 1H), 4.81-4.78 (m, 2H), 3.33-3.31 (m, 2H)
BTBCを、Takeda, K.; Tsuboyama, K.; Hoshino, M.; Kishino, M.; Ogura, H. ‘A Synthesis of a New Type of Alkoxycarbonylating Reagents from 1,1-Bis[6-(trifluoromethyl)benzotriazolyl] Carbonate (BTBC) and Their Reactions', Synthesis, 1987, 557-560に記載の方法に従い、スキーム3に示すとおり、合成した。
H-Cys(Trt)-2-クロロトリチル樹脂(100mg)を12mLのジクロロメタンに分配し、アルゴンで10分バブリングした。ジクロロメタン除去後、10mLのDMF 10mLを添加し、5分バブリングした。5mLの20%ピペリジンのDMF溶液を、各10分で3回添加した。樹脂を各10mLのDMFで5分、3回洗浄した。10mLのイソプロパノールを添加して、樹脂を各5分、3回洗浄した。数分空気乾燥後、遊離アミンを、青色ビーズがアミンの完全な脱保護を示す固体合成モニターキットで試験した。DMFに溶解したFmoc-Glu-OtBu(64mg、0.15mol)、DIPEA(0.105mL、0.6mol)、PyBOP(79mg、0.15molをDMF溶液中のビーズに添加した。5~6時間反応後、DMF/IPAでの3回の反復洗浄を行った。アミンの脱保護が、5mLの20%ピペリジンDMF溶液の3回の添加により行った。3回DMFで洗浄後、2mLのDMF溶液とN10-(トリフルオロアセチル)プテロイン酸(62mg、0.15mol)、DIPEA(0.105ml、0.6mol)、PyBOP(79mg、0.15mol)をDMF溶液中のビーズに添加した。反応をアルゴン下5~6時間続けた。8mLの体積比96.25/1.25/1.25/1.25のTFA/エタンジチオール/トリイソプロピルシラン/H2O混合溶液を、各30分で3回添加して、化合物を樹脂から開裂させた。トリフルオロアセチル保護化合物8をHPLCで精製した。化合物8を、トリフルオロアセチル基をアンモニウム溶液(5ml、0.5M)で2時間、室温で脱保護後得た。LCMS: [M+H]+ m/z = 544
Claims (7)
- 葉酸受容体結合リガンドが葉酸受容体βに特異的であり、葉酸受容体結合リガンドが骨髄由来サプレッサー細胞上の葉酸受容体βに結合する、請求項1に記載の医薬組成物。
- 癌が非小細胞肺癌、頭頸部癌、トリプルネガティブ乳癌、乳癌、卵巣癌、結腸癌、前立腺癌、肺癌、子宮内膜癌および腎臓癌から選択される、請求項1または2に記載の医薬組成物。
- 薬物が骨髄由来サプレッサー細胞を初期化する、請求項1~3の何れかに記載の医薬組成物。
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