JP7274748B2 - 核酸の安定化及び分離を行う方法 - Google Patents
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Description
本出願は、「METHODS OF PERFORMING NUCLEIC ACID STABILIZATION AND SEPARATION」と題した、2016年11月8日出願の、米国特許仮出願第62/419,340号の優先権を主張し、この内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
サンプルと溶解及び安定化試薬を含む混合物を形成するステップであって、該溶解及び安定化試薬は、サンプル中に存在する細胞を溶解し細胞から放出される核酸と複合体を形成可能なカチオン界面活性剤を含み、該溶解及び安定化試薬は、核酸分解を安定化させ防止するのに十分な量で提供される、ステップ;
前記混合物から前記複合体を分離するステップ;
前記分離した複合体を水溶液中に再懸濁し、それにより前記分離した複合体を含む水性懸濁液を得るステップ;並びに
前記複合体の解離に適した時間にわたり前記水性懸濁液を50℃を超える温度に加熱し、それによりそれから核酸を放出させるステップ
を含む。
(a)サンプルと溶解及び安定化試薬を含む混合物を形成するステップであって、該溶解及び安定化試薬は、サンプル中に存在する細胞を溶解し細胞から放出される核酸と複合体を形成可能なカチオン界面活性剤を含み、該溶解及び安定化試薬は核酸分解を安定化させ防止するのに十分な量で提供される、ステップ;
(b)前記混合物から前記複合体を分離するステップ;
(c)前記分離した複合体を水溶液中に再懸濁し、それにより前記分離した複合体を含む水性懸濁液を得るステップ;
(d)前記複合体の解離に適した時間にわたり前記水性懸濁液を50℃を超える温度に加熱し、それにより前記複合体から放出される核酸を含む核酸溶液を形成するステップ;並びに
(e)前記核酸溶液中に存在する核酸を検出するためのアッセイを行うステップであって、該アッセイは核酸抽出なしで行われる、ステップ
を含む。
本実施例は、単一反応ウエル内でのmRNAと共にそれに対応するgDNAを検出するが、インテロゲートする融解ピークによる増幅産物へのそれらの寄与を識別する上述の方法の実施能力を実証する。PAXgeneTM管からの1mLのサンプル/カチオン界面活性剤混合物を図2Aに示すパラメータを用いて処理した。2つの増幅アッセイ、すなわちRT-PCRアッセイ及びPCRのみのアッセイを別個のウエルで実施した。得られた増幅曲線を図2B及び図2Cに示す。図2D及び図2Eの対応する派生物の融解曲線におけるピークの位置は、NAS複合体から核酸を遊離させるための加熱の使用を含む上記方法が、mRNA及びその対応するgDNAの検出及び識別に好適であることを示している。
本実施例は、様々な保存温度及び保存時間の点でカチオン界面活性剤及びサンプル混合物の堅牢性を実証するために提供する。処理パラメータを図3に示す。図4のアッセイ結果は、本明細書に開示の方法例を使用して、白血球中のmRNAレベルを検出する能力を損なうことなく、混合物を3日を超える時間にわたり室温で保存し得ることを示している。さらに、図4に示す結果は、アッセイ性能に実質的に影響を及ぼすことなく、混合物を様々な時間間隔で凍結し得ることを実証している。
本実施例は、保存条件に関係なくNAS複合体が容易に沈降することを実証するために提供する。処理パラメータを図5に示し、アッセイ結果を図6に示す。
本実施例は、NAS複合体の崩壊が達成される温度Tdの調査のために提供する。処理パラメータを図7に示す。図8Aに示す結果はまた図8Bにもプロットした。図で観察されるように、80℃以下の処理温度Tdで、より多いリアルタイムRT-PCR及びリアルタイムPCRのサイクル回数の結果は、明瞭な温度依存性を示している。理論に限定されることを意図するものではないが、このアッセイ結果の温度依存性は、NAS複合体の崩壊(例えば、解離、破砕)の温度依存性に相当すると考えられる。
本実施例は、熱が誘導するNAS複合体崩壊時間に対する先行する方法の例示的実施のmRNA検出性能の依存性を実証するために提供する。処理パラメータを図9に示す。図10に示す結果は、洗浄したNAS複合体を1分を超える時間で十分に高い温度に供することが、mRNA検出を達成するために十分であることを示している。理論に限定されることを意図するものではないが、より短い熱処理時間でさえ、より高い処理温度で、及び/又は加熱時の迅速な温度上昇の速度の存在で達成可能であり得ると予想される。
本実施例は、NAS複合体崩壊を達成するために迅速ジュール加熱(「フラッシュ加熱」)に基づく熱処理の使用可能性を実証する。現在の実施例では、内部ジュール加熱を生成するための電極対を有する電気処理チャンバにNAS複合体懸濁液を導入した。電気処理チャンバは、容積20μL、厚さ200μmを有し、上部及び下部電極を備える。上述するように、酸化アルミニウム誘電体共形層を有する微細構造化アルミニウムから電極を形成した。最終洗浄ステップ後、イオン強度0.8 mMを有するPBバッファー中にNAS複合体を再懸濁した。電気励起は、持続時間50μs、振幅200 Vの一連の方形波ACパルスの形態で提供し、パルスを50 msの時間でチャンバに印加した。チャンバ内の温度が100℃を超え、加熱速度が1500℃/sを超えたと考えられる。処理パラメータを図11に示す。図12のアッセイ結果は、迅速ジュール加熱がNAS複合体崩壊効率の点で慣用の加熱と類似しているが、より速い時間スケールでNAS複合体の崩壊を達成することを示している。
本実施例は、リアルタイムRT-PCRによるmRNA標的の検出に対する追加の遠心洗浄サイクルの効果を実証する。処理パラメータを図13に示し、アッセイ結果を図14に示す。結果は、本例では、30回未満のPCRサイクル回数では、RT-PCRアッセイによるmRNA標的の検出に少なくとも2回の洗浄サイクルが必要であったことを実証している。
例えば、本発明は以下の実施形態を包含する:
[実施形態1]サンプルから核酸を放出させるようにサンプルを処理する方法であって、
サンプルと溶解及び安定化試薬を含む混合物を形成するステップであって、該溶解及び安定化試薬は、サンプル中に存在する細胞を溶解し細胞から放出される核酸と複合体を形成可能なカチオン界面活性剤を含み、該溶解及び安定化試薬は、核酸分解を安定化させ防止するのに十分な量で提供される、ステップ;
前記混合物から前記複合体を分離するステップ;
前記分離した複合体を水溶液中に再懸濁し、それにより前記分離した複合体を含む水性懸濁液を得るステップ;並びに
前記複合体の解離に適した時間にわたり前記水性懸濁液を50℃を超える温度に加熱し、それによりそれから核酸を放出させるステップ
を含む方法。
[実施形態2]前記水性懸濁液を少なくとも70℃超に加熱する、実施形態1に記載の方法。
[実施形態3]前記水性懸濁液を少なくとも80℃超に加熱する、実施形態1に記載の方法。
[実施形態4]前記水性懸濁液を少なくとも1分間加熱する、実施形態1~3のいずれかに記載の方法。
[実施形態5]前記水性懸濁液をそれに印加される電流を介したジュール加熱によって加熱する、実施形態1~4のいずれかに記載の方法。
[実施形態6]前記サンプルが血液含有サンプルである、実施形態1~5のいずれかに記載の方法。
[実施形態7]前記サンプルが全血サンプルである、実施形態1~5のいずれかに記載の方法。
[実施形態8]前記全血サンプルを、前記溶解及び安定化試薬を含む採血容器に直接サンプリングする、実施形態7に記載の方法。
[実施形態9]前記採血容器がPAXgene(TM)管である、実施形態8に記載の方法。
[実施形態10]前記混合物を遠心し前記複合体を沈殿させ、それにより沈殿した複合体を得ること;
前記沈殿した複合体を1回以上遠心して洗浄すること
により、前記複合体を遠心によって分離する、実施形態1~9のいずれかに記載の方法。
[実施形態11]前記複合体をろ過により分離する、実施形態1~9のいずれかに記載の方法。
[実施形態12]前記混合物を遠心し前記複合体を沈殿させ、それにより沈殿した複合体を得ること;
前記沈殿した複合体を2回以上遠心して洗浄すること
により、前記複合体を遠心によって分離する、実施形態7~9のいずれかに記載の方法。
[実施形態13]サンプルに対して分子アッセイを行い、サンプルから放出される核酸を検出する方法であって、
(a)サンプルと溶解及び安定化試薬を含む混合物を形成するステップであって、該溶解及び安定化試薬は、サンプル中に存在する細胞を溶解し細胞から放出される核酸と複合体を形成可能なカチオン界面活性剤を含み、該溶解及び安定化試薬は核酸分解を安定化させ防止するのに十分な量で提供される、ステップ;
(b)前記混合物から前記複合体を分離するステップ;
(c)前記分離した複合体を水溶液中に再懸濁し、それにより前記分離した複合体を含む水性懸濁液を得るステップ;
(d)前記複合体の解離に適した時間にわたり前記水性懸濁液を50℃を超える温度に加熱し、それにより前記複合体から放出される核酸を含む核酸溶液を形成するステップ;並びに
(e)前記核酸溶液中に存在する核酸を検出するためのアッセイを行うステップであって、該アッセイは核酸抽出なしで行われる、ステップ
を含む方法。
[実施形態14]前記アッセイが、前記核酸溶液の少なくとも一部を、バイオマーカーを検出するように構成されたプライマーセットを含むアッセイ試薬と接触させることにより行われるバイオマーカーアッセイである、実施形態13に記載の方法。
[実施形態15]前記バイオマーカーがメッセンジャーRNAバイオマーカーである、実施形態14に記載の方法。
[実施形態16]前記メッセンジャーRNAバイオマーカーが、イントロンの少なくとも一部を含むゲノム領域と関連している、実施形態15に記載の方法。
[実施形態17]前記バイオマーカーが、感染に対する宿主の応答と関連している、実施形態14に記載の方法。
[実施形態18]前記アッセイ試薬が第1のアッセイ試薬であり、前記プライマーセットが第1のプライマーセットであり、前記方法がさらに:
前記核酸溶液の少なくとも一部を、ハウスキーピング遺伝子と関連するハウスキーピングメッセンジャーRNAを検出するように構成された第2のプライマーセットを含む第2のアッセイ試薬と接触させることによりハウスキーピング遺伝子アッセイを行うステップ
を含み、
前記バイオマーカーアッセイが、前記核酸溶液中に存在するバイオマーカーの量を定量するバイオマーカー逆転写アッセイ結果を生成するものであり、前記ハウスキーピング遺伝子アッセイが、前記核酸溶液中に存在するハウスキーピングメッセンジャーRNAの量を定量するハウスキーピングアッセイ結果を生成する、実施形態17に記載の方法。
[実施形態19]バイオマーカー逆転写アッセイ結果とハウスキーピング遺伝子逆転写アッセイ結果とを比較する比較測定値をさらに計算する、実施形態18に記載の方法。
[実施形態20]異なる時点で得られたサンプルに対してステップ(a)~(e)又はさらに多くの回数を行うこと;及び
前記異なる時点と関連する比較測定値を処理して、時間依存的宿主応答を推測することをさらに含む、実施形態19に記載の方法。
[実施形態21]前記プライマーセットが第1のプライマーセットであり、前記アッセイ試薬が選択した遺伝子と関連するゲノムDNAを検出するように構成された第2のプライマーセットをさらに含み、前記アッセイが、前記核酸溶液中に存在するバイオマーカーの量を定量するバイオマーカー逆転写アッセイ結果、及び前記核酸溶液中に存在するゲノムDNAの量を定量するゲノムDNAアッセイ結果を生成し、第1のプライマーセット及び第2のプライマーセットにより増幅される産物にそれぞれ関連したシグナルは融解曲線分析によって識別される、実施形態17に記載の方法。
[実施形態22]前記選択した遺伝子の少なくとも一部がイントロンの少なくとも一部を含む、実施形態21に記載の方法。
[実施形態23]バイオマーカー逆転写アッセイ結果とゲノムDNAアッセイ結果とを比較する比較測定値をさらに計算する、実施形態21に記載の方法。
[実施形態24]異なる時点で得られたサンプルに対してステップ(a)~(e)又はさらに多くの回数を行うこと;及び
前記異なる時点と関連する比較測定値を処理して、時間依存的宿主応答を推測することをさらに含む、実施形態21に記載の方法。
[実施形態25]ステップ(b)~(e)を自動機器の制御下で使い捨てカートリッジ内で行う、実施形態13~24のいずれかに記載の方法。
[実施形態26]前記水性懸濁液を少なくとも70℃超に加熱する、実施形態13~25のいずれかに記載の方法。
[実施形態27]前記水性懸濁液を少なくとも80℃超に加熱する、実施形態13~25のいずれかに記載の方法。
[実施形態28]前記水性懸濁液を少なくとも1分間加熱する、実施形態13~27のいずれかに記載の方法。
[実施形態29]前記水性懸濁液をそれに印加される電流を介したジュール加熱によって加熱する、実施形態13~28のいずれかに記載の方法。
[実施形態30]前記サンプルが血液含有サンプルである、実施形態13~29のいずれかに記載の方法。
[実施形態31]前記サンプルが全血サンプルである、実施形態13~29のいずれかに記載の方法。
[実施形態32]前記全血サンプルを、前記溶解及び安定化試薬を含む採血容器に直接サンプリングする、実施形態31に記載の方法。
[実施形態33]前記採血容器がPAXgene(TM)管である、実施形態32に記載の方法。
[実施形態34]前記混合物を遠心し前記複合体を沈殿させ、それにより沈殿した複合体を得ること;
前記沈殿した複合体を1回以上遠心して洗浄すること
により、前記複合体を遠心によって分離する、実施形態13~33のいずれかに記載の方法。
[実施形態35]前記複合体をろ過により分離する、実施形態13~33のいずれかに記載の方法。
[実施形態36]前記混合物を遠心し前記複合体を沈殿させ、それにより沈殿した複合体を得ること;
前記沈殿した複合体を2回以上遠心して洗浄すること
により、前記複合体を遠心によって分離する、実施形態31~33のいずれかに記載の方法。
Claims (34)
- サンプルから核酸を放出させるようにサンプルを処理する方法であって、
サンプルと溶解及び安定化試薬を含む混合物を形成するステップであって、該溶解及び安定化試薬は、サンプル中に存在する細胞を溶解し細胞から放出される核酸と複合体を形成可能なカチオン界面活性剤を含み、該溶解及び安定化試薬は、核酸分解を安定化させ防止するのに十分な量で提供される、ステップ;
前記混合物から前記複合体を分離するステップ;
前記分離した複合体を水溶液中に再懸濁し、それにより前記分離した複合体を含む水性懸濁液を得るステップ;並びに
前記複合体の解離に適した時間にわたり前記水性懸濁液を少なくとも70℃超の温度に加熱し、それによりそれから核酸を放出させるステップ
を含む方法。 - 前記水性懸濁液を少なくとも80℃超に加熱する、請求項1に記載の方法。
- 前記水性懸濁液を少なくとも1分間加熱する、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記水性懸濁液をそれに印加される電流を介したジュール加熱によって加熱する、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記サンプルが血液含有サンプルである、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記サンプルが全血サンプルである、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記全血サンプルを、前記溶解及び安定化試薬を含む採血容器に直接サンプリングする、請求項6に記載の方法。
- 前記採血容器がPAXgene(TM)管である、請求項7に記載の方法。
- 前記混合物を遠心し前記複合体を沈殿させ、それにより沈殿した複合体を得ること;
前記沈殿した複合体を1回以上遠心して洗浄すること
により、前記複合体を遠心によって分離する、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。 - 前記複合体をろ過により分離する、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記混合物を遠心し前記複合体を沈殿させ、それにより沈殿した複合体を得ること;
前記沈殿した複合体を2回以上遠心して洗浄すること
により、前記複合体を遠心によって分離する、請求項6~8のいずれか1項に記載の方法。 - サンプルに対して分子アッセイを行い、サンプルから放出される核酸を検出する方法であって、
(a)サンプルと溶解及び安定化試薬を含む混合物を形成するステップであって、該溶解及び安定化試薬は、サンプル中に存在する細胞を溶解し細胞から放出される核酸と複合体を形成可能なカチオン界面活性剤を含み、該溶解及び安定化試薬は核酸分解を安定化させ防止するのに十分な量で提供される、ステップ;
(b)前記混合物から前記複合体を分離するステップ;
(c)前記分離した複合体を水溶液中に再懸濁し、それにより前記分離した複合体を含む水性懸濁液を得るステップ;
(d)前記複合体の解離に適した時間にわたり前記水性懸濁液を少なくとも70℃超の温度に加熱し、それにより前記複合体から放出される核酸を含む核酸溶液を形成するステップ;並びに
(e)前記核酸溶液中に存在する核酸を検出するためのアッセイを行うステップであって、該アッセイは核酸抽出なしで行われる、ステップ
を含む方法。 - 前記アッセイが、前記核酸溶液の少なくとも一部を、バイオマーカーを検出するように構成されたプライマーセットを含むアッセイ試薬と接触させることにより行われるバイオマーカーアッセイである、請求項12に記載の方法。
- 前記バイオマーカーがメッセンジャーRNAバイオマーカーである、請求項13に記載の方法。
- 前記メッセンジャーRNAバイオマーカーが、イントロンの少なくとも一部を含むゲノム領域と関連している、請求項14に記載の方法。
- 前記バイオマーカーが、感染に対する宿主の応答と関連している、請求項13に記載の方法。
- 前記アッセイ試薬が第1のアッセイ試薬であり、前記プライマーセットが第1のプライマーセットであり、前記方法がさらに:
前記核酸溶液の少なくとも一部を、ハウスキーピング遺伝子と関連するハウスキーピングメッセンジャーRNAを検出するように構成された第2のプライマーセットを含む第2のアッセイ試薬と接触させることによりハウスキーピング遺伝子アッセイを行うステップ
を含み、
前記バイオマーカーアッセイが、前記核酸溶液中に存在するバイオマーカーの量を定量するバイオマーカー逆転写アッセイ結果を生成するものであり、前記ハウスキーピング遺伝子アッセイが、前記核酸溶液中に存在するハウスキーピングメッセンジャーRNAの量を定量するハウスキーピングアッセイ結果を生成する、請求項13に記載の方法。 - バイオマーカー逆転写アッセイ結果とハウスキーピングアッセイ結果とを比較する比較測定値をさらに計算する、請求項17に記載の方法。
- 異なる時点で得られたサンプルに対してステップ(a)~(e)を1回又はさらに多くの回数行うこと;及び
前記異なる時点と関連する比較測定値を処理して、時間依存的宿主応答を推測すること
をさらに含む、請求項18に記載の方法。 - 前記プライマーセットが第1のプライマーセットであり、前記アッセイ試薬が選択した遺伝子と関連するゲノムDNAを検出するように構成された第2のプライマーセットをさらに含み、前記アッセイが、前記核酸溶液中に存在するバイオマーカーの量を定量するバイオマーカー逆転写アッセイ結果、及び前記核酸溶液中に存在するゲノムDNAの量を定量するゲノムDNAアッセイ結果を生成し、第1のプライマーセット及び第2のプライマーセットにより増幅される産物にそれぞれ関連したシグナルは融解曲線分析によって識別される、請求項13に記載の方法。
- 前記選択した遺伝子の少なくとも一部がイントロンの少なくとも一部を含む、請求項20に記載の方法。
- バイオマーカー逆転写アッセイ結果とゲノムDNAアッセイ結果とを比較する比較測定値をさらに計算する、請求項20に記載の方法。
- 異なる時点で得られたサンプルに対してステップ(a)~(e)を1回又はさらに多くの回数行うこと;及び
前記異なる時点と関連する比較測定値を処理して、時間依存的宿主応答を推測すること
をさらに含む、請求項20に記載の方法。 - ステップ(b)~(e)を自動機器の制御下で使い捨てカートリッジ内で行う、請求項12~23のいずれか1項に記載の方法。
- 前記水性懸濁液を少なくとも80℃超に加熱する、請求項12~24のいずれか1項に記載の方法。
- 前記水性懸濁液を少なくとも1分間加熱する、請求項12~25のいずれか1項に記載の方法。
- 前記水性懸濁液をそれに印加される電流を介したジュール加熱によって加熱する、請求項12~26のいずれか1項に記載の方法。
- 前記サンプルが血液含有サンプルである、請求項12~27のいずれか1項に記載の方法。
- 前記サンプルが全血サンプルである、請求項12~27のいずれか1項に記載の方法。
- 前記全血サンプルを、前記溶解及び安定化試薬を含む採血容器に直接サンプリングする、請求項29に記載の方法。
- 前記採血容器がPAXgene(TM)管である、請求項30に記載の方法。
- 前記混合物を遠心し前記複合体を沈殿させ、それにより沈殿した複合体を得ること;
前記沈殿した複合体を1回以上遠心して洗浄すること
により、前記複合体を遠心によって分離する、請求項12~31のいずれか1項に記載の方法。 - 前記複合体をろ過により分離する、請求項12~31のいずれか1項に記載の方法。
- 前記混合物を遠心し前記複合体を沈殿させ、それにより沈殿した複合体を得ること;
前記沈殿した複合体を2回以上遠心して洗浄すること
により、前記複合体を遠心によって分離する、請求項12~31のいずれか1項に記載の方法。
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