JP6212488B2 - 電気的な試料調製のための方法及びデバイス - Google Patents
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Description
本出願は、「電気的な試料調製のための方法及びデバイス(METHODS AND DEVICES FOR ELECTRICAL SAMPLE PREPARATION)」と題した、2011年7月25日出願の米国仮特許出願第61/511,201号と、「電気的な試料調製のための方法及びデバイス(METHODS AND DEVICES FOR ELECTRICAL SAMPLE PREPARATION)」と題した、2012年1月16日出願の米国仮特許出願第61/586,906号の優先権を主張するものであり、これらの内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれている。
[実施例1]
酵素の不活性化
本実施例において説明する実験は、選択された例示酵素の不活性化(完全又は部分的)を示すことによって、タンパク質の構造及び機能を変化させるデバイスの静電容量に対する電気及び熱パラメータの影響を示すことを意図している。実験は、タンパク質コンフォメーションの変更を伴う、本明細書において開示されたデバイスの電気的処理機能及び能力の一態様を示す。
大腸菌の電気溶解
本実施例において説明する実験は、大腸菌細胞を溶解するデバイスの有効性に対する電気パラメータの影響を示すことを意図している。アンピシリン耐性遺伝子及びβ-ガラクトシダーゼ遺伝子を含むpUC19プラスミドで形質転換されたNEB 5-α形質転換受容性大腸菌細胞を、100μg/mLのアンピシリン、60μg/mLのX-gal及び0.1mMのイソプロピルチオ-β-D-ガラクトシダーゼ(IPTG)を添加したLB寒天プレート上で生育させた。大腸菌の単一の青色コロニーを、100μg/mLのアンピシリンを添加したLB液体培地において37℃で一晩培養した。細胞を7000rpmで5分間遠心分離した。細胞ペレットを2回洗浄し、0.5〜1×109CFU/mLの濃度で0.1〜0.4mMリン酸緩衝液(pH7.4)に再懸濁させた。
0.1mMリン酸緩衝液(pH7.4)中5×108CFU/mLの細菌懸濁液を5μL/10sで狭いチャネルに通し、異なる持続時間及び振幅を有する10kHzのパルス列を懸濁液に印加した。二つの異なる任意のパラメータセットである(t1、V1)と(t2、V2)の持続時間tと振幅Vを、いずれの場合もほぼ等しい電力を確実にチャネルに供給するように、t1/t2=(V2/V1)2によって関連付けた。さらに、0.1mMの低いイオン強度を選択することに加えて、生体温度を大きく上回るほど液体を加熱しない程度に持続時間を短く選択した。チャネルが実現した平均温度Tmを推定し、異なる検査パラメータでの電流の包絡線を示す図14(a)の凡例にそれを記録した。
0.1又は0.4mMリン酸緩衝液(pH7.4)中1×109CFU/mLの細菌懸濁液を5μL/10sで狭いチャネルに通し、異なる持続時間を有する10kHz及び155Vのパルス列を懸濁液に印加した。電流の包絡線を図15(a)に示す。
生体分子に対する電気的処理の作用を示すために、pUC19プラスミドベクターによって表される内因性酵素β-ガラクトシダーゼの活性を測定した。β-ガラクトシダーゼの酵素活性を検出するために、直前の実施例の細胞ライセートを7000rpmで5分間遠心分離し、50μLの上清を、0.1mMリン酸緩衝液(pH7.4)中4mg/mLの等量の2-ニトロフェニルβ-D-ガラクトピラノシド(N-1127、シグマ(Sigma))と混合した。色の発現を420nmの吸光度で分光光度計によって測定した。GB溶解の場合の活性に対して正規化した、測定された酵素の残存活性を図15(e)に示す。また、tc近くとそれを超えるパルス列持続時間の増加は、酵素の不活性化に対して有意な影響を及ぼす。この発見は、電気溶解によって高分子のコンフォメーションが修正されることを示す。
電気溶解によって放出される異なるタイプの核酸のスペクトルを評価するために、セクション2.2の実施例における細胞ライセートを10000rpmで5分間遠心分離し、上清中の核酸を、0.5×TBE緩衝液及び0.5μg/mL臭化エチジウム(EtBr)中の0.5%アガロースゲルで、150ボルトで45分間のゲル電気泳動によって分離した。電気溶解によるゲノムDNA、プラスミドDNA及び全RNAの放出を図15(f)に示した。
本実施例は、PCRの阻害因子を低減して、追加の試薬又は処理を必要とせずにダイレクトPCR処理を可能にすることに関する、デバイスの電気的処理作用の有効性を示す。細菌に特異的な16S rRNA遺伝子(rDNA)を、Bacteria Identification Kit(バイオチェーン・インスティテュート・インコーポレイテッド(BioChain Institute, Inc.))を使用して、PCRによって増幅させた。実験は、0.1及び0.4mMリン酸緩衝液(pH7.4)中に再懸濁させたNEB5-α形質転換受容性大腸菌細胞を溶解することによって実施した。
本実施例は、下流での用途のための、完全性が保存されたプラスミドDNAを放出するデバイスの能力を示す。
肺炎レンサ球菌の電気溶解
本実施例で説明する実験は、肺炎レンサ球菌細胞を溶解するデバイスの有効性に対する電気パラメータの影響を示すことを意図している。ATCC 6303株肺炎レンサ球菌細胞を、5%のヒツジ血液を含むトリプチケースソイ寒天で生育させ、肺炎レンサ球菌の単一のコロニーをTryptic Soy Brothにおいて37℃で一晩培養した。溶解実験では、細胞を10000rpmで5分間遠心分離した。細胞ペレットを2回洗浄し、1×109CFU/mLの濃度で0.2〜0.4mMリン酸緩衝液(pH7.4)に再懸濁させた。
0.2及び0.4mMリン酸緩衝液(pH7.4)中1×109CFU/mLの濃度の細菌懸濁液を10μL/10sで幅広のチャネルに通し、異なる持続時間及び振幅を有する20kHzのパルス列を懸濁液に印加した。二つの異なる任意のパラメータセットである(t1、V1)と(t2、V2)の持続時間と振幅を、いずれの場合もほぼ等しい電力を確実にチャネルに供給するように、t1/t2=(V2/V1)2によって関連付けた。実験は、五つの異なる値の振幅について繰り返した。二つの振幅範囲の電流の包絡線を図17(a)に示す。両方のイオン強度において、パルス列持続時間は対応するtcよりも長い。
電気溶解によって放出される異なるタイプの核酸のスペクトルを評価するために、細胞ライセートを10000rpmで5分間遠心分離し、上清中の核酸を、0.5×TBE緩衝液及び0.5μg/mL臭化エチジウム(EtBr)中の0.5%アガロースゲルで、150ボルトで45分間のゲル電気泳動によって分離した。電気溶解によるゲノムDNA及び全RNAの放出が図17(d)(左)において観察された。ガラスビーズ溶解と比較すると、電気溶解によって放出されたゲノムDNAは、主として、低い蛍光強度を有するスローな移動バンドとして観察された。大腸菌の場合と類似して、この観察は、ゲノムDNAのコンフォメーションが緩んだ状態に変化したことが原因だった。
本実施例は、PCRの阻害因子を低減して、追加の試薬を必要とせずにダイレクトPCR処理を可能にすることに関する、デバイスのライセート処理作用の有効性を示す。細菌に特異的な16S rRNA遺伝子(rDNA)を、Bacteria Identification Kit(バイオチェーン・インスティテュート・インコーポレイテッド(BioChain Institute, Inc.))を使用して、PCRによって増幅させた。実験は、(0.4mM、240V)に類似するパラメータセットで肺炎レンサ球菌細胞を溶解することによって実施したものであり、このケースの対応する電流を図17(a)に示してある。
本研究は、電気溶解中に高分子の完全性を保存することに関して、SEOAを電極材料として使用することの利点を示す。0.4mMリン酸緩衝液(pH7.4)中に懸濁した肺炎レンサ球菌細胞を、一方のチャネルがSEOA2電極を備え、他方のチャネルが銅電極を備える形状的に類似した幅広のチャネル内で溶解した。パルス振幅及び周波数はそれぞれ200V及び20kHzであった。これらのケースに対応する電流の包絡線を図18(a)に示す。
出芽酵母の電気溶解
本実施例で説明する実験は、出芽酵母の真菌細胞を溶解するデバイスの有効性に対する電気パラメータの影響を示すことを意図している。細胞を、5%のヒツジ血液を含むトリプチケースソイ寒天で生育させ、出芽酵母の単一のコロニーをTryptic Soy Brothにおいて37℃で一晩培養した。溶解実験では、細胞を10000rpmで5分間遠心分離した。細胞ペレットを2回洗浄し、2.5×107CFU/mLの濃度で0.4mMリン酸緩衝液(pH7.4)に再懸濁させた。
rRNAの逆転写(RT)-PCR用のアッセイしやすい試料を調製するデバイスの機能
本実施例は、ライセートをrRNAの一部について酵素の転写にかけ、次いで、得られたcDNAをPCR増幅することによってデバイス内で調製されたライセートのアッセイ容易性を示す。異なる高さ、h=100μm、h=200μm、及びh=400μmを有する三つの幅広のチャネルを使用して検査を実施した。これらのチャネル内で溶解した細胞懸濁液のイオン強度は、それぞれ0.4、0.8及び1.6mMであり、これにより、所与の印加電圧において初期イオン電流がチャネル内で確実にほぼ類似するようにした。さらに、液体を三つのチャネル内に、それぞれ5μL/10s(h=100μmの場合)、10μL/10s(h=200mMの場合)及び20μL/10s(h=400μmの場合)で、各細胞が10kHz及び160Vのパルス列を2回受けるように注入した。三つのケースについての電流の包絡線を図20(a)に示す。
[1] マイクロ流体デバイス内の液体を電気的に処理して、少なくとも一つの高分子を前記液体内の少なくとも一つの細胞から放出させる方法であって、
前記マイクロ流体デバイスが、
上部チャネル表面、下部チャネル表面、側壁、及び1ミリメートル未満のサイズの厚さを有する流体チャネルと、
前記上部チャネル表面上の上部電極と、
前記下部チャネル表面上の下部電極とを備え、
前記チャネルが、前記電極に電圧パルスが印加されている間、前記液体の急速加熱をサポートするように構成されており、
前記方法が、
前記液体を前記チャネル内に流すステップと、
一連の双極性電圧パルスを前記上部電極と前記下部電極の間に印加するステップであって、前記電圧パルスの振幅、パルス幅、及び持続時間が、前記液体を急速加熱し、前記液体内の前記細胞を不可逆的に電気穿孔し、それによって前記高分子を前記細胞から放出させるのに十分なものである、ステップと
を含む、方法。
[2] 前記電圧パルスが、少なくともおよそ毎秒250度の速度で前記液体のジュール発熱が生じるように印加される、1に記載の方法。
[3] 前記電圧パルスが印加されている間、前記液体が、前記チャネルからの熱拡散の時間尺度よりも速く加熱される、1又は2に記載の方法。
[4] 前記チャネル表面の熱特性が、印加される電圧パルスに応答して、前記液体のジュール発熱が少なくともおよそ毎秒2000度の速度で生じるように選択される、1から3のいずれか一項に記載の方法。
[5] 前記液体を少なくとも所定の温度に加熱するための効果的な振幅及び持続時間で前記電圧パルスが供給される、1から4のいずれか一項に記載の方法。
[6] 前記液体の温度が相転移温度の値にほぼ等しい値まで増加するような効果的な振幅及び持続時間で前記電圧パルスが供給される、1から5のいずれか一項に記載の方法。
[7] 前記電圧パルスが印加される規定の持続時間の間、前記液体の温度が相転移温度のものとほぼ等しくなるような効果的な振幅及び持続時間で前記電圧パルスが供給される、1から6のいずれか一項に記載の方法。
[8] 前記上部電極と前記下部電極の間を流れる電流を監視するステップと、前記電流の変化に応答して前記電圧パルスの前記振幅及び前記持続時間のうち1以上を制御するステップとをさらに含む、1から7のいずれか一項に記載の方法。
[9] 前記電流の最初のピークを前記液体の相転移の開始として識別するステップと、前記相転移の開始後、規定の持続時間の間、前記電圧パルスを印加し続けるステップとをさらに含む、8に記載の方法。
[10] 前記電流の前記最初のピーク後、電流の減少を検出するステップと、その後のある期間の間、前記電圧パルスを印加し続けるステップとをさらに含む、9に記載の方法。
[11] 前記電圧パルスを印加している間は前記チャネル内の圧力が増加するように、前記電圧パルスを印加している間、チャネル容積を密閉するステップをさらに含む、1から10のいずれか一項に記載の方法。
[12] 前記電圧パルスを印加している間、前記チャネル内の前記液体の圧力を調整するステップをさらに含む、11に記載の方法。
[13] 前記マイクロ流体デバイスが受動圧力調整デバイスを備え、前記液体の前記圧力を調整するステップが、前記液体の前記圧力を受動的に調整するステップを含む、12に記載の方法。
[14] 前記液体の前記圧力を調整するステップが、前記液体を過熱しながら前記チャネル内の圧力を維持するステップを含む、12に記載の方法。
[15] 前記液体のイオン強度を低下させるように前記液体を処理するステップをさらに含む、1から14のいずれか一項に記載の方法。
[16] 前記液体のイオン強度がおよそ0.1mM〜100mMである、1から15のいずれか一項に記載の方法。
[17] 前記液体のイオン強度がおよそ0.1mM〜10mMである、1から15のいずれか一項に記載の方法。
[18] 前記液体のイオン強度がおよそ0.2mM〜2mMである、1から15のいずれか一項に記載の方法。
[19] 前記マイクロ流体デバイスが、
前記チャネルの第1の側と流れ連通する第1のポートと、
前記チャネルの第2の側と流れ連通する第2のポートと、
前記チャネル内で支持されるフィルター、ここで前記フィルターは前記第1のポートと前記第2のポートの間を流れる液体が前記フィルターを通過するように位置し、かつ、前記フィルタの少なくとも一部分が前記上部電極と前記下部電極の間に位置する、前記フィルタとを備え、
液体を前記チャネル内に流すステップが、前記電圧パルスの印加の前に、前記液体内の細胞が前記フィルタ上に集中させられるように、前記液体を前記第1のポートから前記第2のポートに流すステップを含む、1から18のいずれか一項に記載の方法。
[20] 前記マイクロ流体デバイスが、
前記チャネルの第1の側と流れ連通する第1のポートと、
前記チャネルの第2の側と流れ連通する第2のポートと、
前記チャネル内で支持されるフィルター、ここで前記フィルターは前記第1のポートと前記第2のポートの間を流れる液体が前記フィルターを通過するように位置し、かつ、前記フィルタの少なくとも一部分が前記上部電極と前記下部電極の間に位置する、前記フィルタとを備え、
前記方法が、
前記液体を前記チャネル内に流すステップの前に、前記試料内の細胞が前記フィルタ上に保持されるように、前記第1のポートから前記第2のポートに試料を流すステップをさらに含み、
前記細胞を前記フィルタ上に保持した後に、前記液体が前記チャネル内に流される、1から18のいずれか一項に記載の方法。
[21] 前記液体が、前記細胞の効果的な電気的処理に適したイオン強度を有する、20に記載の方法。
[22] 前記液体が、前記試料よりも低いイオン強度を有する、20又は21に記載の方法。
[23] 前記液体を前記チャネル内に流すステップの前に、混合イオン交換樹脂内を通過するように前記液体を流すステップをさらに含む、1から22のいずれか一項に記載の方法。
[24] 前記高分子が2本鎖DNAを含む、1から23のいずれか一項に記載の方法。
[25] 前記高分子が、リボソームRNAとリボソームタンパク質の複合体を含み、リボソームRNA及び前記リボソームタンパク質が変性させられるような振幅及び持続時間で前記電圧パルスが供給される、1から23のいずれか一項に記載の方法。
[26] 前記高分子が酵素を含み、前記酵素の活性を低下させるための振幅及び持続時間で前記電圧パルスが供給される、1から23のいずれか一項に記載の方法。
[27] 前記酵素がヌクレアーゼである、26に記載の方法。
[28] 前記高分子がPCR阻害物質を含み、前記PCR阻害物質の阻害作用を低減又は除去するための振幅及び持続時間で前記電圧パルスが供給される、1から23のいずれか一項に記載の方法。
[29] 前記高分子が核酸を含み、前記方法が、後に核酸の抽出又は精製工程を実施することなく、PCRを実施して前記核酸の配列を増幅するステップをさらに含む、1から23のいずれか一項に記載の方法。
[30] 前記電圧パルスの大きさが、およそ200V/cm〜50kV/cmである、1から29のいずれか一項に記載の方法。
[31] 前記電圧パルスの大きさが、およそ2kV/cm〜30kV/cmである、1から29のいずれか一項に記載の方法。
[32] 前記電圧パルスのパルス幅が、およそ1マイクロ秒〜10ミリ秒である、1から31のいずれか一項に記載の方法。
[33] 前記電圧パルスのパルス幅が、およそ1ミリ秒未満である、32に記載の方法。
[34] 前記電圧パルスのパルス幅が、およそ10マイクロ秒を超える、32に記載の方法。
[35] 液体を処理して、少なくとも一つの高分子を前記液体内の少なくとも一つの細胞から放出させるマイクロ流体デバイスであって、
上部チャネル表面、下部チャネル表面、側壁、及びミクロンサイズの厚さを有する流体チャネルと、
前記チャネルの第1の側と流れ連通する第1のポートと、
前記チャネルの第2の側と流れ連通する第2のポートと、
前記上部チャネル表面上に設けられる上部電極と、
前記下部チャネル表面上に設けられる下部電極と、
前記上部電極と前記下部電極の間に双極性電圧パルスを印加するように構成されている電源であって、前記液体が前記チャネル内に供給されているときに、前記電圧パルスの振幅及びパルス幅が、前記細胞を不可逆的に電気穿孔するのに十分である、電源とを備え、 前記チャネルの熱特性及び寸法が、前記電極に電圧パルスが印加されている間、前記液体の急速加熱を誘導するように選択される、マイクロ流体デバイス。
[36] 前記上部チャネル表面及び前記下部チャネル表面の熱特性が、前記電圧パルスが印加されている間、少なくともおよそ毎秒250度の速度で前記液体中にジュール発熱が生じるように選択される、35に記載のマイクロ流体デバイス。
[37] 前記電圧パルスが存在しない場合、前記チャネルの冷却時間が1秒未満の時間尺度であるように、前記チャネル表面の熱特性がさらに選択される、35に記載のマイクロ流体デバイス。
[38] 前記上部電極及び前記下部電極の1以上が金属電極である、35から37のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
[39] 前記上部電極及び前記下部電極の1以上が、誘電体層で被覆されることによって前記チャネル内の液体に電気的に直接連絡していないブロッキング電極である、35から37のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
[40] 前記ブロッキング電極が微細構造の表面を有する、39に記載のマイクロ流体デバイス。
[41] 前記微細構造の表面が、少なくともおよそ100の表面積増大係数を有する、40に記載のマイクロ流体デバイス。
[42] 前記ブロッキング電極に関連する静電容量が、1平方センチメートル当たり約0.5マイクロファラッドと、1平方センチメートル当たり約200マイクロファラッドとの間になるように、前記誘電体層の厚さ及び前記誘電体層の誘電率が選択される、41に記載のマイクロ流体デバイス。
[43] 前記ブロッキング電極に関連する静電容量が、1平方センチメートル当たり約1マイクロファラッドと、1平方センチメートル当たり約100マイクロファラッドとの間になるように、前記誘電体層の厚さ及び前記誘電体層の誘電率が選択される、41に記載のマイクロ流体デバイス。
[44] およそ10mM未満のイオン強度を有する液体で前記チャネルが満たされているとき、前記上部電極及び前記下部電極の帯電時間が1マイクロ秒を超えるように前記誘電体層の厚さ及び前記誘電体層の誘電率が選択される、41に記載のマイクロ流体デバイス。
[45] 前記ブロッキング電極が、ナノメートルサイズの厚さを有する酸化アルミニウム層で被覆された微細構造のアルミニウムを含む、39から44のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
[46] 前記酸化アルミニウム層で被覆された前記微細構造のアルミニウムが、陽極酸化処理によって形成される、45に記載のマイクロ流体デバイス。
[47] 前記ブロッキング電極が、ナノメートルサイズの厚さを有する二酸化ケイ素の層で被覆された多孔質シリコンを含む、39から44のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
[48] 前記チャネル内で支持されるフィルタをさらに含み、前記フィルタが、前記第1のポートと前記第2のポートの間を流れる流体が前記フィルタを通過するように位置する、35から47のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
[49] 前記フィルタの少なくとも一部分が、前記上部電極と前記下部電極の間に位置する、48に記載のマイクロ流体デバイス。
[50] 前記フィルタが前記チャネル内で複数のビーズによってサポートされ、前記ビーズが、前記チャネル内の前記フィルタのいずれかの側に設けられている、48又は49に記載のマイクロ流体デバイス。
[51] 前記フィルタが、前記チャネル内で前記フィルタの第1の側に設けられた第1の支持構造と、前記フィルタの第2の側に設けられた第2の支持構造とによって、前記チャネル内で支持され、前記第1の支持構造及び前記第2の支持構造が、前記フィルタ内を通る流体の流れを可能にする、48又は49に記載のマイクロ流体デバイス。
[52] 前記フィルタがメンブレンフィルタである、48又は51に記載のマイクロ流体デバイス。
[53] 前記チャネルと流れ連通する、前記チャネル内の圧力を制御するための圧力調整デバイスをさらに備える、35から52のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
[54] 前記電源が、およそ200V/cm〜50kV/cmの大きさを有する電圧パルスを供給するように構成されている、35から52のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
[55] 前記電源が、およそ2kV/cm〜30kV/cmの大きさを有する電圧パルスを供給するように構成されている、35から52のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
[56] 前記電源が、およそ1マイクロ秒〜10ミリ秒のパルス幅を有する電圧パルスを供給するように構成されている、35から55のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
[57] 前記電源が、およそ1ミリ秒未満のパルス幅を有する電圧パルスを供給するように構成されている、56に記載のマイクロ流体デバイス。
[58] 前記電源が、およそ10マイクロ秒を超えるパルス幅を有する電圧パルスを供給するように構成されている、56に記載のマイクロ流体デバイス。
Claims (57)
- マイクロ流体デバイス内の液体を電気的に処理して、少なくとも一つの高分子を前記液体内の少なくとも一つの微生物細胞から放出させる方法であって、
前記マイクロ流体デバイスが、
上部チャネル表面、下部チャネル表面、側壁、及び1ミリメートル未満のサイズの厚さを有する流体チャネルと、
前記上部チャネル表面上の上部電極と、
前記下部チャネル表面上の下部電極とを備え、
前記方法が、
前記液体を前記チャネル内に流すステップと、
一連の双極性電圧パルスを前記上部電極と前記下部電極の間に印加するステップであって、それにより流体チャネルの厚さ全体にわたって生じる電界が2kV/cmよりも高く30kV/cm未満であり、及び該液体が少なくとも毎秒250度の速度で加熱され、
前記電圧パルスの振幅、パルス幅、及び持続時間が、前記液体内の少なくとも1つの微生物細胞を電気的に溶解させ、それによって前記高分子を前記細胞から放出させるのに十分な上昇した温度へと該液体を加熱するよう制御されるものである、ステップと
を含む、方法。 - 前記電圧パルスが存在しない場合、前記チャネルの冷却時間が1秒未満の時間尺度であるように前記チャネル表面の熱特性が選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記上昇した温度がおよそ80℃〜200℃である、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記チャネル表面の熱特性が、印加される電圧パルスに応答して、前記液体のジュール発熱が少なくともおよそ毎秒2000度の速度で生じるように選択される、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記液体を少なくとも所定の温度に加熱するための効果的な振幅及び持続時間で前記電圧パルスが供給される、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記液体の温度が相転移温度の値にほぼ等しい値まで増加するような効果的な振幅及び持続時間で前記電圧パルスが供給される、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記電圧パルスが印加される規定の持続時間の間、前記液体の温度が相転移温度のものとほぼ等しくなるような効果的な振幅及び持続時間で前記電圧パルスが供給される、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記上部電極と前記下部電極の間を流れる電流を監視するステップと、前記電流の変化に応答して前記電圧パルスの前記振幅及び前記持続時間のうち1以上を制御するステップとをさらに含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記電流の最初のピークを前記液体の相転移の開始として識別するステップと、前記相転移の開始後、規定の持続時間の間、前記電圧パルスを印加し続けるステップとをさらに含む、請求項8に記載の方法。
- 前記電流の前記最初のピーク後、電流の減少を検出するステップと、その後のある期間の間、前記電圧パルスを印加し続けるステップとをさらに含む、請求項9に記載の方法。
- 前記電圧パルスを印加している間は前記チャネル内の圧力が増加するように、前記電圧パルスを印加している間、チャネル容積を密閉するステップをさらに含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記電圧パルスを印加している間、前記チャネル内の前記液体の圧力を調整するステップをさらに含む、請求項11に記載の方法。
- 前記マイクロ流体デバイスが受動圧力調整デバイスを備え、前記液体の前記圧力を調整するステップが、前記液体の前記圧力を受動的に調整するステップを含む、請求項12に記載の方法。
- 前記液体の前記圧力を調整するステップが、前記液体を過熱しながら前記チャネル内の圧力を維持するステップを含む、請求項12に記載の方法。
- 前記液体のイオン強度を低下させるように前記液体を処理するステップをさらに含む、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記液体のイオン強度がおよそ0.1mM〜100mMである、請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記液体のイオン強度がおよそ0.1mM〜10mMである、請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記液体のイオン強度がおよそ0.2mM〜2mMである、請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記マイクロ流体デバイスが、
前記チャネルの第1の側と流れ連通する第1のポートと、
前記チャネルの第2の側と流れ連通する第2のポートと、
前記チャネル内で支持されるフィルター、ここで前記フィルターは前記第1のポートと前記第2のポートの間を流れる液体が前記フィルターを通過するように位置し、かつ、前記フィルタの少なくとも一部分が前記上部電極と前記下部電極の間に位置する、前記フィルタとを備え、
液体を前記チャネル内に流すステップが、前記電圧パルスの印加の前に、前記液体内の細胞が前記フィルタ上に集中させられるように、前記液体を前記第1のポートから前記第2のポートに流すステップを含む、請求項1から18のいずれか一項に記載の方法。 - 前記マイクロ流体デバイスが、
前記チャネルの第1の側と流れ連通する第1のポートと、
前記チャネルの第2の側と流れ連通する第2のポートと、
前記チャネル内で支持されるフィルター、ここで前記フィルターは前記第1のポートと前記第2のポートの間を流れる液体が前記フィルターを通過するように位置し、かつ、前記フィルタの少なくとも一部分が前記上部電極と前記下部電極の間に位置する、前記フィルタとを備え、
前記方法が、
前記液体を前記チャネル内に流すステップの前に、前記試料内の細胞が前記フィルタ上に保持されるように、前記第1のポートから前記第2のポートに試料を流すステップをさらに含み、
前記細胞を前記フィルタ上に保持した後に、前記液体が前記チャネル内に流される、請求項1から18のいずれか一項に記載の方法。 - 前記液体が、前記細胞の効果的な電気的処理に適したイオン強度を有する、請求項20に記載の方法。
- 前記液体が、前記試料よりも低いイオン強度を有する、請求項20又は21に記載の方法。
- 前記液体を前記チャネル内に流すステップの前に、混合イオン交換樹脂内を通過するように前記液体を流すステップをさらに含む、請求項1から22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記高分子が2本鎖DNAを含む、請求項1から23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記高分子が、リボソームRNAとリボソームタンパク質の複合体を含み、リボソームRNA及び前記リボソームタンパク質が変性させられるような振幅及び持続時間で前記電圧パルスが供給される、請求項1から23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記高分子が酵素を含み、前記酵素の活性を低下させるための振幅及び持続時間で前記電圧パルスが供給される、請求項1から23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記酵素がヌクレアーゼである、請求項26に記載の方法。
- 前記高分子がPCR阻害物質を含み、前記PCR阻害物質の阻害作用を低減又は除去するための振幅及び持続時間で前記電圧パルスが供給される、請求項1から23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記高分子が核酸を含み、前記方法が、後に核酸の抽出又は精製工程を実施することなく、PCRを実施して前記核酸の配列を増幅するステップをさらに含む、請求項1から23のいずれか一項に記載の方法。
- 電圧パルスを印加するときにチャネルが開いている、請求項1に記載の方法。
- 前記チャネルと流体連通しているポートの直径が、電圧パルスを印加している間、該液体が過熱されるよう、その大きさが十分に制限される、請求項30に記載の方法。
- 前記電圧パルスのパルス幅が、およそ1マイクロ秒〜10ミリ秒である、請求項1から31のいずれか一項に記載の方法。
- 前記電圧パルスのパルス幅が、およそ1ミリ秒未満である、請求項32に記載の方法。
- 前記電圧パルスのパルス幅が、およそ10マイクロ秒を超える、請求項32に記載の方法。
- 液体を処理して、少なくとも一つの高分子を前記液体内の少なくとも一つの微生物細胞から放出させるマイクロ流体デバイスであって、
上部チャネル表面、下部チャネル表面、側壁、及びミクロンサイズの厚さを有する流体チャネルと、
前記チャネルの第1の側と流れ連通する第1のポートと、
前記チャネルの第2の側と流れ連通する第2のポートと、
前記上部チャネル表面上に設けられる上部電極と、
前記下部チャネル表面上に設けられる下部電極と、
電源とを備え、
前記上部電極と前記下部電極の間に双極性電圧パルスが印加され、それにより流体チャネルの厚さ全体にわたって生じる電界が2kV/cmよりも高く30kV/cm未満であり、かつ該液体が少なくとも毎秒250度の速度で加熱されるように構成されている、マイクロ流体デバイス。 - 前記上部チャネル表面及び前記下部チャネル表面の熱特性が、前記電圧パルスが印加されている間、少なくともおよそ毎秒250度の速度で前記液体中にジュール発熱が生じるように選択される、請求項35に記載のマイクロ流体デバイス。
- 前記電圧パルスが存在しない場合、前記チャネルの冷却時間が1秒未満の時間尺度であるように、前記チャネル表面の熱特性がさらに選択される、請求項35に記載のマイクロ流体デバイス。
- 前記上部電極及び前記下部電極の1以上が金属電極である、請求項35から37のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
- 前記上部電極及び前記下部電極の1以上が、誘電体層で被覆されることによって前記チャネル内の液体に電気的に直接連絡していないブロッキング電極である、請求項35から37のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
- 前記ブロッキング電極が微細構造の表面を有する、請求項39に記載のマイクロ流体デバイス。
- 前記微細構造の表面が、少なくともおよそ100の表面積増大係数を有する、請求項40に記載のマイクロ流体デバイス。
- 前記ブロッキング電極に関連する静電容量が、1平方センチメートル当たり約0.5マイクロファラッドと、1平方センチメートル当たり約200マイクロファラッドとの間になるように、前記誘電体層の厚さ及び前記誘電体層の誘電率が選択される、請求項41に記載のマイクロ流体デバイス。
- 前記ブロッキング電極に関連する静電容量が、1平方センチメートル当たり約1マイクロファラッドと、1平方センチメートル当たり約100マイクロファラッドとの間になるように、前記誘電体層の厚さ及び前記誘電体層の誘電率が選択される、請求項41に記載のマイクロ流体デバイス。
- およそ10mM未満のイオン強度を有する液体で前記チャネルが満たされているとき、前記上部電極及び前記下部電極の帯電時間が1マイクロ秒を超えるように前記誘電体層の厚さ及び前記誘電体層の誘電率が選択される、請求項41に記載のマイクロ流体デバイス。
- 前記ブロッキング電極が、ナノメートルサイズの厚さを有する酸化アルミニウム層で被覆された微細構造のアルミニウムを含む、請求項39から44のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
- 前記酸化アルミニウム層で被覆された前記微細構造のアルミニウムが、陽極酸化処理によって形成される、請求項45に記載のマイクロ流体デバイス。
- 前記ブロッキング電極が、ナノメートルサイズの厚さを有する二酸化ケイ素の層で被覆された多孔質シリコンを含む、請求項39から44のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
- 前記チャネル内で支持されるフィルタをさらに含み、前記フィルタが、前記第1のポートと前記第2のポートの間を流れる流体が前記フィルタを通過するように位置する、請求項35から47のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
- 前記フィルタの少なくとも一部分が、前記上部電極と前記下部電極の間に位置する、請求項48に記載のマイクロ流体デバイス。
- 前記フィルタが前記チャネル内で複数のビーズによってサポートされ、前記ビーズが、前記チャネル内の前記フィルタのいずれかの側に設けられている、請求項48又は49に記載のマイクロ流体デバイス。
- 前記フィルタが、前記チャネル内で前記フィルタの第1の側に設けられた第1の支持構造と、前記フィルタの第2の側に設けられた第2の支持構造とによって、前記チャネル内で支持され、前記第1の支持構造及び前記第2の支持構造が、前記フィルタ内を通る流体の流れを可能にする、請求項48又は49に記載のマイクロ流体デバイス。
- 前記フィルタがメンブレンフィルタである、請求項48又は51に記載のマイクロ流体デバイス。
- 前記チャネルと流れ連通する、前記チャネル内の圧力を制御するための圧力調整デバイスをさらに備える、請求項35から52のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
- 前記電源が、およそ1マイクロ秒〜10ミリ秒のパルス幅を有する電圧パルスを供給するように構成されている、請求項35から53のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
- 前記電源が、およそ1ミリ秒未満のパルス幅を有する電圧パルスを供給するように構成されている、請求項54に記載のマイクロ流体デバイス。
- 前記電源が、およそ10マイクロ秒を超えるパルス幅を有する電圧パルスを供給するように構成されている、請求項54に記載のマイクロ流体デバイス。
- 前記電源が、少なくとも毎秒2000度の速度で前記液体が加熱されるよう、電圧パルスを供給するように構成される、請求項35〜56のいずれか1項に記載のマイクロ流体デバイス。
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