ES2961813T3 - Componentes basados en Bacillus para inhibir o retrasar el crecimiento de Enterococcus ssp. en animales - Google Patents

Componentes basados en Bacillus para inhibir o retrasar el crecimiento de Enterococcus ssp. en animales Download PDF

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Abstract

Un método para inhibir o retrasar el crecimiento de Enterococcus spp. en animales que utilizan al menos un componente basado en Bacillus se describe en el presente documento. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Componentes basados en Bacillus para inhibir o retrasar el crecimiento de Enterococcus ssp. en animalesCAMPO
El campo se refiere al uso de componentes basados enBacilluspara inhibir o retrasar el crecimiento deEnterococcus spp.en animales.
ANTECEDENTES
Enterococcuses un género grande de bacterias ácido-lácticas del filo Firmicutes.Enterococcison cocos grampositivos que frecuentemente ocurren en pares (diplococos) o cadenas cortas, y son difíciles de distinguir de los estreptococos únicamente por características físicas.Enterococcison organismos anaerobios facultativos, es decir, son capaces de respiración celular en tanto entornos ricos en oxígeno como pobres en oxígeno. Aunque no son capaces de formar esporas, los enterococos son tolerantes a un amplio intervalo de condiciones medioambientales: temperatura extrema (10-45 °C), pH (4,5-10,0) y altas concentraciones de cloruro sódico. Los miembros del géneroEnterococcusse clasificaron comoStreptococcusdel grupo D hasta 1984, cuando los análisis de ADN genómico indicaron que sería apropiada una clasificación de género separada. Entre las especies deEnterococcus,se sabe que algunas son patógenos oportunistas cuando salen del intestino. Este es el caso con respecto aE. avium, E. gallinarumyE. cecorum,en dondeE. cecorumes importante en términos de pérdidas económicas sostenidas por criadores de aves de corral en la cadena de producción de pollos de engorde.
Enterococcus cecorumes un habitante normal del intestino de aves y otros vertebrados, tales como caballos, ganado vacuno, cerdos, perros, gatos, canarios, palomas, pavos y patos criollos. Se considera un patógeno emergente de aves de corral y otras especies aviares. La necrosis de la cabeza femoral y la espondilitis se han descrito como los principales cambios patológicos en los pollos infectados.
Una parte de la flora intestinal normal, alteraciones o ataques a la función intestinal normal pueden dar como resultado translocación deEnterococcus cecoruma la columna vertebral de las aves. Las infecciones porEnterococcus cecorumen la columna vertebral conducen a lesiones vertebrales y artríticas, cojera y mortalidad en una afección conocida como espondilitis enterocócica o "espalda rizada".
La espondilitis, denominada "espalda rizada" por los productores de aves de corral, se conoce en la producción comercial desde hace muchos años y normalmente se observa en aves pesadas de rápido crecimiento, especialmente machos y reproductoras de pollos de engorde (Aziz, T. & Barnes, H.J. (2009). Spondylitis is emerging in broilers. World Poultry, 25, 19).
Las cepas altamente patógenas y resistentes a antibióticos deEnterococcus cecorumcontinúan provocando pérdidas económicas a la industria de los pollos de engorde. Por lo tanto, procedimientos de higiene rutinaria de las granjas y terapia antimicrobiana han demostrado ser insuficientes para controlar los brotes deEnterococcusspp. patógeno, especialmente,Enteroccocus cecorum.
Por consiguiente, se necesita una alternativa segura y eficaz para controlar este importante patógeno emergente. El documento de patente WO 2014/151837 A1 describe un método de mantenimiento o mejora de la salud de las patas de aves de corral que comprende administrar a las aves de corral una composición que comprende una cepa deBacillus subtiliso un mutante de la misma.
Lee et al., (2011) Research in Veterinary Science, 91 (3): e87-91 describen que los microbianos de alimentación directa basados enBacillus subtilisaumentan la función de macrófagos en pollos de engorde.
Waititu et al., (2014) Poultry Science, 93(3):625-635 describen el efecto de suplementar los microbianos de alimentación directa sobre el rendimiento de los pollos de engorde, las digestibilidades de nutrientes y las respuestas inmunitarias.
Kadaikunnan et al., (2015) Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials, 14(1):9 describen las propiedades antibacterianas, antifúngicas, antioxidantes y funcionalesin vitrodeBacillus amyloliquefaciens.
Wideman et al. (2015) Poultry Science, 94(1):25-36 describen la administración profiláctica de un prebiotico y probiótico combinados, o una administración terapéutica de enrofloxacino, para reducir la incidencia de condronecrosis bacteriana con osteomielitis en pollos de engorde.
Wideman (2015) Poultry Science, 95(2):325-344 revisa la condronecrosis bacteriana con osteomielitis y cojera en pollos de engorde.
Borst et al., (2016) Veterinary Pathology, 54(1 ):61 -73 describen la patogénesis de la espondilitis enterocócica causada porEnterococcus cecorumen pollos de engorde.
SUMARIO
Se proporciona un microbiano de alimentación directa basado enBacilluspara su uso en un método de inhibición o retraso de todo o parte del crecimiento deEnterococcus cecorumpatógeno en un animal en donde el microbiano de alimentación directa basado enBacillusse selecciona de la cepa deBacillus2084 n.° de acceso NRRl B-50013 y la cepa deBacillus15A-P4 ATCC n.° de acceso 15 PTA-6507.
En algunas realizaciones, el animal puede ser un animal monogástrico, preferentemente, puede ser aves de corral. En algunas realizaciones, el animal puede ser un animal multigástrico.
En algunas realizaciones, al menos un componente basado enBacillusse puede administrar directamente a un animal a través del pienso para animales, tanto en el pienso como encima del pienso o en un líquido, tal como agua.
En realizaciones adicionales, el componente basado enBacillusse puede administrar al animal en una forma seleccionada del grupo que consiste en un pienso, una composición de aditivo para piensos, una premezcla o en un líquido, tal como agua.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La Figura 1 muestra la inhibición promedio para las cepas deE. cecorumrecogidas de la producción de aves de corral americana y europea por cepas Enviva® PRO.
La Figura 2 representa datos de la cinética del crecimiento de la cepa G84-68 deE. cecorumcon/sinBacillusBS8.
La Figura 3 representa datos de la cinética del crecimiento de la cepa D45-08 deE. cecorumcon/sinBacillusBS8.
La Figura 4 representa la inhibición del perfil de crecimiento de la cepa 11976-2 deEnterococcus cecorumincubada con o sin sobrenadante sin células (CFS) deBacillusBS8,Bacillus15AP4 oBacillus2084.
La Figura 5 muestra la actividad antimicrobiana de CFS deB. amyloliquefacienssubsp.plantarum15AP4, BS8 y 2084 contraEnterococcus gallinarumVTT E-97776T expresada como el % de inhibición en el punto final exacto cuando la curva de patógeno de control alcanza DO 0,4.
La Figura 6 muestra los perfiles de crecimiento deEnterococcus aviumE 84197 incubados o no con CFS deBacillus2084.
La Figura 7 muestra la actividad antimicrobiana de CFS deBacillus amyloliquefaciensDSM7T,B. subtilisDSM10T yB. licheniformisDSM13T contra 10 cepas clínicas deEnterococcus cecorum,expresada como el % de inhibición en el punto final exacto cuando la curva de patógeno de control alcanza DO 0,4.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
En la presente divulgación, se usan varios términos y abreviaturas. Se aplican las siguientes definiciones, a menos que se establezca específicamente lo contrario.
Los artículos "un", "una", "el" y "la" que preceden a un elemento o componente pretenden no ser restrictivos con respecto al número de casos (es decir, manifestaciones) del elemento o componente. Por lo tanto, "un", "una", "el" y "la" se deben leer como que incluyen uno o al menos uno, y la forma de la palabra en singular del elemento o componente también incluye el plural, a menos que el número tenga por objeto ser obviamente singular.
El término "que comprende" significa la presencia de características, números enteros, etapas o componentes establecidos como se hace referencia en las reivindicaciones, pero que no excluye la presencia o adición de una o varias de otras características, números enteros, etapas, componentes o grupos de los mismos. El término "que comprende" pretende incluir realizaciones englobadas por los términos "que consiste esencialmente en" y "que consiste en". Similarmente, el término "que consiste esencialmente en" pretende incluir realizaciones englobadas por el término "que consiste en".
Donde estén presentes, todos los intervalos son incluyentes y combinables. Por ejemplo, cuando se cita un intervalo de "1 a 5", el intervalo citado se debe interpretar como que incluye los intervalos "1 a 4", "1 a 3", "1-2", "1-2 y 4-5", "1 -3 y 5", y similares.
Como se usa en el presente documento a propósito de un valor numérico, el término "aproximadamente" se refiere a un intervalo de /- 0,5 el valor numérico, a menos que el término se defina de otro modo específicamente en el contexto. Por ejemplo, la expresión un "valor de pH de aproximadamente 6" se refiere a los valores de pH de desde 5,5 hasta 6,5, a menos que el valor de pH se defina en concreto de otro modo.
Se pretende que cada limitación numérica máxima facilitada en toda esta memoria descriptiva incluya cada limitación numérica más baja, como si dichas limitaciones numéricas más bajas se escribieran explícitamente en el presente documento. Cada limitación numérica mínima dada en toda esta memoria descriptiva incluirá cada limitación numérica más alta, como si dichas limitaciones numéricas más altas se escribieran explícitamente en el presente documento. Cada intervalo numérico dado en toda esta memoria descriptiva incluirá cada intervalo numérico más estrecho que entra dentro de dicho intervalo numérico más ancho, como si dichos intervalos numéricos más estrechos se escribieran todos explícitamente en el presente documento.
Los términos"Enterococcus"y"Enterococcus spp. "se usan indistintamente y como se usan en el presente documento se refieren a un género grande de bacterias ácido-lácticas del filo Firmicutes.Enterococcison cocos grampositivos que frecuentemente ocurren en pares (diplococos) o cadenas cortas, y son difíciles de distinguir de los estreptococos únicamente por características físicas.Enterococcison organismos anaerobios facultativos, es decir, son capaces de respiración celular en tanto entornos ricos en oxígeno como pobres en oxígeno. Aunque no son capaces de formar esporas, los enterococos son tolerantes a un amplio intervalo de condiciones medioambientales: temperatura extrema (10-45 °C), pH (4,5-10,0) y altas concentraciones de cloruro sódico. Los miembros del géneroEnterococcusse clasificaron comoStreptococcusdel grupo D hasta 1984, cuando los análisis de ADN genómico indicaron que sería apropiada una clasificación de género separada.
Los términos"Enterococcus cecorum"y"E. cecorum"se usan indistintamente en el presente documento. E.cecorumes una especie deEnterococcusy es una bacteria del tubo digestivo de muchos animales domésticos.
Los términos "animal" y "sujeto" se usan indistintamente en el presente documento. Un animal incluye todos los animales no rumiantes (incluyendo seres humanos) y rumiantes. En una realización particular, el animal es un animal no rumiante, tal como un caballo y un animal monogástrico. Los ejemplos de animales monogástricos incluyen, pero no se limitan a, cerdos y porcinos, tales como lechones, cerdos en crecimiento, cerdas; aves de corral, como pavos, patos, pollos, pollitos de engorde, ponedoras; peces, tales como salmón, trucha, tilapia, siluro y carpas; y crustáceos, tales como gambas y langostinos. En una realización adicional, el animal puede ser multigástrico, tal como un animal rumiante, que incluyen, pero no se limitan a, bovinos, terneros, cabras, ovejas, jirafas, bisontes, alces, uatipís, yaks, búfalos de agua, ciervos, camellos, alpacas, llamas, antílopes, antílopes americanos y nilgós.
El término "rumiante", como se usa en el presente documento, se refiere a un mamífero que es capaz de adquirir nutrientes de alimentos de origen vegetal fermentándolos en un estómago especializado antes de la digestión, principalmente, mediante acciones microbianas. El proceso requiere normalmente que la ingesta fermentada (conocida como bolo alimenticio) sea regurgitada y masticada otra vez. El proceso de remasticar el bolo alimenticio para degradar más la materia vegetal y estimular la digestión se denomina rumiación. Aproximadamente 150 especies de rumiantes incluyen tanto especies domésticas como salvajes. Los animales rumiantes incluyen, pero no se limitan a, bovinos, vacas, cabras, ovejas, jirafas, yaks, alces, uatipís, antílopes, búfalos y similares.
El término "UFC", como se usa en el presente documento, significa "unidades formadoras de colonias" y es una medida de células viables en la que una colonia representa un agregado de células derivadas de una única célula progenitora.
El término "microbiano de alimentación directa" ("DFM"), como se usa en el presente documento, es una fuente de microorganismos naturales vivos (viables). Un DFM puede comprender uno o más de dichos microorganismos naturales, tales como cepas bacterianas. Las categorías de DFM incluyen bacterias formadoras de esporas, tales comoBacillusyClostridium,además de bacterias no formadoras de esporas, tales como bacterias ácido-lácticas, levaduras y hongos. Por lo tanto, el término DFM engloba uno o más de los siguientes: bacterias de alimentación directa, levadura de alimentación directa, levadura u hongos de alimentación directa y combinaciones de los mismos.
BacillusyClostridiumson bacilos grampositivos únicos que forman esporas. Estas esporas son muy estables y pueden resistir a condiciones medioambientales, tales como el calor, la humedad y un intervalo de pH. Estas esporas germinan en células vegetativas activas cuando son ingeridas por un animal y se pueden usar en dietas de harina y de gránulos. Las bacterias ácido-lácticas son cocos grampositivos que producen ácido láctico que son antagonistas para los patógenos. Puesto que las bacterias ácido-lácticas parecen ser algo sensibles al calor, no se usan en dietas de gránulos como tales y necesitan ser protegidas (recubiertas). Los tipos de bacterias ácido-lácticas incluyenBifidobacterium, LactobacillusyEnterococcus.
El término "microbiano de alimentación directa basado enBacillus"significa un microbiano de alimentación directa que comprende una o más cepas bacterianas de Bacillus.
El término "componente basado enBacillus",como se usa en el presente documento, se refiere a (i) un microbiano de alimentación directa basado enBacillusque comprende una o más cepas bacterianas de Bacillus, (ii) un sobrenadante obtenido de un cultivo de Bacillus o (iii) una combinación de (i) y (ii).
Un "pienso" y un "alimento", respectivamente, significan cualquier dieta natural o artificial, comida o similares o ingredientes de dichas comidas previstos o adecuados para ser comidos, tomados, digeridos, por un animal no humano y un ser humano, respectivamente.
Como se usa en el presente documento, el término "alimento" se usa en un amplio sentido, y cubre comida y productos alimenticios para seres humanos, así como alimentos para animales no humanos (es decir, un pienso).
El término "pienso" se usa con referencia a productos que se alimentan a los animales en la cría de ganado. Los términos "pienso" y "pienso para animales" se usan indistintamente. En una realización preferida, el alimento o pienso es para consumo por no rumiantes y rumiantes.
El término "probiótico", como se usa en el presente documento, define microorganismos vivos (incluyendo bacterias o levaduras, por ejemplo) que, cuando, por ejemplo, son ingeridos o administrados por vía local en números suficientes, afectan beneficiosamente al organismo hospedador, es decir, confiriendo uno o más beneficios demostrables para la salud en el organismo hospedador. Los probióticos pueden mejorar el equilibrio microbiano en una o más superficies de la mucosa. Por ejemplo, la superficie de la mucosa puede ser el intestino, las vías urinarias, las vías respiratorias o la piel. El término "probiótico", como se usa en el presente documento, también engloba microorganismos vivos que pueden estimular las beneficiosas ramas del sistema inmunitario y al mismo tiempo disminuir las reacciones inflamatorias en una superficie de la mucosa, por ejemplo, el intestino. Aunque no existen límites inferiores o superiores para el consumo de probióticos, se ha sugerido que al menos 106-1012, preferentemente al menos 106-1010, preferentemente 108-109, ufc como dosis diaria serán eficaces para lograr los efectos beneficiosos para la salud en un sujeto.
El término "prebiótico" significa un ingrediente de alimento no digerible que afecta beneficiosamente al hospedador estimulando selectivamente el crecimiento y/o la actividad de una o un número limitado de bacterias beneficiosas.
El término "patógeno", como se usa en el presente documento, significa cualquier agente causante de enfermedad. Dichos agentes causantes pueden incluir, pero no se limitan a, agentes causantes bacterianos, víricos, fúngicos y similares.
Los términos "derivado de" y "obtenido de" se refieren a no solo una proteína producida o producible por una cepa del organismo en cuestión, sino también a una proteína codificada por una secuencia de ADN aislada de dicha cepa y producida en un organismo hospedador que contiene dicha secuencia de ADN. Además, el término se refiere a una proteína que está codificada por una secuencia de ADN de origen sintético y/o ADNc y que tiene las características identificadoras de la proteína en cuestión.
El término "cantidad eficaz" significa una cantidad suficiente del componente especificado.
Como se observó anteriormente,Enteroccocus cecorumse considera un patógeno emergente en aves de corral y puede provocar pérdidas sustanciales en bandadas de pollos de engorde y de reproductoras de pollos de engorde.E. cecorumse reconoce cada vez más como causa de la espondilitis enterocócica, anteriormente denominada osteoartritis vertebral enterocócica (EVOA) en pollos. Los brotes de enfermedad fueron diagnosticados principalmente en bandadas de pollos de engorde criadas en un sistema de producción intensiva. Las aves clínicamente afectadas sufrían problemas locomotores debido a la compresión de la médula espinal en las vértebras torácicas resultante de la osteomielitis inducida porE. cecorumy debido a necrosis de la cabeza femoral. Los brotes de enfermedad pueden conducir a elevada morbilidad, mortalidad, sacrificio, declaración de canales no aptas para el consumo, y puede dar como resultado graves pérdidas económicas en un corto tiempo. Además, las cepas aisladas deE. cecorumno solo han demostrado elevada patogenia, sino también elevada resistencia antimicrobiana.
Por lo tanto, el microbiano de alimentación directa basado enBacillusdescrito en el presente documento proporciona una alternativa al uso de antibióticos desde que la resistencia a antimicrobianos se está convirtiendo en una gran amenaza para la salud mundial.
La invención proporciona un microbiano de alimentación directa basado enBacilluspara su uso en un método de inhibición o retraso de todo o parte del crecimiento deEnterococcus cecorumpatógeno en un animal en donde el microbiano de alimentación directa basado enBacillusse selecciona de la cepa deBacillus2084 n.° de acceso NRRl B-50013 y la cepa deBacillus15A-P4 ATCC n.° de acceso 15 PTA-6507.
En otra realización, el DFM se puede combinar adicionalmente con los siguientesLactococcusspp:Lactococcus cremorisandLactococcus lactisy combinaciones de los mismos.
El DFM se puede combinar además con los siguientesLactobacillus spp: Lactobacillus buchneri, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus kefiri, Lactobacillus bifidus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus sakei, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus lactis, Lactobacillus delbreuckii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus johnsoniiyLactobacillus jensenii, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus amylolyticus, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus aviaries, Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus casei, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus gallinarum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus kefiranofaciens, Lactobacillus kefiri, Lactobacillus mucosae, Lactobacillus panis, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus paraplantarum, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus pontis, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus sakei, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus sanfranciscensis, Lactobacillus zeaey combinaciones de cualquiera de los mismos.
En otra realización adicional, el DFM se puede combinar además con los siguientesBifidobacteriaspp:Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium bifidium, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacterium pseudocatenulatum, Bifidobacterium adolescentis,yBifidobacterium angulatum,y combinaciones de cualquiera de los mismos.
Adecuadamente, la composición según la presente divulgación se puede combinar con uno o más de los productos o los microorganismos contenidos en los productos desvelados en el documento de patente WO2012110778, y resumidos del siguiente modo:
Bacillus subtiliscepa 2084 n.° de acceso NRRl B-50013,Bacillus subtiliscepa LSSAO1 n.° de acceso NRRL B-50104 yBacillus subtiliscepa 15A-P4 ATCC n.° de acceso PTA-6507 (de Enviva® PRO® (anteriormente conocido como Avicorr®); Bacillus subtilis cepa C3102 (de Calsporin®);Bacillus subtiliscepa PB6 (de Clostat®);Bacillus pumilis(8G-134);EnterococcusNCIMB 10415 (SF68) (de Cylactin®);Bacillus subtiliscepa C3102 (de Gallipro® y GalliproMax®);Bacillus licheniformis(de Gallipro®Tect®);Enterococcus faeciul, Lactobacillus salivarius, L. reuteri, Bifidobacterium animalisyPediococcus acidilactici(de Poultry Star®);Lactobacillus, Bifidobacteriumy/oEnterococcus(de Protexin®);Bacillus subtiliscepa QST 713 (de Proflora®);Bacillus amyloliquefaciensCECT-5940 (de Ecobiol® y Ecobiol® Plus);Enterococcus faeciumSF68 (de Fortiflora®);Bacillus subtilisyBacillus licheniformis(de BioPlus2B®); bacterias ácidolácticas 7Enterococcus faecium(de Lactiferm®); cepa deBacillus(de CSI®);Saccharomyces cerevisiae(de Yea-Sacc®);Enterococcus(de Biomin IMB52®);Pediococcus acidilactici, Enterococcus, Bifidobacterium animalisssp.animalis, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus salivariusssp.salivarius(de Biomin C5®);Lactobacillus farciminis(de Biacton®);Enterococcus(de Oralin E1707®);Enterococcus(2 cepas),Lactococcus lactisDSM 1103(de Probiospioneer PDFM®);Lactobacillus rhamnosusyLactobacillus farciminis(de Sorbiflore®);Bacillus subtilis(de Animavit®);Enterococcus(de Bonvital®);Saccharomyces cerevisiae(de Levucell SB 20®);Saccharomyces cerevisiae(de Levucell SC 0 y SC10® ME);Pediococcus acidilacti(de Bactocell);Saccharomyces cerevisiae(de ActiSaf® (anteriormente BioSaf®));Saccharomyces cerevisiaeNCy CSc47 (de Actisaf® SC47);Clostridium butyricum(de Miya-Gold®);Enterococcus(de Fecinor y Fecinor Plus®);Saccharomyces cerevisiaeNCYC R-625 (de InteSwine®);Saccharomyces cerevisia(de BioSprint®);EnterococcusyLactobacillus rhamnosus(de Provita®);Bacillus subtilisyAspergillus oryzae(de PepSoyGen-C®);Bacillus cereus(de Toyocerin®);Bacillus cereusvar.toyoiNCIMB 40112/CNCM 1-1012 (de TOYOCERIN®),Lactobacillus plantarum(de LactoPlan®) u otros DFM, tales comoBacillus licheniformisyBacillus subtilis(de BioPlus® YC) y Bacillus subtilis (de GalliPro®).
También es posible combinar los DFM descritos en el presente documento con una levadura de los géneros y especies:Debaryomyces hansenii, Hanseniaspora uvarum, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Pichia angusta, Pichia anomala, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pastorianus (sinónimo de Saccharomyces carlsbergensis) y hongos filamentosos del género Aspergillus.
El DFM basado enBacilluscomo se describe en el presente documento descrito en el presente documento inhibe o retrasa todo o parte del crecimiento deEnterococcusspp., por ejemplo,E. cecorum.En otras palabras, un DFM basado enBacilluscomo se describe en el presente documento es antipatógeno. El término "antipatógeno", como se usa en el presente documento, significa que el DFM contrarresta un efecto (efecto negativo) de un patógeno, en este caso, el patógenoEnterococcusspp., por ejemplo,E. cecorum.
Por ejemplo, se puede usar el siguiente ensayo "ENSAYO de DFM" para determinar la idoneidad de un microorganismo para ser un DFM o en esta realización, un DFM basado enBacilluscomo se describe en el presente documento. Dicho DFM puede ejecutarse del siguiente modo:
Se centrifugó el cultivo completamente cultivado de una cepa deBacillusy se esterilizó por filtración (0,2 gm) para obtener sobrenadante estéril sin células (CFS). Cada pocillo de una placa de microtitulación de 96 pocillos se llena con 180 gl de una suspensión de patógeno/BHI (o medio de crecimiento apropiado) (1 %). Los pocillos de control positivo se llenan con 20 gl adicionales del mismo medio de caldo mientras que los pocillos probados se llenan con 20 gl de los CFS probados. Los controles negativos contienen el medio de caldo solo o medio de caldo añadido con 20 de CFS. La placa de microtitulación de 96 pocilios se incuba entonces aeróbicamente a 37 °C durante 14 horas en una máquina FlexStation para registrar la absorbancia, transfiriéndose los datos directamente a un ordenador para el análisis para generar la curva de crecimiento cinético. Las mediciones se tomaron cada 15 minutos. Los resultados se dan como el % de inhibición comparando el control a DO = 0,4 (patógeno solo) y tratado (patógeno incubado con CFS deBacillus).El retraso en el crecimiento se calcula como la diferencia en el tiempo para alcanzar DO 0,4 entre los pocillos de control y complementados con CFS. Todos los ensayos se realizan por duplicado. La separación de medias se realizó usando HSD de Tukey en JMP 11; las diferencias se consideraron significativas a P<0,05.
Un componente basado enBacilluscomo se describe en el presente documento se puede preparar como cultivo(s) y vehículo(s) (donde se usen) y se pueden añadir a una mezcladora de cinta o paletas y mezclar durante aproximadamente 15 minutos, aunque el ritmo adecuado se puede aumentar o disminuir. Los componentes se mezclan de forma que resulte una mezcla uniforme de los cultivos y vehículos. El producto final es preferentemente un polvo fluido seco. Por consiguiente, un componente basado enBacilluspuede comprender: un microbiano de alimentación directa basado enBacillusque comprende una o más cepas bacterianas deBacillus,un sobrenadante obtenido de un cultivo deBacilluso una combinación. Dicho componente basado enBacillusse pueden añadir a continuación al pienso para animales o una premezcla de pienso. Se puede añadir a la parte superior del pienso para animales ("alimentación superior") o se puede añadir a un líquido, tal como el agua de beber del animal.
La inclusión de las cepas individuales en el DFM basado enBacilluscomo se describe en el presente documento puede ser en proporciones variables del 1 % al 99 % y, preferentemente, del 25 % al 75 %.
Las dosis adecuadas del componente basado enBacilluscomo se describe en el presente documento en el pienso para animales pueden variar desde aproximadamente 1x103 UFC/g de pienso a aproximadamente 1x1010 UFC/g de pienso, adecuadamente entre aproximadamente 1x104 UFC/g de pienso a aproximadamente 1x108 UFC/g de pienso, adecuadamente entre aproximadamente 7,5x104 UFC/g de pienso a aproximadamente 1x107 UFC/g de pienso.
Los piensos para animales pueden incluir material vegetal, tal como maíz, trigo, sorgo, soja, canola, girasol o mezclas de cualquiera de estos materiales vegetales o fuentes de proteína vegetal para aves de corral, cerdos, rumiantes, acuicultura y mascotas.
Los términos "pienso para animales", "pienso" y "piensos" se usan indistintamente y pueden comprender uno o más materiales para pienso seleccionados del grupo que comprende a) cereales, tales como granos pequeños (por ejemplo, trigo, cebada, centeno, avena y combinaciones de los mismos) y/o granos grandes, tales como maíz o sorgo; b) productos de cereales, tales como harina de gluten de maíz, granos secos de destilería con solubles (DDGS) (particularmente granos secos de destilería con solubles basados en maíz (cDDGS), salvado de trigo, trigo molido, moyuelos de trigo, salvado de arroz, cascarillas de arroz, cascarillas de avena, palmiste y pulpa de cítricos; c) proteína obtenida de fuentes tales como soja, girasol, cacahuete, altramuz, guisantes, judías verdes, algodón, canola, harina de pescado, proteína plasmática secada, harina de carne y hueso, proteína de la patata, suero de leche, copra, sésamo; d) aceites y grasas obtenidas de fuentes animales y vegetales; y/o e) minerales y vitaminas.
Cuando se usa como, o en la preparación de, un pienso, como en pienso funcional, un componente basado enBacilluscomo se describe en el presente documento se puede usar junto con uno o más de: un vehículo nutricionalmente aceptable, un diluyente nutricionalmente aceptable, un excipiente nutricionalmente aceptable, un adyuvante nutricionalmente aceptable, un principio nutricionalmente activo. Por ejemplo, se podría mencionar al menos un componente seleccionado del grupo que consiste en una proteína, un péptido, sacarosa, lactosa, sorbitol, glicerol, propilenglicol, cloruro sódico, sulfato de sodio, acetato sódico, citrato de sodio, formiato de sodio, sorbato de sodio, cloruro de potasio, sulfato de potasio, acetato de potasio, citrato de potasio, formiato de potasio, acetato de potasio, sorbato de potasio, cloruro de magnesio, sulfato de magnesio, acetato de magnesio, citrato de magnesio, formiato de magnesio, sorbato de magnesio, metabisulfito de sodio, metilparabeno y propilparabeno.
En una realización preferida, un componente basado enBacilluscomo se describe en el presente documento se puede mezclar con un componente de pienso para formar un pienso. El término "componente de pienso", como se usa en el presente documento, significa todo o parte del pienso. Parte del pienso puede significar un constituyente del pienso o más de un constituyente del pienso, por ejemplo 2 o 3 o 4 o más. En una realización, el término "componente de pienso" engloba una premezcla o constituyentes de premezcla. Preferentemente, el pienso puede ser un forraje, o una premezcla del mismo, un pienso compuesto, o una premezcla del mismo. Una composición de aditivo para piensos que comprende un componente basado enBacilluscomo se describe en el presente documento se puede mezclar con un pienso compuesto o con una premezcla de un pienso compuesto o con un forraje, un componente de forraje o una premezcla de un forraje.
El término forraje, como se usa en el presente documento, significa cualquier alimento que se proporciona a un animal (en vez de que el animal tenga que buscarlo por sí mismo). Forraje engloba plantas que han sido cortadas.
El término forraje incluye heno, paja, ensilado, piensos compactados y granulados, aceites y raciones mixtas, así como granos germinados y leguminosas
El forraje se puede obtener de una o más de las plantas seleccionadas de: alfalfa (lucerna), cebada, trébol de pata de pájaro, brassicas, Chau moellier, col rizada, colza (canola), colinabo (nabo), nabo, trébol, trébol alsike, trébol rojo, trébol subterráneo, trébol blanco, hierba, falsa hierba de avena, festuca, hierba Bermuda, bromo, hierba de los brezales, hierba de los prados (de pastizales mezclados de forma natural), hierba de los huertos, hierba de centeno, hierba timotea, grano (maíz), mijo, avena, sorgo, sojas, árboles (brotes de árboles podados para heno de árboles), trigo y leguminosas.
El término "pienso compuesto" significa un pienso comercial en forma de una harina, un gránulo, frutos secos, torta o migajas. Los piensos compuestos pueden mezclarse de diversos materiales de partida y aditivos. Estas mezclas se formulan según los requisitos específicos del animal objetivo.
Los piensos compuestos pueden ser piensos completos que proporcionan todos los nutrientes requeridos diariamente, concentrados que proporcionan una parte de la ración (proteína, energía) o suplementos que solo proporcionan micronutrientes adicionales, tales como minerales y vitaminas.
Los principales ingredientes usados en el pienso compuesto son los granos para piensos, que incluyen maíz, sojas, sorgo, avena y cebada.
Adecuadamente, una premezcla como se denomina en el presente documento puede ser una composición compuesta de microingredientes, tales como vitaminas, minerales, conservantes químicos, antibióticos, productos de fermentación y otros ingredientes esenciales. Las premezclas son normalmente composiciones adecuadas para mezclar en raciones comerciales.
Cualquier pienso descrito en el presente documento puede comprender uno o más materiales para pienso seleccionados del grupo que comprende a) cereales, tales como granos pequeños (por ejemplo, trigo, cebada, centeno, avena y combinaciones de los mismos) y/o granos grandes, tales como maíz o sorgo; b) productos de cereales, tales como harina de gluten de maíz, granos secos de destilería con solubles (DDGS), salvado de trigo, trigo molido, moyuelos de trigo, salvado de arroz, cascarillas de arroz, cascarillas de avena, palmiste y pulpa de cítricos; c) proteína obtenida de fuentes tales como soja, girasol, cacahuete, altramuz, guisantes, judías verdes, algodón, canola, harina de pescado, proteína plasmática secada, harina de carne y hueso, proteína de la patata, suero de leche, copra, sésamo; d) aceites y grasas obtenidas de fuentes animales y vegetales; e) minerales y vitaminas.
Además, dicho pienso puede contener al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 % o al menos 60 % en peso de harina de maíz y soja o maíz y soja entera, o harina de trigo o harina de girasol.
Además, o alternativamente, un pienso puede comprender al menos un material de pienso rico en fibra y/o al menos un subproducto de al menos un material de pienso rico en fibra para proporcionar un pienso rico en fibra. Los ejemplos de materiales de pienso rico en fibra incluyen: trigo, cebada, centeno, avena, productos de cereales, tales como harina de gluten de maíz, granos secos de destilería con solubles (DDGS), salvado de trigo, trigo molido, moyuelos de trigo, salvado de arroz, cascarillas de arroz, cascarillas de avena, palmiste y pulpa de cítricos. Algunas fuentes de proteína también se pueden considerar ricas en fibra: proteína obtenida de fuentes, tales como girasol, altramuz, judías verdes y algodón.
Como se describe en el presente documento, el pienso puede ser uno o más de los siguientes: un pienso compuesto y premezcla, que incluye gránulos, frutos secos o torta (para ganado vacuno); un cultivo o residuo de cultivo: maíz, sojas, sorgo, avena, cebada, hojas y tallos del maíz, copra, paja, cascarilla, residuo de remolacha azucarera; harina de pescado; pasto recién cortado y otras plantas de forraje; harina de carne y hueso; melaza; torta de aceite y torta de prensa; oligosacáridos; plantas de forraje conservadas: heno y ensilado; algas marinas; semillas y granos, ya sean completos o preparados por trituración, molienda, etc.; granos germinados y legumbres; extracto de levadura.
El término pienso, como se usa en el presente documento, también engloba en algunas realizaciones comida para mascotas. Una comida para mascotas es un material vegetal o animal previsto para el consumo por mascotas, tales como comida para perros o comida para gatos. La comida para mascotas, tal como comida para perros y gatos, puede estar o en una forma seca, tal como croquetas para perros, o en una forma húmeda enlatada. La comida para gatos puede contener el aminoácido taurina.
El término pienso también puede englobar en algunas realizaciones comida para peces. Una comida para peces contiene normalmente macronutrientes, oligoelementos y vitaminas necesarias para mantener con buena salud a los peces en cautividad. La comida para peces puede estar en forma de un copo, gránulo o pastilla. Las formas granuladas, algunas de las cuales se hunden rápidamente, se usan frecuentemente para peces más grandes o especies que se alimentan en el fondo. Algunas comidas para peces también contienen aditivos, tales como beta caroteno u hormonas sexuales, para potenciar artificialmente el color de los peces ornamentales.
También están englobados dentro del término "pienso" la comida para pájaros, que incluye comida que se usa tanto en comederos para pájaros como para alimentar a pájaros de compañía. Normalmente, la comida para pájaros comprende una variedad de semillas, pero también puede engloban sebo (grasa de vacuno o cordero).
Como se usa en el presente documento, el término "contactado" se refiere a la aplicación indirecta o directa de la composición de aditivo para piensos al producto (por ejemplo, el pienso). Los ejemplos de métodos de aplicación que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a, tratamiento del producto en un material que comprende la composición de aditivo para piensos, aplicación directa mezclando la composición de aditivo para piensos con el producto, pulverizando la composición de aditivo para piensos sobre la superficie de producto o sumergiendo el producto en un preparado de la composición de aditivo para piensos.
El componente basado enBacillusse puede mezclar preferentemente con el producto (por ejemplo, pienso). Alternativamente, se puede incluir en la emulsión o ingredientes crudos de un pienso.
Para algunas aplicaciones, es importante que se ponga a disposición sobre o en la superficie de un producto a afectar/tratar.
El componente basado enBacillusse puede aplicar para intercalar, recubrir y/o impregnar un producto (por ejemplo, pienso o ingredientes crudos de un pienso) con una cantidad controlada de un componente basado enBacillus.
El DFM según la invención se puede añadir en concentraciones adecuadas, por ejemplo, en concentraciones en el producto de pienso final que ofrecen una dosis diaria de entre aproximadamente 2x103 UFC/g de pienso y aproximadamente 2x10” UFC/g de pienso, adecuadamente entre aproximadamente 2x106 y aproximadamente 1x1010, adecuadamente entre aproximadamente 3,75x107 UFC/g de pienso y aproximadamente 1x1010 UFC/g de pienso.
Preferentemente, el componente basado enBacillusserá térmicamente estable al tratamiento térmico hasta aproximadamente 70 °C; hasta aproximadamente 85 °C; o hasta aproximadamente 95 °C. El tratamiento térmico se puede realizar desde aproximadamente 30 segundos hasta varios minutos. El término "térmicamente estable" significa que al menos aproximadamente el 50 % de componente basado enBacillusque estaba presente/activo antes del calentamiento hasta la temperatura especificada está todavía presente/activo después de que se enfríe hasta temperatura ambiente. En una realización particularmente preferida, el componente basado enBacillusse homogeneiza para producir un polvo.
Alternativamente, el componente basado enBacillusse formula en gránulos como se describe en el documento de patente WO2007/044968 (denominados gránulos TPT).
En otra realización preferida, cuando la composición de aditivo para piensos se formula en gránulos, los gránulos comprenden una sal de barrera hidratada cubierta sobre el núcleo de proteína. La ventaja de dicho recubrimiento de sal es termotolerancia mejorada, mejora de la estabilidad durante el almacenamiento y protección contra otros aditivos para piensos que de otro modo tienen un efecto adverso sobre la al menos una proteasa y/o DFM que comprende una o más cepas bacterianas. Preferentemente, la sal usada para el recubrimiento de sal tiene una actividad del agua superior a 0,25 o humedad constante superior al 60 % a 20 °C. Preferentemente, el recubrimiento de sal comprende Na2SO4.
El pienso que contiene el componente basado enBacillusse puede producir usando un proceso de granulación de piensos. Opcionalmente, la etapa de granulación puede incluir un tratamiento con vapor de agua, o etapa de acondicionamiento, antes de la formación de los gránulos. La mezcla que comprende el polvo se puede disponer en un acondicionador, por ejemplo, una mezcladora con inyección de vapor de agua. La mezcla se calienta en el acondicionador hasta una temperatura especificada, tal como desde 60-100 °C, temperaturas típicas serían 70 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C o 95 °C. El tiempo de residencia puede variar de segundos a minutos e incluso horas. Tal como 5 segundos, 10 segundos, 15 segundos, 30 segundos, 1 minutos 2 minutos., 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 30 minutos y 1 hora.
Con respecto al gránulo, al menos un recubrimiento puede comprender un material hidratante de la humedad que constituye al menos 55 % p/p del gránulo; y/o al menos un recubrimiento puede comprender dos recubrimientos. Los dos recubrimientos pueden ser un recubrimiento hidratante de la humedad y un recubrimiento de barrera a la humedad. En algunas realizaciones, el recubrimiento hidratante de la humedad puede ser entre el 25 % y el 60 % p/p del gránulo y el recubrimiento de barrera a la humedad puede ser entre el 2 % y el 15 % p/p del gránulo. El recubrimiento hidratante de la humedad se puede seleccionar de sales inorgánicas, sacarosa, almidón y maltodextrina y el recubrimiento de barrera a la humedad se puede seleccionar de polímeros, gomas, suero de leche y almidón.
El gránulo se puede producir usando un proceso de granulación de piensos y el proceso de pretratamiento de piensos se puede realizar entre 70 °C y 95 °C durante hasta varios minutos, tal como entre 85 °C y 95 °C.
El componente basado enBacillusse puede formular en un gránulo para el pienso para animales que comprende: un núcleo; un agente activo, reteniendo el agente activo del gránulo al menos el 80 % de la actividad después del almacenamiento y después de un proceso de granulación calentada con vapor de agua, donde el gránulo es un ingrediente; un recubrimiento de barrera a la humedad; y un recubrimiento hidratante de la humedad que es al menos 25 % p/p del gránulo, teniendo el gránulo una actividad del agua inferior a 0,5 antes del proceso de granulación calentada con vapor de agua.
El gránulo puede tener un recubrimiento de barrera a la humedad seleccionado de polímeros y gomas y el material hidratante de la humedad puede ser una sal inorgánica. El recubrimiento hidratante de la humedad puede ser entre el 25 % y el 45 % p/p del gránulo y el recubrimiento de barrera a la humedad puede ser entre el 2 % y el 10 % p/p del gránulo.
Un gránulo se puede producir usando un proceso de granulación calentado con vapor de agua que se puede realizar entre 85 °C y 95 °C durante hasta varios minutos.
Alternativamente, la composición está en una formulación líquida adecuada para consumo, preferentemente dicho consumo líquido contiene uno o más de los siguientes: un tampón, sal, sorbitol y/o glicerol.
Por tanto, la composición de aditivo para piensos se puede formular aplicando, por ejemplo, pulverizando, el componente basado enBacillussobre un sustrato de vehículo, tal como, por ejemplo, trigo molido.
En una realización, dicha composición de aditivo para piensos que comprende un componente basado enBacilluscomo se describe en el presente documento se puede formular como una premezcla. A modo de ejemplo solo, la premezcla puede comprender uno o más componentes de piensos, tales como uno o más minerales y/o una o más vitaminas.
Alternativamente, la composición está en una formulación líquida adecuada para consumo, preferentemente dicho consumo líquido contiene uno o más de los siguientes: un tampón, sal, sorbitol y/o glicerol.
Por tanto, la composición de aditivo para piensos se puede formular aplicando, por ejemplo, pulverizando, del componente basado enBacillussobre un sustrato de vehículo, tal como, por ejemplo, trigo molido.
En una realización, dicho componente basado enBacilluscomo se describe en el presente documento se puede formular como una premezcla. A modo de ejemplo solo, la premezcla puede comprender uno o más componentes de piensos, tales como uno o más minerales y/o una o más vitaminas.
Se entenderá que el componente basado enBacillus,como se desvela en el presente documento, es adecuado para adición a cualquier material para piensos apropiado.
Como se usa en el presente documento, el término material de pienso se refiere al material de pienso básico que va a ser consumido por un animal. Se entenderá además que esto puede comprender, por ejemplo, al menos uno o más granos no procesados, y/o planta procesada y/o material animal, tal como harina de soja o harina de hueso.
Se entenderá por el experto que diferentes animales requieren diferentes piensos, e incluso el mismo animal puede requerir diferentes piensos, dependiendo del fin para el que se cría el animal.
Preferentemente, el pienso puede comprender materiales de pienso que comprenden maíz o grano, trigo, cebada, triticale, centeno, arroz, tapioca, sorgo, y/ o cualquiera de los subproductos, así como componentes ricos en proteína como harina de soja, harina de semilla de colza, harina de canola, harina de semilla de algodón, harina de semilla de girasol, harinas de semilla de subproductos animales y mezclas de los mismos. Más preferentemente, el pienso puede comprender grasas animales y/o aceites vegetales.
Opcionalmente, el pienso también puede contener minerales adicionales, tales como, por ejemplo, calcio y/o vitaminas adicionales. Preferentemente, el pienso es una mezcla de harina de maíz y soja.
El pienso se produce normalmente en molinos para pienso, en los que los materiales de partida se muelen primero hasta un tamaño de partículas adecuado y luego se mezclan con aditivos apropiados. El pienso se puede producir entonces como una papilla o gránulos; los últimos implican normalmente un método por el que la temperatura se eleva hasta un nivel objetivo y luego el pienso pasa a través de una boquilla para producir gránulos de un tamaño particular. Los gránulos se dejan enfriar. Posteriormente, se pueden añadir aditivos líquidos, tales como grasa y enzima. La producción de pienso también puede implicar una etapa adicional que incluye extrusión o expansión antes de la granulación, en particular, por técnicas adecuadas que pueden incluir al menos el uso de vapor de agua.
El pienso puede ser un pienso para un animal monogástrico, tal como aves de corral (por ejemplo, pollo de engorde, gallina ponedora, reproductoras de pollos de engordes, pavo, pato, ganso, gallinas de agua), cerdos (de todas las categorías de edad), una mascota (por ejemplo, perros, gatos) o peces, preferentemente el pienso es para aves de corral.
El componente basado enBacillusdescrito en el presente documento se puede disponer encima del pienso para animales, es decir, alimentación superior. Alternativamente, el componente basado enBacillusdescrito en el presente documento se puede añadir a un líquido, tal como en el agua de beber del animal.
Como se usa en el presente documento, el término "contactado" se refiere a la aplicación indirecta o directa de un componente basado enBacilluscomo se describe en el presente documento a un producto (por ejemplo, el pienso).
Ejemplos de métodos de aplicación que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a, tratamiento del producto en un material que comprende el componente basado enBacillus,aplicación directa mezclando un componente basado enBacillusde composición de aditivo de alimento como se describe en el presente documento con el producto, pulverización de dicha composición de aditivo para piensos sobre la superficie del producto o inmersión del producto en un preparado de la composición de aditivo para piensos. En una realización, un componente basado enBacillusde composición de aditivo para piensos como se describe en el presente documento se mezcla preferentemente con el producto (por ejemplo, el pienso). Alternativamente, la composición de aditivo para piensos se puede incluir en la emulsión o ingredientes crudos de un pienso. Esto permite a la composición conferir un beneficio en el rendimiento.
Un método de preparación del componente basado enBacillustambién puede comprender la etapa adicional de granular el polvo. El polvo se puede mezclar con otros componentes conocidos en la técnica. El polvo, o mezcla que comprende el polvo, puede ser forzada a pasar a través de una boquilla y las hebras resultantes se cortan en gránulos adecuados de longitud variable.
Opcionalmente, la etapa de granulación puede incluir un tratamiento con vapor de agua, o etapa de acondicionamiento, antes de la formación de los gránulos. La mezcla que comprende el polvo se puede disponer en un acondicionador, por ejemplo, una mezcladora con inyección de vapor de agua. La mezcla se calienta en el acondicionador hasta una temperatura especificada, tal como desde 60-100 °C, temperaturas típicas serían 70 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C o 95 °C. El tiempo de residencia puede variar de segundos a minutos e incluso horas. Tal como 5 segundos, 10 segundos, 15 segundos, 30 segundos, 1 minuto, 2 minutos, 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 30 minutos y 1 hora.
Se entenderá por el experto que diferentes animales requieren diferentes piensos, e incluso el mismo animal puede requerir diferentes piensos, dependiendo del fin para el que se cría el animal.
Opcionalmente, el pienso también puede contener minerales adicionales, tales como, por ejemplo, calcio y/o vitaminas adicionales. En algunas realizaciones, el pienso es una mezcla de harina de maíz y soja.
El pienso se produce normalmente en molinos para pienso, en los que los materiales de partida se muelen primero hasta un tamaño de partículas adecuado y luego se mezclan con aditivos apropiados. El pienso se puede producir entonces como una papilla o gránulos; los últimos implican normalmente un método por el que la temperatura se eleva hasta un nivel objetivo y luego el pienso pasa a través de una boquilla para producir gránulos de un tamaño particular. Los gránulos se dejan enfriar. Posteriormente, se pueden añadir aditivos líquidos, tales como grasa y enzima. La producción de pienso también puede implicar una etapa adicional que incluye extrusión o expansión antes de la granulación, en particular, por técnicas adecuadas que pueden incluir al menos el uso de vapor de agua.
Como se indicó anteriormente, el componente basado enBacillusy/o un pienso que comprende el mismo se puede usar en cualquier formada adecuada. Se puede usar en forma de preparados sólidos o líquidos o alternativas de los mismos. Los ejemplos de preparados sólidos incluyen polvos, pastas, bolos, cápsulas, pellas, comprimidos, polvos y gránulos que pueden ser humectables, secados por pulverización o liofilizados. Los ejemplos de preparados líquidos incluyen, pero no se limitan a, disoluciones, suspensiones y emulsiones acuosas, orgánicas o acuosas-orgánicas.
En algunas aplicaciones, las composiciones de aditivo para piensos se pueden mezclar con pienso o administrar en el agua para beber.
Un componente basado enBacillus,que comprende mezclar un componente basado enBacilluscomo se describe en el presente documento con un vehículo, diluyente o excipiente para piensos aceptable, y (opcionalmente) envasado.
El pienso y/o componente basado enBacillusse pueden combinar con al menos un mineral y/o al menos una vitamina. Las composiciones así obtenidas se pueden denominar en el presente documento premezcla. El pienso puede comprender al menos 0,0001 % en peso de componente basado enBacillus.Adecuadamente, el pienso puede comprender al menos 0,0005 %; al menos 0,0010 %; al menos 0,0020 %; al menos 0,0025 %; al menos 0,0050 %; al menos 0,0100%; al menos 0,020 %; al menos 0,100 % al menos 0,200 %; al menos 0,250 %; al menos 0,500 % en peso del componente basado enBacillus.
Preferentemente, un alimento o componente basado enBacilluspuede comprender además al menos un vehículo fisiológicamente aceptable. El vehículo fisiológicamente aceptable se selecciona preferentemente de al menos uno de maltodextrina, caliza (carbonato cálcico), ciclodextrina, trigo o un componente de trigo, sacarosa, almidón, Na[2]SO[4], talco, PVA y mezclas de los mismos. En una realización adicional, el alimento o pienso puede comprender además un quelante de ion metálico. El quelante de ion metálico se puede seleccionar de EDTA o ácido cítrico.
En una realización, un componente basado enBacilluscomo se describe en el presente documento (tanto encapsulado como no) se puede formular con al menos un vehículo fisiológicamente aceptable seleccionado de al menos uno de maltodextrina, caliza (carbonato cálcico), ciclodextrina, trigo o un componente de trigo, sacarosa, almidón, Na2SO4, talco, PVA, sorbitol, benzoato, sorbato, glicerol, sacarosa, propilenglicol, 1,3-propanodiol, glucosa, parabenos, cloruro sódico, citrato, acetato, fosfato, calcio, metabisulfito, formiato y mezclas de los mismos.
En algunas realizaciones, un componente basado enBacilluscomo se describe en el presente documento estará en un vehículo fisiológicamente aceptable. Los vehículos adecuados pueden ser macromoléculas grandes lentamente metabolizadas, tales como proteínas, polipéptidos, liposomas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y partículas víricas inactivas. Se pueden usar sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, sales de ácidos minerales, tales como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos y sulfatos, o sales de ácidos orgánicos, tales como acetatos, propionatos, malonatos y benzoatos. Los vehículos farmacéuticamente aceptables en composiciones terapéuticas pueden contener además líquidos, tales como agua, solución salina, glicerol y etanol. Además, pueden estar presentes sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes o sustancias de tamponamiento del pH, en dichas composiciones. Dichos vehículos permiten formular las composiciones farmacéuticas como comprimidos, píldoras, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones y suspensiones, para ingestión por el paciente. Una vez formulados, se pueden administrar directamente al sujeto. Los sujetos que se va a tratar pueden ser animales.
EJEMPLO
A menos que se defina lo contrario en el presente documento, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente es entendido por un experto habitual en la técnica a la que pertenece la presente divulgación. Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2.a ED., John Wiley and Sons, New York (1994), y Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, N.Y. (1991) proporcionan a un experto un diccionario general de muchos de los términos usados con la presente divulgación.
La divulgación se define además en los siguientes ejemplos. Se debe entender que los Ejemplos, aunque indican ciertas realizaciones, se facilitan a modo de ilustración solo. A partir de la discusión anterior y los ejemplos, un experto en la técnica puede determinar características esenciales de la presente divulgación, y puede hacer diversos cambios y modificaciones para adaptarlas a los diversos usos y condiciones.
Los DFM que comprenden la cepa deBacillus2084 n.° de acceso NRRl B-50013 y la cepa deBacillus15A-P4 ATCC n.° de acceso 15 PTA-6507 están dentro del alcance de la invención. Todas las otras cepas deBacillusdescritas se proporcionan para un contexto útil.
Ejemplo 1
Cepas de Enterococcus cecorum y Bacillus
Se recogieron cincuenta y dos cepas deEnterococcus cecorumde colecciones de cultivo en América del Norte y Europa, como se resume en la Tabla 1 a continuación. Durante la recogida, se hizo énfasis en conseguir cepas deEnterococcus cecorumaisladas de lesiones extraintestinales y de brotes de espondilitis, lo que permitió la confianza de que las cepas probadas eran virulentas y capaces de causar la enfermedad.
Tabla 1. Cepas deEnterococcus cecorumusadas en este estudio
Se probó el potencial inhibidor de 11 cepas deBacillusen total. Estas incluyeron tanto cepas de DFM de patentes de DuPont como cepas aisladas deBacillusde productos de DFM de competidores, como se resume en la Tabla 2. Todas las cepas deBacillusprobadas se comercializan para su uso en la producción de aves de corral. Enviva® PRO, que está comercialmente disponible de Danisco A/S, es una combinación de la cepa deBacillus2084 n.° de acceso NRRl B-50013, la cepa deBacillusLSSAO1 n.° de acceso NRRL B-50104 y la cepa deBacillus 15A-P4 ATCC n.° de acceso PTA-6507 (como se enseña en el documento de patente US 7.754.469 B).
Tabla 2.B illDFM r n i
Todos los productos deBacillusno de DuPont se compraron, y se aislaron por triplicado de 3 lotes de producción separados. Todas las cepas se identificaron para garantizar que las cepas recuperadas coincidieran con las declaraciones de cepa en la etiqueta de producto. Los productos no de DuPont se probaron contra un subconjunto de 9 cepas aisladas de la colección completa deEnterococcus cecorum,como se indica en la Tabla 2 anteriormente.
Ejemplo 2
Producción de sobrenadantes sin células (CFS) y crecimiento de cepas de Enterococcus cecorum, Enterococcus avium y Enterococcus gallinarum
Se usa un bucle de inoculación para inocular un tubo de agitador de 30 ml con 10 ml de caldo de soja tríptico (TSB) de una reserva congelada deBacillus.El tubo se incuba en una estufa de incubación a 32 °C durante 24 horas y se agita a 130 para hacer crecer elBacillus.
Se comprobó la densidad óptica (DO) en un espectrómetro (longitud de onda 600 nm, absorbancia 0) después de incubar los matraces durante 18 horas. Se pipetearon 2 ml de TSB estéril en una cubeta para crear un blanco de control. Se creó una dilución de 10x deBacilluspipeteando 1,8 ml de TSB estéril y 0,2 ml de crecimiento de 18 h en cada cubeta. Las cubetas se cubrieron y se invirtieron para garantizar la mezcla minuciosa. Se determinó que la absorbancia de las diluciones deBacillusera entre 0,25 y 0,3 (se reincubaron muestras con lecturas de absorbancia inferiores a 0,25 hasta que la absorbancia alcanzó niveles aceptables).
El crecimiento deBacillusse transfirió de cada matraz a botellas estériles de centrifugadora de 250 ml y se centrifugaron a 10.000 rpm durante 10 minutos. Después del centrifugado, los sobrenadantes de cada tipo deBacillusse transfirieron a un filtro superior de botella Nalgene y se bombearon en tubos cónicos de 50 ml.
Se siguió este procedimiento para todas las cepas deBacillus.Entonces se congeló sobrenadante sin células (CFS) a -80 °C hasta que fuera necesario.
Se inocularon cepas deE. cecorumde cultivos de reserva ultracongelados en un caldo BHI (infusión de cerebro y corazón) y una placa de agar de BHI (para comprobar la pureza) y se incubaron durante la noche a 37 °C. Todas las cepas se subcultivaron al menos dos veces antes de la inclusión en el ensayo para garantizar la adaptación al medio de crecimiento.
Todos los ensayos se realizaron por duplicado para cada DFM basado enBacillusidentificado en la Tabla 2 anterior.
Se incubaron 20 ml de caldo BHI durante 1 hora antes del ensayo, para evitar el choque térmico para las células deEnterococcus cecorum.
En una placa de microtitulación tratada con UV de 96 pocillos con pocillos de fondo plano, el medio (caldo de BHI) y el CFS y el microorganismo diana se añadieron del siguiente modo:
• Control positivo: 200 pl de medio 2 pl de bacterias (1 %)
• Control negativo: 200 pl de medio
• Pocillo de ensayo de CFS: 180 pl de medio 20 pl de CFS 2 pl de bacterias (1 %)
• Pocillo de CFS negativo: 180 pl de medio 20 pl de CFS
Las placas se incubaron durante 14 horas a 37 °C en una máquina FlexStation para registrar la absorbancia, transfiriéndose los datos directamente a un ordenador para el análisis. Las mediciones se tomaron cada 15 minutos.
Los resultados se dan como el % de inhibición comparando el control a DO = 0,4(E. cecorumsolo) y tratados(E. cecorumincubado con CFS deBacillus).Con respecto a 42 cepas individuales, la inhibición promedio para cada una de las 3 cepas Enviva® PRO (componente basado enBacillus)fue >85 %, como se muestra en la Figura 1. Se determinó que >50 % de inhibición se considera aceptable y >75 % de inhibición se considera excelente. Inhibición superior al 100 % indica que la cepa aislada patógena ha sido lisada por elBacillus,en vez de simplemente inhibida.
La Tabla 3 muestra la inhibición promedio del crecimiento de 51 cepas deEnterococcus cecorumpor cepas Enviva® PRO. Todas las cepas fueron capaces de inhibir significativamente el crecimiento deEnterococcus cecorum,en comparación conE. cecorumincubado sin CFS deBacillus.La cepa más eficaz fue 15AP4 (componente basado enBacillus),con una inhibición promedio de 88,79 %, aunque las diferencias entre cepas no fueron estadísticamente significativas.
Tabla 3. Inhibición promedio de cepas deEnterococcus cecorumrecogidas de producción de aves de corral americanas y europeas por 3 cepas de DFM deBacillus(componente basado enBacillus)Cepas europeas Cepas americanas Todas las cepas
Inhibición EEM Inhibición EEM Inhibición EEM promedio, % promedio, % promedio, %
15AP4 88,27 2,887 89,03 3,086 88,79 2,30
BS2084 89,87 2,887 88,08 2,955 88,60 2,233
BS8 86,80 2,887 84,24 2,955 84,99 2,233
Valor de 0,7552 0,4898 0,4054
P
La Tabla 4 muestra la inhibición promedio del crecimiento de un subconjunto de 9 cepas deEnterococcus cecorumpor12cepas deBacillus.La cepa más eficaz fue BS2084 (componente basado enBacillus),con una inhibición promedio del 85,33 %. La cepa deBacillusmenos eficaz fue 2B2, con una inhibición promedio de -80,17%, que indica queEnterococcus cecorumcreció más rápido en presencia de CFS deBacillus(componente basado enBacillus),luego en su ausencia. Hubo diferencias significativas en la eficacia entre las cepas deBacillus.
Tabla 4. Inhibición promedio del crecimiento de 11 cepas deEnterococcus cecorumpor 11 cepas de DFM deBacillus15AP4 BS2084 BS8 CSl #11/1 #12/1 #10/4 #10B/1 #10B/4 2B1 2B2 11951-1 73,90 89,09 73,49 -23,50 47,98 31,67 36,26 - - 37,57 31,80 11957-3 102,15 102,39 99,83 97,67 -6,57 25,89 -11,83 52,68 -6,57 -55,86 -2,80 11960-1 93,12 88,99 74,47 83,30 -54,90 -5,51 32,99 94,25 51,11 -83,02 -50,94 12696M-1 32,17 49,62 67,50 99,12 -0,10 15,12 -15,19 100,36 73,90 -17,63 -6,77 C.34.19 89,79 77,34 75,19 99,35 -6,28 5,25 -25,09 94,81 53,57 -67,24 -40,41 D.42.11 98,69 99,40 99,30 86,33 -67,20 -35,45 -29,53 50,36 25,55 -54,36
128,06 E.59.56 50,60 84,74 71,20 86,33 -16,02 -6,04 -8,02 82,07 57,95 -87,93
146,62 15AP4 BS2084 BS8 CSl #11/1 #12/1 #10/4 #10B/1 #10B/4 2B1 2B2 F.68.19 89,38 83,21 78,16 79,76 -4,68 -9,61 -13,67 66,94 23,08 -41,97
121,79 G.75.17 100,99 93,22 97,43 79,76 -81,97 -9,07 -77,68 69,90 32,96 -35,45
138,92 Promedio1 81,20a 85,33a 81,84a 76,46a -21,04c 1,36bc -12,41bc 76,46a 38,94ab
32,09cd Error 8,176 5,168 4,365 12,771 13,391 6,883 11,287 6,861 8,948 20,559 11,624 estándar
1Valor de P = P<0,0001; a,b,c Valores en una fila sin superíndices comunes son significativamente diferentes a P<0,05
REFERENCIA: Verslyppe B, De Smet W, De Baets B, De Vos P, Dawyndt P 2014. StrainInfo introduces electronic passports for microorganisms. Syst Appl Microbiol. 37(1):42-50.
Los datos en la Tabla 5 demuestran la actividad antimicrobiana de CFS deB. amyloliquefacienssubsp.plantarum15AP4, BS8 y 2084 (componente basado enBacillus), contraEnterococcus gallinarumVTT E-97776T.
Tabla 5: Retrasoin vitrodel crecimiento de un cultivo deEnterococcus gallinarumVTT E-97776T inducido por CFS de m n n nB ill B ill m l li f i n.l n r m1 AP4 B 2 4.
Las Figuras 1 y 2 muestran la inhibición promedio para las cepas deE. cecorumrecogidas de producción de aves de corral americana europeas, respectivamente.
La Figura 3 representa datos de la cinética del crecimiento deE. cecorumcon/sin las cepas Enviva® PRO. AlgunosE. cecorumno son inhibidos completamente por los sobrenadantes deBacillus, es decir, un componente basado enBacillus.Al final del tiempo de incubación de 14 h, las concentraciones del patógeno son las mismas para las placas de control y tratadas, pero la fase de latencia se prolonga y se retrasa el crecimiento exponencial. Dado el tiempo de tránsito intestinal de las aves de corral, este tipo de resultado significaría (a pesar de la falta de inhibición global) que el componente basado enBacilluspodría prevenir la proliferación del patógeno durante su paso a través del intestino, reduciendo el riesgo de adherencia y translocación. Otras cepas son tanto retrasadas como inhibidas en el momento de tiempo de 14 h, como se demuestra en la Figura 4.
La Figura 5 muestra la actividad antimicrobiana de CFS deB. amyloliquefacienssubsp.plantarum15AP4, BS8 y 2084 (componente basado enBacillus)contraEnterococcus gallinarumVTT E-97776T expresada como el % de inhibición en el punto final exacto cuando la curva de patógeno de control alcanza DO 0,4
La Figura 6 muestra los perfiles de crecimiento deEnterococcus aviumE 84197 incubado o no con CFS deBacillus2084 (componente basado enBacillus).
La Figura 7 muestra la actividad antimicrobiana de CFS deBacillus amyloliquefaciensDSM7T,B. subtilisDSM10T yB. licheniformisDSM13T contra 10 cepas clínicas deEnterococcus cecorumaisladas del sistema de producción de aves de corral en los EE. UU. y en Bélgica, expresada como el % de inhibición en el punto final exacto cuando la curva de patógeno de control alcanza DO 0,4 (barras negras corresponden al % promedio de inhibición).
Trabajo previo ha mostrado que los pollos de engorde desarrollan septicemia entre las semanas 1-3 en producción como se observa en tanto la inhibición completa como los retrasos enE. cecorumque afectan la fase de crecimiento exponencial. La suplementación de pienso de aves de corral con el (los) DFM basado(s) enBacillusdescritos en el presente documento puede retrasar la colonización intestinal, adherencia y posterior invasión, lo que significa que las aves llegan al matadero con incidencia reducida de síntomas clínicos.
Estos datos son bastante convincentes en comparación con los intervalos de inhibición de otros patógenos que han sido probados. El efecto también parece bastante coherente en la variedad de cepas aisladas deE. cecorumprobadas, a pesar de una variación natural en la eficacia deBacillus.
Los resultadosin vitropresentados en el presente documento demuestran que la suplementación de aves de corral alimentadas con un componente basado enBacillusdescrito en el presente documento pueden ser muy eficaces en inhibir o retrasar todo o parte del crecimiento del patógeno emergente,E. cecorum, así como inhibir o retrasar el crecimiento deEnterococcus spp.en animales (como se demuestra en la Figura 5).
Ejemplo comparativo 3
Componentes basados en Bacillus para inhibir o retrasar el crecimiento de Enterococcus spp. en animales
Una cepa tipo se define en el "Código Internacional de Nomenclatura de Bacterias" como el "tipo de nomenclatura de la especie", y es el "punto de referencia" con el que se comparan todas las otras cepas para determinar si pertenecen a esa especie. La inclusión de cepas tipo de cada una de las especies bacterianas (véase la Tabla 6 a continuación) incluidas en este estudio permite una comparación del potencial inhibidor de cepas caracterizadas como "probióticas" frente a cepas que pertenecen a la misma especie, pero no se caracterizaron como "probióticas". La hipótesis aquí es que las propiedades probióticas son únicas para cepas específicas y las propiedades no se pueden transferir a ninguna otra cepa que pertenezca a la misma especie. Solo las cepas que han sido caracterizadas y evaluadas minuciosamente se pueden designar "probióticas". Las cepas tipo incluidas en este experimento son representativas de tres especies distintas deBacillusrelacionadas con las cepas aquí estudiadas. Su origen y una lista no exhaustiva de cepas equivalentes disponibles en otras colecciones de cultivo se presentan en la Tabla 6.
Tabla 6: Cepas tipo usadas en este estudio, su origen y lista no exhaustiva de equivalencias en otras colecciones de cultivo (adaptadas de Versl ppe et al., 2014; http://www.straininfo.net/
La actividad antimicrobiana de las tres cepas tipo se evaluó contra un conjunto de 10 cepas aisladas deEnterococcus cecorum(Tabla 7) como se describe previamente.
Tabla 7: Características de las cepas clínicas deEnterococcus cecorumoriginadas de la producción de aves de corral usada en este estudio.
Mercado Tema NúmeroOrigen de laOrigen biológico Fecha de Colección geográfico de cepacepa aisladaaislamiento
Los porcentajes de inhibición del crecimiento de diez cepas aisladas deEnterococcus cecorumpatógeno por cada uno de los CFS obtenidos de las 3 cepas tipo distintas se presentan en la Figura 7. A diferencia de las 3 cepas deB. amyloliquefaciensde Enviva Pro (15AP4; BS8 y 2084) (véase la Tabla 4 anterior), la cepa tipoB. amyloliquefaciensDSM7T no presentó actividad antimicrobiana contra los patógenos probados (Fig. 7). En este experimento, el CFS de la cepa tipo deB. amyloliquefaciens(DSM7T) promovió el crecimiento del patógeno y no fue capaz de inhibir ninguno de los patógenos probados. Este hallazgo soporta la especificidad por cepa de la propiedad antimicrobiana. Las declaraciones de probiótico para una cepa específica resultan de un enfoque de cribado científico que tiene como objetivo identificar esa cepa o cepa entre miles de cepas, que presentan naturaleza única y, por lo tanto, son capaces de proporcionar beneficios para el hospedador, así como valor económico.
Por lo tanto, fue sorprendente observar queB. licheniformisDSM13T presentó mayor actividad antimicrobiana (68,58 % en promedio) contra las cepas aisladas patógenas deE. cecorumen comparación con las cepas probióticas comerciales deB. licheniformisy #10/4 respectivamente 1,36 % y -12,41 % (Tabla 4). La cepa tipoB. subtilisDSM10T presentó un porcentaje de inhibición del 26 % en promedio que fue todavía mayor cuando se comparó con el porcentaje promedio presentado por la cepa probiótica comercialB. subtiliscepa #11/1 (-21 %) (Fig. 7 y Tabla 4).

Claims (6)

REIVINDICACIONES
1. Un microbiano de alimentación directa basado enBacilluspara su uso en un método de inhibición o retraso de todo o parte del crecimiento deEnterococcus cecorumpatógeno en un animal, en donde el microbiano de alimentación directa basado enBacillusse selecciona de la cepa deBacillus2084 n.° de acceso NRR1 B-50013 y la cepa deBacillus15A-P4 ATCC n.° de acceso 15 PTA-6507.
2. Un microbiano de alimentación directa basado enBacilluspara su uso según la reivindicación 1, en donde el animal es un animal monogástrico.
3. Un microbiano de alimentación directa basado enBacilluspara su uso según la reivindicación 1, en donde el animal es un animal multigástrico.
4. Un microbiano de alimentación directa basado enBacilluspara su uso según la reivindicación 2, en donde el animal monogástrico es aves de corral.
5. Un microbiano de alimentación directa basado enBacilluspara su uso según la reivindicación 1, en donde el microbiano de alimentación directa basado enBacillusse administra directamente a un animal a través del pienso para animales tanto en el pienso como encima del pienso o en un líquido.
6. Un microbiano de alimentación directa basado enBacilluspara su uso según la reivindicación 5, en donde el microbiano de alimentación directa basado enBacillusse administra al animal en una forma seleccionada del grupo que consiste en un pienso, una composición de aditivo para piensos, una premezcla o en un líquido.
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