JP7248325B2 - 腫瘍および/または癌の処置のための医薬のための単離された組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、医薬組成物、およびそれらの使用 - Google Patents
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Description
(1) 単離された組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスであって、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスはTK遺伝子およびVGF遺伝子を機能欠損し、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスのゲノムは外来性のIL-21遺伝子をインテグレーションされ、IL-21遺伝子は腫瘍細胞内で発現されることができる。
(2) (1)に従う組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスであって、TK遺伝子は、外来性のヌクレオチド配列が挿入されることによって機能的に欠損する。
(3) (1)に従う組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスであって、外来性のIL-21遺伝子はTK遺伝子内に挿入され、それによってTK遺伝子の機能欠損を引き起こす。
(4) (1)に従う組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスであって、VGF遺伝子はノックアウトされることまたは外来性のヌクレオチド配列を挿入されることによって機能欠損する。
(5) (1)に従う組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスであって、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスはWyeth株またはWR株である。
(6) (1)に従う組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスであって、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスのゲノムはさらに外来性のスクリーニング遺伝子をインテグレーションされ、外来性のスクリーニング遺伝子はgpt遺伝子および/またはLacZ遺伝子を包含するが、蛍光蛋白質遺伝子を包含しない。
(7) (1)または(5)に従う組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスであって、外来性のIL-21遺伝子はマウスまたはヒトに由来する。
(8) 医薬組成物であって、医薬組成物は活性成分としての(1)~(7)のいずれか1つに従う組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスと薬学的に許容される添加剤とを含む。
(9) (8)に従う医薬組成物であって、医薬組成物は組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを1×105~5×109pfu/日の用量で含む。
(10) (8)に従う医薬組成物であって、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは腫瘍内注射または静脈内投与によって投与される。
(11) (1)~(7)のいずれか1つに従う組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを調製するためのベクターであって、ベクターはプロモーターのコントロール下の外来性のIL-21遺伝子を含む。
(12) (11)に従うベクターを含む宿主細胞。
(13) 腫瘍および/または癌の処置のための医薬の調製のための、(1)から(7)のいずれか1つに従う組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの使用。
(14) (13)に従う使用であって、腫瘍および/または癌は肺癌、黒色腫、頭頸部癌、肝臓癌、脳腫瘍、結腸直腸癌、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頚癌、リンパ腫、胃癌、食道癌、腎臓癌、前立腺癌、膵臓癌、白血病、骨癌、精巣癌を包含する。
(15) 腫瘍および/または癌を処置するための方法であって、(1)~(7)のいずれか1つに従う組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを腫瘍および/または癌患者に投与することを含む。
(16) (15)に従う方法であって、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、1×105~5×109pfu/日の用量で、1日1回、連続1~6日に渡って投与される。
(17) (15)に従う方法であって、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは腫瘍内注射または静脈内投与によって投与される。
(18) (15)に従う方法であって、腫瘍および/または癌は肺癌、黒色腫、頭頸部癌、肝臓癌、脳腫瘍、結腸直腸癌、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頚癌、リンパ腫、胃癌、食道癌、腎臓癌、前立腺癌、膵臓癌、白血病、骨癌、精巣癌を包含する。
本願において用いられる用語「腫瘍」、「癌」、「腫瘍細胞」、および「癌細胞」は当分野において通常認識される意味を包摂する。
本願において用いられる用語「腫瘍溶解性ウイルス」は、腫瘍細胞内で選択的に複製し、腫瘍細胞を溶解し得るウイルスを言う。
本願において用いられる用語「治療有効量」は、検出測定可能な治療もしくは阻害効果を見せるかまたは抗腫瘍応答を誘起するために有用な機能性薬剤または医薬組成物の量を言う。効果は当分野において公知のいずれかのアッセイ方法によって検出測定され得る。
本願において用いられる用語「投与する」または「投与」は、化合物、複合物、または組成物(ウイルスおよび細胞を包含する)を対象に提供することを言う。
本願において用いられる用語「患者」はヒトまたは非ヒト生物を言う。それゆえに、本願に記載される方法および組成物はヒトおよび獣類の疾患両方に適用可能である。ある種の実施形態では、患者は腫瘍を有する。いくつかのケースでは、患者は1つ以上の型の癌に同時に罹患し得る。
本願において用いられる用語「相乗効果」は、それらの単体の効果の合計よりも多大な効果を生ずる2つ以上の薬剤の間に生起する効果を言う。
本願において用いられる用語「pfu」または「プラーク形成単位」はプラークを形成するウイルス数を言う。
本願において用いられる用語「MOI」または「多重感染度」は、ウイルス数および細胞数の間の比、すなわち細胞あたりのウイルス感染を開始するために用いられるウイルス粒子数を言う。MOI=pfu/細胞、すなわち細胞数×MOI=トータルのPFU。
(A) 第1の医薬組成物が本発明の組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを第1の薬学的に許容される担体中に含む、第1の医薬組成物と、
(B) 第2の医薬組成物がNK細胞を第2の薬学的に許容される担体中に含む、第2の医薬組成物と、
を含む治療薬をもまた提供する。
1) 本開示に従う組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを腫瘍および/または癌患者に投与すること、
2) 組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの投与の18~72時間(例えば、20~70時間、22~48時間、24~48時間、30~48時間など)後に、本開示に従うNK細胞を腫瘍および/または癌患者に投与すること。
杭州市第一人民医院に由来するFaDuヒト頭頸部癌細胞を例外として、残りの腫瘍細胞は中国典型培養物保蔵センターおよびATCCに由来する。細胞はマッコイ5A+10%FBSおよびMEM+10%FBSの正常な環境において培養した。マッコイ5AおよびMEMはGIBCOから購入した。ウシ胎児血清FBSはSIGMAから購入した。
実験に用いたNK細胞の起源は次の通りである。
各例に用いたNK細胞は杭州康万達医薬科技有限公司によって培養および凍結保存されたヒトNK細胞であった。ヒトNK細胞は次のプロセスによって調製した。当分野の通常用いられる技術として、採血針を尺骨静脈に挿入して、免疫細胞PBMCの抽出のために健康人の末梢静脈血を採集した。放射線照射済みK562フィーダー細胞(杭州鼎云生物技術有限公司から購入)を用いて、自家血漿培養によってNK細胞を拡大し、NK細胞は最高で90%の最終純度、最高で90%の生存可能性、および最高で85%のインビトロ腫瘍細胞殺傷率を有した。
コントロールウイルスとしての腫瘍溶解性ワクシニアウイルスddvv-RFPは公知であり、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスWR株に属する(例えば“X Song,et al.T-cell Engager-armed Oncolytic Vaccinia Virus Significantly Enhances Antitumor TherapyMolecular Therapy.(2014);22 1,102-111”を参照)。腫瘍溶解性ワクシニアウイルスddvv-RFPはTK遺伝子およびVGF遺伝子両方を機能欠損し、外来性の赤色蛍光蛋白質(RFP)遺伝子を保有する。RFP遺伝子はスクリーニング/レポーターの役割のみを発揮するので、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスddvv-RFPの抗腫瘍機能はTK遺伝子およびVGF遺伝子を機能欠損する腫瘍溶解性ワクシニアウイルスと実質的に同等である。腫瘍溶解性ワクシニアウイルスddvv-RFPは当分野の従来技術を用いるVSC20ワクシニアウイルスの遺伝子改変によってもまた得られ得る。VSC20ワクシニアウイルスはVGF遺伝子を欠失するワクシニアウイルスである。VSC20ワクシニアウイルスの調製方法は、“McCart,JA,et al.Systemic cancer therapy with a tumor-selective vaccinia virus mutant lacking thymidine kinase and vaccinia growth factor genes.Cancer Res(2001)61: 8751-8757”を参照。遺伝子改変は、外来性のDsRed遺伝子(すなわちRFP遺伝子)を制御するための人工の合成ワクシニアウイルス初期/後期プロモーターpSELの使用と、インビトロ細胞内組換え技術を用いるワクシニアウイルスVSC20株のTK遺伝子領域内へのDsRed遺伝子の挿入とを包含し、それによって腫瘍溶解性ワクシニアウイルスddvv-RFPを構築する。その産生および精製は下に記載される調製例2に従って行われ得る。
6ウェル細胞培養プレート(ウェルあたり2ml培養体積)、24ウェル細胞培養プレート(ウェルあたり500μl培養体積)、96ウェル細胞培養プレート(ウェルあたり200μl培養体積)は全てコーニング社から入手可能である。
MTTアッセイ:10μlのMTT溶液(5mg/ml)を各ウェルの細胞に追加し、それから細胞をインキュベータ内で、37℃で4時間に渡ってインキュベーションし、培養培地を吸って捨て、150μlのDMSOを各ウェルに追加し、それからシェーカー上で低速で10分に渡って振盪し、結晶物が充分に溶解することを許し、マイクロプレートリーダーを用いて490nmの吸光度値(OD490)を測定した。阻害率の計算式:細胞増殖阻害率(IR%)=1-(OD490試験産物-OD490ブランク)/(OD490負のコントロール-OD490ブランク)×100%。
トリパンブルー染色法を用いる細胞計数:細胞をPBSによって洗浄し、トリプシンを用いて消化し、それから細胞をPBSに懸濁した。懸濁液に、0.04%(w/v)の終濃度でトリパンブルー溶液を追加した。それから、細胞計数を顕微鏡下で行った。これの間に、死細胞は青く染色され、生細胞はいずれかの色なしで透明に見えた。生細胞数を最終的なデータとして用いた。
FBS:ウシ胎児血清
PSG:ペニシリン-ストレプトマイシン-グルタミン
PBMC:末梢血単核細胞
RFP:赤色蛍光蛋白質
TIL:腫瘍浸潤リンパ球
DMSO:ジメチルスルホキシド
次のプロセスは図2に見られ得る。
それぞれヒトIL-21およびネズミIL-21遺伝子を保有するように、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの2つの株を構築した。これらはそれぞれDDvv-hIL21およびDDvv-mIL21と呼ぶ。
1) NCBI遺伝子ライブラリー配列NM_001291041およびNM_021803に従って、トータルで2つのマウスIL21のDNA断片(mIL-21)およびヒトIL21のDNA断片(hIL-21)を遺伝子合成法によって合成した。具体的には、mIL-21は正常配列を有するマウス由来IL21断片(すなわち、Genbank番号NM_001291041のヌクレオチド配列の72~560bp断片)を含有する。その配列(配列番号1)を下に示す。
1) 良好な成長状態のCV1細胞を選択し、6ウェルプレートに約4×105細胞/ウェルで広げ、次の日の細胞密度が80%~90%に達するようにさせた。
1) CV1細胞を60mmペトリ皿で培養した。80%コンフルに達したときに、1mlのウイルス希釈液を追加し、これは150μlのP0ウイルスを含有した。2時間の感染後に、3mlの1×gpt含有スクリーニング試薬を追加し、スクリーニングを行った。細胞変性を観察し、ウイルスを採集し、P1ウイルスと標識する。ウイルスゲノム抽出キットを用いてPCR検証のためにウイルス遺伝子を抽出した。
(1) 産生および精製
1) DDvv-mIL21のP5-1サンプルおよびDDvv-hIL21のP4-3サンプルの大量増幅50枚の150mmペトリ皿を用いて、Hu-143B細胞が約80%まで成長したときに、およそ2×104PFUの50μLの小スケール増幅したウイルスを各ペトリ皿に追加して細胞を感染させ、37℃かつ5%CO2で培養する。約2から3日の後に、細胞は顕微鏡下で丸く数珠状になることが観察され、いくつかの細胞はペトリ皿から剥離した。培養溶液/細胞を、セルスクレーパーを用いて採集し、-80℃冷凍庫に保存した。
1) 2つの6ウェルペトリ皿を用い、ウェルあたり約4×105個のHuTK-143B細胞を接種し、37℃の5%CO2インキュベータ内で一晩インキュベーションし、次の日の細胞量が80%~90%に接近するようにさせる。
B16細胞(マウス黒色腫細胞)、GL261細胞(マウスグリオーマ細胞)、LLC細胞(マウスルイス肺癌細胞)、CT-26細胞(マウス結腸癌細胞)、4T-1細胞(マウス乳癌細胞)を包含するマウス腫瘍細胞を、96ウェルプレートにウェルあたり5000細胞で広げ、一晩培養して壁に接着するようにさせた。細胞を上の方法によって調製された1MOIのDDvv-mIL21ウイルスに感染させ、腫瘍細胞のアポトーシスを、24時間、48時間、および60時間後に(LLC細胞、GL261細胞)、または24時間、48時間、および72時間後に(B16細胞、CT-26細胞、4T-1細胞)、MTTによって検出測定した(n=3。2~3回の繰り返し実験)。この試験のコントロール群は負のコントロール群(ウイルス感染なし)、組換え体マウス由来IL-21蛋白質(rmIL-21。R&Dシステムズから購入)、および正のコントロール群(1μMパクリタキセル。北京双鷺薬業から購入)であり、各実験群およびコントロール群について3つのデュプリケートウェルを設け、細胞殺傷率は負のコントロール群に対する実験群の比%であった。結果は、DDvv-mIL21ウイルスの殺傷率が60時間または72時間後に種々の腫瘍細胞に対して60%よりも多くを達成するということを示した。それらの中でも、CT-26および4T1細胞に対するDDvv-mIL21ウイルスの殺傷率は24時間の感染後に70%に達した(図6参照)。
B16細胞、CT26細胞、4T1細胞、LLC細胞、およびGL261細胞を96ウェルプレートにウェルあたり5000細胞で広げた。これらを、上の方法によって調製した0.002MOI、0.02MOI、0.2MOI、1MOI、2MOIのDDvv-mIL21ウイルスを用いて72時間に渡って感染させ、それから細胞を細胞殺傷についてMTT試薬を用いて試験し、異なる腫瘍細胞に対するDDvv-mIL21組換え体ワクシニアウイルスの殺傷効果の半数致死用量(IC50値)を計算した(n=3。1回の実験)。結果は、B16細胞、CT26細胞、4T1細胞、LLC細胞、およびGL261細胞に対する組換え体ワクシニアウイルスのIC50がそれぞれ0.232MOI、0.216MOI、0.07MOI、0.304MOI、および0.227MOIであるということを示した(図7参照)。異なる腫瘍細胞に対する本発明の組換え体ワクシニアウイルスDDvv-mIL21のIC50値は低く(0.3MOIよりも小さいかまたはおよそ等しい)、それは医薬利用の良好な見込みを有するということが分かる。
A549(ヒト非小細胞肺癌細胞)、SKOV3(ヒト卵巣腺癌細胞)、Hela(ヒト子宮頚癌細胞)、U251(ヒト神経膠細胞腫細胞)を96ウェルプレートにウェルあたり5000細胞で広げ、一晩の培養および壁への接着後に、細胞を上の方法によって調製された1MOIのDDvv-hIL21ウイルスに感染させた。24時間、48時間、および72時間後に、MTTアッセイを用いて腫瘍細胞アポトーシスを検出測定した(n=3。3回の繰り返し実験)。この試験のコントロール群は、負のコントロール群(ウイルス感染なし)、組換え体ヒト由来IL-21蛋白質(rhIL-21。R&Dシステムズから購入)、および正のコントロール群(1μMパクリタキセル)であった。各実験群および各コントロール群について3つのデュプリケートウェルを設け、細胞殺傷率は負のコントロール群に対する実験群の比%値であった。結果は、Hela、A549、SKVO3、U251細胞に対する組換え体ウイルスの殺傷効果が時間依存的であり、経時的に強化されるということを示した(図8参照)。加えて、結果は、DDvv-hIL21ウイルスが各腫瘍細胞に対して48時間後には60%よりも多くの殺傷率を、72時間後には70%よりも多くの殺傷率を有するということをもまた示した。
A549、HepG2(ヒト肝臓癌細胞)、Hela、HT29(ヒト結腸直腸癌細胞)、SKOV3(ヒト卵巣腺癌細胞)、PANC1(ヒト膵臓癌細胞)、SKHEP-1(ヒト肝臓癌細胞)、FaDu(ヒト咽頭扁平上皮癌細胞)を96ウェルプレートにウェルあたり5000細胞で広げた。細胞を、3倍段階希釈のMOIの上の方法によって調製されたDDvv-hIL21ウイルスに感染させ、その結果、DDvv-hIL21ウイルスのMOI濃度は0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10であった。感染の48時間後に、MTT試薬を用いて細胞殺傷を検出測定し、異なる腫瘍細胞に対するウイルスの殺傷のIC50値を計算した(n=3。1回の実験)。この研究の処置群およびコントロール群のそれぞれについては3つのデュプリケートウェルを設けた。結果は、種々の腫瘍細胞に対する組換え体ワクシニアウイルスの殺傷のIC50値が0.05および0.4MOIの間であり、これらは全て相対的に低いことを示した(図9参照)。本発明の組換え体ワクシニアウイルスDDvv-hIL21は医薬利用の良好な見込みを有することが分かる。
腫瘍を持つ免疫健康マウスの構築:対数増殖期のB16細胞を用い、各C57BL/6マウス(北京維通力華実験動物センター)の後ろ足背側に200,000細胞を皮下接種して、腫瘍成長を観察した。腫瘍体積が約100~200mm3と測定されたときに、投与を開始した。マウスを、それぞれ上の方法によって調製された5×106pfu(低用量)、1×107pfu(高用量)のDDvv-mIL21を含有する100μlのPBSおよびPBSの腫瘍内投与によって、群あたり3匹のマウスで処置した。マウスの腫瘍サイズおよび体重を3日毎に測定した。結果は、組換え体ウイルスDDvv-mIL21が腫瘍成長を有効に阻害し得、用量依存的であるということを示した(図10A)。投与後の第9日には、各投与群のT/C(腫瘍抑制有効性。つまり、コントロール群の腫瘍サイズに対する投与群の腫瘍サイズのパーセンテージ比。これは値が<40%であるときに有効である)は40%よりも小さかった(図10B)。マウスを第12日に屠殺し、腫瘍を除去して腫瘍重量を検出測定した。これもまた類似の結果を示した(図10C)。
対数増殖期のB16細胞を用いた。各C57/Bl6マウスの後ろ足背側に200,000細胞を皮下接種した。腫瘍成長を観察した。腫瘍体積が約100~200mm3と測定されたときに、投与を開始した。マウスを、それぞれ5×106pfu(低用量)、1×107pfu(高用量)の上の方法によって調製されたDDvv-mIL21を含有する100μlのPBSおよびPBSの腫瘍内投与によって、群あたり3匹のマウスで処置した。マウスを2週後に屠殺して脾臓および腫瘍組織を採集し、脾臓のPBMCおよび腫瘍組織の腫瘍細胞を抽出し、CD8+T細胞(CD3+CD8+)(抗体:抗マウスCD3、抗マウスCD8a、eBioscience)およびCD4+T細胞(CD3+CD4+)(抗体:抗マウスCD4、eBioscience)を、フローサイトメトリーを用いて検出測定した。結果は、組換え体ウイルスDDvv-mIL21を与えられたマウスの脾臓PBMC中のCD8+T細胞およびCD4+T細胞の割合がPBS群と比較して有意に増大するということを示した(図11A~B)。同時に、腫瘍組織の免疫細胞浸潤の分析は、DDvv-mIL2高用量群のCD8+T細胞およびCD4+T細胞(TIL)の割合がPBS群に対して相対的に増大するということを明らかにした(図11C~D)。
対数増殖期のLLC細胞を用い、各C57BL/6マウスの後ろ足背側に100万細胞を皮下接種して、腫瘍成長を観察した。腫瘍体積が大体100~200mm3であるときに、投与を開始した。マウスを、それぞれ1×106pfu(低用量)、1×107pfu(高用量)の上の方法によって調製されたDDvv-mIL21を含有する100μlのPBSまたはコントロール群としての100μlのPBSの腫瘍内投与によって、群あたり5匹のマウスで処置した。各群の腫瘍サイズおよび体重を3日毎に測定した。結果は、組換え体ウイルスDDvv-mIL21がLLC腫瘍の成長を用量依存的な様式で有効に阻害し得るということを示した(図12A)。投与後の第9日に、高用量投与群のT/Cは40%よりも小さかった(図12B)。
SK-HEP-1細胞を24ウェル培養プレートに30%コンフルエントで播種し、37℃かつ5%CO2で24時間に渡ってMEM+10%FBS環境においてインキュベーションした。MOI=0.15の上の方法によって調製されたDDvv-hIL21ウイルスをDMEM血清不含環境において追加した。6時間に渡って感染させた後で、MEM+10%FBSを培地交換のために追加し、37℃かつ5%CO2で24時間に渡って培養した。それから、新しいMEM+10%FBSを培地交換のために追加し、NK細胞を追加し(エフェクター対標的細胞比NK:SK-HEP-1=5:1)、48時間に渡ってインキュベーションし続け、死細胞および破片を洗い落とした。残りのSK-HEP-1生細胞をトリパンブルー染色によって計数した。実験群はDDvv-hIL21+NK群であった。実験では、SK-HEP-1細胞の1つの群はウイルスおよびNKを追加せず、ブランク群とした。1つの群はDDvv-hIL21ウイルスを対応する時点で追加したが、ただしNKは追加せず、DDvv-hIL21ウイルス群とした。1つの群はNKを対応する時点で追加したが、DDvv-hIL21ウイルスは追加せず、NK群とした。1つの群はNKを対応する時点で追加し、同時にヒトIL21組換え体蛋白質を50ng/mlの終濃度で追加したが、DDvv-hIL21ウイルスは追加せず、NK+IL21群とした。1つの群はウイルスおよびNKは追加しなかったが、ヒトIL21組換え体蛋白質は50ng/mlの終濃度で対応する時点で追加し、ブランク+IL21群とした。各群の実験は3回以上繰り返し、平均値を取って統計分析をした。
腫瘍を持つ薬剤性免疫低下マウスの構築:対数増殖期のB16細胞を用い、各C57BL/6マウスの後ろ足背側に200,000細胞を皮下接種して、腫瘍成長を観察した。腫瘍体積が大体80~150mm3と測定されたときに、実験の終わりまでの毎日30mg/kgのシクロスポリンの腹腔内注射を開始した。次の日に(すなわち、接種の10日後に)、マウスを、それぞれ1×105pfu(低用量)、1×106pfu(中用量)、1×107pfu(高用量)の上の方法によって調製されたDDvv-mIL21を含有する100μlのPBSおよび100μlのPBSの腫瘍内投与によって、群あたり5匹で処置した。腫瘍サイズおよび体重を3日毎に測定した。結果は、組換え体ウイルスDDvv-mIL21が腫瘍成長を有効に阻害し得、用量依存的であることを示した(図14A)。投与後の第9日(すなわち、接種後の第19日)には、中用量群および高用量群のT/C(有効腫瘍阻害率。つまり、コントロール群の腫瘍サイズに対する投与群の腫瘍サイズのパーセンテージ。これは、40%よりも低いときに、医薬が有効であるということを指示する)は40%よりも小さかった(図14B)。
対数増殖期のB16細胞を用いた。各C57BL/6マウスの後ろ足背側に200,000細胞を皮下接種した。腫瘍成長を観察した。腫瘍体積が大体80~150mm3と測定されたときに、実験の終わりまでの毎日30mg/kgのシクロスポリンの腹腔内注射を開始した。次の日に、マウスを、それぞれ1×106pfuの上の方法によって調製されたDDvv-mIL21、1×106pfuのDDvv-RFPを含有する100μlのPBS、および100μlのPBSの腫瘍内投与によって、群あたり3匹で処置した。各群の腫瘍サイズおよび体重を3日毎に測定した。結果は、DDvv-RFPと比較して、DDvv-mIL21が腫瘍成長を有効に阻害し得るということを示した(図15A)。投与後の第6日から、DDvv-mIL21群のT/Cは全て40%よりも小さかった(図15B)。実験後に、マウスを屠殺し、腫瘍組織を採集および秤量した。DDvv-mIL21群の腫瘍重量は有意に縮減された(図15C)。同時に、腫瘍組織のTIL(CD8+T細胞(CD3+CD8+)(抗体:抗マウスCD3、抗マウスCD8a、eBioscience)およびCD4+T細胞(CD3+CD4+)(抗体:抗マウスCD3、抗マウスCD4、eBioscience)を包含する)およびNK細胞(CD3-NK1.1+)(抗体:抗マウスNK1.1、eBioscience)の含量を、フローサイトメトリーによって検出測定した。結果は、DDvv-RFPおよびDDvv-mIL21の投与が腫瘍組織のTIL含量を有意に改善し得るということを示した。DDvv-RFP群と比較して、腫瘍TIL中のCD4+T細胞がDDvv-mIL21群では有意に増大しているということが示された(図16A~C)。
重度免疫不全NCGマウス(浙江省動物センターから得た)を用いて、マウスの後ろ足背側に500万個のHCT116細胞を皮下接種した。腫瘍成長を観察した。腫瘍体積が約80~150mm3と測定されたときに(接種後の約第7日に)、マウスを、それぞれ5×106pfuのDDvv-hIL21ウイルス、5×106pfuのコントロールワクシニアウイルスを含有する100μlのPBS、および100μlのPBSの腫瘍内投与によって、群あたり5匹のマウスで処置した。次の日から、各マウスの尾静脈に5×107個のNK細胞/日を投与し、投与を3日に渡って続け、3日に渡って止め、これを1サイクルとした。トータルで3サイクルのNK細胞を投与した。腫瘍サイズおよび体重をウイルス投与の始まりから2~5日毎に測定した。結果は、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスDDvv-RFPおよびDDvv-hIL21両方が腫瘍成長を有効に阻害し得、DDvv-hIL21がDDvv-RFPよりも良好な腫瘍抑制効果を示すということを示した(図17A)。DDvv-RFPおよびDDvv-hIL21群の両方は投与の12日後から40%よりも小さいT/Cを有した(図17B)。実験後に、マウスを屠殺し、腫瘍組織を採集した。定量PCRによって、腫瘍組織のワクシニアウイルスのA46R遺伝子の発現レベル(標的遺伝子のプライマー配列は5’-CAGGGAAACGGATGTATA-3’(配列番号8)および5’-TGTGTTACAGAATCATATAAGG-3’(配列番号9)であった)、IL-21遺伝子の発現レベル(標的遺伝子のプライマー配列は5’-CCAACTAAAGTCAGCAAATACAGG-3’(配列番号10)および5’-CTTTCTAGGAATTCTTTGGGTGG-3’(配列番号11)であった)、NK細胞のNKG2D遺伝子の発現レベル(標的遺伝子のプライマー配列は5’-GGCTTTTATCCACAAGAATCAAGATC-3’(配列番号12)および5’-GTGCACGTCTACCGCAGAGA-3’(配列番号13)であった)、IFN-γ遺伝子の発現レベル(標的遺伝子のプライマー配列は5’-AGTGTGGAGACCATCAAGGAAG-3’(配列番号14)および5’-GTATTGCTTTGCGTTGGACAT-3’(配列番号15)であった)を検出測定した。ハウスキーピング遺伝子GAPDHを内部参照として用いた(標的遺伝子のプライマー配列は5’-GGTCTCCTCTGACTTCAACA-3’(配列番号16)および5’-AGCCAAATTCGTTGTCATAC-3’(配列番号17)であった)。標的遺伝子の発現量はpg/GAPDHのμgとする。結果は、腫瘍内のDDvv-hIL21腫瘍溶解性ウイルスの複製がコントロールワクシニアウイルスDDvv-RFPと有意には異ならないということを示し(図18A)、IL21の発現は、腫瘍組織内のDDvv-hIL21腫瘍溶解性ウイルスの存在をさらに検証した(図18B)。DDvv-RFPウイルスを投与されたコントロール群と比較して、腫瘍のNK含量はDDvv-hIL21腫瘍溶解性ウイルスを投与された群では有意に増大し(図18C)、免疫因子INF-γの発現もまた増大する(図18D)ということが見いだされた。
対数増殖期のB16細胞を用いた。各雌C57/Bl6マウスの後ろ足背側に200,000細胞を皮下接種した。腫瘍成長を観察した。腫瘍体積が約100~200mm3と測定されたときに、マウスに、上の方法によって調製された5×109pfuのDDvv-mIL21腫瘍溶解性ウイルスを含有する100μlのPBSを、トータル4匹のマウスで静脈内投与した。マウスを1週後に屠殺して心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、脳、卵巣、および腫瘍組織を採集した。PCR法を用いて種々の臓器におけるワクシニアウイルスの分布を検出測定した。具体的には、各組織および臓器におけるワクシニアウイルスのA46R遺伝子の発現量を腎臓におけるワクシニアウイルスのA46R遺伝子の発現量と比較した(標的遺伝子のプライマー配列は5’-CAGGGAAACGGATGTATA-3’(配列番号8)および5’-TGTGTTACAGAATCATATAAGG-3’(配列番号9)であった)。結果は、投与されたDDvv-mIL21腫瘍溶解性ウイルスが主に腫瘍組織に分布するということを示した。DDvv-mIL21腫瘍溶解性ウイルスはそれらの中の1匹のマウスの卵巣組織においてもまた検出測定され、ウイルスは他の臓器では検出測定されなかった(図19)。
HepG2細胞を24ウェル培養プレートに30%コンフルエントで播種し、DMEM+10%FBS環境において37℃かつ5%CO2で24時間に渡ってインキュベーションした。DMEM血清不含環境において、MOI=0.027の上の方法によって調製されたDDvv-hIL21ウイルスを追加して細胞を6時間に渡って感染させ、それから溶液をDMEM+10%FBSに交換し、インキュベーションを37℃かつ5%CO2で18時間に渡って続けた。それから、液を新しいDMEM+10%FBSに交換し、NK細胞を追加し(エフェクター対標的細胞比NK:HepG2=3:1)、インキュベーションを48時間に渡って続け、死細胞および破片を洗い落とし、残りのHepG2生細胞をトリパンブルー染色によって計数した。この実験群はDDvv-hIL21+NK群である。実験では、HepG2細胞の1つの群はウイルスおよびNKを追加せず、ブランク(BK)群とした。1つの群はDDvv-hIL21ウイルスを対応する時点で追加したが、ただしNKは追加せず、DDvv-hIL21ウイルス群とした。1つの群はNKを対応する時点で追加したが、ただしDDvv-hIL21ウイルスは追加せず、NK群とした。1つの群はNKを対応する時点で追加し、同時にヒトIL21組換え体蛋白質を50ng/mlの終濃度で追加したが、ただしDDvv-hIL21ウイルスは追加せず、NK+IL21群とした。1つの群はウイルスおよびNKは追加しなかったが、ただしヒトIL21組換え体蛋白質を50ng/mlの終濃度で上のNK追加時点に対応する時点で追加し、ブランク+IL21群とした。上のコントロール群では、対応する時点で液を交換した。各群の実験は3回以上繰り返し、平均値を取って統計分析をした。
実験から、HCT116細胞に対するDDVV-RFPの殺傷用量は好適には約MOI=0.7であり、HCT116細胞に対するNK細胞の殺傷用量は好適にはエフェクター対標的細胞比NK:HCT116が約5:1であるということが決定された。
FaDu細胞を24ウェル培養プレートに30%コンフルエントで播種し、MEM+10%FBS環境において37℃かつ5%CO2で24時間に渡ってインキュベーションした。MEMの血清不含環境において、MOI=0.2の上の方法によって調製されたDDVV-hIL21またはDDVV-RFPを追加して6時間の感染を許し、それからMEM+10%FBS環境において37℃かつ5%CO2で18時間に渡ってさらにインキュベーションした。NK細胞(エフェクター対標的細胞比NK:FaDu=5:1)を爾後に追加し(培地は交換しなかった)、インキュベーションを48時間に渡って続けた。死細胞および破片を洗い落とした。残りのFaDu生細胞をトリパンブルー染色によって計数した。実験群はそれぞれDDVV-RFP+NK群およびDDVV-hIL21+NK群であった。実験では、FaDu細胞の1つの群はウイルスおよびNKを追加せず、ブランク群とした。1つの群はウイルスおよびNKを追加しなかったが、ヒトIL21組換え体蛋白質を50ng/mlの終濃度で上のNK追加時点に対応する時点で追加し、ブランク+IL21群とした。1つの群はDDVV-RFPのみを対応する時点で追加したが、ただしNKは追加せず、DDVV-RFP群とした。1つの群はDDVV-hIL21のみを対応する時点で追加したが、ただしNKは追加せず、DDVV-hIL21群とした。1つの群はNKを対応する時点で追加したが、ウイルスは追加せず、NK群とした。1つの群はNKを対応する時点で追加し、同時にヒトIL21組換え体蛋白質を50ng/mlの終濃度で追加したが、ただしウイルスを追加せず、NK+IL21群とした。1つの群はDDVV-RFPおよびNKを対応する時点で追加し、NKの追加と同時にヒトIL21組換え体蛋白質を50ng/mlの終濃度で追加し、DDVV-RFP+NK+IL21群とした。コントロール群では、対応する時点で対応する液交換操作をした。各群の実験は3回以上繰り返し、平均値を取って統計分析をした。
Claims (11)
- 組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスがTK遺伝子およびVGF遺伝子を機能欠損し、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスのゲノムが外来性のIL-21遺伝子をインテグレーションされ、IL-21遺伝子が腫瘍細胞内で発現されることができ、
前記組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスがWR株であり、
前記外来性のIL-21遺伝子がTK遺伝子内に挿入され、それにより、GenBankのNC_006998と付番されたワクシニアウイルス遺伝子の80962~81032bpに示されている配列断片が欠失された、
単離された組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルス。 - VGF遺伝子が、ノックアウトされることまたは外来性のヌクレオチド配列を挿入されることによって機能欠損する、請求項1に記載の組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルス。
- 組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスのゲノムがさらに外来性のスクリーニング遺伝子をインテグレーションされ、外来性のスクリーニング遺伝子がgpt遺伝子および/またはLacZ遺伝子を包含するが、蛍光蛋白質遺伝子を包含しない、請求項1に記載の組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルス。
- 外来性のIL-21遺伝子がマウスまたはヒトに由来する、請求項1に記載の組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルス。
- 医薬組成物が、活性成分としての請求項1~4のいずれか1項に記載の組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスと薬学的に許容される添加剤とを含む、医薬組成物。
- 医薬組成物が組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを1×105~5×109pfu/日の用量で含む、請求項5に記載の医薬組成物。
- 組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、それが腫瘍内注射または静脈内投与によって投与されるように製剤される、請求項5に記載の医薬組成物。
- ベクターがプロモーターのコントロール下の外来性のIL-21遺伝子を含む、請求項1~4のいずれか1項に記載の組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを調製するためのベクター。
- 請求項8に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 腫瘍および/または癌の処置のための医薬の調製のための、請求項1~4のいずれか1項に記載の組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの使用。
- 腫瘍および/または癌が肺癌、黒色腫、頭頸部癌、肝臓癌、脳腫瘍、結腸直腸癌、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頚癌、リンパ腫、胃癌、食道癌、腎臓癌、前立腺癌、膵臓癌、白血病、骨癌、精巣癌を包含する、請求項10に記載の使用。
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CN113846068A (zh) * | 2021-08-25 | 2021-12-28 | 居颂光 | 融合基因ril-7重组牛痘病毒及其在制备抗肿瘤药物中的应用 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2000073479A1 (en) | 1999-05-28 | 2000-12-07 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | A combined growth factor-deleted and thymidine kinase-deleted vaccinia virus vector |
JP2005530716A (ja) | 2002-03-27 | 2005-10-13 | アメリカ合衆国 | ヒトにおける癌の治療方法 |
WO2017043815A1 (en) | 2015-09-08 | 2017-03-16 | Sillajen, Inc. | Modified oncolytic vaccinia viruses expressing a cytokine and a car- boxylesterase and methods of use thereof |
JP2017511136A (ja) | 2014-04-01 | 2017-04-20 | クイーン マリー ユニバーシティ オブ ロンドン | 腫瘍崩壊ワクシニアウィルス |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009507853A (ja) * | 2005-09-07 | 2009-02-26 | ジェンネレックス インコーポレイティッド | Gm−csf発現ポックスウイルスを用いる転移性および/または全身播種性癌の全身処置 |
US20070077231A1 (en) * | 2005-09-30 | 2007-04-05 | Contag Christopher H | Immune effector cells pre-infected with oncolytic virus |
KR20160002971A (ko) * | 2013-04-18 | 2016-01-08 | 틸트 바이오세러퓨틱스 오이 | 향상된 입양 세포 치료 |
CA2990133A1 (en) * | 2015-06-19 | 2017-03-09 | Sillajen, Inc. | Compositions and methods for viral embolization |
ES2831080T5 (es) * | 2016-01-08 | 2023-10-30 | Replimune Ltd | Virus oncolítico modificado |
WO2018195552A1 (en) * | 2017-04-21 | 2018-10-25 | Sillajen, Inc. | Oncolytic vaccinia virus and checkpoint inhibitor combination therapy |
-
2017
- 2017-09-26 CN CN201710882027.1A patent/CN109554353B/zh active Active
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Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2000073479A1 (en) | 1999-05-28 | 2000-12-07 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | A combined growth factor-deleted and thymidine kinase-deleted vaccinia virus vector |
JP2005530716A (ja) | 2002-03-27 | 2005-10-13 | アメリカ合衆国 | ヒトにおける癌の治療方法 |
JP2017511136A (ja) | 2014-04-01 | 2017-04-20 | クイーン マリー ユニバーシティ オブ ロンドン | 腫瘍崩壊ワクシニアウィルス |
WO2017043815A1 (en) | 2015-09-08 | 2017-03-16 | Sillajen, Inc. | Modified oncolytic vaccinia viruses expressing a cytokine and a car- boxylesterase and methods of use thereof |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
Leonard, W. J. et al. ,IL-21 Signaling in Immunity,F1000Res,2016年,Vol. 5:F1000 Faculty Rev-224,pp. 1-10 |
McCart, J. A. et al.,Systemic cancer therapy with a tumor-selective vaccinia virus mutant lacking thymidine kinase and vaccinia growth factor genes,Cancer Res.,2001年,Vol. 61(24),pp. 8751-8757 |
Thorne, S. H. et al.,Rational strain selection and engineering creates a broad-spectrum, systemically effective oncolytic poxvirus, JX-963,J. Clin. Invest.,2007年,Vol. 117(11),pp. 3350-3358 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
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