JP2023071953A - 単離された組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスとnk細胞を含む治療薬、その使用およびそれを適用したキット - Google Patents
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Abstract
Description
のための医薬のための単離された組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、医薬組成物、
およびそれらの使用に関する。
胞を害さない型のウイルスである。感染した腫瘍細胞内で複製した後に、新たなウイルス
粒子を放出し、これが今度はそれらの周りの腫瘍細胞に感染し、さらに腫瘍溶解効果を行
使する。この直接的な腫瘍溶解効果に加えて、腫瘍溶解性ウイルスは、ウイルスそれ自体
および感染した腫瘍細胞に対する免疫応答を生ずるように体を有効に刺激し得る。腫瘍溶
解性ウイルスの抗腫瘍効果は、腫瘍細胞を選択的に殺傷することと、系統的な抗腫瘍免疫
応答を生ずるように体を誘導することとの両方によって達成されるということが分かる。
いだされ、腫瘍治療の分野におけるウイルスのポテンシャルを指示した。遺伝子テクノロ
ジーの発展によって、ウイルスゲノム構造はそれが腫瘍細胞内で選択的に複製され得るよ
うに改変され得、それによってその腫瘍標的化特性を強化する。過去10年に、研究者は
、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、小型RNAウイルス、ワクシニアウイルス、およ
び他のウイルスを遺伝子改変するための遺伝子組換え、遺伝子伝達、遺伝子ノックアウト
、および他のテクノロジーによって、一連の腫瘍溶解性ウイルス製品を開発した。今まで
に、20個よりも多くの製品が臨床研究の異なる段階に入っている。それらの中でも、中
国CFDAは、頭頸部腫瘍の処置について、上海三維生物技術有限公司の遺伝子改変され
た腫瘍溶解性アデノウイルスH101の上市を2005年に承認しており、これは世界で
最初の腫瘍溶解性ウイルス医薬であった。10年後になって、第2の腫瘍溶解性ウイルス
医薬、Amgenの遺伝子改変された腫瘍溶解性ヘルペスウイルスT-Vecが、進行し
た悪性黒色腫の処置について、米国FDAおよび欧州連合EMAによって2015年に承
認された。現行では、医薬として上市されている遺伝子改変された腫瘍溶解性ワクシニア
ウイルスはない。
る必要がなおある。
めの医薬のための単離された組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、医薬組成物、およ
びそれらの使用を提供する。
(1) 単離された組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスであって、組換え体腫瘍溶
解性ワクシニアウイルスはTK遺伝子およびVGF遺伝子を機能欠損し、組換え体腫瘍溶
解性ワクシニアウイルスのゲノムは外来性のIL-21遺伝子をインテグレーションされ
、IL-21遺伝子は腫瘍細胞内で発現されることができる。
(2) (1)に従う組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスであって、TK遺伝子は
、外来性のヌクレオチド配列が挿入されることによって機能的に欠損する。
(3) (1)に従う組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスであって、外来性のIL
-21遺伝子はTK遺伝子内に挿入され、それによってTK遺伝子の機能欠損を引き起こ
す。
(4) (1)に従う組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスであって、VGF遺伝子
はノックアウトされることまたは外来性のヌクレオチド配列を挿入されることによって機
能欠損する。
(5) (1)に従う組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスであって、組換え体腫瘍
溶解性ワクシニアウイルスはWyeth株またはWR株である。
(6) (1)に従う組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスであって、組換え体腫瘍
溶解性ワクシニアウイルスのゲノムはさらに外来性のスクリーニング遺伝子をインテグレ
ーションされ、外来性のスクリーニング遺伝子はgpt遺伝子および/またはLacZ遺
伝子を包含するが、蛍光蛋白質遺伝子を包含しない。
(7) (1)または(5)に従う組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスであって、
外来性のIL-21遺伝子はマウスまたはヒトに由来する。
(8) 医薬組成物であって、医薬組成物は活性成分としての(1)~(7)のいずれ
か1つに従う組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスと薬学的に許容される添加剤とを含
む。
(9) (8)に従う医薬組成物であって、医薬組成物は組換え体腫瘍溶解性ワクシニ
アウイルスを1×105~5×109pfu/日の用量で含む。
(10) (8)に従う医薬組成物であって、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルス
は腫瘍内注射または静脈内投与によって投与される。
(11) (1)~(7)のいずれか1つに従う組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイル
スを調製するためのベクターであって、ベクターはプロモーターのコントロール下の外来
性のIL-21遺伝子を含む。
(12) (11)に従うベクターを含む宿主細胞。
(13) 腫瘍および/または癌の処置のための医薬の調製のための、(1)から(7
)のいずれか1つに従う組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの使用。
(14) (13)に従う使用であって、腫瘍および/または癌は肺癌、黒色腫、頭頸
部癌、肝臓癌、脳腫瘍、結腸直腸癌、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頚癌、リンパ
腫、胃癌、食道癌、腎臓癌、前立腺癌、膵臓癌、白血病、骨癌、精巣癌を包含する。
(15) 腫瘍および/または癌を処置するための方法であって、(1)~(7)のい
ずれか1つに従う組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを腫瘍および/または癌患者に
投与することを含む。
(16) (15)に従う方法であって、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、
1×105~5×109pfu/日の用量で、1日1回、連続1~6日に渡って投与され
る。
(17) (15)に従う方法であって、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは腫
瘍内注射または静脈内投与によって投与される。
(18) (15)に従う方法であって、腫瘍および/または癌は肺癌、黒色腫、頭頸
部癌、肝臓癌、脳腫瘍、結腸直腸癌、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頚癌、リンパ
腫、胃癌、食道癌、腎臓癌、前立腺癌、膵臓癌、白血病、骨癌、精巣癌を包含する。
能欠損させることと、同時に腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが免疫制御因子IL-21の
遺伝子を保有するようにさせることとを初めて提案し、その結果、得られた組換え体腫瘍
溶解性ワクシニアウイルスは腫瘍細胞内で選択的に複製し得、免疫制御因子IL-21を
発現する。本概念に基づいて提供される腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、医薬組成物、お
よび方法は、腫瘍細胞内で選択的に複製および腫瘍細胞を殺傷し、さらに体の爾後の免疫
応答を引き起こす腫瘍溶解性ウイルスの役割を充分に行使し得、外来性のIL-21の抗
腫瘍免疫効果をもまた充分に行使し得る。本発明は、IL-21遺伝子を腫瘍溶解性ワク
シニアウイルスにインテグレーションすることによって、本発明が腫瘍溶解性ウイルスの
腫瘍溶解性殺傷効果とIL-21の抗腫瘍免疫刺激効果とを相乗化し得るということを見
いだした。
的化特性を有効に強化し、それによって安全性を改善する。
し、同時に外来性のIL-21を発現するので、それは体の抗腫瘍免疫応答を相乗的に刺
激し得、それによって本発明の組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスをNK細胞と組み
合わせることを可能にする。この概念に基づいて提供される医薬組成物および方法は、腫
瘍細胞内で選択的に複製および腫瘍細胞を殺傷しかつさらに体の爾後の免疫応答を引き起
こす本発明の組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの役割を充分に発揮するのみならず
、腫瘍細胞を殺傷するNK細胞の機能をもまた行使し得、腫瘍細胞内で選択的に複製する
本発明の組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの特徴を巧妙に利用し、本発明の組換え
体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを含有する腫瘍細胞がNK細胞の特異的標的になるよう
にする。発現される外来性のIL-21もまたNK細胞の致死性を強化し得、それによっ
てNK細胞の腫瘍殺傷効果をさらに強化する。これは最終的にさらに強化された相乗的な
腫瘍殺傷効果を生ずる。
ルスおよびNK細胞のそれぞれの投与用量、投与順序、および投与間隔は、それらの組み
合わせが最大の相乗効果を達成することを可能にし、同時にそれらの相互の制約を回避し
、それゆえに腫瘍および/または癌を処置する有効な効果を達成する。
本願において用いられる用語「腫瘍」、「癌」、「腫瘍細胞」、および「癌細胞」は当
分野において通常認識される意味を包摂する。
本願において用いられる用語「腫瘍溶解性ウイルス」は、腫瘍細胞内で選択的に複製し
、腫瘍細胞を溶解し得るウイルスを言う。
本願において用いられる用語「治療有効量」は、検出測定可能な治療もしくは阻害効果
を見せるかまたは抗腫瘍応答を誘起するために有用な機能性薬剤または医薬組成物の量を
言う。効果は当分野において公知のいずれかのアッセイ方法によって検出測定され得る。
本願において用いられる用語「投与する」または「投与」は、化合物、複合物、または
組成物(ウイルスおよび細胞を包含する)を対象に提供することを言う。
本願において用いられる用語「患者」はヒトまたは非ヒト生物を言う。それゆえに、本
願に記載される方法および組成物はヒトおよび獣類の疾患両方に適用可能である。ある種
の実施形態では、患者は腫瘍を有する。いくつかのケースでは、患者は1つ以上の型の癌
に同時に罹患し得る。
本願において用いられる用語「相乗効果」は、それらの単体の効果の合計よりも多大な
効果を生ずる2つ以上の薬剤の間に生起する効果を言う。
本願において用いられる用語「pfu」または「プラーク形成単位」はプラークを形成
するウイルス数を言う。
本願において用いられる用語「MOI」または「多重感染度」は、ウイルス数および細
胞数の間の比、すなわち細胞あたりのウイルス感染を開始するために用いられるウイルス
粒子数を言う。MOI=pfu/細胞、すなわち細胞数×MOI=トータルのPFU。
を意味し、***はp<0.001を意味し、****はp<0.0001を意味する(
一元配置ANOVA統計分析法を用いて、示されているコントロール群と比較)。
説明される。ただし、これは本発明を限定するわけではない。種々の改変または改善が本
開示の趣旨から外れることなしに然るべくなされ得、よって、これらは本開示の範囲内で
あるということは当業者には明らかであろう。
て通常認識される意味を包摂する。
れる。これらのシステムは協調連携して、人体内の種々の複雑な生命活動が正常に進むこ
とを可能にする。腫瘍が生ずるときには、体は種々の免疫エフェクターメカニズムによっ
て抗腫瘍効果を行使し得る。体の抗腫瘍メカニズムは細胞性免疫および液性免疫を包含す
る。それらは密接に結びついており、互いに影響し、種々の免疫エフェクター分子および
エフェクター細胞が関わる。通常は、細胞性免疫は抗腫瘍プロセスにおいて主導的な役割
を発揮し、液性免疫はいくつかのケースでは相乗的な役割を発揮するということが信じら
れている。本発明は、腫瘍細胞内で選択的に複製し、および腫瘍細胞を殺傷する腫瘍溶解
性ワクシニアウイルスの特徴を利用することと、同時にそれが免疫制御因子IL-21を
保有するようにさせることとを提案し、その結果、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイル
スは選択的な腫瘍溶解性および体の抗腫瘍免疫効果の強化の機能を相乗的に行使する。こ
の概念に基づき、本発明の発明者は、実験研究および理論的検討から、腫瘍溶解性ワクシ
ニアウイルスのTK遺伝子およびVGF遺伝子の両方を機能欠損させることとIL-21
遺伝子をゲノム中にインテグレーションすることとによって、上述の相乗効果を達成する
ことが可能であるということを発見した。
の1つであり、これは痘瘡を防止するためのワクチンウイルスである。ウイルスの特殊な
生物学的特性は、それが腫瘍免疫療法/遺伝子治療の分野において増々大きくなる注目を
得るようにさせている。(1)安全性:ワクシニアウイルスは、細胞の細胞質内で複製し
、宿主細胞ゲノムにはインテグレーションしないDNAウイルスであり、外来性遺伝子に
よって誘導される変異を縮減する(文献:“Hruby, DE Vaccinia V
irus Vectors:New Strategies for Producin
g Recombinant Vaccines.Clin.Microbiol.Re
v.3,153-170(1990).”参照)。(2)高い発現効率:ワクシニアウイ
ルスは非常に高い力価(>109pfu/ml)まで培養され得、通常は1~3時間の感
染が、感染した細胞の90%よりも多くが目当ての遺伝子産物を発現するようにさせ得る
(文献:“Pfleiderer,M.,Falkner,FG & Dorner,F
.A novel vaccinia virus expression syste
m allowing construction of recombinants
without the need for selection markers,
plasmids and bacterial hosts.J.Gen.Virol
.76,2957-2962(1995).”参照)。(3)広い範囲の感染細胞:***
および非***細胞を包含するほぼ全ての型の哺乳類細胞に感染する(文献:“Hruby
,DE Vaccinia Virus Vectors:New Strategie
s for Producing Recombinant Vaccines.Cli
n. Microbiol. Rev.3,153-170(1990).”参照)。(
4)大きいゲノム容量:少なくとも25kbの外来性遺伝子が、その遺伝子安定性に影響
することなしに挿入され得る(文献:“Hruby,DE Vaccinia Viru
s Vectors:New Strategies for Producing R
ecombinant Vaccines.Clin.Microbiol.Rev.3
,153-170(1990).”参照)。(5)安定性:温度に対して敏感でなく、医
薬利用性が良好、用いることおよび輸送することが容易(文献:“Hruby,DE V
accinia Virus Vectors: New Strategies fo
r Producing Recombinant Vaccines.Clin.Mi
crobiol.Rev.3,153-170(1990).”参照)。(6)発現産物
は天然の構造を有する:発現された産物はその天然配置に近い正しいグリコシル化および
翻訳後プロセシングを有し得る(文献:“Hruby,DE Vaccinia Vir
us Vectors:New Strategies for Producing
Recombinant Vaccines.Clin.Microbiol.Rev.
3,153-170 (1990).”参照)。これはウイルスが体の免疫応答を刺激す
るための免疫制御遺伝子を保有するために必須である。
セスが依存する遺伝子の1つである。ワクシニアウイルスがTK遺伝子を欠失する場合に
は、TK蛋白質を宿主細胞から供給することが必要である。しかしながら、TK蛋白質は
正常な細胞周期においては一過的にのみ発現され得るが、TK蛋白質はほとんどの腫瘍細
胞においては一貫して高発現される。よって、腫瘍組織におけるTK蛋白質の発現特徴を
用いることは、TK欠損ワクシニアウイルスの複製が正常細胞よりもむしろ腫瘍組織に限
定されることを許し、それによって腫瘍標的化を改善する。ワクシニアウイルス遺伝子改
変系が用いられ始めた1982年から、TK遺伝子領域は外来性遺伝子の挿入領域である
(文献:“Byrd,C.&Hruby,D.Construction of Rec
ombinant Vaccinia Virus.In Vaccinia Viru
s and Poxvirology:Methods and Protocols
269,31-40(2004).”参照)。
子受容体(EGFR)シグナル伝達経路の活性化に密接に関連する。ワクシニアウイルス
は細胞に感染し、ウイルス成長因子(VGF)を分泌し、これは感染したまたは近傍の未
感染の細胞の表面のEGFRに結合し、EGFR/Rasシグナル伝達経路を活性化し、
これはワクシニアウイルスが複製および近傍の細胞に感染することにとって有利である。
よって、VGF欠損ワクシニアウイルスは正常細胞のEGFR/Ras経路を活性化し得
ず、これは正常細胞に感染するそれらの能力を限定する。しかしながら、腫瘍細胞のEG
FRシグナル伝達経路は活性化され、その結果、腫瘍細胞におけるVGF遺伝子を欠失す
るワクシニアウイルスの複製および感染は影響されない。つまり、腫瘍に対する効果の特
異性は相対的に改善される(文献:“Autio,K.et al.Safety an
d biodistribution of a double-deleted on
colytic vaccinia virus encoding CD40 lig
and in laboratory Beagles.Mol.Ther.-Onco
lytics 1,1-8(2014).”参照)。
細胞によって産生される。これは自然および獲得免疫応答を制御し、抗腫瘍免疫応答にお
いて重要な役割を発揮する。種々の免疫細胞およびシグナルトランスダクションに対する
IL-21の効果が文献に報告されている(文献:“Leonard,WJ & Wan
,C.IL-21 Signaling in Immunity.F1000Rese
arch 5,1-10(2016).”参照)。種々の型の免疫細胞は、主に次を包含
する。1)CD4+T細胞:増殖を促進し、サイトカインを産生する。Tfh細胞:分化
を促進し、胚中心機能を改善する。Th17細胞:分化および増殖を促進する。Treg
細胞:その産生および生存を阻害する。2)NKT細胞:増殖し、細胞傷害性を強化する
。3)CD8+T細胞:細胞傷害性、増殖および/または生存、抗腫瘍効果を改善する。
4)NK細胞:細胞成熟、増殖を促進し、細胞傷害効果を増大させ、抗腫瘍活性を強化す
る。5)DC細胞:抗原提示機能を阻害し、アポトーシスを誘導する。6)マクロファー
ジ:ファゴサイトーシスを強化する。7)B細胞:増殖および/またはアポトーシスを促
進し、プラズマ細胞分化およびイムノグロブリン産生を促進する。8)加えて、IL-2
1は、JAK/STAT、MARK/PI3K、および他のシグナル経路を包含する種々
の腫瘍関連シグナル経路を活性化し、腫瘍発生を制御し得る。腫瘍免疫療法では、NK細
胞およびCD8+T細胞の細胞傷害性の活性化が鍵であり、多くの研究が、IL-21が
この手続きにおいて重要な役割を発揮するということを充分に示している。IL-21は
NK細胞の成熟を促進してIFN-γおよびパーフォリンを産生し、NK細胞によって媒
介される抗腫瘍細胞傷害性を誘導して腫瘍細胞の表面のNKG2Dリガンドを標的化し、
抗体依存性細胞媒介性傷害性(ADCC)を介してNK細胞の致死性を増大させる(文献
:“Spolski,R.& Leonard,WJ Interleukin-21:
a double-edged sword with therapeutic po
tential.Nat.Rev.Drug Discov.13,379-395(2
014).”参照)。第2に、IL-21はCD8+T細胞の増殖を誘導し、メモリーT
細胞の生成を誘導し、IFNγ/グランザイムの分泌を促進して、CD8+T細胞による
腫瘍の殺傷を強化し、再発腫瘍細胞に対する記憶免疫応答に寄与し得る。重要なことに、
IL-2とは違って、IL-21はTreg細胞の拡大を誘導せず、さらにCD8+T細
胞の免疫機能応答を強化する(文献:“Spolski,R.& Leonard,WJ
Interleukin-21:a double-edged sword wit
h therapeutic potential.Nat.Rev.Drug Dis
cov.13,379-395(2014).”参照)。免疫細胞に対するIL-21の
多様な効果に基づいて、IL-21は腫瘍微小環境において種々のエフェクター細胞を「
再活性化」し得るということが示されている。いくつかの臨床研究が、IL-21を単独
でまたは腫瘍処置のための他の医薬との組み合わせで用いている。
体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスはTK遺伝子およびVGF遺伝子を機能欠損し、組換え
体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスのゲノムは外来性のIL-21遺伝子をインテグレーシ
ョンされ、IL-21遺伝子は腫瘍細胞内で発現されることができる。
きには、腫瘍溶解性ウイルスが、遺伝子が本来有するべき機能を果たし得ないということ
を意味する。つまり、機能は失われている。この目的は、例えば外来性の断片を遺伝子内
に挿入することまたは遺伝子のノックアウトによって達成され得る。
る。外来性のヌクレオチド配列をVGF遺伝子内に挿入してその機能を欠損させることも
また可能であるが、VGF遺伝子をノックアウトすることが好ましい。
伝子は機能欠損し得、IL-21遺伝子は腫瘍細胞の感染後に発現され得る。
株の例はVSC20である。
アウイルスを遺伝子改変することによって得られる。VSC20ワクシニアウイルスはV
GF遺伝子を欠失するワクシニアウイルスであり、LacZ遺伝子がC11R部位に挿入
されている。その調製方法は、科学文献:“McCart,JA,et al.Syst
emic cancer therapy with a tumor-selecti
ve vaccinia virus mutant lacking thymidi
ne kinase and vaccinia growth factor gen
es.Cancer Res(2001)61:8751-8757”に見いだされ得る
。遺伝子改変は、外来性のIL-21遺伝子をVSC20ワクシニアウイルスのTK遺伝
子内に挿入することを包含し、その結果、TK遺伝子が機能欠損する。具体的には、IL
-21遺伝子をワクシニアウイルスVSC20のTK遺伝子内に挿入するためのプラスミ
ドの図解と、組換えメカニズムによる挿入の略図とが図1に示されている。
またインテグレーションされ得る。外来性のスクリーニング遺伝子はgpt(グアニンホ
スホリボシルトランスフェラーゼ)遺伝子および/またはLacZ遺伝子を包含するが、
患者における蛍光蛋白質発現の潜在的危険性を回避するために蛍光蛋白質遺伝子を包含し
ない。
ンテグレーションされ得ない。
ターp7.5によってgpt遺伝子をコントロールし、合成ワクシニアウイルス初期プロ
モーターpSELを用いることによって外来性のIL-21遺伝子をコントロールする。
腫瘍溶解性ウイルスを構築するために、gptおよびIL-21遺伝子はインビトロ細胞
内組換えテクノロジーを用いることによってワクシニアウイルスVSC20株のTK遺伝
子領域内に挿入された。2つのプロモーターはそれぞれ背中合わせでそれぞれの制御され
る遺伝子の発現を活性化した。
損を引き起こし、かつ腫瘍溶解性ワクシニアウイルスのVGF遺伝子が機能欠損させられ
るときにのみ、腫瘍溶解性ウイルスは腫瘍細胞内で選択的に複製し、腫瘍細胞を殺傷し、
体の爾後の免疫応答を引き起こし得、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスによって保有される
外来性のIL-21遺伝子は抗腫瘍免疫効果を直接的に誘導し得るということを見いだし
ている。
法によって得られ得、具体的な実施形態が図2に示されている。
、それらの役割を発揮するようにそれらを巧妙に組み合わせる。腫瘍溶解性ワクシニアウ
イルスは腫瘍溶解を行使し、同時に、腫瘍細胞内で複製する機能によって、腫瘍細胞内で
のIL-21の発現、それから細胞外への分泌を増大させて、さらに体の腫瘍免疫効果を
誘導する。組み合わせられたそれらの効果は、より良好な治療効果を有する。
は医薬組成物をもまた提供し、医薬組成物は、活性成分としての本発明に従う組換え体腫
瘍溶解性ワクシニアウイルスと薬学的に許容される添加剤とを含む。
。ある種の実施形態では、医薬組成物の活性成分は、本発明に従う組換え体腫瘍溶解性ワ
クシニアウイルスを1×105から5×109pfu/日(例えば、1×105から3×
109pfu/日、1×105から1×108pfu/日など)の用量で含む。
例えば腫瘍内注射または静脈内投与によって投与され得る。
-2(IL-2)、IL-15、IL-18、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子
(GM-CSF)、インターフェロン-γ(IFN-γ)、腫瘍壊死因子-α(TNF-
α)、および同類をもまた含有し得、その用量及び投与経路はそれらのそれぞれの従来の
様式で行われ得る。他の活性成分が包含される場合には、組換え体腫瘍溶解性ワクシニア
ウイルスは他の活性成分と混合されることなしに独立して医薬組成物中に存在するべきで
ある。例えば、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは別個の容器に単体でパッケージ
ングされる。
いうことを理解するであろう。
含む。医薬製剤は当分野において公知の手続きによって調製され得る。例えば、化合物お
よび同類を包含する活性成分は、通常の添加剤、希釈剤(例えばリン酸緩衝液または食塩
水)、組織培養培地、および担体(例えば自家血漿またはヒト血清アルブミン)によって
製剤され、懸濁液として投与され得る。他の担体はリポソーム、ミセル、ナノカプセル、
ポリマーナノ粒子、固体脂質粒子を包含し得る(例えばE.Koren and V.T
orchilin,Life,63:586-595,2011 参照)。本願において
開示される医薬組成物の製剤のための技術の詳細は科学および特許文献に良く記載されて
いる。例えばRemington’s Pharmaceutical Science
s, Maack Publishing Co., Easton PA(「Remi
ngton’s」)の最新版を参照。
ためのベクターをもまた提供する。
伝子の機能欠損を引き起こし得る。例えば、具体的な実施形態では、図1に示されている
通り、組換え体ベクターは、TK相同断片TK-L、TK-R、ならびにIL-21遺伝
子を活性化するための発現カセット、および外来性のスクリーニング遺伝子gptを包含
する。ワクシニアウイルスがWR株であるときには、TK遺伝子の配列は、NCBI(す
なわち、国立生物工学情報センター。URL:https://www.ncbi.nl
m.nih.gov)のGenBankのNC_006998と付番されたワクシニアウ
イルス遺伝子の80724~81257bpに示されている配列であり、TK-Lの配列
は例えば80724~80961bpに示されている配列断片であり得、TK-Rの配列
は例えば81033~81257bpに示されている配列断片であり得る。ベクターは、
IL-21遺伝子発現カセットおよびgpt遺伝子発現カセットを細胞内組換えメカニズ
ムによってワクシニアウイルスのTK遺伝子領域内に挿入し得る(それゆえに、例えば、
GenBankのNC_006998と付番されたワクシニアウイルス遺伝子の8096
2~81032bpに示されている配列断片が欠失させられる)。その結果、組換え体ワ
クシニアウイルスはTK遺伝子の機能を失う。本発明の別の態様に従うと、本発明のベク
ターを含む宿主細胞が提供される。
明に従う組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの使用をもまた提供する。
脳腫瘍、結腸直腸癌、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頚癌、リンパ腫、胃癌、食道
癌、腎臓癌、前立腺癌、膵臓癌、白血病、骨癌、精巣癌などを包含するが、これらに限定
されない。
瘍および/または癌患者に本発明に従う組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを投与す
ることを含む。
脳腫瘍、結腸直腸癌、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頚癌、リンパ腫、胃癌、食道
癌、腎臓癌、前立腺癌、膵臓癌、白血病、骨癌、精巣癌などを包含するが、これらに限定
されない。
、1~6日連続投与で1日1回の治療有効量である(1日、2日、3日、4日、5または
6日の連続投与を包含する)。治療有効量は好ましくは1×105から5×109pfu
/日の用量である(例えば、1×105から3×109pfu/日の用量、1×105か
ら1×108pfu/日の用量など)。
ばインターロイキン-2(IL-2)、IL-15、IL-18、顆粒球・マクロファー
ジコロニー刺激因子(GM-CSF)、インターフェロン-γ(IFN-γ)、腫瘍壊死
因子-α(TNF-α)、および同類との組み合わせでもまた用いられ得、それらの用量
および投与経路はそれらのそれぞれの従来の様式で行われ得る。
の方法は患者に1回または複数回適用され得る。
例えば腫瘍内注射または静脈内投与によって投与され得る。
(A) 第1の医薬組成物が本発明の組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを第1の
薬学的に許容される担体中に含む、第1の医薬組成物と、
(B) 第2の医薬組成物がNK細胞を第2の薬学的に許容される担体中に含む、第2
の医薬組成物と、
を含む治療薬をもまた提供する。
の実施形態では、第1の薬学的に許容される担体および第2の薬学的に許容される担体は
異なる。
形態では、腫瘍溶解性ウイルスは腫瘍内注射によって投与または静脈内投与される。腫瘍
溶解性ウイルスが腫瘍細胞との接触をするときに、それらは腫瘍細胞に感染し、それらに
入るであろう。腫瘍溶解性ウイルスは主に腫瘍細胞内で複製および生殖するが、正常細胞
内では複製しないかまたはほとんど複製しないので、感染した腫瘍細胞内では、大量の子
孫腫瘍溶解性ウイルスが産生され、腫瘍細胞の溶解および死に至り得る。腫瘍細胞が溶解
するときには、大量の腫瘍抗原および子孫腫瘍溶解性ウイルスが放出され得、それから、
抗原がさらにインビボの免疫系を活性化し得、インビボのNK細胞およびT細胞を刺激し
て残りの腫瘍細胞を攻撃し続ける。同時に、子孫腫瘍溶解性ウイルスはまだ感染していな
い腫瘍細胞に感染し得る。
細胞を正常細胞から見分け得る。NK細胞が腫瘍細胞との接触をするときに、それらは腫
瘍細胞を異常細胞として認識し得、多種の相乗的プロセス、例えば受容体認識、抗体によ
る標的認識(ADCC)、ならびに腫瘍細胞を間接的に殺傷することができるグランザイ
ム、パーフォリン、およびインターフェロンの放出を介して腫瘍細胞を殺傷するであろう
。インビトロの研究は、健康なNK細胞はそのライフサイクルの間に最高で27個の腫瘍
細胞を殺傷し得るということを指示している。
合には、ウイルスは大量に複製し、感染した細胞は老化変性を呈し、それらの細胞膜上の
蛋白質群の組成変化を示すであろう。このプロセスの間に、NK細胞は感染した細胞を敏
感かつ有効に認識し、上に記載されているそれらが腫瘍細胞を殺傷するために用いる類似
のアプローチによってこれらの細胞を殺傷し得、それによって正常細胞内でのウイルスの
複製および増殖を阻害する。その後、抗原の刺激およびインターフェロンなどの免疫因子
の効果の存在下で、他の型の免疫細胞がウイルスと戦い続けるであろう。
巧妙に組み合わせようとする。一緒に組み合わせられたときには、NK細胞の抗ウイルス
メカニズムは腫瘍溶解性ウイルスに感染した腫瘍細胞にもまた適用可能であり、抗腫瘍メ
カニズムを補完する。加えて、組み合わせ治療は、腫瘍溶解性ウイルスに感染した腫瘍細
胞がNK細胞の特異的標的になることを許し、これはそれらの腫瘍殺傷効果を改善し得る
。腫瘍溶解性ウイルスは癌細胞内で選択的に複製するのみならず、それらを内側から殺傷
するが、細胞膜上の蛋白質受容体群が変化することをもまた引き起こし、それゆえにNK
細胞による癌細胞の認識を容易化し得る。その結果、NK細胞は癌細胞を外側から攻撃し
得る。よって、腫瘍溶解性ウイルスおよびNK細胞は癌細胞を相乗的に殺傷し、改善され
た効力を達成する。さらに、本発明の組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは外来性の
IL-21をもまた発現し、発現された外来性のIL-21はNK細胞の殺傷力を強化し
得、それによってNK細胞の殺傷効果をさらに強化する。上に記載されている組換え体腫
瘍溶解性ワクシニアウイルスおよびNK細胞の組み合わせ使用は、腫瘍殺傷効果に対して
驚くべき効果を生じ得る。
アウイルスであり、第2の医薬組成物の活性成分はNK細胞である。
それぞれ独立して治療薬中に存在する。
は、NK細胞はインビトロ拡大から得られる自家NK細胞またはインビトロ拡大から得ら
れる同種NK細胞である。NK細胞の大スケールインビトロ拡大培養技術は公知であり、
基本的に成熟している(例えば、次の科学文献を参照:“Somanchi SS,Le
e DA.Ex Vivo Expansion of Human NK Cells
Using K562 Engineered to Express Membra
ne Bound IL21 Methods Mol Biol.2016;1441
:175-93.”または“Phan MT,Lee SH,Kim SK,Cho D
. Expansion of NK Cells Using Geneticall
y Engineered K562 Feeder Cells.Methods M
ol Biol.2016;1441:167-74.”)。臨床データは、自家NK細
胞、半同種NK細胞(同種NK細胞に属する)、および臍帯血から調製されたNK細胞が
、人体への再循環後に、毒性の副作用がなく、長期依存性がなく、安全かつ有効であると
いうことを確認した。
%以上であり得、同種NK細胞の純度は90%以上であり得る。不純物細胞はNK-Tお
よび/またはγδT細胞であり得る。好ましくは、NK細胞活性(生存率)は90%以上
であり、NK細胞殺傷活性は80%以上である。
のそれぞれの投与用量をさらに検討および最適化し、これは極めて重要である。好ましく
は、第1の医薬組成物は組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを1×105~5×10
9pfu/日の用量で含み(例えば、1×105~3×109pfu/日の用量の組換え
体腫瘍溶解性ウイルス、1×105~1×108pfu/日の用量の組換え体腫瘍溶解性
ワクシニアウイルスなど)、第2の医薬組成物はNK細胞を1×107~1×1010細
胞/日の用量で含有する(好ましくは、第2の医薬組成物はNK細胞を1×108から5
×109細胞/日の用量で含み、好ましくは、第2の医薬組成物はNK細胞を1×109
から4×109細胞/日の用量でもまた含む。より好ましくは、第2の医薬組成物はNK
細胞を1×109から3×109細胞/日の用量で含む)。好ましくは、治療薬の活性成
分は、1×105から5×109pfu/日の用量の組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイ
ルス(例えば、1×105から3×109pfu/日の用量の組換え体腫瘍溶解性ワクシ
ニアウイルス、1×105から1×108pfu/日の用量の組換え体腫瘍溶解性ワクシ
ニアウイルスなど)および1×107から1×1010細胞/日の用量のNK細胞(例え
ば、1×108から5×109細胞/日、1×109から4×109細胞/日、1×10
9から3×109細胞/日など)から構成される。
例えば腫瘍内注射または静脈内投与によって投与され得る。
得る。
ことを了解するであろう。
(IL-2)、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、インターフ
ェロン-γ(IFN-γ)、腫瘍壊死因子-α(TNF-α)などをもまた含有し得る。
。医薬製剤は当分野において公知の方法によって調製され得る。例えば、化合物などの活
性成分は、通常の添加剤、希釈剤(例えばリン酸緩衝化食塩水または食塩水)、組織培養
培地、および担体(例えば自家血漿またはヒト血清アルブミン)によって製剤され、懸濁
液として投与され得る。他の担体はリポソーム、ミセル、ナノカプセル、ポリマーナノ粒
子、固体脂質粒子を包含し得る(例えば文書“E.Koren and V.Torch
ilin,Life,63:586-595,2011”を参照)。本発明の治療薬を製
剤する具体的な方法は科学および特許文献に見いだされ得る。例えば、Remingto
n’s Pharmaceutical Sciences,Maack Publis
hing Company,Easton PA(「Remington’s」)の最新
版を参照。
色腫、頭頸部癌、肝臓癌、脳腫瘍、結腸直腸癌、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頚
癌、リンパ腫、胃癌、食道癌、腎臓癌、前立腺癌、膵臓癌、白血病、骨癌、精巣癌などを
包含するが、これらに限定されない。
ウイルスを腫瘍および/または癌患者に投与し、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルス
の投与の18~72時間(例えば、20~70時間、22~48時間、24~48時間、
30~48時間など)後に、NK細胞を腫瘍および/または癌患者に投与する。「組換え
体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの投与の18~72時間(例えば、20~70時間、2
2~48時間、24~48時間、30~48時間など)後に、NK細胞を腫瘍および/ま
たは癌患者に投与する」は、NK細胞の最初の投与と組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイ
ルスの最初の投与との間の時間間隔が18~72時間の範囲であるか(例えば、20~7
0時間、22~48時間、24~48時間、30~48時間など)、またはNK細胞の最
初の投与と組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの直近の投与との間の時間間隔が18
~72時間の範囲である(例えば、20~70時間、22~48時間、24~48時間、
30~48時間など)ということを意味する。好ましくは、NK細胞の最初の投与と組換
え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの直近の投与との間の時間間隔は18~72時間の範
囲である(例えば、20~70時間、22~48時間、24~48時間、30~48時間
など)。より好ましくは、NK細胞の最初の投与と組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイル
スの直近の投与との間の時間間隔は24~48時間の範囲である。
で1日1回、連続1~6日に渡って投与され、NK細胞は1×107から1×1010細
胞/日の用量で(例えば、1×108から5×109細胞/日、1×109から4×10
9細胞/日、1×109から3×109細胞/日の用量)、1日1回、連続1~6日に渡
って投与される。本発明の別の好ましい実施形態では、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウ
イルスの投与用量は、治療有効量、隔日、2~6日の連続投与であり、NK細胞の投与用
量は、1×107から1×1010細胞/日(例えば、1×108から5×109細胞/
日、1×109から4×109細胞/日、1×109から3×109細胞/日)、隔日、
2~6日の連続投与である。NK細胞が組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの投与の
18から72時間後に腫瘍および/または癌患者に与えられるはずである限りは、上述の
実施形態のいずれか1つまたはいずれかの他の代替的な実施形態が本開示に従って採用さ
れ得る。組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスおよびNK細胞は間をおいて投与され得
るか(例えば、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを第1日に投与し、NK細胞を第
2日に投与し、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを第3日に投与し、NK細胞を第
4日に投与するなど)、または逐次に投与され得るか(例えば、組換え体腫瘍溶解性ワク
シニアウイルスを第1日に投与し、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスおよびNK細
胞を逐次の順番で第2日に投与し、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスおよびNK細
胞を逐次の順番で第3日に投与し、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスおよびNK細
胞を逐次の順番で第4日に投与するなど)、あるいは他の用量レジメンを用いて投与され
得る(例えば、最初に、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを連続1から6日に渡っ
て1日1回投与し、18から72時間の間隔の後に、NK細胞を連続1から6日に渡って
1日1回投与する)。好ましくは、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは最初に投与
され、NK細胞は組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの全ての用量を投与した18か
ら72時間後に投与される。本開示の好ましい実施形態では、最初に、腫瘍および/また
は癌患者は組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを与えられ、組換え体腫瘍溶解性ワク
シニアウイルスは治療有効量で1回のみ与えられる。組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイ
ルスの投与の18から72時間後に、腫瘍および/または癌患者はNK細胞を投与され、
NK細胞は1×107から1×1010細胞/日の範囲である用量レベルで1回のみ投与
される(例えば、1×108から5×109細胞/日、1×109から4×109細胞/
日、または1×109から3×109細胞/日)。組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイル
スの治療有効量は好ましくは1×105から5×109pfu/日の用量である(例えば
、1×105から3×109pfu/日の用量、1×105から1×108pfu/日の
用量)。
の使用をもまた提供する。
脳腫瘍、結腸直腸癌、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頚癌、リンパ腫、胃癌、食道
癌、腎臓癌、前立腺癌、膵臓癌、白血病、骨癌、精巣癌などを包含するが、これらに限定
されない。
み合わせ医薬のキットもまた提供され、本開示に従う組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイ
ルスを含有する第1の容器およびNK細胞を含有する第2の容器を包含し、第1の容器は
第2の容器とは別個である。さらに、キットは投与のタイミングおよび経路を定める説明
書を含む。好ましくは、キットは、それぞれ本開示に従う組換え体腫瘍溶解性ワクシニア
ウイルスおよびNK細胞を含有する独立した容器と、投与のタイミングおよび経路を定め
る説明書とからなる。
脳腫瘍、結腸直腸癌、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頚癌、リンパ腫、胃癌、食道
癌、腎臓癌、前立腺癌、膵臓癌、白血病、骨癌、精巣癌などを包含するが、これらに限定
されない。
治療有効量の組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを含有し、NK細胞を含有する第2
の容器は1×107~1×1010細胞/日の用量を提供するために十分なNK細胞を含
有する(例えば、1×108から5×109細胞/日の用量のNK細胞、1×109から
4×109細胞/日の用量のNK細胞、1×109から3×109細胞/日のNK細胞な
ど)。組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの治療有効量は好ましくは1×105から
5×109pfu/日の用量である(例えば、1×105から3×109pfu/日の用
量、1×105から1×108pfu/日の用量)。
腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを1×105~1×108pfu/日の用量で含有し、N
K細胞を含有する第2の容器はNK細胞を1×109から3×109細胞/日の用量で含
有する。
は、NK細胞はインビトロ拡大から得られる自家NK細胞またはインビトロ拡大から得ら
れる同種NK細胞である。
れぞれの投与方法、例えば腫瘍内注射または静脈内投与を用いて投与され得る。
得る。
脳腫瘍、結腸直腸癌、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頚癌、リンパ腫、胃癌、食道
癌、腎臓癌、前立腺癌、膵臓癌、白血病、骨癌、精巣癌などを包含するが、これらに限定
されない。
様式で次のステップを含む。
1) 本開示に従う組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを腫瘍および/または癌患
者に投与すること、
2) 組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの投与の18~72時間(例えば、20
~70時間、22~48時間、24~48時間、30~48時間など)後に、本開示に従
うNK細胞を腫瘍および/または癌患者に投与すること。
0時間、22~48時間、24~48時間、30~48時間など)後に、本開示に従うN
K細胞を腫瘍および/または癌患者に投与する」は、NK細胞の最初の投与と組換え体腫
瘍溶解性ワクシニアウイルスの最初の投与との間の時間間隔が18~72時間の範囲であ
るか(例えば、20~70時間、22~48時間、24~48時間、30~48時間など
)、またはNK細胞の最初の投与と組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの直近の投与
との間の時間間隔が18~72時間の範囲である(例えば、20~70時間、22~48
時間、24~48時間、30~48時間など)ということを意味する。好ましくは、NK
細胞の最初の投与と組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの直近の投与との間の時間間
隔は18~72時間の範囲である(例えば、20~70時間、22~48時間、24~4
8時間、30~48時間など)。より好ましくは、NK細胞の最初の投与と組換え体腫瘍
溶解性ワクシニアウイルスの直近の投与との間の時間間隔は24~48時間の範囲である
。
脳腫瘍、結腸直腸癌、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頚癌、リンパ腫、胃癌、食道
癌、腎臓癌、前立腺癌、膵臓癌、白血病、骨癌、精巣癌などを包含するが、これらに限定
されない。
し得る。本発明の発明者は、一定時間の複製後に、腫瘍細胞内の腫瘍溶解性ウイルスがN
K細胞による腫瘍細胞の殺傷を促進し得ることを見いだした。よって、本発明によって提
案される組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスおよびNK細胞の投与順序および間隔は
、2つの効果のピークのダブルピークオーバーラップを達成する。
量をさらに検討および最適化し、上述の投与順序および間隔によるそれらの連携が極めて
重要であり、これは組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの抗腫瘍効力、NK細胞の抗
腫瘍効力、および腫瘍細胞に対する上の2つの最も良好な相乗的な殺傷を決定する。
で1日1回、連続1~6日に渡って与えられ、NK細胞は1×107から1×1010細
胞/日の範囲の用量レベルで(例えば、1×108から5×109細胞/日、1×109
から4×109細胞/日、または1×109から3×109細胞/日)、1日1回、連続
1~6日に渡って与えられる。本開示の別の好ましい実施形態では、組換え体腫瘍溶解性
ワクシニアウイルスは治療有効量で、隔日で連続2から6日に渡って与えられ、NK細胞
は1×107から1×1010細胞/日の範囲である用量レベルで(例えば、1×108
から5×109細胞/日、1×109から4×109細胞/日、または1×109から3
×109細胞/日)、隔日で連続2から6日に渡って与えられる。NK細胞が組換え体腫
瘍溶解性ワクシニアウイルスの投与の18から72時間後に腫瘍および/または癌患者に
与えられるはずである限りは、上述の実施形態のいずれか1つまたはいずれかの他の代替
的な実施形態が本開示に従って採用され得る。組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスお
よびNK細胞は間をおいて投与され得るか(例えば、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイ
ルスを第1日に投与し、NK細胞を第2日に投与し、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイ
ルスを第3日に投与し、NK細胞を第4日に投与するなど)、または逐次に投与され得る
か(例えば、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを第1日に投与し、組換え体腫瘍溶
解性ワクシニアウイルスおよびNK細胞を逐次の順番で第2日に投与し、組換え体腫瘍溶
解性ワクシニアウイルスおよびNK細胞を逐次の順番で第3日に投与し、組換え体腫瘍溶
解性ワクシニアウイルスおよびNK細胞を逐次の順番で第4日に投与するなど)、あるい
は他の用量レジメンを用いて投与され得る(例えば、最初に、組換え体腫瘍溶解性ワクシ
ニアウイルスを連続1から6日に渡って1日1回投与し、18から72時間の間隔の後に
、NK細胞を連続1から6日に渡って1日1回投与する)。好ましくは、組換え体腫瘍溶
解性ワクシニアウイルスは最初に投与され、NK細胞は組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウ
イルスの全ての用量を投与した18から72時間後に投与される。本開示の好ましい実施
形態では、最初に、腫瘍および/または癌患者は組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルス
を与えられ、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは治療有効量で1回のみ与えられる
。組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの投与の18から72時間後に、腫瘍および/
または癌患者はNK細胞を与えられ、NK細胞は1×107から1×1010細胞/日の
範囲である用量レベルで1回のみ投与される(例えば、1×108から5×109細胞/
日、1×109から4×109細胞/日、または1×109から3×109細胞/日)。
組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの治療有効量は好ましくは1×105から5×1
09pfu/日である(例えば、1×105から3×109pfu/日の用量、1×10
5から1×108pfu/日の用量など)。
の方法は患者に1回または複数回適用され得る。
は、NK細胞はインビトロ拡大から得られる自家NK細胞またはインビトロ拡大から得ら
れる同種NK細胞である。
癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頚癌、リンパ腫、胃癌、食道癌、腎臓癌、前立腺癌、膵
臓癌、白血病、骨癌、精巣癌などを包含する。
例えば腫瘍内注射または静脈内投与によって投与され得る。
得る。
例は本開示の保護の範囲を限定することを意図されていない。
験手続き、操作、材料、および条件を用いて行う。
積によるパーセンテージ(%(v/v))を指示する。
由来する。
杭州市第一人民医院に由来するFaDuヒト頭頸部癌細胞を例外として、残りの腫瘍細
胞は中国典型培養物保蔵センターおよびATCCに由来する。細胞はマッコイ5A+10
%FBSおよびMEM+10%FBSの正常な環境において培養した。マッコイ5Aおよ
びMEMはGIBCOから購入した。ウシ胎児血清FBSはSIGMAから購入した。
実験に用いたNK細胞の起源は次の通りである。
各例に用いたNK細胞は杭州康万達医薬科技有限公司によって培養および凍結保存され
たヒトNK細胞であった。ヒトNK細胞は次のプロセスによって調製した。当分野の通常
用いられる技術として、採血針を尺骨静脈に挿入して、免疫細胞PBMCの抽出のために
健康人の末梢静脈血を採集した。放射線照射済みK562フィーダー細胞(杭州鼎云生物
技術有限公司から購入)を用いて、自家血漿培養によってNK細胞を拡大し、NK細胞は
最高で90%の最終純度、最高で90%の生存可能性、および最高で85%のインビトロ
腫瘍細胞殺傷率を有した。
コントロールウイルスとしての腫瘍溶解性ワクシニアウイルスddvv-RFPは公知
であり、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスWR株に属する(例えば“X Song,et
al.T-cell Engager-armed Oncolytic Vaccin
ia Virus Significantly Enhances Antitumo
r TherapyMolecular Therapy.(2014);22 1,1
02-111”を参照)。腫瘍溶解性ワクシニアウイルスddvv-RFPはTK遺伝子
およびVGF遺伝子両方を機能欠損し、外来性の赤色蛍光蛋白質(RFP)遺伝子を保有
する。RFP遺伝子はスクリーニング/レポーターの役割のみを発揮するので、腫瘍溶解
性ワクシニアウイルスddvv-RFPの抗腫瘍機能はTK遺伝子およびVGF遺伝子を
機能欠損する腫瘍溶解性ワクシニアウイルスと実質的に同等である。腫瘍溶解性ワクシニ
アウイルスddvv-RFPは当分野の従来技術を用いるVSC20ワクシニアウイルス
の遺伝子改変によってもまた得られ得る。VSC20ワクシニアウイルスはVGF遺伝子
を欠失するワクシニアウイルスである。VSC20ワクシニアウイルスの調製方法は、“
McCart,JA,et al.Systemic cancer therapy
with a tumor-selective vaccinia virus mu
tant lacking thymidine kinase and vaccin
ia growth factor genes.Cancer Res(2001)6
1: 8751-8757”を参照。遺伝子改変は、外来性のDsRed遺伝子(すなわ
ちRFP遺伝子)を制御するための人工の合成ワクシニアウイルス初期/後期プロモータ
ーpSELの使用と、インビトロ細胞内組換え技術を用いるワクシニアウイルスVSC2
0株のTK遺伝子領域内へのDsRed遺伝子の挿入とを包含し、それによって腫瘍溶解
性ワクシニアウイルスddvv-RFPを構築する。その産生および精製は下に記載され
る調製例2に従って行われ得る。
疫不全NCGマウスは浙江省動物センターから得た。
6ウェル細胞培養プレート(ウェルあたり2ml培養体積)、24ウェル細胞培養プレ
ート(ウェルあたり500μl培養体積)、96ウェル細胞培養プレート(ウェルあたり
200μl培養体積)は全てコーニング社から入手可能である。
れ10mg/mlのミコフェノール酸(400×)、10mg/mlの40×キサンチン
(40×)、10mg/mlのヒポキサンチン(670×)を調製し、暗所で-20℃に
保存する。用いるときに1×ワーキング溶液を調製する:25μlミコフェノール酸+2
50μlキサンチン+15μlヒポキサンチンを10mlのDMEMに追加する。
O4、2.6mMのKCl、pH7.2~7.4。
DTA、pH8.0。
MTTアッセイ:10μlのMTT溶液(5mg/ml)を各ウェルの細胞に追加し、
それから細胞をインキュベータ内で、37℃で4時間に渡ってインキュベーションし、培
養培地を吸って捨て、150μlのDMSOを各ウェルに追加し、それからシェーカー上
で低速で10分に渡って振盪し、結晶物が充分に溶解することを許し、マイクロプレート
リーダーを用いて490nmの吸光度値(OD490)を測定した。阻害率の計算式:細
胞増殖阻害率(IR%)=1-(OD490試験産物-OD490ブランク)/(OD4
90負のコントロール-OD490ブランク)×100%。
トリパンブルー染色法を用いる細胞計数:細胞をPBSによって洗浄し、トリプシンを
用いて消化し、それから細胞をPBSに懸濁した。懸濁液に、0.04%(w/v)の終
濃度でトリパンブルー溶液を追加した。それから、細胞計数を顕微鏡下で行った。これの
間に、死細胞は青く染色され、生細胞はいずれかの色なしで透明に見えた。生細胞数を最
終的なデータとして用いた。
FBS:ウシ胎児血清
PSG:ペニシリン-ストレプトマイシン-グルタミン
PBMC:末梢血単核細胞
RFP:赤色蛍光蛋白質
TIL:腫瘍浸潤リンパ球
DMSO:ジメチルスルホキシド
次のプロセスは図2に見られ得る。
それぞれヒトIL-21およびネズミIL-21遺伝子を保有するように、腫瘍溶解性
ワクシニアウイルスの2つの株を構築した。これらはそれぞれDDvv-hIL21およ
びDDvv-mIL21と呼ぶ。
1) NCBI遺伝子ライブラリー配列NM_001291041およびNM_021
803に従って、トータルで2つのマウスIL21のDNA断片(mIL-21)および
ヒトIL21のDNA断片(hIL-21)を遺伝子合成法によって合成した。具体的に
は、mIL-21は正常配列を有するマウス由来IL21断片(すなわち、Genban
k番号NM_001291041のヌクレオチド配列の72~560bp断片)を含有す
る。その配列(配列番号1)を下に示す。
M_021803のヌクレオチド配列の47~535bp断片)を含有する。その配列(
配列番号2)は次の通りである。
、IL21遺伝子をpCBプラスミド内に挿入した(起源は文献“Yourong FA
NG et al,Construction of Recombinant Vac
cinia Virus Vector with Zeocin and GFP D
ouble Screening labels “International Jo
urnal of Epidemiology and Infectious Dis
ease”,2012.39(3):148-152.”に見られ得る)。大腸菌DH5
αを用いて、プラスミドpCB-mIL21およびpCB-hIL21を形質転換および
抽出した(図3)。
21およびpCB-hIL21を検出測定し、配列が正しいことを確認した。
-03)を中量プラスミドDNA抽出に用いた。
1) 良好な成長状態のCV1細胞を選択し、6ウェルプレートに約4×105細胞/
ウェルで広げ、次の日の細胞密度が80%~90%に達するようにさせた。
スを含有する1mlの血清不含かつ抗生物質不含のDMEM培地(ウイルスの起源は、“
McCart,JA,et al.Systemic cancer therapy
with a tumor-selective vaccinia virus mu
tant lacking thymidine kinase and vaccin
ia growth factor genes. Cancer Res(2001)
61:8751-8757.”を参照)を、濃度が0.03pfu/細胞に達するように
2つのウェルのそれぞれに追加し、上下左右に均一混合し、2時間に渡って37℃で培養
し、20分毎に均一混合した。同時に、ウイルス溶液を追加することなしのコントロール
ウェルを設けた。
00トランスフェクション試薬、ライフテクノロジーズ、11668-019)混合溶液
を調製する。溶液A-5μgのプラスミドを吸い取り、それを300μlのOpti-M
EMI(Gibco、1802679)に追加して均一混合し、室温で5分に渡ってイン
キュベーションする。溶液B-12μlのLipo2000を吸い取り、300μlのO
pti-MEMIに追加して均一混合し、室温で5分に渡ってインキュベーションする。
製剤された溶液Aおよび溶液Bを混合し、穏やかに均一混合し、室温で15分に渡ってイ
ンキュベーションして、プラスミド/Lipo2000混合物を得る。300μlのプラ
スミド/Lipo2000混合溶液を感染したウェルの1つに追加し、トランスフェクシ
ョンプラスミドのみによるコントロールウェルを設ける。37℃で4時間に渡ってインキ
ュベーションする。10%FBS+1%PSGを含有する2mlのDMEM培地を各ウェ
ルに補充する。
EM培地に交換し、培養を約48時間続ける。顕微鏡下で細胞の完全な変性を観察した後
に、上清および細胞を採集し、3分間に渡って繰り返し凍結融解してウイルスを放出する
。
キット(TIANGEN、DP315)を用いてウイルスゲノムを抽出し、PCR法を用
いて、挿入されたIL-21遺伝子がバックボーンウイルス内にインテグレーションされ
たかどうかを検出測定する。同時に、50μlのウイルス溶液を取り、遠心し、上清をE
LISA試験用に取って(マウスIL-21DuoSet-ELISA、R&D、DY5
94-05;ヒトIL-21Uncoated-ELISA、インビトロジェン、88-
8218)、組換え体ワクシニアウイルスがIL-21蛋白質を発現したかどうかをさら
に決定する。残りのウイルス溶液は-80℃で保存し、P0と標識した。PCR鑑定に用
いたプライマー配列を表1に示す。陽性のウイルスのPCR検出測定によって得られた鑑
定バンドのサイズを表2に示す。
れているということを示した。つまり、ウイルスは首尾よく組換えられた(図4A~B)
。ELISA結果は、IL21を含有する組換え体ウイルス上清(図では「DDvv-m
IL-21」として示す)がIL-21蛋白質発現を示し、残りの細胞(図では「NC」
として示す)、トランスフェクションプラスミド(pCB-mIL21)、およびVSC
20コントロールはIL-21発現を示さない(図4C)ということを示した。
1) CV1細胞を60mmペトリ皿で培養した。80%コンフルに達したときに、1
mlのウイルス希釈液を追加し、これは150μlのP0ウイルスを含有した。2時間の
感染後に、3mlの1×gpt含有スクリーニング試薬を追加し、スクリーニングを行っ
た。細胞変性を観察し、ウイルスを採集し、P1ウイルスと標識する。ウイルスゲノム抽
出キットを用いてPCR検証のためにウイルス遺伝子を抽出した。
検証する。
3mlの段階希釈したP3ウイルスを追加し、2時間に渡って感染させ、培養培地を除去
し、0.8×gptスクリーニング試薬を含有する8mlの1%(w/v)アガロースゲ
ルを追加し(V5%アガロースゲル:V1×gptワーキング溶液=1:4)、37℃で
48時間に渡って培養し、シングルプラークを300μlの無菌PBSに拾い、繰り返し
3回凍結融解してウイルスを放出する。150μlのウイルス溶液を各プラークから取り
、24ウェルプレートでCV1細胞を用いて小スケールの拡大を行った。ウイルスの完全
な変性を約48時間待った後に、ウイルスを採集し、200μlのウイルス溶液を用いて
ゲノムを抽出し、これをPCR法による検証に用いた。残りのウイルス溶液はP4と標識
し、-80℃で保存した。
ンウイルスVSC20を含有しないということを確認した。ELISAおよびウエスタン
ブロット法(一次抗体:ウサギ抗マウスIL21、PeproTech社、#500-P
278;ウサギ抗IL21抗体、abcam、ab5978;二次抗体:ヤギ抗Rb、A
bcam、ab97051)を用いて、IL21蛋白質の発現を確認した。
R結果ではバンドを示さないということを示し、組換え体ウイルスが外来性の標的遺伝子
IL-21を保有する純粋なウイルスであり、そのバックボーンバックグラウンドウイル
スVSC20を含有しないということを指示した(図5A~D)。ウエスタンブロット結
果は、DDvv-IL21ウイルスがIL-21蛋白質を有効に発現し得、正しいサイズ
であることをもまた示した(図5E、G)。ELISA結果は、IL-21蛋白質が組換
え体ウイルスDDvv-IL21においては細胞培養上清および細胞ライセート(図では
「細胞」として示されている)中に検出測定され得るということを示した。これはさらに
分泌蛋白質としてのIL-21蛋白質の特徴を反映している(図5F、H)。
(1) 産生および精製
1) DDvv-mIL21のP5-1サンプルおよびDDvv-hIL21のP4-
3サンプルの大量増幅50枚の150mmペトリ皿を用いて、Hu-143B細胞が約8
0%まで成長したときに、およそ2×104PFUの50μLの小スケール増幅したウイ
ルスを各ペトリ皿に追加して細胞を感染させ、37℃かつ5%CO2で培養する。約2か
ら3日の後に、細胞は顕微鏡下で丸く数珠状になることが観察され、いくつかの細胞はペ
トリ皿から剥離した。培養溶液/細胞を、セルスクレーパーを用いて採集し、-80℃冷
凍庫に保存した。
返し3回凍結融解し、2000rpmで3分に渡って遠心し、上清を採集する。
レットを5mLのPBSに再懸濁し、12,000rpmで10minに渡って遠心し、
上清を捨て、ペレットを4mLの30%(w/v)ショ糖に再懸濁する。
ョ糖溶液を超遠心チューブの底から最も上へ順にそれぞれ2mL追加し、最も上の層に4
mLの30%(w/v)ショ糖に再懸濁したウイルス溶液を追加した。
%(w/v)ショ糖層に分布した乳白色のバンドとして観察され得る。ウイルスバンドを
1mLの平らに切った/大口のチップによって吸い取り、新たな遠心管の中に置いた(吸
い取ったウイルスバンドの体積をV1として記録した)。
し、35,000×gで1時間に渡って遠心し、上清を捨て、ペレットをキープする。
心し、ペレットをキープし、この操作を2回繰り返し、それからPBSによって3回洗浄
する。
ューブに小分けし、-80℃に保存し、1つのチューブはウイルス力価検出測定のために
4℃に取り置く。
1) 2つの6ウェルペトリ皿を用い、ウェルあたり約4×105個のHuTK-14
3B細胞を接種し、37℃の5%CO2インキュベータ内で一晩インキュベーションし、
次の日の細胞量が80%~90%に接近するようにさせる。
て10倍段階希釈し、希釈が10-4~10-8の範囲であるようにさせる。
追加し、各ウェルの希釈をマークし、同時に2つのブランクコントロールウェルを設け、
それらを37℃で2時間に渡って感染させる。6ウェルプレートを20分毎に1回振盪し
て、ウェル内の一様な濡れを保証し、局所的乾燥を回避する。
に渡ってインキュベーションする。
各ウェルに追加し、室温で10分に渡って染色し、染色溶液を除去し、PBSによって3
回洗浄し、プレートをひっくり返して風乾し、撮影する。
ーク数/(ウイルス希釈度×追加したウイルスの体積)。
価は30/(10-5×0.5)=6×106pfu/mlである。
ウイルスの力価は2×108から4×108PFU/mlであった。
21ワクシニアウイルスの殺傷効果
B16細胞(マウス黒色腫細胞)、GL261細胞(マウスグリオーマ細胞)、LLC
細胞(マウスルイス肺癌細胞)、CT-26細胞(マウス結腸癌細胞)、4T-1細胞(
マウス乳癌細胞)を包含するマウス腫瘍細胞を、96ウェルプレートにウェルあたり50
00細胞で広げ、一晩培養して壁に接着するようにさせた。細胞を上の方法によって調製
された1MOIのDDvv-mIL21ウイルスに感染させ、腫瘍細胞のアポトーシスを
、24時間、48時間、および60時間後に(LLC細胞、GL261細胞)、または2
4時間、48時間、および72時間後に(B16細胞、CT-26細胞、4T-1細胞)
、MTTによって検出測定した(n=3。2~3回の繰り返し実験)。この試験のコント
ロール群は負のコントロール群(ウイルス感染なし)、組換え体マウス由来IL-21蛋
白質(rmIL-21。R&Dシステムズから購入)、および正のコントロール群(1μ
Mパクリタキセル。北京双鷺薬業から購入)であり、各実験群およびコントロール群につ
いて3つのデュプリケートウェルを設け、細胞殺傷率は負のコントロール群に対する実験
群の比%であった。結果は、DDvv-mIL21ウイルスの殺傷率が60時間または7
2時間後に種々の腫瘍細胞に対して60%よりも多くを達成するということを示した。そ
れらの中でも、CT-26および4T1細胞に対するDDvv-mIL21ウイルスの殺
傷率は24時間の感染後に70%に達した(図6参照)。
L21ワクシニアウイルスの殺傷効果のIC50
B16細胞、CT26細胞、4T1細胞、LLC細胞、およびGL261細胞を96ウ
ェルプレートにウェルあたり5000細胞で広げた。これらを、上の方法によって調製し
た0.002MOI、0.02MOI、0.2MOI、1MOI、2MOIのDDvv-
mIL21ウイルスを用いて72時間に渡って感染させ、それから細胞を細胞殺傷につい
てMTT試薬を用いて試験し、異なる腫瘍細胞に対するDDvv-mIL21組換え体ワ
クシニアウイルスの殺傷効果の半数致死用量(IC50値)を計算した(n=3。1回の
実験)。結果は、B16細胞、CT26細胞、4T1細胞、LLC細胞、およびGL26
1細胞に対する組換え体ワクシニアウイルスのIC50がそれぞれ0.232MOI、0
.216MOI、0.07MOI、0.304MOI、および0.227MOIであると
いうことを示した(図7参照)。異なる腫瘍細胞に対する本発明の組換え体ワクシニアウ
イルスDDvv-mIL21のIC50値は低く(0.3MOIよりも小さいかまたはお
よそ等しい)、それは医薬利用の良好な見込みを有するということが分かる。
ワクシニアウイルスの殺傷効果
A549(ヒト非小細胞肺癌細胞)、SKOV3(ヒト卵巣腺癌細胞)、Hela(ヒ
ト子宮頚癌細胞)、U251(ヒト神経膠細胞腫細胞)を96ウェルプレートにウェルあ
たり5000細胞で広げ、一晩の培養および壁への接着後に、細胞を上の方法によって調
製された1MOIのDDvv-hIL21ウイルスに感染させた。24時間、48時間、
および72時間後に、MTTアッセイを用いて腫瘍細胞アポトーシスを検出測定した(n
=3。3回の繰り返し実験)。この試験のコントロール群は、負のコントロール群(ウイ
ルス感染なし)、組換え体ヒト由来IL-21蛋白質(rhIL-21。R&Dシステム
ズから購入)、および正のコントロール群(1μMパクリタキセル)であった。各実験群
および各コントロール群について3つのデュプリケートウェルを設け、細胞殺傷率は負の
コントロール群に対する実験群の比%値であった。結果は、Hela、A549、SKV
O3、U251細胞に対する組換え体ウイルスの殺傷効果が時間依存的であり、経時的に
強化されるということを示した(図8参照)。加えて、結果は、DDvv-hIL21ウ
イルスが各腫瘍細胞に対して48時間後には60%よりも多くの殺傷率を、72時間後に
は70%よりも多くの殺傷率を有するということをもまた示した。
ワクシニアウイルスの殺傷効果のIC50
A549、HepG2(ヒト肝臓癌細胞)、Hela、HT29(ヒト結腸直腸癌細胞
)、SKOV3(ヒト卵巣腺癌細胞)、PANC1(ヒト膵臓癌細胞)、SKHEP-1
(ヒト肝臓癌細胞)、FaDu(ヒト咽頭扁平上皮癌細胞)を96ウェルプレートにウェ
ルあたり5000細胞で広げた。細胞を、3倍段階希釈のMOIの上の方法によって調製
されたDDvv-hIL21ウイルスに感染させ、その結果、DDvv-hIL21ウイ
ルスのMOI濃度は0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10で
あった。感染の48時間後に、MTT試薬を用いて細胞殺傷を検出測定し、異なる腫瘍細
胞に対するウイルスの殺傷のIC50値を計算した(n=3。1回の実験)。この研究の
処置群およびコントロール群のそれぞれについては3つのデュプリケートウェルを設けた
。結果は、種々の腫瘍細胞に対する組換え体ワクシニアウイルスの殺傷のIC50値が0
.05および0.4MOIの間であり、これらは全て相対的に低いことを示した(図9参
照)。本発明の組換え体ワクシニアウイルスDDvv-hIL21は医薬利用の良好な見
込みを有することが分かる。
ワクシニアウイルスの抗腫瘍効果
腫瘍を持つ免疫健康マウスの構築:対数増殖期のB16細胞を用い、各C57BL/6
マウス(北京維通力華実験動物センター)の後ろ足背側に200,000細胞を皮下接種
して、腫瘍成長を観察した。腫瘍体積が約100~200mm3と測定されたときに、投
与を開始した。マウスを、それぞれ上の方法によって調製された5×106pfu(低用
量)、1×107pfu(高用量)のDDvv-mIL21を含有する100μlのPB
SおよびPBSの腫瘍内投与によって、群あたり3匹のマウスで処置した。マウスの腫瘍
サイズおよび体重を3日毎に測定した。結果は、組換え体ウイルスDDvv-mIL21
が腫瘍成長を有効に阻害し得、用量依存的であるということを示した(図10A)。投与
後の第9日には、各投与群のT/C(腫瘍抑制有効性。つまり、コントロール群の腫瘍サ
イズに対する投与群の腫瘍サイズのパーセンテージ比。これは値が<40%であるときに
有効である)は40%よりも小さかった(図10B)。マウスを第12日に屠殺し、腫瘍
を除去して腫瘍重量を検出測定した。これもまた類似の結果を示した(図10C)。
ワクシニアウイルスの抗腫瘍免疫活性化効果
対数増殖期のB16細胞を用いた。各C57/Bl6マウスの後ろ足背側に200,0
00細胞を皮下接種した。腫瘍成長を観察した。腫瘍体積が約100~200mm3と測
定されたときに、投与を開始した。マウスを、それぞれ5×106pfu(低用量)、1
×107pfu(高用量)の上の方法によって調製されたDDvv-mIL21を含有す
る100μlのPBSおよびPBSの腫瘍内投与によって、群あたり3匹のマウスで処置
した。マウスを2週後に屠殺して脾臓および腫瘍組織を採集し、脾臓のPBMCおよび腫
瘍組織の腫瘍細胞を抽出し、CD8+T細胞(CD3+CD8+)(抗体:抗マウスCD
3、抗マウスCD8a、eBioscience)およびCD4+T細胞(CD3+CD
4+)(抗体:抗マウスCD4、eBioscience)を、フローサイトメトリーを
用いて検出測定した。結果は、組換え体ウイルスDDvv-mIL21を与えられたマウ
スの脾臓PBMC中のCD8+T細胞およびCD4+T細胞の割合がPBS群と比較して
有意に増大するということを示した(図11A~B)。同時に、腫瘍組織の免疫細胞浸潤
の分析は、DDvv-mIL2高用量群のCD8+T細胞およびCD4+T細胞(TIL
)の割合がPBS群に対して相対的に増大するということを明らかにした(図11C~D
)。
ワクシニアウイルスの抗腫瘍効果
対数増殖期のLLC細胞を用い、各C57BL/6マウスの後ろ足背側に100万細胞
を皮下接種して、腫瘍成長を観察した。腫瘍体積が大体100~200mm3であるとき
に、投与を開始した。マウスを、それぞれ1×106pfu(低用量)、1×107pf
u(高用量)の上の方法によって調製されたDDvv-mIL21を含有する100μl
のPBSまたはコントロール群としての100μlのPBSの腫瘍内投与によって、群あ
たり5匹のマウスで処置した。各群の腫瘍サイズおよび体重を3日毎に測定した。結果は
、組換え体ウイルスDDvv-mIL21がLLC腫瘍の成長を用量依存的な様式で有効
に阻害し得るということを示した(図12A)。投与後の第9日に、高用量投与群のT/
Cは40%よりも小さかった(図12B)。
-hIL21ワクシニアウイルスおよびNK細胞の組み合わせの殺傷効果
SK-HEP-1細胞を24ウェル培養プレートに30%コンフルエントで播種し、3
7℃かつ5%CO2で24時間に渡ってMEM+10%FBS環境においてインキュベー
ションした。MOI=0.15の上の方法によって調製されたDDvv-hIL21ウイ
ルスをDMEM血清不含環境において追加した。6時間に渡って感染させた後で、MEM
+10%FBSを培地交換のために追加し、37℃かつ5%CO2で24時間に渡って培
養した。それから、新しいMEM+10%FBSを培地交換のために追加し、NK細胞を
追加し(エフェクター対標的細胞比NK:SK-HEP-1=5:1)、48時間に渡っ
てインキュベーションし続け、死細胞および破片を洗い落とした。残りのSK-HEP-
1生細胞をトリパンブルー染色によって計数した。実験群はDDvv-hIL21+NK
群であった。実験では、SK-HEP-1細胞の1つの群はウイルスおよびNKを追加せ
ず、ブランク群とした。1つの群はDDvv-hIL21ウイルスを対応する時点で追加
したが、ただしNKは追加せず、DDvv-hIL21ウイルス群とした。1つの群はN
Kを対応する時点で追加したが、DDvv-hIL21ウイルスは追加せず、NK群とし
た。1つの群はNKを対応する時点で追加し、同時にヒトIL21組換え体蛋白質を50
ng/mlの終濃度で追加したが、DDvv-hIL21ウイルスは追加せず、NK+I
L21群とした。1つの群はウイルスおよびNKは追加しなかったが、ヒトIL21組換
え体蛋白質は50ng/mlの終濃度で対応する時点で追加し、ブランク+IL21群と
した。各群の実験は3回以上繰り返し、平均値を取って統計分析をした。
値である)。DDvv-hIL21ウイルスおよびNK細胞の組み合わせ(腫瘍溶解性ウ
イルスを最初に投与し、後でNK細胞を投与した)はSK-HEP-1に対する有意な相
乗的な殺傷効果を示した。相乗的な阻害率は約87%である。この実験では、DDvv-
hIL21ウイルス単独の阻害率はおよそ47%であり、NK細胞単独の阻害率はおよそ
11%であり、NK+IL21群の阻害率はおよそ22%であり、ブランク+IL21群
の阻害率は約1%であった。ブランク群の阻害率は約0であった(図13には示されてい
ない)。
ウイルスを最初に投与し、後でNK細胞を投与した)が、SK-HEP-1細胞に対する
有意な相乗的な殺傷効果を有し、相乗的な阻害率は約87%であるということを示した。
るDDvv-mIL21ワクシニアウイルスの抗腫瘍効果
腫瘍を持つ薬剤性免疫低下マウスの構築:対数増殖期のB16細胞を用い、各C57B
L/6マウスの後ろ足背側に200,000細胞を皮下接種して、腫瘍成長を観察した。
腫瘍体積が大体80~150mm3と測定されたときに、実験の終わりまでの毎日30m
g/kgのシクロスポリンの腹腔内注射を開始した。次の日に(すなわち、接種の10日
後に)、マウスを、それぞれ1×105pfu(低用量)、1×106pfu(中用量)
、1×107pfu(高用量)の上の方法によって調製されたDDvv-mIL21を含
有する100μlのPBSおよび100μlのPBSの腫瘍内投与によって、群あたり5
匹で処置した。腫瘍サイズおよび体重を3日毎に測定した。結果は、組換え体ウイルスD
Dvv-mIL21が腫瘍成長を有効に阻害し得、用量依存的であることを示した(図1
4A)。投与後の第9日(すなわち、接種後の第19日)には、中用量群および高用量群
のT/C(有効腫瘍阻害率。つまり、コントロール群の腫瘍サイズに対する投与群の腫瘍
サイズのパーセンテージ。これは、40%よりも低いときに、医薬が有効であるというこ
とを指示する)は40%よりも小さかった(図14B)。
るDDvv-mIL21ワクシニアウイルスおよびコントロールワクシニアウイルスの抗
腫瘍効果の比較
対数増殖期のB16細胞を用いた。各C57BL/6マウスの後ろ足背側に200,0
00細胞を皮下接種した。腫瘍成長を観察した。腫瘍体積が大体80~150mm3と測
定されたときに、実験の終わりまでの毎日30mg/kgのシクロスポリンの腹腔内注射
を開始した。次の日に、マウスを、それぞれ1×106pfuの上の方法によって調製さ
れたDDvv-mIL21、1×106pfuのDDvv-RFPを含有する100μl
のPBS、および100μlのPBSの腫瘍内投与によって、群あたり3匹で処置した。
各群の腫瘍サイズおよび体重を3日毎に測定した。結果は、DDvv-RFPと比較して
、DDvv-mIL21が腫瘍成長を有効に阻害し得るということを示した(図15A)
。投与後の第6日から、DDvv-mIL21群のT/Cは全て40%よりも小さかった
(図15B)。実験後に、マウスを屠殺し、腫瘍組織を採集および秤量した。DDvv-
mIL21群の腫瘍重量は有意に縮減された(図15C)。同時に、腫瘍組織のTIL(
CD8+T細胞(CD3+CD8+)(抗体:抗マウスCD3、抗マウスCD8a、eB
ioscience)およびCD4+T細胞(CD3+CD4+)(抗体:抗マウスCD
3、抗マウスCD4、eBioscience)を包含する)およびNK細胞(CD3-
NK1.1+)(抗体:抗マウスNK1.1、eBioscience)の含量を、フロ
ーサイトメトリーによって検出測定した。結果は、DDvv-RFPおよびDDvv-m
IL21の投与が腫瘍組織のTIL含量を有意に改善し得るということを示した。DDv
v-RFP群と比較して、腫瘍TIL中のCD4+T細胞がDDvv-mIL21群では
有意に増大しているということが示された(図16A~C)。
るDDvv-hIL21ワクシニアウイルスおよびヒトNK細胞の組み合わせならびにコ
ントロールワクシニアウイルスおよびヒトNK細胞の組み合わせの抗腫瘍効果の比較
重度免疫不全NCGマウス(浙江省動物センターから得た)を用いて、マウスの後ろ足
背側に500万個のHCT116細胞を皮下接種した。腫瘍成長を観察した。腫瘍体積が
約80~150mm3と測定されたときに(接種後の約第7日に)、マウスを、それぞれ
5×106pfuのDDvv-hIL21ウイルス、5×106pfuのコントロールワ
クシニアウイルスを含有する100μlのPBS、および100μlのPBSの腫瘍内投
与によって、群あたり5匹のマウスで処置した。次の日から、各マウスの尾静脈に5×1
07個のNK細胞/日を投与し、投与を3日に渡って続け、3日に渡って止め、これを1
サイクルとした。トータルで3サイクルのNK細胞を投与した。腫瘍サイズおよび体重を
ウイルス投与の始まりから2~5日毎に測定した。結果は、腫瘍溶解性ワクシニアウイル
スDDvv-RFPおよびDDvv-hIL21両方が腫瘍成長を有効に阻害し得、DD
vv-hIL21がDDvv-RFPよりも良好な腫瘍抑制効果を示すということを示し
た(図17A)。DDvv-RFPおよびDDvv-hIL21群の両方は投与の12日
後から40%よりも小さいT/Cを有した(図17B)。実験後に、マウスを屠殺し、腫
瘍組織を採集した。定量PCRによって、腫瘍組織のワクシニアウイルスのA46R遺伝
子の発現レベル(標的遺伝子のプライマー配列は5’-CAGGGAAACGGATGT
ATA-3’(配列番号8)および5’-TGTGTTACAGAATCATATAAG
G-3’(配列番号9)であった)、IL-21遺伝子の発現レベル(標的遺伝子のプラ
イマー配列は5’-CCAACTAAAGTCAGCAAATACAGG-3’(配列番
号10)および5’-CTTTCTAGGAATTCTTTGGGTGG-3’(配列番
号11)であった)、NK細胞のNKG2D遺伝子の発現レベル(標的遺伝子のプライマ
ー配列は5’-GGCTTTTATCCACAAGAATCAAGATC-3’(配列番
号12)および5’-GTGCACGTCTACCGCAGAGA-3’(配列番号13
)であった)、IFN-γ遺伝子の発現レベル(標的遺伝子のプライマー配列は5’-A
GTGTGGAGACCATCAAGGAAG-3’(配列番号14)および5’-GT
ATTGCTTTGCGTTGGACAT-3’(配列番号15)であった)を検出測定
した。ハウスキーピング遺伝子GAPDHを内部参照として用いた(標的遺伝子のプライ
マー配列は5’-GGTCTCCTCTGACTTCAACA-3’(配列番号16)お
よび5’-AGCCAAATTCGTTGTCATAC-3’(配列番号17)であった
)。標的遺伝子の発現量はpg/GAPDHのμgとする。結果は、腫瘍内のDDvv-
hIL21腫瘍溶解性ウイルスの複製がコントロールワクシニアウイルスDDvv-RF
Pと有意には異ならないということを示し(図18A)、IL21の発現は、腫瘍組織内
のDDvv-hIL21腫瘍溶解性ウイルスの存在をさらに検証した(図18B)。DD
vv-RFPウイルスを投与されたコントロール群と比較して、腫瘍のNK含量はDDv
v-hIL21腫瘍溶解性ウイルスを投与された群では有意に増大し(図18C)、免疫
因子INF-γの発現もまた増大する(図18D)ということが見いだされた。
ルスの分布
対数増殖期のB16細胞を用いた。各雌C57/Bl6マウスの後ろ足背側に200,
000細胞を皮下接種した。腫瘍成長を観察した。腫瘍体積が約100~200mm3と
測定されたときに、マウスに、上の方法によって調製された5×109pfuのDDvv
-mIL21腫瘍溶解性ウイルスを含有する100μlのPBSを、トータル4匹のマウ
スで静脈内投与した。マウスを1週後に屠殺して心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、脳、卵巣
、および腫瘍組織を採集した。PCR法を用いて種々の臓器におけるワクシニアウイルス
の分布を検出測定した。具体的には、各組織および臓器におけるワクシニアウイルスのA
46R遺伝子の発現量を腎臓におけるワクシニアウイルスのA46R遺伝子の発現量と比
較した(標的遺伝子のプライマー配列は5’-CAGGGAAACGGATGTATA-
3’(配列番号8)および5’-TGTGTTACAGAATCATATAAGG-3’
(配列番号9)であった)。結果は、投与されたDDvv-mIL21腫瘍溶解性ウイル
スが主に腫瘍組織に分布するということを示した。DDvv-mIL21腫瘍溶解性ウイ
ルスはそれらの中の1匹のマウスの卵巣組織においてもまた検出測定され、ウイルスは他
の臓器では検出測定されなかった(図19)。
1ワクシニアウイルスおよびNK細胞の組み合わせの殺傷効果
HepG2細胞を24ウェル培養プレートに30%コンフルエントで播種し、DMEM
+10%FBS環境において37℃かつ5%CO2で24時間に渡ってインキュベーショ
ンした。DMEM血清不含環境において、MOI=0.027の上の方法によって調製さ
れたDDvv-hIL21ウイルスを追加して細胞を6時間に渡って感染させ、それから
溶液をDMEM+10%FBSに交換し、インキュベーションを37℃かつ5%CO2で
18時間に渡って続けた。それから、液を新しいDMEM+10%FBSに交換し、NK
細胞を追加し(エフェクター対標的細胞比NK:HepG2=3:1)、インキュベーシ
ョンを48時間に渡って続け、死細胞および破片を洗い落とし、残りのHepG2生細胞
をトリパンブルー染色によって計数した。この実験群はDDvv-hIL21+NK群で
ある。実験では、HepG2細胞の1つの群はウイルスおよびNKを追加せず、ブランク
(BK)群とした。1つの群はDDvv-hIL21ウイルスを対応する時点で追加した
が、ただしNKは追加せず、DDvv-hIL21ウイルス群とした。1つの群はNKを
対応する時点で追加したが、ただしDDvv-hIL21ウイルスは追加せず、NK群と
した。1つの群はNKを対応する時点で追加し、同時にヒトIL21組換え体蛋白質を5
0ng/mlの終濃度で追加したが、ただしDDvv-hIL21ウイルスは追加せず、
NK+IL21群とした。1つの群はウイルスおよびNKは追加しなかったが、ただしヒ
トIL21組換え体蛋白質を50ng/mlの終濃度で上のNK追加時点に対応する時点
で追加し、ブランク+IL21群とした。上のコントロール群では、対応する時点で液を
交換した。各群の実験は3回以上繰り返し、平均値を取って統計分析をした。
値である)。DDvv-hIL21ウイルスおよびNK細胞の組み合わせ使用(腫瘍溶解
性ウイルスを最初に投与し、後でNK細胞を投与した)はHepG2に対する有意な相乗
的な殺傷効果を有し、相乗的な阻害率は約71%である。この実験では、DDvv-hI
L21ウイルス単独の阻害率は約34%であり、NK細胞単独の阻害率は約14%であっ
た。2つの合計を図中の点線によって示す。加えて、NK+IL21群の阻害率は約25
%であり、ブランク+IL21群の阻害率は約2%であった。ブランク群の阻害率は約0
であった(図20には示されていない)。
ウイルスを最初に投与し、後でNK細胞を投与した)がHepG2細胞に対する有意な相
乗的殺傷効果を有し、相乗的な阻害率は約71%であるということを示した。
hIL21ワクシニアウイルスおよびヒトNK細胞の組み合わせならびにコントロールワ
クシニアウイルスおよびヒトNK細胞の組み合わせの殺傷効果の比較
実験から、HCT116細胞に対するDDVV-RFPの殺傷用量は好適には約MOI
=0.7であり、HCT116細胞に対するNK細胞の殺傷用量は好適にはエフェクター
対標的細胞比NK:HCT116が約5:1であるということが決定された。
イ5A+10%FBS環境において37℃かつ5%CO2で24時間に渡ってインキュベ
ーションした。マッコイ5Aの血清不含環境において、MOI=0.7の上の方法によっ
て調製されたDDVV-hIL21またはDDVV-RFPを追加して、細胞を6時間に
渡って感染させ、それからマッコイ5A+10%FBS環境において18時間に渡って3
7℃かつ5%CO2でさらにインキュベーションした。NK細胞(エフェクター対標的細
胞比NK:HCT116=5:1)を爾後に追加し(培地は交換しなかった)、インキュ
ベーションを48時間に渡って続けた。死細胞および破片を洗い落とし、残りのHCT1
16生細胞をトリパンブルー染色によって計数した。実験群はそれぞれDDVV-RFP
+NK群およびDDVV-hIL21+NK群であった。実験では、HCT116細胞の
1つの群をキープし、ウイルスおよびNKは追加せず、ブランク群とした。1つの群は、
ウイルスおよびNKは追加しなかったが、ただしヒトIL21組換え体蛋白質を50ng
/mlの終濃度で上のNK追加時点に対応する時点で追加し、ブランク+IL21群とし
た。1つの群は、DDVV-RFPのみを対応する時点で追加したが、ただしNKを追加
せず、DDVV-RFP群とした。1つの群はDDVV-hIL21のみを対応する時点
で追加したが、ただしNKは追加せず、DDVV-hIL21群とした。1つの群はNK
を対応する時点で追加したが、ただしウイルスは追加せず、NK群とした。1つの群はN
Kを対応する時点で追加し、同時にヒトIL21組換え体蛋白質を50ng/mlの終濃
度で追加したが、ウイルスは追加せず、NK+IL21群とした。1つの群はDDVV-
RFPおよびNKを対応する時点で追加し、ヒトIL21組換え体蛋白質を50ng/m
lの終濃度でNK追加と同じ時点で追加し、DDVV-RFP+NK+IL21群とした
。コントロール群では、対応する時点で液交換操作をした。各群の実験は3回以上繰り返
し、平均値を取って統計分析をした。
ンテージ値である)、DDvv-hIL21ウイルスおよびNK細胞の組み合わせ使用(
腫瘍溶解性ウイルスを最初に投与し、後でNK細胞を投与した)はHCT116細胞に対
する有意な相乗的な殺傷効果を有し、相乗的な阻害率は約86%である。この実験では、
DDvv-hIL21ウイルス単独の阻害率は約43%であり、NK細胞単独の阻害率は
約10%であった。2つの合計を図中の点線によって示す。ブランク群の阻害率は約0で
あった(図21AまたはBには示されていない)。
のパーセンテージ値である)、HCT116細胞に対するDDVV-hIL21およびN
K細胞の組み合わせ使用の殺傷効果(阻害率は約86%であった)は、同じ用量のDDV
V-RFPおよびNK細胞の組み合わせの殺傷効果(阻害率は約67%であった)よりも
有意に高く、同じ用量のDDVV-RFPおよびNK細胞ならびにヒトIL21組換え体
蛋白質の組み合わせの殺傷効果(阻害率は約64%であった)よりもまた有意に高い。D
DVV-RFP単独の阻害率は約37%であり、ブランク+IL21群の阻害率は検出測
定されず、NK+IL21群の阻害率は約12%であった。他の群のデータは上と同じで
あった。
にHCT116細胞を殺傷し、同時に外来性のIL-21を発現し、それによって、発現
された外来性のIL-21がNK細胞の致死性を強化し、HCT116に対するNK細胞
の殺傷効果をさらに強化し、その結果、DDVV-hIL21およびNK細胞の組み合わ
せがHCT116細胞を殺傷する点で驚くべき効果を見せるということを指示している。
L21ワクシニアウイルスおよびヒトNK細胞の組み合わせならびにコントロールワクシ
ニアウイルスおよびヒトNK細胞の組み合わせの殺傷効果の比較
FaDu細胞を24ウェル培養プレートに30%コンフルエントで播種し、MEM+1
0%FBS環境において37℃かつ5%CO2で24時間に渡ってインキュベーションし
た。MEMの血清不含環境において、MOI=0.2の上の方法によって調製されたDD
VV-hIL21またはDDVV-RFPを追加して6時間の感染を許し、それからME
M+10%FBS環境において37℃かつ5%CO2で18時間に渡ってさらにインキュ
ベーションした。NK細胞(エフェクター対標的細胞比NK:FaDu=5:1)を爾後
に追加し(培地は交換しなかった)、インキュベーションを48時間に渡って続けた。死
細胞および破片を洗い落とした。残りのFaDu生細胞をトリパンブルー染色によって計
数した。実験群はそれぞれDDVV-RFP+NK群およびDDVV-hIL21+NK
群であった。実験では、FaDu細胞の1つの群はウイルスおよびNKを追加せず、ブラ
ンク群とした。1つの群はウイルスおよびNKを追加しなかったが、ヒトIL21組換え
体蛋白質を50ng/mlの終濃度で上のNK追加時点に対応する時点で追加し、ブラン
ク+IL21群とした。1つの群はDDVV-RFPのみを対応する時点で追加したが、
ただしNKは追加せず、DDVV-RFP群とした。1つの群はDDVV-hIL21の
みを対応する時点で追加したが、ただしNKは追加せず、DDVV-hIL21群とした
。1つの群はNKを対応する時点で追加したが、ウイルスは追加せず、NK群とした。1
つの群はNKを対応する時点で追加し、同時にヒトIL21組換え体蛋白質を50ng/
mlの終濃度で追加したが、ただしウイルスを追加せず、NK+IL21群とした。1つ
の群はDDVV-RFPおよびNKを対応する時点で追加し、NKの追加と同時にヒトI
L21組換え体蛋白質を50ng/mlの終濃度で追加し、DDVV-RFP+NK+I
L21群とした。コントロール群では、対応する時点で対応する液交換操作をした。各群
の実験は3回以上繰り返し、平均値を取って統計分析をした。
ンテージ値である)、DDvv-hIL21ウイルスおよびNK細胞の組み合わせ使用(
腫瘍溶解性ウイルスを最初に投与し、後でNK細胞を投与した)はFaDu細胞に対する
有意な相乗的な殺傷効果を有し、相乗的な阻害率は約73%である。この実験では、DD
vv-hIL21ウイルス単独の阻害率は約37%であり、NK細胞単独の阻害率は約1
3%であった。2つの合計は図中の点線によって示されている。ブランク群阻害率は約0
であった(図22AまたはBには示されていない)。
のパーセンテージ値である)、FaDu細胞に対するDDVV-hIL21およびNK細
胞の組み合わせ使用の殺傷効果(阻害率は約73%であった)は、同じ用量のDDVV-
RFPおよびNK細胞の組み合わせの殺傷効果(阻害率は約66%であった)よりも有意
に高く、同じ用量のDDVV-RFPおよびNK細胞ならびにヒトIL21組換え体蛋白
質の組み合わせのもの(阻害率は約65%であった)よりもまた有意に高い。DDVV-
RFP単独の阻害率は約39%であり、ブランク+IL21群の阻害率は検出測定されず
、NK+IL21群の阻害率は約14%であった。他の群のデータは上と同じであった。
aDu細胞を殺傷し、同時に外来性のIL-21を発現し、それによって、発現された外
来性のIL-21がNK細胞の致死性を増大させ、それゆえにFaDuに対するNK細胞
の殺傷効果をさらに強化し、その結果、DDVV-hIL21およびNK細胞の組み合わ
せがFaDu細胞を殺傷する点で驚くべき効果を見せるということを指示している。
Claims (18)
- 組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスがTK遺伝子およびVGF遺伝子を機能欠損し
、組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスのゲノムが外来性のIL-21遺伝子をインテ
グレーションされ、IL-21遺伝子が腫瘍細胞内で発現されることができる、単離され
た組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルス。 - TK遺伝子が外来性のヌクレオチド配列を挿入されることによって機能欠損する、請求
項1に記載の組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルス。 - 外来性のIL-21遺伝子がTK遺伝子内に挿入され、それによってTK遺伝子の機能
欠損を引き起こす、請求項1に記載の組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルス。 - VGF遺伝子が、ノックアウトされることまたは外来性のヌクレオチド配列を挿入され
ることによって機能欠損する、請求項1に記載の組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルス
。 - 組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスがWyeth株またはWR株である、請求項1
に記載の組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルス。 - 組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスのゲノムがさらに外来性のスクリーニング遺伝
子をインテグレーションされ、外来性のスクリーニング遺伝子がgpt遺伝子および/ま
たはLacZ遺伝子を包含するが、蛍光蛋白質遺伝子を包含しない、請求項1に記載の組
換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルス。 - 外来性のIL-21遺伝子がマウスまたはヒトに由来する、請求項1または5に記載の
組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルス。 - 医薬組成物が、活性成分としての請求項1~7のいずれか1項に記載の組換え体腫瘍溶
解性ワクシニアウイルスと薬学的に許容される添加剤とを含む、医薬組成物。 - 医薬組成物が組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを1×105~5×109pfu
/日の用量で含む、請求項8に記載の医薬組成物。 - 組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、それが腫瘍内注射または静脈内投与によっ
て投与されるように製剤される、請求項8に記載の医薬組成物。 - ベクターがプロモーターのコントロール下の外来性のIL-21遺伝子を含む、請求項
1~7のいずれか1項に記載の組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを調製するための
ベクター。 - 請求項11に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 腫瘍および/または癌の処置のための医薬の調製のための、請求項1~7のいずれか1
項に記載の組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの使用。 - 腫瘍および/または癌が肺癌、黒色腫、頭頸部癌、肝臓癌、脳腫瘍、結腸直腸癌、膀胱
癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頚癌、リンパ腫、胃癌、食道癌、腎臓癌、前立腺癌、膵
臓癌、白血病、骨癌、精巣癌を包含する、請求項13に記載の使用。 - 請求項1~7のいずれか1項に記載の組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを腫瘍お
よび/または癌患者に投与することを含む、腫瘍および/または癌を処置するための方法
。 - 組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、1×105~5×109pfu/日の用量
で、1日1回、連続1~6日に渡って投与される、請求項15に記載の方法。 - 組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが腫瘍内注射または静脈内投与によって投与さ
れる、請求項15に記載の方法。 - 腫瘍および/または癌が肺癌、黒色腫、頭頸部癌、肝臓癌、脳腫瘍、結腸直腸癌、膀胱
癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頚癌、リンパ腫、胃癌、食道癌、腎臓癌、前立腺癌、膵
臓癌、白血病、骨癌、精巣癌を包含する、請求項15に記載の方法。
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