JP7242829B2 - 新規細菌lpp突然変異体及び組換えタンパク質の分泌産生のためのその使用 - Google Patents
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Description
i 以下のii及びiiiに連結している、ペリプラズムへのタンパク質の移動を媒介するN末端シグナルペプチドをコードするDNA断片
ii 野生型lpp遺伝子によってコードされるリポタンパク質Lppと比較して、最大で10個のアミノ酸の相違を有するリポタンパク質(Lpp(N))をコードするiに続くDNA配列(lpp(N))及び
iii 野生型lpp遺伝子によってコードされるリポタンパク質(Lpp)と比較して、最大で10個のアミノ酸の相違を有するリポタンパク質(Lpp(C))をコードするさらなるDNA配列(lpp(C))
i) Lpp(N) 野生型Lppタンパク質に存在するC末端アミノ酸リジンが突然変異するか、
ii) Lpp(C) 野生型Lppタンパク質に存在するN末端アミノ酸システインが突然変異する
という点で、野生型Lppタンパク質のアミノ酸配列と異なることを特徴とすることが好ましい。
SP、シグナルペプチド
Cys、アミノ酸システイン
Lys、アミノ酸リジン
Gly、アミノ酸グリシン
L、0~20個のアミノ酸からなる存在する可能性があるリンカー配列
Lpp、Lpp野生型タンパク質のアミノ酸配列
Lpp(N)、Lpp野生型配列に基づいて、最大で10個のアミノ酸位置に突然変異がある、Lppのアミノ酸配列のN末端に位置する複製
Lpp(C)、Lpp野生型配列に基づいて、最大で10個のアミノ酸位置に突然変異がある、Lppのアミノ酸配列のC末端に位置する複製
Lpp(N)ΔLys78、Lpp野生型配列に基づいて78位のアミノ酸リジンを欠く、Lppのアミノ酸配列のN末端に位置する複製
Lpp(C)ΔCys21、Lpp野生型配列に基づいて21位のアミノ酸システインを欠く、Lppのアミノ酸配列のC末端に位置する複製
-、破線はアミノ酸の欠失を表す
tac p/o:tacプロモーター/オペレーター
EcoRI:制限酵素EcoRIの切断部位
cgt-SP:CGTaseのシグナルペプチド
HC:Fab断片CD154の重鎖のORF
phoA-SP:phoAシグナルペプチド
LC:Fab断片CD154の軽鎖のORF
His-Tag:Fab断片の軽鎖のC末端のHisタグ
rrnB:ターミネーター
bla:β-ラクタマーゼ遺伝子(アンピシリン耐性)
ColE1:ColE1複製起点
TcR:テトラサイクリン耐性遺伝子
lacIq:tacプロモーターのリプレッサー
Lpp融合タンパク質を形成する菌株の生成に用いられた出発菌株は、大腸菌lpp野生型株JE5512(HfrC man pps)であった(Hirotaら 1977、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74、1417~1420頁、国立遺伝学研究所微生物遺伝学研究所、NBRP大腸菌、411-8540日本静岡県三島市谷田1111から入手した菌株)。
2xLppΔタンパク質をコードするDNA断片を、「オーバーラップ伸長」PCRの方法により作製した(Hortonら 2013、BioTechniques 54、129-33)。この目的のために、JE5512の染色体DNAを最初に鋳型とした。これは野生型lpp遺伝子を含む。
次の段階では、cat-sacBカセットを2xlppΔで置き換えた。この目的のために、Datsenko及びWannerの方法(上記参照)により、PCR5からの産物をJE5512 lpp::cat-sacB pKD46株のコンピテント細胞に形質転換した。野生型lpp遺伝子の元の位置でのJE5512 lpp::cat-sacB pKD46の染色体への2xlppΔの一体化のための選択を、7%のショ糖を含むLB寒天プレート上で行った。sacBの発現のない細胞のみがショ糖含有培地上で増殖できるので、cat-sacBカセットが2xlppΔ(JE5512 2xlppΔ)に置き換えられた細胞を選択することができた。オリゴヌクレオチドpykF(配列番号8)及びynhG2(配列番号9)及びショ糖耐性細胞の染色体DNAを鋳型として用いるPCRにより、染色体の正しい位置に一体化が行われていることを確認した。一体化された2xlppΔの配列は、PCR産物の配列決定によって確認した。その結果得られた株をJE5512 2xlpΔと命名した。
本実施例は、ヒト化モノクローナル抗CD154抗体5c8のFab断片の作製を記述し、その配列は、野生型lpp株及びlpp3突然変異体と比較して、大腸菌JE5512 2xlppΔ株を用いて、Karpusasら(2001、Structure 9、321~329頁)に公表されている。US2008/0254511A1号に記載されているプラスミドpJF118utを、抗CD154 Fab断片の遺伝子のクローニング及び発現のための出発ベクターとして使用した。pJF118utを、Microorganisms and Cell Cultures GmbH(ブラウンシュヴァイク)のDSMZ-ドイツコレクションに番号DSM 18596で寄託する。いずれの場合もシグナル配列を含む、Fab断片の重鎖(VH-CH1ドメイン)及び軽鎖(VL-CLドメイン)についての2つの読み枠を、前記プラスミド中にクローン化した。このために、以下の手順を実施した。すなわち、配列番号17のDNA断片を遺伝子合成(Eurofins Genomics)により作製した。それは、
i 配列番号5に由来するシグナル配列及び
ii Fab断片の重鎖の読み枠
からなる遺伝子融合、及び
i 大腸菌のphoAシグナル配列及び
ii Fab断片の軽鎖の読み枠及び
iii 軽鎖のC末端の4つのアミノ酸からなるリンカー及び
iv リンカーのC末端のヘキサヒスチジンタグ
からなる遺伝子融合を含んでいた。
発酵装置スケールでの抗CD154 Fab抗体断片の作製のために、JE5512、JE5512 lpp3及びJE5512 2xlppΔ株を、CaCl2法によりプラスミドpJF118ut-CD154で形質転換した。プラスミド含有細胞の選択は、テトラサイクリン(20mg/l)を用いて行った。
アッセイ緩衝液:5mMのTris HCl緩衝液、5mMのCaCl2×2H2O、pH6.5
基質液:アッセイ緩衝液中の10%デンプン溶液(Merck No.1.01252)、pH6.5
アッセイミックス:基質溶液0.2ml+適切に希釈したCGTase試料(培養上清又は均質化し清澄化した培養ブロス)0.2ml
反応温度:40℃
* 基質溶液及びCGTase含有試料の事前調整(40℃で約5分)
* 基質溶液とCGTase含有試料を速やかに混合(渦巻きミキサー)してアッセイミックスを調製し、必要ならばアッセイ緩衝液で試料を希釈し、その後のHPLC分析で0.9~1.5g/l CDの値を決定する
* 40℃で3分間インキュベート
* メタノール0.6ml添加、迅速混合(渦巻きミキサー)による酵素反応停止
* 氷上でのミックスの冷却(約5分)
* 遠心分離(5分、12000rpm)し、透明な上清をピペットオフ(pipette off)する
* HPLCによるCD産生量の分析:Nucleodur 100-3 NH2-RPカラム(150mm×4.6mm、Macherey-Nagel)及び移動相として水中の64%アセトニトリル(v/v)を用いるAgilent HP 1100 HPLCシステムで、流速2.1ml/分で分析を行った。検出はRI検出器(1260 Infinity RI、Agilent)を用いて行い、ピーク面積及びα-CD標準物質(Cavamax W6-8 Pharma、Wacker)に基づいて定量を行った。
A=活性、
G=CD含有量(mg/l)
V1=アッセイミックスにおける希釈係数
V2=アッセイに用いる前のCGT含有試料の希釈係数、希釈していない場合はV2=1
t=分で表される反応時間
MG=g/molで表される分子量(MGCD=973g/mol)
1単位(U)は1μmol/l製品(CD)/分に相当する。
Claims (11)
- 組換えタンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子を含む大腸菌株の細菌株であって、以下からなるオープンリーディングフレームを含むことを特徴とする細菌株:
i 以下のii及びiiiに連結している、ペリプラズムへのタンパク質の移動を媒介するN末端シグナルペプチドをコードするDNA断片、ここで、N末端シグナルペプチドは、配列番号2のアミノ酸1~20のアミノ酸配列であるか、又は、アミノ酸位置14において、グリシンの代わりに、タンパク質を構成する任意の他のアミノ酸を含み、他の全てのアミノ酸位置において野生型Lppタンパク質のシグナルペプチドと同一である(アミノ酸の番号付け及び配列は、配列番号2のアミノ酸1~20に基づく)か、又は、大腸菌のリポタンパク質Pal、NlpI、NlpB若しくはOsmBのシグナルペプチドである、
ii 配列番号2のアミノ酸21~78又はアミノ酸21~77のいずれかで特定されるリポタンパク質(Lpp(N))をコードするiに続くDNA配列(lpp(N))であって、配列番号2のアミノ酸位置77のアルギニンは、タンパク質を構成する任意の他のアミノ酸で置き換えられてもよい、DNA配列、及び
iii 配列番号2のアミノ酸21~78又はアミノ酸22~78のいずれかで特定されるリポタンパク質(Lpp(C))をコードするさらなるDNA配列(lpp(C))であって、配列番号2のアミノ酸位置77のアルギニンは、タンパク質を構成する任意の他のアミノ酸で置き換えられてもよい、DNA配列。 - 配列番号2のアミノ酸21~78と比較して少なくとも80%の同一性を有するタンパク質をコードするさらなる遺伝子を含まないことを特徴とする、請求項1に記載の細菌株。
- Lpp(N)及びLpp(C)が、1個から複数のアミノ酸からなるリンカーにより連結されていることを特徴とする、請求項1又は2に記載の細菌株。
- lpp(N)又はlpp(C)によってコードされるアミノ酸配列の少なくとも1つにおいて、アミノ酸位置77のアルギニンの代わりに存在するものが、タンパク質を構成する他の任意のアミノ酸であることを特徴とする(アミノ酸の番号付け及び配列は、配列番号2に基づく)、請求項1~3のいずれか一項に記載の細菌株。
- lpp(N)又はlpp(C)によってコードされるアミノ酸配列の少なくとも1つについて77位におけるタンパク質を構成するアミノ酸が、システインであることを特徴とする、請求項4に記載の細菌株。
- N-末端シグナルペプチドの位置14におけるタンパク質を構成するアミノ酸が、アスパラギン酸であることを特徴とする、請求項5に記載の細菌株。
- リンカー配列を形成するアミノ酸が、グリシン、セリン及びアラニンからなる群から選択されることを特徴とする、請求項3に記載の細菌株。
- 前記オープンリーディングフレームが、配列番号1の代わりに、染色体に位置することを特徴とする、請求項7に記載の細菌株。
- 組換えタンパク質が、異種タンパク質であることを特徴とする、請求項1~8のいずれか一項に記載の細菌株。
- 請求項1~9のいずれか一項に記載の細菌株を発酵培地で培養し、発酵後、細胞から前記発酵培地を除去し、前記発酵培地からタンパク質を単離することを特徴とする、組換えタンパク質の発酵産生方法。
- 組換えタンパク質が、発酵培地の除去後に発酵培地から精製されることを特徴とする、請求項10に記載の方法。
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