JP7242057B2 - 薬物性腎損傷を予防及び治療するための方法 - Google Patents
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Description
(i)項1~58のいずれか1項に記載の方法に使用されるプラスミノーゲン、またはプラスミノーゲンを含む薬物組成物とを含む製品であって、前記ラベルは、項1~58のいずれか1項に記載の方法を実施するように前記プラスミノーゲンまたは組成物を前記被験者に投与することを指示する、製品に係る。
(i)項1~58のいずれか1項に記載の方法に使用されるプラスミノーゲン、またはプラスミノーゲンを含む薬物組成物とを含む製品であって、前記ラベルは、項1~58のいずれか1項に記載の方法を実施するように前記プラスミノーゲンまたは組成物を前記被験者に投与することを指示する、製品に係る。
「腎臓病変」とは、様々な原因に起因する腎臓構造と機能障害のことである。
分数X/Y×100
プラスミノーゲンは治療の用途に用いられるために、自然界から分離及び精製されるものでもよく、標準的な化学ペプチド合成技術によって合成することでもよい。化学的手法によりポリペプチドを合成する際、液相または固相で合成を行うことができる。固相ポリペプチド合成(SPPS)(配列のC末端アミノ酸を不溶性支持体に附着させ、順番に配列中の残りのアミノ酸を添加する)はプラスミノーゲンの化学的合成に適したものである。各種形式のSPPS、例えばFmoc及びBocは、プラスミノーゲンの合成に用いることができる。固相合成に用いられる技術は以下に記載されている:Barany及びSolid-Phase Peptide Synthesis;3-284ページ、The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology.第二巻:Special Methods in Peptide Synthesis,Part A.,Merrifield,tら J.Am.Chem.Soc.,85:2149-2156(1963);Stewartら,Solid Phase Peptide Synthesis,2nd ed.Pierce Chem.Co.,Rockford,Ill.(1984);及びGanesan A.2006Mini Rev.Med Chem.6:3-10及びCamarero JAら 2005Protein Pept Lett.12:723-8。簡単に言えば、その上にペプチド鎖が構築されている機能性ユニットにより不溶性の多孔ビーズを処理する。カップリング/脱保護の繰り返し循環後に、附着した固相の遊離N末端アミンと単一のN保護を受けているアミノ酸ユニットをカップリングさせる。それから、該ユニットを脱保護し、他のアミノ酸と接続する新しいN末端アミンを露出させる。ペプチドを固相上に固定したままにし、それからそれを切除する。
所望の純度のプラスミノーゲンと必要に応じた薬用担体、賦形剤、または安定化剤(Remington’s Pharmaceutical Sciences,第16版,Osol,A.ed.(1980))を混合して凍結乾燥製剤または水溶液を形成して治療用の配合剤を得る。許容可能な担体、賦形剤、安定化剤は所要の用量及び濃度下において被験者に対して毒性がなく、さらに例えばリン酸塩、クエン酸塩及びその他の有機酸などの緩衝剤を含む。抗酸化剤はアスコルビン酸和メチオニンを含む;防腐剤(例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド;塩化ヘキサメチレンジアミン;塩化ベンザルコニウム(benzalkonium chloride)、ベンゼトニウムクロリド;フェノール、ブタノールまたはベンジルアルコール;アルキルパラヒドロキシ安息香酸エステル、例えばメチルまたはプロピルパラヒドロキシ安息香酸エステル;ピロカテコール;レソルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;m-クレゾール);低分子量ポリペプチド(少なくとも10個の残基を有するもの);タンパク質例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン;親水性重合体、例えばポリビニルピロリドン;アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン酸、ヒスチジン、アルギニンまたはリシンである;単糖、二糖及びその他の炭水化物はグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む;キレート剤は例えばEDTAである;糖類は例えばショ糖、マンニトール、フコースまたはソルビトールである;塩形成対イオン、例えばナトリウム;金属複合体(例えば亜鉛-タンパク複合体);及び/または非イオン界面活性剤、例えばTWEENTM、PLURONICSTMまたはポリエチレングリコール(PEG)である。好ましくは凍結乾燥された抗-VEGF抗体配合剤であり、WO 97/04801に記載されているとおりであり、本明細書において参考とされるものである。
異なる方式、例えば静脈内、腹膜内、皮下、頭蓋骨内、髄腔内、動脈内(例えば頸動脈)、筋肉内、鼻内、体表または皮内投与または脊髄または脳内輸送により本発明の薬物組成物の投与を実現できる。エアロゾル製剤例えば鼻噴霧製剤は活性化剤を含有する精製した水性またはその他の溶液及び防腐剤と等張剤を含有する。このような製剤を鼻粘膜と相容し得るpH及び等張状態に調整する。
本発明の一つの実施形態はプラスミノーゲンを用いて被験者を治療した後、治療効力及び治療安全性に対して判断を行うことに係る。その臨床上における治療効力を判断する方法は以下の指標を測定することにより腎臓機能を評価することを含むが、これらに限られない:血清クレアチニンレベル、クレアチニン除去率、24-時間尿タンパク排出率(UAER)、糸球体濾過率、尿アルブミン/クレアチニン比、アルブミン分泌率及び腎臓生検等である。例えば、糸球体濾過率は糸球体の過剰濾過及び過剰灌流の状況を示すことができ、これは糖尿病性腎症の早期症状の緩和の程度を示すものである。糸球体濾過率は腎臓から1分間に生じる濾液の体積であり、各種方法によって決めることができ、例えばプロテオグリカン、イオタラム酸塩またはイオヘキソールのような濾過マーカーの尿除去率を測定することで測定できる。最もよく見られる方法は、クレアチニン(筋肉によって生じさらに血液中に放出されるタンパク質)の除去率を知ることによって糸球体濾過率を予測することである。クレアチニン除去率(通常はml/分と示される)は所定時間(例えば12時間または24時間)内の尿液中で収集されたクレアチニンレベル及び血液中のクレアチニンレベルを比較することによって知ることができる。成人男性の典型的なクレアチニン除去率は約97-137ml/分であり、成人女性は約88-128ml/分である。クレアチニン除去率と尿クレアチニン***は正比例の関係であり、血清クレアチニン濃度と逆比例の関係である。
本発明の一つの実施形態は製品または薬物キットに係るものであり、糖尿病腎症を治療するための本発明のプラスミノーゲンを含有する。前記製品は好ましくは一つの容器、ラベルまたはプロトコルを含む。適切な容器はボトル、小瓶、注射器などである。容器は各種材料例えばガラスまたはプラスチックから作られることができる。前記容器は組成物を含有し、前記組成物は本発明の疾患または症状を有効に治療し且つ無菌の入口を有する(例えば前記容器は静脈輸液用パックまたはバイアルであり、皮下注射針によって貫通される栓を含む)。前記組成物中の少なくとも一種類の活性化剤がプラスミノーゲンである。前記容器上にあるまたは添付されているラベルは前記組成物を本発明の前記糖尿病によって引き起こされる糖尿病性腎症及びその関連疾患の治療に用いられると説明するものである。前記製品はさらに薬用緩衝液を含有する第二容器を含み、前記薬用緩衝液は例えばリン酸塩緩衝の食塩水、リンガー溶液及びグルコース溶液を含む。さらには商業及び使用者の角度から見ると必要とされるその他の物質、即ちその他の緩衝液、希釈剤、濾過物、針及び注射器を含むことができる。また、前記製品は使用説明を有するプロトコルを含み、これは例えば前記組成物の使用者にプラスミノーゲン組成物及び疾患の治療に伴うその他の薬物を患者に投与することを指示するものである。
実施例1は、プラスミノーゲンがシスプラチンによる腎損傷の修復を促進することに関するものである。
8~9週齢の健康なオスC57マウスを10匹取り、ランダムに二つの群に分け、それぞれ溶媒PBS投与対照群及びプラスミノーゲン投与群で、各群5匹ずつである。群分けが完了した後に、10mg/Kg体重で一回経腹腔でシスプラチンを注射し[33]、化学療法損傷モデルを構築した。モデル構築が完了した後にプラスミノーゲン投与群に1mg/0.1mL/匹/日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒PBS投与対照群にも同じ体積のPBSを同じ方法で投与した。実験開始当日を0日目として体重を測ってから群分けし、一日目からシスプラチンを腹腔注射してモデル構築を行い、モデル構築後3時間以内にプラスミノーゲンまたは溶媒PBSを投与し、投与期間は7日間である。8日目にマウスを殺処分し、腎臓を取って10%中性フルマリン固定液において24~48時間固定を行った。固定後の腎臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは4μmであり、切片を脱パラフィンさせさらに浸水してから一回水洗いした。クエン酸で30分間修復し、室温にて10分間冷却してから水でやさしく洗い流した。PAPマーカーで組織を丸で囲み、3%過酸化水素水で15分間インキュベーションし、0.01M PBSで2回洗い、毎回5分間であった。5%の健常ヒツジ血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)で30分間ブロッキングした;時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ヤギ抗マウスIgM(HRP)抗体(Abcam)を滴加して室温で1時間インキュベーションし、PBSで2回洗い、毎回5分間であった。DABキット(Vector laboratories,Inc.,USA)で呈色させ、3回水洗いした後にヘマトキシリンで30秒複染色して、流水で5分間流した。段階的に脱水してから透徹にし封入させ、切片を顕微鏡下で200倍にて観察した。
IgM抗体は、アポトーシス細胞及び壊死細胞の排除において重要な役割を果たし、組織器官損傷の局所的IgM抗体のレベルは、損傷の程度と正比例に相関している[29,30]。よって、検出した組織器官の局所的IgM抗体のレベルは該組織器官の損傷状況を反映することができる。
その結果、プラスミノーゲン投与群(図1B)のIgM陽性発現は、溶媒PBS投与対照群(図1A)より明らかに低く、しかもその差が統計学的に有意である(図1C)。これは、プラスミノーゲンが腎損傷の修復を促進できることを示している。
実施例2は、プラスミノーゲンがシスプラチン化学療法損傷モデルマウスの腎線維症を軽減することに関するものである。
8~9週齢の健康なオスC57マウスを10匹取り、ランダムに二つの群に分け、それぞれ溶媒PBS投与対照群及びプラスミノーゲン投与群で、各群5匹ずつである。群分けが完了した後に、化学療法損傷モデルを構築し、10mg/Kg体重で一回経腹腔でシスプラチンを注射した[33]。モデル構築が完了した後にプラスミノーゲン投与群に1mg/0.1mL/匹/日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒PBS投与対照群にも同じ体積のPBSを尾静脈注射により投与した。実験開始当日を0日目として体重を測ってから群分けし、一日目からシスプラチンを腹腔注射してモデル構築を行い、モデル構築後3時間以内にプラスミノーゲンまたは溶媒PBSを投与し、投与期間は7日間である。8日目にマウスを殺処分し、腎臓を取って4%パラホルムアルデヒド固定液において24時間固定を行った。固定後の腎臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは4μmであり、切片を脱パラフィンさせさらに浸水してから一回水洗いした。PAPマーカーで組織を丸で囲み、3%過酸化水素水で15分間インキュベーションし、0.01M PBSで2回洗い、毎回5分間であった。5%の健常ヒツジ血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)で30分間ブロッキングした;時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ウサギ抗マウスIgG(HRP)抗体(Abcam)二次抗体を滴加して室温で1時間インキュベーションし、TBSで2回洗い、毎回5分間であった。DABキット(Vector laboratories,Inc.,USA)で呈色させ、3回水洗いした後にヘマトキシリンで30秒複染色して、流水で5分間ブルーイングさせてからTBSで1回洗った。段階的に脱水してから透徹にし封入させ、切片を顕微鏡下で200倍にて観察した。
その結果、溶媒PBS投与対照群(図2A)の腎臓IV型コラーゲンの陽性発現はプラスミノーゲン投与群(図2B)より明らかに高い。これは、プラスミノーゲンがシスプラチンによる損傷モデルマウスの腎線維症を軽減できることを示している。
実施例3は、プラスミノーゲンが慢性腎損傷モデルの腎臓に対する保護作用に関するものである。
8~9週齢のPLG+/+マウス20匹、及びPLG-/-マウス6匹を取り、PLG+/+マウスをランダムに二つの群に分け、それぞれプラスミノーゲン投与群と溶媒PBS投与対照群で、各群10匹ずつとした。プラスミノーゲン投与群、溶媒PBS投与対照群、及びPLG-/-マウスに毎日0.25%のプリン飼料(南通トロフィー)を給餌し、慢性腎損傷モデルを構築した[26]。モデル構築した当日を1日目として投薬を始めた。プラスミノーゲン投与群に1mg/0.1mL/匹/日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒PBS投与対照群にも同じ体積のPBSを尾静脈注射により投与し、モデル構築投薬を10日間連続し、PLG-/-マウスは処置しなかった。11日目にマウスを殺処分して腎臓を取り、4%パラホルムアルデヒド固定液において24時間固定を行った。固定後の腎臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは3μmであり、切片を脱パラフィンさせさらに浸水してヘマトキシリン及びエオシンで染色(HE染色)させ、1%塩酸エタノールで分別させ、アンモニア水でブルーイングさせ、さらにアルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で200倍(図3A、B、C)、400倍(1D)にて観察した。
その結果、PLG-/-マウスの腎臓(図3C、3D)病変が最も重度であり、大量の膿キャスト(矢印に示される)、少量のプリン結晶(三角で表記されている)、大面積の腎尿細管萎縮、及び扁平上皮細胞が観察される。PLG-/-マウスと比べ、溶媒PBS投与対照群のマウスの腎(図3A)損傷は軽い。糸球体萎縮及び腎尿細管の壊死は依然として深刻であるが、明らかなプリン結晶は見られず、膿キャストも比較的に軽い。プラスミノーゲン投与群のマウス(図3B)の腎尿細管の萎縮面積は、PBS投与対照群より小さく、腎尿細管の拡張も軽く、膿キャストは発見していない。これは、プラスミノーゲンが慢性腎損傷モデルマウスの腎損傷を修復できることを示している。
実施例4は、プラスミノーゲンが慢性腎損傷モデルの腎線維症を修復することに関するものである。
8~9週齢のPLG+/+マウス12匹、及びPLG-/-マウス6匹を取り、PLG+/+マウスをランダムに二つの群に分け、それぞれプラスミノーゲン投与群と溶媒PBS投与対照群で、各群6匹ずつとした。慢性腎損傷モデルの構築方法は実施例1と同様である。モデル構築した当日を1日目として投薬を始めた。プラスミノーゲン投与群に1mg/0.1mL/匹/日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒PBS投与対照群にも同じ体積のPBSを尾静脈注射により投与し、モデル構築投薬を10日間連続し、PLG-/-マウスは処置しなかった。11日目にマウスを殺処分して腎臓を取り、4%パラホルムアルデヒド固定液において24時間固定を行った。固定後の腎臓をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは3μmであり、切片を脱パラフィンさせてから1回水洗い、0.1%シリウスレッドで60分間染色させた後、流水で洗い、ヘマトキシリンで1分間染色してから流水で洗い、1%塩酸エタノール及びアンモニア水で分別させてブルーイングさせ、流水で洗い、乾燥させてから封入し、切片を顕微鏡下で200倍にて観察した。
シリウスレッド染色は、コラーゲンを長期的に染色することができ、病理学的切片の特殊染色法として、シリウスレッド染色はコラーゲン組織を特異的に表示することができる。
その結果、プラスミノーゲン投与群(図4B)と溶媒PBS投与対照群(図4A)のコラーゲン沈着はPLG-/-群(図4C)より明らかに少なく、しかもその差が統計学的に有意である(図4D)ことは示されている。また、プラスミノーゲン投与群のコラーゲン沈着は、溶媒PBS投与対照群より明らかに少ない。これは、プラスミノーゲンが慢性腎損傷モデルマウスの腎線維症を修復する過程において肝心な役割を果たすことを示している。
実施例5は、プラスミノーゲンが慢性腎損傷マウスの腎臓アポトーシス抑制タンパク質Bcl-2の発現を促進することに関するものである。
8~9週齢のオスPLG+/+マウス18匹を取り、ランダムに三つの群に分け、それぞれブランク対照群、プラスミノーゲン投与群、及び溶媒PBS投与対照群で、各群6匹ずつとした。慢性腎損傷モデルの構築方法は実施例1と同様である。モデル構築した当日を1日目として投薬を始めた。ブランク対照群に通常の維持食を給餌した。プラスミノーゲン投与群に1mg/0.1mL/匹/日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒PBS投与対照群にも同じ体積のPBSを尾静脈注射により投与し、モデル構築投薬を10日間連続し、ブランク対照群マウスは処置しなかった。モデル構築投薬を始めた日を1日目として、11日目にマウスを殺処分して腎臓を取り、4%パラホルムアルデヒド固定液において24時間固定を行った。固定後の腎臓をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは3μmであり、切片を脱パラフィンさせてから1回水洗った。PAPマーカーで組織を丸で囲み、3%過酸化水素水で15分間インキュベーションし、0.01M PBSで2回洗い、毎回5分間であった。5%の健常ヒツジ血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)で30分間ブロッキングした;時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ウサギ抗マウスBcl-2抗体(Abcam)を滴加して4℃で終夜インキュベーションし、0.01M PBSで2回洗い、毎回5分間であった。ヤギ抗ウサギIgG(HRP)抗体(Abcam)二次抗体を室温で1時間インキュベーションし、0.01M PBSで2回洗い、毎回5分間であった。DABキット(Vector laboratories,Inc.,USA)で呈色させ、3回水洗いした後にヘマトキシリンで30秒複染色して、流水で5分間流した。アルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で200倍にて観察した。
Bcl-2は細胞アポトーシス抑制タンパク質であり、アポトーシス刺激因子により発現が低くなる[27,28]。Bcl-2免疫組織化学的結果によって、プラスミノーゲン投与群(図5C)の腎臓Bcl-2の陽性着色は溶媒PBS投与対照群(図5B)より明らかに深く、しかもブランク対照群(図5A)のBcl-2の陽性着色の程度に近いことは示されている。これは、プラスミノーゲンが慢性腎損傷モデルマウスの腎細胞アポトーシス抑制分子Bcl-2の発現を促進でき、それによって慢性腎損傷マウスの腎組織細胞をアポトーシスから保護することに寄与できることを示している。
実施例6は、プラスミノーゲンが慢性腎損傷マウスの腎臓の局所損傷を改善することに関するものである。
8~9週齢のオスPLG+/+マウス18匹を取り、ランダムに三つの群に分け、それぞれブランク対照群、プラスミノーゲン投与群、及び溶媒PBS投与対照群で、各群6匹ずつとした。慢性腎損傷モデルの構築方法は実施例1と同様である。モデル構築した当日を1日目として投薬を始めた。ブランク対照群に通常の維持食を給餌した。プラスミノーゲン投与群に1mg/0.1mL/匹/日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒PBS投与対照群にも同じ体積のPBSを尾静脈注射により投与し、モデル構築投薬を10日間連続し、ブランク対照群マウスは処置しなかった。11日目にマウスを殺処分して腎臓を取り、4%パラホルムアルデヒド固定液において24時間固定を行った。固定後の腎臓をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは3μmであり、切片を脱パラフィンさせてから1回水洗った。PAPマーカーで組織を丸で囲み、3%過酸化水素水で15分間インキュベーションし、0.01M PBSで2回洗い、毎回5分間であった。5%の健常ヒツジ血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)で30分間ブロッキングした;時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ヤギ抗ウサギIgG(HRP)抗体(Abcam)を滴加して室温で1時間インキュベーションし、PBSで2回洗い、毎回5分間であった。DABキット(Vector laboratories,Inc.,USA)で呈色させ、3回水洗いした後にヘマトキシリンで30秒複染色して、流水で5分間流した。段階的に脱水させて透徹にして封入させ、切片を顕微鏡下で200倍にて観察した。
IgM抗体は、アポトーシス細胞及び壊死細胞の排除において重要な役割を果たし、組織器官損傷の局所IgM抗体のレベルは、損傷の程度と正比例に相関している[29,30]。よって、検出した組織器官の局所IgM抗体のレベルは該組織器官の損傷程度を反映することができる。
その結果、プラスミノーゲン投与群(図6C)マウスの腎臓IgMの陽性着色は溶媒PBS投与対照群(図6B)より浅く、しかも範囲は対照群より小さく、着色はブランク対照マウス(図6A)に非常に近いことは示されている。これは、プラスミノーゲンの注射後、糸球体損傷が明らかに改善されており、プラスミノーゲンが慢性腎損傷マウスの腎損傷に対して顕著な修復効果を持っていることを示している。
実施例7は、プラスミノーゲンが慢性腎損傷マウスの腎臓フィブリンの発現を減少することに関するものである。
8~9週齢のPLG+/+マウス12匹、及びPLG-/-マウス6匹を取り、PLG+/+マウスをランダムに二つの群に分け、それぞれプラスミノーゲン投与群と溶媒PBS投与対照群で、各群6匹ずつとした。慢性腎損傷モデルの構築方法は実施例1と同様である。モデル構築した当日を1日目として投薬を始めた。モデル構築と投薬期間は4日間であり、ブランク対照群に通常の維持食を給餌した。プラスミノーゲン投与群に1mg/0.1mL/匹/日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒PBS投与対照群にも同じ体積のPBSを尾静脈注射により投与し、PLG-/-マウスは処置しなかった。5日目にマウスを殺処分して腎臓を取り、4%パラホルムアルデヒド固定液において24時間固定を行った。固定後の腎臓をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは3μmであり、切片を脱パラフィンさせてから1回水洗った。PAPマーカーで組織を丸で囲み、3%過酸化水素水で15分間インキュベーションし、0.01M PBSで2回洗い、毎回5分間であった。5%の健常ヒツジ血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)で30分間ブロッキングした;時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ウサギ抗マウスBcl-2抗体(Abcam)を滴加して4℃で終夜インキュベーションし、PBSで2回洗い、毎回5分間であった。ヤギ抗ウサギIgG(HRP)抗体(Abcam)二次抗体を室温で1時間インキュベーションし、PBSで2回洗い、毎回5分間であった。DABキット(Vector laboratories,Inc.,USA)で呈色させ、3回水洗いした後にヘマトキシリンで30秒複染色して、流水で5分間流した。段階的に脱水させて透徹にして封入させ、切片を光学顕微鏡下で200倍にて観察した。
フィブリノーゲンはフィブリンの前駆体であり、組織に損傷が存在する状況下において、生体の損傷に対する応答反応として、フィブリノーゲンはフィブリンに加水分解されて損傷部位に沈着する[31,32]。そのため、損傷局所のフィブリンのレベルを損傷程度の一つの指標とすることができる。
その結果、溶媒PBS投与対照群(図7A)の腎フィブリンの陽性着色はプラスミノーゲン投与群マウス(図7B)より深く、しかもPLG-/-群(図7C)の着色は溶媒PBS投与対照群より深いことは示されている。これは、プラスミノーゲンが一定の程度で腎臓組織の損傷を修復できることを示している。
実施例8は、プラスミノーゲンが糖尿病マウスの腎線維症を軽減することに関するものである。
24~25週齢のオスdb/dbマウス10匹を取り、ランダムに二つの群に分け、それぞれ溶媒PBS投与対照群とプラスミノーゲン投与群で、各群5匹ずつとした。実験開始当日を0日目として体重を測ってから群分けし、1日目からプラスミノーゲンまたはPBSを投与し、31日間連続して投与した。プラスミノーゲン投与群マウスに2mg/0.2mL/匹/日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒PBS投与対照群にも同じ体積のPBSを尾静脈注射により投与した。プラスミノーゲンを31日間投与した後にマウスを殺処分して腎臓組織を取り、4%パラホルムアルデヒド固定液において24時間固定を行った。固定後の腎臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは4μmであり、切片を脱パラフィンさせてから1回水洗った。PAPマーカーで組織を丸で囲み、3%過酸化水素水で15分間インキュベーションし、0.01M PBSで2回洗い、毎回5分間であった。5%の健常ヒツジ血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)で30分間ブロッキングした;時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、IVコラーゲンのウサギポリクローナル抗体(Abcam)を滴加して4℃で終夜インキュベーションし、TBSで2回洗い、毎回5分間であった。ヤギ抗ウサギIgG(HRP)抗体(Abcam)二次抗体を室温で1時間インキュベーションし、TBSで2回洗った。DABキット(Vector laboratories,Inc.,USA)で呈色させ、3回水洗いした後にヘマトキシリンで30秒複染色して、流水で5分間流した。段階的に脱水させて透徹にして封入させ、切片を光学顕微鏡下で200倍にて観察した。
糖尿病性腎症は糖尿病の慢性合併症であり、糸球体硬化症及び腎間質性線維症はその典型的な病理学的変化である[34]。本発明実験の結果によって、プラスミノーゲン投与群(図8B)のIVコラーゲン陽性着色は溶媒PBS投与対照群(図8A)より明らかに浅いことは示されている。これは、プラスミノーゲンが糖尿病マウスの腎線維症を軽減できることを示している。
実施例9は、プラスミノーゲンが糖尿病マウスの腎線維症を軽減することに関するものである。
26週齢のオスdb/dbマウス10匹を取り、ランダムに二つの群に分け、それぞれ溶媒PBS投与対照群とプラスミノーゲン投与群で、各群5匹ずつとした。実験開始当日を0日目として体重を測ってから群分けし、1日目からプラスミノーゲンまたはPBSを投与し、35日間連続して投与した。プラスミノーゲン投与群マウスに2mg/0.2mL/匹/日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒PBS投与対照群にも同じ体積のPBSを尾静脈注射により投与した。36日目にマウスを殺処分して腎臓組織を取り、4%パラホルムアルデヒド固定液において24時間固定を行った。固定後の腎臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは4μmであり、切片を脱パラフィンさせて浸水してから重クロム酸カリウム溶液に終夜置いた。鉄ヘマトキシリンで3~5分間染色して流水で流した。1%塩酸エタノールで分別させてアンモニア水で1秒処理してから水で洗った。ポンソー酸性マゼンタ溶液にて8分間染色し、水中で素早く濯いだ。1%リンモリブデン酸水溶液で約2分間処理し、アニリンブルー溶液にて6分間複染色した。1%氷酢酸で約1分間濯いだ。無水エタノールで脱水させてキシレンで透徹にしてから封入し、切片を光学顕微鏡下で200倍にて観察した。
マッソン(Masson)染色は組織の線維症を示すことができる。その結果、溶媒PBS投与対照群(図9A)の腎間質に軽度の線維症があり、過形成した線維症は青色である。溶媒PBS投与対照群と比べ、プラスミノーゲン投与群(図9B)の腎間質線維症は明らかに減少している。これは、プラスミノーゲンが糖尿病マウスの腎線維症を低下させることができることを示している。
実施例10は、プラスミノーゲンが全身性硬化症モデルマウスの腎線維症を減少させることに関するものである。
12週齢のC57オスマウス10匹を取り、体重をはかった後にランダムに二つの群に分け、それぞれ溶媒PBS投与対照群とプラスミノーゲン投与群で、各群5匹ずつとした。すべてのマウスに1mg/0.1mL/匹/日でブレオマイシンを皮下注射して全身性硬化症を誘発させ[35]、当日からプラスミノーゲンまたはPBSを投与し、その日を1日目とし、21日間連続して投与した。プラスミノーゲン投与群マウスに1mg/0.1mL/匹/日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒PBS投与対照群にも同じ体積のPBSを尾静脈注射により投与した。22日目にマウスを殺処分して腎臓を取り、4%パラホルムアルデヒド固定液において24時間固定を行った。固定後の腎臓をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは3μmであり、切片を脱パラフィンさせて1回水で洗い、0.1%シリウスレッド飽和ピクリン酸で30分間染色した後、流水で2分間流し、ヘマトキシリンで1分間染色してから流水で流し、1%塩酸エタノールで分別させてアンモニア水でブルーイングさせ、流水で流した。乾燥した後に中性ゴムに封入させ、光学顕微鏡下で200倍にて観察した。
その結果、ブレオマイシンにより誘発された全身性硬化症モデルマウスにおいて、溶媒PBS投与対照群(図10A)の腎臓コラーゲン沈着がプラスミノーゲン投与群(図10B)より明らかに多いことは示されている。これは、プラスミノーゲンが全身性硬化症マウスの腎線維症を効果的に減少させたことを示している。
実施例11は、プラスミノーゲンが慢性腎損傷モデルマウスの腎臓機能の修復を促進することに関するものである。
8~9週齢のPLG+/+マウス10匹、及びPLG-/-マウス6匹を取り、慢性腎損傷モデルの構築方法は実施例1と同様である。モデル構築の当日を1日目とし、モデル構築期間は10日間である。11日目に眼球を摘出して採血し、遠心分離して上澄み液を取り、血清中の尿素窒素濃度を測定した。尿素窒素含有量は、尿素窒素検出キット(南京建成生物工程研究所、品目番号C013-2)を用い、該尿素窒素検出キットに記載された方法に従って測定した。
その結果、PLG+/+群の血清における尿素窒素濃度がPLG-/-群より明らかに低く、しかもその差が統計学的に有意である(図11)ことは示されている。これは、プラスミノーゲンが慢性腎損傷モデルマウスの腎機能を顕著に改善できることを示している。
実施例12は、プラスミノーゲンが慢性腎損傷モデルマウスの腎臓機能の修復を促進することに関するものである。
8~9週齢のPLG+/+マウス20匹、及びPLG-/-マウス6匹を取り、PLG+/+マウスをランダムに二つの群に分け、それぞれプラスミノーゲン投与群と溶媒PBS投与対照群で、各群10匹ずつとした。慢性腎損傷モデルの構築方法は実施例1と同様である。モデル構築の当日を1日目としてその日から投薬し、投与期間は4日間である。プラスミノーゲン投与群に1mg/0.1mL/匹/日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒PBS投与対照群にも同じ体積のPBSを尾静脈注射により投与し、PLG-/-マウスは処置しなかった。5日目に眼球を摘出して採血し、遠心分離して上澄み液を取り、血清中のクレアチニン濃度を測定した。血清クレアチニン濃度は、クレアチニン検出キット(南京建成生物工程研究所、品目番号C011-2)を用い、該キットに記載された方法に従って測定した。
その結果、溶媒PBS投与対照群とプラスミノーゲン投与群の血清クレアチニン濃度がPLG-/-群マウスより明らかに低く、しかもその差が統計学的に有意であることは示されている。また、プラスミノーゲン投与群の血清クレアチニン濃度は溶媒PBS投与対照群(図12)より明らかに低い。これは、プラスミノーゲンが慢性腎損傷モデルマウスの腎機能を顕著に改善できることを示している。
実施例13は、プラスミノーゲンが急性腎損傷モデルマウスの腎臓機能の修復を促進することに関するものである。
7週齢のオスC57マウス9匹を取り、ランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群で5匹、溶媒PBS投与対照群で4匹とした。すべてのマウスに250mg/kg体重で一回経腹腔で葉酸(sigma A7876)溶液を注射し、急性腎損傷を誘発した[36]。葉酸を0.3mоl/L NaHCO3に溶解した。モデル構築の当日を1日目とし、その日からプラスミノーゲンまたは溶媒PBSを投与し、プラスミノーゲン投与群に1mg/0.1mL/匹/日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒PBS投与対照群にも同じ体積のPBSを尾静脈注射により投与し、投与期間は7日間である。8日目に眼球を摘出して採血し、遠心分離して上澄み液を取り、血清中の尿素窒素濃度を測定した。尿素窒素含有量は、尿素窒素検出キット(南京建成生物工程研究所、品目番号C013-2)を用い、該尿素窒素検出キットに記載された方法に従って測定した。
その結果、プラスミノーゲン投与群の血清中の尿素窒素濃度は溶媒PBS投与対照群より明らかに低く、しかもその差が統計学的な有意に近い(P=0.06)(図13)ことは示されている。これは、プラスミノーゲンが急性腎損傷モデルマウスの腎機能を顕著に改善できることを示している。
実施例14は、プラスミノーゲンが3%コレステロール高脂血症モデルマウスの腎脂肪沈着を低減することに関するものである。
9週齢のオスC57マウス16匹に3%コレステロール高脂肪食(南通トロフィー)を4週間給餌して高脂血症を誘発し[37,38]、このモデルを3%コレステロール高脂血症モデルとし、モデル化後のマウスに引き続き3%コレステロール高脂肪食を与えた。また、同じ週齢のオスC57マウスを5匹取ってブランク対照群とし、実験期間中に通常の維持食を給餌した。投薬の3日前に各マウスから50μLの血液を採取し、総コレステロールを測定し、モデルマウスを総コレステロール濃度と体重によってランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群と溶媒PBS投与対照群で、各群で8匹ずつとした。投薬し始めた日を1日目とし、プラスミノーゲン投与群マウスに1mg/0.1mL/匹/日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒PBS投与対照群にも同じ体積のPBSを尾静脈注射により投与し、投与期間は30日間である。31日目にマウスを殺処分して腎臓を取り、4%パラホルムアルデヒド固定液において24時間固定を行った。それぞれ15%、30%スクロース中において4℃で終夜沈めさせ、OCTで包埋処理を行い、凍結切片の厚みは8μmであり、オイルレッドOで15分間染色し、75%アルコールで5秒間分別し、そしてヘマトキシリンで30秒間核を染色し、グリセリンゼラチンに封入させた。切片を光学顕微鏡下で400倍にて観察した。
オイルレッドO染色は脂質沈着を示し、脂質沈着の程度を反映することができる[37]。その結果、プラスミノーゲン投与群(図14C)マウスの腎脂肪沈着(矢印に表記される)は溶媒PBS投与対照群(図14B)より明らかに少なく、しかもその差が統計学的に有意である(図14D)。また、プラスミノーゲン投与群の脂質沈着レベルはブランク対照群マウス(図14A)に似ている。これは、プラスミノーゲンが高脂血症モデルマウスの腎臓における脂肪の沈着を低減でき、それによって脂肪沈着による腎損傷を減少させることができることを示している。
実施例15は、プラスミノーゲンが葉酸急性腎損傷モデルマウスの腎損傷を改善することに関するものである。
7週齢のオスC57マウス15匹を取り、ランダムに三つの群に分け、ブランク対照群で3匹、プラスミノーゲン投与群で7匹、溶媒PBS投与対照群で5匹とした。プラスミノーゲン投与群と溶媒PBS投与対照群マウスに250mg/kg体重で一回経腹腔で葉酸(sigma A7876)溶液を注射し、急性腎損傷モデルを誘発し[36]、ブランク対照群に一回経腹腔で同じ体積のNaHCO3溶液を注射した。葉酸を0.3mоl/L NaHCO3に溶解した。モデル構築の当日を1日目とし、その日からプラスミノーゲンまたは溶媒PBSを投与し、プラスミノーゲン投与群に1mg/0.1mL/匹/日でプラスミノーゲンを尾静脈により投与し、溶媒PBS投与対照群にも同じ体積のPBSを尾静脈により投与し、投与期間は7日間である。8日目にマウスを殺処分して腎臓を取り、4%パラホルムアルデヒド固定液において24時間固定を行った。組織切片の厚みは3μmであり、切片を脱パラフィンさせさらに浸水してヘマトキシリン及びエオシンで染色(HE染色)させ、1%塩酸エタノールで分別させ、アンモニア水でブルーイングさせ、さらにアルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で200倍にて観察した。
その結果、ブランク対照群(図15A)の腎臓核は円形または楕円形であり、細胞質は赤色に染色され、糸球体及び腎尿細管は正常な形態を呈する。溶媒PBS投与対照群(図15B)では腎に大部分の腎尿細管上皮細胞が扁平化し(太い矢印に表記される)、刷子縁が剥がれ、一部の核濃縮が観察され、一部の腎尿細管のみにわずかに染色された細胞質が呈され、一部の腎尿細管には膿キャスト(細い矢印に表記される)も見えられ、糸球体及び腎間質性に軽度の炎症細胞浸潤が示されている。溶媒PBS投与対照群と比べ、プラスミノーゲン投与群(図15C)の腎尿細管拡張及び上皮細胞扁平化は明らかに改善され、腎尿細管細胞質の大部分は赤色に染色され、膿キャストは見られていない。これは、プラスミノーゲンが葉酸によって誘発された急性腎損傷を改善できることを示している。
実施例16は、プラスミノーゲンが葉酸急性腎損傷モデルマウスの腎臓Bcl-2の発現を促進することに関するものである。
7週齢のオスC57マウス12匹を取り、ランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群で7匹、溶媒PBS投与対照群で5匹とした。すべてのマウスに250mg/kg体重で一回経腹腔で葉酸(sigma A7876)溶液を注射し、急性腎損傷を誘発した[36]。葉酸を0.3mоl/L NaHCO3に溶解した。モデル構築の当日を1日目とし、その日からプラスミノーゲンまたは溶媒PBSを投与し、プラスミノーゲン投与群に1mg/0.1mL/匹/日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒PBS投与対照群にも同じ体積のPBSを尾静脈注射により投与し、投与期間は7日間である。8日目にマウスを殺処分して腎臓を取り、4%パラホルムアルデヒド固定液において24時間固定を行った。固定後の腎臓をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは3μmであり、切片を脱パラフィンさせて浸水してから1回水洗った。PAPマーカーで組織を丸で囲み、3%過酸化水素水で15分間インキュベーションし、0.01M PBSで2回洗い、毎回5分間であった。5%の健常ヒツジ血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)で30分間ブロッキングした;時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ウサギ抗マウスBcl-2抗体(Abcam)を滴加して4℃で終夜インキュベーションし、0.01M PBSで2回洗い、毎回5分間であった。ヤギ抗ウサギIgG(HRP)抗体(Abcam)二次抗体を室温で1時間インキュベーションし、0.01M PBSで2回洗い、毎回5分間であった。DABキット(Vector laboratories,Inc.,USA)で呈色させ、3回水洗いした後にヘマトキシリンで30秒複染色して、流水で5分間流した。アルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で200倍にて観察した。
Bcl-2免疫組織化学的結果によって、プラスミノーゲン投与群(図16B)の腎臓Bcl-2の陽性着色は溶媒PBS投与対照群(図16A)より明らかに深く、しかもその差が統計学的に有意である(図16C)ことは示されている。これは、プラスミノーゲンが急性腎損傷モデルマウスの腎細胞アポトーシス抑制タンパクBcl-2の発現を促進でき、それによって急性腎損傷マウスの腎組織細胞をアポトーシスから保護することに寄与できることを示している。
実施例17は、プラスミノーゲンが葉酸による急性腎損傷モデルマウスの腎損傷を低減することに関するものである。
7週齢のオスC57マウス12匹を取り、ランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群で7匹、溶媒PBS投与対照群で5匹とした。すべてのマウスに250mg/kg体重で一回経腹腔で葉酸(sigma A7876)溶液を注射し、急性腎損傷を誘発した[36]。葉酸を0.3mоl/L NaHCO3溶液に溶解した。モデル構築の当日を1日目とし、その日からプラスミノーゲンまたは溶媒PBSを投与し、プラスミノーゲン投与群に1mg/0.1mL/匹/日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒PBS投与対照群にも同じ体積のPBSを尾静脈注射により投与し、投与期間は7日間である。8日目にマウスを殺処分して腎臓を取り、4%パラホルムアルデヒド固定液において24時間固定を行った。固定後の腎臓をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは3μmであり、切片を脱パラフィンさせて浸水してから1回水洗った。PAPマーカーで組織を丸で囲み、3%過酸化水素水で15分間インキュベーションし、0.01M PBSで2回洗い、毎回5分間であった。5%の健常ヒツジ血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)で30分間ブロッキングした;時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ヤギ抗マウスIgM(HRP)抗体(Abcam)を室温で1時間インキュベーションし、PBSで2回洗い、毎回5分間であった。DABキット(Vector laboratories,Inc.,USA)で呈色させ、3回水洗いした後にヘマトキシリンで30秒複染色して、流水で5分間流した。段階的に脱水させて透徹にし、切片を光学顕微鏡下で200倍にて観察した。
その結果、プラスミノーゲン投与群(図17B)マウスの腎臓IgMの陽性着色は溶媒PBS投与対照群(図17A)より浅く、しかも範囲は対照群より小さいことは示されている。これは、プラスミノーゲンの注射後、腎臓IgMの発現は明らかに低下し、プラスミノーゲンが葉酸による急性腎損傷マウスの腎損傷を効果的に低減できることを示している。
実施例18は、プラスミノーゲンが3%コレステロール高脂血症モデルマウスの腎線維症を低減することに関するものである。
9週齢のオスC57マウス16匹に3%コレステロール高脂肪食(南通トロフィー)を4週間給餌して高脂血症を誘発し[37,38]、このモデルを3%コレステロール高脂血症モデルとし、モデル化後のマウスに引き続き3%コレステロール高脂肪食を与えた。また、同じ週齢のオスC57マウスを5匹取ってブランク対照群とし、実験期間中に通常の維持食を給餌した。投薬の3日前に各マウスから50μLの血液を採取し、総コレステロールを測定し、モデルマウスを総コレステロール濃度と体重によってランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群と溶媒PBS投与対照群で、各群で8匹ずつとした。投薬し始めた日を1日目とし、プラスミノーゲン投与群マウスに1mg/0.1mL/匹/日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒PBS投与対照群にも同じ体積のPBSを尾静脈注射により投与し、投与期間は30日間である。31日目にマウスを殺処分して腎臓を取り、4%パラホルムアルデヒド固定液において24~48時間固定を行った。固定後の組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは3μmであり、切片を脱パラフィンさせて浸水して1回水で洗い、0.1%シリウスレッド飽和ピクリン酸で30分間染色した後、流水で2分間流し、ヘマトキシリンで1分間染色してから流水で流し、1%塩酸エタノールで分別させてアンモニア水でブルーイングさせ、流水で流した。乾燥した後に中性ゴムに封入させ、光学顕微鏡下で200倍にて観察した。
その結果、プラスミノーゲン投与群(図18C)の腎臓コラーゲン沈着(矢印に表記される)は溶媒PBS投与対照群(図18B)より明らかに少なく、しかもその差が統計学的に有意である(図18D)。プラスミノーゲン投与群の線維症は基本的に正常レベルに回復している(図18A)。これは、プラスミノーゲンが3%コレステロール高脂血症モデルマウスの腎線維症を効果的に減少させることができることを示している。
実施例19は、プラスミノーゲンが虚血再灌流による急性腎損傷モデルマウスの腎損傷を低減することに関するものである。
7~9週齢のオスPLG+/+マウス9匹を取り、ランダムに三つの群に分け、偽手術群、プラスミノーゲン投与群、及び溶媒PBS投与対照群で、各群3匹ずつとした。すべてのマウスに50mg/kg体重で経腹腔でペントバルビタールナトリウムを注射して麻酔した。プラスミノーゲン投与群と溶媒PBS投与対照群マウスの腹部にすき間を開け、腎臓を露出させ、両側の動脈と静脈を分離し、両側の動脈と静脈を血管クランプでクリップし、クリップした後に腎臓を腹腔に移動させて創傷を45分間閉じた。時間になった後腎臓を再び露出させ、血管クランプを取り除き、腎臓の状況を観察し、再灌流を確定した後に創傷を縫合した。偽手術群では腹部にすき間を開け、虚血処理をせずに腎臓を露出させ、時間になった後に創傷を縫合した[39]。術後、各マウスに37℃の生理食塩水1mLを経腹腔注射した。手術中に体温を36.5~38℃に維持した。モデル構築の当日を1日目とし、その日からプラスミノーゲンまたは溶媒PBSを投与し始め、プラスミノーゲン投与群に1mg/0.1mL/匹/日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒PBS投与対照群にも同じ体積のPBSを尾静脈注射により投与し、偽手術群マウスには注射処置をしなかった。投与期間は7日間である。8日目にマウスを殺処分して腎臓を取り、4%パラホルムアルデヒド固定液において24時間固定を行った。組織切片の厚みは3μmであり、切片を脱パラフィンさせて浸水してヘマトキシリン及びエオシンで染色(HE染色)させ、1%塩酸エタノールで分別させ、アンモニア水でブルーイングさせ、さらにアルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、光学顕微鏡下で200倍にて観察した。
その結果、偽手術群(図19A)の糸球体毛細血管は開存的であり、腎尿細管細胞質は赤色に染色され、正常な腎尿細管形態を呈する。溶媒PBS投与対照群(図19B)の糸球体には軽度の炎症細胞浸潤(三角で表記されている)が見えられ、腎間質に大量の炎症細胞浸潤が見えられ、一部の腎尿細管に膿キャスト(細い矢印に表記される)があり、少量の腎尿細管核濃縮、大面積の上皮細胞扁平化(太い矢印に表記される)、腎尿細管の拡張が見えられる。溶媒PBS投与対照群と比べ、プラスミノーゲン投与群(図19C)には、少量の腎尿細管上皮のみが扁平化しており、ほとんどの腎尿細管は正常な腎尿細管の形態に回復しており、細胞質は赤色に染色され、明らかな腎尿細管萎縮は発見されず、腎間質に軽度の炎症細胞浸潤のみがあり、偽手術群の形態に近い。これは、プラスミノーゲンが虚血再灌流による急性腎損傷モデルマウスの腎損傷を改善できることを示している。
[1] James L. Pirkle, MD1 and Barry I. Freedman, MD. Hypertension and chronic kidney disease: controversies in pathogenesis and treatment, Minerva Urol Nefrol. 2013 March ; 65(1): 37-50.
[2]Nguyen DCA,Touyz RM.A new look at the renin-angiotensin system-focusing on the vascular system [J]. Peptides, 2011, 32 ( 10) : 2141-2150.
[3] Kimoto E, Shoji T. Shinohara K, et al. Regional arterialstiffness inpatient with type 2 diabetes and chronic kidney disease [J]. J Am Soc Nephrol, 2006, 17(8):2245-2252.
[4] Mogensen CE, Damsgaard Em, Frland A, et al, Microalbuminuria in non-insulin depedent diabetes [J]. Clin Nephrol. 1992, 38(1):28-39.
[5] Choudhury D, Ahmed Z. Drug-associated renal dysfunction and injury [J]. Nat Clin Pract Nephrol, 2006, 2: 80-91.
[6] Colares VS, Oliveira RB, Abdulkader RC. Nephrotoxicity of vancomycin in patients with normal serum creatinine [J]. Nephrol Dial Transplant, 2006, 21: 3608.
[7] Izzedine H, Launay-Vacher V, Deray G. Antiviral drug-induced nephrotoxicity [J]. Am J Kidney Dis, 2005, 45: 804-817.
[8] Uwai Y, Ida H, Tsuji Y, et al. Renal transport of adefovir, cidofovir, and tenofovir by SLC22A family members (hOAT1, hOAT3, and hOCT2) [J]. Pharm Res, 2007, 24: 811-815.
[9] Servais H, Ortiz A, Devuyst O, et al. Renal cell apoptosis induced by nephrotoxic drugs: cellular and molecular mechanisms and potential approaches to modulation [J]. Apoptosis, 2008, 13: 11-32.
[10] Taguchi T, Nazneen A, Abid MR, et al. Cisplatin-associated nephrotoxicity and pathological events [J]. Contrib Nephrol, 2005, 148: 107-121.
[11] Harirforoosh S, Jamali F. Renal adverse effects of nonsteroidal anti-inflammatory drugs [J]. Expert Opin Drug Saf, 2009, 8: 669-681.
[12] Lincoln T. Toxicology: danger in the diet [J]. Nature, 2007,448: 148.
[13] Guitard J, Kamar N, Mouzin M, et al. Sulfadiazine-related obstructive urinary tract lithiasis: an unusual cause of acute renal failure after kidney transplantation [J]. Clin Nephrol, 2005, 63: 405-407.
[14] Boucher BJ. Renal failure and rhabdomyolysis associated with sitagliptin and simvastatin use. But what about the amiodarone? [J]. Diabet Med, 2009, 26: 192-193.
[15] Hsu CY, McCulloch CE, Fan D, et al. Community-based incidence of acute renal failure[ J]. Kidney Int, 2007, 72(2): 208-212.
[16] Liangos O, Wald R, O'Bell JW, et al. Epidemiology and outcomes of acute renal failure in hospitalized patients: a national survey[ J]. Clin J Am Soc Nephrol, 2006, 1(1): 43-51.
[17] Hoste EA, Clermont G, Kersten A, et al. RIFLE criteria for acute kidney injury are associated with hospital mortality in critically ill patients: a cohort analysis[ J]. Crit Care, 2006, 10(3): R73.
[18] Zhang L, Yang YY, Fu P. The development and problems of continuous renal replacement therapy[ J]. Chin J Pract Inter Med, 2011, 31(4):301-304.
[19] RENAL Replacement Therapy Study Investigators, Bellomo R, Cass A, et al. Intensity of continuous renal-replacement therapy in critically ill patients[ J]. N Engl J Med, 2009, 361(17): 1627-1638.
[20] VA/NIH Acute Renal Failure Trial Network, Palevsky PM, Zhang JH, et al. Intensity of renal support in critically ill patients with acute kidney injury[ J]. N Engl J Med, 2008, 359(1): 7-20.
[21] Coca SG, Yusuf B, Shlipak MG, et al. Long-term risk of mortality and other adverse outcomes after acute kidney injury: a systematic review and meta-analysis[ J]. Am J Kidney Dis, 2009, 53(6): 961-973.
[22] Marder V J, Novokhatny V. Direct fibrinolytic agents: biochemical attributes, preclinical foundation and clinical potential [J]. Journal of Thrombosis and Haemostasis, 2010, 8(3): 433-444.
[23] Hunt J A, Petteway Jr S R, Scuderi P, et al. Simplified recombinant plasmin: production and fu-nctional comparison of a novel thrombolytic molecule with plasma-derived plasmin [J]. Thromb Haemost, 2008, 100(3): 413-419.
[24] Sottrup-Jensen L, Claeys H, Zajdel M, et al. The primary structure of human plasminogen: Isolation of two lysine-binding fragments and one “mini”-plasminogen (MW, 38,000) by elastase-catalyzed-specific limited proteolysis [J]. Progress in chemical fibrinolysis and thrombolysis, 1978, 3: 191-209.
[25] Nagai N, Demarsin E, Van Hoef B, et al. Recombinant human microplasmin: production and potential therapeutic properties [J]. Journal of Thrombosis and Haemostasis, 2003, 1(2): 307-313.
[26] Cristhiane Favero Aguiar,Cristiane Naffah-de-Souza, Angela Castoldi et al. Administration of α-Galactosylceramide Improves Adenine-Induced Renal Injury. Mol Med. 2015 Jun 18;21:553-62.
[27] Moungjaroen J, Nimmannit U, Callery PS, Wang L, Azad N, Lipipun V, Chanvorachote P, Rojanasakul Y (2006). Reactive oxygen species medi-ate caspase activation and apoptosis induced by lipoic acid in human lung epithelial cancer cells through Bcl-2 downregulation. J Pharmacol Exp Ther 319, 1062-1069.
[28] Wang L, Chanvorachote P, Toledo D, Stehlik C, Mercer RR, Castranova V, Rojanasakul Y (2008). Peroxide is a key mediator of Bcl-2 down-regulation and apoptosis induction by cisplatinin human lung cancer cells. Mol Pharmacol 73, 119-127.
[29] Zhang M, Takahashi K, Alicot EM, Vorup-Jensen T, Kessler B, et al. (2006)
Activation of the lectin pathway by natural IgM in a model of ischemia/
reperfusion injury. J Immunol 177: 4727-4734.
[30] Kim SJ, Gershov D, Ma X, Brot N, Elkon KB (2002) I-PLA2 Activation during Apoptosis Promotes the Exposure of Membrane LysophosphatidylcholineLeading to Binding by Natural Immunoglobulin M Antibodies and Complement Activation. The Journal of Experimental Medicine 196: 655-665.
[31] Dimitrios Davalos , Katerina Akassoglou. Fibrinogen as a key regulator of inflammation in disease. Seminars in Immunopathology,2012. 34(1):43-62.
[32] Valvi D, Mannino DM, Mullerova H, et al. Fibrinogen, chronic obstructive pulmonary disease (COPD) and outcomes in two United States cohorts. Int J Chron Obstruct Pulmon Dis 2012;7:173-82.
[33] Blanca Humanes,Alberto Lazaro,Sonia Camano et al. Cilastatin protects against cisplatin-induced nephrotoxicity without compromising its anticancer efficiency in rats. Kidney Int. 2012 Sep;82(6):652-63.
[34] Donnelly SM, Zhou XP, Hu ang JT et al. Prevention of early glomerulopathy with tolrestat in the streptozotocin-induced diabetic rat. Biochem Cell Biol. 1996;74(3):355-62.
[35] Yosuke Kanno, En Shu, Hiroyuki Kanoh and Mariko Seishima. The Antifibrotic Effect of a2AP Neutralization in Systemic Sclerosis Dermal Fibroblasts and Mouse Models of Systemic Sclerosis. Journal of Investigative Dermatology (2016) 136, 762e769
[36] SzczypkaMS, WestoverAJ, ClouthierSGetal.Rare incorporation of bone marrow-derived cells into kidney after folic acid-induced injury.Stem Cells. 2005;23(1):44-54.
[37] Dominika Nackiewicz, Paromita Dey, Barbara Szczerba et al. Inhibitor of differentiation 3, a transcription factor regulates hyperlipidemia associated kidney disease. Nephron Exp Nephrol. 2014 ; 126(3): 141-147.
[38] Ming Gu1, Yu Zhang., Shengjie Fan et al. Extracts of Rhizoma Polygonati Odorati Prevent High-Fat Diet-Induced Metabolic Disorders in C57BL/6 Mice. PLoS ONE 8(11): e81724.
[39] Li Yang, Craig R. Brooks,Sheng Xiao et al. KIM-1-mediated phagocytosis reduces acute injuryto the kidney. J Clin Invest. 2015 Apr;125(4):1620-36.
Claims (8)
- 有効量の、配列番号2のプラスミノーゲンおよびそれと少なくとも90%のアミノ酸同一性を有するその保存的置換バリアントからなる群から選択されるプラスミノーゲンを含む、化学療法薬物によって引き起こされる被験者の腎組織損傷を予防及び/または治療するための薬物組成物。
- 前記薬物は腎毒性薬物である、請求項1に記載の薬物組成物。
- 前記薬物は腎臓から***される薬物である、請求項1または2に記載の薬物組成物。
- 前記薬物はシスプラチンである、請求項1または2に記載の薬物組成物。
- 前記プラスミノーゲンは、損傷した腎組織の修復を促進する、腎臓機能の回復を促進する、損傷した腎組織の線維性を軽減する、及び/または損傷した腎組織のアポトーシスを軽減する、請求項1~4のいずれか1項に記載の薬物組成物。
- 前記薬物によって引き起こされる被験者の腎組織損傷は、急性腎組織損傷または慢性腎組織損傷である、請求項1~5のいずれか1項に記載の薬物組成物。
- 前記プラスミノーゲンは、腎臓機能の回復を促進する、請求項1~6のいずれか1項に記載の薬物組成物。
- 前記プラスミノーゲンは、腎臓による尿素窒素及び/またはクレアチニンの排除を促進する、請求項1~7のいずれか1項に記載の薬物組成物。
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CN113456579B (zh) * | 2021-07-12 | 2023-04-25 | 南开大学 | 具有双靶点的hdac抑制剂的纳米胶束-水凝胶制剂在治疗急性肾损伤药物中的应用 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005519992A (ja) | 2002-01-29 | 2005-07-07 | キャリングタン、ラバラトーリズ、インク | 増殖因子とプロテアーゼ酵素の組合せ |
US20050250694A1 (en) | 2003-10-10 | 2005-11-10 | Ma Jian-Xing | Compounds useful in inhibiting vascular leakage, inflammation and fibrosis and methods of making and using same |
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JP2016529255A (ja) | 2013-08-13 | 2016-09-23 | サノフイ | プラスミノーゲン活性化因子阻害剤−1(pai−1)に対する抗体及びその使用 |
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---|---|---|---|---|
US3773919A (en) | 1969-10-23 | 1973-11-20 | Du Pont | Polylactide-drug mixtures |
IE52535B1 (en) | 1981-02-16 | 1987-12-09 | Ici Plc | Continuous release pharmaceutical compositions |
CN87104683A (zh) * | 1986-05-15 | 1988-12-21 | 埃默里大学 | 改善血纤维蛋白溶解作用的组合物 |
CN102416176A (zh) | 1995-07-27 | 2012-04-18 | 基因技术股份有限公司 | 稳定等渗的冻干蛋白质制剂 |
JP2005525798A (ja) * | 2002-02-06 | 2005-09-02 | トロムスドルフ ゲーエムベーハー ウント コー.カーゲー アルツナイミッテル | 微生物内での組み換えタンパク質の生産方法 |
AU2003301809A1 (en) * | 2002-05-13 | 2004-06-07 | Children's Hospital Los Angeles | Treatment and prevention of abnormal scar formation in keloids and other cutaneous or internal wounds or lesions |
US7348351B2 (en) * | 2002-12-10 | 2008-03-25 | Wyeth | Substituted 3-alkyl and 3-arylalkyl 1H-indol-1yl acetic acid derivatives as inhibitors of plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) |
CN101044136A (zh) * | 2004-08-23 | 2007-09-26 | 惠氏公司 | 作为pai-1抑制剂的吡咯基-萘基酸 |
US8741260B2 (en) | 2005-10-07 | 2014-06-03 | Armagen Technologies, Inc. | Fusion proteins for delivery of GDNF to the CNS |
US20120129721A1 (en) * | 2009-05-26 | 2012-05-24 | Universidad De Salamanca | Urinary gm2 activator protein as a marker of acute renal failure or the risk of developing acute renal failure |
CA2767612A1 (en) * | 2009-07-10 | 2011-01-13 | Thrombogenics Nv | Variants of plasminogen and plasmin |
CN102121023B (zh) * | 2010-12-22 | 2012-07-04 | 中山大学 | 突变型人纤溶酶原kringle5及其制备方法及应用 |
ES2583082T3 (es) * | 2011-01-05 | 2016-09-19 | Thrombogenics N.V. | Variantes de plasminógeno y plasmina |
CN102154253A (zh) | 2011-01-06 | 2011-08-17 | 郑州大学 | 具有抑制血小板凝集功能的微小纤溶酶原突变体及其制备方法和用途 |
CA3123992C (en) * | 2011-09-29 | 2024-06-04 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Aromatic-cationic peptides and methods for using same |
RU2016137486A (ru) * | 2014-02-21 | 2018-03-22 | Астеллас Фарма Инк. | Новое антитело против pai-1 человека |
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Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005519992A (ja) | 2002-01-29 | 2005-07-07 | キャリングタン、ラバラトーリズ、インク | 増殖因子とプロテアーゼ酵素の組合せ |
US20050250694A1 (en) | 2003-10-10 | 2005-11-10 | Ma Jian-Xing | Compounds useful in inhibiting vascular leakage, inflammation and fibrosis and methods of making and using same |
JP2010502600A (ja) | 2006-08-28 | 2010-01-28 | オムニオ・ヒーラー・アクチボラゲット | 感染症に対する候補薬 |
JP2016529255A (ja) | 2013-08-13 | 2016-09-23 | サノフイ | プラスミノーゲン活性化因子阻害剤−1(pai−1)に対する抗体及びその使用 |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
Curr. Diagn. Pathol. (2007) vol.13, issue 2, p.25-31 |
Heamostasis,1988年,Vol.18, Suppl.1,p.165-175 |
日腎会誌 (Oct 2016) vol.58, no.7, p.1064-1068 |
血栓止血誌 (2009) vol.20, no.1, p.23-26 |
血管と脈管,1981年,第12巻、第4号,第493頁-第501頁 |
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Publication number | Publication date |
---|---|
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