CN114174533A - 使用等温扩增的数字生物分子检测和/或定量 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于等温扩增的用于检测和/或定量样本中至少一种靶标生物分子的数字方法，所述生物分子选自DNA、RNA和蛋白质。本发明还涉及所述数字方法的不同应用和试剂盒。

Description

使用等温扩增的数字生物分子检测和/或定量

技术领域

本发明涉及一种检测和/或定量样本中的生物分子(例如，DNA、RNA和蛋白质)的数字方法，其基于具有特定分子设计的等温扩增。本发明还涉及一种用于疾病诊断的方法和农业诊断方法，所述疾病选自癌症、神经元疾病、心血管疾病、炎性疾病、自身免疫性疾病、由病毒或细菌感染引起的疾病、皮肤病、骨骼肌疾病、牙病和产前疾病。其还涉及在食品农业食品领域和环境中检测生物标记物(生物分子)的方法。所有这些诊断和检测方法都包括使用本发明的数字方法。本发明还涉及一种用于检测和/或定量至少一种靶标生物分子的试剂盒，所述试剂盒包含酶、寡核苷酸和分割剂。

背景技术

若干种生物分子如DNA、RNA或蛋白质用作有吸引力的诊断、预后或预测生物标记物。这些分子，特别是核酸已经积累其与各种疾病(癌症、神经元或心血管疾病、糖尿病等)密切相关的临床证据。此外，它们存在于体液中，因此可以通过微创液体活检(血清、血浆、尿液)获得。循环中的生物标记物可以被反复评估，从而能够对治疗和复发进行定期随访、能够进行大规模人群筛查或进行早期诊断。

检测这些生物分子通常是一项具有挑战性的任务，因为获得的结果必须是准确的，才能用于临床目的。因此，对这些生物标记物的精确测量是至关重要的瓶颈，这促进开发灵敏的、特异性的和定量的检测技术。

最常用的灵敏检测蛋白质的技术是酶联免疫吸附测定(ELISA)，最常用的灵敏检测核酸的技术是：对于检测DNA是聚合酶链式反应(PCR)，对于检测RNA是逆转录定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)。所有这些技术都允许进行特异性的和灵敏性的检测，但有一些限制，需要得到加强。

例如，目前通过PCR及相关方法检测DNA需要对靶标核酸进行扩增。这可能容易出现非特异性扩增或弱的信号扩增，从而降低检测方法的特异性和灵敏性。

关于RNA检测，尽管RT-qPCR具有高灵敏性，但该技术具有一些缺点：已知RT步骤会在定量中引入显著偏差(Bustin等人，2015)；引物和探针必须针对每个靶标进行设计，并且由于靶标的长度短而依赖于复杂的设计；应针对每个测定优化热循环的方案；扩增靶标本身，因而靶标本身是遗留污染的危险源(Aslanzadeh等人，2004)；已知PCR反应在生物样本中受到抑制(Opel等人，2010)。此外，该方法依赖于扩增的实时跟踪，并需要标准校准，因此只能获得对生物分子数量的定性估计。

上述缺点可以通过使用基于小区室中单个核酸分子的分离和分析的数字程序来部分克服。

数字技术有若干优点，特别是：i)数字技术与端点测定兼容，不需要连续监测反应；ii)数字技术提供不需校准标准的绝对定量；iii)数字技术提供极限灵敏性；iv)数字技术尤其是在复杂背景中的罕见靶标的情况下还改善测定的灵敏性和特异性。

然而，只有当测定的批量灵敏性已经高于每个区室的单个靶标的对应的浓度时，才可以将测定转换为数字格式。例如，如果用于数字程序的区室的内部体积约为一纳升(nanoliter)，此类区室中单个分子的浓度约为飞摩尔(femtomolar)，则检测极限低于飞摩尔的扩增技术将是数字测定所必需的。检测极限高于飞摩尔的扩增方法不适用于此情况。尽管PCR通常满足高灵敏性的要求，并为生物分子(特别是核酸)的精确和绝对定量提供一种强大的方法，但对于数字格式的评估，其仍保留了RT-qPCR的弱点(Campomenosi等人，2016)。

已经提出了等温替代方案(Zhao等人，2015年)(EXPAR、LAMP、RCA、HCR等)，其依赖于更简单的一步方案，不需要热循环，并且从逆转录反应中解脱出来。虽然这些技术具有可竞争的灵敏性，但受到非特异性扩增反应的影响，这使得它们不适应数字读数。例如，Zhang等人(Zhang等人，2015)清楚地证明EXPAR(指数扩增反应)的这些局限性，EXPAR是一种众所周知的易于进行快速非特异性扩增的方法。当适用于数字格式时，作者表明空液滴仅在含有靶标的液滴几分钟后扩增，从而证明等温核酸扩增方法虽然在批量中表现出良好的灵敏性，但不能转换为稳健的数字格式。

因此，目前还没有用于酶和核酸，特别是microRNA的数字测量的稳健方法。

本发明的目的是提供一种在检测用作生物标记物的生物分子，例如生物聚合物，特别是核酸和酶时允许绝对定量和更高灵敏性的方法，所述方法基于特异性等温扩增方法的数字化，但没有上述缺点。此外，本发明旨在提供这种可以在一个***中容易执行的方法。

发明内容

本发明的发明人之前已经开发了一种消除背景扩增的方法用于检测核酸(WO2017140815)。他们出人意料地发现，这种模拟方法可以成功地数字化以便获得一种数字方法，从而可以提高检测作为生物标记物的生物分子的灵敏性，在批量测量中准确地定量这些生物分子而不必连续监测扩增反应、或使用校准曲线。

根据第一方面，本发明因此涉及一种用于检测和/或定量样本中至少一种生物分子的数字方法，包括以下步骤：

a)将所述样本与包括缓冲液、酶、作为扩增寡核苷酸的第一寡核苷酸、作为泄露吸收寡核苷酸的第二寡核苷酸和作为靶标特异性转换寡核苷酸的第三寡核苷酸的混合物进行混合；

b)将步骤a)中获得的混合物分割成几个区室，使得部分区室不包含靶标生物分子；

c)将靶标生物分子转换为信号，所述信号优选为DNA单链

d)扩增信号，以及

e)检测和/或测量每个区室中的所述扩增的信号。

这种方法的主要优点是它可以快速和选择性地检测生物分子，如DNA、RNA和蛋白质等，并还可以对这些生物分子进行绝对定量。

特别是在检测和/或定量RNA时，与RT-PCR模拟方法相比，本发明方法的优点是1)不需要可能妨碍定量测定的逆转录步骤；2)不必须PCR步骤所需的高温和温度循环；3)等温扩增对许多可能存在于粗样本中化学物质具有稳健性，并且已证明会抑制PCR反应(Huggett等人，2008)，因为靶标生物分子没有被扩增，所以避免了交叉污染问题。

发明人还证明，本发明的方法可用于直接从任何类型的含有生物分子的样本，如血液样本和其它生物液体中检测生物分子。

这种方法的特异性、简单性和快速性使其可用于医学诊断方法，特别是用于疾病诊断，例如，癌症、神经元疾病、心血管疾病、炎性疾病、自身免疫性疾病、由病毒或细菌感染引起的疾病，皮肤病、骨骼肌疾病、牙病和产前疾病。

根据第二方面，本发明还涉及一种用于诊断疾病的体外方法，所述疾病选自癌症、神经元疾病、心血管疾病、炎性疾病、自身免疫性疾病、由病毒或细菌感染引起的疾病、皮肤病、骨骼肌疾病、牙病和产前疾病，所述诊断方法包括使用数字方法。

本发明的数字方法的特异性、灵敏性、简单性和快速性允许将其用于农业诊断方法中，特别是用于诊断由生物胁迫，如传染病和寄生虫病引起的疾病、或由非生物胁迫，如营养缺乏或不利的环境引起的疾病。

根据第三方面，本发明还涉及一种用于农业疾病诊断的体外方法，所述疾病选自：

-由生物胁迫，优选传染源和/或寄生虫源引起的疾病，或

-由非生物胁迫引起的疾病，优选营养缺乏和/或不利的环境引起的疾病，

所述方法包括使用本发明的数字方法。为实施本发明的方法，还提供试剂盒。

根据第四方面，本发明因此涉及一种用于检测和/或定量至少一种靶标生物分子的试剂盒，所述试剂盒包含：

a)酶的混合物，所述酶优选选自聚合酶、切口酶或限制酶和外切酶；

b)寡核苷酸的混合物，其包含作为扩增寡核苷酸的第一寡核苷酸、作为泄露吸收寡核苷酸的第二寡核苷酸和作为靶标特异性转换寡核苷酸的第三寡核苷酸以及任选的作为报告探针的第四寡核苷酸，以及

c)分割剂，优选油包水乳剂。

详细描述

如上所述，本发明涉及将最近的无背景扩增化学方法应用于数字读数，从而提供生物分子靶标的绝对定量。

特别是，适合的无背景扩增化学，包括在生物分子靶标，特别是核酸靶标的等温扩增中消除背景扩增，是由本发明的一些发明人实施并在国际申请WO2017140815中公开的。

根据第一方面，本发明因此涉及一种用于检测和/或定量样本中至少一种生物分子的数字方法，包括以下步骤：

a)将所述样本与包含缓冲液、酶、作为扩增寡核苷酸的第一寡核苷酸、作为泄露吸收寡核苷酸的第二寡核苷酸和作为靶标特异性转换寡核苷酸的第三寡核苷酸的混合物进行混合；

b)将步骤a)中获得的混合物分割成若干区室，使得部分区室不包含靶标生物分子；

c)将靶标生物分子转换为信号，所述信号优选为DNA单链；

d)扩增信号，以及

e)检测和/或测量每个区室中的所述扩增的信号。

根据本发明的数字方法可以同时检测和/或定量一种或多种生物分子，所述生物分子具有相同或不同的结构和功能。

在本发明的上下文中，术语“生物分子”涉及大的大分子或生物聚合物(例如，蛋白质、碳水化合物、脂类和核酸)以及小分子，例如，初级代谢物、次级代谢物和天然产物。本发明中的生物分子通常是内源性的，但也可以是外源性的(例如，生物制药药物)。

根据本发明的一个优选实施方案，生物分子选自蛋白质(优选为酶)或核酸。

发明人出人意料地发现，将酶活性与在数字生物测定中对DNA信号进行阈值指数扩增的通用分子环路耦合，与本领域的其它数字酶测试(允许检测少数类型的酶)相比，其允许以非常高的灵敏性检测和/或定量酶。环路包括模块以及DNA扩增***，所述模块将靶标活性与短的DNA触发物的产生相连，所述DNA扩增***产生可检测的读数，特别是荧光读数。因为它将酶的催化率与信号产生解耦，这个多功能的框架允许数字检测，特别是使用标准微区室，特别是内部体积在皮升范围内的微流控液滴对各种DNA加工酶进行液滴数字检测。因此，本发明的方法允许将与单个酶相关的弱催化活性转换为可检测信号，特别是足够强的荧光信号，以便在微区室，特别是微液滴中容易检测。

在本发明的上下文中，术语“酶”指具有催化功能的蛋白质，其能够催化分子底物的转化。可通过本发明的数字方法检测和/或定量的酶组选自具有广泛活性的DNA相关酶，例如，核酸酶、DNA N-糖基化酶、聚合酶、连接酶和激酶，或非DNA相关酶。特别是，这些酶选自切口酶、限制酶、内切酶、DNA N-糖基化酶、AP-内切酶、外切酶RNA/DNA聚合酶、连接酶、激酶和甲基化酶。更特别地，可实施本发明的方法用于识别和/或定量切口酶和限制性内切酶。可以通过本发明的方法检测和/或定量的酶的具体示例包括但不限于Nt.BstNBI、RNAseH2、APE-内切酶1(APE-1)、尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)、烷基腺嘌呤糖基化酶(AAG)、BsmAI限制酶、poly(A)聚合酶(PAP)、T4 DNA连接酶和T4多核苷酸激酶(T4PNK)。

在本发明的上下文中，术语“模块”涉及执行特定作用如信号转换、扩增、报告等的寡核苷酸或一组寡核苷酸。在检测核酸的情况下，所述模块对应于寡核苷酸(模板)。当检测酶时，所述模块对应于一组寡核苷酸。

在另一实施方案中，本发明的生物分子靶标是核酸，例如DNA、cDNA、RNA、mRNA、microRNA。甚至更优选地，所述生物分子靶标是核糖核酸(RNA)。

在本发明的上下文中，术语“核酸”涉及由核苷酸组成的生物聚合物或小生物分子，所述核苷酸是由三种成分组成的单体：5-碳糖、磷酸基团和含氮碱基。如果所述糖是复合核糖，所述聚合物就是RNA(核糖核酸)；如果所述糖是由核糖衍生的脱氧核糖，所述聚合物就是DNA(脱氧核糖核酸)。

如上所述，本发明的数字方法可用于检测和/或定量DNA分子或作为编码分子的互补DNA(cDNA)。

甚至更优选地，本发明的方法用于检测和/或定量选自信使RNA(mRNA)、小干扰RNA(siRNA)和微RNA(miRNA)的核糖核酸(RNA)分子。

根据最优选的实施方案，本发明的方法可用于检测和/或定量microRNA分子。

在本发明的上下文中，术语“microRNA”指约为22个核苷酸长的内源性的短非编码RNA链，其参与基因表达的转录后调节。

为了实施本发明的方法，有必要在第一步(步骤a))将允许避免背景扩增的分子程序与含有靶标生物分子的生物样本混合。

如本文所用，术语“靶标生物分子(target biomolecule)”或“生物分子靶标(biomolecule target)”涉及通过本发明的方法检测和/或定量的上述定义的生物分子。

这些靶标生物分子存在于样本中。所述样本可以是任何类型的。例如，所述样本可以从测试的受试者获得，所述受试者是动物，优选是哺乳动物，更优选是人。这种样本也可称为生物样本。

在本发明的上下文中，术语“生物样本”涉及从生命有机体中获得的固体或液体生物材料。固体生物样本可以是例如细胞、部分组织(活检)、整个组织或器官。

优选地，本发明的方法中使用的样本是液体样本。

在本发明的上下文中，术语“生物液体样本(sample of biological fluid)”或“液体样本(fluid sample)”涉及到从生命有机体产生的生物有机液体中获得的任何样本。所述生物液体选自细胞外液、血管内液、间质液、淋巴液和细胞间液(transcellularfluid)。

具体地，生物液体样本选自血液和血液成分、尿液、唾液等。

在更优选的实施方案中，生物液体样本是血液样本或血液成分样本。“血液样本”或“血液成分样本”指全血或特别是选自红细胞部分、白细胞部分、血小板、血浆或血清的血液成分之一。

在本发明的另一实施方案中，样本可以从非生物有机体中获得。例如，所述样本可以从空气、水、土壤、消化产物等获得。样本的类型取决于本发明的数字方法的应用。根据本发明，所述样本含有或可能含有生物分子。

如上所述，在本发明的数字方法的步骤a)中，将含有靶标生物分子的样本与分子程序混合。

本发明方法中使用的分子程序在国际申请WO2017140815中详细公开，其内容通过引用并入本文。

在本发明的上下文中，术语“分子程序”涉及到设计生物分子环路以执行体外信息加工任务。分子程序是基于可预测的Watson和Crick碱基配对，所述碱基配对赋予DNA独特的可编程性，使得能够合理设计分子环路。

本发明的方法中使用的分子程序是基于本发明人中的一些人开发的程序，该程序包含名为PEN-DNA工具箱的多功能的分子编程语言((Polymerase Exonuclease Nickase-Dynamic Network Assembly)，Montagne等人，2011)。网络的拓扑结构是由一组短的寡核苷酸(模板)定义的。所述网络由酶(聚合酶、外切酶和切口酶或限制酶)的混合物解释，所述酶的混合物通过产生和降解DNA链来加工信息流，进而活化或抑制所述网络的其它节点。

根据本发明的数字方法的一个实施方案，步骤a)的混合物中的酶选自聚合酶、切口酶、限制酶和外切酶。聚合酶、切口酶和限制酶可以驱动等温扩增，外切酶可以避免***饱和。

具体地，本发明的数字方法中使用的聚合酶选自Bst2.0 DNA聚合酶、Bst大片段DNA聚合酶、Klenow片段(3’->5’exo-)(也称为Klenow DNA聚合酶(Klenow(exo-)或Klenow聚合酶))、Phi29 DNA聚合酶、Vent(exo-)DNA聚合酶，更具体地，所述聚合酶是Vent(exo-)DNA聚合酶(购自New England Biolabs(NEB))。根据本发明方法的一个实施方案，可以同时使用多于一种的聚合酶。根据一个优选的实施方案，聚合酶Vent(exo-)DNA聚合酶和Klenow片段(3'->5'exo-)一起使用。特别是当所检测的生物分子是RNA时，同时使用Klenow聚合酶和Vent(exo-)DNA聚合酶可以提高扩增反应的速度。速度的增加主要是由于Klenow聚合酶，但使用Vent(exo-)DNA聚合酶仍然是必要的，以避免出现非特异性扩增产物。

为获得更高的扩增反应速度，Klenow聚合酶的浓度包含在1至50u/mL之间，特别是8至25u/mL之间，以及甚至更特别地，该浓度限制到16u/mL。

切口酶选自Nb.BbvCI、Nb.BstI、Nb.BssSI、Nb.BsrDI，特别地，切口酶是Nb.BsmI和/或Nt.BstNBI(购自New England Biolabs(NEB))。可以同时使用多于一种的切口酶。

根据本发明方法的一个实施方案，可以用限制酶取代切口酶。与切割单链的切口酶相反，限制酶切割双链。因此，当使用限制酶而不是切口酶时，有必要保护本发明的方法中使用的模板。这种保护可以通过例如模板的化学修饰来获得。这种修饰包括骨架修饰，例如硫代磷酸酯连接。

本发明的数字方法中使用的外切酶选自，例如RecJ_f、外切酶I、外切酶VII，特别地，所述外切酶是按照Yamagata(Yamagata等人，2001)描述的方案获得的ttRecJ外切酶。可以同时使用多于一种的外切酶。

用于酶和寡核苷酸混合物的缓冲液与所选择的寡核苷酸模板相适应。本领域技术人员将能够使常规缓冲液适应特定的分子设计。本申请的实验部分也给出了这种缓冲液的示例。例如，在优选实施方案中，反应缓冲液包含20mM的Tris HCl pH 7.9、10mM的(NH₄)₂SO₄、40mM的KCl、10mM的MgSO₄、50μM的每种dNTP、0.1％(w/v)的泊洛沙姆(Synperonic)F104、2μM的纺锤菌素(netropsin)、200μg/mL的BSA。

根据一种实施方案，特别是当检测和/或定量酶时，步骤a)的混合物包括使用至少一种模块。

本发明的数字方法的步骤a)的混合物的每种寡核苷酸或模块具有特定的功能，最终允许靶标生物分子转换和获得的信号扩增，并且没有同时诱导的背景扩增，即在没有靶标生物分子的情况下发生的信号扩增反应。

因此，这种混合物包含作为扩增寡核苷酸的第一寡核苷酸或第一模块、作为泄露吸收寡核苷酸的第二寡核苷酸或第二模块以及作为靶标特异性转换寡核苷酸的第三寡核苷酸或第三模块。特别地，所述混合物包含用于检测和/或定量酶的第三模块。

在本发明的上下文中，术语“扩增寡核苷酸”或“自催化模板”或“aT”设计能够指数扩增触发物序列的寡核苷酸。可作为扩增寡核苷酸发挥功能的寡核苷酸的示例在下面表1中给出。

在本发明的上下文中，术语“泄露吸收寡核苷酸”或“伪模板”或“pT”涉及比自催化模板更强地结合被扩增的序列的寡核苷酸，但仅在该寡核苷酸的3'端添加几个核苷酸就可使其失去进一步在自催化模板上引发反应的活性(因为现在其3'端与自催化模板不匹配)。泄露吸收寡核苷酸可以避免非特异性扩增，这里也称为背景扩增(即，在没有扩增信号序列的情况下发生的扩增)。它促使从泄露反应中合成的触发物失去活性。伪模板需要受到保护以防止被降解，正如自催化模板那样。这通过在伪模板的5'端使用一些硫代磷酸酯修饰(或其它可能的外切酶阻断，例如生物素-链霉亲和素修饰、倒置或修饰的核苷酸)实现。泄露吸收寡核苷酸的示例在下表1中给出。

在本发明的上下文中，术语“靶标特异性转换寡核苷酸”或“转换模板”或“cT”涉及将靶标生物分子转换为通用触发物序列(或在此也称为“信号”或“信号序列”)的寡核苷酸。转换模板可以或可以不像自催化模板那样受到保护以防止降解。术语“转换模块”涉及本文定义的一组转换寡核苷酸。

根据本发明的数字方法的一个实施方案，第一寡核苷酸包括含有切口酶识别位点的部分重复结构，并且第二寡核苷酸能够沿着第一寡核苷酸结合、延伸、失活并缓慢释放聚合产物，从而诱导阈值。

根据本发明的数字方法的另一实施方案，特别是当靶标是DNA或RNA序列时，第三寡核苷酸的3'侧能够与靶标序列结合，并且在经过聚合和切口后，第三寡核苷酸输出能够在高于通过控制第二寡核苷酸的浓度调整的阈值上活化第一寡核苷酸的序列。

根据本发明的数字方法的一个实施方案，第一寡核苷酸的3'端具有降低的对扩增序列的亲和力。

在又另一实施方案中，第二寡核苷酸的3'端与第一寡核苷酸扩增的序列互补，第二寡核苷酸的5'端作为模板向被扩增的序列添加失活尾。

在实施本数字方法的一个实施方案中，选择第一和第二寡核苷酸的浓度，以便在高浓度的扩增序列上第一寡核苷酸的反应比第二寡核苷酸的反应快，但在低浓度的扩增序列上第二寡核苷酸的反应比第一寡核苷酸的反应快，从而有效地消除扩增，除非刺激阈值是交叉的。

在另一实施方案中，第三寡核苷酸(转换模板或模块)可以针对受检测和/或定量的生物分子的性质以不同方式设计。具体地，当检测酶时，可以根据待检测酶的性质以不同方式设计转换模板(模块)。例如，可以通过在传感模板的茎结构中分别引入核糖核苷酸和脱碱基位点(AP)来检测RNASe H和AP-内切酶(APE-1)。尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)可以通过，例如用脱氧核糖尿苷(deoxyribouridine)部分取代AP位点来检测。限制酶的检测可以通过在传感模板的5'部分附加识别位点来实现。转换模板可以被设计成作为靶标酶的底物，并包括特定的序列或一种或多种化学修饰，例如磷酸酯修饰、修饰的核碱基(nucleobase)、糖或骨架部分或结构特征，例如，摇摆的、错配的、补平的或垂悬的端部、悬垂序列(flapsequences)。

在另一实施方案中，可以使用多于一种的转换寡核苷酸，特别是用于检测和/或识别酶。这些模板可以如上所述设计。例如，当靶标酶特异于双链DNA底物，或当靶标酶使用多个核酸链作为底物时，可能使用由两个或多个寡核苷酸组成的模块。这些酶包括一些DNAN-糖基化酶(例如，烷基腺嘌呤糖基化酶)或DNA或RNA连接酶或激酶、转座酶、DNA或RNA核酸酶)。此外，还可能设计转换模块使靶标酶触发级联修饰，最终导致产生触发物，起始扩增。例如，可以使用两种寡核苷酸检测和定量poly(A)聚合酶(PAP)，第一种用作聚腺苷酸化的底物，第二种用作模板使用新聚合的poly(A)尾作为输入以生成触发物输出。

根据本发明的数字方法的一个实施方案，加入作为报告探针的第四寡核苷酸。

在本发明的上下文中，术语“报告探针”或“报告模板”或“rT”是指将触发物序列的存在翻译成为可检测信号的寡核苷酸。这种可检测的信号指，例如颗粒聚集、介质胶凝、电化学信号或化学发光信号，优选荧光信号。因此，报告探针优选为荧光探针。

在一个实施方案中，报告探针检测由扩增寡核苷酸扩增的信号链。

在另一实施方案中，报告探针是在两端受荧光团和/或淬灭剂(quencher)修饰的自身互补DNA链。如本文所用，术语“自身互补”是指同一分子的两个不同部分由于碱基互补(A-T和G-C)而可以彼此杂交。在本发明的情况下，单链探针的两个端部(3'和5'部分的几个核苷酸)可以彼此杂交，并诱发淬灭剂对荧光团的淬灭。扩增的序列可以与部分报告模板结合，导致茎环结构打开，从而增强荧光信号。

报告探针也可包括含有切口识别位点的环。

与现有技术中使用的必须为每个靶标设计(序列)和优化(长度)的PCR探针(用于检测)相比，本发明方法中使用的报告探针是模块化的，这意味着它们可以用于通过合适的双稳态模块(自催化模板+伪模板)进行信号转换的任何靶标。

在本发明的数字方法的步骤a)中使用的不同寡核苷酸(模板)的示例在下表1中给出并且也可以在本申请的实施例部分中给出。

表1：寡核苷酸(模板)的示例。

在上表1中，biotin和bioteg分别指的是使用氨基乙氧基-乙氧基乙醇接头和较长的三甘醇接头的生物素化的合成子(synthons)。“*”表示硫代磷酸酯骨架修饰，“p”表示3’磷酸酯修饰。在SEQ ID No：16至23和30中，胸苷(T)被脱氧尿苷(U)取代，以避免触发物在模板上聚合的产物中的切口。Atto633、FAM、Cy5、Hex、Cy3.5、BMN3是荧光团，BHQ1、BHQ2、BMNQ530是淬灭剂。

在以上列出的序列和本文描述的示例的基础上，可以使用各种模板组合来实现本发明的数字方法。本领域的技术人员，从本说明和有关核苷酸设计的公知常识出发，能够确定其它模板和其它组合以便针对任何目的靶标实施本发明的方法。

特别地，选择模板序列取决于实验参数，例如，工作温度、速度和所用酶，特别是切口酶的特异性。优选地，可以使用含有Nb.BsmI切口酶位点的扩增模板和与Nt.BstNBI工作的模板。

根据本发明方法的一个实施方案，模板，优选四种模板(自催化模板、转换模板、伪模板和报告模板)通过作为扩增序列的“通用触发物”的序列进行连接。

图3显示了优选用于本发明数字方法的分子程序中的环路连接的一个实施方案。通用信号扩增部分产生双稳态节点，即扩增***许可两种状态：在没有触发物的情况下的非生产性状态，以及当触发物的浓度超过给定的阈值时扩增起始的生产性状态。该双稳态节点由两种模板组成：自催化模板(aT)，其由催化优选为12聚体寡核苷酸的指数复制的双重复序列组成；伪模板(pT)，其吸收自催化模板上的非特异性反应产生的泄漏产物从而避免背景扩增。转换模板(cT)连接到aT上游：在靶标与cT的输入部分结合后，转换模板催化大量输出链的产生，进而触发aT上的自催化反应。在aT的下游，报告模板(rT)捕获扩增的信号链以产生荧光信号。根据本发明方法的优选的实施方案，详细的反应网络见图2。

根据另一实施方案，可以不使用报告模板读出扩增的信号，而是例如通过DNA双链***(Evagreen或SYBR绿)，通过聚集纳米粒子或形成特定的DNA结构、DNA酶等来进行。

本发明的数字方法的步骤b)通过将在步骤a)中获得的混合物分割成若干区室以使得部分区室不包含靶标生物分子来进行。

样本分割是数字定量方法的基础。数字定量依赖于对含有扩增混合物的样本进行分割，使靶标生物分子以以下方式随机分布：在大多数的区室中仅存在少数靶标生物分子，优选在零至十个之间，更优选在零至五个之间，甚至更优选在零至两个之间，以及仍甚至更优选为一个分子。随机分割的过程产生的每个区室的靶标生物分子数量分布遵循泊松定律。当至少有一些区室不包含任何靶标生物分子时，可以应用数字定量方法。该部分空区室应该高于1％，优选高于10％。因此，根据本发明，大部分区室而不是这些区室的全部含有至少一个靶标生物分子。

换句话说，将在步骤a)中获得的混合物分割到若干区室中，使得靶标生物分子的分布产生一些接受至少一个生物分子的区室，其数目少于区室总数的100％。

如本文所用，术语“数字方法”或“数字扩增方法”指检测方法，其中包含靶标生物分子的受测样本被分隔在若干微区室中，例如，靶标遵循泊松分布随机分离在区室中。随后，反应在每个单独的区室中进行，以允许用于直接计算离散事件和用于绝对靶标定量。

样本的分割可以通过几种方式进行，例如，微型小室(chamber)(例如，如来自Thermofisher Scientific的SlipChip或QuantStudio 3D)或微液滴(例如，来自Biorad的QX200***或Stilla technologies的Naica***)。

根据本发明的数字方法的一个优选的实施方案，受测样本分割到数以百万计的油包水液滴中，所述液滴由两种不相溶的液体组合而成：样本水相和连续疏水相，例如，十一烷-1-醇、硅油、矿物油，更优选全氟化油，因为其与水的高度不相溶性、具有生物相容性、低粘度、透明以及与微流控设备普遍兼容。

液滴的平均尺寸非常重要，因为其决定测定的可行性、进行测定所需的时间(相当于含有单个靶标的液滴扩增所需的时间)和测定的动态范围(即浓度范围，其包含在测定的灵敏性下限和有相当一部分的液滴不启动(turn on)的最高浓度之间)。事实上，在数字格式中，有必要调整液滴的尺寸，以使对应于一个液滴中封装的单拷贝靶标的浓度达到高于批量检测极限的数值。如果液滴太大，则通常的测定灵敏性将不允许进行检测，仅仅是因为靶标被过于稀释，将不会触发与背景可区别的信号。液滴的尺寸也必须足够小(因此液滴中单个分子的浓度足够大)，以确保在合理的时间内(通常是几个小时)触发靶标阳性液滴的扩增。更小的液滴会使测定更快。最后，针对上述两个条件给定适当尺寸的液滴，数字测定的动态范围包含在较低的批量靶标浓度(对于该浓度，启动的液滴分数显著高于阴性对照)和有相当分数的液滴不启动的浓度之间。较小的液滴使动态范围转向较高的浓度，而较大的液滴(如果与测定兼容)则使其动态范围转向较低的浓度。

此外，区室或液滴的尺寸受到一些技术上的限制。较小的单分散液滴可能更难生产，但它们在高温孵育或循环中通常更稳定。

本领域大多数基于PCR的数字测定都采用直径为20至100微米(即，4至500pL)的液滴。这是因为PCR扩增方法的高灵敏性使得这种方法与非常低的起始靶标浓度相兼容。等温技术灵敏性较低，因此更适合于较小尺寸的液滴。根据目的靶标，本文所述的测定在没有液滴分割的情况下达到的灵敏性通常优于1pM，以及在某些情况下，例如对于酶检测，可以达到1fM。因此，对于核酸检测而言，特别是对于microRNA检测，优选使用相对较小的液滴，而对于酶的检测而言液滴可以较大。仍有可能改变液滴的尺寸以使测定的动态范围移动。

在一个实施方案中，调整液滴的尺寸以使得封装在一个区室体积中的单拷贝靶标达到皮摩尔左右的数值。这也确保在合理的时间内(通常是几个小时)触发靶标阳性液滴的扩增。如果区室太大，仅仅是因为靶标过于被稀释，通常灵敏性的测定将不允许进行扩增。

反应区室的缩小(从试管中的微升规模到液滴中的皮升规模)增加了扩增反应中的随机效应(源于模板和酶在液滴中的分布、表面效应、生物分子和表面活性剂之间的相互作用、温度的不均匀性)。这些现象意味着液滴的扩增开始时间的分散性(即，所有含有单个靶标的液滴不会在完全相同的时间扩增)。这种分散性在基于PCR的反应中不太普遍，因为热循环方法在所有的区室之间同步进行复制循环。由于等温反应中较高的ON时间分散性，重要的是在所有含有靶标的液滴转为ON之前，使空液滴保持OFF。经典的等温方法(EXPAR、RCA、HCR等)，虽然在批量中表现出良好的灵敏性，但不能处理这种限制。等温数字方法的必要条件是，使用为靶标浓度提供充足时间窗口的方法，加上精确选择尺寸的区室，使得存在于一个这样的尺寸的区室中的单拷贝靶标生物分子达到提及的靶标浓度。

根据一个实施方案，本发明的数字方法中使用的液滴具有包含在0.001pL至100pL之间，优选在0.1pL至10pL之间，以及更优选在0.5pL至5pL之间或0.5pL至8pL之间的尺寸。优选地，当本发明的方法用于确定和/或定量酶时，液滴的尺寸包含在5至8L之间，优选地，这种情况下液滴的尺寸是7.2pL。

根据另一实施方案，当本发明的方法用于检测和/或定量酶时，液滴的尺寸可包含在0.5pL至100pL之间，特别在5pL至50pL之间，以及更特别在6pL至10pL之间。

如上所述，本发明方法的主要优点是不是直接检测靶标生物分子，而是将其转换为信号序列。这可以避免直接检测靶标生物分子所引起的灵敏性和特异性问题，而且还限制了携带污染的风险。

因此，在本发明的方法中，在步骤b)中分割混合物之后，靶标生物分子的序列在步骤c)中，优选地通过转换模板被转换为信号。

如本文所用，术语“信号”或“信号序列”涉及核酸序列，优选通过将靶标生物分子(优选核酸分子，更优选microRNA)的序列转换为可被扩增的序列而获得的单链DNA。

然后，在本发明方法的步骤d)中扩增转换的信号序列。

根据一个实施方案，步骤d)中信号序列的扩增在35℃至60℃，更优选37℃至55℃，甚至更优选45℃至50℃的恒定工作温度下进行。

根据本发明，步骤c)和d)中的化学反应同时发生。步骤c)和d)也可以设计为孵育步骤。

为了检测和/或测量扩增的信号序列，有必要对所述分子进行标记。优选地，通过使用有机染料或无机染料标记的荧光探针进行标记，例如，量子点、颗粒凝集。本领域技术人员能够将传统的标记手段适用于本发明的数字方法。

根据本发明的数字方法的优选实施方案，所使用的标记是荧光信号。在步骤d)中扩增信号序列的孵育过程中，靶标生物分子在其被封装的液滴中触发信号扩增。因此，孵育后液滴显示阳性荧光信号。

因此，根据本发明的数字方法的一个实施方案，检测和/或测量所述扩增信号的步骤e)包括检测和/或计数发射高荧光的区室。

在一个实施方案中，当本发明的数字方法用于测量受测生物样本中靶标生物分子的绝对浓度时，计数显示高荧光的区室(即，那些接受了靶标生物分子的区室)和无荧光区室，并计算它们的比率。

优选地，通过荧光显微镜成像可以对阳性/阴性液滴进行计数以及从而计算出起始样本中准确的靶标生物分子浓度。

根据另一实施方案，另一常规方法(例如，流式细胞术)可用于计数阳性/阴性液滴。

根据优选的实施方案，本发明的数字方法如下进行：使用标准微流控技术将包含分子程序(缓冲液、上述酶、聚合酶、切口酶和外切酶以及上述四种寡核苷酸模板)和含靶标生物分子的样本的混合物分割到皮升尺寸(约在0.1pL至5pL之间)的油包水液滴。靶标遵循泊松定律在液滴中随机分布。然后，在恒定的工作温度(从42℃到55℃不等)下孵育乳液，以使靶标生物分子转换为信号并扩增所述信号。信号被扩增，并且在分割步骤中接受至少一个靶标生物分子的液滴中启动荧光。同时，空的液滴保持在低的荧光水平。最后，使用荧光显微镜对液滴进行成像(可能使用其它读数，例如荧光活化液滴分选(FADS)或流式细胞术)。因此，与测试试管实验所必须的实时监测相反，读数取决于终点测量。阳性/阴性液滴的比率(或也称为“ON/OFF”比率)可计算初始样本中的确切靶标浓度而无需参考校准标准。

上述生物分子可能存在于所有类型的样本中。例如，它们可以存在于从非生物有机体获得的样本中(例如，土壤样本、水样本、空气样本、食品样本等)，或存在于从生物有机体获得的样本中，例如，细胞、体液或组织。

根据本发明方法的一个实施方案中，通过本发明的数字方法检测和/或测量的靶标生物分子用作生物标记物。

在本发明的上下文中，术语“生物标记物”涉及天然存在的分子，优选生物分子、基因，或通过其可以识别特定的病理或生理过程、疾病等的表征。

这些生物标记物可用于检测生物有机体，例如植物、动物，优选哺乳动物以及更优选人中的疾病。

此外，这些生物标记物可用于检测食品和农业食品行业或环境中的一种或几种异常现象。

所述生物标记物可以存在于例如所有的体液中，因此可通过微创液体活检获得(血清、血浆、尿液、泪液、唾液、汗液等)。

优选地，所述生物标记物用作检测疾病的生物标记物，所述疾病选自癌症、神经元疾病、心血管疾病、炎性疾病、自身免疫性疾病、由病毒或细菌感染引起的疾病、皮肤病、骨骼肌疾病、牙病和产前疾病。

在本发明的上下文中，术语“检测(detection)”用于以一般方式定义对上述定义的样本中的靶标生物分子的检测。

如本文所用，术语“检测”还涉及对一种或几种上述疾病或其症状的诊断或预后。检测还包括对一种或几种所述疾病的预测，或对受试者患一种或几种这些疾病的风险的预测。

此外，术语“检测”还涉及农业诊断，即植物病理学的诊断，特别是本发明中定义中的具有生物或非生物来源的植物病理学的诊断。

在本发明的上下文中，术语“癌症”指以细胞生长失调或失控为特征的恶性赘生物。特别是，“癌细胞”是指细胞生长失控或不受控制的细胞。

术语“癌症”包括原发性恶性肿瘤(例如，肿瘤的细胞没有迁移到受试者体内除原始肿瘤部位以外的其它部位的那些肿瘤)和继发性恶性肿瘤(例如，那些因转移而产生的肿瘤，肿瘤细胞转移到与原始肿瘤部位不同的继发部位的肿瘤)。这种癌症尤其可以选自实体癌症和/或选自造血癌症。

在本发明的一个实施方案中，所述癌症选自骨质溶解、骨肉瘤(bone sarcomas)(骨肉瘤(osteosarcoma)、尤文氏肉瘤、骨巨细胞瘤)、骨转移瘤、胶质母细胞瘤和脑癌、肺癌、听神经瘤、急性白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病(单核细胞、成髓细胞、腺瘤、血管肉瘤、星形细胞瘤、髓单核细胞和早幼粒细胞)、急性T细胞白血病、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、乳腺癌、支气管癌、***、软骨肉瘤、脊索瘤、绒毛膜癌、慢性白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞(粒细胞的)白血病、慢性骨髓性白血病、结肠癌、结直肠癌、颅咽管瘤、囊腺癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤、增殖异常改变(发育异常和化生)、胚胎癌、子宫内膜癌、内皮肉瘤、室管膜瘤、上皮癌、红白血病、食管癌、***受体阳性乳腺癌、原发性血小板增多症、纤维肉瘤、滤泡性淋巴瘤、生殖细胞睾丸癌、神经胶质瘤、重链疾病、血管母细胞瘤、肝癌、肝细胞癌、激素不敏感***癌、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、肺癌、***内皮肉瘤、***肉瘤、成淋巴细胞性白血病、淋巴瘤(霍奇金氏和非霍奇金氏)，膀胱、乳腺、结肠、肺、卵巢、胰腺、***、皮肤和子宫的恶性肿瘤和过度增殖性疾病，T细胞或B细胞来源的淋巴样恶性肿瘤、白血病、淋巴瘤、髓样癌、成神经管细胞瘤、黑素瘤、脑膜瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤、骨髓性白血病、骨髓瘤、粘液肉瘤、神经母细胞瘤、非小细胞肺癌、少突胶质细胞瘤、口腔癌、成骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、***状腺癌、***状癌、松果体瘤、真性红细胞增多症、***癌、直肠癌、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、皮脂腺癌、***瘤、皮肤癌、小细胞肺癌、实体瘤(癌和肉瘤)、小细胞肺癌、胃癌、鳞状细胞癌、滑膜瘤、汗腺癌、甲状腺癌、华氏巨球蛋白血症、睾丸瘤、子宫癌和维尔姆斯瘤。

在本发明的上下文中，术语“神经元疾病”是指包括大脑、脊髓、颅神经、周围神经、神经根、自主神经***、神经肌肉接头和肌肉的中央和周围神经***的疾病。神经元疾病选自神经发育、神经退行性或精神疾病。其包括癫痫、阿尔茨海默病和其它痴呆症、脑血管疾病(包括中风、偏头痛和其它头痛疾病)、多发性硬化症、帕金森病、神经感染、脑肿瘤、由于头部创伤造成的神经***的创伤性疾病等等。

本文所用的“心血管疾病”涉及心脏或血管衰竭，包括冠心病：供应心肌的血管疾病；脑血管疾病：供应大脑的血管疾病；周围动脉疾病：供应胳膊和腿的血管疾病；风湿性心脏病：由链球菌引起的风湿热对心肌和心脏瓣膜的损害；先天性心脏病：出生时就存在的心脏结构畸形，以及深静脉血栓和肺栓塞：可以脱落并移动到心脏和肺部中的腿部静脉中的血凝块。

如本文所用，“炎性疾病”优选指急性胰腺炎；ALS；阿尔茨海默病；恶病质/厌食症；哮喘；动脉粥样硬化；慢性疲劳综合征，发烧；糖尿病(例如，胰岛素糖尿病)；肾小球肾炎；移植物对宿主的排斥反应；失血性休克；痛觉过敏，炎性肠病；关节的炎性病状，包括骨关节炎、银屑病性关节炎和类风湿性关节炎；缺血性损伤，包括脑缺血(例如，由于创伤、癫痫、出血或中风造成的脑损伤，每一种都可能导致神经退化)；肺部疾病(例如，ARDS)；多发性骨髓瘤；多发性硬化症；骨髓性(例如，AML和CML)和其它白血病；肌肉疾病(例如，肌肉蛋白代谢，特别是在败血症中)；骨质疏松症；帕金森病；疼痛；早产；银屑病；再灌注损伤；败血性休克；放射治疗的副作用，颞下颌关节疾病，肿瘤转移；或由劳损、扭伤、软骨损伤、创伤、骨科手术、感染或其它疾病过程引起的炎性病状。

在本发明的上下文中，“自身免疫性疾病”定义为受试者身体产生针对其自身组织和细胞的抗体的病状。自身免疫性疾病的示例有：I型糖尿病、格雷夫斯病、炎性肠病、多发性硬化症、银屑病、类风湿性关节炎、***性红斑狼疮等。

由病毒或细菌感染引起的疾病是由致病病毒或细菌菌株造成的。这类疾病的示例有艾滋病、蛔虫病；足癣；杆菌痢疾、水痘；霍乱、普通感冒、登革热、腹泻、白喉、丝虫病、淋病、疱疹、钩虫病、流感、麻风病、麻疹、腮腺炎、东方疖、蛲虫病、鼠疫、肺炎、脊髓灰质炎、狂犬病、体癣、化脓性咽喉炎、嗜睡病、天花、梅毒、破伤风、伤寒、***炎、病毒性脑炎、百日咳等。

“皮肤病”是影响皮肤的病状，例如痤疮、斑秃、基底细胞癌、博温氏病、先天性红细胞生成性卟啉症、接触性皮炎、达里尔(darier)氏病、播散性浅表光化性孔角化病、营养不良性大疱型表皮松解症、湿疹(特应性湿疹)、***外佩吉特氏病、单纯性大疱性表皮松解症、红细胞生成性原卟啉症、指甲真菌感染、海利-海利病、单纯疱疹、化脓性汗腺炎、多毛症、多汗症、鱼鳞病、脓疱病、瘢痕疙瘩、毛发角化病、扁平苔藓、硬化苔癣、黑素瘤、黄褐斑、黏膜类天疱疮、类天疱、寻常天疱疮、苔藓样糠疹、毛发红糠疹、跖疣(疣)、多形性光线疹、银屑病、坏疽性脓皮病、酒渣鼻、疥疮、带状疱疹、鳞状细胞癌、斯威特氏综合征、荨麻疹和血管性水肿、白癜风。

如本文所用，“骨骼肌肉疾病”涉及骨骼、肌肉(肌病)和骨骼肌肉连接处的疾病。例如，此类疾病选自背痛、滑囊炎、纤维肌痛、骨纤维结构发育不良、生长板损伤、***遗传性疾病、马凡氏综合征、成骨不全症、骨坏死、骨质疏松症、骨佩吉特氏病、脊柱侧弯、椎管狭窄、肌腱炎等。

本文所用的“牙病”涉及牙齿和口腔问题。这类疾病的示例是龋齿、牙周(牙龈)病、口腔癌、口腔传染病、受伤造成的创伤和遗传性病变等。

如本文所用，“产前疾病”涉及可能影响妊娠或胎儿发育的疾病，例如艾滋病、羊水、妊娠期出血、宫颈疾病、妊娠糖尿病、弥散性血管内凝血(DIC)、异位妊娠、胎儿成红细胞增多症、胎儿发育问题、妊娠高血压、HELLP综合征、***、妊娠剧吐、宫内生长受限、大于胎龄(LGA)、流产、胎盘早剥、前置胎盘、胎盘功能不全、羊水过多、产前检查、流产、早产和分娩、风疹、小于胎龄儿(SGA)、***性红斑狼疮、弓形体病、双胞胎输血综合征、双胞胎、三胞胎、多胞胎、怀孕期间的***出血等。

因此，本发明的数字方法可用于诊断疾病的体外诊断方法中，所述疾病选自癌症、神经元疾病、心血管疾病、炎性疾病、自身免疫性疾病、由病毒或细菌感染引起的疾病、皮肤病、骨骼肌疾病、牙病和产前疾病。

因此，在第二方面，本发明涉及一种用于诊断疾病的体外方法，所述疾病选自癌症、神经元疾病、心血管疾病、炎性疾病、自身免疫性疾病、病毒或细菌感染引起的疾病、皮肤病、骨骼肌疾病、牙病和产前疾病，所述方法包括使用根据本发明的数字方法。

根据一个实施方案，所述诊断方法括以下步骤：

-提供从受试者获得的样本，以及

-通过使用本发明的数字方法检测一种或多种所述疾病的存在与否。

本发明的数字方法的特异性、灵敏性、简单性和快速性允许将其用于农业诊断方法中，特别是用于诊断由生物胁迫(例如，传染病和寄生虫病)引起的疾病、或由非生物胁迫(例如，营养缺乏或不利的环境)引起的疾病。

根据第三个方面，本发明还涉及一种用于农业疾病诊断的体外方法，所述疾病选自：

-由生物胁迫，优选传染源和/或寄生虫源引起的疾病，或

-由非生物胁迫引起的疾病，优选营养缺乏和/或不利的环境引起的疾病，

所述方法包括使用本发明的数字方法。

根据一个实施方案，所述农业诊断方法括以下步骤：

-提供从植物的任一部分获得的样本，和

-通过使用本发明的数字方法检测一种或多种所述疾病的存在与否。

在本发明的上下文中，术语“农业诊断”涉及植物病理学的诊断，所述诊断包括对植物样本进行分析用于鉴定真菌、病毒、细菌、线虫和任何其它引起生物胁迫的生命有机体和/或鉴定由于非生物胁迫而存在的生物分子。

在本发明的上下文中，术语“植物病理学”或“植物疾病”涉及植物异常，这些异常是由于生物或非生物胁迫造成的植物形态、生理或行为的变化而导致的。

如本文所用，术语“生物胁迫”是指由生物有机体引起的胁迫或疾病。生物胁迫可由任何生物有机体引起，但优选由传染源和/或寄生虫源引起，以及可由选自真菌、病毒、细菌和线虫的有机体引起。

根据一个实施方案，本发明的农业诊断方法可用于诊断真菌引起的疾病，所述疾病选自炭疽病、黑癌病、枯萎病、栗疫病(例如，晚疫病)、溃疡病、棒状硬化根、猝倒病、荷兰榆树病、麦角症、枯萎病、巴拿马病、叶疱病、霉病(例如，霜霉病和白粉病)、橡树枯萎病、腐烂病(例如，基腐病、灰霉病和心腐病)、锈病(例如，疱锈病、雪松苹果锈病和咖啡锈病)、疮痂病(例如，苹果疮痂病)、黑穗病、腥黑穗(bunt)、玉米黑穗病、雪霉病、烟灰霉病和黄萎病(Verticillium wilt)。

根据另一实施方案，本发明的农业诊断方法可用于诊断由病毒引起的疾病，所述疾病选自卷顶病、花叶病、鳞皮病和斑萎病。

根据另一实施方案，本发明的农业诊断方法可用于诊断由细菌引起的疾病，所述疾病选自紫菀黄化病、细菌性枯萎病、枯萎病(如火疫病和水稻细菌性枯萎病)、腐烂病、冠瘿病、腐烂病、基腐病和疮痂病。

本发明的农业诊断方法还可用于诊断由线虫引起的疾病，所述线虫选自根癌线虫(例如，根结线虫(Meloidogyne spp.))、胞囊线虫(例如，异节线虫(Heterodera spp.)和球线虫(Globodera spp.))、根部病变线虫(例如，短体线虫(Pratylenchus spp.))、掘穴线虫(例如，相似穿孔线虫(Radopholus similis))、鳞球茎茎线虫(Ditylenchus dipsaci)、松枯病线虫(例如，松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus))；肾形线虫(例如，肾形轮线虫(Rotylenchulus reniformis))、标记剑线虫(Xiphinema index)、异常科布线虫(Nacobbusaberrans)和叶芽线虫(Aphelenchoides besseyi)。

根据一个实施方案，本发明的农业诊断方法用于诊断由“非生物胁迫”引起的疾病，术语“非生物胁迫”定义不是由生物有机体引起的疾病。这些疾病优选由营养缺乏和/或不利的环境所引起。例如，非生物胁迫可由不合适的pH值、水可利用性(干旱胁迫)、温度(热胁迫和冷胁迫)、氧气和/或气体可利用性、矿物质缺乏(盐分胁迫)和有毒化合物(例如，污染物)所引起。

本发明的数字方法的特异性、灵敏性、简单性和快速性使其也可用于食品、农业食品工业和环境领域的生物分子检测方法。特别地，本发明的数字方法用于检测食品、农业食品和环境异常。这种检测是通过使用本发明的数字方法检测生物分子来进行的，这些生物分子可视为所述异常的生物标记物。

这种生物分子可以是，例如，生物有机体的一部分，也可以是由生物有机体的活性产生的，还可以是人工生物分子。这些生物分子(或生物标记物)选自生物聚合物，特别是DNA、RNA、蛋白质和酶。

所述生物分子存在于农业食品和食品来源和/或转化的产品中。

它们也可能存在于环境中，例如，空气、水和/或土壤中。

因此，根据一个方面，本发明还涉及用于检测农业食品、食品工业和/或环境中的生物分子(生物标记物)的体外方法，所述方法包括使用本发明的数字方法。

在本发明的上下文中，术语“食品”涉及基本的或转化的、不使用工业加工生产的或使用这种加工生产的所有食品。

在本发明的上下文中，术语“农业食品”涉及农业食品工业，即通过耕作进行的食品商业生产。

术语“环境(environment)”或“环境的(environmental)”涉及自然环境，即作为自然***运作而没有大规模文明人干预的生态单位，包括所有植物、微生物、土壤、岩石、大气以及在其边界内以及其自然界内发生的自然现象。这些术语也涉及可由人创造的非天然或人工环境。根据一个方面，本发明还涉及一种使用本发明的数字方法在食品和在农业食品工业和/或在环境中检测异常的体外方法。

优选地，所述方法包括：

-提供从食品、农业食品或环境中获得的样本，

-通过本发明的数字方法检测所述样本中的受测生物分子(生物标记物)。

发明人还证明，本发明的方法可用于同时或平行地检测和/或定量来自不同样本的不同靶标生物分子。为此，在一个实施方案中，可以用荧光染料对样本进行条码化，例如，使得每个液滴的条码荧光强度允许指定到每个初始样本。条码化方案公开自，例如Brouzes等人(2009)和Genot等人(2016)。由于这种条码化程序，多个样本可以同时进行乳化、收集、孵育和分析，从而允许减少检测时间和成本。

因此，根据第四方面，本发明的数字方法也可用于平行测定多于一个的样本，或样本中多于一个的靶标生物分子。

根据一个优选的实施方案，为了在一个或多于一个的不同的样本中(即使提供的信号很弱)直接检测和/或定量多于一个的生物分子，发明人出人意料地发现，使用作为串扰(crosstalk)抑制寡核苷酸的第五寡核苷酸(在此称为“杀手(killer)寡核苷酸”或“杀手模板”)可以显著提高方法的特异性。该实施方案依赖靶标特异性DNA环路(包括aT、cT、pT和/或rT)与DNA编码的抑制剂相互连接，所述DNA编码的抑制剂抑制由于分子串扰在多重检测通道之间产生不想要的通信这一事实所引起的非特异性信号扩增。

因此，在本发明的上下文中，“杀手寡核苷酸”或“杀手模板”或“kT”涉及能够产生相反开关的伪模板(pT)的寡核苷酸，从而作为交叉抑制剂用于扩增和减小非特异性串扰。用于杀手模板的序列的示例在下表1A中给出。

1pM和100nM，优选10pM和20nM之间，甚至更优选100pM和10nM之间以便控制抑制反应的强度。因此，根据该实施方案，本发明的检测和/或鉴定生物分子的数字方法还包括添加作为交叉抑制寡核苷酸的第五寡核苷酸，用于检测和/或定量两个或更多个生物分子。

本发明还涉及一种试剂盒，其可根据本发明的方法用于检测和/或定量靶标生物分子。

根据一个方面，本发明涉及一种用于检测和/或定量至少一种靶标生物分子的试剂盒，所述试剂盒包含：

a)酶的混合物，所述酶优选选自聚合酶、切口酶和外切酶；

b)寡核苷酸的混合物，其包括作为扩增寡核苷酸的第一寡核苷酸、作为泄露吸收寡核苷酸的第二寡核苷酸和作为靶标特异性转换寡核苷酸的第三寡核苷酸以及任选的作为报告探针的第四寡核苷酸，以及

c)分割剂，优选油包水乳剂。

试剂盒的部分，即酶、寡核苷酸和分割剂是如上所定义的。

本发明的试剂盒还可包括使用说明。

本发明的具体实施方案将从以下的实施例和附图中清楚地呈现。

附图说明

图1：微流控芯片设计(比例尺表示100μm)。

图2：液滴分析。a)油包水液滴夹在两个疏水载玻片之间，并用落射荧光显微镜成像。b)Atto633荧光通道。c)明视野通道，d)以10μm偏移量散焦的明视野通道。通过此设置，加强液滴轮廓并有利于液滴分割。e)明视野图像(d)被二值化，f)使用形态成分命令对所有液滴进行分割。g)液滴根据其尺寸和圆度进行过滤。h)每个液滴的荧光提取自半径为r(3<r<6像素)和中心为xy(xy对应于所选成分的形心)的圆盘。i)阳性液滴对应于荧光超过设定阈值的液滴(此处，阈值＝7)。知道液滴体积后，根据泊松定律计算回推出浓度。

图3：专门用于检测microRNA的分子程序。a)4-模板DNA环路编码分子程序的连接，所述分子程序的反应由一组酶(聚合酶、外切酶、内切酶)催化：转换模板(cT)将靶标microRNA转换为通用触发物序列；自催化模板(aT)以指数方式扩增触发物序列；为避免非特异性扩增(在没有microRNA的情况下)，伪模板(pT)促使从泄漏反应合成的触发物失活；报告模板(rT)使用触发物序列生成荧光信号。b)在存在递增浓度的Let-7a的情况下实时监测扩增反应。c)扩增时间(Cq)与Let-7a浓度之间的相关性。从三个独立的重复实验计算误差条。

图4：图3所示的用于检测microRNA的分子程序的详细化学反应网络。

图5：使用a)完整的分子程序、b)没有转换模板的分子程序或c)没有伪模板(pT)的分子程序进行Let-7a的批量检测。实时监测扩增反应，并将扩增时间(Cq)绘制为Let-7a浓度的函数。

图6：microRNA的液滴数字检测。a)将样本与分子程序混合并分割成数以百万计的单分散液滴，使得microRNA靶标随机分布在区室中。孵育后，用荧光显微镜对液滴进行成像。已接受至少一个靶标的液滴显示出阳性荧光信号(1)，而其它保持为阴性(0)。b)在扩增后掺入递增浓度的Let-7a的乳化样本的荧光快照。c)30000个液滴的分析。d)预期(conc.th.)与实验测量(conc.meas.)的靶标浓度之间的线性关系图。e)通过调节转换模板来测定其它microRNA。f)从Let7a相对于Let7c(1个错配)和Let7b(2个错配)的交叉反应性来评估发明方法的特异性。

图7：伪模板和Nb.BsmI浓度对Let7a检测的影响。含有定义浓度的pT(0至15nM)和Nb.BsmI(0.1至0.4u/μL)的样本掺入0或1pM的Let-7a，并实时监测扩增反应。a)将Cq绘制为pT和Nb.BsmI浓度的函数。将MDS绘制为b)伪模板浓度和c)Nb.BsmI浓度的函数。

图8：Nt.BstNBI浓度的优化。掺入0或1pM的Let7a的样本在不同浓度的Nt.BstNBI存在下进行孵育。将Cq绘制为Nt.BstNBI浓度的函数。

图9：减少假阳性液滴比率的分子程序。具有不同浓度的伪模板(pT)的无靶标样本分割成液滴。实时监测乳液的荧光。

图10：消除非特异性扩增反应。具有0或15nM的pT的分子程序在分割前掺入0或1pM的合成的Let-7a。液滴在50℃下孵育并连续监测批量荧光(乳液的平均值)(实线)。在不同的时间点停止孵育，通过荧光显微镜对液滴进行成像以提取阳性区室(菱形)的百分比。

图11：从生物样本中检测microRNA。a)从H1975细胞系检测Let7a。b)从人结肠总RNA中检测Let7a和mir-39ce。

图12：Klenow(exo-)对Let7a microRNA检测的影响。a)在0或10pM的Let7a和不同浓度的Klenow(exo-)存在下的实时扩增反应。b)扩增时间(Cq)作为Klenow(exo-)浓度的函数。c)实验条件。

图13：使用Klenow(exo-)和Vent(exo-)的混合物对Let7a进行数字检测。a)测量的浓度作为掺入的预期浓度的函数。b)实验条件。混合物A(包含酶)和混合物B(包含模板)使用3个入口的流动聚焦(flow focusing)装置在芯片上混合。液滴在50℃下孵育200分钟。

图14：检测血浆样本中的cel-miR39。从健康的捐赠者收集人血液样本，通过离心获得血浆。将0pM或1pM的cel-miR39掺入到补充有5％的血浆(v/v)和RNAse抑制剂的扩增混合物中。图中报告的测量浓度表明外源性microRNA在5％的血浆中完全回收。

图15：转换模块设计和酶活性的批量检测(针对至少三个独立数据点计算的标准偏差)。a)Nt.BstNBI、b)RNAseH2。c)APE内切酶1(APE-1)。d)尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)。e)烷基腺嘌呤糖基化酶(AAG)。f)BsmAI限制酶。g)Poly(A)聚合酶(PAP)。h)T4 DNA连接酶。i)T4多核苷酸激酶(T4 PNK)。

图16：酶的数字检测。a)6种不同浓度的Nt.BstNBI酶的2D液滴阵列的显微镜快照。b)测量的浓度(fM)作为不同酶的掺入浓度(u/mL)的函数。线性关系显示数字读数所提供的绝对定量。误差条对应于测量的95％置信区间。

图17：对小(0.95pL)和大(7.2pL)液滴的Nt.BstNBI数字测定定量进行比较。两个实验中计算出的浓度是一致的。误差条对应于测量的95％置信区间。

图18：由两个交叉抑制性双稳态开关构建的四稳态***。(a)四稳态DNA环路的示意图。两个microRNA传感环路(cT、aT、pT和rT)通过杀手模板αkβ和βkα相互连接，抑制不想要的交叉活化。(b)五种模板(pol.＝Vent(exo-)、nick1＝Nt.BstNBI、nick2＝Nb.BsmI、RE＝BsmI、exo＝ttRecJ)的详细机制。转换模板(cT)将互补microRNA靶标转换为信号链(α或β)。自催化模板(aT)以指数方式扩增信号链。伪模板通过使一部分信号链失活来抑制由生化噪声引起的背景扩增。报告模板(rT)将分子信号(α或β)转导为可检测的荧光信号(绿色＝俄勒冈绿色荧光团，红色＝Atto633荧光团)。从α或β链，杀手模板(kT)产生相反开关的pT，减轻非特异性串扰。所有产生的链都被外切酶持续降解以保持***动力。这里只表示四稳态环路的一半，另一半是通过用β取代α获得的，与之前的相反。

图19：杀手模板效率。(a)如果是mir39的话，则由10pM触发的α开关连接到杀手模板αkβ，产生不同长度的pTβ(具有0到5个腺苷酸部分的失活尾)。(b)β开关的荧光(t＝1000分钟)作为kT浓度的函数。

图20：来自图19的扩展数据，(a)不同浓度αkβ产生不同长度的pTβ的扩增曲线。(b)Cq绘制为αkβ浓度的函数。

图21：抑制α和β开关之间交叉活化的kT浓度的确定。(a)在递增浓度的αkβ和βkα存在的情况下，用0或10pM的mir92a和let7a分别触发Α和β环路。(b)α和β开关的扩增时间(Cq)。(c)作为kT浓度函数的Cq的颜色编码表示。蓝色虚线框表示***达到四稳态时的kT浓度。(d)mir39/mir7双重测定的扩增曲线(每个靶标0或10pM)。(e)对于7种不同双重测定的测量的Cq。左边的插图表示7种测定的平均Cq和标准偏差。

图22：数字双重测定的原理。(a)使用微流控芯片从4个样本(0pM mir39/0pMlet7a、3pM mir39/0pM let7a、0pM mir39/3pM let7a、3pM mir39/3pM let7a)中产生液滴，以及通过显微镜分析乳液。(b)探针荧光的2D直方图(α开关＝绿色荧光-mir39、β开关＝红色荧光-let7a)。垂直和水平虚线分别表示α和β开关的阳性阈值(c)测量的与预期的靶标浓度的直方图。(d)不同组合物(microRNA靶标和浓度)的各种样本的数字双重测定。

图23：溶液中的单重与双重测定。(a)分别与扩增混合物和0或3pM的let7a和mir39靶标(单重测定)一起孵育α(顶部)和β(底部)的双稳态环路的扩增曲线。(b)α和β开关嵌入完整的四稳态环路(双重测定)的扩增曲线。(c)针对重复实验测量的扩增时间。从这些数据可以得出结论，杀手模板对这些条件下的扩增时间影响不大。

图24：空白单重测定与双重测定的限制。4个样本组装如下：样本A＝仅α环路、0pM靶标，样本B＝仅β环路、0pM靶标，样本C＝α和β环路、0pM靶标，样本D＝α和β环路、1pM靶标mir39和let7e。(a)在溶液中4种样本的扩增曲线。(b)微流控小室一部分的合成图像(明视野、绿色和红色荧光)。(c)液滴荧光的2D直方图(α开关＝绿色荧光，β开关＝红色荧光)。(d)阳性液滴的百分比。无论测定是以单重还是双重进行，假阳性液滴的百分比在定性上是相似的(在单重中假阳性α＝1.1％和在双重中为1.1％，在单重中假阳性α＝0.25％以及在双重中为0.28％)。

具体实施方式

实施例

以下实施例旨在证明，本发明通过将等温核酸扩增的模拟方法数字化以允许高灵敏性的分子检测。

实施例1：用本发明的数字方法检测microRNA

方法和材料

化学品：寡核苷酸(模板和合成的microRNA)购自Biomers(德国)。序列通过HPLC纯化，并通过基质辅助的激光解吸/电离质谱法检查。模板根据Montagne等人所述的规则设计(Montagne等人，2011和Montagne等人，2016)。自催化模板(aT)、伪模板(pT)和报告模板(rT)通过5'硫代磷酸酯骨架修饰保护免受外切酶的降解。3'阻断部分(aT、pT、cT的磷酸基团和rT的淬灭剂)用来避免非特异性聚合。下表2概括本发明中使用的所有序列。

表2.本发明中使用的寡核苷酸序列。“*”表示硫代磷酸酯骨架修饰。“p”表示3'-磷酸酯修饰。大写和小写分别表示2'-脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。触发物seq或触发物序列与自催化模板扩增的序列有关。序列SEQ ID NO：61至66在

表1中也被引用为序列54至59。

Nb.BsmI和Nt.BstNBI切口酶、Vent(exo-)DNA聚合酶和BSA购自New EnglandBiolabs(NEB)。通过将储备酶溶解在补充有0.1％Triton X-100的Diluent A(NEB)中，制备Nt.BstNBI的10倍稀释液。根据Yamagata公布的操作方案(Yamagata等人，2001)，外切酶ttRecJ自制表达并通过色谱纯化。酶以1.53μM储存在Diluent A+0.1％Triton X-100。所有的蛋白质都储存在-20℃。

细胞培养。利用人非小细胞肺癌细胞系H1975和结直肠癌细胞系HCT116的细胞进行miRNA提取。HCT116细胞在补充有10％FCS、100单位/mL的青霉素G和100μg/mL链霉素的DMEM/F12培养基中培养。H1975细胞在补充有10％(v/v)FBS、100单位/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI 1640培养基中培养。细胞在5％的CO₂培养箱中生长，温度为37℃。

microRNA提取：人结肠总RNA(Thermofisher Scientific)以13μg/mL等分，并在使用前储存在-20℃。对于细胞提取，使用

miRNA ABC纯化试剂盒(AppliedBiosystems)按照试剂盒的说明书从大约1×10⁶个细胞中提取microRNA。简单地说，将细胞重新悬浮在50μL的1×PBS中，并与150μL的裂解缓冲液混合。在细胞裂解步骤后，将2μL的1nM外部对照cel-miR-39-3p寡核苷酸(Biomers)掺入到准备好的样本中并进行涡旋，以评估提取效率。使用磁性Human Panel珠捕获靶标microRNA并在100μL的洗脱缓冲液中洗脱。

反应混合物组装：所有反应混合物在4℃下组装在200μL的PCR管中：模板与反应缓冲液(20mM Tris HCl pH 7.9、10mM(NH₄)₂SO₄、40mM KCl、10mM MgSO₄、50μM的每种dNTP、0.1％(w/v)泊洛沙姆F 104、2μM纺锤菌素，所有都购自Sigma Aldrich)和BSA(200μg/mL)混合。匀质化后，加入酶(300u/mL的Nb.BsmI、10u/mL的Nt.BstNBI、80u/mL的Vent(exo-)、23nM的ttRecJ)。每个样本都掺入microRNA靶标，使用低结合的DNA的枪头(Eppendorf)在1×Tris-EDTA缓冲液(Sigma Aldrich)中连续稀释。将样本(批量或乳液)在50℃的qPCR热循环仪(CFX96 Touch，Biorad)中孵育，并实时记录荧光。对于批量实验，将时间痕迹归一化以及将Cq(扩增起始时间)确定为最大荧光信号的10％。

液滴产生：使用标准的软光刻技术，用在4英寸硅片上布局的SU-8光刻胶(MicroChem公司，MA，USA)，制备2个入口(一个用于油，一个用于水性样本)的流动聚焦微流控模具。将Sylgard 184PDMS树脂(40克)/交联剂(4克)(Dow Corning，MI，USA)的10：1混合物倒在模具上，在真空下脱气并在70℃下烘烤2小时。固化后，将PDMS从硅片上剥离，并用活检冲头(Integra Miltex，PA，USA)冲出直径为1.5mm的入口和出口的孔。在氧等离子体处理后立即将PDMS层粘合在1mm厚的载玻片(Paul Marienfeld GmbH&Co.K.G.，德国)上。最后，芯片在200℃下进行第二次烘烤5小时使通道具有疏水性(Kaneda等人，2012)。微流控芯片细节见图1。使用压力泵控制器MFCS-EZ(Fluigent，法国)和直径200μm的PTFE管(C.I.L.，法国)在芯片上混合水性样本相和由含有1％(w/w)氟表面活性剂(RAN Biotechnologies，MA，USA)的氟化油(Novec-7500，3M)组成的连续相，通过流体动力流动聚焦产生0.5pL液滴。

液滴成像:孵育后，通过荧光显微镜对液滴进行成像。用200μL Cytop CTL-809M(Asahi Glass)旋转包被底部载片(76×52×1mm载玻片)，并在180℃下干燥2小时。将乳液夹在用Aquapel处理过的0.17mm厚的盖玻片上。10μm的聚苯乙烯颗粒(Polysciences公司，PA，USA)作为间隔物以支撑顶部的载片以避免乳液受到压缩。最后，用环氧树脂胶(Sader)密封成像小室，并使用落射荧光(epifluorescen)显微镜Nikon Eclipse Ti获得成像，所述显微镜配备电动XY载物台(Nikon)、Nikon DS-Qi2相机、10×的复消色差(N.A.0.45)(Nikon)和CoolLed pE-4000照明光源。用开源的ImageJ软件生成复合图像。按照图2中详述的程序，使用Mathematica软件(Wolfram)从显微图像中提取定量数据。

结果

根据国际申请WO2017140815的模拟扩增方法

本发明的发明人之前开发了多功能的分子编程语言，名为PEN-DNA工具箱(聚合酶外切酶切口酶-动态网络组装(Polymerase Exonuclease Nickase-Dynamic NetworkAssembly))(Montagne等人，2011和Baccouche等人，2014)。网络的拓扑结构是由一组短的寡核苷酸(模板)限定的。所述网络是由酶(聚合酶、外切酶和切口酶)的混合物解释(interprete)，所述酶的混合物通过产生和降解DNA链来加工信息流，进而活化或抑制所述网络的其它节点。

利用这组反应模块，发明人之前设计专门用于检测microRNA的通用分子程序。图3显示环路的连接：通用信号扩增部分对应由两个模板组成的双稳态节点：自催化模板(aT)，其由催化12聚体寡核苷酸的指数复制的双重复序列组成；伪模板(pT)，其吸收自催化模板上的非特异性反应产生的泄漏产物从而避免背景扩增。转换模板(cT)连接到aT上游：在靶标与cT的输入部分结合后，cT的输入部分催化输出链的产生，从而触发aT上的自催化反应。在aT的下游，报告模板(rT)捕获扩增的信号链以产生荧光信号。详细的反应网络显示在图4中。

图5b至图5c显示这种方法对Let-7a的批量检测的灵敏性评估。4种模板与酶促加工物混合在一起，并掺入浓度为0至1nM的合成靶标Let-7a。用设置在50℃恒温的PCR热循环仪实时监测rT的荧光。阴性对照(无靶标)超过20小时也不产生阳性信号。该测定的灵敏性约为1fM，批量的动态范围从1fM到100pM，即6个数量级。在没有pT的情况下(图5b)，对灵敏性产生负面影响，其中检测极限为1pM(根据阴性对照的平均扩增时间的3个标准偏差进行估计)。这些结果证明这种主动泄漏-吸收机制对控制扩增阈值以及从而消除背景扩增的重要性。在没有cT的情况下(图5c)，观察不到扩增反应，证明分子程序对靶标microRNA的特异性。

模拟扩增方法的数字化

为将模拟信号转换为数字化读数，发明人继续评估了检测在液滴中区室化的单个分子的可能性。使用流动聚焦微流控接头，将掺入已知浓度的Let-7a的分子程序分割在皮升尺寸的油包水液滴中。单分散乳液在50℃下孵育，并在含有靶标的液滴扩增后停止反应。最后，用荧光显微镜对液滴进行成像，并根据泊松定律重新计算浓度。

图6显示孵育200分钟后的乳液的显微镜快照。可以观察到掺入的miRNA浓度和根据泊松定律测量的浓度之间的线性关系。计算出的检测极限是2.1fM。

仅仅通过重新设计转换模板(图6d)使其与任何目的靶标，能够使目前***的模块方法改变目的分子程序，而不影响定量，该定量取决于通用信号扩增机制。

与microRNA定量有关的主要问题是microRNA靶标之间的高度序列同源性。因此，发明人评估了目前的检测方法在Let-7家族中的特异性。图4e显示在Let-7a序列和包含单(Let-7c)或双(Let-7b)错配碱基的类似物之间的非常良好的区分。

伪模板(pT)和核酸酶浓度的影响

发明人还测定伪模板(pT)和核酸酶浓度(Nb.Bsml)的影响。

为此，含有限定浓度的pT(从0至15nM)和Nb.BsmI(从0.1至0.4u/μL)的样本掺入0或1pM的Let-7a，并实时监测扩增反应。Cq绘制为pT和Nb.BsmI浓度的函数(图7a)。根据下式计算每组浓度的microRNA检测评分(MDS)。

MDS用于反映NC和1pM的扩增时间之间的时间窗口和靶标触发反应的速度。MDS绘制成伪模板浓度(图7b)和Nb.BsmI浓度(图7c)的函数。

图7显示，这两个参数都延迟了扩增反应：伪模板起到主动下降(active sink)的作用，降解所产生的部分触发物。已知Nb.BsmI被其自身的产物(切口的、未熔融的双链)所抑制，这可能是通过在切割双链之后阻止触发物的释放而减缓反应。需要注意的是，增加伪模板的浓度通过优先延迟阴性对照(NC)扩增对检测评分产生积极影响，并且对靶标触发的扩增产生较小的影响。另一方面，无论靶标浓度如何，Nb.BsmI影响扩增时间，因此对检测评分有负面影响。该观察结果表明，即使在将扩增方法进行数字化的情况下，伪模板提供的主动降解机制对减少/消除背景扩增的重要性。

发明人还调查了核酸酶Nt.BstNBI的最佳浓度。为此，在不同浓度的Nt.BstNBI的存在下，将掺入0或1pM的Let7a的样本进行孵育。将Cq绘制为Nt.BstNBI浓度的函数。图8显示，内切酶Nt.BstNBI的最佳浓度为0.01u/μL左右。

比较性实施例

大多数等温核酸扩增技术不能转换到数字格式。这一般归因于非特异性反应，无论靶标是否存在最终都引发所有区室的扩增，正如Zhang等人所述(Zang等人，2015)。依靠端点分析，有一个足够大的时间窗口来区分含靶标的液滴(表现出阳性信号)和不含靶标的液滴是至关重要的。图9显示，在没有pT和靶标的情况下，所有的液滴在不到一个小时的时间内就会启动。该结果大大影响分离两个群体所需的时间窗口，并与Zhang等人之前描述的EXPAR***一致(Zhang等人，2015)。

通过增加pT浓度从而提高扩增阈值，将自启动延迟，直到在15nM的pT时自启动完全取消。图10比较了使用0或15nM的pT检测1pM的Let-7a的时间窗口。在没有pT的情况下，几乎不可能区分含有靶标的样本和阴性对照。然而，吸收导致假阳性液滴的泄漏保证了稳定在关闭状态(off-state)超过16小时，而不妨碍含靶标液滴的扩增。由于完全的背景消除，本发明的方法在孵育时间方面显示出无与伦比的稳健性，并在理论上显示出无限的时间窗口。

此外，与之前实施的其它数字扩增方法(Zhang等人，2015，Cohen等人，2016和Tian等人，2016)相比，本发明方法的选择性估计优于97％。

用本发明的方法检测人细胞的内源性microRNA

基于microRNA的诊断作为常规生物医学方法的成功，取决于microRNA定量的稳健性和可重复性。因此，发明人评估了检测来自于人细胞中内源性microRNA的可能性。

从细胞系H1975(腺癌)中提取microRNA，并使用不同浓度的RNA提取物，用本发明的方法对Let-7a进行定量。从含有1％和10％的RNA提取物的样本中测量的Let-7a浓度分别为90fM和1pM(图11a)。

此外，发明人还从人结肠总RNA中定量Let-7a：图11b显示总RNA浓度(从0至4μg/mL)与所测量的Let-7a浓度之间的线性关系。作为阴性对照实验，在这些样本中没有检测到人基因组中没有的mir-39ce。总之，这证明了本发明方法的准确性和其在高复杂背景样本中的稳健性。

实施例2：使用Klenow(3’→5’exo-)DNA聚合酶加速microRNA触发的扩增

为了加速microRNA靶向的扩增，发明人研究了添加另一DNA聚合酶Klenow(exo-)的效果。扩增混合物(含有Vent(exo-)聚合酶)，掺入0或10pM的Let7a microRNA靶标，并补充有不同浓度的Klenow(exo-)。图12显示，在不存在Klenow(exo-)聚合酶的情况下，特异性扩增在约100分钟内发生，而阴性对照在1000分钟内未扩增。有趣地，使用16u/mL的Klenow(exo-)将特异性扩增降低到20分钟，而阴性对照不受影响。在这个浓度以上，发明人观察到阴性对照样本在不到40分钟的时间内出现不想要的自我扩增。总之，这些结果表明，除了Vent(exo-)之外，添加最佳浓度的Klenow(exo-)有利于加速扩增反应，因为Klenow(exo-)有效地起始RNA引物的延伸。

然后，发明人研究了使用DNA聚合酶的混合物进行microRNA的液滴数字检测。由于Klenow(exo-)在室温下具有不可忽视的活性，分别组装寡核苷酸(模板)和酶(混合A和混合B)，并在使用3入口微流控装置(一个用于连续相的入口和2个用于扩增混合物A和B两部分的入口)进行液滴分割之前，在芯片上混合。这防止在靶标封装(encapsulation)之前开始反应。测量的浓度与每个样本的掺入浓度一致，证明用这种聚合酶混合物对靶标microRNA的准确的数字定量(图13)。

实施例3：直接从血浆样本中检测microRNA

发明人还评估使用本发明的数字检测方法检测血浆样本中的microRNA。

从健康的供体(HIV、HBV和HCV阴性)处收集人血液样本，放入10mL采血管(由Biopredic International提供的Streck管)。在4℃下以2000×g离心10分钟，然后在4℃下以2000×g离心15分钟获得血浆。用巴斯德吸管将血浆等分到干净的聚丙烯管中，并储存在-80℃直到使用。0或1pM的cel-miR39(来自秀丽隐杆线虫(C.Elegans))的microRNA序列)掺入到补充有5％血浆(v/v)和1u/μL的RNAse抑制剂(小鼠)的扩增混合物中。图中报告的测量浓度表明外源性microRNA在5％的血浆中完全回收。因此，图14上显示的结果证明粗制血浆样本中microRNA浓度的定量测量。

实施例4：用本发明的数字方法检测酶

寡核苷酸从Biomers或Eurofins获得(表3)。切口酶nt.BstNBI(R0607)、Nb.BsmI(R0706)、DNA聚合酶Vent(exo-)(M0257)、Klenow(exo-)聚合酶、限制酶BsmAI(R0529)、AP-内切酶APE-1(M0282)、尿嘧啶DNA糖基化酶UDG(M0280)、烷基腺嘌呤糖基化酶hAAG(M0313)、poly(A)聚合酶(M0276)、T4 DNA连接酶(M0202)、T4多核苷酸激酶PNK(M0201)购自NewEngland Biolabs。RNAse H2酶(11-03-02-02)购自Integrated DNA Technologies。外切酶ttRecJ是根据以前报道的方法自制纯化的(8)。所有寡核苷酸和蛋白质都储存在-20℃。

表3.本研究中使用的序列。“*”表示硫代磷酸酯骨架修饰。“p”表示磷酸酯修饰。大写和小写分别表示2'-脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。“F”表示脱碱基位点类似物，四氢呋喃基团。“I”表示脱氧肌苷。BHQ2表示黑洞淬灭剂(Black Hole Quencher)2，用作Cy5荧光团的淬灭剂。

反应组装：所有反应在4℃下组装在200μL的PCR管中。将模板和酶(表4)与反应缓冲液(20mM Tris HCl pH 7.9、10mM(NH₄)₂SO₄、40mM KCl、10mM MgSO₄、50μM的每种dNTP、0.1％(w/v)泊洛沙姆F 104、2μM纺锤菌素，所有购自Sigma Aldrich)和BSA(200μg/mL)混合。样本中掺入10％v/v的不同浓度的靶标酶，所述靶标酶在200μL PCR管中用补充有BSA(200μg/mL)的1×反应缓冲液连续稀释。在可选的预孵育步骤之后，样本在CFX96触摸式热循环仪中于48℃孵育。详细的实验条件见表4。

表4.检测不同评估酶的实验条件。

数字测定：在数字测定的情况下，酶(混合A)和模板(混合B)在反应缓冲液1×中分别混合在两个分开的试管中，以防止单个酶封装在油包水液滴中之前开始反应。为提高测定输出，发明人采用之前报道过的连续乳化策略(Menezes等人,2019)：含有不同浓度靶标酶的混合物A用三种荧光标记的右旋糖酐(右旋糖酐Texas Red 70,000MW、右旋糖酐AlexaFluor 488 3,000MW以及右旋糖酐Cascade Blue 10,000MW赖氨酸可固定(Lysinefixable)(ThermoFisher Scientific))的不同组合进行条码化。使用3个入口的流动聚焦的微流控PDMS芯片，混合物A(装入加压的样本交换器)和混合物B在芯片上混合并连续乳化。连续相由含1％(w/w)氟表面活性剂(RAN Biotechnologies，MA，USA)的氟化油(Novec-7500，3M)组成。微流控模具是用标准的软光刻技术制备的，使用在4英寸硅片上布局的并使用MJB4光刻机(SUSS Microtec)手动对准的SU-8光刻胶(MicroChem公司，MA，USA)。将Sylgard 184PDMS树脂(40克)/交联剂(4克)(Dow Corning，MI，USA)的10：1混合物倒在模具上，在真空下脱气并在70℃下烘烤2小时。固化后，将PDMS从硅片上剥离，并用活检冲头(Integra Miltex，PA，USA)冲出直径为1.5mm的入口和出口的孔。在氧等离子体处理后立即将PDMS层粘合在1mm厚的载玻片(Paul Marienfeld GmbH&Co.K.G.，德国)上。最后，芯片在200℃下进行二次烘烤5小时使通道具有疏水性。

液滴成像和分析：通过透射和落射荧光显微镜对液滴进行分析。通过倒入3mLNovec 1720(3M)并在加热板上在100℃下烘烤1分钟使70×50×1mm载玻片(PaulMarienfeld，GmbH&Co.K.G.，德国)具有疏水性。用作硬的球型间隔物的10μm聚苯乙烯珠((Polysciences,Inc.，PA，USA)点在载玻片上，并在100℃下蒸发。将乳液沉积在载玻片上并用Novec 1720处理过的22×22mm盖玻片(VWR)覆盖。用环氧树脂胶(Sader)密封小室，并使用落射荧光显微镜Nikon Eclipse Ti获得成像，所述显微镜配备电动XY载物台(Nikon)、Nikon DS-Qi2相机和CoolLed pE-4000照明光源以及20×的复消色差(N.A.0.75，WD 1.0)物镜。用开源的ImageJ软件生成伪彩色图像。

使用Mathematica软件(Wolfram)分析图像，使用荧光条码对不同的样本群进行分类。每个样本的阴性和阳性液滴的数量允许根据泊松统计学计算出靶标酶浓度。

结果

用切口酶Nt.BstNBI进行原理证明

这里使用的等温信号扩增***基于三种编码的脱氧核糖寡核苷酸：第一种是自催化模板(seq.Cbo12-2PS3 SEQ ID NO:73)，其为使用DNA聚合酶(Vent(exo-))和切口酶(Nb.BsmI)催化触发链的指数复制的双重复序列；第二种为伪模板模块(seq.pTBoT5PS3SEQ ID NO:74)，其使一部分触发链失活并充当催化引流(catalytic drain)以避免由泄漏反应引起的非特异性的、靶标非依赖性的扩增；第三种为报告模块(seq:rTBo-2BsmICy5SEQ ID NO:75)，其为促荧光(profluorescent)发夹形的探针，在聚合反应时与触发物杂交产生荧光信号。总之，这些酶和核酸成分创造可用于各种超灵敏的生物传感应用的双稳态分子环路。

作为原理证明，发明人设计第一传感模块(seq:nbitoBo-2+2 SEQ ID NO:76)将切口酶Nt.BstNBI的活性与双稳态扩增开关相连接(图15a)。发夹形模板包括与触发链互补的、在切口识别和切割位点上游的5'输出位点。3'端是自身互补的，通过聚合酶沿模板引发延伸。在其双链形式下，双链可以被Nt.BstNBI切开切口，释放出触发物。聚合/切开切口的催化循环导致线性的触发链产生，在超过伪模板设定的浓度阈值后起始扩增。发明人在Nt.BstNBI浓度增加的情况下实时监测反应。正如预期的那样，浓度越高，触发物产生越快，因此扩增也越迅速。这种方法的灵敏性批量(in bulk)约为5mu/ml(毫单位每毫升)，比使用传统的原荧光探针的切割测定低3个数量级。

对超过9种酶证明通用性

基于这些结果，发明人设计多种传感策略用于超灵敏地检测其它DNA相关酶。设计级联反应，其将目的的酶活性与特定触发链的生成联系起来。对核酸酶的检测是基于在Nt.BstNBI的组成性存在下阻断触发物产生。RNAseH(RNAseH2)和AP-内切酶(APE-1)通过在传感模板的茎结构中分别引入核糖核苷酸和脱碱基位点(AP)来检测(图15a和图15b，seq：nbitoBo-2+2(rG)SEQ ID NO:77和nbitoBo-2+2AP SEQ ID NO:78)。在这些设计中，具有突出的3’聚胸苷酸(polythimidylate)延伸的未加工底物的聚合被阻断。相应的酶对这些底物的加工诱导茎的内切核苷酸的切割，通过聚合/切开切口循环恢复触发物的产生。尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)通过用脱氧核糖尿苷部分(seq:nbitoBo-2+2UDG(2)SEQ ID NO:79)取代AP位点来检测，在酶的级联中又增加一个步骤(图15c)。糖基化酶对尿嘧啶碱基的切除引入脱碱基位点，通过APE-1进一步切开脱碱基位点，最终重新活化触发物的产生。

发明人测试用于检测另一种单功能DNA N-糖基化酶、烷基腺嘌呤糖基化酶(AAG，图15d)的不同策略。肌苷残基(次黄嘌呤核碱基，Hx)并入短的双链寡核苷酸(seq:Aagtorna-上/Aagtorna-下，SEQ ID NO:80/SEQ ID NO:81)。在通过AAG切除后，AP-位点被APE-1切开。切口链的5'部分可以解离并与第二NBI依赖性模板的输入部分结合，其输出是触发链(seq:dnatoBo-2+2P SEQ ID NO:82)。

限制酶的检测是通过在传感模板的5'部分附加识别位点来实现(图15e)。在没有靶标酶的情况下，聚合/切开切口的无用循环产生具有3'延伸(包括限制性位点)的非生产性触发物。在靶标酶存在的情况下，双链限制性位点被切割，从传感模板上释放出延伸部分，这又产生了触发物。

也可以使用这种方法检测具有特定活性的聚合酶，例如聚(A)聚合酶(PAP)，其催化将聚腺嘌呤尾添加到RNA链的3'端(图15f)。在RNA链的多腺苷酸化之后(seq:rna SEQ IDNO:84)，聚(A)尾结合到传感模板的聚(T)输入位点(seq：polyAtoBo-2+2P SEQ ID NO:85)，进而输出触发物。

发明人还将该策略用于检测DNA连接酶(图15d)。传感模块由三种模板组成：用5'磷酸部分修饰的发夹形模板(seq:lig2P SEQ ID NO:87)；线性模板，其5'侧与活化子序列(seq:lig1toBo SEQ ID NO:86)互补；与两条其它链部分杂交的夹层(splint)链(seq:lig3P SEQ ID NO:88)。由此产生的三联体包括切口，所述切口可被ATP供能的T4 DNA连接酶封闭。因此，夹层链被DNA聚合酶取代，恢复活化子链的功能来源。多核苷酸激酶(T4 PNK)可能使用非磷酸化版本的发夹形模板(seq:lig2noP SEQ ID NO:89)进行检测。在其连接所需的磷酸化后，T4DNA连接酶可以封闭切口拯救活化子链的产生。

发明人在批量溶液中使用同源设计分别对每种酶进行检测。图15显示从实时记录的荧光时间轨迹中提取的扩增时间(Cq)。对于每种酶，发明人观察到在Cq和靶标酶的浓度(低至μU至mU/mL的浓度范围)之间的倒置关系。这表明使用多功能的DNA扩增机制对酶的活性进行特异性和灵敏性检测。

单个酶的数字化计数

为进一步证明这种方法的灵敏性，发明人对在微流控液滴中分离的单个酶进行数字计数。与批量测定一样，通过Nt.BstNBI检测环路实现原理证明。制备了两个系列的掺入不同浓度的NBI的样本，并使用流动聚焦微流控芯片将其分别乳化成皮升尺寸的液滴(～0.95pL)。液滴在48℃下孵育3小时，并通过荧光显微镜进行分析(图16a)。图16b(上部，左侧)显示掺入的NBI浓度与根据泊松定律计算的测量浓度之间的线性相关性(R2>0.99)。图16b显示其它酶，包括RNAseH2、APE-1、UDG、BsmAI、PAP、T4 DNA连接酶和T4 PNK的数字液滴测定结果。同样，掺入的浓度和测量浓度之间的比例证明这种方法对这些酶进行数字计数的成功。

Nt.BstNBI的数字检测使用较大的液滴(7.2pL)进行(图17)。与较小的液滴相比，计算出的浓度非常相似。靶标的掺入浓度和测量浓度之间的比例以及对不同液滴尺寸获得的一致结果，都明确地证明活性酶的直接绝对定量。

实施例5：microRNA的多重检测

材料：HPLC纯化的寡核苷酸购自Biomers或Eurofins，以100μM重悬于1×Tris-EDTA pH 7.5中长期保存。模板根据上述实施例1的方案设计。通过添加三个5'硫代磷酸酯骨架修饰，模板序列aT、pT、rT和kT受到保护免受ttRecJ的5'->3'外切酶活性的影响。通过添加3'磷酸酯部分阻断模板aT、pT、cT和kT不想要的聚合。aT被设计成只与相应的输入(α或β)的最后10个碱基杂交，以便有利于pT对泄漏反应产生的信号链进行失活。kT表现出相同的短缩的输入结合位点，以降低信号链的竞争性结合。这防止了在靶标触发的扩增之前kT的非特异性活化。表5概括该测定中使用的所有序列(SEQ ID NO:104、106、108和109也分别引用为SEQ ID NO:54、55、56和57)。

表5：多重测定中使用的序列

切口酶Nb.BsmI和Nt.bstNBI、限制酶BsmI、DNA聚合酶Vent(exo-)、BSA和dNTP获自New England Biolabs(NEB)。嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)RecJ外切酶是按照之前公布的方案(Yamagata等人Nucleic Acids Res.2001，29(22)，4617–4624)内部生产。氯化钠、氯化钾、硫酸镁、硫酸铵、Trizma盐酸盐、纺锤菌素、泊洛沙姆(Synperonic)F104购自Merck(Sigma-Aldrich)。

反应混合物组装：所有反应混合物在4℃下组装在200μL的PCR管中。模板和酶首先与反应缓冲液(20mM Tris-HCl、pH 8.9、10mM(NH4)2SO4、40mM KCl、10mM MgSO4、50μM每种dNTP、0.1％(w/v)泊洛沙姆F104、2μM纺锤菌素和200mg/mL BSA)混合。优化的模板浓度如下：aTα＝50nM、aTβ、50nM、pTα＝15nM、pTβ＝11nM、rTα＝40nM、rTβ＝40nM、cT(每种)＝0.5nM、αkβ＝1nM和βkα＝2.5nM。酶浓度为Nb.BsmI＝300u/mL、Nt.BstNBI＝10u/mL、Vent(exo-)＝60u/mL、BsmI＝60u/mL、ttRecJ＝23nM。均质化后，样本掺入microRNA溶液，使用低结合的DNA枪头(Eppendorf)在1×Tris-EDTA缓冲液中连续稀释。样本(批量或乳液)在qPCR机器CFX96 touch(Bio-Rad)中在50℃下孵育。

生成微流控液滴：使用标准软光刻技术制备2入口的流动聚焦装置。简而言之，微流控模具是通过在4英寸硅片上包被SU-8光刻胶(Micro-Chem Corp.)在UV暴露下网状化而获得的。用异丙醇仔细清洁模具后，将Sylgard 184PDMS树脂(40克)/固化剂(4克)(DowCorning)的10：1混合物倒在模具上，在真空下脱气并在70℃下烘烤2小时。将PDMS板从模具上剥离，并用活检冲头(Integra Miltex)冲出直径为1.5mm的入口和出口。在氧等离子体活化后立即将PDMS板结合在1mm厚的载玻片(Paul Marienfeld GmbH&Co)上。芯片在200℃下烘烤5小时以使通道具有疏水性。通过使用压力泵控制器MFCS-EZ(Fluigent)和200μm内径的PTFE管(C.I.L.)在芯片上混合水性样本和连续相(氟化油Novec 7500，3M+1％(w/w)fluosurf，Emulseo)，产生单分散的油包水液滴。

液滴成像和分析：孵育后，通过显微镜对乳液进行成像。将单层液滴夹在间隔有10μm聚苯乙烯颗粒(Polysciences,Inc.)的两个载玻片之间(1mm厚的底部玻片，PaulMarienfeld GmbH&Co，0.17mm厚的顶部玻片，VWR)以避免液滴压缩。小室用环氧树脂胶(Sader)密封。图像获自落射荧光显微镜Eclipse Ti，其配备电动XY载物台(Nikon)、NikonDS-Qi2相机、10×的复消色差物镜(N.A.0.45，Nikon)和CoolLed pE-400照明光源。用开源的ImageJ软件生成复合图像。使用Mathematica软件(Wolfram)按照上述实施例中描述的报告方法分析液滴。microRNA的浓度是用公式计算：

和

其中F_g和F_r分别是绿色和红色阳性液滴分数，NA是阿伏伽德罗(Avogadro)数以及V是液滴的体积。

结果

杀手模板计数开关交叉活化

发明人将两个平行的双稳态开关转换为四稳态生化环路。理由是，四种可选择的状态中的每一种之后都可以归因于与每种靶标的存在/不存在相关的四种可能的化学“状态”(0：0、0：1、1：0和1：1)，从而允许在每种情况下进行适当分类。为此目的，发明人设计双向连接两个开关的交叉抑制性模板(杀手模板，kT)(图18)。在被其同源的输入(α或β)活化后，kT为相反的开关产生伪模板从而起到扩增的交叉抑制物的作用。为使***容许四种状态，抑制物需要足够强以稳定状态1：0和0：1(其中两个开关中只有一个是打开的(ON))，但抑制物又不能太强以允许状态1：1的存在(两个开关都是打开的)。因此，发明人评估内源性pT的长度(由失活的5'尾的长度确定)对杀手模板强度的影响。图19显示在存在用5nM的cel-mir-39触发的α开关和产生各种pTβ的递增αkβ浓度时，简单的β开关的扩增反应。该***的设置方式是，在没有αkβ的情况下，β开关在大约100分钟内自发打开(图20)。

当增加kT的浓度时，发明人如预期地观察到在扩增之前有增长的延迟。此外，很明显产生较短pT的αkβ是较强的抑制剂：需要少于100pM的kTαkβA1(意味着产生的pTβ将在α链的3'端只增加一个胸苷核苷酸)以完全阻止α开关的扩增，而需要100倍以上的αkβA4才能观察到同样的效果(图18c)。有趣的是，对于αkβA5而言，在测试浓度范围内没有观察到抑制作用。同样，αkβA0(从α产生一条互补链，没有催化延伸活性)对β开关的扩增没有影响，证实伪模板的催化机制。

在这些测量之后，发明人选择的kT产生具有4个核苷酸延伸的pT，对于所述pt的抑制强度可以很容易地通过调节浓度进行调整。

接下来，发明人评估了kT抑制α和β开关之间交叉反应的潜力，同时保留了对其同源靶标的灵敏性。在不同浓度的αkβ和βkα两者的存在下，两种microRNA传感环路掺入0或10pM的mir92a(α开关)和let7a(β开关)(图21)。图21b和图21c显示两个开关的扩增时间。在这些实验条件下，2.5-10nM的βkα和0.63-1.3nM的αkβ实现了四稳定性：在kT的这种浓度范围内，没有靶标导致没有扩增(Cq>1000分钟，状态0：0)；当仅存在一种microRNA靶标时，只有相应的开关扩增荧光信号(Cq～200分钟，状态1：0和0：1)；最后，当注射两种microRNA时，两种开关打开(状态1：1)。

发明人测试了该策略在检测其它microRNA方面的一般性。这种可编程DNA环路的模块设计只需调适转换模板的输入域，原则上允许检测具有已知3'-羟基末端的任何核酸链(RNA或DNA)。双重环路的其余部分(即aT、pT、rT和kT)序列和浓度保持不变。在这些实验中，发明人使用五种microRNA：has-mir-92a-5p、cel-mir-39、hsa-mir-7-5p、hsa-let-7a-5p和hsa-let-7e-5p(分别缩写为mir92a、mir39、mir7、let7a和le7e)。图21e描绘用于检测0或10pM的microRNA靶标的溶液中七种不同双重实验的扩增时间(Cq)。与预期相同，在每种情况下***相当于四稳态生化环路。重要的是，每种开关的扩增时间与靶标序列无关(Cqα＝178±44分钟，Cqβ＝149±19分钟)。因此，这证实交叉抑制性环路抑制了不想要的交叉反应，同时实现可编程的靶标检测。

microRNA的双重数字检测。

发明人最终将这种多重测定转至使用液滴微流控技术的数字读取中(图22)。使用流动聚焦的微流控装置，将样本混合物分割成数以千计的皮升尺寸的液滴。因此，靶标microRNA随机分布在油包水液滴中，其占位率遵循泊松分布。在可使液滴的荧光变成绿色、红色或橙色的孵育(取决于其初始含量)之后，液滴通过落射荧光显微镜进行成像。知道液滴的尺寸和每种颜色的阳性液滴的分数，就可以计算出原始样本中两种microRNA的浓度。发明人证明与单重测定相比，四稳态环路不影响检测(图23)和空白极限(图24)。为了更好的证明，发明人制备了掺入0或3pM的microRNA mir39(α开关)和let7a(β开关)的4种样本。每种样本用两种荧光右旋糖酐条码的组合进行条码化，并使用自制的样本转换器进行连续乳化。孵育后，用荧光显微镜对液滴进行成像(图22b至图22d)。虽然记录一些假阳性事件，但在12％±6％的误差范围内实现对两种microRNA的精确定量(这可能部分是由于靶标的连续稀释带来的浓度不确定性)。为了评估该技术的可重复性，发明人对不同成分的样本(各种浓度的各种microRNA)重复进行该实验。对于这15个样本，发明人观察到掺入的microRNA的预期浓度和测量浓度之间有良好的相关性(图22d)。最后，发明人还验证双阳性液滴(绿色和红色液滴)的分数与两个靶标的泊松分布所预期的分数相对应(F_o＝F_g·F_r，其中F_o、F_g和F_r是橙色、绿色和红色液滴的分数)。

结论

发明人之前证明，基于MP的等温扩增策略有可能完全消除背景扩增。在本发明中，他们充分利用该特点将模拟读数(实时荧光监测)转换为数字格式(端点区室分析)。因此，本发明的方法可以对靶标生物分子，特别是酶和核酸，更特别是microRNA进行灵敏、特异和定量测量。基于一步程序，其减少样本的操作，因此减少携带污染的风险。由于该***依赖于信号扩增机制而不是靶标序列复制这一事实，污染问题就更少。

通过设计相应的转换模板，基于多功能DNA的环路可以被重新用于任何目的生物分子。关于microRNA，应该指出所有其它环路部分对所有microRNA都是通用的，因此不需要引物和探针设计，降低测定成本。

此外，上述结果表明，DNA环路结构可以适用于检测酶，特别是具有广泛活性的DNA相关酶(核酸酶、DNA N-糖基化酶、聚合酶、连接酶和激酶)。本方法的灵敏性允许对皮升尺寸的区室中分离的单个酶进行直接数字化计数。所述方法也可用于纯化过程后的活性酶的定量，并确定物理(温度)或化学处理对单个酶水平上的酶活性的影响。

上述实施例还表明，本发明的方法可适用于以更灵敏的方式进行多重检测。

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序列表

<110> 国家科学研究中心

国家健康科学研究所

巴黎城市物理化工高等学院

巴黎科学与文学联大

巴黎大学

<120> 使用等温扩增的数字生物分子检测和/或定量

<130> 378050D38528

EP19305669.4

<141> 2019-05-27

<160> 115

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CBe12PS3:自催化模板

<400> 1

cgatcctgaa tgcgatcctg aatg 24

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CBe12-1PS3:自催化模板

<400> 2

cgatcctgaa tgcgatcctg aat 23

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CBe12-2PS3:自催化模板

<400> 3

cgatcctgaa tgcgatcctg aa 22

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ptBe12T5SP:伪模板

<400> 4

tttttcgatc ctgaatg 17

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CBa12-1PS4:自催化模板

<400> 5

ctcgtcagaa tgctcgtcag aat 23

<210> 6

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> ptBa12A4SP:伪模板

<400> 6

aaaactcgtc agaatg 16

<210> 7

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ptBa12T5SP伪模板

<400> 7

tttttctcgt cagaatg 17

<210> 8

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ptBa12T4S3P:伪模板

<400> 8

ttttctcgtc agaatg 16

<210> 9

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> ptBa12T3S3P:伪模板

<400> 9

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<210> 10

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> ptBa12T2S3P:伪模板

<400> 10

ttctcgtcag aatg 14

<210> 11

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> ptBa12T1S3P:伪模板

<400> 11

tctcgtcaga atg 13

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CBa12-2PS4:自催化模板

<400> 12

ctcgtcagaa tgctcgtcag aa 22

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CBa12PS4:自催化模板

<400> 13

ctcgtcagaa tgctcgtcag aatg 24

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CBa12-1PS4:自催化模板

<400> 14

ctcgtcagaa tgctcgtcag aat 23

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CBa12-3PS4:自催化模板

<400> 15

ctcgtcagaa tgctcgtcag a 21

<210> 16

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pTk12T5S4P:伪模板

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(13)

<223> n是u

<400> 16

tttttcaatg acncctg 17

<210> 17

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ApTk12A1SUP:伪模板

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(9)

<223> n是u

<400> 17

acaatgacnc ctga 14

<210> 18

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> ApTk12A2SUP:伪模板

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<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> n是u

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aacaatgacn cctga 15

<210> 19

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> ApTk12A3PS:伪模板

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(11)

<223> n是u

<400> 19

aaacaatgac ncctga 16

<210> 20

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> ApTk12A4SUP:伪模板

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<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> n是u

<400> 20

aaaacaatga cncctga 17

<210> 21

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> ApTk12A5SUP:伪模板

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<221> misc_feature

<222> (13)..(13)

<223> n是u

<400> 21

aaaaacaatg acncctga 18

<210> 22

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> ApTk12A6SUP:伪模板

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)..(14)

<223> n是u

<400> 22

aaaaaacaat gacncctga 19

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> Ck12-2PS4 bioteg自催化模板

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(8)

<223> n是u

<400> 23

caatgacncc tgcaatgact cc 22

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Cba12-2biot3自催化模板

<400> 24

tcgtcagaat gctcgtcaga a 21

<210> 25

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ptBa12A5SP伪模板

<400> 25

aaaaactcgt cagaatg 17

<210> 26

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Cbe12-2S4P自催化模板

<400> 26

cgatcctgaa tgcgatcctg aa 22

<210> 27

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ApTBe12A3S3P伪模板

<400> 27

aaacgatcct gaatga 16

<210> 28

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CBe12-2noPS3自催化模板

<400> 28

cgatcctgaa tgcgatcctg aa 22

<210> 29

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Ck12-2S4noUbioteg自催化模板

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(8)

<223> n是u

<400> 29

caatgacncc tgcaatgact cc 22

<210> 30

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ApTk12A5S3P伪模板

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(13)

<223> n是u

<400> 30

aaaaacaatg acncctga 18

<210> 31

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CBe12-2AULP自催化模板

<400> 31

cgatcctgaa tgcgatcctg a 21

<210> 32

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> D21tof5TBe12S3P转换模板

<400> 32

cgatcctgaa agcgaagttt gactcatcaa catcagtctg ataagcta 48

<210> 33

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CBe12-3noPS3自催化模板

<400> 33

cgatcctgaa tgcgatcctg a 21

<210> 34

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> D21tofBe12S0P转换模板

<400> 34

cgatcctgaa tgtcaacatc agtctgataa gcta 34

<210> 35

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CBe12-2SPCy355自催化模板

<400> 35

cgatcctgaa tgcgatccat cctgaa 26

<210> 36

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CBc12SPBMN35自催化模板

<400> 36

cagtccagaa tgcagtccag aa 22

<210> 37

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pTBc12T5SP伪模板

<400> 37

tttttcagtc cagaatg 17

<210> 38

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 92atoF5TBe12PS0转换模板

<400> 38

cgatcctgaa agcgaagttt gactcaagca ttgcaaccga tcccaacc 48

<210> 39

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Let7atof5TBa12S0P转换模板

<400> 39

ctcgtcagaa agcgaagttt gactcaaact atacaaccta ctacctca 48

<210> 40

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CBa12-2AULP自催化模板

<400> 40

ctcgtcagaa tgctcgtcag aaagcgaagc 30

<210> 41

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ApTBa12A3S3P伪模板

<400> 41

aaactcgtca gaatga 16

<210> 42

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RPBe-Cy6报告探针

<400> 42

ttttgcattc aattttcgat cctgaatg 28

<210> 43

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CBe12-1S4 bioteg自催化模板

<400> 43

cgatcctgaa tgcgatcctg aat 23

<210> 44

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Cba12S bioteg自催化模板

<400> 44

ctcgtcagaa tgctcgtcag aatg 24

<210> 45

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RPBa-Hex报告探针

<400> 45

ttttgaattc tattttctcg tcagaatt 28

<210> 46

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Cba12-3noPS3自催化模板

<400> 46

ctcgtcagaa tgctcgtcag a 21

<210> 47

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RPBe-Cy5(2)报告探针

<400> 47

ttcaggtttt cgatcctgaa 20

<210> 48

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RPBe-Cy5(3)报告探针

<400> 48

attcagaatg cgatcctgaa t 21

<210> 49

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ptBa12A6biot伪模板

<400> 49

aaaaaactcg tcagaatg 18

<210> 50

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 92atof1Be12-3+3转换模板

<400> 50

atgcgatcct gacgtttgac tcaagcattg caaccgatcc caacc 45

<210> 51

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Let7atof1Ba12-3+3转换模板

<400> 51

atgctcgtca gacgtttgac tcaaactata caacctacta cctca 45

<210> 52

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CBc12-3noPS3自催化模板

<400> 52

cagtccagaa tgcagtccag a 21

<210> 53

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RPBc-FAM报告探针

<400> 53

ttctggtttt cagtccagaa 20

<210> 54

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> alphatoalpha自催化模板

<400> 54

cagtccagaa tgcagtccag aa 22

<210> 55

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pTalpha伪模板

<400> 55

tttttcagtc cagaatg 17

<210> 56

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> rTalpha报告模板

<400> 56

attctgaatg cagtccagaa t 21

<210> 57

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Let7atoalpha转换模板

<400> 57

tgcagtccag aagtttgact caaactatac aacctactac ctca 44

<210> 58

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Let7ctoalpha转换模板

<400> 58

tgcagtccag aagtttgact caaaccatac aacctactac ctca 44

<210> 59

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mir39toalpha转换模板

<400> 59

tgcagtccag aagtttgact cacaagctga tttacaccc 39

<210> 60

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> alpha

<400> 60

cattctggac tg 12

<210> 61

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> alphatoalpha: aT

<400> 61

cagtccagaa tgcagtccag aa 22

<210> 62

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pTalpha: pT

<400> 62

tttttcagtc cagaatg 17

<210> 63

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> rTalpha: rT

<400> 63

attctgaatg cagtccagaa t 21

<210> 64

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Let7atoalpha: cT

<400> 64

tgcagtccag aagtttgact caaactatac aacctactac ctca 44

<210> 65

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Let7ctoalpha: cT

<400> 65

tgcagtccag aagtttgact caaaccatac aacctactac ctca 44

<210> 66

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mir39toalpha: cT

<400> 66

tgcagtccag aagtttgact cacaagctga tttacaccc 39

<210> 67

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Let-7a microRNA

<400> 67

ugagguagua gguuguauag uu 22

<210> 68

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Let-7b microRNA

<400> 68

ugagguagua gguugugugg uu 22

<210> 69

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Let-7c microRNA

<400> 69

ugagguagua gguuguaugg uu 22

<210> 70

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mir92a microRNA

<400> 70

ucaccgggug uaaaucagcu ug 22

<210> 71

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Expar-Let7a DNA

<400> 71

aactatacaa cctactacct caaacagact caaactatac aacctactac ctcaa 55

<210> 72

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mir92a合成的寡核苷酸

<400> 72

agguugggau cgguugcaau gcu

23

<210> 73

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CBo12-2PS3

<400> 73

ctgggatgaa tgctgggatg aa

22

<210> 74

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pTBoT5S3P伪模板

<400> 74

tttttctggg atgaatg 17

<210> 75

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> rTBo-2BSmICy5报告模板

<400> 75

cttcatgaat gctgggatga ag 22

<210> 76

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NBItoBo-2+2P

<400> 76

tgctgggatg aagtttgact cacattgctt cattttgaag caatgtgagt caaacttctg 60

gactgtt 67

<210> 77

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> nbitoBo-2+2(rG)

<400> 77

tgctgggatg aagtttgact cacattgctt cagctttgct gaagcaatgt gaga 54

<210> 78

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> nbitoBo-2+2AP

<400> 78

tgctgggatg aagtttgact cacattgctt cattttgaag caatgtgagc aaacttttt 69

<210> 79

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> nbitoBo-2+2UDG (2)

<400> 79

tgctgggatg aagtttgact cacattgctt cattttgaag caaugugagt tttt 54

<210> 80

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Aagtodna-上

<400> 80

gtaggttgtaatg atgtagaatg agt 26

<210> 81

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Aagtodnabot

<400> 81

actcattcta catcatttac aacctac 27

<210> 82

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> dnatoBo-2+2P

<400> 82

tgctgggatg aagtttgact caaactatac aacctactac ctca 44

<210> 83

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> nbitoBo-2+2BsmAI+9

<400> 83

atgcctaatg tctcatgctg ggatgaagtt tgactcacat tgcttcattt tgaagcaatg 60

tgagtcaaac 70

<210> 84

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Prec-rna

<400> 84

ugagguagua gguuguauag uu 22

<210> 85

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> polyAtoBo-2+2P

<400> 85

tgctgggatg aagtttgact catttttttt tttttttttt ttttttt 47

<210> 86

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> lig1toBo-2+2

<400> 86

tgctgggatg aag 13

<210> 87

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> lig2P

<400> 87

cttgactcac attgcttcat tttttgaagc aatgtg 36

<210> 88

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> lig3P

<400> 88

agtcaagctt catcttt 17

<210> 89

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> lig2noP

<400> 89

cttgactcac attgcttcat tttttgaagc aatgtg 36

<210> 90

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> lig3noP

<400> 90

agtcaagctt catcttt 17

<210> 91

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> akb (kT)

<400> 91

cattctggac tgaaaacaat gactcgatcc tgaa 34

<210> 92

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> bka (kT)

<400> 92

cattcaggat cgaaaacaat gactcagtcc agaa 34

<210> 93

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> akbA0 (kT)

<400> 93

cattctggac tgcaatgact cgatcctgaa 30

<210> 94

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> bkaT4 (kT)

<400> 94

cattcaggat cgaaaacaat gactcagtcc agaa 34

<210> 95

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> akbA1 (kT)

<400> 95

cattctggac tgtcaatgac tcgatcctga a 31

<210> 96

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> akbA2 (kT)

<400> 96

cattctggac tgttcaatga ctcgatcctg aa 32

<210> 97

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> akbA3 (kT)

<400> 97

cattctggac tgtttcaatg actcgatcct gaa 33

<210> 98

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> akbA4 (kT)

<400> 98

cattctggac tgttttcaat gactcgatcc tgaa 34

<210> 99

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> akbA5 (kT)

<400> 99

cattctggac tgtttttcaa tgactcgatc ctgaa 35

<210> 100

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> akbT4 (kT)

<400> 100

cattctggac tgaaaacaat gactcgatcc tgaa 34

<210> 101

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> a触发物

<400> 101

cattcaggat cg 12

<210> 102

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> b触发物

<400> 102

cattctggac tg 12

<210> 103

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> aTa (aT)

<400> 103

cgatcctgaa tgcgatcctg aa 22

<210> 104

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> aTb (aT)

<400> 104

cagtccagaa tgcagtccag aa 22

<210> 105

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pTa (pT)

<400> 105

tttttcgatc ctgaatg 17

<210> 106

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pTb (pT)

<400> 106

tttttcagtc cagaatg 17

<210> 107

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> rTa (rT)

<400> 107

attcagaatg cgatcctgaa t 21

<210> 108

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> rTb (rT)

<400> 108

attctgaatg cagtccagaa t 21

<210> 109

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> let7atob (cT)

<400> 109

tgcagtccag aagtttgact caaactatac aacctactac ctca 44

<210> 110

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> let7etob (cT)

<400> 110

tgcagtccag aagtttgact caaactatac aacctcctac ctca 44

<210> 111

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mir7tob (cT)

<400> 111

tgcagtccag aagtttgact caaacaacaa aatcactagt cttcca 46

<210> 112

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mir92ato (cT)

<400> 112

tgcgatcctg aagtttgact caagcattgc aaccgatccc aacc 44

<210> 113

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mir39ato (cT)

<400> 113

tgcgatcctg aagtttgact cacaagctga tttacaccc 39

<210> 114

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Let7e (microRNA)

<400> 114

ugagguagga gguuguauag uu 22

<210> 115

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mir7 (microRNA)

<400> 115

uggaagacua gugauuuugu uguu 24

Claims (16)

1.一种用于检测和/或定量样本中至少一种靶标生物分子的数字方法，其包括以下步骤：

a)将所述样本与包含缓冲液、酶、作为扩增寡核苷酸的第一寡核苷酸、作为泄露吸收寡核苷酸的第二寡核苷酸和作为靶标特异性转换寡核苷酸的第三寡核苷酸的混合物进行混合；

b)将步骤a)中获得的混合物分割成若干区室，使得部分区室不包含靶标生物分子；

c)将靶标生物分子转换为信号，所述信号优选为DNA单链；

d)扩增信号，以及

e)检测和/或测量每个区室中的所述信号。

2.根据权利要求1所述的数字方法，其中所述靶标生物分子是核酸或蛋白质，所述蛋白质优选是酶。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述靶标生物分子是核酸，优选选自DNA、cDNA、RNA、mRNA和micro RNA，更优选地，所述核酸是micro RNA。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中步骤a)中使用的所述酶选自聚合酶、切口酶或限制酶和外切酶。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述第一寡核苷酸包括含有切口酶识别位点的部分重复结构，以及所述第二寡核苷酸能够沿着所述第一寡核苷酸结合、延伸、失活并缓慢释放聚合产物，从而诱导阈值效应。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，还包括加入作为报告探针的第四寡核苷酸，优选所述报告探针是荧光探针。

7.根据权利要求1至6中任一项所述方法，还包括加入作为交叉抑制寡核苷酸的第五寡核苷酸，用于检测和/或定量两个或多个生物分子。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中将步骤a)中获得的混合物在步骤b)中分割为液滴，优选分割为油包水乳液液滴。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述液滴的尺寸为0.001至100pL之间，优选为0.01至10pL之间，更优选为0.1至5pL之间或为0.1至8pL之间。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述信号是标记的，优选是通过荧光标记的。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述检测和/或测量所述信号的步骤d)包括检测和/或计数发射荧光的区室。

12.根据权利要求11所述的方法，其中为测量在受测生物样本中所述靶标生物分子的绝对浓度，对接收荧光信号的区室和非荧光区室进行计数并计算它们的比率。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述靶标生物分子用作生物标记物。

14.一种用于诊断疾病的体外方法，所述疾病选自癌症、神经元疾病、心血管疾病、炎性疾病、自身免疫性疾病、由病毒或细菌感染引起的疾病、皮肤病、骨骼肌疾病、牙病和产前疾病，所述方法包括使用根据权利要求1至13中任一项所述的方法。

15.一种用于农业疾病诊断的体外方法，所述疾病选自：

-由生物胁迫，优选传染源和/或寄生虫源引起的疾病，或

-由非生物胁迫引起的疾病，优选由营养缺乏和/或不利的环境引起的疾病，

所述方法包括使用根据权利要求1至13中任一项所述的数字方法。

16.一种用于检测和/或定量至少一种靶标生物分子的试剂盒，所述试剂盒包含：

a)酶的混合物，所述酶优选选自聚合酶、切口酶或限制酶和外切酶；

b)寡核苷酸的混合物，所述寡核苷酸包含作为扩增寡核苷酸的第一寡核苷酸、作为泄露吸收寡核苷酸的第二寡核苷酸和作为靶标特异性转换寡核苷酸的第三寡核苷酸以及任选的作为报告探针的第四寡核苷酸，以及

c)分割剂，优选油包水乳剂。

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