JP7233129B2 - 時間的多重化ライトシートを利用する高速体積蛍光顕微鏡法のための装置及び方法 - Google Patents
時間的多重化ライトシートを利用する高速体積蛍光顕微鏡法のための装置及び方法 Download PDFInfo
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Description
(例示的な実施形態)
高速体積撮像デバイスは、生物学的サンプル内で発生する動的プロセスの連続ビデオを捉えることができる。これを実証するために、直径が1μmの蛍光ポリマービーズを水に投入し、シリンジポンプによって四角いガラスピペットに注入した。照射対物レンズと検出対物レンズとは、ガラスピペットの隣接する側面に直交して配置された。この構成により、検出対物レンズが、マイクロ流体の流れの中で蛍光ポリマービーズの動的な動きを捉えることができる。図7(a)は80msでの蛍光ポリマービーズの体積画像を示している。図7(b)は680msでの蛍光ポリマービーズの体積画像を示している。図7(c)は1.36sでの蛍光ポリマービーズの体積画像を示している。図7(b)は1.92sでの蛍光ポリマービーズの体積画像を示している。ボリュームフレームレートは-25vol/secで、ビデオを使用して流速を27μm/secと推測した。
高速体積撮像デバイスを使用して、マウスの腸の血管系とマウスの腎臓の糸球体を撮像した。腸と腎臓の組織は、光学的透明性を高めるためにOPTICLear溶液で清澄化し、内皮細胞膜にDil(DilC18)色素で標識した。図8(a)は、腸内の血管のネットワーク構造の体積画像である。この画像は、血管新生の芽でさえもはっきりと視覚化できることを示している。図8(b)は、光学的に透明なマウスの腎臓組織の血管網に付着した3つの糸球体を示している。ボリュームフレームレートは1.6vol/secであった。
高速体積撮像デバイスは、拡張焦点深度(DOF)と波面コーディング(WFC)を組み込むように構成することができる。予め規定した位相マスクを検出パスに配置し、システムの点像分布関数(psf)を設計して、深さの変動を少なくすることができる。デコンボリューション中にキュービック位相マスク(CPM)に基づくWFCスキームを使用して、高速ボリューム撮像デバイスの拡張DOFを実現することができる。CPM位相関数は、φ(u,v)=r(u3+v3)で表すことができ、ここで、u及びvは空間周波数座標であって、rはフリー最適化パラメーターである。CPMは、検出対物レンズ(20×、NA=0.4)のバック焦点面に配置されている。psfは、50μmを超える深さにわたって概ね不変である。これは、CPMなしのpsf(DOFがわずか~5μmである)に比べ、明らかな拡張DOF効果を示している。CPMは位相を変調するのみであって、ロスを生じない。psfシミュレーション研究において、CPMを追加したときのpsfの深さ不変性(50μm以上)が示されている(例えば、図4を参照)。CPMを使用して生成されたpsf画像は非対称のぼやけを示したが、これはデコンボリューションによって改善することができる。
発明者は、マイクロ流体ポンプによって流体チャネル(四角いガラスピペット、内側の辺長が1mm)に供給される流れる蛍光ビーズを撮像することによって、CLAMの撮像速度を更に評価した。図15に示すように、概念実証実験として、1100乃至1400Hzの周波数範囲(BW)内で、合計N=24のライトシートで構成されたCLAMシステムは、図15に示すように、流れ(流速が~20μm/s)の中で、最大体積レートfvolが13vol/secで微粒子を捉えることができる。現在の装置の実際の体積レートは、実験に必要なライトシートの数(N)に応じて更に向上することができることに注意されたい。例えば、軸方向に沿った撮像FOVが半分に減少すれば(すなわち、N=12)、現在のカメラで体積レートを~25vol/sに増加することができる。
組織の透明処理は、解剖学的構造を変更することなく、構成の一部を交換、取り除き、変更することで屈折率を均一化することにより、大きな生物学的サンプル、例えば生物全体を透明にすることである。これにより、光散乱を最小限に抑えて光学顕微鏡下での組織構造の分析が可能となるが、画像の劣化が生じる。CLAMは、組織の透明処理と併せた組織構造の3D視覚化のための先進なツールを提供する。ここでは、OPTIClearと呼ばれる最近の方法を使用して、組織の透明処理を行う。これは、界面活性剤及び変性剤を使用せず、構造及び分子の変化を最小限にするためである。OPTIClearで処理したマウス組織(回腸と腎臓)を、親油性カルボシアニン色素(DiI)で灌流し、CLAMを使用して画像化する。球面収差を利用した拡張DOFを実現するために、試料を媒体(n=1.47)に浸漬した。
Claims (15)
- ライトシートベースの顕微鏡デバイスであって、
1D光ビームを放射するように構成された光源と、
一対の平行ミラーであって、前記1D光ビームを受け取り、受け取った前記1D光ビームを前記平行ミラー間で複数回反射してインコヒーレントなライトシートのアレイを生成するように構成された、前記一対の平行ミラーと、
前記インコヒーレントなライトシートのアレイをエンコードするように構成されたエンコーダであって、
前記インコヒーレントなライトシートのアレイをセグメント化し、各ライトシートをそれぞれの周波数でエンコードするように構成された周波数変調器、又は
アダマールベース又はランダムマスクを含む任意の直交エンコーディング基準によって前記インコヒーレントなライトシートのアレイをセグメント化するように構成された時間変調器、を含む、
前記エンコーダと、
エンコードされたライトシートを生物学的サンプルに向けさせるように構成されたレンズと、
前記生物学的サンプルから蛍光信号を受信するように構成された画像キャプチャデバイスと、
を備える、
ライトシートベースの顕微鏡デバイス。 - 前記光源は、連続波レーザ又はパルス波レーザの少なくとも1つ、又は複数の異なる波長の、連続波レーザ又はパルス波レーザの組み合わせである、請求項1に記載のライトシートベースの顕微鏡デバイス。
- 前記一対の平行ミラーは、それぞれが99%を超える反射率を有する、請求項1に記載のライトシートベースの顕微鏡デバイス。
- 前記光源からの光ビームを拡張又は集束するように構成されたビームエキスパンダーを更に含む、請求項1に記載のライトシートベースの顕微鏡デバイス。
- 前記周波数変調器は、移動又は回転をする空間光変調器、又は走査光ビームによる静的な空間的にパターン化されたマスク照射の形を有するビームエンコーダである、請求項1に記載のライトシートベースの顕微鏡デバイス。
- 光を前記生物学的サンプルに伝送するように構成された照射対物レンズと、前記照射対物レンズに直交して配置された検出対物レンズとを更に備える、請求項1に記載のライトシートベースの顕微鏡デバイス。
- 画像信号を多重分離するための回路を更に備える、請求項1に記載のライトシートベースの顕微鏡デバイス。
- 光を前記生物学的サンプルに伝送するように構成された照射対物レンズを更に備え、
前記画像キャプチャデバイスは、2D画像センサ又はカメラであって、前記画像キャプチャデバイスはビデオを捉えるように構成されており、
画像キャプチャデバイスの対物レンズは、前記照射対物レンズに直交して配置されているか、又は前記照射対物レンズと一直線上に配置されている、
請求項1に記載のライトシートベースの顕微鏡デバイス。 - ライトシートベースの顕微鏡デバイスであって、
1D光ビームを放射するように構成された光源と、
角度がずれたミラーペアであって、前記1D光ビームを受け取り、受け取った前記1D光ビームを前記角度がずれたミラーペア間で複数回反射してライトシートのアレイを生成し、前記ライトシートのアレイの密度とコヒーレンスとは、前記角度がずれたミラーペアの幾何学構成を調整することによって再構成可能である、前記角度がずれたミラーペアと、
前記ライトシートのアレイをエンコードして並列照射を形成するように構成されたライトシートエンコーダと、
エンコードされたライトシートを生物学的サンプルに向けさせるように構成されたレンズと、
前記生物学的サンプルから蛍光信号を受信するように構成された画像キャプチャデバイスと、
を備る、
ライトシートベースの顕微鏡デバイス。 - 前記角度がずれたミラーペアに入射された光を整形して、円錐角を有する線集束ビームを形成するビーム整形器を更に備える、請求項9に記載のライトシートベースの顕微鏡デバイス。
- 投射されたエンコードされた光シートを通過させてN個の光シートのアレイを形成するように構成されたリレーレンズを更に備える、請求項9に記載のライトシートベースの顕微鏡デバイス。
- 前記N個の光シートのアレイの任意のサブセットを選択して前記生物学的サンプルを照射するための予め規定されたマスクを更に備え、
前記予め規定されたマスクは、走査光ビームによる静的な空間的にパターン化されたマスク照射、又は空間光変調器を使用する能動的に制御可能なマスクを含む、
請求項11に記載のライトシートベースの顕微鏡デバイス。 - 前記アレイ内の複数のライトシート間のコヒーレンス度は、ミラー間隔Sを調整することによって調整可能であり、前記ライトシートのアレイ密度は、ミラーのずれた角度αを調整することによって構成可能である、
請求項9に記載のライトシートベースの顕微鏡デバイス。 - 軸方向及び横方向の両方の方向で視野(FOV)を増加させるように構成された波面コーディング/整形要素を更に備える、
請求項9に記載のライトシートベースの顕微鏡デバイス。 - 前記ライトシートエンコーダは、
前記ライトシートのアレイをセグメント化し、各ライトシートをそれぞれの周波数でエンコードするように構成された周波数変調器、又は
アダマールベース又はランダムマスクを含む任意の直交エンコーディング基準によって前記ライトシートのアレイをセグメント化するように構成された時間変調器、を含む、
請求項9に記載のライトシートベースの顕微鏡デバイス。
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