JP7222404B2 - 細胞シート形成部材、細胞シート形成部材の製造方法、および、細胞シートの製造方法 - Google Patents

Description

本開示は、細胞シートを形成するための細胞シート形成部材、細胞シート形成部材の製造方法、および、細胞シートの製造方法に関する。

細胞を培養するための方法は、従来から種々提案されている。例えば、特許文献１に記載の細胞の培養方法は、微細な側壁で区画された複数の空間構造を細胞培養用基材に設け、空間構造が相互に連通する方向と、細胞の伸長方向とを揃えることによって、細胞シートの細胞の配向性を制御する（特許文献１参照）。

特開２００６－１９１８０９号公報

ところで、例えば特許文献１で記載されたような細胞シートは、脆弱であることから、細胞培養用基材から剥離する際に損傷してしまうおそれがある。
本開示の目的は、細胞シートの剥離を容易とした細胞シート形成部材、細胞シート形成部材の製造方法、および、細胞シートの製造方法を提供することにある。

本開示の一態様に係る細胞シート形成部材は、細胞シートを形成するための表面を備え、前記表面は、細胞を培養する培養部と、前記培養部に対して外側に位置し、前記細胞シートの前記表面からの剥離開始部位を形成する剥離補助部とを備え、前記培養部は、複数の第１平坦部と、複数の第１凹凸部とを備え、前記第１平坦部の各々は、第１方向に延びる形状を有し、かつ、前記第１平坦部は、前記第１方向と交差する第２方向に並び、前記第１凹凸部の各々は、相互に隣り合う前記第１平坦部の間を埋める第１段差構造を備え、前記第１段差構造は、第１ピッチで配置された凸部から構成されており、前記剥離補助部は、第２ピッチで配置された凸部から構成された第２段差構造を備えた第２凹凸部、または、第２平坦部で構成されている。

上記構成によれば、細胞シート形成部材は、培養部の外側に剥離補助部を備えているので、細胞シートを剥離し易くできる。すなわち、剥離補助部が第２段差構造を備えた第２凹凸部で構成されている場合には、剥離補助部での細胞シートに対する接触面積は、培養部での細胞シートに対する接触面積より小さくなり、接着力も低くなる。したがって、細胞シートの外周部が細胞シート形成部材の表面から剥がれ易くなる。また、剥離補助部が第２平坦部で構成されている場合には、細胞シートの外周部の強度が高まり、細胞シートの外周部を表面から剥がすときに損傷しにくくなる。

上記細胞シート形成部材において、例えば、前記細胞シート形成部材において培養される細胞は、筋芽細胞、線維芽細胞、および、心筋細胞からなる群から選ばれた少なくとも１種である。上記構成によれば、筋芽細胞、線維芽細胞、および、心筋細胞などの配向性を持たせた細胞シートを容易に製造することができ、細胞シートを損傷させることなく細胞シート形成部材から容易に剥離することができる。

上記細胞シート形成部材において、前記剥離補助部は、第２ピッチで配置された凸部から構成された第２段差構造を備えた第２凹凸部で構成されており、前記第２ピッチは、前記第１ピッチと同じであるか、前記第１ピッチよりも大きいことが好ましい。上記構成によれば、剥離補助部での細胞シートに対する接触面積は、培養部での細胞シートに対する接触面積より小さくなり、接着力も低くなる。したがって、細胞シートの外周部が細胞シート形成部材の表面から剥がれ易くなる。

上記細胞シート形成部材において、例えば、前記第１ピッチは、１０ｎｍ以上、１０μｍ以下であり、前記第２ピッチは、１００ｎｍ以上、１０μｍ以下であることが好ましい。

上記細胞シート形成部材において、前記剥離補助部は、前記培養部を包囲する一重の環状部であることが好ましい。上記構成によれば、一重の環状部で構成された剥離補助部から細胞シートを剥離し易くできる。

上記細胞シート形成部材において、前記剥離補助部は、第２ピッチで配置された凸部から構成された第２段差構造を備えた第２凹凸部で構成されており、前記剥離補助部は、前記培養部を包囲する２重以上の環状部であって、外側に位置する環状部は、内側に位置する環状部と同じか、前記内側に位置する環状部よりも大きなピッチを有する凹凸構造を備えることが好ましい。上記構成によれば、外側に向かうほど、細胞シートの接着力を弱めることができる。これにより、剥離補助部において、外側から細胞シートを剥離し易くできる。

上記細胞シート形成部材において、前記表面には、温度応答性ポリマーが塗布されていることが好ましい。上記構成によれば、細胞シートの剥離・回収を容易にすることができる。

上記細胞シート形成部材において、前記剥離補助部は、第２ピッチで配置された凸部から構成された第２段差構造を備えた第２凹凸部で構成されており、前記表面に対して平行な仮想平面と前記剥離補助部とが単位面積当たりに接触する面積は、前記仮想平面と前記第１凹凸部とが単位面積当たりに接触する面積よりも小さいことが好ましい。上記構成によれば、表面に対して平行な仮想平面と前記剥離補助部とが単位面積当たりに接触する面積が、仮想平面と前記第１凹凸部とが単位面積当たりに接触する面積よりも小さいので、接着力も低くなる。したがって、細胞シートの外周部が細胞シート形成部材の表面から剥がれ易くなる。

上記細胞シート形成部材において、前記剥離補助部は、第２平坦部で構成されており、前記表面に対して平行な仮想平面と前記剥離補助部とが単位面積当たりに接触する面積は、前記仮想平面と前記第１凹凸部とが単位面積当たりに接触する面積よりも大きいことが好ましい。上記構成によれば、表面に対して平行な仮想平面と剥離補助部とが単位面積当たりに接触する面積が、仮想平面と前記第１凹凸部とが単位面積当たりに接触する面積よりも大きいので、細胞シートの外周部の強度が高まり、細胞シートの外周部を表面から剥がすときに損傷しにくくなる。

本開示の別の態様に係る細胞シート形成部材は、細胞シートを形成するための表面を備え、前記表面は、細胞を培養する培養部と、前記表面の縁に位置して前記細胞シートの前記表面からの剥離開始部位を形成する剥離補助部とを備え、前記培養部は、複数の第１平坦部と、複数の第１凹凸部とを備え、前記第１平坦部の各々は、第１方向に延びる形状を有し、かつ、前記第１平坦部は、前記第１方向と交差する第２方向に並び、前記表面に対して平行な仮想平面と前記剥離補助部とが単位面積当たりに接触する面積は、前記仮想平面と前記第１凹凸部とが単位面積当たりに接触する面積よりも小さい。

上記構成によれば、表面に対して平行な仮想平面と前記剥離補助部とが単位面積当たりに接触する面積が、仮想平面と前記第１凹凸部とが単位面積当たりに接触する面積よりも小さいので、接着力も低くなる。したがって、細胞シートの外周部が細胞シート形成部材の表面から剥がれ易くなる。

本開示の更なる別の態様に係る細胞シート形成部材は、細胞シートを形成するための表面を備え、前記表面は、細胞を培養する培養部と、前記表面の縁に位置して前記細胞シートの前記表面からの剥離開始部位を形成する剥離補助部とを備え、前記培養部は、複数の第１平坦部と、複数の第１凹凸部とを備え、前記第１平坦部の各々は、第１方向に延びる形状を有し、かつ、前記第１平坦部は、前記第１方向と交差する第２方向に並び、前記表面に対して平行な仮想平面と前記剥離補助部とが単位面積当たりに接触する面積は、前記仮想平面と前記第１凹凸部とが単位面積当たりに接触する面積よりも大きい。

上記構成によれば、表面に対して平行な仮想平面と剥離補助部とが単位面積当たりに接触する面積が、仮想平面と前記第１凹凸部とが単位面積当たりに接触する面積よりも大きいので、細胞シートの外周部の強度が高まり、細胞シートの外周部を表面から剥がすときに損傷しにくくなる。

上記課題を解決するための細胞シート形成部材の製造方法は、凹版を形成することと、細胞シートを形成するための細胞シート形成部材の表面を前記凹版の転写によって形成することとを含み、前記表面は、細胞を培養する培養部と、前記培養部に対して外側に位置し、前記細胞シートの前記表面からの剥離開始部位を形成する剥離補助部とを備え、前記培養部は、複数の第１平坦部と、複数の第１凹凸部とを備え、前記第１平坦部の各々は、第１方向に延びる形状を有し、かつ、前記第１平坦部は、前記第１方向と交差する第２方向に並び、前記第１凹凸部の各々は、相互に隣り合う前記第１平坦部の間を埋める第１段差構造を備え、前記第１段差構造は、第１ピッチで配置された凸部から構成されており、前記剥離補助部は、第２ピッチで配置された凸部で構成された第２段差構造を備えた第２凹凸部、または、第２平坦部で構成されており、前記凹版は、前記第１平坦部を成形する第１平坦成形部と、前記第１凹凸部を成形する第１凹凸成形部と、前記第２凹凸部または前記第２平坦部を成形する第２成形部とを備え、前記凹版を形成することは、前記第１平坦成形部、前記第１凹凸成形部、および、前記第２成形部を、フォトリソグラフィー法、コロイダルリソグラフィー法、陽極酸化法、および、干渉露光法の少なくとも１種を用いて形成することを含む。

本開示の一態様に係る細胞シートの製造方法は、以上のような細胞シート形成部材を用い、前記第１平坦部および前記第１凹凸部の何れか一方に対する接着が他方に対する接着よりも優勢である細胞を前記細胞シート形成部材の表面に接着させて、前記細胞シート形成部材の表面に細胞シートを形成することと、前記細胞シート形成部材の前記剥離補助部上の前記剥離開始部位から前記細胞シートを前記表面から剥離することとを含む。

（ａ）は、本開示に係る細胞シート形成部材の構造をシャーレと共に示す斜視図、（ｂ）は、図１（ａ）の細胞シート形成部材の表面全体を示す平面図、（ｃ）は、図１（ｂ）の細胞シート形成部材の培養部表面の一部を拡大して示す斜視図、（ｄ）は、図１（ｂ）の細胞シート形成部材の培養部表面の一部を拡大して示す平面図、（ｅ）は、図１（ｂ）の細胞シート形成部材の培養部の一部を拡大して示す部分断面図、（ｆ）は、図１（ｂ）の細胞シート形成部材の表面を走査電子顕微鏡によって撮影した画像。 （ａ）は、第１細胞シート形成部材の平面図であり、（ｂ）は、図２（ａ）の第１細胞シート形成部材の要部断面図。 （ａ）は、第２細胞シート形成部材の平面図であり、（ｂ）は、図３（ａ）の第２細胞シート形成部材の要部断面図。 （ａ）は、第３細胞シート形成部材の平面図であり、（ｂ）は、図４（ａ）の第３細胞シート形成部材の要部断面図。 （ａ）は、第４細胞シート形成部材の平面図であり、（ｂ）は、図５（ａ）の第４細胞シート形成部材の要部断面図。 図２（ａ）および図２（ｂ）に示す細胞シート形成部材の製造方法の一例を説明するための工程図。 （ａ）～（ｃ）は、細胞シートの製造過程を説明するための模式図。 本開示に係る細胞シート形成部材を用いて培養した筋芽細胞の蛍光染色画像。 参考例としての細胞培養シャーレを用いて培養した筋芽細胞の蛍光染色画像。 （ａ）～（ｃ）は、細胞シートの製造過程を説明するための模式図。 （ａ）～（ｃ）は、細胞シートの製造過程を説明するための模式図。 （ａ）は培養細胞を示す図であり、（ｂ）は、培養細胞が接着膜で被覆された状態を示す図、（ｃ）は、培養細胞が三次元組織化された状態を示す図、（ｄ）は、細胞シート形成部材を用いて培養した筋芽細胞の蛍光染色画像。

以下、細胞シート形成部材、細胞シート形成部材の製造方法、および、細胞シートの製造方法の実施形態について説明する。まず、細胞シート形成部材の構成を説明し、次いで、細胞シート形成部材の製造方法、細胞シートの製造方法を説明する。

［細胞シート形成部材］
図１（ａ）に示すように、細胞シート形成部材１００は、例えば、シャーレの培養皿１１０に配置されるシート材である。細胞シート形成部材１００は、培養皿１１０に載置されるものであってもよいし、シャーレを直接加工して設けるものであってもよい。シャーレに直接加工して設ける場合、細胞シート形成部材１００は、例えばシャーレを射出成型して賦形される。シャーレは、培養皿１１０と蓋１２０とに囲まれた空間に細胞懸濁液を保持する。細胞懸濁液に含まれる細胞は、例えば、筋芽細胞、線維芽細胞、および心筋細胞からなる群から選ばれた少なくとも１種であるが、これに限定されるものではない。

図１（ｂ）に示すように、細胞シート形成部材１００の表面１１１は、細胞培養する培養部１０１と、表面１１１からの細胞シートの剥離を行い易くする剥離補助部１０２とを備えている。剥離補助部１０２は、培養部１０１の外側において、培養部１０１を包囲する環状部として構成されている。また、剥離補助部１０２は、表面１１１の縁に位置している。剥離補助部１０２では、一例として、剥離補助部１０２に対する細胞シートの接着力が培養部１０１に対する細胞シートの接着力よりも低くなるようにし、細胞シートの外周部が剥離開始部位となるように、表面１１１から剥がれ易くなるように構成されている。また、剥離補助部１０２では、別の例として、剥離補助部１０２に対する細胞シートの接着力が培養部１０１に対する細胞シートの接着力よりも高くなるようにし、細胞シートの外周部の強度を高め、細胞シートの外周部を表面１１１から剥がすときに損傷しにくくしている。

［培養部］
図１（ｃ）に示すように、培養部１０１は、複数の第１平坦部１３０と、複数の第１凹凸部１４０とを備える。各第１凹凸部１４０は、段差構造（第１段差構造）を備え、複数の段差構造は、相互に隣り合う第１平坦部１３０の間を埋める。段差構造は、凸部、または、凹部である。なお、本実施形態における段差構造は、凸部１４１であり、第１凹凸部１４０は、相互に隣り合う第１平坦部１３０に挟まれた凹部と、凹部の底面に位置する複数の凸部１４１とを備える。

図１（ｄ）に示すように、各第１平坦部１３０は、１つの方向である第１方向（図１（ｄ）の上下方向）に延びる平坦面である。第１平坦部１３０は、表面１１１の全体において、第１方向と直交する第２方向（図１（ｄ）の左右方向）に並ぶ。各第１凹凸部１４０もまた、第１方向に延び、かつ、第１凹凸部１４０は、表面１１１の全体において、第２方向に並ぶ。このことは、図１（ｆ）に示すように、細胞シート形成部材１００の表面を走査電子顕微鏡によって撮影した画像からも明らかである。

第１凹凸部１４０を構成する各凸部１４１は、表面１１１と対向する方向から見て、例えば、三角格子の各頂点に位置する。各第１凹凸部１４０は、凸部１４１のこのような配列を、第１方向、および、第２方向に繰り返す。三角格子の各頂点に凸部１４１が位置する第１凹凸部１４０であれば、凸部１４１を形成するための原盤を、微小な繰り返し構造を形成することに適したマスク、例えば、単粒子膜をマスクとしたエッチング法によって形成することが可能となる。

表面１１１と対向する方向から見て、各凸部１４１は、例えば円形状を有する。相互に隣り合う凸部１４１の中心間の距離の最頻値は、凸部１４１のピッチである。また、凸部１４１の平面視形状における凸部の最大幅は、凸部１４１の直径である。

凸部１４１のピッチである第１ピッチが下記（Ａ）および（Ｂ）を満たす構成は、ヒト・マウスなどの動物細胞、特に上述した筋芽細胞、線維芽細胞、および、心筋細胞の伸長方向を第１方向に揃える観点において好適である。すなわち、凸部１４１のピッチ（第１ピッチ）が下記（Ａ）および（Ｂ）を満たす構成は、動物細胞、特に上述した筋芽細胞、線維芽細胞、および、心筋細胞などの接着に対する優劣が、第１平坦部１３０と第１凹凸部１４０との間で明確に区画される観点において好適である。

（Ａ）凸部１４１の第１ピッチ：１０ｎｍ以上、１０μｍ以下（好ましくは、１００ｎｍ以上、１０μｍ以下）
なお、凸部１４１のピッチが、たとえば３００ｎｍ以下であれば、細胞シートを透過した可視光が、凸部１４１によって干渉されにくい。凸部１４１の干渉によって表示される色は、顕微鏡を使用した細胞シートの観察を複雑にする。こうした視認性の観点において、凸部１４１のピッチは１０ｎｍ以上３００ｎｍ以下が好ましい。一方、凸部１４１のピッチが大きいほど、射出成形等によって樹脂表面に凸部の微細構造を正確に形成することができる。たとえば、凸部１４１のピッチが５００ｎｍ以上であれば、樹脂表面への微細構造の形成は容易である。こうした加工性の観点において、凸部１４１のピッチは５００ｎｍ以上１０μｍ以下であることが好ましい。

（Ｂ）凸部１４１の直径：凸部１４１のピッチの５０％以上、１００％以下
各第１平坦部１３０の第２方向（短辺方向）での長さは、第１平坦部１３０の幅である。また、相互に隣り合う平坦部１３０間の第２方向（短辺方向）での長さは、第１凹凸部１４０の幅である。

第１平坦部１３０の幅、および、第１凹凸部１４０の幅は、例えば、培養の対象となる細胞の大きさ（５μｍ以上、１００μｍ以下）の１／１０倍以上、１０倍以下である。第１平坦部１３０の幅、および、第１凹凸部１４０の幅が下記（Ｃ）および（Ｄ）を満たす構成は、動物細胞、特に上述した筋芽細胞、線維芽細胞、および、心筋細胞の伸長方向を第１方向に揃えることを容易なものとする観点において好適である。

（Ｃ）第１平坦部１３０の幅：１０μｍ以上、５０μｍ以下
（Ｄ）第１凹凸部１４０の幅：１０μｍ以上、５０μｍ以下
図１（ｅ）に示すように、第１凹凸部１４０は、相互に隣り合う凸部１４１、および、第１平坦部１３０とそれに隣接する凸部１４１との間に、凹部１４２を備えても良い。複数の凸部１４１が第１凹凸部１４０に点在するため、凸部１４１間の空間である凹部１４２は、第１凹凸部１４０において、第１方向、および、第２方向に連なる。

細胞シート形成部材１００の厚み方向において、凹部１４２の底面と第１平坦部１３０との間の長さは、第１平坦部１３０の高さである。また、細胞シート形成部材１００の厚み方向において、各凸部１４１の先端面と第１平坦部１３０との間の高低差は、境界段差である。凹部１４２の底面と各凸部１４１の先端面の高低差は、凸部１４１の高さである。各凸部１４１の先端面と平坦部１３０とが面一である構成では、第１平坦部１３０の高さと、凸部１４１の高さとが、相互に等しい。凸部１４１の高さに対する凸部１４１のピッチの比は、凸部１４１のアスペクト比である。

境界段差が下記（Ｅ）を満たす構成は、細胞シートの平坦性を高める観点において好適である。凸部１４１の高さが下記（Ｆ）を満たす構成、また、凸部１４１のアスペクト比が下記（Ｇ）を満たす構成は、第１凹凸部１４０の構造上での安定性を高められる観点、また、第１凹凸部１４０の形成を容易なものとする観点において好適である。

（Ｅ）境界段差：０．５μｍ以下（好ましくは０．３μｍ以下）
（Ｆ）凸部１４１の高さ：５ｎｍ以上、５μｍ以下（好ましくは、５０ｎｍ以上、５μｍ以下
（Ｇ）凸部１４１のアスペクト比：０．１以上、１０以下
そして、上記（Ａ）および（Ｂ）を満たす構成であれば、第１平坦部１３０に対する接着が優勢である細胞であれ、第１凹凸部１４０に対する接着が優勢である細胞であれ、一方の構造体に対して細胞が優先的に接着し、他方の構造体に対する接着の劣勢と相まって、双方の構造体の延在方向である第１方向に、細胞の伸長方向が揃えられる。結果として、表面１１１に沿った二次元方向に広がる細胞シートにおいて、細胞の伸長方向を一次元方向に揃えること、すなわち、細胞の配向性を向上させることが可能となる。なお、細胞シートは、培養細胞が一次元方向に揃った状態、すなわち配向性を有する状態で厚さ方向に積み上がって三次元組織を形成することも可能である。

また、上記（Ｅ）を満たす構成、特に、各凸部１４１の先端面と第１平坦部１３０とが面一である構成は、第１凹凸部１４０と第１平坦部１３０とを覆うように形成された細胞シートにおいて、それの平坦性を高めることを可能とする。さらに、上記（Ｆ）を満たす構成は、細胞シートの平坦性をより一層に高めることが可能である。

なお、細胞シート形成部材１００の表面１１１が、第１平坦部１３０と第１凹凸部１４０とを備えるため、第１平坦部１３０に対する接着が優勢である細胞と、第１凹凸部１４０に対する接着が優勢である細胞との両方に、共通する細胞シート形成部材１００を適用することが可能ともなる。すなわち、細胞シート形成部材１００の汎用性を高めることも可能となる。

細胞シート形成後に細胞シートの剥離・回収を容易にするために、刺激応答性材料を塗布しても良い。刺激応答性材料としては、温度変化によって水親和性が変化する温度応答性ポリマーが好ましい。具体的にはポリ－Ｎ－イソプロピルアクリルアミド（ＰＩＰＡＡｍ）が好ましい。刺激応答性材料は慣用の塗布方法を用いて基材に塗布しても良い。なお、細胞シートの剥離・回収を容易にするために、細胞シートが形成された細胞シート形成部材は、超音波処理を施されてもよい。

［剥離補助部］
［第１細胞シート形成部材］
図２（ａ）および図２（ｂ）に示すように、細胞シート形成部材１００の一実施形態である第１細胞シート形成部材の剥離補助部１０２は、培養部１０１を包囲する環状部として構成された第２凹凸部１２１を備える。第２凹凸部１２１は、細胞シート形成部材１００の外周部に位置している。第２凹凸部１２１は、培養部１０１を囲む一重の段差構造（第２段差構造）を備える。剥離補助部１０２における段差構造は、凸部１２２であり、第２凹凸部１２１は、第１平坦部１３０に対して隣接する凹部と、凹部の底面に位置する複数の凸部１２２とを備える。

第２凹凸部１２１を構成する各凸部１２２は、表面１１１と対向する方向から見て、例えば、三角格子の各頂点に位置する。第２凹凸部１２１は、三角格子の各頂点に凸部１２２が位置するものであれば、凸部１２２を形成するための原盤を、微小な繰り返し構造を形成することに適したマスク、例えば、単粒子膜をマスクとしたエッチング法によって形成することが可能となる。そして、第２凹凸部１２１は、第１凹凸部１４０と同時に形成することができる。第２凹凸部１２１の幅は、０．５ｍｍ以上、２０ｍｍ以下であることが好ましい。

表面１１１と対向する方向から見て、各凸部１２２は、例えば円形状を有する。相互に隣り合う凸部１２２の中心間の距離の最頻値は、凸部１２２のピッチである。また、凸部１２２の平面視形状における凸部の最大幅は、凸部１２２の直径である。

凸部１２２のピッチである第２ピッチが下記（Ｈ）を満たす構成は、ヒト・マウスなどの動物細胞、特に上述した筋芽細胞、線維芽細胞、および、心筋細胞の剥離性を高める観点において好適である。

（Ｈ）凸部１２２の第２ピッチ：１００ｎｍ以上、１０μｍ以下（好ましくは、３００ｎｍ以上、５μｍ以下、より好ましくは、５００ｎｍ以上、１μｍ以下）
第２ピッチは第１ピッチと同じであるか、第２ピッチよりも大きいことが好ましい。すなわち、第２ピッチは、第１ピッチ以上の大きさを有することが好ましい。換言すると、表面１１１に対して平行な仮想平面と剥離補助部１０２の第２凹凸部１２１とが単位面積当たりに接触する面積は、当該仮想平面と第１凹凸部１４０とが単位面積当たりに接触する面積よりも小さくなる。これにより、細胞シートは、培養部１０１に対する接着力よりも剥離補助部１０２に対する接着力が小さくなる。したがって、細胞シートは、表面１１１の外周縁（剥離開始部位）から剥離が容易となり、損傷しにくくなる。また、第２ピッチが第１ピッチと同じ場合であっても、第１平坦部１３０の外周側に隣接しているときは、第２凹凸部１２１の細胞シートに対する接触面積が第１平坦部１３０の細胞シートに対する接触面積よりも小さくなることで、接着力が弱まり、表面１１１の外周縁から剥離が容易となる。

細胞シート形成部材１００の厚み方向において、凹部の底面と凸部１２２との間の長さが凸部１２２の高さである。各凸部１２２の先端面と凸部１４１および第１平坦部１３０とが面一である構成では、細胞シートの平坦性を高めることができる。

［第２細胞シート形成部材］
図３（ａ）および図３（ｂ）に示すように、細胞シート形成部材１００の別の実施形態である第２細胞シート形成部材の剥離補助部１０２は、第２凹凸部１２１として、内側環状部１２３と外側環状部１２４とを備えている。すなわち、第２凹凸部１２１は、培養部１０１を囲む二重の段差構造（第２段差構造）を有し、内側環状部１２３は、培養部１０１に隣接して位置し、外側環状部１２４は、内側において、内側環状部１２３と隣接し、外側において、細胞シート形成部材１００の外周縁を構成する。

内側環状部１２３および外側環状部１２４の各々の段差構造は、凸部、または、凹部である。内側環状部１２３の段差構造は、凸部１２３ａであり、内側環状部１２３は、第１平坦部１３０に対して隣接する凹部と、凹部の底面に位置する複数の凸部１２３ａとを備える。外側環状部１２４の段差構造は、凸部１２４ａであり、外側環状部１２４は、凹部の底面に位置する複数の凸部１２４ａを備える。

各凸部１２３ａ，１２４ａは、表面１１１と対向する方向から見て、例えば、三角格子の各頂点に位置する。環状部１２３，１２４の各々は、三角格子の各頂点に凸部１２３ａ，１２４ａが位置するものであれば、凸部１２３ａ，１２４ａを形成するための原盤を、微小な繰り返し構造を形成することに適したマスク、例えば、単粒子膜をマスクとしたエッチング法によって形成することが可能となる。そして、環状部１２３，１２４は、第１凹凸部１４０と同時に形成することができる。

凸部１２３ａのピッチである内側第２ピッチおよび凸部１２４ａのピッチである外側第２ピッチが下記（Ｉ）および（Ｊ）を満たす構成は、ヒト・マウスなどの動物細胞、特に上述した筋芽細胞、線維芽細胞、および、心筋細胞の剥離性を高める観点において好適である。さらに、この構成は、外側環状部１２４の方が内側環状部１２３よりも細胞シートが剥がれ易くする観点において好適である。

（Ｉ）内側環状部１２３における凸部１２３ａの内側第２ピッチ：１００ｎｍ以上、１０μｍ以下（好ましくは、３００ｎｍ以上、１μｍ以下）
（Ｊ）外側環状部１２４における凸部１２４ａの外側第２ピッチ：５００ｎｍ以上、１０μｍ以下（好ましくは、７００ｎｍ以上、２μｍ以下）
このような構成により、表面１１１に対して平行な仮想平面と剥離補助部１０２の環状部１２３，１２４とが単位面積当たりに接触する面積は、当該仮想平面と第１凹凸部１４０とが単位面積当たりに接触する面積よりも小さくなる。これにより、細胞シートは、培養部１０１に対する接着力よりも剥離補助部１０２に対する接着力が小さくなる。したがって、細胞シートは、表面１１１の外周縁（剥離開始部位）から剥離が容易となり、損傷しにくくなる。

さらに具体的には、内側第２ピッチは、第１ピッチと同じであるか、第１ピッチよりも大きいことが好ましい。細胞シートは、培養部１０１に対する単位面積当たりの接触面積よりも剥離補助部１０２に対する接触面積が小さくなることで、接触力が弱まる。内側第２ピッチが第１凹凸部１４０の第１ピッチと同じ場合であっても、第１平坦部１３０の外周側に隣接しているときは、内側環状部１２３の細胞シートに対する接触面積が第１平坦部１３０の細胞シートに対する接触面積よりも小さくなることで、接着力が弱まる。これにより、内側環状部１２３の方が第１平坦部１３０よりも細胞シートの接着力が弱まり剥がれ易くなる。内側環状部１２３の凸部１２３ａの内側第２ピッチは、外側環状部１２４の凸部１２４ａの外側第２ピッチよりも小さい。すなわち、外側第２ピッチは、内側第２ピッチよりも大きい。これにより、外側環状部１２４の方が細胞シートに対する単位面積当たりの接触面積が内側環状部１２３よりも小さくなり、細胞シートの接着力が弱まり剥がれ易くなる。

細胞シート形成部材１００の厚み方向において、凹部の底面と凸部１２３ａ，１２４ａの間の長さが凸部１２３ａ，１２４ａの高さである。各凸部１２３ａ，１２４ａの先端面と凸部１４１および第１平坦部１３０とが面一である構成では、細胞シートの平坦性を高めることができる。

［第３細胞シート形成部材］
図４（ａ）および図４（ｂ）に示すように、細胞シート形成部材１００の更なる別の実施形態である第３細胞シート形成部材の剥離補助部１０２は、第２凹凸部１２１として、内側環状部１２５と外側環状部１２６とを備えている。すなわち、第２凹凸部１２１は、培養部１０１を囲む二重の段差構造を有し、内側環状部１２５は、培養部１０１に隣接して位置し、外側環状部１２６は、内側において、内側環状部１２５と隣接し、外側において、細胞シート形成部材１００の外周縁を構成する。

内側環状部１２５および外側環状部１２６の各々の段差構造は、凸部、または、凹部である。内側環状部１２５の段差構造（第２段差構造）は、円錐台形状を有した凸部１２５ａであり、内側環状部１２５は、第１平坦部１３０に対して隣接する凹部と、凹部の底面に位置する複数の凸部１２５ａとを備える。外側環状部１２６の段差構造は、円錐形状を有した凸部１２６ａであり、外側環状部１２６は、凹部の底面に位置する複数の凸部１２６ａを備える。

各凸部１２５ａ，１２６ａは、表面１１１と対向する方向から見て、例えば、三角格子の各頂点に位置する。環状部１２５，１２６の各々は、三角格子の各頂点に凸部１２５ａ，１２６ａが位置するものであれば、凸部１２５ａ，１２６ａを形成するための原盤を、微小な繰り返し構造を形成することに適したマスク、例えば、単粒子膜をマスクとしたエッチング法によって形成することが可能となる。そして、環状部１２５，１２６は、第１凹凸部１４０と同時に形成することができる。

凸部１２５ａのピッチである内側第２ピッチおよび凸部１２６ａのピッチである外側第２ピッチが下記（Ｋ）を満たす構成は、動物細胞、特に上述した筋芽細胞、線維芽細胞、および、心筋細胞の剥離性を高める観点において好適である。

（Ｋ）環状部１２５，１２６における凸部１２５ａ，１２６ａの内側第２ピッチおよび外側第２ピッチ：１００ｎｍ以上、１０μｍ以下（好ましくは、３００ｎｍ以上、１μｍ以下）
このような構成により、表面１１１に対して平行な仮想平面と剥離補助部１０２の環状部１２５，１２６とが単位面積当たりに接触する面積は、当該仮想平面と第１凹凸部１４０とが単位面積当たりに接触する面積よりも小さくなる。これにより、細胞シートは、培養部１０１に対する接着力よりも剥離補助部１０２に対する接着力が小さくなる。したがって、細胞シートは、表面１１１の外周縁（剥離開始部位）から剥離が容易となり、損傷しにくくなる。

さらに具体的には、内側第２ピッチは、第１ピッチと同じであるか、第１ピッチよりも大きいことが好ましい。細胞シートは、培養部１０１に対する単位面積当たりの接触面積よりも剥離補助部１０２に対する接触面積が小さくなることで、接触力が弱まる。内側第２ピッチが第１ピッチと同じ場合であっても、第１平坦部１３０の外周側に隣接しているときは、内側環状部１２５の細胞シートに対する接触面積が第１平坦部１３０の細胞シートに対する接触面積よりも小さくなることで、接着力が弱まる。これにより、内側環状部１２５の方が第１平坦部１３０よりも細胞シートの接着力が弱まり剥がれ易くなる。また、外側環状部１２６は、各凸部１２６ａが円錐形状で、内側環状部１２５は、各凸部１２５ａが円錐台形状である。したがって、内側環状部１２５の方が外側環状部１２４よりも単位面積当たりの接触面積が大きくなる。これにより、外側環状部１２６の方が内側環状部１２５よりも細胞シートが剥がれ易くなる。

細胞シート形成部材１００の厚み方向において、凹部の底面と凸部１２５ａ，１２６ａとの間の長さが凸部１２５ａ，１２６ａの高さである。各凸部１２５ａ，１２６ａの先端面と凸部１４１および第１平坦部１３０とが面一である構成では、細胞シートの平坦性を高めることができる。

［第４細胞シート形成部材］
図５（ａ）および図５（ｂ）に示すように、細胞シート形成部材１００の更なる別の実施形態である第４細胞シート形成部材の剥離補助部１０２は、第２平坦部１２７を備えている。第２平坦部１２７は、平坦面である。細胞シート形成部材１００の厚み方向において、凹部１４２の底面と第２平坦部１２７との間の長さは、第２平坦部１２７の高さである。凹部１４２の底面と第２平坦部１２７の先端面の高低差は、第２平坦部１２７の高さである。各凸部１４１の先端面と第１平坦部１３０と第２平坦部１２７とが面一である構成が好ましい。このような表面１１１は、凸部１２２を形成するための原盤を、微小な繰り返し構造を形成することに適したマスク、例えば、単粒子膜をマスクとしたエッチング法によって形成することが可能となる。そして、第２平坦部１２７は、第１凹凸部１４０と同時に形成することができる。第２平坦部１２７の幅は、０．５ｍｍ以上、２０ｍｍ以下であることが好ましい。

このような構成により、表面１１１に対して平行な仮想平面と剥離補助部１０２の第２平坦部１２７とが単位面積当たりに接触する面積は、当該仮想平面と第１凹凸部１４０とが単位面積当たりに接触する面積よりも大きくなる。これにより、第２平坦部１２７は、一例として、剥離補助部１０２に対する細胞シートの接着力が培養部１０１に対する細胞シートの接着力よりも高くなる。したがって、細胞シートの外周部の強度を高め、細胞シートの外周部を表面１１１から剥がすときに損傷しにくくできる。

なお、剥離補助部１０２は、第２平坦部１２７を段差構造を有する第２凹凸部で構成するようにしてもよい。この場合の第２凹凸部は、第１凹凸部１４０のピッチより小さくして、単位面積当たりの細胞シートとの接触面積が培養部１０１より大きくなるようにしてもよい。このような構成によって、剥離補助部１０２での細胞シートの強度を高めることができる。そして、第２凹凸部を２以上の多重の環状部で構成するときには、外側に位置する環状部が、内側に位置する環状部よりも凹凸構造のピッチ小さくなるように構成する。このような構成によって、表面１１１の縁に近づくほど、細胞シートの強度を高めることができる。

［細胞シート形成部材の製造方法］
次に、細胞シート形成部材の製造方法の一例について説明する。なお、以下の説明では、ナノインプリント法を用いて、細胞シート形成部材の表面１１１を、凹版１５０の転写によって形成する例を説明する。ここでは、一例として、上述した第１細胞シート形成部材（図２（ａ）および図２（ｂ））の製造方法を説明する。

図６に示すように、細胞シート形成部材の製造方法は、凹版１５０を形成する工程と、細胞シート形成部材１００の表面１１１を凹版１５０の転写によって形成する工程とを含む。

凹版１５０の下面は、第１方向（紙面と直交する方向）に延びる形状を有し、かつ、第１方向と交差する第２方向（紙面の左右方向）に並ぶ複数の第１平坦成形部１５１と、相互に隣り合う第１平坦成形部１５１の間を埋める複数の段差構造を有する第１凹凸成形部１５２とを備える。第１平坦成形部１５１は、第１平坦部１３０を形成するための部分であって、第１凹凸成形部１５２は、第１凹凸部１４０を形成するための部分である。さらに、凹版１５０における第１平坦成形部１５１の外側の部分は、剥離補助部１０２を形成する部分であって、図６の例では、第２凹凸部１２１を形成するための第２凹凸成形部１５３を備えている。第１凹凸成形部１５２の凹凸構造は、第１凹凸部１４０の凹凸構造に対応したピッチや高さなどを有している。また、第２凹凸成形部１５３の凹凸構造は、第２凹凸部１２１の凹凸構造に対応したピッチや高さなどを有している。なお、図２示すような第２平坦部１２７を成形するときには、これに対応する第２平坦成形部を凹版１５０の下面に設けることになる。

凹版１５０を形成する工程では、例えば、凹版１５０を形成するためのシリコン基板に対する、フォトリソグラフィー法、コロイダルリソグラフィー法、陽極酸化法、および、干渉露光法の少なくとも１種を用いて、凹凸部が形成される。また、凹版１５０自体を原盤からの１回、あるいは複数回の転写によって得てもよい。原盤には、例えば、シリコン基板に対するフォトリソグラフィー法、コロイダルリソグラフィー法、陽極酸化法、および、干渉露光法の少なくとも１種を用いて凹版１５０の表面形状に対応する形状が作り込まれている。

次に、細胞シート形成部材１００を形成するための基材１６０の表面１１１に、凹版１５０の下面を対向させる。基材１６０の形成材料は、例えば、熱可塑性樹脂や光硬化性樹脂である。そして、基材１６０が流動性を有する状態で、基材１６０の表面１１１に、凹版１５０の下面を押し付ける。次いで、基材１６０の流動性を抑えた状態で、凹版１５０を基材１６０の表面１１１から離型する。これによって、基材１６０の表面１１１に凹版１５０の第１平坦成形部１５１、第１凹凸成形部１５２、および、第２凹凸成形部１５３が転写され、第１平坦部１３０、第１凹凸部１４０、第２凹凸部１２１などが形成される。

基材１６０の形成材料の熱可塑性樹脂や光硬化性樹脂の表面に、細胞の接着性を高めることを目的として、例えば、ラミニン、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ポリーリシン（ＰＤＬまたはＰＬＬ）、ヒアルロン酸などの細胞外マトリックス、ポリマー、ゲルなどの接着因子を含む有機物が塗布されていてもよい。また、基材１６０の形成材料として、多糖類やタンパク質などの生体材料を用いてもよい。

［細胞シートの製造方法］
次に、細胞シート形成部材１００を用いて製造される細胞シートについて説明する。
図７（ａ）に示すように、細胞シート形成部材１００の表面１１１上に位置する細胞懸濁液は、例えば、第１平坦部１３０に接着する細胞Ｓ１を含む。この際、各第１平坦部１３０は、第１凹凸部１４０の長辺方向（第１方向）に延び、各第１平坦部１３０の幅は、一般的な細胞の大きさの１～数倍程度である。そのため、図７（ｂ）に示すように、細胞Ｓ１の位置は、第１平坦部１３０の範囲内に優先的に分布し、細胞Ｓ１は、第１方向に細胞の長軸方向が配置されて直線状に連なる。すなわち、細胞Ｓ１の伸長方向は、第１平坦部１３０の長辺方向と揃うように制御される。図８は、細胞シート形成部材１００を用いて培養した筋芽細胞の一例を示しており、同図に示す例では、筋芽細胞の伸長方向が一方向に揃うように制御されている。

なお、図７（ｃ）に示すように、上記（Ａ）を満たさない細胞シート形成基材では、細胞Ｓ１の配向性が制御されないため、細胞の長軸方向はランダムな方向で配置される。図９は、参考例となる市販の細胞培養シャーレを用いて培養した筋芽細胞の一例を示しており、同図に示す例では、筋芽細胞の伸長方向がランダムに配置されている。

図１０（ａ）に示すように、細胞シート形成部材１００の表面１１１上に位置する細胞懸濁液は、例えば、第１凹凸部１４０に接着する細胞Ｓ２を含む。この際、各第１凹凸部１４０は、第１凹凸部１４０の長辺方向（第１方向）に延び、各第１凹凸部１４０の幅は、一般的な細胞の大きさの１～数倍程度である。そのため、図１０（ｂ）に示すように、細胞Ｓ２は、第１凹凸部１４０の範囲内に優先的に分布し、細胞Ｓ２は、第１方向に細胞の長軸方向が配置されて直線状に連なる。すなわち、細胞Ｓ２の伸長方向は、第１凹凸部１４０の長辺方向と揃うように制御される。

なお、図１０（ｃ）が示すように、上記（Ａ）を満たさない細胞シート形成基材では、細胞Ｓ１の配向性が制御されないため、細胞の長軸方向はランダムな方向で存在する。
一方、上記（Ａ）を満たす細胞シート形成基材では、図１１（ａ）に示すように、細胞シート形成部材１００に保持された細胞懸濁液の細胞が、第１平坦部１３０に対して優先的に接着する細胞Ｓ１であり、第１平坦部１３０よりも劣勢ではあるが、第１凹凸部１４０に対する接着を許容された細胞Ｓ２でもある。あるいは、細胞シート形成部材１００に保持された細胞懸濁液の細胞が、第１凹凸部１４０に対して優先的に接着する細胞Ｓ２であり、第１凹凸部１４０よりも劣勢ではあるが、平坦部１３０に対する接着を許容された細胞Ｓ１でもある。

この場合、図１１（ｂ）に示すように、第１平坦部１３０、および、第１凹凸部１４０は、第１方向に延び、第２方向に交互に配置される。そのため、細胞シート形成部材の表面１１１には、例えば、平坦部１３０に優先的に接着された細胞Ｓ１の配向性が、平坦部１３０の構造、および、それを区画する第１凹凸部１４０の構造によって制御される。

そして、相互に隣り合う平坦部１３０に挟まれた第１凹凸部１４０においては、平坦部１３０よりも劣勢ではあるが、第１凹凸部１４０に接着した細胞Ｓ２にて、平坦部１３０による配向性の制御が反映される。結果として、図１１（ｃ）に示すように、第１方向に配向性の制御された細胞Ｓ１，Ｓ２が、表面１１１の全体に広がる細胞シートＳＡを形成する。

あるいは、第１凹凸部１４０に優先的に接着された細胞Ｓ２の配向性が、第１凹凸部１４０の構造、および、それを区画する第１平坦部１３０の構造によって制御される。そして、相互に隣り合う第１凹凸部１４０に挟まれた第１平坦部１３０においては、第１凹凸部１４０よりも劣勢ではあるが、第１平坦部１３０に接着した細胞Ｓ１にて、第１凹凸部１４０による配向性の制御が反映される。結果として、図１１（ｃ）に示すように、第１方向に配向性の制御された細胞Ｓ１，Ｓ２が、表面１１１の全体に広がる細胞シートＳＡを形成する。

上記実施形態に記載の細胞シート形成部材、細胞シート形成部材の製造方法、および、細胞シートの製造方法における実施例を以下に説明する。
＜実施例１＞
＜細胞シート形成部材の作製＞
図３（ａ）および図３（ｂ）に示す剥離補助部１０２を備えた細胞シート形成部材１００の第１平坦部１３０、第１凹凸部１４０および第２凹凸部１２１の環状部１２３，１２４を転写によって形成するためのニッケル製凹版を作製した。次いで、ニッケル製凹版をスタンパーとして用い、ナノインプリント法によって、温度応答性ポリマー（ＰＩＰＡＡｍ）を基材表面に固定したポリスチレンシートに第１平坦部１３０、第１凹凸部１４０および第２凹凸部１２１の環状部１２３，１２４を加工し、それによって、実施例１の細胞シート形成部材１００を作製した。培養部１０１における各第１平坦部１３０は、第１方向に延びる形状を有し、かつ、第１方向と交差する第２方向に並び、各第１平坦部１３０の幅（第２方向での長さ）は１０μｍであった。第１凹凸部１４０は、相互に隣り合う平坦部１３０の間を埋める複数の段差構造を備え、相互に隣り合う第１平坦部１３０間の第２方向での長さは１０μｍであり、第１凹凸部１４０における凸部１４１のピッチは３００ｎｍであった。第１凹凸部１４０における各凸部の高さはＡＦＭを用いて測定し、凹部の底面から凸部の先端までの高さの平均は、４４６ｎｍであった。また、凹部の底面から第１平坦部１３０までの高さの平均は４５５ｎｍであった。

また、第２凹凸部１２１において、細胞シート形成部材１００の外縁部に位置する外側環状部１２４の幅は、５ｍｍであり、凸部１２４ａの外側第２ピッチは、６００ｎｍであった。外側環状部１２４における各凸部の高さは、ＡＦＭを用いて測定し、凹部の底面から凸部の先端までの高さの平均は、７６３ｎｍであった。外側環状部１２４の内側であって培養部１０１の外側に位置する内側環状部１２３における凸部１２３ａの内側第２ピッチは、３００ｎｍであった。内側環状部１２３における凸部１２３ａの高さは、ＡＦＭを用いて測定し、凹部の底面から凸部の先端までの高さの平均は、４４６ｎｍであった。

そして、実施例１の細胞シート形成部材１００に、温度応答性ポリマーを固定し、ＵＶ照射を行い、この滅菌処理を行った後に、細胞培養試験に使用した。
＜細胞培養試験＞
まず、マウス由来の筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２細胞、ＤＳファーマバイオメディカル社製）を細胞培養用フラスコ（２５ｃｍ^２）で培養した。培養条件は、ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）１
０％添加したＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）を用い、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で行った。細胞の回収にはトリプシンを用い、定法に従い実施した。回収した細胞について血球計算版を用いて細胞数を計測した。

次いで、細胞培養用マルチウェルプレート（４８孔）の底面に、直径８．８ｍｍの円形に裁断した実施例１の細胞シート形成部材１００を設置し、筋芽細胞を１ｍｌずつ播種した。ＣＯ_２インキュベーターで２４時間以上培養した後に培地交換を行い、１日ごとに培地交換を行った。培養開始７日後に、培養した細胞シートを回収した。

細胞シートの回収方法は、まず、培地を細胞が浸る程度を残して除去し、マルチウェルプレートを－２０℃のインキュベーターで３０分静置した。次に、細胞支持体としてＰＤＶＦ膜を細胞シート上に載せ、細胞シートを接着させた。ＰＤＶＦ膜に細胞シートが付着した状態でＰＤＶＦ膜を持ち上げ、コラーゲンゲル上に移動させた。培地を滴下し、ＰＤＶＦ膜のみを取り除いた。回収した細胞シートは、顕微鏡観察により、シートの破れや細胞の脱落が無い事を確認した。

上記実施形態によれば、以下に列挙する効果が得られる。
（１）図２（ａ）～図４（ｂ）に示す細胞シート形成部材１００は、培養部１０１の外側に、第２凹凸部１２１から構成された剥離補助部１０２を備えている。剥離補助部１０２は、細胞シートの接触面積を、培養部１０１に対してよりも小さくすることで、接着力を弱めることができる。これにより、剥離補助部１０２において、細胞シートを剥離し易くできる。こうした第２凹凸部１２１から構成された剥離補助部１０２を備えた細胞シート形成部材１００は、例えば、比較的強い接着性を有する細胞の培養に適する。すなわち、比較的強い接着性を有する細胞シートを剥離する場合であっても、剥離補助部１０２によって、細胞シートの接着力を弱めることができるので、細胞シートが剥離し易くなる。

一方、図５（ａ）および図５（ｂ）に示す細胞シート形成部材１００は、培養部１０１の外側に、第２平坦部１２７からなる剥離補助部１０２を備えている。このように剥離補助部１０２に対する細胞シートの接着力が培養部１０１に対する細胞シートの接着力よりも高くなるようにしたときには、細胞シートの外周部の強度が高められ、細胞シートの外周部を表面１１１から剥がすときに損傷しにくくできる。こうした第２平坦部１２７からなる剥離補助部１０２を備えた細胞シート形成部材１００は、例えば、比較的弱い接着性を有する細胞の培養に適する。弱い接着性を有する細胞では、細胞培養中および細胞シートの回収時（剥離時）に、意図しないタイミングでの細胞の剥離や、細胞シートの破れが生じやすいという課題がある。この点、こうした第２平坦部１２７からなる剥離補助部１０２を備えた細胞シート形成部材１００を用いると、剥離補助部１０２（外周部）の第２平坦部１２７は細胞に対する接着性が比較的高いので、高い力学的強度を有する細胞シートを形成することができ、細胞シートが剥離しやすくなる。

（２）筋芽細胞、線維芽細胞、および、心筋細胞などの配向性を持たせた細胞シートを容易に製造することができ、細胞シートを損傷させることなく細胞シート形成部材１００から容易に剥離することができる。

（３）剥離補助部１０２における第２凹凸部１２１での段差構造の第２ピッチは、第１凹凸部１４０における段差構造の第１ピッチと同じであるか、第２ピッチよりも大きい。これにより、第２凹凸部１２１での細胞シートに対する接触面積は、第１凹凸部１４０での細胞シートに対する接触面積より小さくなり、接着力も低くなる。したがって、細胞シートの外周部が表面１１１から剥がれ易くできる。

（４）図２（ａ）に示す剥離補助部１０２は、培養部１０１を包囲する一重の環状部で構成された第２凹凸部１２１である。したがって、第２凹凸部１２１は、細胞シートの接触面積が培養部１０１に対して小さくなることで、接着力が弱くなる。これにより、剥離補助部１０２において、細胞シートを剥離し易くできる。

（５）図３（ａ）～図４（ｂ）に示す剥離補助部１０２は、培養部１０１を包囲する二重の環状部で構成された第２凹凸部１２１であり、外側に位置する環状部の凹凸構造のピッチは、内側に位置する環状部の凹凸構造のピッチと同じであるか、内側に位置する環状部の凹凸構造のピッチよりも大きい。これにより、剥離補助部１０２においても、外側に向かうほど、細胞シートの接着力を弱めることができる。これにより、剥離補助部１０２において、細胞シートを剥離し易くできる。

（６）基材１６０の表面には、温度応答性ポリマーが塗布されている。これにより、細胞シートの剥離・回収を容易にすることができる。
なお、上記実施形態は、以下のように変更して実施してもよい。

・上述した細胞外マトリックスによるコーティング方法によって配向性を有する三次元組織が構成された細胞シートを形成することもできる。図１２（ａ）～図１２（ｃ）に示すように、この場合、細胞シート形成部材１００の表面１１１上に位置する細胞懸濁液は、細胞接着第１成分を含有する第１溶液と第１成分と相互作用する細胞接着第２成分を含有する第２溶液とを交互にコーティングした培養細胞１を含んでいる。すなわち、図１２（ａ）に示す培養細胞１は、図１２（ｂ）に示すように、接着膜２で被覆されている。接着膜２は、第１成分を含む第１膜２ａと第２成分を含む第２膜２ｂとで構成されている（図１２（ｂ））。第１成分と第２成分との組み合わせは、例えば、インテグリンが結合するアルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）配列を含む高分子とＲＧＤ配列を含む高分子と相互作用をする高分子との組み合わせである。

第１成分を含むＲＧＤ配列を含む高分子は、ＲＧＤ配列を有するタンパク質でもよいし、ＲＧＤ配列が化学的に結合されたタンパク質であってもよい。また、ＲＧＤ配列を有していればよく、タンパク質以外の天然由来高分子であってもよいし、合成高分子であってもよい。タンパク質からなるＲＧＤ配列を含む高分子としては、例えば、従来公知の接着性タンパク質が挙げられ、フィブロネクチン（分子量約５０万）、ビトロネクチン、ラミニン、カドヘリン、コラーゲンなどである。

第２成分を含むＲＧＤ配列を含む高分子と相互作用する高分子としては、ＲＧＤ配列を含む高分子との相互作用により、両物質が、例えば、結合、接着、吸着、電子の授受が可能な程度近接できる物質であれば特に制限されないが、ＲＧＤ配列を含む高分子と相互作用するタンパク質、天然由来高分子及び合成高分子の何れか１種である。ＲＧＤ配列を含む高分子と相互作用するタンパク質としては、例えば、水溶性タンパク質が挙げられ、具体例として、コラーゲン、ゼラチン（一例として分子量１０万）、プロテオグリカン、インテグリン、酵素、抗体などの何れかである。ＲＧＤ配列を含む高分子と相互作用する天然由来高分子としては、例えば、水溶性ポリペプチド、低分子ペプチド、α－ポリリジン，ε－ポリリジン（分子量５千）等のポリアミノ酸、ヘパリンやヘパラン硫酸、デキストラン硫酸（分子量５０万）、ヒアルロン酸（分子量１００万～）などの糖などである。

第１成分と第２成分との組み合わせは、例えば、フィブロネクチンとゼラチン、フィブロネクチンとヘパリン、フィブロネクチンとデキストラン硫酸、および、ラミニンとコラーゲンの何れかである。

次に、三次元組織を備えた細胞シートの製造方法を説明する。
先ず、培養細胞１を用意し、その表面全体を接着膜２で被覆して被覆細胞を作製する。具体的には、用意した培養細胞１を試験管に入れる。

次いで、第１成分を培養細胞１に接触させる。培養細胞と第１成分との接触方法としては、例えば、第１成分を直接添加する方法、第１成分の含有液に細胞を浸漬する方法、培養細胞１に第１成分の含有液を滴下または噴霧する方法などがある。好ましくは、操作が容易であることから浸漬である。接触の条件は、接触方法や使用する含有液の濃度などによって適宜決定できる。具体的には、接触時間は、例えば、１５秒～６０分であり、好ましくは１５秒～１５分、より好ましくは１５秒～５分であり、更に好ましくは１５秒～１分である。接触温度は、特に制限されないが、例えば、４～６０℃であり、好ましくは２０～４０℃、より好ましくは３０～３７℃であり、更に好ましくは３７℃である。

第１成分の含有液を調製する場合、溶媒としては、水や緩衝液などの水性溶媒が挙げられ、緩衝液としては、例えば、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液等のＴｒｉｓ緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、クエン酸－リン酸緩衝液、グリシルグリシン－水酸化ナトリウム緩衝液、Ｂｒｉｔｔｏｎ－Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液、ＧＴＡ緩衝液などが挙げられる。

このようにして培養細胞１を第１成分からなる第１膜２ａにより被覆した後、遊離している第１成分を除去する。第１成分を除去する方法としては、上記の溶媒を用いて遠心分離を行い、培養細胞１と第１成分の含有液とを分離して上澄みを取り除くことで、遊離している第１成分を除去する方法が挙げられる。これにより、第１成分からなる第１膜２ａで被覆された培養細胞１を得ることができる。

接着膜２として、第１成分の第１膜２ａと第２成分からなる第２膜２ｂとからなる積層膜を形成させる場合、第１成分で被覆された培養細胞１を第２成分と接触させることにより、第２成分からなる第２膜２ｂで被覆する。第２成分との接触方法は、第１成分と同様な方法で行うことができ、第２成分の含有液を用いて接触させる場合は、第１成分の含有液を調製する方法と同様にして第２成分の含有液を調製することができる。これにより、第１成分からなる第１膜２ａと、第２成分からなる第２膜２ｂとからなる接着膜２で被覆された培養細胞１が得られる。第１成分の第１膜２ａと第２成分からなる第２膜２ｂとからなる積層膜は、繰り返し被覆をすることで、複数の被覆膜層を形成することが可能である。非腹膜層は、例えば１～２０層であり、好ましくは１～１０層であり、より好ましくは１～５層である。培養細胞１を含む細胞懸濁液は、細胞シート形成部材１００の表面１１１上に滴下され、培養細胞１が播種される。その後、培養細胞１は、培養される。

培養細胞１の三次元細胞シートを完成させるための培養条件は、培養する細胞に応じて適宜決定される。例えば、培養温度が、例えば、４～６０℃であり、好ましくは２０～４０℃、より好ましくは３０～３７℃であり、培養時間は、例えば、１～１６８時間であり、好ましくは３～２４時間、より好ましくは３～１２時間である。これにより、接着膜２を介して、培養細胞１同士を接着させたり、増殖した培養細胞１同士を接着させたりして、三次元組織を有する細胞シート１０を製造することができる（図１２（ｃ）参照。）。

細胞シート１０では、一次元方向に延在した培養細胞に重なるように、一次元方向に延在した他の培養細胞が培養されるため、一次元方向に延在した培養細胞の大きさと形状は、第１方向のみならず、第２方向、および、第１方向と第２方向とに直交する方向において、区々となる。結果として、三次元組織では、第１方向に延在して第２方向で隣り合う培養細胞間が、当該細胞よりも小さく、かつ、第１方向に延在した他の細胞で埋められる。したがって、三次元組織は、表面１１１に隣接する第１面を構成する１層目やその近い位置では、層構造が認められるが、培養細胞１の大きさや形状などのばらつきによって、表面１１１（第１面）から離れ、第１面と対向する第２面に近づくほど層構造は崩れ、培養細胞１の間の隙間に別の培養細胞１が入り込むように積み上がって構成される。配向性を有した三次元組織は、生体に近い状態で細胞を培養することができる。また、図１２（ｄ）に示すように、配向性は、培養細胞１の伸長方向が特定方向である第１方向に対して前記第２方向に傾きを有する。このような配向性を有した三次元組織は、生体に近い状態に細胞が培養されるため、薬剤応答性などを生体に近づけることができる。

・細胞シート形成部材１００の表面１１１は、細胞の接着性を高めることを目的として、例えば、ラミニン、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ポリーリシン（ＰＤＬまたはＰＬＬ）、ヒアルロン酸などの細胞外マトリックス、ポリマー、ゲル等の接着因子を含む有機物が塗布されてもよく、あるいは、金属から構成される面であってもよい。また、細胞シート形成部材１００の表面１１１は、細胞の接着性や細胞シートの平坦性を高めることを目的として、親水性、あるいは、疎水性を有してもよい。

・細胞懸濁液中には、細胞外基質産生促進因子を添加するようにしてもよい。細胞外基質産生促進因子としては、例えば、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β３、アスコルビン酸、アスコルビン酸２リン酸またはその誘導体あるいはそれらの塩を挙げることができる。コラーゲン産生の観点から、アスコルビン酸、アスコルビン酸２リン酸またはそれらの誘導体およびその塩（例えば、ナトリウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩など）とすることが好ましい。アスコルビン酸としては、Ｌ体であることが好ましい。

［細胞シート形成部材の培養部］
・凸部１４１の有する形状は、円錐や角錐などの錐状、円柱や角柱などの柱状、円錐台や角錐台などの錐台状、および、半球状の何れか１種とすることが可能である。

・凸部１４１の位置は、四角格子上の各格子点、六角格子上の各格子点、さらには、第１凹凸部１４０において不規則とすることも可能である。
・第１凹凸部１４０の有する形状は、第１方向に延びる直線状に限らず、第１方向に延びる折れ線状や、第１方向に延びる曲線状に変更することも可能である。

・第１凹凸部１４０の底面と平坦部１３０とを面一に変更すること、すなわち、凸部１４１の基端部と第１平坦部１３０とを面一に変更することも可能である。なお、上述したように、第１凹凸部１４０の先端面と第１平坦部１３０とを面一とする構成は、細胞シートの平坦性を高める観点において好適である。

・第１凹凸部１４０を構成する段差構造を、凹部に変更することも可能であり、凹部と凸部との両方に変更することも可能である。例えば、第１凹凸部１４０は、第１平坦部１３０に連続する１つの側面を備え、該側面に複数の凹部が形成された構造に変更することも可能である。

・１つの第１凹凸部１４０の幅と、他の第１凹凸部１４０の幅とは、相互に異なる構成であってもよいし、相互に等しい構成であってもよい。なお、１つの第１凹凸部１４０の幅と、他の第１凹凸部１４０の幅とが、相互に等しい構成であれば、細胞シートが有する特性について、第２方向での均一性を高めることが可能となる。

・１つの第１平坦部１３０の幅と、他の第１平坦部１３０の幅とは、相互に異なる構成であってもよいし、相互に等しい構成であってもよい。なお、１つの第１平坦部１３０の幅と、他の第１平坦部１３０の幅とが、相互に等しい構成であれば、細胞シートが有する特性について、第２方向での均一性を高めることが可能となる。

・第１平坦部１３０の幅と、第１凹凸部１４０の幅とは、相互に異なる構成であってもよいし、相互に等しい構成であってもよい。例えば、細胞の接着が第１平坦部１３０において優勢である場合、第１平坦部１３０の幅は、配向性を制御できる範囲であって、かつ、第１凹凸部１４０の幅よりも大きいことが好適である。また、細胞の接着が第１凹凸部１４０において優勢である場合、第１凹凸部１４０の幅は、配向性を制御できる範囲であって、かつ、第１平坦部１３０の幅よりも大きいことが好適である。

・第１平坦部１３０と第１凹凸部１４０とが交互に並ぶ第２方向は、第１方向と直交する方向に限らず、第１方向と交差する方向であれば、例えば、第１方向と形成する角度が４５°である方向とすることも可能である。

・細胞シート形成部材は、凹版を用いた転写体に限らず、凸版を用いた転写体であってもよく、さらに、射出成形による成形体とすることも可能である。すなわち、射出成形を用いて細胞シート成形部材を製造することも可能である。

［細胞シート形成部材の剥離補助部］
・第２凹凸部１２１において、凸部の高さは、５０ｎｍ以上、５μｍ以下であることが好ましい。また、凸部のアスペクト比は、０．１以上、１０以下であることが好ましい。このような構成は、第２凹凸部１２１の構造上での安定性を高められる観点、また、第２凹凸部１２１の形成を容易なものとする観点において好適である。

・第２凹凸部１２１において、凸部の有する形状は、円錐や角錐などの錐状、円柱や角柱などの柱状、円錐台や角錐台などの錐台状、および、半球状の何れか１種とすることが可能である。

・第２凹凸部１２１において、凸部の位置は、四角格子上の各格子点、六角格子上の各格子点、さらには、第１凹凸部１４０において不規則とすることも可能である。
・第２凹凸部１２１の高さは、第１平坦部１３０および／または第１凹凸部１４０の高さと同じであってもよいし、高くてもよいし、低くてもよい。培養部１０１と剥離補助部１０２との間に高低差を形成する場合には、高低差が形成された位置およびその周辺で、隙間が形成され易く、細胞シートと表面１１１との接着力を弱めることが可能となる。

・剥離補助部１０２における第２凹凸部１２１は、３重以上の環状部で構成してもよい。この場合外周の環状部になるほど、段差構造のピッチを大きくするようにして、接着力を弱めていくことが好ましい。なお、隣接する環状部における段差構造において、ピッチが同じで箇所があってもよい。

［その他］
・細胞シート形成部材は、マルチウェルプレート、シャーレ、フラスコ、チェンバースライドなど、細胞懸濁液を保持可能なものであれば、それに適用することができる。

１…培養細胞、２…接着膜、２ａ…第１膜、２ｂ…第２膜、１０…細胞シート、１００…細胞シート形成部材、１０１…培養部、１０２…剥離補助部、１１０…培養皿、１１１…表面、１２０…蓋、１２１…第２凹凸部、１２２…凸部、１２３…内側環状部、１２３ａ…凸部、１２４…外側環状部、１２４ａ…凸部、１２５…内側環状部、１２５ａ…凸部、１２６…外側環状部、１２６ａ…凸部、１２７…第２平坦部、１３０…第１平坦部、１４０…第１凹凸部、１４１…凸部、１４２…凹部、１５０…凹版、１５１…第１平坦成形部、１５２…第１凹凸成形部、１５３…第２凹凸成形部、１６０…基材。

Claims (9)

1. 細胞シートを形成するための表面を備え、
   前記表面は、細胞を培養する培養部と、前記培養部に対して外側に位置し、前記細胞シートの前記表面からの剥離開始部位を形成する剥離補助部とを備え、
   前記培養部は、複数の第１平坦部と、複数の第１凹凸部とを備え、
   前記第１平坦部の各々は、第１方向に延びる形状を有し、かつ、前記第１平坦部は、前記第１方向と交差する第２方向に並び、
   前記第１凹凸部の各々は、相互に隣り合う前記第１平坦部の間を埋める第１段差構造を備え、前記第１段差構造は、第１ピッチで配置された凸部から構成されており、
   前記剥離補助部は、第２ピッチで配置された凸部から構成された第２段差構造を備えた第２凹凸部、または、第２平坦部で構成されており、
   前記第１ピッチは、１０ｎｍ以上、１０μｍ以下であり、
   前記第２ピッチは、１００ｎｍ以上、１０μｍ以下である、
   細胞シート形成部材。
2. 前記細胞シート形成部材において培養される細胞は、筋芽細胞、線維芽細胞、および、心筋細胞からなる群から選ばれた少なくとも１種である
   請求項１に記載の細胞シート形成部材。
3. 前記剥離補助部は、前記培養部を包囲する一重の環状部である
   請求項１または２に記載の細胞シート形成部材。
4. 前記剥離補助部は、第２ピッチで配置された凸部から構成された第２段差構造を備えた第２凹凸部で構成されており、
   前記剥離補助部は、前記培養部を包囲する２重以上の環状部であって、
   外側に位置する環状部は、内側に位置する環状部と同じか、前記内側に位置する環状部よりも大きなピッチを有する凹凸構造を備える
   請求項１または２に記載の細胞シート形成部材。
5. 前記表面には、温度応答性ポリマーが塗布されている
   請求項１ないし４のうち何れか１項に記載の細胞シート形成部材。
6. 細胞シートを形成するための表面を備え、
   前記表面は、細胞を培養する培養部と、前記表面の縁に位置して前記細胞シートの前記表面からの剥離開始部位を形成する剥離補助部とを備え、
   前記培養部は、複数の第１平坦部と、複数の第１凹凸部とを備え、
   前記第１平坦部の各々は、第１方向に延びる形状を有し、かつ、前記第１平坦部は、前記第１方向と交差する第２方向に並び、
   前記第１凹凸部の各々は、相互に隣り合う前記第１平坦部の間を埋める第１段差構造を備え、前記第１段差構造は、第１ピッチで配置された凸部から構成されており、
   前記剥離補助部は、第２ピッチで配置された凸部から構成された第２段差構造を備えた第２凹凸部、または、第２平坦部で構成されており、
   前記第１ピッチは、１０ｎｍ以上、１０μｍ以下であり、
   前記第２ピッチは、１００ｎｍ以上、１０μｍ以下であり、
   前記表面に対して平行な仮想平面と前記剥離補助部とが単位面積当たりに接触する面積は、前記仮想平面と前記第１凹凸部とが単位面積当たりに接触する面積よりも小さい
   細胞シート形成部材。
7. 細胞シートを形成するための表面を備え、
   前記表面は、細胞を培養する培養部と、前記表面の縁に位置して前記細胞シートの前記表面からの剥離開始部位を形成する剥離補助部とを備え、
   前記培養部は、複数の第１平坦部と、複数の第１凹凸部とを備え、
   前記第１平坦部の各々は、第１方向に延びる形状を有し、かつ、前記第１平坦部は、前記第１方向と交差する第２方向に並び、
   前記第１凹凸部の各々は、相互に隣り合う前記第１平坦部の間を埋める第１段差構造を備え、前記第１段差構造は、第１ピッチで配置された凸部から構成されており、
   前記剥離補助部は、第２ピッチで配置された凸部から構成された第２段差構造を備えた第２凹凸部、または、第２平坦部で構成されており、
   前記第１ピッチは、１０ｎｍ以上、１０μｍ以下であり、
   前記第２ピッチは、１００ｎｍ以上、１０μｍ以下であり、
   前記表面に対して平行な仮想平面と前記剥離補助部とが単位面積当たりに接触する面積は、前記仮想平面と前記第１凹凸部とが単位面積当たりに接触する面積よりも大きい
   細胞シート形成部材。
8. 凹版を形成することと、
   細胞シートを形成するための細胞シート形成部材の表面を前記凹版の転写によって形成することと、を含み、
   前記表面は、細胞を培養する培養部と、前記培養部に対して外側に位置し、前記細胞シートの前記表面からの剥離開始部位を形成する剥離補助部とを備え、
   前記培養部は、複数の第１平坦部と、複数の第１凹凸部とを備え、
   前記第１平坦部の各々は、第１方向に延びる形状を有し、かつ、前記第１平坦部は、前記第１方向と交差する第２方向に並び、
   前記第１凹凸部の各々は、相互に隣り合う前記第１平坦部の間を埋める第１段差構造を備え、前記第１段差構造は、第１ピッチで配置された凸部から構成されており、
   前記剥離補助部は、第２ピッチで配置された凸部で構成された第２段差構造を備えた第２凹凸部、または、第２平坦部で構成されており、
   前記凹版は、前記第１平坦部を成形する第１平坦成形部と、
   前記第１凹凸部を成形する第１凹凸成形部と、
   前記第２凹凸部または前記第２平坦部を成形する第２成形部とを備え、
   前記第１ピッチは、１０ｎｍ以上、１０μｍ以下であり、
   前記第２ピッチは、１００ｎｍ以上、１０μｍ以下であり、
   前記凹版を形成することは、前記第１平坦成形部、前記第１凹凸成形部、および、前記第２成形部を、フォトリソグラフィー法、コロイダルリソグラフィー法、陽極酸化法、および、干渉露光法の少なくとも１種を用いて形成することを含む、
   細胞シート形成部材の製造方法。
9. 請求項１ないし７のうち何れか１項に記載の細胞シート形成部材を用い、前記第１平坦部および前記第１凹凸部の何れか一方に対する接着が他方に対する接着よりも優勢である細胞を前記細胞シート形成部材の表面に接着させて、前記細胞シート形成部材の表面に細胞シートを形成することと、
   前記細胞シート形成部材の前記剥離補助部上の前記剥離開始部位から前記細胞シートを前記表面から剥離することと、を含む
   細胞シートの製造方法。

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