JP7216424B2 - 新規の抗TrkB抗体 - Google Patents
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Description
[0051]用語「抗体」は、本明細書で使用される場合、あらゆる免疫グロブリン、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多価抗体、多重特異性抗体、または二重特異性(2価)抗体、または特異的な抗原に結合するそれらの機能的な部分を包含する。自然の無傷抗体は、ジスルフィド結合で相互に接続された2つの重(H)鎖および2つの軽(L)鎖を含む。各重鎖は、可変領域(VH)および第1、第2、および第3の定常領域(それぞれCH1、CH2およびCH3)からなり、一方で各軽鎖は、可変領域(VL)および定常領域(CL)からなる。哺乳類重鎖は、α、δ、ε、γ、およびμとして分類され、哺乳類軽鎖は、λまたはκとして分類される。軽鎖および重鎖の可変領域は、抗原結合に関与する。両方の鎖の可変領域はさらに、一般的に、相補性決定領域(CDR)と呼ばれる超可変性を有する3つの領域に分割される(軽(L)鎖CDRは、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含み、重(H)鎖CDRは、HCDR1、HCDR2、HCDR3を含む)。本明細書で開示される抗体および抗原結合フラグメントのCDRの境界は、Kabat、Chothia、またはAl-Lazikaniの慣例によって定義または同定することができる(Al-Lazikani, B.、Chothia, C.、Lesk, A. M.、J. Mol. Biol.、273(4)、927(1997);Chothia, C.ら、J Mol Biol. 12月5日;186(3):651~63(1985);Chothia, C.およびLesk, A.M.、J.Mol.Biol.、196,901 (1987);Chothia, C.ら、Nature. Dec 21-28;342(6252):877-83(1989);Kabat E.A.ら、National Institutes of Health、メリーランド州ベセスダ(1991))。3つのCDRは、フレームワーク領域(FR)として公知の両端のストレッチ間に挿入されており、このフレームワーク領域は、CDRより高度に保存されており、高度可変ループを支持するための足場を形成する。それゆえに、各VHおよびVLは、以下の順番(アミノ酸残基のN末端からC末端にかけて):FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の、3つのCDRと4つのFRとで構成される。重鎖および軽鎖の定常領域は抗原結合に関与しないが、様々なエフェクター機能を呈示する。抗体は、それぞれα、δ、ε、γ、およびμ重鎖の存在を特徴とするそれらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列に基づく5つの主要なクラス:IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMに割り当てられる。主要な抗体クラスのうちいくつかのサブクラスは、例えばIgG1(γ1重鎖)、IgG2(γ2重鎖)、IgG3(γ3重鎖)、IgG4(γ4重鎖)、IgA1(α1重鎖)、またはIgA2(α2重鎖)である。
[0056]抗体に関する「Fc」は、ジスルフィド結合を介して第2の重鎖の第2および第3の定常領域に結合した、第1の重鎖の第2および第3の定常領域からなる抗体の一部を指す。IgGおよびIgMFc領域は、3つの重鎖定常領域(各鎖において第2、第3および第4の重鎖定常領域)を含有する。これは、抗体のパパイン消化により得ることができる。抗体のFc部分は、ADCCやCDCなどの様々なエフェクター機能に関与するが、抗原結合において機能しない。
[0060]「単一ドメイン抗体(sdAb)」、例えば「ラクダ単一ドメイン抗体」、「重鎖抗体」、「ナノボディ」、「HCAb」または「VNAR」は、12~15kDaの低い分子量を有する、2つのVHドメインを含有し軽鎖を含有しない抗体を指す(Riechmann L.およびMuyldermans S.、J Immunol Methods. 12月10日;231(1~2):25~38(1999); Muyldermans S.、J Biotechnol. Jun;74(4):277~302(2001);WO94/04678;WO94/25591;米国特許第6,005,079号)。重鎖抗体は元々、ラクダ科動物(ラクダ、ヒトコブラクダ、およびラマ、VHH)、サメ種(新しい抗原受容体の可変ドメイン(VNAR))、または特異的な以下の突然変異:F37、E44、R45、およびF47を有するヒト抗体から得た。ヒトVH/VL単一ドメイン抗体は、再配列されたVH/VLドメインの合成ランダム化を介して構築されたファージディスプレイによって、操作された抗体ドメインライブラリーから単離することができる(Henry KAら、Stability-Diversity Tradeoffs Impose Fundamental Constraints on Selection of Synthetic Human VH/VL Single-Domain Antibodies from In Vitro Display Libraries. Front Immunol. 2017年12月12日;8:1759)。したがって単一ドメイン抗体は、少なくとも4つのフレームワーク領域を含有し、それらの間に3つの高度可変CDR領域が存在することから、結果として以下の典型的な抗体可変ドメイン構造になる:FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。単一のドメインは、軽鎖抗体可変領域と相互作用して、重鎖および軽鎖抗原結合VII構造の従来のヘテロ二量体を形成しない。
[0075]「TrkB-agoAb202」は、本明細書で使用される場合、配列番号12(CDR1)、配列番号13(CDR2)、配列番号14(CDR3)の3つの重鎖可変領域のCDRと、配列番号9(CDR1)、配列番号10(CDR2)、配列番号11(CDR3)の3つの軽鎖可変領域のCDRとを有するウサギモノクローナル抗体を指す。TrkB-agoAb202は、TrkBタンパク質のD1ドメインに結合する。
[00101]ニューロトロフィンファミリーのメンバーは、高度に相同な二量体の増殖因子であり、神経成長因子(NGF)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、ニューロトロフィン-3(NT-3)、ニューロトロフィン-4/5(NT-4/5)などがある(McAllisterら、1999)。ニューロトロフィンは、多様な機能を有する。細胞におけるニューロトロフィンの合成プロセス中、ニューロトロフィンは、最初に前駆体(プロニューロトロフィン)として合成され、それらが切断されて成熟ニューロトロフィンが生産され、これがTrk受容体チロシンキナーゼを活性化することによってニューロンの生存を促進し、シナプス可塑性を強化する(NagappanおよびLu、2005)。プロニューロトロフィンは、p75NTR(p75神経栄養因子受容体、p75NTR)と結合することにより細胞のアポトーシスを引き起こす傾向がある(Wooら、2005)。全ての他のチロシンキナーゼ受容体のように、Trk受容体は、二量体化を介して活性化され、それにより細胞内チロシン残基の自己リン酸化が生じ、シグナル伝達カスケードが開始される。Trkによって活性化されたシグナル伝達経路は、Ras/細胞外調節キナーゼ(Erk)経路、ホスファチジルイノシトール-3キナーゼ(PI3キナーゼ)/Akt経路およびPLCγ/PKC経路を包含する(HuangおよびReichardt、2001;KaplanおよびMiller、2000)。
[00105]BDNFによるTrkBの活性化シグナル伝達経路は神経分化誘導性の機能を有するにもかかわらず、BDNFは、同時にp75NTRにも多少の親和性を有する。この受容体の活性化は、JNKを含む下流因子の活性化をもたらし、細胞傷害性を引き起こすことになり、したがって細胞死を誘導することができる。加えて、BDNFそのものの生化学的性質は、非常に不安定である。その血漿半減期は、わずか約10分である。工業的生産に関して、BDNFの調製は、かなりの費用を要する。それゆえに、BDNF二量体がその受容体の二量体化および自己リン酸化を媒介するメカニズムによれば、抗体分子(主としてIgG)も同様に2価である(2つの同じFabドメインを有する)ことから、それらは類似の活性化を達成することができる。1996年に、Lucidi-Phillipiらが最初に、動物において抗TrkAポリクローナル抗体がTrkAを活性化し、コリン作動性ニューロンの致死を阻害できることを報告した(Lucidi-Phillipiら、1996)。同じ年に、LeSauteurは、TrkAのモノクローナル抗体を報告した。この抗ヒトTrkA抗体はNGFドッキング部位を認識し、TrkAとその下流分子PI3-Kと結合し、それらを活性化する(LeSauteurら、1996)。Qianらは最初に、TrkB抗体アゴニストの発生を報告した。研究者によってスクリーニングされた5つのモノクローナル抗体のなかでも、TrkBが各抗体に結合する部位は異なっていたが、それらは全て、程度は異なるが細胞生存および軸索突起の伸長を促進することができた。より重要なことに、これらの抗体はp75NTRを活性化しない(Qianら、2006)。これらの抗体の1つとして、29D7が、様々な神経疾患において治療作用を有することが見出されている。Katsukiは、29D7を硝子体に入れることによって、視神経のダメージの外科手術中における網膜神経節細胞の死を低減できることを見出した(Huら、2010)。新生児ラットの低酸素虚血性の外科手術後、29D7は、細胞死を低減し、感覚運動機能の長期回復を促進することができることから、脳性麻痺を有する子供への臨床的な治療に有意である(Kimら、2014)。加えてToddは、29D7が、突然変異ハンチンチンタンパク質によって引き起こされる線条体細胞の障害を低減させることができることを証明したことから(Toddら、2014)、29D7は、ハンチントン病の治療における見込みのある薬物になりつつある。
[00124]本発明の開示は、TrkBアゴニスト抗体およびその抗原結合フラグメントをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。特定の実施態様において、単離されたポリヌクレオチドは、本発明の開示において提供されるCDR配列をコードする1つまたはそれより多くのヌクレオチド配列を含む。
[00136]本発明の開示は、さらに別の形態において、本明細書で提供されるTrkBアゴニスト抗体もしくはその抗原結合フラグメント、またはTrkBアゴニスト抗体もしくはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を含むキットを提供する。一部の実施態様において、キットは、生体サンプル中のTrkBの存在またはレベルを検出するのに有用である。生体サンプルは、細胞または組織を含んでいてもよい。
[00140]本発明の開示はさらに、TrkBアゴニスト抗体またはその抗原結合フラグメントおよび1種またはそれより多くの医薬的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
[00159]特定の視神経症としては、緑内障(例えば開放角緑内障、広隅角緑内障、閉塞隅角緑内障(急性および慢性)、正常眼圧緑内障)、前部虚血性視神経症(AION)(例えば、非動脈炎性虚血性視神経症(NAION))、後部虚血性視神経症、放射線視神経症、圧迫性視神経症(例えば、乳頭浮腫)、浸潤性視神経症、外傷性視神経症、ミトコンドリア性視神経症、中毒性視神経症、遺伝性視神経症(例えば、常染色体優性視神経萎縮症(ADOA;Kjer型の視神経萎縮症)、レーバー遺伝性視神経症、ローゼンバーグ-チュトリアン症候群、ウォルフラム症候群、視神経形成不全)、視神経炎(例えば、視神経脊髄炎、乳頭炎)が挙げられる。網膜変性性障害としては、遺伝性のジストロフィー(例えば網膜色素変性症)、または加齢性黄斑変性症(滲出型およびドライ型)などの後天性の状態が挙げられる。一実施態様において、視神経症としては、例えば、網膜神経節細胞(RGC)および/または視神経に影響を与える状態が挙げられる。特定の視神経症としては、緑内障(例えば開放角緑内障、広隅角緑内障、原発性閉塞隅角緑内障、正常眼圧緑内障)、前部虚血性視神経症(AION)、非動脈炎性(non-anterior)虚血性視神経症(NAION)、外傷性視神経症およびレーバー遺伝性視神経症が挙げられる。網膜変性性障害としては、加齢性黄斑変性症(滲出型およびドライ型)などの遺伝性または後天性の状態が挙げられる。
[00162]他のCNS障害としては、糖尿病性神経障害、てんかん、多発性硬化症、片頭痛、神経傷害(例えば外傷性脳傷害(TBI)、脊髄の傷害および末梢神経傷害)、末梢神経障害、神経筋疾患(例えば重症筋無力症および筋無力症症候群)、睡眠障害および卒中が挙げられる。一例において、末梢神経障害としては、化学療法誘発性末梢神経障害(CIPN)が挙げられる。CIPNは、多くの抗がん薬の主要な用量を制限する副作用である。
[00164]現在、神経変性疾患の病因は、遺伝子レベルでおよそ2種に分けることができる:一方の病因は、毒素の蓄積を引き起こす病原性の遺伝子突然変異であり、他方は、自己修復能力を有する遺伝子の突然変異または調節障害である。現在の神経変性疾患研究は、疾患の病因、すなわちいかにしてニューロンの死を引き起こす神経毒を低減させるかに注目する傾向がある。しかしながら、この概念に基づいて老人性認知症を治療するための医薬開発は、近年の5つの大規模III相臨床試験を含め、全て失敗に終わっている(KarranおよびHardy、2014;Mullard、2012)。主な理由は、薬物が標的とするのは病原性の毒素である点である。しかしながら、疾患の症状が現れると、毒素は、数年間、または何十年にもわたりニューロンに毒の作用を与え続け、ニューロンは、深刻なダメージを受け、または死に至ることさえある。そのときになって毒素を低減させても遅すぎる。新しいアプローチは、疾患の症状に直接関連する病態生理学を研究することである(Luら、2013a)。これまで、シナプスの損失は、神経変性疾患において共通する主要な病態生理学的特徴であり、脳の認知機能のダメージを引き起こし、その一方でニューロンは次第に致死し、それにより、より重篤な認知能力の損失に加えて他の状態も生じる。疾患の生理学的プロセスにおける前者は、可逆的であるため、治療が簡単である。したがって、シナプス修復は、アルツハイマー病の治療を研究するための最も現実的な入り口の1つである(Shengら、2012)。
[00166]筋萎縮性側索硬化症(ALS)は、最も一般的なタイプの運動ニューロン疾患(MND)であり、上位および下位運動ニューロンの両方が影響を受ける(WijesekeraおよびLeigh、2009)。病理学的に言えば、ALS患者は、脊髄前角、脳幹および運動皮質における運動ニューロン数の減少を示す。運動ニューロンの損失は、筋肉の除神経および萎縮を引き起こす。患者は、筋力低下および嚥下困難を含む運動機能の進行性消失を特徴とし、最終的に呼吸不全で死亡する(Boilleeら、2006;MitchellおよびBorasio、2007)。ALSのケースの大半は散在性であり、5~10%は家族性のケースである。SOD1は、最初に同定されたALS関連の遺伝子であり、その突然変異が、20%もの家族性のケースの原因となっている(Rosen、1993)。これまで、20種を超える遺伝子が、突然変異すると家族性ALSの原因を引き起こすことが見出されており、遺伝子の突然変異は、散在性のケースでも確認されている(Couthouisら、2011;WijesekeraおよびLeigh、2009)。遺伝学的な不均質性はあるが、罹患した領域におけるタンパク質沈着は、ALSに共通する一般的特徴である。
[00170]緑内障は、視神経乳頭(視神経円板)および視神経における病理学的変化を伴う神経変性性眼疾患であり、典型的には視野の損失およびIOP上昇を伴う(NICE、2009)。緑内障は、過去30年にわたり世界的に失明の主な原因であってきた(DandonaおよびDandona、2006;Quigley、1996;QuigleyおよびBroman、2006)。英国における失明登録のおよそ10%は、緑内障が原因である(Cassonら、2012;NICE、2009)。疫学分野では、緑内障患者人口は急速に増えつつあり(図2および表1)、社会が急速に高齢化し、情報化時代において眼精疲労の罹患率が増加している。中国における緑内障患者の総推定数は、2020年代には約2180万人に達すると予想され、これは中国の40歳を超える全人口の3.05%にあたり、世界平均の2.86%を超えることになる。緑内障性によるRGCおよび視神経のダメージは回復不能であるため、あらゆる種類の緑内障が、最終的に失明に至る可能性が極めて高い。しかしながら今日の中国における医療状況によれば、ほとんどの人は、健康保険がないために、早期段階の緑内障の状態で自身の目を検査するために病院に行くことはない。したがって、医療状況および緑内障の進行性失明に基づき、中国における緑内障患者の増加は、家族と社会に莫大な重荷を科すことになる。本発明者らの究極的な目的は、従来の臨床療法では緑内障の進行が回復不能であると考えられてきた後期段階の緑内障において、緑内障の進行性の失明の進行を遅くし回復させ、さらにダメージを受けたRGCおよび軸索を再生するために、神経向性経路を標的化する有効な医薬または抗体を探索することである。
[00174]卒中は、脳血管の破裂または凝固によって引き起こされる神経血管疾患である。これは世界的な健康問題であり、中国では第一の死因である。毎年、約250万人が卒中になり、160万より多くの人がこの疾患により死亡する。脳の毛細血管の高い密度のために、卒中は脳のあらゆる領域で起こる可能性があり、それにより様々な続発症が生じ、なかでも最も一般的なによく見られるのは片麻痺である。したがって、この疾患の治療に関する調査は、緊急の必要性がある。
[00177]本発明の開示はさらに、TrkBアゴニスト抗体またはその抗原結合フラグメントを使用する方法を提供する。
[00185]1.ハイブリドーマ技術によるマウスモノクローナル抗体の生産
[00186](1)抗原の調製
[00187]TrkB細胞外ドメインのコード配列をシグナルペプチドを含有するPfastbacベクターにクローニングし、昆虫sf9細胞株を使用してタンパク質を精製した。異なるタグを有する2種のタンパク質:動物を免疫化するためのTrkB-ECD-hFc、およびスクリーニング抗原として使用されるTrkB-ECD-Hisを調製した。
[00189]抗原(組換えTrkB-ECD-hFc)をDPBS中で溶解し、これを使用して、全ての注射につき皮下経路を介して約6~8週齢のBALB/Cマウスを免疫化した。迅速な免疫化手順中、これらのマウスを約8回免疫化した。
[00191]免疫化後、タイターELISA試験によって動物を収集のために選択した。簡単に言えば、免疫化されたマウスまたはナイーブマウスからの血清を、TrkB-ECD-hisタンパク質でコーティングされたELISAプレートに添加した。各マウスのタイターを、450nmでの光学密度から決定した。免疫化されたマウスを致死させ、リンパ節を収集した。このリンパ系細胞をDMEM中に懸濁し、その後、骨髄腫細胞株Sp2/0-Ag14と融合させた。
[00193]リンパ系細胞を、PEG(P7306、シグマ)の媒介によりSp2/0-Ag14と融合した。次いで融合した細胞をHAT選択培地(21060-017、ギブコ)中に懸濁した。ハイブリドーマは、無限増殖能力での選択培地に耐性を有し得るものであった。7日目または10日目に、2分の1の培地を交換した。
[00195]選択培養の約14日の後、ハイブリドーマ上清をTrkB特異的なモノクローナル抗体に関してスクリーニングした。抗体の親和性を分析するのにELISAを使用し、活性TrkBアゴニストを選択するのにNFATアッセイを使用した。陽性細胞プールの選択の後、サブクローニングを古典的な限界希釈によって行った。
[00197]ELISAキット(BAT0296、シノ(Sino))を使用して、モノクローナル抗体のアイソタイプを同定した。5’RACEキット(カタログ番号634858および634859、クロンテック(Clontech))を用いてハイブリドーマのシーケンシングを実行した。
[00199]抗原(組換えヒトTrkB-ECD)をDPBS中に溶解し、これを使用して、全ての注射につき皮下経路を介して約6~8週齢のウサギを免疫化した。免疫化後、タイターELISA試験によって動物をB細胞調製のために選択した。免疫化したウサギを致死させ、リンパ節を収集した。軽(V-L)および重(V-H)鎖の再配列された可変ドメインのコンビナトリアルクローニングによって、免疫化されたウサギのB細胞免疫グロブリンレパートリーを不死化し、これを酵母に導入し、酵母表面上に単鎖FV(scFV)として提示させた。FACSを用いたscFV抗体の親和性選択を行い、続いてそれらをIgG抗体の完全なテンプレートに再構成した。NFATアッセイを用いて、アゴニスト抗体に関するさらなるスクリーニングすることを行った。例示的なウサギモノクローナル抗体は、TrkB-agoAb202およびTrkB-agoAb203である。
[00201]ヒトTrkB遺伝子(受託番号S76473.1)のTrkB-ECD430の遺伝子フラグメント(30~430のアミノ酸配列、すなわち全長細胞外ドメインに相当)およびTrkB-ECD365(30~365のアミノ酸配列、細胞外の膜近傍(EJM)領域を含まない細胞外ドメインのD1~D5に相当)を、C末端に6×Hisタグを有するpFastBacデュアルにクローニングした。上記のTrkB-ECD遺伝子を含有するバキュロウイルスを、インビトロジェン(Invitrogen)からのBac-to-Bacシステムを使用して生産した。SF9細胞に感染させた後、培養物をMSF1培地中で27℃でインキュベートした。
[00204]実験を、CHO-hTrkB NFATキット(K1095、ライフテクノロジーズ(Life Technologies))によって提供されたプロトコールに従って行った。実験の前の日に、CHO-hTrkB細胞(K1435、ライフテクノロジーズ)を384-ウェルプレート中に32μlの培地と共にシーディングした。37℃でのBDNFまたはTrkB-AgoAb処理の5時間後、培養物を8μl基質と共に室温で2時間インキュベートした。マイクロプレートリーダー(エンヴィジョン(Envision)、パーキンエルマー(PerkinElmer))を用いてシグナルを得た。
[00206]これまでに記載されたようにして細胞を溶解させた。白色の不透明なプレート中で、10μlのドナービーズ(6760617M、パーキンエルマー)および10μlのビオチン化抗TrkBモノクローナル抗体(BAF397、R&D)を各ウェルに添加し、薄明かりの下、37℃で30分インキュベートした。10μlの溶解産物、10μlの抗TrkB抗体(ab51187、アブカム(Abcam))および10μlのアクセプタービーズ(6760617M、パーキンエルマー)を調和のとれたウェルに添加し、薄明かりの下、37℃で1時間インキュベートした。エンヴィジョン(パーキンエルマー)を用いてシグナルを測定し、その後分析した。
[00208]炭酸緩衝液(pH9.2)中の抗pTrkB抗体(4621S、CST)を、マイクロプレート-96ウェル(163320、ヌンク(NUNC))にコーティングする。プレートを4℃で一晩インキュベートする。プレートを2回洗浄する。プレートをブロッキング緩衝液で37℃で2時間ブロックする。次いでプレートをPBSTで2回洗浄する。
[00211]超音波をかけながらPBS中でCM5チップを洗浄する。候補抗体および標的タンパク質の緩衝液を同じPBSで置き換える。固相として標的タンパク質を1μg/μLに希釈し、液相として候補抗体を7倍希釈まで連続希釈した。シグナルを得た後、ビアコア評価ソフトウェアを使用して、フィッティング曲線を作成した。カイ2<Rmax/10が、優れた信頼水準であることを示す。
[00213]HBSS中の胎児(E)18日目SDラットから皮質を分離し、次いでクモ膜を剥離し、解剖して海馬を消化培地(0.125%トリプシン、インビトロジェン、15050065)中に取り出した。37℃で20分消化した後、完全培地(10%FBSおよびグルタマックス(GlutaMax、ギブコ)が補充されたDMEM培地)によって反応を止めた。組織を混濁するまで穏やかに粉砕し、数分静置した。混濁した上清を別のチューブに移した。この工程を組織が見えなくなるまで繰り返した。懸濁液を混合し、血球計算器を使用して懸濁液中の細胞を計数した。100ng/mlのポリ-D-リシンでコーティングした(シグマ、030M5021V)直径3.5cmのプレート上でニューロンを、細胞1000,000個/ウェルでプレーティングした。4~6時間インキュベートした後、完全培地を完全に吸引し、維持培地(B27およびグルタマックス、ギブコが補充された神経細胞培養用培地)で交換した。維持培地を3日毎に半分維持培地に変えた。ニューロンを10~14日間培養し、次いでBDNFまたはTrkB-AgoAb刺激のために加工した。
[00215]全ての細胞を、37℃で、5%CO2の細胞インキュベーターでインキュベートした。CHO細胞を、10%FBS(16000044、ライフテクノロジーズ)が補充されたFK-12K培地(21127-022、ギブコ)中で培養した。5%FBS、10%ウマ血清(HS)が補充されたPC12細胞をDMEM培地中で培養した。SH-SY5Y細胞を、15%FBSが補充されたRPMI1640培地中で培養した。一次ニューロンの完全培地は、10%FBSおよび1%グルタマックス-I(35050061、ギブコ)が補充されたDMEM培地であった。一次ニューロンの維持培地は、2%B-27および1%グルタマックス-Iが補充されたNeuroBasal(10888022、サーモフィッシャー・サイエンティフィック(Thermofisher Scientific))培地であった。全てのこれらの培地には、0.2%ペニシリンおよびストレプトマイシンが補充された。CHO-hTrkBを、5μg/mLブラスチシジン(R210-01、インビトロジェン)が添加された培地中で培養した。細胞が継代したら、HBSSを使用して培地を洗浄して取り除き、0.05%EDTAトリプシンを使用して細胞を消化した。次いで実験または維持のために細胞をプレート上でプレーティングした。
[00217]本発明者らは、リポフェクタミン(Lipofectamine)2000キット(11668-019、インビトロジェン)を使用して細胞をトランスフェクトし、全ての操作は説明書に従った。細胞濃度は約90%であった。Opti-MEM(31985-070、インビトロジェン)を使用して、プラスミドおよびリポフェクトアミン2000(11668-019、インビトロジェン)をそれぞれ希釈し、次いで本発明者らは、希釈したプラスミドを希釈したリポフェクタミン2000に穏やかに添加し、室温で30分インキュベートした。最後に本発明者らは、混合物を細胞培地に添加し、穏やかに混合した。トランスフェクトされた細胞をインキュベーター中で24時間インキュベートした。
[00219]細胞を冷PBSによって3回洗浄し、50mMのトリス-HCl(pH8.0)、250mMのNaCl、1%のNP-40、0.5%デオキシコレート、0.1%のSDS、およびプロテアーゼ阻害剤(ロシュ・ダイアグノスティックス(Roche Diagnostics))を含有する緩衝液中で氷上で30分溶解させた。遠心分離して不溶性物質を除去した後、10%のSDS-PAGEを使用して溶解産物中のタンパク質を分離し、PVDF膜(イモビロン-P(Immobilon-P)、ミリポア(Millipore))に移した。0.1%トウィーン(TBST)を含むトリス緩衝生理的食塩水中の5%BSAで膜をブロックし、TBST中の5%BSAで希釈した抗体と共に穏やかに振盪しながら4℃で一晩インキュベートした。膜をTBSTで洗浄し、二次抗体と共にインキュベートし、最初にTBSTで、次いでTBSで洗浄し、スーパーシグナル・ウェスト・ピコ(SuperSignal West Pico)化学発光基質(34080、ピアース(Pierce))を用いて展開した。
[00221]細胞を冷PBSによって3回洗浄し、50mMのトリス-HCl(pH8.0)、250mMのNaCl、1%のNP-40、0.5%デオキシコレート、0.1%のSDS、およびプロテアーゼ阻害剤(4693132001、ロシュ)(ロシュ・ダイアグノスティックス)を含有する緩衝液中で氷上で20分溶解させた。遠心分離して不溶性物質を除去した後、溶解産物中のタンパク質を、標的タンパク質と共に4℃で一晩インキュベートした。20μlのプロテインAビーズ(sc-2003、サンタクルース(Santacruz))を、タンパク質混合物に添加した。これらの混合物を4℃で4~5時間インキュベートした後、本発明者らは、ビーズを溶解緩衝液で3回洗浄した。次いで上清を除去し、20μlのローディング緩衝液を沈着ビーズに添加した。タンパク質とカップリングしたビーズを変性させ、10分の95℃の過熱により脱カップリングさせた。
[00223]E13妊娠マウスを頸部脱臼によって安楽死させた。子宮から胎児を慎重に取り出し、氷冷したHBSS中で維持する。断頭し、一対のピンセットで尾部を除去する。胎児の背側を上にして置く。外部の薄い皮膚の***を除去し、一対のピンセットで脊髄の中央溝を開く。単離された脊髄を新しい神経細胞培養用培地を含有する培養皿に移し、脊髄を背側を上にして置く。後根神経節(DRG)と***する髄膜を取り出す。次いで単離された脊髄を小片に細断し、消化溶液(神経細胞培養用培地中のパパインおよびDNアーゼ)中で37℃で20分インキュベートする。消化溶液を遠沈して捨て、新鮮な神経細胞培養用培地中で細胞集合体を5mLピペットで穏やかにすりつぶす。得られた懸濁液をまず室温、600rpmで5分遠心分離して、死細胞片を除去した。次いで、Grahamによって公開されたプロトコールから改変したOptiprep(D1556、シグマ、米国)ベースの密度勾配遠心分離(Graham、2002)を使用して運動ニューロンを濃縮した。上清を捨て、ペレットをHBSSに再懸濁し、懸濁液を3mLの10.4%(w/v)Optiprepのクッション上に層状に重ね、400×gで室温で25分遠心分離した。運動ニューロンが濃縮されたトップ層を収集し、次いで10mLの神経細胞培養用培地を添加し、次いで1200rpmで室温で10分遠心分離して、細胞を収集した。最後に細胞ペレットを運動ニューロン完全培地(神経細胞培養用培地中、10%ウマ血清、1×B27、および1×グルタマックス)中に懸濁した。適切な数の細胞を、PDLおよびラミニンでコーティングした培養皿またはカバーガラス上にプレーティングした。細胞を培養皿の表面に付着させた後、培地を完全培地(神経栄養因子または抗体を含有する)で慎重に交換する。
[00226]コリン作用性の運動ニューロンは、他の脊髄細胞とは異なり、コリンアシルトランスフェラーゼ(ChAT)の高発現レベルによって同定することができる(CamuおよびHenderson、1992)。細胞をPBS中のPFAの4%溶液で20分固定し、免疫染色を、ヤギ抗ChAT抗体(AB143、メルクミリポア(Merk Millipore)、米国)を用いた標準的なプロトコールに従って行った。免疫標識された細胞のパーセンテージを決定することによって培養物の純度を評価した。通常。ニューロンのクラスIIIb-チューブリンに対する抗体(AT-809、Beyotime Biotechnology、中国)で細胞を免疫標識した後、軸索突起の数および長さを決定した。高含量スキャンおよび分析システム(ArrayScan VTI700、サーモ、米国)、それに続き以下のニューロンプロファイルV4プロトコールを使用して、軸索突起の長さを測定した。
[00228]出生後7日のマウス網膜を、4℃、DPBS(ギブコ、14040-216)中で解剖した。10μLの1MのNaOHによってpHを7.4に調整したパパイン(ワージントンバイオケミカル(Worthington Biochemical)LS003126)溶液(10mLのDPBS中のパパイン50μL、DNアーゼ0.4%、L-システイン(シグマ-アルドリッチ(Sigma-Aldrich)C7477)中、37℃で網膜を消化する。パパイン溶液を除去し、細胞を低ovo溶液および高ovo溶液中に別々に再懸濁し、その後、1000r/分、25℃で12分遠心分離した。低および高ovoの10×ストックは、3gのBSA(シグマ-アルドリッチA8806)+3gトリプシン阻害剤(ワージントンLS003086)または6gのBSA+6gのトリプシン阻害剤を200mlのDPBS中に溶解させ、pHを7.4に調整することによって調製される。
[00232]RGC生存率は、ArrayScan(登録商標)VTI HCSリーダー(サーモ、ArrayScan VTI700)によってDIV7初代培養物で実行される。DIV7初代培養物をPFA(4%)によって固定し、DAPI、Brn3a、およびTuj-1によって免疫染色する。生存RGCは、ニューロンの形態によって認識することができる。パニング後、96ウェルプレートの各ウェルに約30,000個のRGCをプレーティングし、1日おきに細胞にフィードして培地の半分の体積を新しくし、5つのウェルで平行して、1nMのBDNF、1nMのCNTF、5μMのフォルスコリンまたはこれらの基質混合物を含む異なる薬物で処理する。
[00234]この研究に、成体雌スプラギーダーレー(SD:Sprague Dawley)ラット(250~300gの体重、70~90日齢)を使用した。ケタミン(80mg/kg体重)およびキシラジン(8mg/kg)の混合物を腹膜内注射することによって動物を麻酔した。右背骨の区域から第5~第7頸椎(C5~C7)を露出させた。C6層上で背側の椎弓切除術を実行して、C7後根を露出させた。硬膜を開いた後、細いガラスフックを使用して右側C7根(背根と腹根の両方)を剥離させた。別の切開を遠位C7脊髄神経で行い、剥離させたC7背根および腹根を、脊髄神経の小さい断片と共に除去した。即座に、傷害を受けた脊髄表面上に、5μgのBDNF、5μgのTrkBアゴニストまたは同体積のPBSに浸漬したゲルフォームを穏やかに置いた。その後、ゲルフォームと同じ溶液で充填された浸透圧ミニポンプを皮下の傷害部位の近傍に埋め込んだ。ポンプをチューブと接続し、放出された薬物はチューブにより傷害を受けた脊髄表面に導かれた。グループ分けおよびサンプルサイズを以下に示す。
剥離なし+ゲルフォーム(5μlのPBSを含む)+ポンプ(12μl/日のPBSの放出)、
2)PBSで処理した陰性対照(N=7):
C7剥離+ゲルフォーム(5μlのPBSを含む)+ポンプ(12μl/日のPBSの放出)、
3)BDNFで処理した陽性対照(N=8):
C7剥離+ゲルフォーム(5μgのBDNFを含む)+ポンプ(1日当たり1μg、12μlのBDNFの放出)、
4)TrkBアゴニスト(低濃度)(N=8):
C7剥離+ゲルフォーム(5μgのTrkBアゴニストを含む)+ポンプ(1日当たり1μg、12μlのTrkBアゴニストの放出)、
5)TrkBアゴニスト(高濃度)(N=8):
C7剥離+ゲルフォーム(5μgのTrkBアゴニストを含む)+ポンプ(1日当たり6μg、12μlのTrkBアゴニストの放出)。
[00238]常磁性ビーズ(20160000-1、bioWORLD)の眼球内注射の前に、RGCは、蛍光マーカーによって標識されることになる。本発明者らは、上丘における両側の脳の定位的注入による逆行性の標識付けのために、4%フルオロゴールド(AB153、メルクミリポア)溶液を選択する。部位の配置は、ブレグマの6.0mm後方、横方向に1.0mm、深さ4.5mmであり、それぞれの側に33Gのスチール製針で1μLが与えられる。外科手術後、マウスは、眼球内注射の前にホームケージ中で2週間安静にさせると予想される。本発明者らは、常磁性ビーズの眼球内注射を実行するのに30ゲージの針を使用する(Samselら、2011)。2分未満で、本発明者らは、針を使用して、レンズを傷つけないように、45°の角度、ガラス体の深さ2mmで角膜輪部の後ろの角膜に穴をあけた。20μLの常磁性ビーズを片側の目の前房に注射し、およそ0.3~0.6mgのビーズを送達する。常磁性ビーズは、磁石によって前角にガイドされると予想される。他方の側の目には20μLの生理的食塩水を注射して、陰性対照を作製する。
[00239]モノクローナルTrkB抗体をハイブリドーマ技術によって生成した。モノクローナル抗体(MAb)生産の第1の工程は、抗原で動物免疫系を刺激することである。これは、マウスにおけるTrkB-ECD(細胞外ドメイン)の抗原(配列番号1を参照)を用いた迅速な免疫化プロトコール(方法に記載されている)を使用してなされた。免疫化されたマウスからのリンパ球をマウス骨髄腫細胞と融合させることによってハイブリドーマクローンを作製した。ハイブリドーマ上清を、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)を用いてTrkB特異的なモノクローナル抗体に関してスクリーニングし、次いでNFATアッセイを用いてアゴニスト抗体に関してスクリーニングした。TrkBを活性化する作用を有する培養上清を決定した後、クローンをモノクローナル細胞株にサブクローニングした。最後に、ELISAおよびNFATアッセイを用いて、全てのサブクローンを、陽性のものに関して再度スクリーニングした。十分な量の抗体の生産のために、これらの望ましい安定なクローンを大量に増殖させた。抗体の精製後、これらの精製した抗体のアイソタイプを以下の表1で同定した。
[00241]3.1 特異性
[00242]TrkBアゴニスト抗体は、ELISAアッセイにおいて、TrkBに特異的に結合することができるが、TrkA、TrkB、TrkCまたはP75に結合しない。図1A~1Fに、例示的な抗体TrkB-agoAb104、TrkB-agoAb202、TrkB-agoAb203、TrkB-agoAb303、TrkB-agoAb1104およびTrkB-agoAb2908のデータを示す。プレートの各ウェル上に50μLの1g/mlタンパク質をコーティングし、50μLの10nM、1nMまたは0.1nM抗体を添加して、ELISAアッセイを実行した。
[00244]ビアコアを使用して、抗原-抗体相互作用の親和性を分析した。以下の表2にデータを示す。
[00247]5つの細胞外ドメインが短縮化されたTrkBコンストラクトを図2Aで示されるように設計し、それぞれの発現のために293T細胞にトランスフェクトした。溶解産物を収集した。免疫沈降を使用して、GFPとコンジュゲートした短縮化されたTrkBに結合するできない抗体を試験した(図2Bを参照)。結果から、D1およびD2ドメインは、TrkB-agoAb202のTrkBへの抗体結合に必要な可能性があることが示唆された。その他のもの、例えばTrkB-agoAb418抗体は、D5ドメインに結合することができる。Δ1は、D1ドメイン(Cys1で表される)を欠失しており、Δ2は、D1およびD2(LAMで表される)ドメインを欠失しており、Δ3は、D1~D3(Cys2で表される)ドメインを欠失しており、Δ4は、D1~D4(Ig1で表される)ドメインを欠失しており、Δ5は、D1~D5(Ig2で表される)ドメインを欠失している。「TM」は、膜貫通ドメインを表し、「C」は、対照(ブランク、空のベクター)を表す。FLは、全長遺伝子(WT)を表す。表3に、本明細書で提供されるTrkBアゴニスト抗体に関するTrkBの標的結合ドメインを示す。
[00251]TrkBアゴニスト抗体は、TrkB細胞内ドメインのチロシン残基をリン酸化するTrkBのチロシンキナーゼを活性化することができる。シグナル伝達経路を誘導することができる最も重要な部位がTry515部位であるという理由で、本発明者らは、リン酸化の強度を定量することができるAlphalisa方法によって、TrkB活性化を示すTry515リン酸化レベルを試験する。本発明者らは、ヒトTrkBでトランスフェクトされたCHO細胞(hTrkB-CHO細胞)を、異なる濃度のBDNFまたはTrkBアゴニスト抗体で30分処理し、タンパク質サンプル収集して、TrkBリン酸化レベルを試験した。これらの結果に従って、BDNFまたはTrkBアゴニスト抗体の用量曲線を計算した。図4および表4に、試験した抗体を示す。
[00256]TrkBは、細胞内チロシン残基のリン酸化によって活性化され、TrkB活性化は、キナーゼシグナル伝達経路MAPK、PI3KおよびPLCγを誘導する。Erk42/44、Akt、およびPLCγのリン酸化レベルは、それぞれこれらの3つのシグナル伝達経路の活性化を示すことができる。hTrkB-CHO細胞密度が60~70%に達したら、本発明者らは、細胞をBDNF(1nM)またはTrkBアゴニスト抗体(TrkB-agoAb101、TrkB-agoAb104、TrkB-agoAb303、TrkB-agoAb203、TrkB-agoAb202、図6A~6Eを参照)で処理し、24時間以内に異なる時間でサンプルを収集した。TrkB(Tyr515)、Erk44/42(Thr202/Tyr204)、Akt(Ser473)およびPLCγ(Tyr783)のリン酸化レベルをウェスタンブロットによって試験した。TrkB-AgoAb104も、BDNFとしてTrkBシグナル伝達経路を活性化できるという結果が示された(図6を参照)。
[00257]4.1 細胞生存実験
[00258]4.1.1 PC12細胞
[00259]ヒトTrkBを発現するPC12細胞株を使用して、細胞生存アッセイを実行した。ヒトTrkB-PC12細胞を96ウェルのプレート中に1日かけてシーディングし、次いで培地を、PC12細胞死を誘導できる血清非含有培地に交換した。BDNFまたはTrkB-agoAb202は、飢餓細胞の死から細胞を保護する可能性がある。カスパーゼ3-基質キット(プロメガ(Promega)、G7573)およびセロミクスアレイスキャンを使用して、細胞生存の質を定量した。
[00261]周知のニューロン毒素としてAβ(25~35)を使用して、培養したラット海馬ニューロンを処理して、AD細胞モデルを確立した。以前の研究によれば、Aβ(25~35)は、インビボまたはインビトロの実験のいずれかで細胞毒素としてAβ(1~42)を模擬でき、それゆえに本発明者らは、Aβ(25~35)(GLバイオケム(GL Biochem))を、培養ラット海馬ニューロンを処理して、インビトロでのAD細胞モデルを確立するのに使用して、TrkB-AgoAbのニューロンを保護する機能を試験した。本発明者らは、ニューロンを異なる濃度のAβ(25~35)で48時間処理し、生きた細胞の数を示すATPレベルを試験するためにセルタイター-Gloキット使用した。5~40μMのAβ(25~35)で処理した細胞のATPレベルが、対照(Aβ(25~35)で処理されていない海馬ニューロン)に対して約60~70%であるという結果が示された(図7A)。次いで本発明者らは、Aβ(25~35)を5μMの毒性濃度で使用した。これは、この細胞死のパーセンテージで救済作用がより優れていると予想されたためである。
[00264]運動ニューロンに対するTrkB抗体アゴニストの作用を調査するために、インビトロのモデルを確立した。13日齢の胎児マウスから運動ニューロンを単離し、インビトロで培養した。血清枯渇は、インビトロにおいて運動ニューロンの死を引き起こすこと報告されている(Wieseら、2010)。運動ニューロンを3日間培養し(DIV3)、次いで培地(方法を参照)を血清(ウマ血清、HS)非含有培地で交換した。16または24時間後の残存する細胞の数およびアポトーシス細胞のパーセンテージによって細胞生存率を推測した。アポトーシスを、トランスフェラーゼ媒介デオキシウリジン三リン酸-ビオチンニック末端標識(TUNEL)アッセイによって決定した。以前の報告と一致して、血清枯渇は、驚くべき細胞損失とアポトーシス上昇をもたらした(図8A~8Cを参照)。細胞の核(Nu)をDAPIで染色した。血清枯渇なしで培養した対照と比較して、血清枯渇グループ中でより多くのTUNEL標識細胞が検出され、一方でBDNF処理は、アポトーシス細胞のパーセンテージを有意に低減させた。本発明者らは、TrkB、TrkB-agoAb102およびTrkB-agoAb202につき2種のアゴニスト抗体を試験した。両方のアゴニスト抗体が、アポトーシスの低減によって実証された通り、ニューロンの保護的作用を示した(図8Cを参照)。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001。データは平均±SEMとして提示され、一元配置ANOVAで分析される。
[00266]イムノパニング方法を使用して出生後の7日目にBALB/cマウスから網膜神経節細胞(RGC)を調製した。純度90%を有するRGCを得た。RGCは、神経栄養因子がないと致死すると予想され、それゆえに細胞生存アッセイを、BDNFおよびTrkBアゴニスト抗体を添加することによって実行した。選択された抗体TrkB-AgoAb102およびTrkB-agoAb202の機能を同定するために、本発明者らは、機能的な分析のためにRGC生存アッセイを事前に行った(図9を参照)。RGCを、1nMのBNDF(n=6)、0.5nMのTrkB-agoAb202(n=6)および30nMのTrkB-agoAb101(n=6);ゼロ対照としてDPBS(n=9)および陰性対照としてK252a(n=6)によって1日おきに別々に処理する。0.5nMのTrkB-Ago202または30nMのTrkB-agoAb101での処理は、生存率を増加させた。*p<0.05、**p<0.01。データは平均±SEMとして提示され、一元配置ANOVAで分析される。
[00268]4.2.1 PC12細胞
[00269]ヒトTrkB発現PC12細胞株を使用して、軸索突起生長アッセイを実行する。PC12細胞は、標準状態で軸索突起を有さないが、軸索突起は、PC12細胞がNGFによって刺激されると出現する。ヒトTrkB-PC12細胞は、BDNF刺激の後、同じ作用を有する。ヒトTrkB-PC12細胞を1日かけて96ウェルプレートにシーディングし、次いで培地を、BDNFまたはTrkB-AgoAbを添加した1%ウマ血清培地に交換する。72時間の処理後、細胞をセロミクスアレイスキャンによって試験して、細胞の軸索突起を定量する。
E18ラット海馬ニューロンをインビトロで2日間培養した後、BDNFまたはTrkB-AgoAbをニューロンに添加し、さらに48時間培養した。蛍光顕微鏡を使用する形態測定分析のために、本発明者らは培養物を固定し、MAP2に対する抗体(ミリポア、MAB3418)でニューロンを免疫染色した。軸索成長を、2つのパラメーター:総軸索突起長さおよび分岐点の数によって定量化した。BDNFまたはTrkB-agoAbはどちらも、軸索突起の全長および分岐点数を増加させることができる(図17Aおよび17B)。**p<0.01、***p<0.001、****p<0.0001。データは平均±SEMとして提示され、一元配置ANOVAで分析される。
[00271]5.1 ALS動物モデル
[00272]脊髄神経根剥離傷害を使用して、ALSの運動ニューロン傷害を模擬した。本発明者らは、BDNFシグナル伝達を回復させるためにBDNFおよびTrkB-agoAb202を利用した。剥離から2週間後、PBSで処理した動物では傷害を受けた運動ニューロンのわずか30.7%が生きたままであったが、BDNF処理は、それらの77.2%が生存可能であった。BDNFと同様に、TrkBアゴニストの低(TrkB-agoAb202(L))および高(TrkB-agoAb202(H))用量(方法を参照)の両方が、傷害のある運動ニューロンを救済することにおいて高い効率を実証し、それらの生存はそれぞれ76.2%および80.9%であった(図10Fを参照)。加えて、BDNFおよびTrkB-Aで処理した運動ニューロンでは、ニッスル染色によって、大きい核、暗く染色された粗面小胞体および大きい細胞質を含む健康な細胞内構造がよく示された(図10A、10C、10Dおよび10Eを参照)。対照的に、PBSで処理した細胞では、認識できる細胞内構造を含まない異常な細胞の出現が観察された。さらに、PBSで処理した脊髄の灰白質中に多数のグリア細胞が存在したが(図10B)、BDNFまたはTrkB-agoAb202で処理した脊髄ではほとんど検出されなかった。BDNFおよびTrkB-agoAb202で処理したグループからのわずかな運動ニューロンが肥大を呈示したが、細胞直径においてグループ間に統計学的差異は観察されなかった。***p<0.001。データは平均±SEMとして提示され、一元配置ANOVAで分析される。
[00274]常磁性ビーズの眼球内注射により誘導された上昇した眼圧(IOP)を使用して、緑内障動物モデルを確立した。注射の前に、RGCを蛍光マーカーによって標識した。上丘における両側の脳の定位的注入による逆行性の標識付けのために、4%フルオロゴールド溶液を選択した。30ゲージの針を使用して、常磁性ビーズの眼球内注射を実行した。常磁性ビーズを磁石によって前角にガイドした。他方の側の目に20μlの生理的食塩水を注射して、陰性対照を作製した。眼球内注射の後、動物をホームケージ中で安静にさせ、IOPを1日おきに試験した。マイクロビーズの眼球内注射の2週間後、両方の目に、1μlの生理的食塩水またはTrkB-agoAb202(1μg)を眼球内注射する。全てのマウスを1ヶ月後に致死させ、網膜を浮遊させる錠剤を作製した。逆行した標識付けによって生じた蛍光シグナルに基づき(図11Aを参照)、RGC数を計数した。TrkB-agoAb202は、RGC生存に対して有意な強化を示した(図11Bを参照)。***p<0.001。データは平均±SEMとして提示され、一元配置ANOVAで分析される。
[00276]スプラギーダーレーラット(約200g)を、2時間の右側中大脳動脈閉塞とそれに続く再灌流(I/R)に供し、それぞれPBS(偽操作)、1mg/kg体重の正常ウサギIgG、1mg/kgのTrkB-agoAb202および0.2mg/kgのTrkB-agoAb202を投与した。動物を、感覚および運動機能に関して14日間試験し、梗塞体積測定のために安楽死させた。3日目に、ウェスタンブロットアッセイのために追加のセットの動物を安楽死させた。
[00282]血漿および脳組織におけるTrkB-agoAb(TrkB-agoAb1104、TrkB-agoAb2908、TrkB-agoAbB901、およびTrkB-agoAb202)の薬物動態を決定するために、C57BL/6マウスにそれらを尾静脈を介して注射により投与した。異なるタイムポイント(1日目、3日目、7日目、15日目および30日目)に1グループ当たり3匹のマウスを致死させて、血液サンプルおよび脳組織を収集した。血液サンプルから即座に血漿を調製した。脳組織を収集する前、マウスを少なくとも20mlのPBSで灌流した。血漿サンプルおよび脳組織を液体窒素によって急速冷凍し、-80℃の冷凍庫で貯蔵した。異なるタイムポイントの全てのサンプルを収集した後、ELISA方法を使用して、各サンプルの抗体濃度を検出した。ベースライン(0)の濃度を対照マウス(注射なし)によって決定した。図18によれば、TrkB-agoAbは、7~30日後に血液から除去され(図18Aを参照)、15日より後に脳から除去された(図18Bを参照)。約0.1~0.5%の血中濃度のTrkB-agoAbが脳血液バリア(BBB)を通って脳組織に透過し、脳中の濃度が、TrkBリン酸化および下流キナーゼシグナル伝達経路を活性化し、神経の生存を促進するのに有効な濃度である。例えば、TrkB-agoAbの血中濃度が3mg/kgである場合、脳組織に透過する濃度は、0.1~0.2μg/gであるかまたはそれより高く(約1nMに相当)、一方でインビトロにおける0.3~1nMのTrkB-agoAb濃度は、十分に有効である(図6および8を参照)。
開示を具体的に示し説明したが、当業者であれば、本明細書で開示される本発明の開示の
本質および範囲から逸脱することなく、形態および詳細における様々な変化をなすことが
できることを理解しているものとする。
国際出願時の特許請求の範囲
〔項1〕 TrkBの細胞外ドメインの1つに含有されるエピトープに結合し、TrkBを活性化することが可能である単離されたTrkBアゴニスト抗体であって、該細胞外ドメインは、TrkBの、配列番号2の配列を有する細胞外D1ドメイン、配列番号3の配列を有するD2ドメイン、配列番号4の配列を有するD3ドメイン、配列番号5の配列を有するD4ドメイン、配列番号6の配列を有するD5ドメイン、および配列番号7の配列を有する膜近傍のドメインを含む、上記抗体。
〔項2〕 膜近傍のドメインに含有されるエピトープに結合し、配列番号8の配列を有する短縮化されたTrkBを活性化することが可能である、請求項1に記載の抗体。
〔項3〕 単離されたTrkBアゴニスト抗体であって、配列番号9~26、29~34、37~42、45~50、53~58、61~66、および69~74から選択される1、2、3、4、5もしくは6つのCDR、またはそれらの少なくとも80%の配列同一性を有する相同体を含む、上記抗体。
〔項4〕 1)配列番号12~14、またはその少なくとも80%の配列同一性を有する相同体;2)配列番号18~20、またはその少なくとも80%の配列同一性を有する相同体;3)配列番号24~26、またはその少なくとも80%の配列同一性を有する相同体;4)配列番号32~34、またはその少なくとも80%の配列同一性を有する相同体;5)配列番号40~42、またはその少なくとも80%の配列同一性を有する相同体;6)配列番号48~50、またはその少なくとも80%の配列同一性を有する相同体;7)配列番号56~58、またはその少なくとも80%の配列同一性を有する相同体;8)配列番号64~66、またはその少なくとも80%の配列同一性を有する相同体;または9)配列番号72~74、またはその少なくとも80%の配列同一性を有する相同体からなる群から選択される3つの重鎖CDR配列を含む、請求項3に記載の抗体。
〔項5〕 1)配列番号9~11、またはその少なくとも80%の配列同一性を有する相同体;2)配列番号15~17、またはその少なくとも80%の配列同一性を有する相同体;3)配列番号21~23、またはその少なくとも80%の配列同一性を有する相同体;4)配列番号29~31、またはその少なくとも80%の配列同一性を有する相同体;または5)配列番号37~39、またはその少なくとも80%の配列同一性を有する相同体;6)配列番号45~47、またはその少なくとも80%の配列同一性を有する相同体;7)配列番号53~55、またはその少なくとも80%の配列同一性を有する相同体;8)配列番号61~63、またはその少なくとも80%の配列同一性を有する相同体;または9)配列番号69~71、またはその少なくとも80%の配列同一性を有する相同体からなる群から選択される3つの軽鎖CDR配列を含む、請求項3または4に記載の抗体。
〔項6〕 1)配列番号12~14、または1、2または3つのアミノ酸改変を有するそのバリアント;2)配列番号18~20、または1、2または3つのアミノ酸改変を有するそのバリアント;3)配列番号24~26、または1、2または3つのアミノ酸改変を有するそのバリアント;4)配列番号32~34、または1、2または3つのアミノ酸改変を有するそのバリアント;5)配列番号40~42、または1、2または3つのアミノ酸改変を有するそのバリアント;6)配列番号48~50、または1、2または3つのアミノ酸改変を有するそのバリアント;7)配列番号56~58、または1、2または3つのアミノ酸改変を有するそのバリアント;8)配列番号64~66、または1、2または3つのアミノ酸改変を有するそのバリアント;または9)配列番号72~74、または1、2または3つのアミノ酸改変を有するそのバリアントからなる群から選択される3つの重鎖CDR配列を含む、請求項3に記載の抗体。
〔項7〕 1)配列番号9~11、または1、2または3つのアミノ酸改変を有するそのバリアント;2)配列番号15~17、または1、2または3つのアミノ酸改変を有するそのバリアント;3)配列番号21~23、または1、2または3つのアミノ酸改変を有するそのバリアント;4)配列番号29~31、または1、2または3つのアミノ酸改変を有するそのバリアント;または5)配列番号37~39、または1、2または3つのアミノ酸改変を有するそのバリアント;6)配列番号45~47、または1、2または3つのアミノ酸改変を有するそのバリアント;7)配列番号53~55、または1、2または3つのアミノ酸改変を有するそのバリアント;8)配列番号61~63、または1、2または3つのアミノ酸改変を有するそのバリアント;または9)配列番号69~71、または1、2または3つのアミノ酸改変を有するそのバリアントからなる群から選択される3つの軽鎖CDR配列を含む、請求項3または4に記載の抗体。
〔項8〕 配列番号28、36、44、52、60、68、76またはそれらのヒト化型からなる群から選択される重鎖可変領域を含む、請求項3~7のいずれか一項に記載の抗体。
〔項9〕 配列番号27、35、43、51、59、67、75またはそれらのヒト化型からなる群から選択される軽鎖可変領域を含む、請求項3~7のいずれか一項に記載の抗体。
〔項10〕 BDNFおよび/またはNT-4の場合とは異なるエピトープに結合することによって、相加効果でTrkBを活性化することが可能であり、ここで該相加効果は、TrkBがBDNFおよび/またはNT-4によるピークの活性化状態のときに、前記抗体によって追加のTrkB活性化の増加がもたらされることである、請求項1~9のいずれか一項に記載の抗体。
〔項11〕 前記抗体がTrkBに結合すると、TrkBは、TrkBのY515、Y701、Y705、Y706およびY816の少なくとも1つのアミノ酸残基でリン酸化される、請求項1~10のいずれか一項に記載の抗体。
〔項12〕 少なくとも12時間の半減期(T1/2)でTrkBに結合することが可能な、単離されたTrkBアゴニスト抗体。
〔項13〕 請求項1~12のいずれか一項に記載の抗体と同じエピトープに結合するか、または請求項1~12のいずれか一項に記載の抗体と競合結合する、単離されたTrkBアゴニスト抗体。
〔項14〕 3nM未満のEC50を有する、請求項1~13のいずれか一項に記載の抗体。
〔項15〕 ビアコアによって測定した場合、4.5nM未満のKD値のTrkBに対する親和性を有する、単離されたTrkBアゴニスト抗体。
〔項16〕 D1、D2、D3、D4、D5または膜近傍に結合する、請求項12、14および15のいずれか一項に記載の抗体。
〔項17〕 P75ニューロトロフィン受容体(P75NTR)、チロシン受容体A(TrkA)またはチロシン受容体C(TrkC)に結合しない、請求項1~16のいずれか一項に記載の抗体。
〔項18〕 神経細胞の生存を強化すること、シナプスの発生および/または可塑性を調節すること、軸索突起の伸長を強化すること、またはそれらの組合せが可能である、請求項1~17のいずれか一項に記載の抗体。
〔項19〕 前記神経細胞が、PC12細胞、海馬ニューロン、網膜神経節細胞、運動ニューロン、およびドーパミン作動性ニューロンを含む、請求項18に記載の抗体。
〔項20〕 二重特異性抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、標識された抗体、2価抗体、または抗イディオタイプ抗体である、請求項1~19のいずれか一項に記載の抗体。
〔項21〕 単一ドメイン抗体、ラクダ単一ドメイン抗体、VNAR、ナノボディ、操作されたヒトVH/VL単一ドメイン抗体、ダイアボディ、scFv、scFv二量体、BsFv、dsFv、(dsFv)2、dsFv-dsFv’、Fvフラグメント、Fab、Fab’、F(ab’)2、dsダイアボディ、ドメイン抗体、単離されたCDRおよび2価ドメイン抗体からなる群から選択される抗原結合フラグメントである、請求項1~20のいずれか一項に記載の抗体。
〔項22〕 治療有効量の請求項1~21のいずれか一項に記載の抗体および製剤用担体を含む医薬組成物。
〔項23〕 BDNFおよび/またはNT-4を含む第2の治療剤をさらに含む、請求項22に記載の医薬組成物。
〔項24〕 請求項1~21のいずれか一項に記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
〔項25〕 請求項24に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
〔項26〕 請求項25に記載のベクターを含む単離された宿主細胞。
〔項27〕 前記ポリヌクレオチドによってコードされた抗体を生産する、請求項26に記載の宿主細胞。
〔項28〕 TrkBに関連する状態を診断すること、予防すること、遅らせること、または治療することにおける、請求項1~21のいずれか一項に記載の抗体または請求項22~23のいずれか一項に記載の医薬組成物を含むキット。
〔項29〕 TrkBに特異的に結合する抗体を生産する方法であって、TrkBタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、請求項27に記載の宿主細胞に導入すること、および該ポリヌクレオチドが発現される条件下で該宿主細胞を培養することを含む、上記方法。
〔項30〕 対象におけるTrkBに関連する状態を治療すること、またはそのリスクを低減するための方法であって、請求項1~21のいずれか一項に記載の抗体または請求項22~23のいずれか一項に記載の医薬組成物を該対象に投与すること、それによって該状態を治療することを含む、上記方法。
〔項31〕 前記状態が、神経変性疾患、視神経症、網膜変性状態、聴力損失を伴う障害、精神障害、神経発達障害、体重の調節の障害、筋障害、代謝性疾患または脳傷害である、請求項30に記載の方法。
〔項32〕 前記状態が、アルツハイマー病(AD)、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、緑内障、ハンチントン病(HD)、パーキンソン病(PD)、運動ニューロン疾患、レヴィ小体病、脊髄性筋萎縮症、多系統萎縮症、認知症およびタウオパチー、緑内障、前部虚血性視神経症(AION)、後部虚血性視神経症、放射線視神経症、圧迫性視神経症、ミトコンドリア性視神経症、中毒性視神経症、外傷性視神経症、遺伝性視神経症、視神経炎、加齢性黄斑変性症、網膜色素変性症、神経性難聴、迷路性難聴、耳鳴り、感覚神経聴力損失、複合型の聴力損失、不安、気分障害、うつ病、パニック障害、心的外傷後ストレス障害(PTSD)、注意欠陥多動性障害(ADHD)、双極性障害、統合失調症、アンジェルマン症候群、プラダー-ウィリー症候群、自閉性障害、レット症候群、思春期やせ症、悪液質、不要な体重の減少、サルコペニア、肥満症、オピオイドによって誘発された嘔吐、サルコペニア、糖尿病性神経障害、てんかん、多発性硬化症、片頭痛、神経傷害、末梢神経障害、神経筋疾患、睡眠障害、外傷性脳傷害(TBI)および卒中からなる群から選択される、請求項30に記載の方法。
〔項33〕 細胞分化および/またはシナプスの発生を強化する方法であって、請求項1~21のいずれか一項に記載の抗体または請求項22~23のいずれか一項に記載の医薬組成物を、TrkBを発現する生体サンプルと接触させることを含む、上記方法。
〔項34〕 神経傷害の修復および/または軸索突起の分岐を強化する方法であって、請求項1~21のいずれか一項に記載の抗体または請求項22~23のいずれか一項に記載の医薬組成物を、TrkBを発現する生体サンプルと接触させることを含む、上記方法。
〔項35〕 細胞のアポトーシスおよび/またはネクロトーシスを予防する方法であって、請求項1~21のいずれか一項に記載の抗体または請求項22~23のいずれか一項に記載の医薬組成物を、TrkBを発現する生体サンプルと接触させることを含む、上記方法。
〔項36〕 細胞生存を強化する方法であって、請求項1~21のいずれか一項に記載の抗体または請求項22~23のいずれか一項に記載の医薬組成物を、TrkBを発現する生体サンプルと接触させることを含む、上記方法。
〔項37〕 対象におけるTrkBに関連する状態を治療すること、またはそのリスクを低減するための方法であって、細胞表面上で請求項1~21のいずれか一項に記載の抗体を発現する細胞、または請求項22~23のいずれか一項に記載の医薬組成物を該対象に投与することを含む、上記方法。
Claims (28)
- 単離されたトロポミオシン受容体キナーゼB(TrkB)アゴニスト抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
1)配列番号48~50の3つの重鎖CDR配列、および配列番号45~47の3つの軽鎖CDR配列;または
2)配列番号40~42の3つの重鎖CDR配列、および配列番号37~39の3つの軽鎖CDR配列
を含む、上記抗体またはその抗原結合フラグメント。 - 配列番号52、44またはそれらのヒト化型からなる群から選択される重鎖可変領域を含む、請求項1に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 配列番号51、43またはそれらのヒト化型からなる群から選択される軽鎖可変領域を含む、請求項1または2に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記抗体がTrkBに結合すると、TrkBは、TrkBのY515、Y701、Y705、Y706およびY816の少なくとも1つのアミノ酸残基でリン酸化される、請求項1~3のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 少なくとも12時間の半減期(T1/2 )を有する、請求項1~4のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 3nM未満のEC50を有する、請求項1~5のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- ビアコアによって測定した場合、4.5nM未満のKD値のTrkBに対する親和性を有する、請求項1~6のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- P75ニューロトロフィン受容体(P75NTR)、チロシン受容体A(TrkA)またはチロシン受容体C(TrkC)に結合しない、請求項1~7のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 神経細胞の生存を強化すること、シナプスの発生および/または可塑性を強化すること、軸索突起の伸長を強化すること、またはそれらの組合せが可能である、請求項1~8のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記神経細胞が、PC12細胞、海馬ニューロン、網膜神経節細胞、運動ニューロン、およびドーパミン作動性ニューロンを含む、請求項9に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 二重特異性抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、標識された抗体、2価抗体、または抗イディオタイプ抗体である、請求項1~10のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- ダイアボディ、scFv、scFv二量体、BsFv、dsFv、(dsFv)2、dsFv-dsFv’、Fvフラグメント、Fab、Fab’、F(ab’)2、およびdsダイアボディからなる群から選択される抗原結合フラグメントである、請求項1~11のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 治療有効量の請求項1~12のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントおよび製剤用担体を含む医薬組成物。
- BDNFおよび/またはNT-4を含む第2の治療剤をさらに含む、請求項13に記載の医薬組成物。
- 請求項1~12のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項15に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項16に記載のベクターを含む単離された宿主細胞。
- 前記ポリヌクレオチドによってコードされた抗体またはその抗原結合フラグメントを生産する、請求項17に記載の宿主細胞。
- TrkBに関連する状態を診断すること、予防すること、遅らせること、または治療することにおいて用いるための、請求項1~12のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントまたは請求項13または14に記載の医薬組成物を含むキット。
- TrkBに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを生産する方法であって、請求項15のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入すること、および該ポリヌクレオチドが発現される条件下で該宿主細胞を培養することを含む、上記方法。
- TrkBに関連する状態を治療すること、またはそのリスクを低減するための、請求項13または14に記載の医薬組成物。
- 前記状態が、神経変性疾患、視神経症、網膜変性状態、聴力損失を伴う障害、精神障害、神経発達障害、体重の調節の障害、筋障害、代謝性疾患または脳傷害である、請求項21に記載の医薬組成物。
- 前記状態が、アルツハイマー病(AD)、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、緑内障、ハンチントン病(HD)、パーキンソン病(PD)、運動ニューロン疾患、レヴィ小体病、脊髄性筋萎縮症、多系統萎縮症、認知症およびタウオパチー、前部虚血性視神経症(AION)、後部虚血性視神経症、放射線視神経症、圧迫性視神経症、ミトコンドリア性視神経症、中毒性視神経症、外傷性視神経症、遺伝性視神経症、視神経炎、加齢性黄斑変性症、網膜色素変性症、神経性難聴、迷路性難聴、耳鳴り、感覚神経聴力損失、複合型の聴力損失、不安、気分障害、うつ病、パニック障害、心的外傷後ストレス障害(PTSD)、注意欠陥多動性障害(ADHD)、双極性障害、統合失調症、アンジェルマン症候群、プラダー-ウィリー症候群、自閉性障害、レット症候群、思春期やせ症、悪液質、不要な体重の減少、サルコペニア、肥満症、オピオイドによって誘発された嘔吐、糖尿病性神経障害、てんかん、多発性硬化症、片頭痛、神経傷害、末梢神経障害、神経筋疾患、睡眠障害、外傷性脳傷害(TBI)および卒中からなる群から選択される、請求項21に記載の医薬組成物。
- 細胞分化および/またはシナプスの発生を強化する方法であって、請求項1~12のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントまたは請求項13または14に記載の医薬組成物を、TrkBを発現する生体サンプルと接触させることを含む、上記方法。
- 神経傷害の修復および/または軸索突起の分岐を強化する方法であって、請求項1~12のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントまたは請求項13または14に記載の医薬組成物を、TrkBを発現する生体サンプルと接触させることを含む、上記方法。
- 細胞のアポトーシスおよび/またはネクロトーシスを予防する方法であって、請求項1~12のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントまたは請求項13または14に記載の医薬組成物を、TrkBを発現する生体サンプルと接触させることを含む、上記方法。
- 細胞生存を強化する方法であって、請求項1~12のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントまたは請求項13または14に記載の医薬組成物を、TrkBを発現する生体サンプルと接触させることを含む、上記方法。
- 対象におけるTrkBに関連する状態を治療すること、またはそのリスクを低減するための医薬であって、細胞表面上で請求項1~12のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを発現する細胞を含む、上記医薬。
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