JP7206230B2 - ヒト間葉間質細胞の上皮細胞分化 - Google Patents
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Description
本出願は、参照により全体が本明細書に組み入れられる、2013年8月16日付で出願された米国特許仮出願第61/866,570号の、米国特許法第119条(e)の下での、優先権を受ける権利がある。
本発明は、国立衛生研究所によって拠出された第GM086287号、第HL111016号および第HL098220号の政府援助を受けて行われた。政府は本発明において一定の権利を有する。
さまざまなグループによって、骨髄由来細胞が肺修復および再生に寄与する能力が記述されている(Krause et al., 2001, Cell 105: 1-9 (非特許文献1); Rojas, et al., 2005, Am J Respir Cell Mol Biol 33(2): 145-52 (非特許文献2); Kotton, et al., 2001, Development 128(24):5181-8 (非特許文献3); Wong et al., 2009, Cytotherapy 11:676-687 (非特許文献4))。興味深いことに、これらの報告は、骨髄の造血幹細胞成分(HSC)および間葉間質細胞(MSC)画分による肺上皮への寄与を示している。これらの研究の多くにおいて、骨髄由来細胞による肺上皮への寄与には、肺損傷を要するように思われる(Krause, 2008, Proc Am Thorac Soc 5:323-327 (非特許文献5))。特に興味深いのは、ヒトおよびげっ歯類骨髄MSC様細胞の亜集団がクララ細胞分泌タンパク質(CCSP)、つまり肺においてクララ細胞に関連しているマーカーを発現しうることである(Wong et al., 2009, Cytotherapy 11:676-687 (非特許文献4))。これらの研究者はまた、CCSPノックアウトマウスへのマウスCCSP+骨髄細胞の尾静脈投与によって、肺損傷後の宿主肺におけるCCSP+細胞の取り込みが起きることも示した。
[本発明1001]
間葉幹細胞(MSC)を肺細胞へ分化させる方法であって、
基材上にMSCを播種する工程; ならびに
レチノイン酸およびヒト上皮成長因子の少なくとも1つを含む成長培地へMSC播種された基材を曝露させ、それによって少なくとも1つの上皮マーカーを発現する肺細胞へMSCを分化させる工程
を含む、該方法。
[本発明1002]
MSCが、骨髄由来MSC (BM-MSC)および脂肪組織由来MSC (AT-MSC)からなる群より選択される、本発明1001の方法。
[本発明1003]
肺細胞がII型肺胞上皮細胞の少なくとも1つの特徴を示す、本発明1001の方法。
[本発明1004]
II型肺胞上皮細胞の少なくとも1つの特徴が、プロSPCおよびサイトケラチン-5からなる群より選択される少なくとも1つの上皮マーカーの発現である、本発明1003の方法。
[本発明1005]
肺細胞がクララ細胞の少なくとも1つの特徴を示す、本発明1001の方法。
[本発明1006]
クララ細胞の少なくとも1つの特徴が、クララ細胞分泌タンパク質(CCSP)の発現である、本発明1005の方法。
[本発明1007]
基材が脱細胞化された肺組織である、本発明1001の方法。
[本発明1008]
基材が、細胞外マトリックスを含むコーティングである、本発明1001の方法。
[本発明1009]
細胞外マトリックスが、ヒトECM、ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲンIV、およびコラーゲンIの1つまたは複数を含む、本発明1008の方法。
[本発明1010]
肺上皮細胞がCCSP、プロSPCおよびサイトケラチン-5からなる群より選択される少なくとも1つの上皮マーカーを発現する、間葉幹細胞(MSC)から分化された肺上皮細胞の集団。
[本発明1011]
MSCが、骨髄由来MSC (BM-MSC)および脂肪組織由来MSC (AT-MSC)からなる群より選択される、本発明1010の肺細胞の集団。
[本発明1012]
肺上皮細胞が、I型肺胞上皮細胞、II型肺胞上皮細胞およびクララ細胞からなる群より選択される、本発明1010の肺細胞の集団。
[本発明1013]
肺上皮細胞が基材上に播種される、本発明1010の肺細胞の集団。
[本発明1014]
基材が脱細胞化された肺組織である、本発明1013の肺細胞の集団。
[本発明1015]
基材が、細胞外マトリックスを含むコーティングである、本発明1013の肺細胞の集団。
[本発明1016]
細胞外マトリックスが、ヒトECM、ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲンIV、およびコラーゲンIの1つまたは複数を含む、本発明1015の肺細胞の集団。
[本発明1017]
遺伝子改変細胞を含む、本発明1010の肺細胞の集団。
[本発明1018]
遺伝子改変細胞が、治療用遺伝子を発現するように遺伝子改変された肺上皮細胞である、本発明1017の肺細胞の集団。
[本発明1019]
哺乳動物において肺異常を軽減または処置する方法であって、間葉幹細胞(MSC)から分化された肺上皮細胞の集団の治療的有効量を哺乳動物に投与する工程を含み、ここで肺上皮細胞が、CCSP、プロSPCおよびサイトケラチン-5からなる群より選択される少なくとも1つの上皮マーカーを発現する、該方法。
[本発明1020]
肺細胞への間葉幹細胞(MSC)の分化を調節する方法であって、基材上でMSCを培養し、それによって肺細胞へMSCを分化させる工程を含む、該方法。
[本発明1021]
MSCが骨髄由来MSC (BM-MSC)である場合、MSCが、II型肺胞上皮細胞の少なくとも1つの特徴を示す細胞へ分化する、本発明1020の方法。
[本発明1022]
II型肺胞上皮細胞の少なくとも1つの特徴が、プロSPCおよびサイトケラチン-5からなる群より選択される少なくとも1つの発現である、本発明1021の方法。
[本発明1023]
MSCが脂肪組織由来MSC (AT-MSC)である場合、MSCが、クララ細胞の少なくとも1つの特徴を示す細胞へ分化する、本発明1020の方法。
[本発明1024]
クララ細胞の少なくとも1つの特徴が、クララ細胞分泌タンパク質(CCSP)の発現である、本発明1023の方法。
[本発明1025]
基材上でMSCを培養し、それによって肺細胞へMSCを分化させる工程を含む、肺細胞へ間葉幹細胞(MSC)を分化させる方法により産生された肺細胞の集団。
[本発明1026]
MSCが、骨髄由来MSC (BM-MSC)および脂肪組織由来MSC (AT-MSC)からなる群より選択される、本発明1025の肺細胞の集団。
[本発明1027]
治療用遺伝子を発現するように遺伝子改変された細胞を含む、本発明1025の肺細胞の集団。
[本発明1028]
肺細胞へ間葉幹細胞(MSC)を分化させる方法により産生された肺細胞の集団の治療的有効量を哺乳動物に投与する工程を含み、ここで分化させる方法は、基材上でMSCを培養しそれによって肺細胞へMSCを分化させることを含む、哺乳動物において肺異常を軽減または処置する方法。
本発明は、ヒト骨髄および脂肪組織由来の間葉間質細胞(それぞれhBM-MSCおよびhAT-MSC)が、その培養基材(例えば、脱細胞化された肺組織またはさまざまな表面コーティングを含有する培養プレート)に依って肺上皮マーカー発現の変化を起こすという発見に基づく。
別段の定義がない限り、本明細書において用いられる技術用語および科学用語は全て、一般に、本発明が属する技術分野の当業者が通常理解しているものと同じ意味を有する。一般に、本明細書において用いられる用語体系や、細胞培養、分子遺伝学、有機化学、ならびに核酸化学およびハイブリダイゼーションにおける実験手順は、当技術分野において周知であり、通常利用されているものである。
ヒドロコルチゾン、上皮成長因子、エピネフリン、トランスフェリン、インスリン、レチノイン酸、トリヨードサイロニン、および脂肪酸不含ウシ血清アルブミン。
本発明は、さまざまな幹細胞型(例えば、骨髄由来間葉幹細胞(BM-MSC)および脂肪組織由来間葉幹細胞(AT-MSC))が、その培養基材に依って、肺上皮マーカー発現の大きな変化を起こすという発見に関する。基材の一例としては、脱細胞化された肺組織およびさまざまな表面コーティングを含んだ培養プレートが挙げられるが、これに限定されることはない。脱細胞化された肺組織の教示は、米国特許出願公開第20120064050号のなかで見出すことができ、その内容は参照により本明細書に組み入れられる。
本発明は、肺細胞の一種(例えば、II型肺胞上皮細胞またはクララ細胞)へ分化させるために任意の細胞を用いることに関する。好ましくは、適当な細胞または細胞群は再生性である。再生性細胞の一例としては、幹細胞、胚性幹細胞、成人幹細胞、臍帯血細胞、組織由来の幹細胞または前駆細胞、骨髄由来の幹細胞または前駆細胞、血液由来の幹細胞または前駆細胞、脂肪組織由来の幹細胞または前駆細胞、間葉幹細胞(MSC)、骨格筋由来の細胞、複能性成人前駆細胞(MAPC)、胎児肺細胞、分化肺上皮細胞、肺前駆細胞、血管前駆細胞、分化血管細胞などが挙げられるが、これらに限定されることはない。使用できるさらなる再生性細胞には、骨髄由来の幹細胞、例えば骨髄単核球(BM-MNC)、内皮または血管幹細胞または前駆細胞、および末梢血由来の幹細胞、例えば内皮前駆細胞(EPC)などが含まれる。
本発明は、本発明の細胞を用いてさまざまな肺疾患および肺状態を処置するための組成物および方法を提供する。いくつかの例では、細胞には遺伝子改変細胞が含まれた。
分化は、非限定的にCa2+、上皮成長因子(EGF)、血小板由来成長因子(PDGF)、ケラチノサイト成長因子(KGF)、形質転換成長因子(TGF)、サイトカイン、例えばインターロイキン、インターフェロン、または腫瘍壊死因子、レチノイン酸、トランスフェリン、ホルモン(例えば、アンドロゲン、エストロゲン、インスリン、プロラクチン、トリヨードサイロニン、ヒドロコルチゾン、もしくはデキサメタゾン)、酪酸ナトリウム、TPA、DMSO、NMF (N-メチルホルムアミド)、DMF (ジメチルホルムアミド)、あるいはマトリックス要素、例えばコラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸)を含む、1種または複数種の分化剤を用いて誘導することができる。
以下に実験例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。これらの実施例は、例示のために記載するに過ぎず、別段の指定がない限り、限定を意図するものではない。したがって、本発明は、決して、以下の実施例に限定されると解釈されるべきではなく、本発明は、本明細書が提供する教示の結果として明白になる、ありとあらゆる変形を包含すると解釈すべきである。
本明細書において提示される実験において、ラット脱細胞化肺マトリックス上での培養後に肺上皮に寄与するヒト由来BM-MSCおよびAT-MSCの可能性について評価した。hBM-MSCおよびhAT-MSCは、肺足場上への播種後に付着および成長できることが分かった。末梢気道成長培地(small airway growth medium; SAGM)中の脱細胞化ラット肺足場における7日間の培養後、hBM-MSCは、RNAおよびタンパク質レベルで2型肺細胞マーカーのプロSPCを発現し、培地へ界面活性剤を分泌し、透過電子顕微鏡検査(TEM)によって示されるように層状体を含有する。さらに、hBM-MSC細胞は、ラットバイオリアクタ中での培養後、近位気道マーカーのサイトケラチン-5陽性である細胞を生じる。対照的に、hAT-MSCは、解剖学的に正確な位置で気道を裏打ちするクララ様細胞だけでなくプロSPC陽性細胞も生じる。しかしながら、hAT-MSCは、hBM-MSCと違って肺バイオリアクタ中での培養後にサイトケラチン-5陽性細胞を生じない。
新鮮な未処理ヒト骨髄サンプルをLonza, Allendale, NJ, USA (カタログ番号1M-125)から入手した。年齢22~29歳の女性2人および男性1人の、3人の全ドナーサンプルを得た。10% FBSを含有する高グルコースDMEM中に1 cm2あたり細胞5×105個の密度で骨髄細胞をプレーティングした。培地を2~3日ごとに交換した。低継代数(5回以下)の細胞だけを実験に用いた。細胞を1:3の比率で7~10日ごとに継代した。細胞をCD90、CD105、CD73、CD45 (全ての抗体はeBiosciencesから入手した)の発現についてフローサイトメトリー(BD LSR II)により特徴付けた。
単個細胞を10分間2%パラホルムアルデヒド溶液で固定し、各5分間PBS中で2回洗浄した。関心対象の希釈抗体を含有する10% FBS, 0.2% Triton X-100とともに細胞をインキュベートした。細胞を暗所中で25分間、以下の抗体(全てeBiosciences, San Diego, CA, USAから入手): CD45-PE (12-9459-41)、CD90-FITC (11-0909-41)、CD73-PE (12-0739-41)、CD105-APC (17-1057-41)とともに氷上でインキュベートした。使用したさらなる抗体は、プロSPC 1/100 (Millipore, Billerica, MA, USA: ab 3786)、およびCCSP 1/100 (Millipore 07-623)であった。これらの抗体の二次抗体は全て、1/500に希釈した種に適したInvitrogen Alexa Fluorsであった。使用したアイソタイプ対照には、抗マウスIgG-PE (eBiosciences 12-4714)、抗マウスIgG-FITC (ebiosciences 11-4724)、抗マウスIgG APC (ebiosciences 17-4015-80)、ウサギIgG-FITC (ebiosciences 11-4614-80)、および精製ウサギIgG (Invitrogen 02-6102)が含まれた。アイソタイプ対照に加えて、二次だけの抗体対照を並行して流した。
成体Sprague Dawleyラット肺(3~5ヶ月齢)を既述(Petersen et al., 2010, Science 329:538-541)のように脱細胞化した。手短に言えば、ラットをペントバルビタールナトリウム(ユサゾール(Euthasol))のIP注射によって安楽死させた。ラット肺を切除し、気管および肺動脈にカニューレを挿入した。ヘパリン(50 U/ml)およびニトロプルシドナトリウム(1 μg/ml)の10 ml混合液を肺動脈を通じ重力によって注入した。肺動脈に20 mmHgの一定圧力にて37℃でPBS中8 mMのCHAPS、25 mMのEDTA、1 MのNaClから構成されるpH 12の脱細胞化溶液500 mlを注入した。次いで気道を通して肺にベンゾナーゼ10 mlを注入し、37℃で1時間インキュベートした。細胞残留物をPBS 2.5 Lで洗い流した。細胞を播種する前に少なくとも16時間、肺を抗生物質および抗真菌薬(1%ゲンタマイシン、4 mg/mlのアンフォテリシン、10%ペニシリン/ストレプトマイシン)の混合液中でインキュベートした。このインキュベーションの間、肺動脈を通して1 mL/分で溶液を灌流させた。細胞を播種する前に、抗生物質/抗真菌薬の溶液を肺から除去し、PBSと交換した。細胞播種の前にさらに30分間、肺にPBSを灌流させた。一方の脱細胞化された右上ラット肺葉へ気管を通じて細胞2.5×106~10×106個のボーラスとして細胞を播種した。1 ml/分で肺動脈を通して培地を灌流させながら培養物をSAGM (Lonza, Allendale, NJ; カタログ番号CC-3118)中で7日間維持した。培地を2~3日ごとに交換した。
気道を通して肺に10%ホルマリン溶液を注入し、絶えず揺り動かしながら室温で4時間10%ホルマリン中に置いた。肺をパラフィン中に包埋し、5ミクロンで薄片にした。標準的な再水和アルコール/キシレン系列にしたがって切片を脱パラフィン処理した。20分間75℃でのTris-EDTA緩衝液(10 mM Tris Base, 1 mM EDTA, 0.05% Tween-20 pH 9.0)との再水和された組織切片のインキュベーションにより、抗原回復を行った。組織切片を次に、さらに20分間室温に冷却させた。免疫染色の前に、切片をPBS中で1回洗浄した。切片を45分間ブロッキング試薬(PBS中10%のNGSまたはFBS、0.2% Triton X-100)中でインキュベートした。一次抗体(CCSP 1/50: Millipore カタログ番号07-623; プロSPC 1/100: Millipore: # ab 3786; カベオリン-1 1/100: Abcam, Cambridge, UK # 39541; α平滑筋アクチン1/100: Dako, Glostrup, Denmark カタログ番号M0851)を室温で2時間、または4℃で終夜インキュベートした。切片を1回の洗浄につき3分間、3回PBS中で洗浄した後に、45分間室温で二次抗体(全て1/500に希釈したInvitrogen Alexa Fluorシリーズの種特異的な二次抗体)とのインキュベーションを行った。DAPI (Vector cat., Olean, NY # H1200)を含有するVector labs Vectashieldマウンティング培地中で組織切片をマウントした。
QiagenのRNeasy Mini Kitを用い、製造元の使用説明書にしたがって細胞から総RNAを抽出した。第1鎖相補DNA (cDNA)は、製造元のプロトコル(Invitrogen)にしたがってSuperScript First-Strand Synthesis Systemを使い、ランダムヘキサマーをプライマーとして用いて合成した。産物の等量混合物をPCR増幅の鋳型として用いた。iCylerおよびiQソフトウェア(Bio-Rad)を用いiQ(商標) SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, NY)ならびに示した各200 nMのフォワードおよびリバースプライマーとともに25 μlの容量中で反応を行った。各サンプルを三つ組で操作した。PCR条件には、95℃で4分の初期変性工程、その後に95℃で15秒、60℃で30秒および72℃で30秒からなるPCR 40サイクルを含めた。関心対象の遺伝子(GOI)に対する三つ組のPCR反応からの平均の閾値サイクル(Ct)値を、同じcDNAサンプルからの平均GAPDH Ct値に対して正規化した。サンプルAとサンプルBとの間のGOI転写産物レベルの倍変化は、2-ΔΔCtに等しく、ここでΔCt = Ct(GOI) - Ct(GAPDH)、およびΔΔCt=ΔCt(A) - ΔCt(B)である。用いたプライマーは、本明細書の他の箇所に記載されている。
全ての統計分析は、Originソフトウェア(OriginLab, Northampton, MA)で行った。データを平均±s.e.m. (測定の標準誤差)として表した。t検定を行って、2つの群が互いに有意差があるかどうか評価し、p≦0.05を統計的に有意とみなした。
Schmiedl et al. 2005の修正プロトコルにしたがった(Schmiedl, et al., 2005, Histochem Cell Biol 124(6):465-76)。天然ラット肺および再細胞化された肺を30分間0.2 Mのカコジル酸ナトリウム中2.5%のグルタルアルデヒド/2.0%のパラホルムアルデヒドで37℃にて膨張(inflation)固定した後に、4℃で2時間のインキュベーションを行った。固定された組織を0.1 Mのカコジル酸ナトリウムで洗い流した。組織を2時間1% OsO4中で後固定した後に、酢酸ウラニルブロック染色(en block uranyl acetate staining)を行った。組織を標準的なエタノール系列中で脱水し、EPON中に包埋した。切片(70 nm)を採取し、酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で後染色した。Philips Tecnai透過電子顕微鏡を用いて画像を得た。
フィブロネクチン(50 μg/ml)、コラーゲンI (100 μg/ml)、コラーゲンIV (50 μg/ml)、マトリゲル(1:80)、ならびにヒトECMタンパク質(1:100)の混合物(コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、テネイシン、エラスチン、ならびにいくつかのプロテオグリカンおよびグリコサミノグリカン; Sigmaからなる)を含む種々の細胞外タンパク質上で7日間、hBM-MSCおよびhAT-MSCを培養した。フィブロネクチン、コラーゲンI、コラーゲンIVおよびラミニンは、肺マトリックスの主成分である。
製造元の使用説明書にしたがい分泌SPC (Life Science Advanced Technology)を定量化するために、ラット無細胞肺足場上で培養されたhBM-MSCおよびhAT-MSCの上清から回収された細胞培地に対してELISAを行った。SPC値を細胞総数に対して正規化し、実験サンプルの値を新鮮SAGM培地のみから差し引いた。
新鮮単離された骨髄サンプルからhBM-MSCを得た(図1A~1C)。未分画骨髄を組織培養フラスコ上に配し、得られた接着細胞を、分化マーカーの標準的MSCクラスタの発現について免疫表現型判定した。継代数2~4の、初期継代hBM-MSCは、CD90、CD105、およびCD73について93%超陽性であったものの、大部分がCD45については陰性であった(図1B)。以前の研究によって、培養されたMSC様細胞の亜分画が上皮マーカーを発現しうることが示されていた(Wong, et al., 2009, J Clin Invest 119(2):336-48)ため、CCSP、プロSPCおよびサイトケラチン5を含む上皮マーカーの発現についても細胞をアッセイした(図1C)。FACS分析から、hBM-MSCが10% FBS/DMEM中での標準的な培養後に上皮マーカーを発現することが明らかにされた。本明細書において提示されたデータから、hBM-MSCがFACS分析によりCCSP (80%)、プロSPC (63%)、およびサイトケラチン-5 (77%)について陽性であることが示唆される(図1C)。これらの実験の陰性対照として、未分画の全骨髄単核細胞をFACSによって分析したところ、これらは肺上皮マーカーの評価について一様に陰性であった(図12)。
ラット肺無細胞マトリックス上に再播種されたhBM-MSC
脂肪または骨髄由来MSCがラット無細胞マトリックスを再細胞化しうるかどうか、およびこれらの細胞が無細胞マトリックス上での配置後に上皮表現型を呈しうるかどうか理解しようとして、MSCを既述の生体模倣ラット肺バイオリアクタシステム中で培養した(Petersen et al., 2010, Science 329:538-541)。脱細胞化された肺足場へMSCを播種する前に、天然のおよび脱細胞化された肺マトリックスのH&E組織像およびDAPI染色を観察した。これらの分析から、脱細胞化された肺には残存する天然肺細胞がないことが確認される(図2A~B)。
脱細胞化された肺上へ生着するhAT-MSCの能力を判定するため、細胞2.5~10×106個を、右上の、脱細胞化げっ歯類肺葉へボーラスとして播種し、hBM-MSCと同じ条件の下で7日間SAGM培地中で培養した。播種された肺のH&E組織プレパラートから、hAT-MSCは、マトリックス全体に付着しうるが、しかし気道中に付着しないhBM-MSCとは異なり、気道に付着して再配置するための特定の親和性を有することが実証された(図3A~B)。免疫染色から、気道に付着された細胞がクララ細胞のマーカーCCSP陽性であることが明らかにされた。これはhBM-MSCとは対照的であった。hBM-MSCは肺マトリックス上での培養後にCCSPの発現を維持しておらず、これらの細胞は気道に接着もしていない。
hBM-MSCおよびhAT-MSC再細胞化された肺において、さまざまな末梢肺上皮マーカーの遺伝子発現についても評価した。リアルタイムqRT-PCRを用いて、サーファクタントタンパク質C (II型)、カベオリン-1およびアクアポリン5 (AQP5, I型)の発現についてアッセイした(図4)。
脱細胞化された肺足場上へ播種されたMSCが器官に対して機能的な改善を提供したかどうか判定するため、脱細胞化された足場上で増殖している細胞による培地への活性サーファクタント分泌が認められるかどうか評価した(図5)。hBM-MSCを右上の、脱細胞化された肺葉へ細胞2×106個の密度で播種し、2時間マトリックスに付着させた後に、肺葉を半分に切断し、SAGMを含有する6ウェル培養プレート中にその小片を配した。このようにして播種された、肺スライスを3日間または7日間培養し、これらの時点で培地を集めた。RT-PCRにより、脱細胞化された足場のみと比べて、3日目~7日目の間にSPC遺伝子発現の増加が示された(図5A, 5B)。活性培養物の明視野顕微鏡検査によって、肺小片の近くに大部分が濃縮されていた油様液滴の可視層が明らかにされた(図5D, 5E)。これらの実験の対照として、MSCを播種しなかった足場を、同じ培養条件に置いた。これらの対照は油様液滴を含有していなかった(図8)。可視液滴が、播種された細胞により活発に産生されていたサーファクタントであったという可能性があるため、ELISAを行って、サーファクタントタンパク質Cの存在について試験した(図5C)。サーファクタントタンパク質Cは3日目および7日目の両時点で、それぞれ3.3 ng/mLおよび0.26/mLでhBM-MSCスライス培養物に存在していた(図5C)。hAT-MSCを播種した肺培養物は、培地中に存在するさらに多量のサーファクタントタンパク質を有していた。これらの培養物由来の馴化SAGMは、それぞれ5.55 ng/mLおよび1.16 ng/mLを含有していた(図5C)。これらのデータから、播種されたMSCは、MSCが脱細胞化された肺足場上で培養された場合にサーファクタントを活発に産生かつ分泌するという点で、2型肺細胞に似た機能をとることが示唆される。
MSCの分化に及ぼす培養基材の影響をさらに理解しようとして、hAT-MSCまたはhBM-MSCのいずれかを、コラーゲン1、コラーゲンIV、ラミニン、フィブロネクチン、ヒトECM、およびマトリゲルを含むさまざまな細胞外マトリックス(ECM)タンパク質でコーティングされた組織培養フラスコ上で培養した(図6)。コラーゲン1、コラーゲンIV、ラミニンおよびフィブロネクチンを選択したが、これは、各々が肺ECMの代表的成分だからである(Petersen et al., 2012, Cells Tissues Organs 195:222-231; Cortiella et al., 2010, Tissue Eng Part A 16:2565-2580); 細胞に混合ECM組成を供与しようとして、ヒトECMおよびマトリゲル・コーティングを選択した。SAGM中で7日間の培養期間の後、細胞の集団をFACSによりおよびRT-PCRにより上皮マーカー発現について特徴付けた。
過去の研究は、ラット肺を成功裏に脱細胞化させる方法の開発につながっている(Petersen et al., 2010, Science 329:538-541; Petersen et al., 2012, Cells Tissues Organs 195:222-231)。これらの知見は、脱細胞化されたヒト肺が、適切なドナー細胞を増殖させ、肺上皮細胞型へ分化させることができる足場として使用されることを究極的には可能にしうる(Badylak et al., 2011, Annu Rev Biomed Eng 13:27-53)。ドナー細胞型に不可欠である特徴には、1) 肺上皮または他の細胞型へ分化する能力; 2) 高度に増殖性である(脱細胞化された肺足場上へ播種する前にこれらの細胞を多数に拡大させることができなければならない); 3) 患者から容易に採取可能である(すなわち分化した細胞か幹細胞かのいずれかの、自家細胞源); および4) 免疫原性または免疫応答の誘発の欠如が含まれる。全体として、これらの特徴は、脱細胞化された肺に再播種するための供給源として間葉間質細胞を用いることの可能性を指し示すものである。hBM-MSCは、肺上皮を含むさまざまな上皮細胞型を生じることが以前に示されているが、これらの知見のなかには、まだ議論の余地があるものもある(Krause et al., 2001, Cell 105: 1-9; Wong et al., 2009, Cytotherapy 11:676-687; Ortiz et al., 2003, PNAS 100:8408-8411; Wong et al., 2007, Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 293:L740-L752; Wang et al., 2006, Stem Cells 24:482-493)。さらに、MSCは大部分の細胞型よりも免疫原性が低く、MHCクラス2マーカーを発現せず、T細胞の活性化の欠如によって証明されるように強力な免疫応答を惹起しない(Rasmusson et al., 2003, Transplantation, 76: 1208-1213)。ラット肺マトリックスにおけるヒト骨髄および脂肪組織由来MSCの本研究は、少なくともII型肺胞細胞表現型、恐らく同様に他の表現型への上皮細胞分化の明白かつ疑う余地のない証拠を指し示すものである。
Claims (4)
- 脂肪組織由来間葉幹細胞(AT-MSC)から分化された肺上皮細胞の集団であって、
該AT-MSCが基材上に播種され、該基材が脱細胞化された肺組織であり、該AT-MSCが小気道増殖培地(SAGM)中で培養され、かつ分化された肺上皮細胞が、クララ細胞の少なくとも1つのマーカーを発現し、該少なくとも1つのマーカーが、クララ細胞分泌タンパク質(CCSP)である、前記肺上皮細胞の集団。 - 遺伝子改変細胞を含む、請求項1記載の肺上皮細胞の集団。
- 遺伝子改変細胞が、治療用遺伝子を発現するように遺伝子改変された肺上皮細胞である、請求項2記載の肺上皮細胞の集団。
- 哺乳動物において肺異常を軽減または処置するための組成物であって、請求項1記載の肺上皮細胞の集団の治療的有効量を含む、前記組成物。
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