IT201800020722A1

IT201800020722A1 - Biomateriale e suo utilizzo nel trattamento di patologie polmonari

Info

Publication number: IT201800020722A1
Application number: IT102018000020722A
Authority: IT
Inventors: Assunta Borzacchiello; Francesco Messina; Sala Francesca Della
Original assignee: Assunta Borzacchiello; Francesco Messina
Priority date: 2018-12-21
Filing date: 2018-12-21
Publication date: 2020-06-21
Also published as: WO2020128932A1; EP3897761A1

Description

DESCRIZIONE

annessa a domanda di brevetto per BREVETTO D’INVENZIONE INDUSTRIALE avente per titolo:

“Biomateriale e suo utilizzo nel trattamento di patologie polmonari”

CAMPO DELL’INVENZIONE

La presente invenzione si riferisce al settore biomedico del trattamento delle malattie polmonari e dei relativi sintomi. In particolare, la presente invenzione fornisce composizioni e metodi basati sull'uso di biomateriali polimerici combinati con cellule staminali che possano essere in grado di migliorare sinergisticamente lo sviluppo, la rigenerazione e la riparazione delle lesioni polmonari croniche e sintomi ad esse correlati.

TECNICA DI FONDO

Le malattie polmonari croniche tra cui la malattia polmonare ostruttiva cronica (COPD), l'asma e la broncodisplasia polmonare (BPD) del neonato prematuro presentano, come comune denominatore, lesioni polmonari che non si risolvono ma portano ad una aberrante riparazione del tessuto, determinando così un arresto della crescita alveolare nella BPD o la distruzione alveolare nella COPD. In particolare, l'asma e la COPD sono disordini comuni che colpiscono 1 su 12 persone in tutto il mondo. L'asma e la COPD sono malattie infiammatorie croniche caratterizzate da ostruzione delle vie aeree che sono reversibili nell'asma e spesso irreversibili nella COPD. Un'altra caratteristica importante della COPD, e occasionalmente anche dell’asma grave, è l'enfisema che comporta la distruzione del tessuto alveolare, con conseguente riduzione dello scambio di ossigeno. Le vie aeree sono costituite da un epitelio pseudostratificato che comprende cellule basali, ciliate e secretorie. Inoltre, sia nell'asma che nella COPD la funzione di barriera dell’epitelio risulta essere diminuita, poiché le proteine di giunzione intercellulari sono state distrutte [Postma et al, The New Engl Jour of med 2015, Slats et al Therap advan in resp disease 2016, Gohy et al J of the British Society for Aller and Clin Immuno 2016]. Altre caratteristiche condivise dell'asma e della COPD includono metaplasia delle cellule del calice con una maggiore produzione di muco, alterazioni delle reazioni infiammatorie, riduzione dell'espressione e dell'attività del peptide antimicrobico e alterazione della funzione basale che può portare a risposte difettive dopo la lesione [Mertens et al Pulm Pharmacol Ther 2017]. La BPD è una patologia polmonare cronica del neonato pretermine, rimane una delle causa principali di morbilità e mortalità, ed inoltre la percentuale di nascite premature è in costante aumento. Il rischio di sviluppare BPD è correlato inversamente con l'età gestazionale e il peso alla nascita. I neonati prematuri (24-28 settimane di gestazione) nascono durante le fasi canalicolari o sacculari dello sviluppo dei polmoni. La struttura polmonare, essendo caratterizzata da uno spazio aereo e pareti inspessite con carenza di surfattante, non è in grado di fornire una sufficiente ventilazione e scambio di gas. Per questo motivo, spesso sono necessari per la nascita la ventilazione meccanica e alte concentrazioni di ossigeno. Così, il barotrauma indotto dalla ventilazione meccanica, nonché la tossicità dell’ossigeno e lo stato di infiammazione sono fattori che contribuiscono per la maggior parte ai danni morfologici e funzionali nel polmone immaturo. Storicamente, la tossicità dell'ossigeno e il danno indotto dalla ventilazione meccanica erano i prerequisiti per l’attribuzione della BPD nei neonati prematuri, la cosiddetta “old BPD” ovvero vecchia BPD. Attualmente l’aumento della percentuale di sopravvivenza dei neonati in età gestazionale sempre più bassa ha portato alla definizione di una patologia etichettata come nuova BPD (“new BPD”) per la quale i risultati istologici dei polmoni hanno mostrato un’alterata formazione degli alveoli, in numero minore e di dimensioni maggiori, ed una crescita dismorfica a livello microvascolare, insieme ad un minore grado di infiammazione e fibrosi rispetto alla "vecchia" BPD.

Attualmente, non è disponibile una terapia curativa efficace. Sulla base della definizione di gravità della BPD (inclusi i neonati con BPD lieve) il 68% dei neonati prematuri nati con un'età gestazionale (GA) ≤28-29 settimane sviluppano la BPD. Inoltre, la BPD grave è associata a compromissione dello sviluppo neuronale, ipertensione polmonare e morte [Bhandari et al Pediatrics 2009, Chao CM et al Front Med 2015,].

Recenti intuizioni nella biologia delle cellule staminali hanno generato entusiasmo sul potenziale delle cellule staminali per rigenerare organi danneggiati [Pierro et al Thorax 2013, Beers et al J Clin Invest 2016]. Le cellule staminali mesenchimali (MSC) hanno attirato molta attenzione a causa della loro facilità di isolamento, potenziale differenziativo multilineare e proprietà immunomodulatorie. Le MSC derivanti dal midollo osseo degli adulti riescono a prevenire lesioni polmonari in vari modelli sperimentali di malattia polmonare, inclusi quelli su BPD. Le MSC possono essere isolate da diverse fonti, tra cui il sangue del cordone o dal cordone ombelicale, due fonti di cellule neonatali che presentano vantaggi unici rispetto alla controparte di MSC adulta [Pierro et al Thorax 2013]. Le MSC offrono una varietà di meccanismi potenzialmente vantaggiosi per il trattamento delle malattie polmonari riducendo l'infiammazione polmonare, la fibrillazione, lo stress ossidativo e l'apoptosi. Per valutare il loro potenziale nella prevenzione della BPD, l'efficacia della terapia delle MSC sull'immaturità polmonare deve ancora essere determinata.

Il loro modo di azione sembra essere principalmente attribuito ai meccanismi paracrini mediante i quali favoriscono alterazioni dell'ambiente nicchia/tessuto, con rilascio di fattori pro-angiogenici e antiapoptotici, produzione di matrice extracellulare (ECM), scambio di organelli come i mitocondri attraverso micro vescicole, attività immunomodulatorie e proprietà anti- infiammatorie [Laube et al Int J Biochem Cell Biol 2016].

Risultati preliminari dell'uso delle MSC sono riportati nel primo studio clinico delle MSC su neonati affetti da BPD nel 2014 chiamato PNEUMOSTEM. Questo prodotto è costituito da colture di cellule staminali ex-vivo allogeniche mesenchimali (hUCB-MSCs) derivate dal sangue di cordone ombelicale umano, [Chang YS et al J Pediatr 2014], somministrate in uno studio di “dose escalation” (1-2 x 107 cellule per chilogrammo) attraverso un tubo endotracheale in neonati estremamente prematuri nati a 27 settimane di gestazione per un periodo da 5 a 14 giorni. Rispetto ai controlli storici confrontati alle stesse età, i neonati trattati sviluppavano BPD meno gravi e presentavano livelli ridotti di infiammazione e non sono stati osservati effetti negativi correlati al trattamento. Attualmente è in corso la registrazione negli Stati Uniti (clinicaltrials.gov; NCT02381366) di uno studio open-label di dose escalation per questi neonati prematuri [Nitkin CR et al Stem Cells Transl Med 2017, O'Reilly, Thébaud et al CellTissue Res 2017].

Alcuni esempi di trattamenti delle lesioni polmonari noti alla letteratura brevettuale, ad esempio, sono i documenti brevettuali: US 5,633,003 Cantor, US 2008/0311088 Chang et al., US 2010/0266552 Jenkin et al., US 2009/0274665 Akabutu et al. I trattamenti illustrati in questi documenti sono eterogenei, ma nessuno di loro si concentra su composizioni che consentano un aumento dell’efficacia terapeutica delle MSC, per il trattamento delle malattie polmonari.

Inoltre, nelle patologie polmonari croniche, come la BPD e la COPD, è stato riportato che la rigenerazione della lesione polmonare, solo attraverso terapie basate sulle MSC, è più difficile da raggiungere. Poiché, la perdita e l'alterazione della ECM di supporto all’architettura polmonare può precludere la riparazione della normale struttura alveolare. In effetti, l'ECM è un'entità complessa fondamentale in molti processi biologici e, con segnali distinti, che contribuiscono a guidare l'adesione cellulare, la sopravvivenza, la proliferazione e inoltre il rimodellamento della ECM è coinvolto nel processo di alveolarizzazione. post-natale [Pittenger et al. Science 1999, Baksh et al. Stem Cells 2007, Collins JJP et al. Front Med (Lausanne) 2017].

Dunque, è sentita l’esigenza di ulteriori strategie aggiuntive combinate all’uso di una terapia basata solo su MSC [Collins, Thebaud et al, Birth Defects Research (part A) 2014] che permettano di incrementare l’efficacia della riparazione del danno polmonare al fine di ottenere una più completa rigenerazione dei tessuti polmonari.

SOMMARIO DELL’INVENZIONE

I presenti inventori hanno trovato che la somministrazione delle cellule mesenchimali all’interno di un biomateriale particolarmente adatto per la somministrazione per via polmonare permette di superare i limiti discussi sopra riscontrati nell’utilizzo delle cellule mesenchimali nel trattamento delle patologie polmonari.

Un primo oggetto dell’invenzione è pertanto un biomateriale, comprendente:

(a) almeno un polisaccaride naturale o semisintetico, e/o

(b) almeno una proteina del tessuto connettivo o un composto gelificante scelto tra proteine e polimeri sintetici gelificanti, e

(c) cellule mesenchimali umane.

Un secondo oggetto dell’invenzione è un biomateriale in accordo al primo oggetto dell’invenzione per uso in terapia, in particolare nel trattamento di patologie polmonari.

DESCRIZIONE DELLE FIGURE

Figura 1: Percentuale di vitalità delle hUCMSCs dopo 24 h di messa a contatto con il biomateriale 1 (pannello a) o 2 (pannello b), misurata come descritto nell’esempio 3.

Figura 2: Percentuale di vitalità delle hUCMSCs dopo 24 h di messa a contatto con il biomateriale 3 e con diverse concentrazioni del biomateriale 1, misurata come descritto nell’esempio 3.

Figura 3: di vitalità delle hUCMSCs dopo 24 h di messa a contatto con diverse concentrazioni del biomateriale 4, misurata come descritto nell’esempio 3.

Figura 4: Immagini confocali del differenziamento in cellule alveolari di tipo II dopo 15 e 21 giorni di incubazione con il biomateriale 1 nel sistema 1, come descritto nell’esempio 4.

Figura 5: Immagini confocali del differenziamento in cellule alveolari di tipo II dopo 15 e 21 giorni di incubazione con il biomateriale 1 nel sistema 2, come descritto nell’esempio 4.

Figura 6: Immagini confocali del differenziamento in cellule alveolari di tipo II dopo 15 e 21 giorni di incubazione con il biomateriale 4 nel sistema 3, come descritto nell’esempio 4.

Figura 7: Effetto dei biomateriali sul differenziamento delle hUCMSCS in cellule alveolari di tipo II dell’esempio 3.2. Analisi quantitativa delle immagini confocali dell’espressione della proteina SPC nel sistema 1 e 2 in presenza di biomateriale 1 (a) e del biomateriale 3 e del biomateriale 1 (b), come descritto nell’esempio 4.

Figura 8: Spettro meccanico del biomateriale 3, come descritto nell’esempio 5.

Figura 9: Spettro meccanico del biomateriale 3 e del biomateriale 4 a due diverse concentrazioni di acido ialuronico, 5 e 10 mg/ml, come descritto nell’esempio 5

DEFINIZIONI

Il termine “biomateriale” secondo la presente invenzione si riferisce ad una composizione che è adatta ad essere introdotta a livello di un tessuto o un organo del corpo umano ed in tal sede indurre o coadiuvare una risposta fisiologica.

Il termine “polisaccaride” secondo la presente invenzione si riferisce a macromolecole biologiche composte dall'unione di numerose molecole di monosi, uguali o diversi, uniti tra loro da un legame covalente.

Il termine “polisaccaride semisintetico” si riferisce ad un polisaccaride ottenuto modificando, tramite una o più reazioni chimiche, un polisaccaride naturale.

Il termine “proteina del tessuto connettivo” si riferisce a proteine che si trovano naturalmente nei tessuti connettivi animali .

I termini “composto gelificante”, “proteina gelificante” o “polimero gelificante” si riferiscono a un composto, proteina o polimero, rispettivamente, che dà origine, una volta disciolto in acqua o in una soluzione acquosa, ad una soluzione gelificabile, come sotto definita. Preferibilmente, detto composto, proteina o polimero dà origine ad una soluzione gelificabile a condizioni di pH e temperatura fisiologiche, ad esempio è scelta tra collagene di tipo I, albumina e copolimeri pluronici.

Il termine “copolimero pluronico” si riferisce a copolimeri simmetrici a tre blocchi comprendenti polietilene ossido e polipropilene ossido in alternanza lineare.

Il termine “cellule staminali mesenchimali”, dette anche cellule stromali multipotenti (MSC), si riferisce a cellule di aspetto molto simili ai fibroblasti in grado di formare colonie e di replicarsi e, in seguito a stimolazione con fattori di crescita e con mezzi di coltura condizionanti il differenziamento in senso alveolare, ad esempio il SAGM commercializzato da Lonza, di differenziarsi in cellule alveolari di tipo II.

Il termine “acido ialuronico” si riferisce ad un polisaccaride lineare che consiste in unità alternate di un disaccharide ripetuto, acido β -1,4-D-glucuronico-β-1,3-N-acetil-D-glucosamina. L'acido ialuronico è anche noto come ialuronano, ialuronato o HA. I termini ialuronano, acido ialuronico e HA sono usati in modo intercambiabile nel presente documento.

Il termine “gel” secondo la presente invenzione si riferisce ad un reticolo rigonfiato con una elevata percentuale di acqua e capace di mantenere una propria forma.

Il termine “soluzione gelificabile” secondo la presente invenzione si riferisce ad una soluzione che è in grado di gelificare in specifiche condizioni di pH e temperatura. Nella presente invenzione sono di particolare interesse soluzioni gelificabili in condizioni di pH e temperatura fisiologiche, in particolare a pH tra 7 e 7.8 e temperatura tra 36° e 37°C).

Il termine “soluzione viscosa” si riferisce ad una soluzione avente un viscosità di almeno 1x10<-3 >Pa s. DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE

I presenti inventori hanno identificato un nuovo biomateriale particolarmente adatto per la terapia delle patologie polmonari, che permette di superare i limiti riscontrati con l’utilizzo di sole cellule mesenchimali.

Un primo oggetto dell’invenzione è pertanto un biomateriale comprendente:

(a) almeno un polisaccaride naturale o semisintetico, e/o

(c) cellule mesenchimali umane.

Il biomateriale è preferibilmente un gel o una soluzione viscosa aventi una fase liquida acquosa. Nella fase acquosa del gel o della soluzione si trovano disciolti o dispersi i componenti a) e/o b) e c) di cui sopra.

Preferibilmente, il biomateriale presenta un pH fisiologico compatibile con l’ambiente polmonare, in particolare compreso tra 7 e 7.8.

Secondo una forma di realizzazione preferita, il biomateriale comprende tutti i componenti a), b) e c). Preferibilmente, in accordo a questa forma di realizzazione, il biomateriale si presenta in forma di gel o di soluzione viscosa aventi una fase liquida acquosa in cui si trovano disciolti i suddetti polisaccaride e proteina del tessuto connettivo o composto gelificante ed in cui sono disperse le suddette cellule staminali mesenchimali.

Secondo una forma di realizzazione preferita alternativa, il biomateriale comprende invece solo i componenti a) e c).

Preferibilmente, in accordo a questa forma di realizzazione, il biomateriale si presenta in forma di gel o di soluzione viscosa aventi una fase liquida acquosa in cui si trova disciolto il suddetto polisaccaride ed in cui sono disperse le suddette cellule staminali mesenchimali.

Secondo una ulteriore forma di realizzazione preferita alternativa, il biomateriale comprende i componenti b) e c).

Preferibilmente, in accordo a questa forma di realizzazione, il biomateriale si presenta in forma di gel o di soluzione viscosa, aventi una fase liquida acquosa in cui si trova disciolta la suddetta proteina ed in cui sono disperse le cellule staminali mesenchimali.

Preferibilmente, quando il suddetto biomateriale comprende il componente b) è una soluzione viscosa e il componente b) è un composto gelificante che dà origine ad una soluzione gelificabile in condizioni di pH e temperatura fisiologiche. Preferibilmente, detto polimero è scelto tra collagene di tipo I, albumina e copolimeri pluronici. Secondo questa forma di realizzazione, la soluzione si presenta in forma liquida a temperatura ambiente ma gelifica quando viene riscaldata ad una temperatura di 36°C-37°C, pari alla temperatura corporea.

Preferibilmente, il biomateriale presenta una viscosità compresa tra 1x10<-3 >Pa s e 10 Pa s, preferibilmente tra 4x10<-3 >Pa s e 1x Pa s. In particolare, quando il biomateriale è una soluzione viscosa, la viscosità è preferibilmente compresa tra 1x10<-3 >Pa s e 1 Pa s, quando il biomateriale è un gel, la viscosità è preferibilmente compresa tra 1x10<-2 >e 10 Pa s.

La viscosità del materiale è regolata a seconda della via di somministrazione utilizzata, come discusso sotto.

La viscosità del biomateriale può essere variata modificando la concentrazione e il peso molecolare del componente a) e la natura del componente b). In particolare, per il componente a) la viscosità aumenta all’aumentare sia della concentrazione che del peso molecolare (M). Ad esempio, per sistemi polimerici diluiti la viscosità aumenta come M <1>, mentre per sistemi polimerici concentrati aumenta come M <3.4>.

Preferibilmente, il suddetto polisaccaride è scelto tra polisaccaridi di origine marina, vegetale o animale, loro derivati naturali o sintetici e loro sali.

Più preferibilmente, il suddetto polisaccaride è scelto tra glicosamminoglicani, preferibilmente acido ialuronico, alginati, cellulose, chitina, chitosano, agarosio, loro derivati naturali o sintetici e loro sali. Più preferibilmente, tra i suddetti polisaccaridi sono particolarmente preferiti i polisaccaridi mucoadesivi, in grado di aderire alla mucosa polmonare.

Secondo una forma di realizzazione particolarmente preferita, il suddetto polisaccaride è acido ialuronico o un suo sale, preferibilmente un sale di sodio.

L'acido ialuronico presenta caratteristiche particolarmente adatte alle applicazioni del biomateriale della presente invenzione in quanto presenta capacità di mucoadesione ed è un componente essenziale della matrice extracellulare, avente proprietà strutturali e biologiche che gli conferiscono attività nella segnalazione cellulare, nella riparazione della ferita, nella morfogenesi e nell'organizzazione della matrice.

Particolarmente, il suddetto acido ialuronico o suo sale presenta un peso molecolare compreso tra 40 e 2000 KDa, più preferibilmente tra 100 e 1600 kDa, ancor più preferibilmente tra 100 e 500 kDa, ancor più preferibilmente tra 150 e 250 kDa, ancor più preferibilmente di 200 kDa.

Come dimostrato nella porzione sperimentale, l’acido ialuronico avente bassi pesi molecolari, tra 100 e 500 kDa, è particolarmente efficace nello stimolare la differenziazione cellulare. Inoltre, tale acido ialuronico presenta maggiori caratteristiche di compatibilità con l’ambiente polmonare. Infatti, l’acido ialuronico con peso molecolare intorno a 220 KDa è fisiologicamente già presente nel polmone [Burdick et al Adv Mater 2011], dove svolge importanti funzioni biologiche come la stabilizzazione dello strato tensioattivo del surfattante attraverso l’interazione con la componente fosfolipidica [Bray et al J Theor Biol 2001].

Secondo una forma di realizzazione, il biomateriale comprende un solo polisaccaride naturale e/o semisintetico, come sopra definito. Secondo una forma alternativa di realizzazione il biomateriale comprende una miscela di due o più dei suddetti polisaccaridi naturali e/o semisintetici.

Preferibilmente, detto polisaccaride, preferibilmente detto acido ialuronico o suo sale, è contenuto nel suddetto biomateriale ad una concentrazione in peso da 0,001 a 20%, più preferibilmente da 0,001 al 10%, ancor più preferibilmente da 0,005 a 10%, rispetto al peso totale del biomateriale. Quando miscele di due più polisaccaridi sono usati, gli intervalli di concentrazione succitati si riferiscono al peso totale di polisaccaridi rispetto al peso totale del biomateriale.

La suddetta proteina del tessuto connettivo è preferibilmente scelta tra collagene, fibronectina, proteoglicano, fibrillina, elastina, gelatina.

Il suddetto composto gelificante è preferibilmente scelto tra albumina, copolimeri pluronici (F127, F68). Il composto gelificante può anche essere una proteina del tessuto connettivo che presenta anche proprietà dei composti gelificanti, in particolare il collagene di tipo I o la gelatina.

Secondo una forma di realizzazione, il biomateriale comprende solo una proteina o un composto gelificante, come sopra definiti. Secondo una forma alternativa di realizzazione, il biomateriale comprende una miscela di due o più delle suddette proteine, dei suddetti composti gelificanti o una miscela di una o più delle suddette proteine e uno o più dei suddetti composti gelificanti.

Secondo una forma di realizzazione particolarmente preferita, la proteina usata nella presente invenzione è collagene, più preferibilmente collagene di tipo I o di tipo III, ancor più preferibilmente collagene di tipo I. Queste proteine sono fisiologicamente presenti in elevata quantità nel tessuto connettivo interstiziale dei polmoni, dove formano fibre a banda da 500 a 1000 μm.

Inoltre, il collagene di tipo I presenta la proprietà di composto gelificante, in quanto dà origine a soluzioni che gelificano a temperatura corporea (37°C) e a pH compreso tra 7 e 7.8. Questo permette di ottenere un biomateriale con caratteristiche particolarmente vantaggiose, in quanto si presenta in forma di soluzione viscosa prima della somministrazione e aumenta la viscosità gelificando una volta somministrato al paziente.

Preferibilmente, la suddetta proteina o composto gelificante, preferibilmente collagene, ancor più preferibilmente collagene di tipo I o di tipo III, è presente nel suddetto biomateriale ad una concentrazione in peso da 0,05 al 1%, preferibilmente da 0,1 a 1%, più preferibilmente da 0,1 a 0.5% rispetto al peso totale del biomateriale.

Le suddette cellule staminali mesenchimali sono preferibilmente di origine umana.

Queste cellule possono essere preferibilmente ottenute dal cordone ombelicale, dal sangue circolante, dall’osso, dal tessuto adiposo o dalla placenta attraverso procedure ben note all’esperto del ramo [Han YF et al Cytotechnology 2013, Smith JR et al Curr Protoc Stem Cell Biol 2017]. Particolarmente preferite sono cellule mesenchimali umane derivanti da cordone ombelicale (indicate anche come hUCMSCs). Queste cellule staminali adulte presentano infatti una significativa capacità di autorinnovamento e capacità di differenziazione multilineare.

Le cellule ottenute da cordone ombelicale sono utilizzabili dalla prima estrazione del tessuto (coltura primaria) fino al sesto passaggio (coltura secondaria), dove per passaggio si intende che le cellule della coltura primaria sono rimosse dalla piastra e seminate ad una minore intensità in un’altra piastra. Le cellule hUCMSCs possono essere anche ottenute direttamente da fonti commerciali, ad esempio le cellule “Umbilical Cord derived mesenchymal cells; Normal, Human” commercializzate da ATCC PCS-500-010.

Le cellule staminali mesenchimali sono disperse nel biomateriale preferibilmente ad una densità compresa tra 6x10<3 >e 10x10<3 >cellule/ml.

Preferibilmente, il suddetto biomateriale comprende inoltre una o più sostanze nutrienti per le cellule staminali mesenchimali, preferibilmente sciolte nella fase liquida acquosa. Preferibilmente, dette sostanze nutrienti sono scelte tra L-glutammina, fenolo rosso, sodio piruvato e sodio bicarbonato. Preferibilmente, il suddetto biomateriale preferibilmente comprende inoltre elettroliti e regolatori del pH che rendono le caratteristiche di osmolarità e pH del biomateriale accettabili per la somministrazione a livello polmonare.

Qualora il biomateriale non venga utilizzato per somministrazione al paziente ma per applicazioni sperimentali in vitro, può comprendere un mezzo di coltura contenente nutrienti come ad esempio il mezzo di coltura DMEM, SAGM, McCoys, CMR GMEM, HM, INDM, LM, RPMI, e/o una o più sostanze che stimolano la differenziazione cellulare delle cellule mesenchimali in cellule alveolari e/o uno o più antibiotici. Preferibilmente, le suddette sostanze che stimolano la differenziazione cellulare sono scelte tra albumina di siero bovino (BSA), preferibilmente alla concentrazione di 0.5 mg/ml, insulina, preferibilmente alla concentrazione di 5 mg/ml, transferrina, preferibilmente alla concentrazione di 10 mg/ml, estratto di pituitaria bovino, preferibilmente alla concentrazione di 30 mg/ml, adrenalina (epinefrina), preferibilmente alla concentrazione di 0,5 mg/ml triiodotironina, preferibilmente alla concentrazione di 6,5 ng/ml, acido retinoico, preferibilmente alla concentrazione di 0,1 ng/ml, cortisolo, preferibilmente alla concentrazione di 0,5 ml/ml, fattore di crescita epidermico umano (EGF), preferibilmente alla concentrazione di 0,5 ng/ml, siero bovino fetale (FBS), preferibilmente alla concentrazione del 5%.

Preferibilmente, i suddetti antibiotici sono scelti tra penicillina G, streptomicina o gentamicina solfato e/o uno o più agenti antifungini, preferibilmente scelti tra amfotericina B e nistatina.

La preparazione del biomateriale secondo la presente invenzione prevede l’utilizzo di un procedimento particolarmente semplice e rapido.

In particolare, viene preparata una soluzione acquosa omogenea dei componenti a) e/o b) e di tutti gli ulteriori componenti del biomateriale solubili in acqua come, ad esempio, le sostanze nutritive, gli elettroliti, gli antibiotici, gli antifungini e/o i regolatori del pH.

Alla soluzione, opzionalmente sterilizzata tramite filtrazione, vengono poi aggiunte le cellule mesenchimali e disperse omogeneamente.

Nel caso in cui il biomateriale contenga il componente b), il procedimento può includere un ulteriore stadio di gelificazione.

Come dimostrato nella porzione sperimentale, il biomateriale secondo l’invenzione stimola la proliferazione e la differenziazione in cellule alveolari delle cellule staminali mesenchimali, producendo un aumento dell’effetto terapeutico delle cellule mesenchimali sulle lesioni polmonari croniche.

Un secondo oggetto dell’invenzione è pertanto un biomateriale in accordo al primo oggetto dell’invenzione per uso in terapia, in particolare per uso nel trattamento di patologie polmonari.

Preferibilmente, dette patologie polmonari sono scelte tra malattia polmonare ostruttiva cronica (COPD), asma e la broncodisplasia polmonare (BPD) del neonato prematuro.

Il biomateriale secondo l’invenzione può essere somministrato attraverso qualsiasi via di somministrazione che ne permetta il trasporto a livello degli alveoli polmonari.

Secondo una applicazione preferita, il biomateriale presenta una viscosità compresa tra 1x10<-3 >Pa s e 1xPa s, preferibilmente tra 4x10<-3 >Pa s e 1x10<-1>Pa s e viene somministrato per via intratracheale attraverso cannule di ventilazione oro-tracheali oppure naso-tracheali. In particolare, questa via di somministrazione è adatta a soluzioni viscose aventi la suddetta viscosità o a soluzioni viscose gelificanti a condizioni di pH e temperatura fisiologico, e che pertanto gelificano a livello dei tessuti polmonari alla temperatura corporea. Secondo una ulteriore applicazione preferita, il biomateriale della presente invenzione può essere somministrato tramite aerosolizzazione. Il biomateriale presenta una viscosità compresa tra 1x10<-3 >Pa s e 1x10 Pa s, preferibilmente tra 4x10<-3 >Pa s e 5x10<-2>.

Una volta somministrato il biomateriale agisce a livello del tessuto polmonare con effetto sinergistico sulla rigenerazione alveolare in seguito al danno provocato dai processi flogistici e/o dall’ immatura e alterata struttura alveolare.

La presente invenzione verrà di seguito illustrata dai seguenti esempi, che non si intendono come limitativi.

ESEMPI

Esempio 1

Sono stati preparati campioni di biomateriali aventi la seguente composizione in acido ialuronico e collagene:

Tabella 1: Composizione in acido ialuronico e collagene dei biomateriali da 1 a 4.

(* HA: acido ialuronico)

a. Preparazione dei biomateriali 1 e 2

Sono state preparati i biomateriali 1 e 2 ad ognuna delle concentrazioni in peso di HA riportate in tabella 1, con HA avente peso molecolare di 200 kDa per i campioni del Biomateriale 1 o con HA avente peso molecolare di 1435 kDa per i diversi campioni del Biomateriale 2. In particolare, sono stati preparati campioni, sotto forma di soluzioni nel mezzo di coltura adatto per l’esperimento da effettuare, alle seguenti concentrazioni di acido ialuronico: 1 mg/ml; 2.5 mg/ml; 5 mg/ml; 7,5 mg/ml e 10 mg/ml per il biomateriale 1 e 1 mg/ml; 2.5 mg/ml; 5 mg/ml e 10 mg/ml per il biomateriale 2.

In dettaglio, per effettuare gli esperimenti di vitalità cellulare, è stata pesata una opportuna quantità di acido ialuronico in forma di sale sodico ed è stato sciolto in un opportuno volume di DMEM (Microgem Italia L0064-500) mantenendo poi in agitazione per 3 ore in modo da garantire l’omogeneità della soluzione.

In dettaglio per effettuare gli esperimenti di differenziamento, è stata pesata una opportuna quantità di acido ialuronico in forma di sale sodico ed è stato sciolto in un opportuno volume di SAGM (Lonza C-4124) mantenendo poi in agitazione per 3 ore in modo da garantire l’omogeneità della soluzione. Le soluzioni ottenute dalla precedente procedura sono stata sterilizzata per filtrazione utilizzando filtri da 0.22 micron.

b. Preparazione del biomateriale 3

Il biomateriale 3 è stato ottenuto utilizzando la seguente procedura:

8 ml di una soluzione di Collagene di tipo I di origine bovina (Sigma Aldrich n. cat. fD 3510-100) è stata aggiunta alla temperatura di 4°C a 2 ml di una soluzione filtrata di tampone di fosfato di Dulbecco 10 X (D-PBS, Gibco), ottenendo una concentrazione finale di collagene di 2,4 mg/ml.

La soluzione così ottenuta viene utilizzata per dare origine ad un gel di collagene, aggiungendo gocce di NaOH e/o HCl per regolare il pH a 7,2 e ponendo la soluzione in un incubatore alla temperatura di 37° C per 40 minuti per far avvenire il processo di fibrillogenesi.

c. Preparazione del biomateriale 4

Sono state preparati diversi campioni del biomateriale 4, in forma di soluzione contenenti collagene alla concentrazione di 2.4 mg/ml e acido ialuronico avente peso molecolare 200 kDa a diverse concentrazioni finali: 1 mg/ml; 5 mg/ml; e 10 mg/ml.

In dettaglio 100 mg di acido ialuronico sono stati sciolti in un apposito contenitore in 10 ml di soluzione di D-PBS per preparare una soluzione madre, in modo da ottenere una soluzione con una concentrazione di acido ialuronico di 10 mg/ml. La soluzione così ottenuta è stata filtrata e diluita con opportuni volumi secondo un fattore di diluizione 2x per ottenere la concentrazione di 5 mg/ml e un fattore 10 X per ottenere la soluzione a concentrazione 1mg/ml. Le soluzioni così ottenute sono aggiunte, alla temperatura di 4°C, alla soluzione di collagene preparata come descritto nell’Esempio 3, per ottenere concentrazioni finali di acido ialuronico di 1 mg/ml; 5 mg/ml; e 10 mg/ml.

La soluzione così ottenuta viene utilizzata per dare origine ad un gel di collagene, aggiungendo gocce di NaOH e/o HCl per regolare il pH a 7,2. e ponendo la soluzione in un incubatore alla temperatura di 37° C per 40 minuti per far avvenire il processo di fibrillogenesi.

Esempio 2

Estrazione e coltura di hUCMSCs

Le hUCMSCs sono state estratte dai cordoni ombelicali secondo i metodi conformi [Han YF et al Cytotechnology 2013] e possono essere crioconservate secondo i metodi conformi [Smith JR et al Curr Protoc Stem Cell Biol 2017].

Nel dettaglio, il tessuto del cordone ombelicale è stato rimosso da una soluzione sterile di cloruro di sodio allo 0,9% contenente Penicillina (200 unità/ml)-Streptomicina (200 μg/ml) in una cappa a flusso laminare e lavato due volte con una soluzione di tampone fosfato (PBS). Il cordone ombelicale, di circa 10 cm, è stato tagliato in tre parti uguali. Ogni pezzo è stato a sua volta tagliato in piccoli pezzi di circa 1 cm di lunghezza, che sono poi stati lavati accuratamente per rimuovere il sangue e coaguli di sangue, le arterie ombelicali, le vene e l'avventizia del cordone ombelicale è stata rimossa per ottenere la gelatina di Wharton. Quindi, i pezzi contenenti la gelatina di Wharton sono stati sezionati in piccoli pezzi di circa 1 mm<3 >e usati per isolare e coltivare le hUCMSC primarie. I pezzi di tessuto tagliati correttamente sono stati inseriti in piastre da 10 cm per culture tissutali e intervallati da 0,5 cm. E’ stato aggiunto mezzo completo (Dulbecco’s modiﬁed Eagle’s medium (DMEM)) addizionato con il 10% (vol/vol) di siero bovino fetale (FBS), penicillina (100 units/ml), e streptomicina (100 μg/ml), i tessuti sono stati coltivati in incubatore al 5 % di CO2 e umidità saturata a 37°C.5 ml di mezzo completo è stato aggiunto 4 ore più tardi per un periodo prolungato di coltura, e i mezzi sono stati cambiati ogni 3-4 giorni. L'adesione e la crescita delle cellule primarie sono state osservate grazie a un microscopio a contrasto di fase invertito.

Per la conservazione, le hUCMSCs preparate sono state sospese alla densità di 1 x 10<6 >cellule per ml in un mezzo per la crioconservazione, costituito dal 10% al 20% di siero bovino fetale (FBS) e dal 5-10% di dimetilsolfossido (DMSO). La sospensione cellulare è stata conservata in criovials in un dispositivo che riduce la temperatura di circa 1° C al minuto a velocità controllata, in modo da conservarle a -80° C. Sono poi state trasferite in un serbatoio di azoto liquido, mantenuto a -150° C.

Esempio 3

Effetto dei biomateriali sulla vitalità delle hUCMSCs

Per verificare la vitalità delle cellule preparate secondo la procedura descritta nell’Esempio 2 quando messe a contatto con i biomateriali da 1-4 è stato eseguito il test Alamar Blu (Invitrogen).

Il test Alamar Blue è stato eseguito aggiungendo il reagente Alamar Blue (AB) alle cellule a contatto con i biomateriali 1-4 e incubando a 37 °C per 4 ore.

L'assorbanza dei campioni è stata misurata utilizzando un lettore di piastre di spettrofotometro (Multilabel Counter, 1420 Victor, Perkin Elmer) a 570 nm e 600 nm. AB è un colorante che incorpora un indicatore dell’ossidazione-riduzione che cambia colore in risposta alla riduzione chimica del mezzo di crescita, risultante dalla vitalità cellulare. I risultati sono espressi come differenza percentuale tra i campioni trattati e controlli e sono calcolati con la seguente formula:

Dove O1 è il coefficiente di estinzione molare (E) di AB ossidato a 570 nm; O2 è l'AB ossidato a 600 nm; A1 è l'assorbanza dei pozzetti di prova a 570 nm; A2 è l'assorbanza dei pozzetti di prova a 600 nm; P1 è l'assorbanza del pozzetto di controllo positivo a 570 nm; P2 è l'assorbanza del pozzetto di controllo positivo a 600 nm.

a. Effetto del biomateriale 1 e del biomateriale 2 sulla vitalità delle hUCMSCs

Cellule hUCMSCs preparate come descritto nell’Esempio 2 sono state seminate sulla superfice piatta di piastre di petri e sono state incubate per 24 hr con i biomateriali 1 e 2 contenenti DMEM e diverse concentrazioni di acido ialuronico preparati nell’Esempio 1a o con DMEM non supplemento con acido ialuronico (controllo).

Dopo questo tempo il reagente Alamar blu è aggiunto ai campioni ed incubato a 37°C per 4 hr. I risultati sono riportati in figura 1 (pannello 1a per biomateriale 1 e pannello 1b per biomateriale 2) ed espressi in termini di percentuale di vitalità calcolata così come riportato sopra, alle diverse concentrazioni di acido ialuronico nel biomateriale 1 e 2.

Dalla figura si può notare che i biomateriali 1 e 2 non hanno effetti negativi sulla vitalità cellulare. Per il biomateriale 1, a tutte le concentrazioni analizzate, si osserva un incremento della vitalità delle cellule hUCMSCs oltre il 100% (fig.1.a). Pertanto il biomateriale 1, contenente acido ialuronico a basso peso molecolare, stimola un incremento della proliferazione cellulare.

Per il biomateriale 2 invece si osserva un incremento della vitalità delle cellule rispetto al controllo ad una sola concentrazione di acido ialuronico.

b. Effetto della combinazione biomateriale 3 e biomateriale 1 sulla vitalità delle hUCMSCs Per valutare l’effetto della combinazione del biomateriale 3 e del biomateriale 1 sulla vitalità cellulare, le hUCMSCs sono state unite alla soluzione di collagene descritta nell’Esempio 1b a pH 7.2 e la sospensione così ottenuta è stata messa a 37°C per un tempo adeguato per consentire la fibrillogenesi in presenza delle cellule e quindi ottenere un gel tridimensionale composito di collagene e hUCMSCs. Il gel composito ottenuto è successivamente messo a contatto con il biomateriale 1 a diverse concentrazioni di acido ialuronico per 24 hr o con DMEM non supplementato con acido ialuronico (controllo). Dopo questo tempo il reagente Alamar blu è stato aggiunto ai campioni ed incubato a 37°C per 4 hr. I risultati sono riportati in figura 2 ed espressi in termini di percentuale di vitalità, alle diverse concentrazioni acido ialuronico nel biomateriale 1, calcolata come riportato sopra. Dalla figura 2 si può osservare che a tutte le concentrazioni di biomateriale 1 la vitalità delle cellule del gel è maggiore o uguale al controllo. Inoltre è possibile notare un incremento della vitalità all’aumentare della concentrazione, che raggiunge un massimo per la concentrazione di 10 mg/ml. Questi risultati indicano che il collagene, utilizzato come materiale di controllo, ha effetti positivi sulla vitalità cellulare, che l’aggiunta di acido ialuronico nel mezzo di coltura ulteriormente favorisce.

c. Effetto del biomateriale 4 sulla vitalità delle hUCMSCs

Per valutare l’effetto del biomateriale 4 sulla vitalità cellulare, le hUCMSCs sono state unite alla soluzione di collagene e acido ialuronico a pH 7.2 descritta nell’Esempio 1c ed è stato poi ottenuto un gel interpenetrato di collagene ed acido ialuronico contenente hUCMSCs. Il biomateriale 4 contenente le cellule è successivamente messo a contatto con DMEM per 24 ore. Il biomateriale 3 è usato come controllo. Dopo questo tempo il reagente Alamar blu è aggiunto ai campioni ed incubato a 37°C per 4 hr. I risultati sono riportati in figura 3 ed espressi in termini di percentuale di vitalità calcolata così come riportato nell’ esempio 2.1. Con questo esperimento è possibile valutare l’effetto dell’acido ialuronico e collagene sulla vitalità quando entrambi sono a contatto con le cellule. Dalla figura 3 si può osservare che a tutte le concentrazioni di acido ialuronico nel biomateriale 4 la vitalità delle cellule del gel è maggiore o uguale al controllo. In particolare si osserva un massimo di vitalità, statisticamente significativa (p<0.01), per una concentrazione specifica di 5mg/ml di acido ialuronico nel biomateriale 4.

Esempio 4

Studio del differenziamento in vitro delle cellule hUCMSCs in cellule alveolari di tipo II Al fine di valutare il differenziamento delle cellule hUCMSCs, a contatto con i biomateriali da 1 a 4, in cellule epiteliali alveolari di tipo II le cellule hUCMSCs sono state poste a contatto con delle cellule, definite cellule feeder (nutrienti) che possano simulare l’ambiente fisiologico della nicchia/tessuto dei polmoni in accordo al protocollo sperimentale riportato in letteratura [Ma N et al Cell Biol Int.2011]. Come cellule feeder è stata utilizzata la linea cellulare MRC-5 (ATCC CCL-171), derivata da normale tessuto polmonare fetale. In particolare, le MRC-5 sono state coltivate in flasche di coltura T-75 (Falcon, Italia 156499), nel mezzo di coltura cellulare EMEM, (Hyclone, USA) integrato con 10% di siero bovino fetale (FBS) e antibiotici (penicillina G 100 U/mL, streptomicina 100 μg/mL) e aminoacidi non essenziali 2x, a 37°C al 5% CO2. Le cellule sono state cresciute fino all'80% della confluenza e sono state trattate con 10 μg / ml di mitomicina C (Sigma n° 10107409001) in mezzo basale per 2 ore a 37° C [Ma N et al Cell Biol Int 2011]. Le cellule del feeder sono poi sono messe a contatto in un preciso rapporto di 1:10 con le cellule hUCMSCs per gli studi del differenziamento.

Inoltre, a tal fine come mezzo di coltura per indurre il differenziamento polmonare è stato utilizzato SAGM (Lonza C-4124), mezzo appositamente usato per la crescita e il mantenimento di un epitelio polmonare distale maturo, che consiste di terreno basale più i seguenti fattori: 0,5 mg/ml di BSA, 5 mg/ml di insulina, 10 mg / ml di transferrina, 30 mg/ml bovini pituitaria estratto, 0,5 mg / adrenalina ml (epinefrina), 6,5 ng triiodotironina / ml, 0,1 ng / acido retinoico ml, 0,5 mg / cortisolo ml, 0,5 ng / ml EGF umano (fattore di crescita epidermico) e antibiotici (gentamicina solfato, 0,05 Mg / ml; amphotericina-B, 0,05 mg / ml) integrata con 5% di siero bovino fetale (FBS).

Per valutare il differenziamento delle cellule hUCMSCs, è stata valutata l'espressione qualitativa e quantitativa della proteina C del surfattante (SPC), marker specifico del differenziamento in tessuti polmonari mediante tecnica di immunofluorescenza [Ma N et al Cell Biol Int 2011].

La proteina SPC è la più importante proteina funzionale del surfattante secreta negli alveoli. Infatti, il surfattante è sintetizzato e secreto dalle cellule epiteliali alveolari di tipo II, chiamate anche pneumociti, che si differenziano tra le 24 e le 34 settimane di gestazione del feto umano. È composto dal 70-80% di fosfolipidi (dipalmitoilfosfatidilcolina-DPPC), circa il 10% di proteine (SP-A, SP-B, SP-C e SP-D) e il 10% di lipidi neutri, principalmente colesterolo [Mertens et al Pulm Pharmacol Ther 2017]. In particolare, la SPC è una proteina trans-membrana con un breve dominio extra-membrana espressa esclusivamente dalle cellule alveolari di tipo II dopo la nascita, viene immagazzinato nei corpi lamellari con i fosfolipidi del surfattante fino alla secrezione nello spazio alveolare in cui aumenta la stabilità e la diffusione dei fosfolipidi.

In particolare, il differenziamento delle hUCMSCs in cellule alveolari di tipo II è stato valutato nelle seguenti condizioni sperimentali:

● Sistema 1:

Cellule hUCMSCs sono state seminate in fluorodish da 35 mm (World Precision Instruments, Inc) e coltivate per 15 e 21 giorni su uno strato di cellule feeder come descritte sopra, utilizzando come mezzo di coltura i biomateriali 1 e 2, contenenti SAGM e acido ialuronico alla concentrazione di 5 mg/ml, preparato come descritto nell’esempio 1a. Come controllo si sono utilizzate cellule hUCMSCs messe a contatto con DMEM, che non induce differenziazione, e con SAGM.

● Sistema 2 :

Cellule hUCMSCs e cellule feeder sono state unite alla soluzione di collagene a pH 7.2 descritta nell’Esempio 1b ed è stato poi ottenuto un gel interpenetrato di collagene contenente hUCMSCs e cellule feeder secondo il procedimento descritto. Le cellule nel gel sono state poi seminate in fluorodish da 35 mm (World Precision Instruments, Inc) e coltivate utilizzando come mezzo di coltura il biomateriale 1 contenenti SAGM e acido ialuronico concentrazione 5 mg/ml o DMEM e SAGM non contenenti acido ialuronico (controllo) per 15 e 21 giorni.

● Sistema 3:

Cellule hUCMSCs e cellule feeder sono state unite alla soluzione di collagene e acido ialuronico a pH 7.2 descritta nell’Esempio 1c, ed è stato poi ottenuto un gel interpenetrato di collagene contenente hUCMSCs e cellule feeder secondo il procedimento descritto. Le cellule nel gel sono state poi seminate in fluorodish da 35 mm (World Precision Instruments, Inc) e coltivate, utilizzando come mezzo di coltura SAGM contenente il biomateriale 1 alla concentrazione 5 mg/ml o DMEM e SAGM non contenenti acido ialuronico (controllo) per 15 e 21 giorni.

Tutti i campioni sono stati fissati al 10% di formalina (Sigma-Aldrich) per 1 h, le cellule sono state permeabilizzate con lo 0,1% di Triton X-100, e il blocking è stato eseguito al 5% di albumina di siero bovina BSA (Sigma). I campioni sono stati quindi incubati con un anticorpo da coniglio SPC ovvero anticorpo-rabbit SPC (Abcam AB40879) diluito all’ 1% BSA a 4° C overnight. Dopo tre lavaggi con il PBS, l'anticorpo secondario anti-rabbit coniugato con fluoroforo verde “fitch" (Millipore, Billerica, MA, U.S.A.) è stato aggiunto alle cellule per 3 ore a temperatura ambiente. Infine, i nuclei cellulari sono stati colorati con blu DAPI per 10 minuti a 37° C. I campioni sono stati osservati al microscopico confocale (Leica TCS SP8) con obiettivi ad immersione e in acqua di 40X e 63X. Le immagini sono state acquisite con una risoluzione di 1024x1024 pixel.

L’analisi quantitativa delle immagini confocali è stata effettuata su cinque immagini per ogni campione dopo 21 giorni di incubazione. Le immagini acquisite mediante microscopio confocale sono state analizzate utilizzando il software ImageJ “area calculator plugins” calcolando la percentuale del valore medio di grigio (MGV).

I dati sono stati riportati come MGV normalizzato per l’area di interesse (ROI) delle singole cellule. Analisi Statistica

In tutti gli istogrammi i risultati sono stati espressi come media ± deviazione standard (SD). I risultati ripetuti sono stati confrontati con l’analisi di varianza a una via (ANOVA) ed è stato considerato significativo un valore P <0,05.

Le immagini confocali (figura 4, 5 e 6), ottenute con la tecnica di immunofluorescenza, mostrano l'espressione qualitativa del marker specifico SP-C nelle cellule alveolari di tipo II dopo aver coltivato le cellule secondo il Sistema 1, 2 o 3, come sopra descritto per 15 e 21 giorni.

Tutti i campioni trattati mostrato reattività all’anticorpo SPC. Cellule SPC immunoreattive, sono state osservate chiaramente sotto forma di spots di fluorescenza rilevati in maniera omogeneamente diffusa a livello citoplasmatico. Inoltre dalla figura 4 è possibile osservare sia a 15 che 21 giorni che le cellule differenziate presentano una morfologia diversa dalla nota morfologia fibroblast like delle hUMSCs, mostrando una forma approssimativamente cuboidale con dimensioni più regolari, tipica delle cellule epiteliali.

Nella Figura 7 è riportata l’analisi quantitativa delle immagini confocali. L’intensità di fluorescenza è espressa come mean gray value (MGV), in particolare nella figura 7 (a, b) sono riportate le intensità di fluorescenza per le hUCMSCs del Sistema 1 e 2, rispettivamente.

Sia per le cellule trattate secondo il Sistema 1 che secondo il Sistema 2 l’intensità di fluorescenza, che indica la presenza della proteina C del surfattante e dunque del differenziamento in senso pneumocitico, è maggiore quando le hUCMSCs sono messe a contatto col biomateriale 1 contenente acido ialuronico sciolto in SAGM, rispetto alle cellule messe a contatto con SAGM da solo. Si può notare che quantitativamente le cellule sono in grado di differenziare in entrambi i Sistema 1 e 2 in presenza sia di biomateriale 1 e 3 che di entrambi.

Il destino delle cellule staminali in vivo è principalmente regolato dal microambiente [Pierro M, Thébaud B et al Thorax 2013]. È stato dimostrato che un'interazione epiteliale-mesenchimale è critica nello sviluppo normale del polmone. I fibroblasti sono il principale tipo di cellule mesenchimali presenti nel microambiente del polmone che possono indurre le cellule epiteliali alveolari di tipo II a maturare ed esprimere il gene SPC. Da questi esperimenti abbiamo visto come l’acido ialuronico, che è normalmente presente nel microambiente polmonare, possa promuovere l’effetto dei segnali cellulari volti al differenziamento in senso pneumocitico con un effetto maggiore rispetto all’utilizzo del mezzo condizionato SAGM da solo e che il collagene, anch’esso presente nell’architettura alveolare come l’acido ialuronico, può promuovere il differenziamento in senso pneumocitico. Inoltre i risultati hanno dimostrato che sia l’acido ialuronico a basso che ad alto peso molecolare favoriscono la differenziazione in senso pneumocitico e quindi anche miscele di acido ialuronico a diversi pesi molecolari sono potenzialmente utili per questa applicazione.

2.3 Proprietà reologiche dei biomateriali analizzati

Al fine di valutare le proprietà reologiche dei biomateriali utilizzati, l’analisi delle proprietà viscoelastiche è stata effettuata mediante un reometro rotazionale a sforzo controllato (Mars III, Reometro HAAKE, Waltham, MA USA), utilizzando una geometria a piatti paralleli alla temperatura controllata di 20 e 37 ̊C. I campioni sono stati sottoposti a prove di taglio oscillatorie a frequenza variabile tra 0,01 e 10 Hz. Al fine di identificare il range di risposta viscoelastico lineare dei materiali sono eseguiti test preliminari di amplitude sweep sui campioni alla frequenza di oscillazione di 1 Hz. I test sono stati ripetuti almeno tre volte su ciascun campione.

La dipendenza del modulo elastico G' e del modulo viscoso G'' in funzione della frequenza, il cosiddetto "spettro meccanico" è stata valutata per i biomateriali della presente invenzione.

Nella figura 8 è riportato, a titolo di esempio, lo spettro meccanico del biomateriale 3. Come si può osservare dalla figura 8 il modulo elastico G’ è poco dipendente dalla frequenza ed è maggiore del modulo viscoso G’’ in tutto il range di frequenza analizzato, questo comportamento è tipico dei “gel” ed è caratteristico di tessuti soffici quali cartilagine, nucleo polposo del disco intervertebrale ecc. Nella figura 9 è invece rappresentata la dipendenza del modulo viscoso dalla frequenza del biomateriale 4 a due diverse concentrazioni di acido ialuronico: 5 mg/ml e 10 mg/ml. Come si può notare dalla figura 9, alla frequenza di 1 Hz il valore del modulo elastico è 3.75 per il biomateriale 3 e 4.7 e 7.11 per il biomateriale 4 alla concentrazione di 5 e 10 mg/ml di acido ialuronico rispettivamente. Ciò indica che la presenza di acido ialuronico porta ad un aumento delle proprietà elastiche del network da cui è costituito il biomateriale stabilizzandone la struttura.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Biomateriale comprendente: (a) almeno un polisaccaride naturale o semisintetico, e (b) almeno una proteina del tessuto connettivo e/o un composto gelificante scelto tra proteine gelificanti e polimeri sintetici gelificanti, e (c) cellule mesenchimali umane.
2. Biomateriale secondo la rivendicazione 1, in forma di gel o soluzione viscosa aventi una fase liquida acquosa.
3. Biomateriale secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui il suddetto polisaccaride è selezionato tra glicosamminoglicani, alginati, cellulose, chitina, chitosano, agarosio, loro derivati naturali o sintetici e loro sali.
4. Biomateriale secondo le rivendicazioni da 1 a 3, in cui il suddetto polisaccaride è acido ialuronico o un suo sale, preferibilmente un sale di sodio, preferibilmente avente peso molecolare compreso tra 40 e 2000 KDa, più preferibilmente tra 100 e 1600 kDa, ancor più preferibilmente tra 100 e 500 kDa, ancor più preferibilmente tra 150 e 250 kDa, ancor più preferibilmente di 200 kDa.
5. Biomateriale secondo le rivendicazioni da 1 a 4 in cui detta proteina del tessuto connettivo è scelta tra collagene, fibronectina, proteoglicano, fibrillina, elastina, gelatina e/o detto composto gelificante è scelto tra albumina, copolimeri pluronici, F127, F68.
6. Biomateriale secondo le rivendicazioni da 1 a 5 in cui detta proteina è collagene, più preferibilmente collagene di tipo I o di tipo III, ancor più preferibilmente collagene di tipo I.
7. Biomateriale secondo le rivendicazioni da 1 a 6, in cui suddette cellule staminali mesenchimali sono di origine umana.
8. Biomateriale secondo le rivendicazioni da 1 a 7, per uso in terapia.
9. Biomateriale per uso secondo la rivendicazione 8, per uso nel trattamento di patologie polmonari.
10. Biomateriale comprendente: (a) almeno un polisaccaride naturale o semisintetico, e/o (b) almeno una proteina del tessuto connettivo e/o un composto gelificante scelto tra proteine gelificanti e polimeri sintetici gelificanti, e (c) cellule mesenchimali umane, per uso nel trattamento di patologie polmonari.
11. Biomateriale per uso secondo le rivendicazioni 9 o 10, in cui dette patologie polmonari sono malattia polmonare ostruttiva cronica (COPD), asma e la broncodisplasia polmonare (BPD) del neonato prematuro.