JP7168552B2 - 造血幹細胞・前駆細胞の作製、増殖および分化のための置換アゾール誘導体 - Google Patents
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Description
(i)前記試料に含まれる単核細胞画分を培地中で培養する工程;および
(ii)前記単核細胞を、少なくとも1種のアゾール系低分子を含む組成物に接触させる工程
を含む方法を提供する。
Xは、NR4、OまたはSを示し;
R1は、C6~10アリールまたは6~10員の芳香族複素環系(該C6~10アリールおよび該6~10員の芳香族複素環系は、無置換であるか、またはハロ、C1~6アルキル、C1~6アルケニルおよびC1~6アルキニルから選択される1つ以上の置換基で置換されている(該C1~6アルキル、該C1~6アルケニルおよび該C1~6アルキニルは、無置換であるか、またはハロから選択される1つ以上の基で置換されている))を示し;
R2は、C6~10アリールまたは6~10員の複素環系(該C6~10アリールおよび該6~10員の複素環系は、無置換であるか、またはハロ、C1~6アルキル、C1~6アルケニルおよびC1~6アルキニルから選択される1つ以上の置換基で置換されている(該C1~6アルキル、該C1~6アルケニルおよび該C1~6アルキニルは、無置換であるか、またはハロから選択される1つ以上の基で置換されている))を示し;
R3は、無置換またはハロ、OR5、C1~6アルキル、C1~6アルケニルおよびC1~6アルキニルから選択される1つ以上の基で置換されたC6~16アリール(該C1~6アルキル、該C1~6アルケニルおよび該C1~6アルキニルは、無置換であるか、またはハロから選択される1つ以上の基で置換されている)を示し;
R4およびR5は、HおよびC1~4アルキルからそれぞれ独立して選択される(該C1~4アルキルは、無置換であるか、またはハロから選択される1つ以上の基で置換されている))
で示される化合物またはその塩もしくは溶媒和物である。
R6は、H、Cl、BrまたはFを示し;
R7は、H、Cl、Br、FまたはOR8を示し;
R8は、無置換またはClおよびFから選択される1つ以上の置換基で置換されたC1~3アルキルを示し;
R1およびR2は、前記2~11項のいずれか一項で定義した通りである)
で示される化合物またはその塩もしくは溶媒和物である。
R9は、H、Cl、Br、FまたはC1~3アルキル(該C1~3アルキルは、無置換であるか、またはClおよびFから選択される1つ以上の置換基で置換されている)を示し;
R10は、H、Cl、BrまたはFを示し;
R2は、前記2~12項のいずれか一項で定義した通りであり;
R6およびR7は、前記12項で定義した通りである)
で示される化合物またはその塩もしくは溶媒和物である。
(i)4-[2-(1-フルオロナフタレン-2-イル)-4(5)-(4-フルオロフェニル)-1H-イミダゾール-5(4)-イル]ピリジン;
(ii)4-[2-(1-フルオロナフタレン-2-イル)-4-(m-トリル)-1H-イミダゾール-5-イル]ピリジン;
(iii)4-[2-(ナフタレン-2-イル)-4(5)-(m-トリル)-1H-イミダゾール-5(4)-イル]ピリジン;
(iv)4-[2-(ナフタレン-2-イル)-4(5)-(4-フルオロフェニル)-1H-イミダゾール-5(4)-イル]ピリジン;
(v)4-[2-(1-ブロモナフタレン-2-イル)-4(5)-(4-フルオロフェニル)-1H-イミダゾール-5(4)-イル]ピリジン;
(vi)4-[2-(1-フルオロナフタレン-2-イル)-4-[3-(トリフルオロメチル)フェニル]-1H-イミダゾール-5-イル]ピリジン;
(vii)2-(1-フルオロナフタレン-2-イル)-4-(ピリジン-4-イル)-5-(m-トリル)オキサゾール;
(viii)5(4)-(3,6-ジヒドロ-2H-ピラン-4-イル)-2-(1-フルオロナフタレン-2-イル)-4(5)-(m-トリル)-1H-イミダゾール;
(ix)5(4)-(3,6-ジヒドロ-2H-ピラン-4-イル)-2-(6-メトキシナフタレン-2-イル)-4(5)-(m-トリル)-1H-イミダゾール;
(x)5(4)-(3,6-ジヒドロ-2H-ピラン-4-イル)-2-(1-フルオロナフタレン-2-イル)-4(5)-(4-フルオロフェニル)-1H-イミダゾール;
(xi)4-(4(5)-(4-フルオロフェニル)-2-(7-メトキシナフタレン-2-イル)-1H-イミダゾール-5(4)-イル)ピリジン;
(xii)4-[4(5)-(m-トリル)-1H-イミダゾール-5(4)-イル]ピリジン;および
(xiii)4-[4(5)-(4-フルオロフェニル)-1H-イミダゾール-5(4)-イル]ピリジン
からなる群から選択される。
便宜上、本明細書、実施例および添付の請求項において使用される特定の用語を以下にまとめた。
(i)前記試料に含まれる単核細胞画分を培地中で培養する工程;および
(ii)前記単核細胞を、少なくとも1種のアゾール系低分子を含む組成物に接触させる工程
を含む方法を提供する。
Xは、NR4、OまたはSを示し;
R1は、C6~10アリールまたは6~10員の芳香族複素環系(該C6~10アリールおよび該6~10員の芳香族複素環系は、無置換であるか、またはハロ、C1~6アルキル、C1~6アルケニルおよびC1~6アルキニルから選択される1つ以上の置換基で置換されている(該C1~6アルキル、該C1~6アルケニルおよび該C1~6アルキニルは、無置換であるか、またはハロから選択される1つ以上の基で置換されている))を示し;
R2は、C6~10アリールまたは6~10員の複素環系(該C6~10アリールおよび該6~10員の複素環系は、無置換であるか、またはハロ、C1~6アルキル、C1~6アルケニルおよびC1~6アルキニルから選択される1つ以上の置換基で置換されている(該C1~6アルキル、該C1~6アルケニルおよび該C1~6アルキニルは、無置換であるか、またはハロから選択される1つ以上の基で置換されている))を示し;
R3は、無置換またはハロ、OR5、C1~6アルキル、C1~6アルケニルおよびC1~6アルキニルから選択される1つ以上の基で置換されたC6~16アリール(該C1~6アルキル、該C1~6アルケニルおよび該C1~6アルキニルは、無置換であるか、またはハロから選択される1つ以上の基で置換されている)を示し;
R4およびR5は、HおよびC1~4アルキルからそれぞれ独立して選択される(該C1~4アルキルは、無置換であるか、またはハロから選択される1つ以上の基で置換されている))
で示される化合物またはその塩もしくは溶媒和物である。
R6は、H、Cl、BrまたはFを示し;
R7は、H、Cl、Br、FまたはOR8を示し;
R8は、無置換またはClおよびFから選択される1つ以上の置換基で置換されたC1~3アルキルを示し;
R1およびR2は、前記2~11項のいずれか一項で定義した通りである)
で示される化合物またはその塩もしくは溶媒和物である。
R9は、H、Cl、Br、FまたはC1~3アルキル(該C1~3アルキルは、無置換であるか、またはClおよびFから選択される1つ以上の置換基で置換されている)を示し;
R10は、H、Cl、BrまたはFを示し;
R2は、前記2~12項のいずれか一項で定義した通りであり;
R6およびR7は、前記12項で定義した通りである)
で示される化合物またはその塩もしくは溶媒和物である。
(i)4-[2-(1-フルオロナフタレン-2-イル)-4(5)-(4-フルオロフェニル)-1H-イミダゾール-5(4)-イル]ピリジン;
(ii)4-[2-(1-フルオロナフタレン-2-イル)-4-(m-トリル)-1H-イミダゾール-5-イル]ピリジン;
(iii)4-[2-(ナフタレン-2-イル)-4(5)-(m-トリル)-1H-イミダゾール-5(4)-イル]ピリジン;
(iv)4-[2-(ナフタレン-2-イル)-4(5)-(4-フルオロフェニル)-1H-イミダゾール-5(4)-イル]ピリジン;
(v)4-[2-(1-ブロモナフタレン-2-イル)-4(5)-(4-フルオロフェニル)-1H-イミダゾール-5(4)-イル]ピリジン;
(vi)4-[2-(1-フルオロナフタレン-2-イル)-4-[3-(トリフルオロメチル)フェニル]-1H-イミダゾール-5-イル]ピリジン;
(vii)2-(1-フルオロナフタレン-2-イル)-4-(ピリジン-4-イル)-5-(m-トリル)オキサゾール;
(viii)5(4)-(3,6-ジヒドロ-2H-ピラン-4-イル)-2-(1-フルオロナフタレン-2-イル)-4(5)-(m-トリル)-1H-イミダゾール;
(ix)5(4)-(3,6-ジヒドロ-2H-ピラン-4-イル)-2-(6-メトキシナフタレン-2-イル)-4(5)-(m-トリル)-1H-イミダゾール;
(x)5(4)-(3,6-ジヒドロ-2H-ピラン-4-イル)-2-(1-フルオロナフタレン-2-イル)-4(5)-(4-フルオロフェニル)-1H-イミダゾール;
(xi)4-(4(5)-(4-フルオロフェニル)-2-(7-メトキシナフタレン-2-イル)-1H-イミダゾール-5(4)-イル)ピリジン;
(xii)4-[4(5)-(m-トリル)-1H-イミダゾール-5(4)-イル]ピリジン;および
(xiii)4-[4(5)-(4-フルオロフェニル)-1H-イミダゾール-5(4)-イル]ピリジン
からなる群から選択される。
(i)4-[2-(1-フルオロナフタレン-2-イル)-4(5)-(4-フルオロフェニル)-1H-イミダゾール-5(4)-イル]ピリジン;
(ii)4-[2-(1-フルオロナフタレン-2-イル)-4-(m-トリル)-1H-イミダゾール-5-イル]ピリジン;
(iii)4-[2-(ナフタレン-2-イル)-4(5)-(m-トリル)-1H-イミダゾール-5(4)-イル]ピリジン;
(iv)4-[2-(ナフタレン-2-イル)-4(5)-(4-フルオロフェニル)-1H-イミダゾール-5(4)-イル]ピリジン;
(v)4-[2-(1-ブロモナフタレン-2-イル)-4(5)-(4-フルオロフェニル)-1H-イミダゾール-5(4)-イル]ピリジン;
(vi)4-[2-(1-フルオロナフタレン-2-イル)-4-[3-(トリフルオロメチル)フェニル]-1H-イミダゾール-5-イル]ピリジン;および
(vii)2-(1-フルオロナフタレン-2-イル)-4-(ピリジン-4-イル)-5-(m-トリル)オキサゾール
からなる群から選択される。
方法
臍帯血(UCB)の採取、処理、解凍および播種
ドナーから提供されたものの臍帯血バンクの臨床基準を満たさなかった臍帯血単位をSingapore Cord Blood Bank(SCBB)から入手し、これらの臍帯血単位から臍帯血(UCB)を得た。臍帯血の提供者である母親およびSCBBの研究諮問倫理委員会から事前の承諾を得るとともに、シンガポール国立大学(NUS)の施設内審査委員会およびSingapore General Hospital(SGH)から、試料を使用する承認を得た。Ficoll-HistopaqueTM Premium(GEヘルスケア、英国)を使用した密度勾配遠心分離によって新鮮なUCBから単核細胞(MNC)を単離した。臍帯血単核細胞(UCB-MNC)をカウントし、10%v/vジメチルスルホキシド(DMSO)(シグマ アルドリッチ、米国)を加えた90%v/v自己血漿中に入れ、次の使用まで凍結保存した。この方法の概要を図3に示す。ヒト血清アルブミン(25%v/v)(Health Sciences Authority、シンガポール)およびデキストラン40(75%v/v)(Hospira、米国)を使用してUCB-MNCを解凍した。次いで、細胞表面マーカーによる幹細胞濃縮を行わずに、100ng/mLの幹細胞因子(SCF)(PeproTech、米国)とトロンボポエチン(TPO)(PeproTech、米国)からなるヒトサイトカインカクテル;50ng/mL FLT-3リガンド(FLT-3L)(PeproTech、米国);および20ng/mLインスリン様成長因子結合タンパク質-2(IGFBP-2)(R&Dシステムズ、米国)を添加したStemSpanTM Serum-Free Expansion Media(SFEM)またはアニマルコンポーネントフリー培地(ACF)(STEMCELL Technologies、カナダ)中に、経験則に基づいて決定した最適密度4.0×105個/mLでUCB-MNCを播種して培養した。UCB-MNCに対する効果について、5μMの濃度のIM-29の存在下または非存在下における様々なサイトカインの組み合わせ(各濃度は前掲の通り)を試験し、ACF培地中で11日間培養した際の総有核細胞(TNC)および造血幹細胞・前駆細胞(HSPC)の増殖に対するこれらのサイトカインおよびIM-29の効果を調べた。いくつかの実験では、精製された細胞集団、たとえば、初期前駆細胞(CD45+CD34+CD38-)を5.0×104個/mlの最適播種濃度で播種し、あるいは後期前駆細胞(CD45+CD34+CD38+)を2.0×106個/mlの最適播種濃度で播種して細胞培養を開始した。これらの純粋な細胞集団は、凍結解凍した未濃縮のUCB-MNCを蛍光標識抗体で標識し、蛍光活性化セルソーティング(FACS)を行うことによって得た。様々な置換アゾール系低分子をDMSOに溶解し、経験則に基づいて決定した最適濃度5.0μMで培養に加えた。アゾール系低分子の非存在下においてサイトカインを添加したUCB-MNC培養をコントロールとして使用し、サイトカインおよびDMSOを添加した培養を溶媒コントロールとして使用した。
解凍した新鮮なUCB-MNCから得た顆粒球・単球(GM)または前記細胞培養プロトコルによって11日間増殖させた細胞のコロニー形成単位(CFU)を評価した。エリスロポエチン(EPO)(ミルテニーバイオテク、ドイツ)を添加した造血幹細胞(HSC)CFU測定用完全培地1.1mLを入れた35mmのペトリディッシュ(BD Falcon、米国)中に、解凍した新鮮なUCB-MNC(5,000個または10,000個)および増殖させた細胞(1,000個または5,000個)を二連で播種し、途中で培地を変更することなく培養した。37℃、5%CO2の湿潤環境下で14~16日間培養後、コロニーを定量し、電荷結合素子(CCD)カメラ(Olympus Europa GmbH、ドイツ)を備えたオリンパス社製SZ61顕微鏡を使用して写真を撮影した。
異種移植研究は、Singapore Health Services(SingHealth)の動物実験委員会による承認を受けてなされた。非肥満糖尿病(NOD)重症複合免疫不全(SCID)γ鎖欠損(NSG)マウスとしてよく知られているNOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJマウスをジャクソン研究所(バー・ハーバー、米国)から購入し、SingHealth Experimental Medicine Centreにおいて性別ごとに6匹ずつケージに収容した。滅菌した食餌および水を自由に摂取させた。順化させ、繁殖させた後、8~12週齢のマウスに致死量以下の放射線(240cGy)を照射し、5つの実験群に無作為に分け、(i)生理食塩水;(ii)増殖させていないUCB-MNC;(iii)StemSpanTM-SFEMまたはStemSpanTM-ACF中においてサイトカインの存在下で増殖させたUCB-MNC(コントロール増殖培養);(iv)StemSpanTM-SFEMまたはStemSpanTM-ACF中においてIM-29およびサイトカインの存在下で増殖させたUCB-MNCのいずれかを尾静脈内投与した。インビボにおけるヒト細胞の生着動態を調べるため、(SFEMまたはACF中でIM-29の存在下または非存在下において)増殖させたUCBを、経験則に基づいて最適化した等価用量(equivalent dosage)2.5×107個/kg、5.0×107個/kgまたは10.0×107個/kgで移植するとともに、増殖させていないUCBを絶対用量2.5×107個/kg、5.0×107個/kgまたは10.0×107個/kgで移植した。移植の20週間後に一次NSGレシピエントマウスの骨髄から細胞を得て、(メーカーのプロトコルに従って)磁気抗体標識およびカラム精製(ミルテニーバイオテク、ドイツ)を行い、ヒトCD45+細胞を単離した。二次NSGレシピエントマウスを、(i)増殖させていないUCB-MNC移植群、(ii)サイトカインの存在下で増殖させたUCB-MNC移植群および(iii)IM-29およびサイトカインの存在下で増殖させたUCB-MNC移植群の各実験群に分け、単離したヒトCD45+細胞をマウス1匹あたり1×106~2×106個の移植用量で尾静脈注射することによって投与した。
データはいずれも、Cytomics FC500フローサイトメーター(ベックマン・コールター社、米国)またはBDTM LSR II(ベクトン・ディッキンソン社、米国)を使用し、1試料あたり少なくとも10,000イベントを測定することによって得た。次に、取得したデータを、CXP解析ソフトウェア(ベックマン・コールター社、米国)またはBD FACSDivaTM 8.0ソフトウェア(ベクトン・ディクソン社、米国)を使用して解析した。後述の滅菌された適切な蛍光標識モノクローナル抗体で標識し、UCB-MNCに由来する初期前駆細胞(CD45+CD34+CD38-)と後期前駆細胞(CD45+CD34+CD38+)をBD FACSAriaTM III(ベクトン・ディクソン、米国)を使用して識別した(図17G)。染色に使用する抗体の最適な濃度を特定するために滴定を行った。解析における非特異的な抗体結合をゲーティングにより除外するために、アイソタイプコントロールを使用した。
UCB-MNC試料を改変カルノア固定液(ライカバイオシステムズ、ドイツ)で固定し、ガラス製の顕微鏡用スライド上に載せ、エタノール系列(シグマ アルドリッチ、米国)(70%、85%および100%)で2分間ずつ脱水し、空気乾燥させた。
培養を行っていないUCB-MNCと、リード化合物であるIM-29の存在下または非存在下において標準的なサイトカインカクテルを含むStemSpanTM-ACF培地中で培養した10日目のUCB-MNCとを使用して核型解析を行った。核型解析を行うため、ウシ胎仔血清(シグマ、米国)、L-グルタミン(Gibco、米国)および抗生物質(Gibco、米国)を添加したRPMI 1640培地(Gibco、米国)を使用して、37℃に維持した5%CO2湿潤インキュベーター内で各UCB-MNC細胞をさらに48時間培養した。培養した細胞を回収し、標準的な臨床検査プロトコルに従ってGバンド解析を行った。20個の細胞を解析し、核型解析の結果は、International System for Human Cytogenetic Nomenclature (2016)に従って記載した。
解凍した新鮮なUCB-MNC細胞または(5.0μM IM-29の存在下または非存在下において)培養したUCB-MNC細胞の細胞塗抹標本を、標準的な臨床検査プロトコルを使用して、メイグリュンワルドギムザ(MGG)染色、スダンブラックB染色、過ヨウ素酸シッフ反応(PAS)染色およびミエロペルオキシダーゼ染色(p-フェニレンジアミンおよびカテコール)で染め、正立顕微鏡を使用して画像を撮影した。染色試薬はすべてシグマ アルドリッチ社(米国)から入手した。
結果は、図面の簡単な説明に記載の特定のn数の平均値±標準誤差(SEM)または平均値±標準偏差(SD)として報告する。2群間の有意差は、スチューデントの両側t検定を使用して決定し、P値は図面の簡単な説明に記載した。データ処理および統計解析は、OriginPro(登録商標)9.1(OriginPro社、米国)、GraphPad Prism 6.0(GraphPad Software社、米国)およびマイクロソフトOffice Excel(マイクロソフト社、米国)を使用して行った。
培養方法の主な工程
IM-29を使用して、凍結解凍したUCB-MNCからHSPCを増殖させる本発明の方法を本発明の実施例において実施し、この方法に含まれる主な工程を図2に示す。具体的には、この方法は、
(i)密度勾配遠心分離によって新鮮なUCBから単核細胞(MNC)画分を単離し、増殖を行うまで-180℃で凍結保存する工程;
(ii)UCB-MNCを解凍し、SCF、TPO、FLT-3LおよびIGFBP-2からなるサイトカインカクテルを含み、既知成分からなる培地中でUCB-MNCを培養する工程;
(iii)5.0μMの最終濃度でIM-29を加える工程;
(iv)37℃に維持した5%CO2湿潤インキュベーター内で細胞をインキュベートする工程;
(v)3日目に、CD45を発現する白血球(WBC)の生存能力を確認する工程(CD45細胞のサブセットの1つとしてHSPCが含まれる);
(vi)7日目に、増殖培地、サイトカインおよびIM-29を補充する(注ぎ足す)工程;ならびに
(vii)10日目または11日目に、細胞を回収して、インビトロ表現型アッセイおよびインビトロ機能アッセイを使用して増殖を評価するとともに、免疫不全マウスにインビボ移植して再構築能を確認する工程
を含む。
SB203580化合物から誘導された低分子
p38 MAPK(マイトジェン活性化プロテインキナーゼ)の公知の阻害剤である親化合物SB203580(図6D)から誘導されたいくつかの類似体で構成された低分子ライブラリーを構築した。これらの類似体は、5~10μMの作用濃度で最適な活性を有していた。試験した化合物のうち、最も高い効果を示したのは図6Aに示す化学構造を有する化合物IM-29である。2番目に高い効果を示したのは、図6Bに示す化学構造を有する化合物IM-04である。IM-29およびIM-04の構造類似体のうち、IM-29およびIM-04に次いで効果が高かったものを図6Cに示す。本研究において、SB203580の類似体として、図6Eに示す計40種の化合物を作製し、構造および化学修飾に基づいて大きく4つのグループに分類した。図6Eに示すグループ1では、イミダゾールのC-4位およびC-5位の隣接するピリジン-4-イル/3-トリル部分またはピリジン-4-イル/3-(トリフルオロメチル)フェニル部分を保持したまま、イミダゾールのC-2位の置換基の様々なバリエーションを評価し、計6種の類似体を作製した。2番目に高い効果を示す化合物IM-04はグループ1に属する。さらに、イミダゾールのC-4位のトリル基または4-フルオロフェニル置換基を保持したまま、C-5位のピリジン-4-イル置換基をピラン-4-イル置換基で置換することによって、別の13種の類似体をグループ2として作製した(図6Eに示す)。図6Eに示すグループ3は、隣接するピリジン-4-イル/4-フルオロフェニル部分を保持したまま、イミダゾールのC-2位の置換基の様々なバリエーションを評価するために使用した化合物の構造を示す。リード化合物であるIM-29は、グループ3に属する。グループ4(図6E)では、化合物のコア構造であるイミダゾールをオキサゾールと置換した。図6Eに示したすべての類似体に基づいて構造活性相関研究を行い、HSPCの増殖を仲介するのに必須の重要な特異的化学構造および特異的修飾を特定した。概して、隣接するピリジン-4-イル/4-フルオロフェニル置換基を有するイミダゾールでは、C5位およびC4位に芳香族領域とH結合アクセプターが存在することによって、エクスビボにおけるHPCの増殖の誘導により高い活性を示すことが観察された。イミダゾールのC4位の置換基をトリルまたは3-(トリフルオロメチル)フェニル基と置換した場合、HPCの増殖に対する類似体の増強能が低下した。これと同様に、イミダゾールのC5位の置換基をピラン-4-イル基と置換した場合、HPCの増殖が有意に低下した。アゾールのC2位の置換基として最も好適であるのはナフチル置換基であり、このような置換基を有する類似体のうち、1-フルオロナフタレン-2-イルを置換基として有する化合物IM-29が、スクリーニングしたすべての化合物において、エクスビボでのHPCの増殖の誘導に最も強力な効果を示すことが特定された。IM-29において、イミダゾールのC2位の1-フルオロナフタレン-2-イルをナフタレン-2-イルで置換すると(たとえば化合物ZQX-33:4-[2-(ナフタレン-2-イル)-4(5)-(4-フルオロフェニル)-1H-イミダゾール-5(4)-イル]ピリジン)、HPCに対する増殖誘導能が少なくとも2分の1に低下した(P<0.001)。さらに、オキサゾール化合物(OZ-07)は、エクスビボにおけるHPCの増殖誘導において最適な活性を示さなかったことから、分子の中心構造にH結合ドナー基を有していることが必須であることが示唆された。
類似体IM-29によるエクスビボHPC増殖の有意な向上
5.0μMの濃度のIM-29の添加によって、CD45+CD34+CD38-CD45RA-の発現プロファイルを有する造血前駆細胞(HPC)が10日間で少なくとも1,200倍に増殖することが示された(図8A)。HPCに対するIM-29の増殖増強効果は、サイトカインコントロールの8倍となった。また、IM-04の添加によってHPCが10日間で1,000~1,150倍に増殖したのに対して(図8A)、IM-01、ZQX-33、ZQX-36、GJ-CまたはOZ-07の添加によってHPCが10日間で400~900倍に増殖した(図8A)。別のアゾール系低分子をさらに含めてアニマルコンポーネントフリー(ACF)培地でスクリーニングを再度行い、増殖データを図8Bに示した。さらに別の実験でも、HPCに関連するCD45+CD34+CD38-CD45RA-の発現がIM-29によって約68%に増加し、これはサイトカインコントロールの3倍であった(図8C)。
IM-29を培養に添加するタイミングおよび添加期間がHPCの増殖に及ぼす効果
IM-29を添加した培養においてUCBの培養期間を7日間から9日間に延長すると、HPCの増殖が少なくとも5倍増加した。一方、サイトカインのみを添加した培養では、同じ培養期間においてHPCの増加はわずか2.7倍に留まった。11日目までには培養開始時の細胞数と比較して、サイトカインコントロールでは総有核細胞(TNC)が最大で3倍に増加したのに対して、IM-29を添加した培養ではTNCが約6倍に増加した(図11)。
IM-29による免疫不全マウス生着細胞(HSC1およびHSC2)の割合の増加
IM-29およびサイトカインの存在下において、CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+(HSC1)およびCD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f+(HSC2)の発現率(%)が、非培養細胞の4~5倍に増加した(図13A)。細胞の絶対数に関しては、IM-29を添加して10日間培養した場合、免疫不全マウスに生着する細胞(HSC1:CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+)の割合が0日目と比べて少なくとも1,000倍に増加し、これに対して同じ集団にサイトカインのみを添加したコントロールでは、約80倍の増加しか観察されなかった(図13B)。CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f+によって定義されるHSC2では、IM-29を添加して10日間培養した場合、サイトカインのみのコントロールと比較して増殖が少なくとも7.5倍増加した(図13C)。
IM-29の存在下で培養した細胞における正常核型の維持
細胞遺伝学的解析を行ったところ、IM-29の存在下で培養した細胞は正常核型を維持し(図13D)、非培養細胞の核型(データ示さず)と比較しても差が認められないことがわかった。また、悪性血液疾患に関連する様々なプローブを使用した蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)を行ったところ、IM-29の存在下で増殖させた移植片は、サイトカインのみの存在下で増殖させた移植片や非培養移植片(データ示さず)と比べて正常な結果を示すことがわかった(図13E)。細胞形態学的解析および白血球細胞化学解析の結果、IM-29の存在下で増殖させた移植片の白血病化を示す証拠は得られなかった(図13E)。
IM-29の存在下で増殖させた移植片によるNSGマウスでの長期的な造血
IM-29の存在下で増殖させた移植片を移植した19週間後のNSGレシピエントマウスの骨髄を解析したところ、この移植片は、長期的な造血を誘導する能力を有することが認められた(図16A~16E)。他の研究者によって報告されているように[Notta F, et al., Blood 115(18): 3704-7 (2010); McDermott SP, et al., Blood 116(2):193-200 (2010)]、移植片の種類(すなわち増殖させた移植片であるか、あるいは増殖させていない移植片であるか)に関係なく、このマウスモデルでは、雌性レシピエントは雄性レシピエントよりも生着率が高かった(図16A)。雄性レシピエントおよび雌性レシピエントに2.5×107個/kgまたは5.0×107個/kgの移植用量で移植を行った場合、IM-29の存在下で増殖させた移植片を移植すると、絶対幾何平均値に差が認められたものの、増殖させていない移植片と比較して統計学的に同程度の量のヒトCD45細胞が確認され(図16B)、生着した共通前駆細胞(CD45+CD34+)、骨髄系前駆細胞(CD45+CD13+CD33+)およびリンパ系前駆細胞(CD45+CD7+)の量も同程度であった(図16C)。さらに、末梢血(PB)中におけるヒトCD45細胞の早期の生着と同様に(図15A)、凍結解凍後にIM-29の存在下で増殖させた移植片を投与すると、骨髄(BM)におけるヒト細胞の生着が、新鮮なUCBをIM-29の存在下で増殖させた移植片を投与した場合と同程度に長期間にわたって維持された(新鮮なUCBをIM-29の存在下で増殖させた移植片と凍結解凍後のUCBをIM-29の存在下で増殖させた移植片の間の差はP=0.6593であった;図16B)。また、IM-29の存在下で増殖させた移植片を移植したところ、末梢血中の初期の生着細胞は骨髄系細胞への分化に傾倒したものの、NSGマウスの骨髄(BM)においてヒト成熟骨髄系細胞(図16D)およびヒト成熟リンパ系細胞(図16E)を含む様々な細胞系列が再構築された。さらに、IM-29の存在下で増殖させた移植片は、移植を受けたNSGマウスの骨髄(BM)において白血病化しなかった。
IM-29およびサイトカインを添加して培養したUCB MNCから主に発生する成熟骨髄系細胞の維持とその増加
図17Aに示したデータは、臍帯血(UCB)単核細胞(MNC)からエクスビボで増殖培養を開始した場合、IM-29およびサイトカインを添加した培養では、骨髄系の成熟細胞(CD45+CD33+単球、CD45+CD13+CD15+顆粒球およびCD45+CD41a+CD61+巨核球で構成される)が主に維持され、増加することを示している。これは、IM-29の存在下で増殖させた移植片では、移植前に成熟リンパ系細胞(CD45+CD3+T細胞、CD45+CD19+B細胞およびCD45+CD56+NK細胞で構成される)が排除されていることを意味している。図17Bに示すように、移植用量を1億個/kgに増加したところ、IM-29の存在下で増殖させた移植片を移植した2週目までには、NSGマウスの末梢血(PB)中のヒトCD45+細胞の割合が7.1±0.6%となり、これはサイトカインのみの存在下で増殖させた移植片を移植したレシピエントの少なくとも5倍であり(P<0.0001;n=14)、さらに全ヒト細胞の絶対数も増加していた。一方、増殖させていないUCBをこのような1億個/kgという高い移植用量で移植すると、IM-29の存在下で増殖させた移植片と比較して少なくとも3.7倍有意に高い生着率を示した(P<0.0001;n=15)(図17B)。図15Bに示したデータと同様に、増殖させていない移植片を高い細胞用量で移植すると、移植後2週目のNSGマウスの末梢血(PB)中においてCD3+T細胞が主に生じたが、IM-29の存在下で増殖させた移植片を移植すると、ヒトT細胞集団の維持は最小限に抑えられた(図17C)。移植後2週目のNSGマウスの骨髄(BM)を解析したところ、増殖させていない移植片の移植(n=6)とIM-29の存在下で増殖させた移植片の移植(n=6)とでは、上記と同様のヒトCD45+細胞の生着が再現され、これは、サイトカインのみの存在下で増殖させたコントロール移植片(n=6)を移植した場合よりも有意に高かった(P<0.01)(図17D)。NSGマウスの骨髄(BM)中のCD34+ヒト前駆細胞に関しては、移植後2週目において、IM-29の存在下で増殖させた移植片の移植(n=6)では13.3±0.8%のCD34+ヒト前駆細胞が維持されていたのに対して、増殖させていない移植片の移植(n=6)では0.7±0.1%のCD34+ヒト前駆細胞が維持されていた(P<0.001)(図17D)。前記の末梢血(PB)中における生着データと同様に、増殖させていないUCBを移植したNSGマウスでは、増殖させた移植片を移植した場合と比較して、骨髄(BM)においてCD3+T細胞が割合の大部分を占めていた(図17D)。しかしながら、図16A~16Eに示したデータに基づくと、IM-29の存在下で増殖させた移植片を移植した場合、ヒト細胞の早期の生着は前駆細胞および骨髄系細胞への分化に傾倒するものの、長期研究(移植の19週間後以降)では、NSGマウスの骨髄(BM)中にリンパ系細胞の発生も見られることから、様々な細胞系列の再構築が維持されるということには注目すべきである。増殖させていない移植片から再構築されたヒトT細胞の量が多いことから、NSGレシピエントマウスにおいて移植片対宿主病(GVHD)がより高率に発生し、その結果、移植後60日目における生存率は約25%と低くなった(図17E)。一方、(IM-29の存在下または非存在下において)増殖させた移植片を移植したNSGマウスでは、GVHDの症状が最小限に抑えられていたことから、移植後60日目において70%を超える生存率となった(図17D)。
(i)工程1-移植には不十分な細胞用量の臨床凍結UCB単位1(UCB1)を得る。解凍して洗浄後、磁気カラムを使用してUCB単位1からCD34+細胞を選択する。
(ii)工程2-前述したIM-29の存在下での増殖プロトコルを使用してUCB1由来のCD34+細胞を培養する。
(iii)工程3-成熟リンパ系細胞を含むUCB1由来CD34-画分を凍結保存する。
(iv)工程4-10~11日間かけてUCB1由来CD34+細胞を増殖させ、7日目に培地、サイトカインおよびIM-29を補充する。
(v)工程5-増殖させたUCB1を回収して洗浄後、特性を評価する。
(vi)工程6-増殖させたUCB1を患者に注入する。
(vii)工程7-UCB1由来CD34-画分を解凍して洗浄後、患者に注入する。
(viii)工程8-移植に十分な細胞用量の臨床凍結UCB単位2(UCB2)を得る。解凍して洗浄後、患者に注入する。
IM-29に匹敵する低分子であるstemregenin-1(SR-1)を使用して濃縮HSPCを最長で15日間培養する類似の方法[Wagner JE, et al., Cell stem cell 18(1): 144-155 (2016)]では、CD34細胞の増殖率の中央値が330倍となっている。一方、本発明の方法に匹敵するニコチンアミド(NAM)を使用した別の技術[Horwitz ME, et al., J Clin Invest 124(7): 3121-3128 (2014)]では、21日間の培養においてCD34細胞の増加はわずか72倍に留まっている。これは、これらの低分子や方法と比べてIM-29が、CD34選択後の移植片の増殖に対して非常に強力な効果を発揮し、より短期間で有意により良好な増殖を達成できることを示している。これによって、試薬コストを節約することができる(SR1やNAMを使用した場合と比較して、培地、サイトカインおよび低分子の補充が少なく済む)とともに、このような細胞療法製品の製造に必要とされる期間を短縮することができると考えられる。少ない細胞用量や、造血機能回復の遅れなどの、臍帯血移植(UCBT)に不随する問題を解決するため、大きく2種に分けられる以下の方法を使用していくつかの臨床試験が試みられている。これら2種の方法を、注意すべき主な点とともに表1および表2にまとめた。
本研究では、新鮮なヒト臍帯血(UCB)を造血幹細胞・前駆細胞(HSPC)の供給源として使用した。
a.造血前駆細胞(HPC)→CD45+CD34+CD38-CD45RA-(最も頻度が高いが自己複製能は最も低い)
b.造血幹細胞1(HSC1)→CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+(中程度の頻度で見られ、中程度の自己複製能を示す)
c.造血幹細胞2(HSC2)→CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f+(最も頻度が低いが自己複製能は最も高い)
1.総有核細胞数を少なくとも5倍増加させることができることから、移植片の細胞用量が少ないという問題を解決できる。
2.造血幹細胞・前駆細胞を増殖させることができる。具体的には、造血前駆細胞(HPC:CD45+CD34+CD38-CD45RA-)を少なくとも1,000倍に増殖させることができる。低分子を使用するだけで、このようなスケールで増殖させることができる方法は過去に報告されていない。確立された他のプロトコルでは、選択または精製されたCD34/CD133細胞から培養を開始した場合に限って、上記のようなスケールでの増殖が達成されている。また、本発明者らが知る限り、本発明の方法は、(a)CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+(HSC1)および(b)CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f+(HSC2)の表現型発現によって定義されるまれなHSPC細胞の増殖を報告した最初の増殖プロトコルである。
3.増殖させたUCB移植片は、インビトロおよびインビボの機能アッセイを使用して測定される幹細胞・前駆細胞の機能性を維持している。具体的には、IM-29の存在下で増殖させた移植片を、致死量以下の放射線を照射した免疫不全マウスに移植すると、3週目までに末梢血中にキメリズムが示されることから、通常よりも早いヒト細胞の生着が認められる。今日まで、異種移植研究およびヒト臨床試験のいずれにおいても、増殖させた移植片から迅速に(3週間未満で)血球数を回復させることは大きな課題であった。さらに、本発明の方法で増殖させた移植片では、移植から19~20週間経過した免疫不全レシピエントマウスの骨髄において様々な細胞系列の造血が検出されたことから、長期間にわたって様々な細胞系列の造血を維持する能力を有することが示された。
1.臨床的意義のあるレベルまでHSPCを増殖させるために、事前に幹細胞の選択を行う必要はなく、培地へのウシ胎仔血清の添加も必要とされない。臨床的見地から見て、事前の細胞選択を省略できると、非常に幼若な幹・前駆細胞、特に細胞の選択に必要とされる表面マーカーを発現しない幼若な幹・前駆細胞を排除してしまう可能性のあるさらなる操作工程が必要でなくなるという利点がある。
2.増殖技術の大部分では複雑なサイトカインカクテルが必要とされ、このうちのいくつかは、分化の後期段階に作用するサイトカインであり、自己複製を停止させて分化を急速に促進する。これに対して、本発明で提案された方法では、細胞増殖を達成するために、4種の成長因子からなる単純なカクテルと低分子とを使用しており、したがって操作が単純化されている。
3.IM-29の存在下で増殖させた移植片を得るにあたって、1単位のUCBTしか必要とされない。現在の臨床手技では、移植片対宿主病の発生率が高くなるにも関わらず、十分な細胞用量を確保するために細胞操作なしで2単位が同時に移植されているが、1単位のUCBTから増殖を行う本発明の方法では、このような現在の臨床手技と比較して、HLAマッチングの煩雑さが低減されている。
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Claims (20)
- 臍帯血試料、骨髄試料または動員末梢血試料に含まれる総有核細胞および/またはCD45+CD34+造血幹細胞・前駆細胞サブセットをエクスビボで増殖させる方法であって、
(i)前記試料に含まれる総有核細胞、単核細胞画分またはCD45+CD34+造血幹細胞・前駆細胞を培地中で培養する工程;ならびに
(ii)前記工程(i)の細胞を、少なくとも1種のアゾール系低分子を含む組成物に接触させる工程
を含み、
前記少なくとも1種のアゾール系低分子が、式(I)
Xは、NR4またはOを示し、R4は、Hまたはメチルであり;
R1は、フェニルまたはピリジニル(該フェニルまたはピリジニルは、無置換であるか、またはCl、Br、Fおよびメチルから選択される1つ以上の置換基で置換されている(該メチルは、無置換であるか、またはFで置換されている))を示し;
R2は、フェニル、ピリジルまたはジヒドロピラニル(該フェニル、ピリジルまたはジヒドロピラニルは、無置換であるか、またはCl、Br、Fおよびメチルから選択される1つ以上の置換基で置換されている(該メチルは、無置換であるか、またはFで置換されている))を示し;
R3は、Hまたは、無置換もしくはCl、FおよびOR5から選択される1つ以上の基で置換されたナフチルを示し、R5は、Hまたはメチルである)で示される化合物またはその塩もしくは溶媒和物であることを特徴とする方法。 - 前記少なくとも1種のアゾール系低分子が、
(i)4-[2-(1-フルオロナフタレン-2-イル)-4(5)-(4-フルオロフェニル)-1H-イミダゾール-5(4)-イル]ピリジン;
(ii)4-[2-(1-フルオロナフタレン-2-イル)-4-(m-トリル)-1H-イミダゾール-5-イル]ピリジン;
(iii)4-[2-(ナフタレン-2-イル)-4(5)-(m-トリル)-1H-イミダゾール-5(4)-イル]ピリジン;
(iv)4-[2-(ナフタレン-2-イル)-4(5)-(4-フルオロフェニル)-1H-イミダゾール-5(4)-イル]ピリジン;
(v)4-[2-(1-ブロモナフタレン-2-イル)-4(5)-(4-フルオロフェニル)-1H-イミダゾール-5(4)-イル]ピリジン;
(vi)4-[2-(1-フルオロナフタレン-2-イル)-4-[3-(トリフルオロメチル)フェニル]-1H-イミダゾール-5-イル]ピリジン;
(vii)2-(1-フルオロナフタレン-2-イル)-4-(ピリジン-4-イル)-5-(m-トリル)オキサゾール;
(viii)5(4)-(3,6-ジヒドロ-2H-ピラン-4-イル)-2-(1-フルオロナフタレン-2-イル)-4(5)-(m-トリル)-1H-イミダゾール;
(ix)5(4)-(3,6-ジヒドロ-2H-ピラン-4-イル)-2-(6-メトキシナフタレン-2-イル)-4(5)-(m-トリル)-1H-イミダゾール;
(x)5(4)-(3,6-ジヒドロ-2H-ピラン-4-イル)-2-(1-フルオロナフタレン-2-イル)-4(5)-(4-フルオロフェニル)-1H-イミダゾール;
(xi)4-(4(5)-(4-フルオロフェニル)-2-(7-メトキシナフタレン-2-イル)-1H-イミダゾール-5(4)-イル)ピリジン;
(xii)4-[4(5)-(m-トリル)-1H-イミダゾール-5(4)-イル]ピリジン;および
(xiii)4-[4(5)-(4-フルオロフェニル)-1H-イミダゾール-5(4)-イル]ピリジン
から選択される、請求項1に記載の方法。 - 前記少なくとも1種のアゾール系低分子が、
(i)4-[2-(1-フルオロナフタレン-2-イル)-4(5)-(4-フルオロフェニル)-1H-イミダゾール-5(4)-イル]ピリジン;
(ii)4-[2-(1-フルオロナフタレン-2-イル)-4-(m-トリル)-1H-イミダゾール-5-イル]ピリジン;
(iii)4-[2-(ナフタレン-2-イル)-4(5)-(m-トリル)-1H-イミダゾール-5(4)-イル]ピリジン;
(iv)4-[2-(ナフタレン-2-イル)-4(5)-(4-フルオロフェニル)-1H-イミダゾール-5(4)-イル]ピリジン;
(v)4-[2-(1-ブロモナフタレン-2-イル)-4(5)-(4-フルオロフェニル)-1H-イミダゾール-5(4)-イル]ピリジン;
(vi)4-[2-(1-フルオロナフタレン-2-イル)-4-[3-(トリフルオロメチル)フェニル]-1H-イミダゾール-5-イル]ピリジン;および
(vii)2-(1-フルオロナフタレン-2-イル)-4-(ピリジン-4-イル)-5-(m-トリル)オキサゾール
から選択される、請求項2に記載の方法。 - 幹細胞因子(SCF)、トロンボポエチン(TPO)、FMS関連チロシンキナーゼ3リガンド(FLT-3L)、インターロイキン3(IL-3)、インターロイキン6(IL-6)、顆粒球コロニー刺激因子(GCSF)およびインスリン様成長因子結合タンパク質2(IGFBP-2)を含む群から選択される少なくとも1種のサイトカインの存在下で前記造血幹細胞・前駆細胞を増殖させる、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- SCF、TPO、FLT-3LおよびIGFBP-2の存在下で前記造血幹細胞・前駆細胞を増殖させる、請求項4に記載の方法。
- 前記少なくとも1種のアゾール系低分子の共存下で、臍帯血単核細胞、骨髄単核細胞および/または動員末梢血単核細胞を少なくとも9日間培養する工程を含む、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1種のアゾール系低分子の共存下で、臍帯血単核細胞、骨髄単核細胞および/または動員末梢血単核細胞を約11日間培養する工程を含む、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。
- 0日目および/または7日目に前記培養に前記サイトカインを添加する、請求項4~7のいずれか一項に記載の方法。
- 0日目および/または7日目に前記培養に前記少なくとも1種のアゾール系低分子を添加する、請求項4~8のいずれか一項に記載の方法。
- 約10~11日間培養後に前記細胞を回収する工程をさらに含む、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。
- a)CD45+CD34+CD38-CD45RA-造血前駆細胞を増殖させ;
b)CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+造血幹細胞を増殖させ;かつ/または
c)CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f+造血幹細胞を増殖させる、
請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。 - エクスビボで増殖させた前記細胞と同時移植するために、リンパ系細胞を含むCD34-細胞画分を別個に保存しておく工程をさらに含む、請求項1~11のいずれか一項に記載の方法。
- 以下のa)、b)又はc)の少なくとも1種のアゾール系低分子と少なくとも1種のサイトカインとを含む、臍帯血試料、骨髄試料または動員末梢血試料に含まれる総有核細胞および/またはCD45+CD34+造血幹細胞・前駆細胞サブセットをエクスビボで増殖させるための組み合わせ物および/またはキットであって、
a)前記少なくとも1種のアゾール系低分子が、
式(I)
Xは、NR 4 またはOを示し、R 4 は、Hまたはメチルであり;
R 1 は、フェニルまたはピリジニル(該フェニルまたはピリジニルは、無置換であるか、またはCl、Br、Fおよびメチルから選択される1つ以上の置換基で置換されている(該メチルは、無置換であるか、またはFで置換されている))を示し;
R 2 は、フェニル、ピリジルまたはジヒドロピラニル(該フェニル、ピリジルまたはジヒドロピラニルは、無置換であるか、またはCl、Br、Fおよびメチルから選択される1つ以上の置換基で置換されている(該メチルは、無置換であるか、またはFで置換されている))を示し;
R 3 は、Hまたは、無置換もしくはCl、FおよびOR 5 から選択される1つ以上の基で置換されたナフチルを示し、R 5 は、Hまたはメチルである)で示される化合物であるか、
b)前記少なくとも1種のアゾール系低分子が、
(i)4-[2-(1-フルオロナフタレン-2-イル)-4(5)-(4-フルオロフェニル)-1H-イミダゾール-5(4)-イル]ピリジン;
(ii)4-[2-(1-フルオロナフタレン-2-イル)-4-(m-トリル)-1H-イミダゾール-5-イル]ピリジン;
(iii)4-[2-(ナフタレン-2-イル)-4(5)-(m-トリル)-1H-イミダゾール-5(4)-イル]ピリジン;
(iv)4-[2-(ナフタレン-2-イル)-4(5)-(4-フルオロフェニル)-1H-イミダゾール-5(4)-イル]ピリジン;
(v)4-[2-(1-ブロモナフタレン-2-イル)-4(5)-(4-フルオロフェニル)-1H-イミダゾール-5(4)-イル]ピリジン;
(vi)4-[2-(1-フルオロナフタレン-2-イル)-4-[3-(トリフルオロメチル)フェニル]-1H-イミダゾール-5-イル]ピリジン;
(vii)2-(1-フルオロナフタレン-2-イル)-4-(ピリジン-4-イル)-5-(m-トリル)オキサゾール;
(viii)5(4)-(3,6-ジヒドロ-2H-ピラン-4-イル)-2-(1-フルオロナフタレン-2-イル)-4(5)-(m-トリル)-1H-イミダゾール;
(ix)5(4)-(3,6-ジヒドロ-2H-ピラン-4-イル)-2-(6-メトキシナフタレン-2-イル)-4(5)-(m-トリル)-1H-イミダゾール;
(x)5(4)-(3,6-ジヒドロ-2H-ピラン-4-イル)-2-(1-フルオロナフタレン-2-イル)-4(5)-(4-フルオロフェニル)-1H-イミダゾール;
(xi)4-(4(5)-(4-フルオロフェニル)-2-(7-メトキシナフタレン-2-イル)-1H-イミダゾール-5(4)-イル)ピリジン;
(xii)4-[4(5)-(m-トリル)-1H-イミダゾール-5(4)-イル]ピリジン;および
(xiii)4-[4(5)-(4-フルオロフェニル)-1H-イミダゾール-5(4)-イル]ピリジンから選択される化合物であるか、又は
c)前記少なくとも1種のアゾール系低分子が、
(i)4-[2-(1-フルオロナフタレン-2-イル)-4(5)-(4-フルオロフェニル)-1H-イミダゾール-5(4)-イル]ピリジン;
(ii)4-[2-(1-フルオロナフタレン-2-イル)-4-(m-トリル)-1H-イミダゾール-5-イル]ピリジン;
(iii)4-[2-(ナフタレン-2-イル)-4(5)-(m-トリル)-1H-イミダゾール-5(4)-イル]ピリジン;
(iv)4-[2-(ナフタレン-2-イル)-4(5)-(4-フルオロフェニル)-1H-イミダゾール-5(4)-イル]ピリジン;
(v)4-[2-(1-ブロモナフタレン-2-イル)-4(5)-(4-フルオロフェニル)-1H-イミダゾール-5(4)-イル]ピリジン;
(vi)4-[2-(1-フルオロナフタレン-2-イル)-4-[3-(トリフルオロメチル)フェニル]-1H-イミダゾール-5-イル]ピリジン;および
(vii)2-(1-フルオロナフタレン-2-イル)-4-(ピリジン-4-イル)-5-(m-トリル)オキサゾールから選択される化合物である組み合わせ物および/またはキット。 - 前記少なくとも1種のサイトカインが、SCF、TPO、FLT-3LおよびIGFBP-2を含む群から選択され、臍帯血、骨髄および/または動員末梢血に含まれる造血幹細胞・前駆細胞のエクスビボでの増殖に使用される、請求項13に記載の組み合わせ物および/またはキット。
- 前記少なくとも1種のアゾール系低分子によって、CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+造血幹細胞、CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f+造血幹細胞および/またはCD45+CD34+CD38-CD45RA-造血前駆細胞の増殖が促される、請求項13または14に記載の組み合わせ物および/またはキット。
- 臍帯血、骨髄および/または動員末梢血に含まれる造血幹細胞・前駆細胞のエクスビボでの増殖に使用するための、以下のa)、b)又はc)の少なくとも1種のアゾール系低分子を含む組成物であって、
a)前記少なくとも1種のアゾール系低分子が、
式(I)
Xは、NR 4 またはOを示し、R 4 は、Hまたはメチルであり;
R 1 は、フェニルまたはピリジニル(該フェニルまたはピリジニルは、無置換であるか、またはCl、Br、Fおよびメチルから選択される1つ以上の置換基で置換されている(該メチルは、無置換であるか、またはFで置換されている))を示し;
R 2 は、フェニル、ピリジルまたはジヒドロピラニル(該フェニル、ピリジルまたはジヒドロピラニルは、無置換であるか、またはCl、Br、Fおよびメチルから選択される1つ以上の置換基で置換されている(該メチルは、無置換であるか、またはFで置換されている))を示し;
R 3 は、Hまたは、無置換もしくはCl、FおよびOR 5 から選択される1つ以上の基で置換されたナフチルを示し、R 5 は、Hまたはメチルである)で示される化合物であるか、
b)前記少なくとも1種のアゾール系低分子が、
(i)4-[2-(1-フルオロナフタレン-2-イル)-4(5)-(4-フルオロフェニル)-1H-イミダゾール-5(4)-イル]ピリジン;
(ii)4-[2-(1-フルオロナフタレン-2-イル)-4-(m-トリル)-1H-イミダゾール-5-イル]ピリジン;
(iii)4-[2-(ナフタレン-2-イル)-4(5)-(m-トリル)-1H-イミダゾール-5(4)-イル]ピリジン;
(iv)4-[2-(ナフタレン-2-イル)-4(5)-(4-フルオロフェニル)-1H-イミダゾール-5(4)-イル]ピリジン;
(v)4-[2-(1-ブロモナフタレン-2-イル)-4(5)-(4-フルオロフェニル)-1H-イミダゾール-5(4)-イル]ピリジン;
(vi)4-[2-(1-フルオロナフタレン-2-イル)-4-[3-(トリフルオロメチル)フェニル]-1H-イミダゾール-5-イル]ピリジン;
(vii)2-(1-フルオロナフタレン-2-イル)-4-(ピリジン-4-イル)-5-(m-トリル)オキサゾール;
(viii)5(4)-(3,6-ジヒドロ-2H-ピラン-4-イル)-2-(1-フルオロナフタレン-2-イル)-4(5)-(m-トリル)-1H-イミダゾール;
(ix)5(4)-(3,6-ジヒドロ-2H-ピラン-4-イル)-2-(6-メトキシナフタレン-2-イル)-4(5)-(m-トリル)-1H-イミダゾール;
(x)5(4)-(3,6-ジヒドロ-2H-ピラン-4-イル)-2-(1-フルオロナフタレン-2-イル)-4(5)-(4-フルオロフェニル)-1H-イミダゾール;
(xi)4-(4(5)-(4-フルオロフェニル)-2-(7-メトキシナフタレン-2-イル)-1H-イミダゾール-5(4)-イル)ピリジン;
(xii)4-[4(5)-(m-トリル)-1H-イミダゾール-5(4)-イル]ピリジン;および
(xiii)4-[4(5)-(4-フルオロフェニル)-1H-イミダゾール-5(4)-イル]ピリジンから選択される化合物であるか、又は
c)前記少なくとも1種のアゾール系低分子が、
(i)4-[2-(1-フルオロナフタレン-2-イル)-4(5)-(4-フルオロフェニル)-1H-イミダゾール-5(4)-イル]ピリジン;
(ii)4-[2-(1-フルオロナフタレン-2-イル)-4-(m-トリル)-1H-イミダゾール-5-イル]ピリジン;
(iii)4-[2-(ナフタレン-2-イル)-4(5)-(m-トリル)-1H-イミダゾール-5(4)-イル]ピリジン;
(iv)4-[2-(ナフタレン-2-イル)-4(5)-(4-フルオロフェニル)-1H-イミダゾール-5(4)-イル]ピリジン;
(v)4-[2-(1-ブロモナフタレン-2-イル)-4(5)-(4-フルオロフェニル)-1H-イミダゾール-5(4)-イル]ピリジン;
(vi)4-[2-(1-フルオロナフタレン-2-イル)-4-[3-(トリフルオロメチル)フェニル]-1H-イミダゾール-5-イル]ピリジン;および
(vii)2-(1-フルオロナフタレン-2-イル)-4-(ピリジン-4-イル)-5-(m-トリル)オキサゾールから選択される化合物である組成物。 - 造血幹細胞移植を必要とする疾患の治療用医薬品の製造における、請求項1~3および12のいずれか一項に記載の方法によって得られる細胞の使用。
- 前記医薬品が、エクスビボで増殖された前記細胞と、別個に保存しておいた前記CD34-リンパ系細胞とを含む、請求項17に記載の使用。
- 臍帯血、骨髄および/または動員末梢血に含まれる造血幹細胞・前駆細胞のエクスビボでの増殖における、以下のa)、b)又はc)の少なくとも1種のアゾール系低分子の使用であって、
a)前記少なくとも1種のアゾール系低分子が、
式(I)
Xは、NR 4 またはOを示し、R 4 は、Hまたはメチルであり;
R 1 は、フェニルまたはピリジニル(該フェニルまたはピリジニルは、無置換であるか、またはCl、Br、Fおよびメチルから選択される1つ以上の置換基で置換されている(該メチルは、無置換であるか、またはFで置換されている))を示し;
R 2 は、フェニル、ピリジルまたはジヒドロピラニル(該フェニル、ピリジルまたはジヒドロピラニルは、無置換であるか、またはCl、Br、Fおよびメチルから選択される1つ以上の置換基で置換されている(該メチルは、無置換であるか、またはFで置換されている))を示し;
R 3 は、Hまたは、無置換もしくはCl、FおよびOR 5 から選択される1つ以上の基で置換されたナフチルを示し、R 5 は、Hまたはメチルである)で示される化合物であるか、
b)前記少なくとも1種のアゾール系低分子が、
(i)4-[2-(1-フルオロナフタレン-2-イル)-4(5)-(4-フルオロフェニル)-1H-イミダゾール-5(4)-イル]ピリジン;
(ii)4-[2-(1-フルオロナフタレン-2-イル)-4-(m-トリル)-1H-イミダゾール-5-イル]ピリジン;
(iii)4-[2-(ナフタレン-2-イル)-4(5)-(m-トリル)-1H-イミダゾール-5(4)-イル]ピリジン;
(iv)4-[2-(ナフタレン-2-イル)-4(5)-(4-フルオロフェニル)-1H-イミダゾール-5(4)-イル]ピリジン;
(v)4-[2-(1-ブロモナフタレン-2-イル)-4(5)-(4-フルオロフェニル)-1H-イミダゾール-5(4)-イル]ピリジン;
(vi)4-[2-(1-フルオロナフタレン-2-イル)-4-[3-(トリフルオロメチル)フェニル]-1H-イミダゾール-5-イル]ピリジン;
(vii)2-(1-フルオロナフタレン-2-イル)-4-(ピリジン-4-イル)-5-(m-トリル)オキサゾール;
(viii)5(4)-(3,6-ジヒドロ-2H-ピラン-4-イル)-2-(1-フルオロナフタレン-2-イル)-4(5)-(m-トリル)-1H-イミダゾール;
(ix)5(4)-(3,6-ジヒドロ-2H-ピラン-4-イル)-2-(6-メトキシナフタレン-2-イル)-4(5)-(m-トリル)-1H-イミダゾール;
(x)5(4)-(3,6-ジヒドロ-2H-ピラン-4-イル)-2-(1-フルオロナフタレン-2-イル)-4(5)-(4-フルオロフェニル)-1H-イミダゾール;
(xi)4-(4(5)-(4-フルオロフェニル)-2-(7-メトキシナフタレン-2-イル)-1H-イミダゾール-5(4)-イル)ピリジン;
(xii)4-[4(5)-(m-トリル)-1H-イミダゾール-5(4)-イル]ピリジン;および
(xiii)4-[4(5)-(4-フルオロフェニル)-1H-イミダゾール-5(4)-イル]ピリジンから選択される化合物であるか、又は
c)前記少なくとも1種のアゾール系低分子が、
(i)4-[2-(1-フルオロナフタレン-2-イル)-4(5)-(4-フルオロフェニル)-1H-イミダゾール-5(4)-イル]ピリジン;
(ii)4-[2-(1-フルオロナフタレン-2-イル)-4-(m-トリル)-1H-イミダゾール-5-イル]ピリジン;
(iii)4-[2-(ナフタレン-2-イル)-4(5)-(m-トリル)-1H-イミダゾール-5(4)-イル]ピリジン;
(iv)4-[2-(ナフタレン-2-イル)-4(5)-(4-フルオロフェニル)-1H-イミダゾール-5(4)-イル]ピリジン;
(v)4-[2-(1-ブロモナフタレン-2-イル)-4(5)-(4-フルオロフェニル)-1H-イミダゾール-5(4)-イル]ピリジン;
(vi)4-[2-(1-フルオロナフタレン-2-イル)-4-[3-(トリフルオロメチル)フェニル]-1H-イミダゾール-5-イル]ピリジン;および
(vii)2-(1-フルオロナフタレン-2-イル)-4-(ピリジン-4-イル)-5-(m-トリル)オキサゾールから選択される化合物である使用。 - 前記少なくとも1種のアゾール系低分子によって、CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+造血幹細胞、CD45+CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f+造血幹細胞および/またはCD45+CD34+CD38-CD45RA-造血前駆細胞の増殖が促される、請求項19に記載の使用。
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