JP7165246B2 - 葉の中の1種または複数種のアルカロイドの量を変化させたタバコ植物ならびにそのような植物の使用方法 - Google Patents
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Description
タバコの低アルカロイド品種を作出しようという試みがなされている。しかし、こうした品種のほとんどは、結果的に、低品質の葉をもたらし、葉のアルカロイド含有量が減少した商業的に利用可能なタバコ系統は皆無である。したがって、タバコの葉のアルカロイドのプロファイル、特に葉のニコチン系アルカロイドのプロファイル、が変更され得るように遺伝子の発現を調節することができる、タバコ遺伝子を同定する必要がある。
タバコにおいて根から葉へのアルカロイドの輸送に関与する複数の配列を記載する。また、こうした配列を使用する方法も記載する。
SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、および90からなる群より選択される配列を有する1つまたは複数の内因性核酸に変異を有する植物を含んでなるタバコ交雑種、品種、系統、または栽培品種。
[本発明1002]
前記植物からの葉が、前記変異を欠く植物からの葉と比べて、少なくとも1種のアルカロイドの減少した量を示す、本発明1001のタバコ交雑種、品種、系統、または栽培品種。
[本発明1003]
前記植物からの乾葉(cured leaf)が、前記変異を欠く植物からの乾葉と比べて、少なくとも1種のタバコ特異的ニトロソアミン(TSNA)の減少した量を示す、本発明1002のタバコ交雑種、品種、系統、または栽培品種。
[本発明1004]
SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、および90からなる群より選択される配列を有する1つまたは複数の内因性核酸に変異を含む、本発明1001~1003のいずれかのタバコ交雑種、品種、系統、または栽培品種により産生された種子。
[本発明1005]
ニコチアナ・タバカム(Nicotiana tabacum)細胞において変異誘発を引き起こして突然変異細胞を作製する段階;
該突然変異細胞から1つまたは複数の植物を得る段階;および
SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、および90からなる群より選択される配列を有する1つまたは複数の内因性核酸に変異を含む植物の少なくとも1つを同定する段階;
を含んでなる、タバコ植物の作出方法。
[本発明1006]
前記変異を欠く植物からの葉と比べて少なくとも1種のアルカロイドの減少した量を示す葉を含む前記植物の少なくとも1つを同定する段階をさらに含む、本発明1005の方法。
[本発明1007]
乾燥した場合に、前記変異を欠く植物からの乾葉と比べて少なくとも1種のTSNAの減少した量を示す葉を含む前記植物の少なくとも1つを同定する段階をさらに含む、本発明1006の方法。
[本発明1008]
変異誘発が化学的変異原または電離放射線を用いて引き起こされる、本発明1005の方法。
[本発明1009]
化学的変異原が亜硝酸、アジ化ナトリウム、アクリジンオレンジ、臭化エチジウム、およびメタンスルホン酸エチル(EMS)からなる群より選択される、本発明1008の方法。
[本発明1010]
電離放射線がX線、ガンマ線、高速中性子照射、およびUV照射からなる群より選択される、本発明1008の方法。
[本発明1011]
変異誘発がTALENを用いて引き起こされる、本発明1005の方法。
[本発明1012]
変異誘発がジンクフィンガー技術を用いて引き起こされる、本発明1005の方法。
[本発明1013]
第1のタバコ系統の少なくとも1つの植物を第2のタバコ系統の少なくとも1つの植物と交配させる段階であって、第1のタバコ系統の植物は、SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、および90からなる群より選択される配列を有する1つまたは複数の内因性核酸に変異を有する、段階;および
該変異を有する後代タバコ植物について選択する段階;
を含んでなる、タバコ植物の作出方法。
[本発明1014]
前記変異を欠く植物からの葉と比べて少なくとも1種のアルカロイドの減少した量を示す葉を含む後代タバコ植物について選択する段階をさらに含む、本発明1013の方法。
[本発明1015]
乾燥した場合に、前記変異を欠く植物からの乾葉と比べて少なくとも1種のTSNAの減少した量を示す葉を含む後代タバコ植物について選択する段階をさらに含む、本発明1014の方法。
[本発明1016]
SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、および90からなる群より選択される配列を有する1つまたは複数の内因性核酸に変異を有するタバコ植物からの乾葉を含むタバコ製品。
[本発明1017]
葉が、前記変異を欠く植物からの葉と比べて、少なくとも1種のアルカロイドの減少した量を示す、本発明1016のタバコ製品。
[本発明1018]
乾葉が、前記変異を欠く植物からの乾葉と比べて、少なくとも1種のTSNAの減少した量を示す、本発明1017のタバコ製品。
[本発明1019]
SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、および90からなる群より選択される配列を有する1つまたは複数の内因性核酸に変異を有するタバコ植物からの乾葉を提供する段階;および
該乾葉を用いてタバコ製品を製造する段階;
を含んでなる、タバコ製品の製造方法。
[本発明1020]
前記乾葉が、前記変異を欠く植物からの乾葉と比べて、少なくとも1種のアルカロイドの減少した量を示す、本発明1019の方法。
[本発明1021]
前記乾葉が、前記変異を欠く植物からの乾葉と比べて、少なくとも1種のTSNAの減少した量を示す、本発明1019の方法。
[本発明1022]
前記変異が点変異、挿入、欠失、および置換からなる群より選択される、本発明1001~1021のいずれかの方法。
[本発明1023]
本発明1001~1003のいずれかの植物からの植物材料を提供する段階;および
植物組織中の1種または複数種のアルカロイドの量を測定する段階;
を含んでなる、植物のスクリーニング方法。
[本発明1024]
植物組織が葉である、本発明1023の方法。
[本発明1025]
植物組織が根である、本発明1023の方法。
別段の定義がない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、本方法および組成物が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料は、本方法および組成物の実施または試験に使用できるが、好適な方法および材料を以下に記載する。さらに、材料、方法、および実施例は例示にすぎず、限定することを意図したものではない。本明細書で言及する全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
タバコの低アルカロイド品種を生み出すために経路を変更する以前の試みは、低品質の葉をもたらすことがあった。現在のところ、(例えば、野生型タバコ植物からの)標準アルカロイド含有量を含む乾葉と同じ品質の乾葉を提供する、葉のアルカロイド含有量が減少した商業的タバコ系統は存在しない。
新規核酸が本明細書中に提供される(例えば、SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、または90を参照されたい)。本明細書で使用する場合、核酸はDNAおよびRNAを含むことができ、1つまたは複数のヌクレオチド類似体または骨格修飾を含む核酸が含まれる。核酸は一本鎖でも二本鎖でもよく、これは通常、その意図した用途に依存する。本明細書に提供される新規核酸は、新規ポリペプチド(例えば、SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、または91参照)をコードする。
本明細書に記載の1つまたは複数の内因性核酸(例えば、SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、または90)に変異を有するタバコ交雑種、品種、系統、または栽培品種が提供される。本明細書に記載するように、内因性核酸(例えば、SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、または90)の1つまたは複数に変異を有する植物からの葉は、(例えば、該変異を欠く植物からの葉と比較して)少なくとも1種のアルカロイドの減少した量を示すことができる。また、内因性核酸(例えば、SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、または90)の1つまたは複数に変異を有する植物からの葉は、(例えば、該変異を欠く植物からの葉と比較して)少なくとも1種のタバコ特異的ニトロソアミン(TSNA)の減少した量を示すことができる。
本明細書に記載の配列は、葉の中の1種または複数種のアルカロイド(および/または1種または複数種のTSNA)の量を増加させるために、植物において過剰発現させることができる。したがって、植物において発現を引き出すことができるプロモーター(例えば、植物プロモーター)の制御下に本明細書に記載の核酸分子(例えば、SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、または90)またはその機能性断片で形質転換された、トランスジェニックタバコ植物またはこのような植物からの葉が提供される。本明細書で説明するように、植物発現ベクター中で使用される核酸分子は、本明細書に記載の配列とは異なる配列を有することができ、こうした配列は、(例えば、SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、または90に対する)配列同一性パーセントとして、あるいは該配列がSEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、または90にハイブリダイズする条件に基づいて、表現され得る。
本明細書に記載の方法は、タバコ植物中の葉成分を変化させることが可能である。本明細書に記載するように、葉成分を変化させることは、葉の中の少なくとも1種のアルカロイドの量を減少または増加させることを指す。本明細書に記載するように、こうした方法は変異誘発(例えば、ランダムもしくは標的)または(例えば、RNAiもしくは過剰発現を用いる)トランスジェニック植物の作出を含むことができる。
以前の研究では、ニコチアナ・タバカムの近縁種であるニコチアナ・アラタ(Nicotiana alata:ハナタバコ)は、葉にアルカロイドを輸送しないことが証明されている(Pakdeechanuan et al., 2012, Plant Cell Physiol., 53(7):1247-54)。この表現型は図5に示すように確認された。また、N.アラタが摘芯後にアルカロイドを輸送することができるという可能性についても試験された。表1を参照されたい。試験したどの条件下でも、アルカロイドの葉への輸送は見出されなかった。
摘芯前および摘芯後のN.アラタ植物の根組織からのRNAを回収し、Illumina社からのTrue-Seqライブラリー構築キットを用いてRNAシークエンシングライブラリーを作製した。N.アラタRNAの配列決定は、Illumina MiSeqプラットフォームを用いて達成した。配列決定ランは150サイクルのペアエンドリード(paired end read)パラメータで実施し、ライブラリーの品質と平均サイズをE遺伝子キャピラリー電気泳動装置により測定した。TN90タバコにおける根特異的遺伝子の発現は、ArrayXpress社(Raleigh, NC)によって実施されたRNAディープシークエンシングにより決定した。
N.タバカムと比較して、N.アラタで異なって発現されるかまたは検出されない輸送関連遺伝子を同定するために、TN90とN.アラタの遺伝子発現データを分析した。TN90発現データを、他の組織との発現の差(>9倍高い遺伝子発現、p値<0.000001)に基づいて、根特異的発現についてフィルタリングした。次に、その結果を、高い根発現についてフィルタリングした(摘芯後に>100のリード)。続いて、二次代謝産物の輸送体を表す遺伝子オントロジー(GO)用語について遺伝子をフィルタリングした(例えば、用語「輸送」を「薬物」または「プリン」と一緒に用いて、その結果をフィルタリングした)。2つの独立した配列決定ランにおいてN.アラタでは検出されなかった遺伝子を、同じGO基準を用いてフィルタリングした。その後、これらのデータセットを比較して、3つ全てのカテゴリー(すなわち、(i)高い根特異的発現、(ii)GO基準、および(iii)N.アラタでは発現されない)に分類される遺伝子を決定した。
輸送に関与すると予測される遺伝子は、5つの主なカテゴリーに分類される:ニコチン取り込みパーミアーゼ(Nup)ファミリー、多剤・毒性化合物排出型(MATE)ファミリー、多剤耐性(MDR)ファミリー、および多面的薬剤耐性(PDR)ファミリー、ならびに無関係な遺伝子のグループ。ヌクレオチド配列および予測されるポリペプチド配列を公開データベースに寄託された配列と比較した。これらの比較の結果は、表4(Nup配列)、表5(MDR配列)、表6(MATE配列)、表7(PDR配列)、表8(その他の輸送体配列)、および表9(高レベルで発現されたN.アラタ遺伝子)に示される。
候補遺伝子の機能を評価するために、一つは全長コード配列を使用し、一つはRNAi配列を使用して、二組のトランスジェニック植物を作出した(図6参照)。全長コード配列またはRNAi配列の発現のために、発現ベクター(SEQ ID NO:21)を使用したが、該ベクターは、CsVMVプロモーターおよびNOSターミネーター、ならびにアクチン2プロモーターの指令下のカナマイシン選択マーカー(NPT II)を有しかつNOSターミネーターを有するカセットを含有する。関心対象の導入遺伝子を担持する核酸構築物は、DNAボンバードメントまたは微粒子銃アプローチを用いて、タバコ葉ディスクに導入した。例えば、Sanford et al., 1993, Methods Enzymol., 217:483-510; およびOkuzaki and Tabei, 2012, Plant Biotechnology, 29:307-310を参照されたい。
EMS変異のために、Tennessee 90タバコ(TN90)の変換種子(converter seed)1グラム(約10,000個の種子)を0.1% Tween(登録商標)中で15分間洗浄し、次いで30mlのddH2O中に2時間浸漬した。その後、150μlの0.5% EMS (Sigma社, カタログ番号M-0880)を種子/ddH2O溶液に混合し、換気フード下に室温(RT;約20℃)で(30rpmで回転しながら)8~12時間インキュベートした。次いで、液体を種子から除去し、その液体を除染および廃棄のために1M NaOH中で一晩混合した。その後、種子を2~4時間かけて100mlのddH2Oで2回洗浄した。洗浄した種子は、次いで、0.1%寒天:水の溶液中に懸濁した。
遺伝子特異的TALEN認識配列は、特定の遺伝子標的内またはプロモーター配列内のいずれかに見出され、遺伝子の発現を低下させたり、または組織特異的発現を変更したりするために、標的欠失またはプロモーター挿入を可能にする。関心対象の領域の配列を以下に示す(SEQ ID NO: 61~69)。遺伝子C22474のための特定の標的配列(Pdr5b)は、関心対象の領域の対応する配列に下線が引かれている。関心対象のTALEN領域の全ての位置を図7に概略的に示す。黄色のバーは、イントロンを含む一次転写産物を表す。緑色は、プロモーター領域としてマークされる上流領域を表す。これらのTALEN部位は、既知のゲノム配列情報に基づいて、単一の遺伝子標的に特異的である。各遺伝子のTALEN領域1および2はプロモーターまたはコード領域の5'末端を破壊するために使用されるが、他の領域はコード配列のみを破壊するために使用される。
実施例5、6、7または8で同定されたトランスジェニック変異型タバコ植物を、10インチのポットに入れたCarolina's Choice Tobacco Mix (Carolina Soil社, Kinston, NC)で畑に似た条件下の温室で生育させる。開花期に、植物を摘芯して、2週間後に展開した葉と根から組織サンプルを採取する。
若いトランスジェニック植物におけるニコチンの輸送は、内因性アルカロイドが測定可能になるのを待つよりもはるかに早くニコチンの量を増加させて表現型を決定するために、肥料を含んだ水と一緒にニコチンを供給することによって試験することができる。供給アッセイは2つの別々の方法で行った。第1の方法では、実生の苗をスタイロフォーム(Styrofoam)のフロートトレイに移した。これらの植物を、該トレイの底から根が出始めるまで、100ppmの肥料を含んだ水(Pete's Professional)で生育させた。次に、肥料を含んだニコチン溶液(1mMニコチン、100ppm肥料)に該トレイを3日間浮かべた。根と葉の組織を採取し、アルカロイドを上記のように抽出して分析した。葉と根のニコチン含有量だけでなく、葉と根のニコチンレベルの比率も計算した(図8)。第2の方法では、植物を4インチのポットに移した。根が土をまとめて保持する程度に十分生育した後、底を取り払った4インチのポットにそれらを移した。2週間の生育後、肥料を含んだニコチン溶液で1日2回2日間植物を処理した。ニコチン供給の前後に葉を採取し、アルカロイドを上記のように抽出して分析した。供給前後の葉のニコチン含有量を図9に示す。
N.タバカムは、タバコ属の2つの異なる系統の交配に由来した。N.アラタは、アルカロイドを輸送しないN.シルベストリス(N. sylvestris)系統のメンバーに相当する(上記実施例3参照)。N.オトフォラ(N. otophora)は、他の系統(N.トメントシフォルミス(N. tomentosiformis))の非輸送性メンバーである。N.オトフォラからは失われているが、N.タバカムには高レベルで存在している輸送関連遺伝子を決定するために、RNAシークエンシングを実施した。
Claims (16)
- 内因性核酸に変異を含むニコチアナ・タバカム(Nicotiana tabacum)植物から作出され、該変異を含むタバコ乾葉であって、該内因性核酸がSEQ ID NO: 35に対して少なくとも95%同一の配列を有し、該変異を欠く対応する植物と比べて、該変異が該内因性核酸にコードされる輸送体の発現または機能の減少を生じさせる、前記タバコ乾葉。
- 前記内因性核酸が、SEQ ID NO: 35に対して100%同一の配列を有する、請求項1記載のタバコ乾葉。
- 前記ニコチアナ・タバカム植物が、バーレー種(Burley type)、ダーク種(dark type)、黄色種(flue-cured type)、メリーランド種(Maryland type)、およびオリエント種(Oriental type)からなる群より選択される、請求項1記載のタバコ乾葉。
- 前記変異を欠く植物からのタバコ乾葉と比べて、ニコチンの少なくとも5%の減少を示す、請求項1記載のタバコ乾葉。
- 自然乾燥、火力乾燥、熱風乾燥および日干し乾燥からなる群より選択される方法を用いて乾燥される、請求項1記載のタバコ乾葉。
- 前記変異が、点変異、挿入、欠失、および置換からなる群より選択される、請求項1記載のタバコ乾葉。
- 請求項1~5のいずれか一項記載のタバコ乾葉を含む、タバコ製品。
- 無煙タバコ製品である、請求項7記載のタバコ製品。
- 前記無煙タバコ製品が、噛みタバコ、スヌース(snus)、パウチ、フィルム、タブレット、コーティングされたダボ(dowel)、およびロッドからなる群より選択される、請求項8記載のタバコ製品。
- シガリロ、非通気型リセスフィルター(recess filter)タバコ、通気型リセスフィルタータバコ、葉巻、嗅ぎタバコ、パイプタバコ、葉巻タバコ、紙巻タバコ、葉タバコ、刻みタバコ、およびカットタバコからなる群より選択される、請求項7記載のタバコ製品。
- フィルター部材またはロッド部材を含む、請求項7記載のタバコ製品。
- 内因性核酸に変異を含むニコチアナ・タバカム(Nicotiana tabacum)植物であって、該内因性核酸がSEQ ID NO: 35に対して少なくとも95%同一の配列を有し、該変異を欠く対応する植物と比べて、該変異が該内因性核酸にコードされる輸送体の発現または機能の減少を生じさせる、前記植物。
- 前記植物からの葉が、前記変異を欠く植物からのタバコ乾葉と比べて、ニコチンの少なくとも5%の減少を示す、請求項12記載のニコチアナ・タバカム植物。
- バーレー種(Burley type)、ダーク種(dark type)、黄色種(flue-cured type)、メリーランド種(Maryland type)、およびオリエント種(Oriental type)からなる群より選択される種である、請求項12記載のニコチアナ・タバカム植物。
- 前記変異が、点変異、挿入、欠失、および置換からなる群より選択される、請求項12記載のニコチアナ・タバカム植物。
- 請求項12~15のいずれか一項記載のニコチアナ・タバカム植物より産生され、前記変異を含む、種子。
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