JP7162011B2 - 癌糖ペプチドに対するモノクローナルおよびヒト化抗体 - Google Patents
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Description
癌細胞は、免疫抑制性の生体高分子である異常な複合糖質(glycoconjugates)を発現して免疫監視を妨害する(図1)。MUC1などの異常なグリコシル化腫瘍ムチンはBAXに結合し、抗アポトーシス経路を活性化する[1-2]。さらに、MUC1グリカンはリンパ球のシグナル伝達分子であるガレクチン9に結合し、ナチュラルキラー細胞の細胞傷害機能を阻害する[3-4]。MUC1は肺癌において最も高度に発現されるムチンであり、肺癌(小細胞肺癌およびNSCLC)の治療において広く研究されている。212例の肺癌における糖タンパク質mRNA発現プロファイルの分析を含む本発明者らの以前の研究では、MUC1が免疫療法の好ましい標的であることを確認した[5]。また、他の人による以前の研究では、Tnおよびシアル酸Tn糖残基を持つMUC1タンパク質が、乳癌、胃癌、結腸癌、膵臓癌、および他の癌タイプによって発現されることを見出した[6-9]。
本発明の目的は、癌糖ペプチドに対するヒト化およびモノクローナル抗体またはその機能的なフラグメント、ならびにそれらの使用を提供することを含む。
SEQ ID NO: 31に示されるアミノ酸配列を含むCDRL1と、SEQ ID NO: 32に示されるアミノ酸配列を含むCDRL2と、SEQ ID NO: 33に示されるアミノ酸配列を含むCDRL3とを有する可変領域を含む軽鎖配列を含む。
以下の非限定的な実施例は、本明細書に開示される本発明の実施形態をさらに説明するために提供される。当業者は明らかなように、実施例に開示された技術が、本発明の実施において完全に機能することが見出された代表的な方法に従うため、実施態様になる実施例とすると考えられる。しかしながら、当業者は明らかなように、本開示に従い、本発明の意旨及び範囲から逸脱することなく、開示された具体的な実施形態に多くの変化が入れると、依然として同様または類似の結果を得ることができる。
全RNAは、QIAGEN RNeasy Mini Reagent(QIAGEN)により、16Aマウスハイブリドーマ(Texas University MD Anderson Cancer Centerから入手した。Reference:Int J Oncol 41(6):1977-84、12/2012)から抽出した。cDNAはSMARTer RACE試薬(CLONTECH)により合成した。逆転写に使用されるプライマーはオリゴdTであった。cDNAがcVH遺伝子およびcVL遺伝子をクローニングするためのPCR鋳型として使用された。ユニバーサルプライマーAミックス(CLONTECH)および5'-GGGRCCARKG GATAGACHGATGG-3 '(マウスIgG抗体重鎖配列のCセグメントに従って設計された)がcVH遺伝子のクローニングプライマーとして使用された。ユニバーサルプライマーAミックス(CLONTECH)および5'-5'-CTTCAGAGGA AGGGTGGAAACAGG-3 '(マウスIgG抗体軽鎖配列のCセグメントに従って設計された)がcVL遺伝子のクローニングプライマーとして使用された。cVHおよびcVL PCR断片が3130XL ABI DNAシークエンサーにより配列決定した。
キメラ16A抗体をコードする遺伝子は、マウス16AのVHおよびVL遺伝子断片がヒトIgG1のC領域断片に連結されているハイブリッド構造である。16Aキメラ抗体のアミノ酸およびcDNA配列を図3に示す。 VLおよびVH遺伝子はSydlabs、MAによって合成された。合成した遺伝子は、3130XL ABI DNAシークエンサーを用いたDNAシークエンシングにより検証した。キメラVLおよびキメラVH遺伝子を、それぞれpcDNA3.1キメラVLおよびpcDNA3.1キメラVHとして、pcDNA3.1発現ベクター(Invitrogen)に構築した。
HEK293細胞を無血清培地(DMEM、Life Technologies)で培養した。pcDNA3.1キメラVLおよびpcDNA3.1キメラVHを同時にエレクトロポレーションによって瞬間にトランスフェクトした(Maxcyte)。エレクトロポレーションの後に、HEK293細胞をさらに5日間培養し、培養上清がその後の抗体力価試験に使用された。 その後、培養上清を合わせ、抗体をプロテインAアフィニティークロマトグラフィー用カラム(GE Healthcare)により精製した。
16A抗体の可変領域のCDRは抗体の特異性を直接に決定する。本発明人らはマウスモノクローナル抗体のCDRをヒト抗体の可変領域に移植することにより、軽鎖hVL1およびhVL2配列、ならびに重鎖hVH1、hVH2、hVH3、hVH4およびhVH5配列を設計した。そのため、本発明人らはその後の抗体機能試験においてhVL2配列を使用した。
ELISAプレートをストレプトアビジン(1.5μg/ml、Millipore)を用い4℃で一晩コーティングして、1% BSAによって室温で1時間ブロックした。2μg/mlのビオチン化糖ペプチド(RPAPGS(GalNAc)TAPAPHG)がストレプトアビジンでコーティングしたプレートに連結された。段階希釈したキメラ抗体またはヒト化16A抗体(図6に示すような抗体濃度)を糖ペプチドと共にインキュベートした。PBS 0.05% Tween-20で3回洗浄した後、プレートをHRP-コンジュゲートのヤギ抗マウス二次抗体(HRP-conjugated goat-anti-mouse secondary antibody)と共にインキュベートした。3回洗浄した後、プレートをDAB試薬と共にインキュベートした。非グリコシル化対照ペプチドを同じ濃度で使用して、キメラ抗体またはヒト化16A抗体へのそれらの結合を測定した。
肺癌細胞株H838は、the University of Texas M.D. Anderson Cancer Centerから入手された。細胞を10%RPMI 1640培地で培養した。異なる濃度のキメラ抗体またはヒト化抗体を一次抗体として染色に使用し、PBSで3回洗浄し、次いでPE-コンジュゲートのマウス抗ヒトIgG(PE-conjugated mouse-anti-human IgG)(BioLegend)と共にインキュベートした。染色された細胞がFACS Calibreフローサイトメトリー(BD Biosciences、San Jose、CA)によって分析された。染色結果を図7に示す。
C3Hマウス(Jackson Laboratory、メイン州)に、MUC1遺伝子によって安定的にトランスフェクトされたマウス線維肉腫細胞株であるAg104-MUC1細胞株を接種した(9)。6週齢のC3Hマウスに200万個の腫瘍細胞を皮下接種した。腫瘍接種の日に、100μgの16A抗体を腹腔内注射によって投与した。16A抗体薬物を3日毎に100μg/マウスで投与した。対照マウスIgG抗体(Southern Biotech、ALから)を、対照群の担癌マウスを治療するために使用した。腫瘍の垂直な直径を測定し、腫瘍面積を用いて腫瘍荷重(tumor burden)を示した。16Aモノクローナル抗体で治療したマウスでは、腫瘍増殖は有意に阻害された。
免疫組織化学を前述のように行った(9)。簡単に言えば、5μmのパラフィン固定した組織切片をキシレンで脱パラフィンし、エタノール勾配(100、95~80%、Sigma、St. Louis、MO)を使用することによって再水和した。PT Module(Lab Vision Corp.、USA)を用いて、トリス-EDTA緩衝液(pH 9.0)で30分間抗原回復を行った。冷却後、スライドを蒸留水で十分に洗浄し、1×リン酸緩衝食塩水(PBS)でそれぞれ2分間3回洗浄した。内因性ペルオキシダーゼ活性を、室温で3%の過酸化水素(Sigma)に浸し、次いでメタノールに10分間浸し、続いて1×PBSで2分間3回洗い流すことによってクエンチした。一次抗体の非特異的な結合は、切片を10%の正常ウマ血清と共に室温で30分間インキュベートすることによってブロックした。その後、切片を1μg/mlの濃度の一次抗16Aモノクローナル抗体と共に4℃で一晩インキュベートした。
Claims (9)
- ヒト化抗体またはその機能的なフラグメントであって、ヒト化抗体が、SEQ ID NO: 28に示されるアミノ酸配列を含むCDRH1と、SEQ ID NO: 29に示されるアミノ酸配列を含むCDRH2と、SEQ ID NO: 30に示されるアミノ酸配列を含むCDRH3とを有する可変領域を含む重鎖配列、および
SEQ ID NO: 31に示されるアミノ酸配列を含むCDRL1と、SEQ ID NO: 32に示されるアミノ酸配列を含むCDRL2と、SEQ ID NO: 33に示されるアミノ酸配列を含むCDRL3とを有する可変領域を含む軽鎖配列を含み、
ここで、ヒト化抗体が、SEQ ID NO: 21-25のいずれか1つに示されるアミノ酸配列を含む重鎖配列の可変領域を含み、
ここで、ヒト化抗体が、SEQ ID NO: 27に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖配列の可変領域を含み、かつ
ここで、ヒト化抗体またはその機能的なフラグメントが癌細胞の表面上のMUC1糖ペプチドエピトープRPAPGS(GalNAc)TAPPAHGと結合することを特徴とするヒト化抗体またはその機能的なフラグメント。 - ヒト化抗体が、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 11およびSEQ ID NO: 13のいずれか1つに示されるアミノ酸配列を含む重鎖配列を含む、請求項1に記載のヒト化抗体またはその機能的なフラグメント。
- ヒト化抗体が、SEQ ID NO: 17に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖配列を含む、請求項1または2に記載のヒト化抗体またはその機能的なフラグメント。
- 請求項1~請求項3のいずれか一項に記載のヒト化抗体またはその機能的なフラグメントの重鎖および軽鎖をコードするヌクレオチドであって、前記ヌクレオチドがSEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12およびSEQ ID NO: 14のいずれか1つならびにSEQ ID NO: 18に表現されるヌクレオチド。
- 請求項4に記載のヌクレオチドを含む、発現ベクター。
- 請求項5に記載の発現ベクター、またはそのゲノムに組み込まれた請求項4に記載のヌクレオチドを含む、宿主細胞。
- 請求項1~請求項3のいずれか一項に記載のヒト化抗体またはその機能的なフラグメントと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
- 癌の予防または治療のための医薬の製造のための、請求項1~請求項3のいずれか一項に記載のヒト化抗体またはその機能的なフラグメントの使用。
- 癌を予防または治療するための医薬組成物であって、有効量の請求項1~請求項3のいずれか一項に記載のヒト化抗体またはその機能的なフラグメントを含む、医薬組成物。
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