CN103880956B - 抗muc1单克隆抗体及其轻链和重链可变区 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了抗MUC1单克隆抗体及其轻链和重链可变区。提供了具有生物学活性的抗MUC1单克隆抗体FMU-MUC1-No.1的轻链和重链可变区,轻链可变区的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1,重链可变区的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。通过采用基因工程技术和杂交瘤技术制备了一组小鼠抗MUC1mAbs,筛选出能稳定分泌高特异性的抗MUC1mAb的杂交瘤细胞株,制备腹水获得高特异性、高亲和力的抗MUC1mAb?FMU-MUC1-No.1。确认该基因序列和相应蛋白序列的惟一性及其CDR序列;为研制和开发抗MUC1嵌合或人源化基因工程抗体或分子诊断和治疗试剂提供支持。
Description
技术领域
本发明属于生物医学技术领域,涉及一种单克隆抗体,特别涉及高特异性抗MUC1单克隆抗体(FMU-MUC1-No.1)及其轻链和重链可变区,包括其氨基酸序列和核苷酸序列以及抗体制备方法和其对乳腺癌等的诊治用途。背景技术
乳腺癌是严重危害女性健康的常见恶性肿瘤,在世界范围内,乳腺癌占所有癌症发病率的10%,占女性癌症发病率的32%、女性癌症死亡率的15%。全世界每年约有120万妇女罹患乳腺癌。在北美、西欧等发达国家,乳腺癌发病率占女性恶性肿瘤首位。中国是乳腺癌发病率增长速度最快的国家之一,近年来乳腺癌发病率正以每年3%的速度递增,已成为城市女性的第一杀手,尽管有手术以及包括放疗、化疗、内分泌治疗等在内的综合治疗措施,但乳腺癌复发、转移病人终因不能治愈而死亡,因此,需要寻求新的诊断和治疗方法。单克隆抗体技术的出现是免疫学领域的重大突破。利用单克隆抗体靶向病变组织或细胞表面抗原,已成为乳腺癌分子诊断和免疫治疗的重要策略,而选择理想的靶分子是其关键。MUC1特有的结构和功能特点,使其成为乳腺癌分子诊断和免疫治疗的一种理想靶抗原。
1、MUC1分子与生物学功能
MUC1又名多形上皮粘蛋白(polymorphicepithelialmucin,PEM),它是最先与机体免疫***接触的细胞表面分子之一,是一种高度糖基化的I型跨膜蛋白,正常情况下主要表达于多种组织、器官中的上皮细胞腺腔面,呈顶端表达,极性分布;在癌细胞表面MUC1异常表达,呈非极性分布。研究表明:MUC1在乳腺癌等多种肿瘤组织中异常表达,并且与肿瘤的发生、发展及预后密切相关。
1.1MUC1基因
MUC1基因最早是从乳腺癌等细胞系构建的cDNA表达文库克隆而得到的,定位于lq21(1号染色体长臂21带处),该基因也是唯一编码跨膜黏蛋白的基因。人的MUC1基因cDNA全长为1821bp,含有7个外显子,不同外显子作用各异。MUC1基因的一个重要特征是其多态性(polymorphism),即其第2个外显子中含有数量不等的串联重复序列(variablenumberoftandemrepeats,VNTRs),从20~125不等,抗原表位即位于VNTRs区。每一个VNTR结构都含有60个碱基,富含GC,编码20个氨基酸,它们是GVTSAPDTRPAPGSTAPPAH。其中APDTRPA部位是T细胞和B细胞共同识别的表位,对MUC1的免疫原性起决定作用。
1.2MUC1分子结构
MUC1是一种高分子量的糖蛋白,由核心肽和糖链组成,糖链占50~90%,多以O型糖苷键与多肽骨架VNTR的Ser/Thr相连。串联重复区是核心肽的典型结构,每个重复序列VNTR含有2个丝氨酸Ser、3个苏氨酸Thr,这些都是糖基化的潜在位点。在MUC1羧基末端,包括由72个氨基酸组成的胞内区、28个氨基酸组成的跨膜区和58个氨基酸组成的胞外区三部分。其中胞内段和跨膜段在不同种属间的结构具有高保守性,提示其重要的生物学功能。胞外段含有由20个氨基酸组成的串联重复序列,决定了MUC1的空间结构特异性及免疫原性。正常情况下,MUC1胞外段覆盖着密集、高度分支的糖链,当细胞发生癌变时,MUCI的糖链变得稀疏,因而抗原表位肽骨架暴露出来,具有免疫原性。
1.3MUC1在乳腺癌等肿瘤组织表达
正常情况下,MUC1主要在乳腺、胰腺、消化道、呼吸道、生殖道等多种组织、器官中上皮细胞近管腔或腺腔面表达,呈顶端表达,极性分布,集中位于腺上皮细胞的腔面,胞质未见表达,不易被免疫***识别。但在肿瘤细胞中MUC1异常表达:(1)MUC1在肿瘤细胞表面表达量显著升高,呈过度表达,为正常表达量的100倍以上,且与肿瘤的恶性程度呈正相关;(2)MUC1在肿瘤细胞上表达呈非极性,分布在细胞的表面,且胞质中也可见;(3)在肿瘤细胞中由于糖基转移酶活性增高,导致糖基化不完全,糖链变短,使正常隐蔽的核心肽表位暴露,使其具有免疫原性,并出现了新的糖链表位(如Tn、STn、TF等糖表位)。MUC1在正常乳腺上皮细胞和良性肿瘤组织中弱阳性表达,呈极性分布,核心肽表位被外周糖链所掩盖,不能被识别;在癌变细胞表面,由于糖基化不全抗原肽表位得以暴露。研究发现,MUC1在乳腺癌组织中阳性表达率超过90%。此外,MUC1在胰腺癌、结直肠癌、肺癌、卵巢癌、甲状腺癌等肿瘤组织细胞中广泛表达。
1.4MUC1的生物学功能
早期的研究证明MUC1黏蛋白的主要生物学功能是对腺腔的上皮细胞起润滑、保护作用以及黏性维持等。随着对MUC1研究的不断深入,发现MUC1分子具有多种功能,如黏附-抗黏附作用、免疫活化-免疫抑制作用等。MUC1还具有介导细胞间的信号转导并参与机体免疫调节等功能。最新的研究表明:由于MUC1基因与信使RNA转译后调控有关联,因此其异常表达可能与癌细胞的生长和转移有关。
2、MUC1抗体研究现状
单克隆抗体(monoclonalantibody,mAb)研究是2l世纪生物学领域最热门的研究方向之一,Cynthia等描述了一种MUC1单克隆抗体的制备方法与用途。DanielCheek等发明抗原结合和/或识别特性的抗mucin抗体以及用于改进抗mucin抗体的抗原结合和/或识别的方法,以用于癌症的免疫治疗。D.BRubinstein等发明提供同时结合完整MUC1蛋白的α亚基和β亚基的抗体,以及制备和使用这些抗体的方法。西村绅一郎等发现:使用MUC1的2,3ST糖肽作为抗原对动物进行免疫,所得抗体可特异性地识别癌特异性的MUC1糖链,进而可以识别、杀伤表达MUC1糖链的癌细胞。该发明提供的抗体对MUC1的癌相关结构的特异性识别与对MUC1的正常组织相关结构的特异性识别二者有显著差异。
国内学者张立新等经高速离心从正常人乳中获得人乳汁颗粒膜(HMFGM),经进一步破碎、脱脂及纯化,获得含MUC1粘蛋白的组分,并经SDS-PAGE、Western-blot及ELISA鉴定后,免疫家兔制备多抗。结果表明,制备获得的多抗经ELISA测定效价为1:64000~1:128000。马忠良等以乳腺癌细胞系ZR75免疫Bulb/c小鼠,获得恒定分泌抗ZR75单克隆抗体的杂交瘤细胞系BM109,具有一定的特异性。李媛等采用大肠杆菌原核表达***表达的8R-MUC1-6Histag为免疫原制备MUC1单克隆抗体,但以此得到的单抗无法识别肿瘤细胞表面MUC1表达,不能满足制备高灵敏度及高特异性ELISA检测试剂盒的要求。为获得高特异性的MUC1单抗,改用Bac-to-Bac杆状病毒表达***表达MUC1蛋白,以期成为制备MUC1单抗的理想抗原。唐艳等以8R-MUC1核心肽重组蛋白为抗原免疫家兔,以ELISA法确定抗MUC1多克隆抗体效价,以Westernblot和ELISA阻断试验鉴定抗体特异性。结果MUC1核心肽多克隆抗体效价为1:256000,能与MUC1核心肽特异性结合,但与单抗相比,多克隆抗体特异性较差。
3、抗体改造与应用
抗体单体分子是由两条相同的重链(H链)和两条相同的轻链(L链),通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。H链和L链包括氨基(N)端和羧基(C)端,靠近N端的可变区(V区)由高变区/互补决定区(HVR/CDR)和骨架区(FR)组成;靠近C端为恒定区(C区)。重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)形成的蛋白质折叠是抗原结合部位,其中的CDR/HVR是抗体与抗原决定基互补结合的部位,C区引发抗原抗体识别后的反应。抗体根据FR/C区不同可分为人源、鼠源等,鼠源性抗体在人体内使用时具有免疫原性,易引起人体的免疫反应,这些免疫反应可引起对鼠源性抗体的清除以及免疫复合物介导的超敏反应。为了克服鼠源性抗体的缺陷,需要构建高亲和力的特异性嵌合抗体、单链抗体或人源化抗体。
在改造过程中,最为重要的是首先必须获得具有良好特异性、亲和力的鼠源性亲本抗体,克隆其轻链和重链可变区基因,然后将这两条基因进行改造,构建重组抗体基因。因此,筛选出高特异性、高亲和力的鼠源性抗MUC1mAb,从中克隆出轻、重链可变区基因,对进一步研制具有完全自主知识产权的MUC1基因工程抗体制剂,作为乳腺癌分子诊断和免疫治疗的重要手段以填补我国在该领域的空白,不仅对于提升我国乳腺癌防治应对能力具有极其重大的重要意义,而且在MUC1阳性表达的胰腺癌、肺癌、胃肠道肿瘤及甲状腺癌的分子诊断与免疫治疗方面也具有十分重要的实际应用价值。
发明内容
本发明解决的问题在于提供抗MUC1单克隆抗体及其轻链和重链可变区,该抗体为与乳腺癌细胞特异性结合、不与正常乳腺细胞结合的抗体,为构建高特异性的抗MUC1嵌合或人源化基因工程抗体提供支持。
本发明是通过以下技术方案来实现:
一种抗MUC1单克隆抗体,包括轻链和重链,所述轻链可变区的3个互补决定区(CDR)序列分别为:
CDR1:Gly-Phe-Thr-Phe-Ser-Asn-Tyr-Trp;
CDR2:Ile-Arg-Leu-Ile-Ser-Asn-Asn-Tyr-Val-Pro;
CDR3:Ser-Phe-Gly-Asn-Ser-Phe-Ala-Tyr;
所述重链的可变区的3个互补决定区(CDR)序列分别为:
CDR1:Ser-Ser-Val-Ser-Tyr;
CDR2:Leu-Thr-Ser;
CDR3:Gln-Gln-Trp-Ser-Ser-Asn-Pro-Leu-Thr。
所述的抗MUC1单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1,重链可变区的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。
所述的编码MUC1单克隆抗体轻链可变区的基因序列如SEQ.ID.NO.3所示,编码重链可变区的基因序列如SEQ.ID.NO.4所示。
所述的抗MUC1单克隆抗体的轻链和重链可变区应用于构建针对MUC1的基因工程抗体或分子诊断和治疗试剂的制备。
与现有技术相比,本发明具有以下有益的技术效果:
1、本发明提供的抗MUC1单克隆抗体,是一种高特异性抗MUC1单克隆抗体:与乳腺癌等MUC1阳性表达肿瘤细胞特异性结合,表现出高亲和力、高特异性;与乳腺癌细胞特异性结合、不与正常乳腺细胞结合的抗体。可进一步用于乳腺癌的分子诊断和免疫治疗等方面的研究,为乳腺癌的早期诊断与免疫治疗提供新方法、新策略。
2、本发明克隆抗MUC1单克隆抗体的轻链、重链可变区基因和氨基酸序列,序列分析证实了该抗体序列的惟一性。
3、分析获得轻链、重链可变区的CDR区,在此基础上为构建高特异性、高亲和力的抗MUC1嵌合或人源化基因工程抗体提供支持。
附图说明
图1是FMU-MUC1-No.1mAb的免疫荧光检测结果;
图2是FMU-MUC1-No.1mAb的流式细胞术鉴定结果;
图3是FMU-MUC1-No.1mAb的Westernblot鉴定结果;
图4是FMU-MUC1-No.1mAb免疫组化结果;
图5是FMU-MUC1-No.1mAb基因PCR结果;
图6是FMU-MUC1-No.1mAb轻链可变区基因同源性序列检测结果;
图7是FMU-MUC1-No.1mAb重链可变区基因同源性序列检测结果;
图8是FMU-MUC1-No.1mAb轻链可变区氨基酸同源性序列检测结果;
图9是FMU-MUC1-No.1mAb重链可变区氨基酸同源性序列检测结果;
图10是FMU-MUC1-No.1mAb轻链和重链可变区氨基酸序列结构。
具体实施方式
本发明用合成的MUC1重复序列免疫Balb/c小鼠,筛选出能稳定分泌高特异性抗MUC1单抗FMU-MUC1-No.1mAb杂交瘤细胞株,制备腹水获得高特异性抗MUC1mAb;并确认该基因序列和相应蛋白序列的惟一性及其CDR序列;为抗MUC1嵌合或人源化基因工程抗体提供支持。下面结合具体单克隆抗体的制备方法、抗体特异性和活性检测,以及序列的检测和唯一性的确定对本发明做详细说明,所述是对本发明的解释而不是限定。本发明具体按以下步骤实施:
1、抗MUC1单抗FMU-MUC1-No.1mAb的制备及其特异性鉴定
1.1MUC1短肽合成与抗原制备
合成的MUC1两个重复序列为CGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAH。合成序列N→C,纯度>95%。多肽合成后,为增强其免疫性,将多肽与钥孔血蓝蛋白(KLH)及牛血清白蛋白(BSA)交联。MUC1重复序列的短肽合成及其与KLH、BSA蛋白偶联由上海紫域生物科技有限公司完成。合成的MUC1两个重复序列短肽与KLH、BSA蛋白偶联后作为制备单克隆抗体的免疫原。
1.2单克隆抗体的制备、纯化
按单克隆抗体制备方法(细胞和分子免疫学实验技术第一版,P9-P17),用MUC1抗原免疫Balb/c小鼠(每只小鼠20μg/次,购自第四军医大学实验动物中心)。初次免疫,使用弗氏完全佐剂,后续免疫使用弗氏不完全佐剂,每次间隔3周,均为皮下多点注射,共免疫4次。末次免疫7~10天后采血测其效价,检测免疫效果。间隔2~3周后,经腹腔注射抗原再加强免疫,3天后处死动物取脾进行细胞融合。
取对数生长的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0计数,同时制备免疫脾细胞悬液。将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:10比例混合进行细胞融合。融合后细胞悬液加入含有饲养细胞(正常Balb/c小鼠腹腔巨噬细胞)的96孔板,37℃、5%CO2孵箱培养。待克隆出现后,间接ELISA检测,挑选阳性克隆。对含有阳性克隆孔的细胞采用有限稀释法进行克隆化,直至获得能够稳定分泌抗体的杂交瘤细胞系(体外连续培养超过6个月)。
诱导产生腹水及抗体纯化:在获得能够稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株后,按常规制备腹水(细胞和分子免疫学实验技术第一版,P9-P17)。腹水经45%饱和硫酸铵沉淀后,采用QFF阴离子交换层析法纯化,纯化的FMU-MUC1-No.1mAb纯度达95%。抗体的IgG亚型的鉴定按Sigma检测试剂盒说明书操作。对其分泌的抗体进行Ig亚类测定(结果为IgG1亚类,κ型轻链)。
1.3抗MUC1单克隆抗体FMU-MUC1-No.1的效价测定
用间接ELISA方法测定纯化前腹水以及纯化后mAb的相对亲和力。其中包被抗原为合成MUC1免疫原,待测样品为系列稀释的腹水以及纯化后mAb,检测抗体为羊抗鼠-HRP酶标记抗体,底物使用ABTS。所筛选出的高亲和力FMU-MUC1-No.1mAb,腹水效价为1×10-6,纯化后效价达1×10-8,而一般采用间接ELISA检测腹水效价达1×10-5以上的抗体即可使用。
1.4抗MUC1单克隆抗体FMU-MUC1-No.1的免疫荧光检测
用制备的抗MUC1mAb对乳腺癌细胞(MCF-7)和肝癌细胞(HepG2)做免疫荧光分析MUC1的表达情况。步骤如下:取出长有细胞的盖玻片,弃培养液,用PBS洗2次,加入40g/L多聚甲醛,室温固定10min,PBS洗涤后,加入1mL100g/L的BSA/PBS,室温封闭1h。使用100g/L的BSA/PBS稀释抗FMU-MUC1-No.1,室温孵育3h。使用100g/L的BSA/PBS稀释的四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)标记的山羊抗小鼠IgG室温避光孵育1h。PBS洗6次。加入1μg/mL用PBS稀释的DAPI,孵育2min。用PBS洗4次,避光,自然风干。封片后观察。
检测结果图1所示,可以看到乳腺癌细胞发出了荧光(右),而肝癌细胞未发出荧光(左)。
免疫荧光染色检测证实:抗MUC1单克隆抗体可与MUC1阳性表达的乳腺癌细胞特异性结合,与MUC1表达阴性的肝癌细胞不结合。
1.5抗MUC1单克隆抗体FMU-MUC1-No.1的流式细胞术鉴定
将乳腺癌细胞MCF-7用0.25%胰蛋白酶消化制成单细胞悬液,计数1×106个细胞,用PBS洗涤2次,1000r/min离心5min,弃去上清液,然后加入单克隆抗体FMU-MUC1-No.1(200μg/mL)孵育45min,使用同型单抗IgG-PE做阴性对照。用PBS洗涤2次,再加入羊抗鼠PE荧光二抗避光孵育30min。PBS洗涤2次,加入多聚甲醛固定液400μL,上机检测与分析,使用仪器为流式细胞仪。
流式细胞检测结果如图2所示,可以看到结合了FMU-MUC1-No.1之后的细胞落到了目标区域(右图),而未看到对照IgG落入到目标区域(左图);结果表明:与对照组相比,抗MUC1单克隆抗体与MUC1阳性表达乳腺癌细胞MCF-7高特异性结合反应。
1.6抗MUC1单克隆抗体FMU-MUC1-No.1的Westernblot鉴定
收集乳腺癌细胞(MCF-7),肝癌细胞(HepG2),裂解细胞,SDS-PAGE后按Westernblot步骤用制备的抗MUC1的FMU-MUC1-No.1mAb分析不同肿瘤细胞中MUC1的表达情况。
Westernblot步骤:收集细胞,将细胞裂解后制样,SDS-PAGE电泳后转膜。50g/L的脱脂奶粉37℃封闭2h,TBST洗膜3次;加入制备的抗MUC1的mAb(1:2000),4℃过夜,TBST洗膜。加入山羊抗小鼠IgG孵育1h;加入ECL底物,显影。
结果显示如图3所示,可以看到FMU-MUC1-No.1能够识别乳腺癌细胞裂解后特定的蛋白(泳道1),而未能识别肝癌细胞裂解物中的蛋白,结果表明:抗MUC1单克隆抗体可以特异性识别乳腺癌组织细胞裂解物中天然的MUC1蛋白,相对分子量为220kDa,与MUC1阴性表达肝癌细胞裂解物不结合。
1.7抗MUC1单克隆抗体FMU-MUC1-No.1的免疫组化鉴定
乳腺癌组织切片脱蜡、水化。PBS洗5min。将切片浸入0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)中,高压锅2min或水浴加热,自然冷却,PBS洗;30mL/L过氧化氢孵育10min;PBS洗切片;滴加抗MUC1一抗,37℃水浴箱中孵育1h。PBS洗5次;滴加生物素标记的山羊抗小鼠IgG,37℃孵育30min。PBS洗5次;DAB显色1~3分钟;苏木素衬染,脱水、透明、封片、光镜观察。实验中以空白试验和替代试验作为阴性对照,以确保实验的特异和可靠性。
乳腺癌石蜡组织切片免疫组织化学染色分析结果如图4所示,结果证实:抗MUC1mAb与乳腺癌细胞高特异性强烈结合(图4A、B、C,阳性染色主要出现在乳腺癌细胞膜上,部分胞浆染色),而不与癌旁正常乳腺组织结合(图4D)。
2、抗MUC1单抗FMU-MUC1-No.1mAb轻链和重链可变区基因的克隆
2.1FMU-MUC1-No.1mAb杂交瘤细胞的培养
按常规方法复苏(细胞培养,第一版,P88)分泌FMU-MUC1-No.1mAb的杂交瘤细胞,用含10%小牛血清的RPMI1640培养基于37℃,5%CO2孵箱中培养至对数生长期。
2.2总RNA的提取和cDNA第一链的合成
采用TRIZOLReagent(购自美国GIBCO公司)提取总RNA,具体操作步骤按说明书进行;cDNA第一链合成试剂盒购自美国GIBCO公司,在得到总RNA后按说明书进行反转录合成cDNA第一链。
2.3RT-PCR法扩增FMU-MUC1-No.1mAb的VL和VH基因
一步法RT-PCR扩增试剂盒购自TakaRa公司,按试剂盒说明书扩增FMU-MUC1-No.1mAb的VL和VH基因;
引物如下:
扩增抗体Fd片段及轻链全长基因的引物(括号内为简并碱基)
小鼠重链V区5’端引物:
VH1:5’-GGGGATATCCACCATGG(AG)ATG(CG)AGCTG(TG)GT(CA)AT(CG)CTCTT-3’
VH2:5’-GGGGATATCCACCATG(AG)ACTTCGGG(TC)TGAGCT(TG)GGTTTT-3’
VH3:5’-GGGGATATCCACCATGGCTGTCTTGGGGCTGCTCTTCT-3’
VH4:5’-GGGGATATCCACCATGAT(AG)GTGTT(AG)AGTCTT(CT)TGT(AG)CCTG3’
Fd3':5'-AGGCTTACTAGTACAATCCCTGGGCACAAT-3';
小鼠轻链V区5’端引物
VL1:5’-GGGGATATCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT-3’
VL2:5’-GGGGATATCCACCATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAG-3’
VL3:5’-GGGGATATCCACCATGGAG(AT)CACA(GT)(AT)CTCGGGTCTTT(GA)TA-3’
VL4:5’-GGGGATATCCACCATG(GT)CCCC(AT)(AG)CTCAG(CT)TC(CT)CT(TG)GT-3’
VL5:5’-GGGGATATCCACCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTG-3’
轻链3'端引物:
MLC-3’:5'-GCGCCGTCTAGAATTAACACTCATTCCTGTTGAA-3';
反应体积50μl,反应条件为:94℃5min;95℃30s,58℃1min,72℃1min,循环35次;72℃7min。
2.4PCR扩增产物的克隆和筛选
PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳,用小量胶回收试剂盒(购自上海华舜生物工程有限会司)回收PCR扩增片段,用DNA连接试剂盒(购自TakaRa公司)将该片段按说明书,利用加A尾***pMD-T18载体(购自TakaRa公司)中,连接物转化E.coli(购自中国普通微生物菌种保藏中心,CGMCC,北京),接种在Amp抗性LB琼脂培养平皿中37℃培养过夜。抗MUC1单抗FMU-SEB-No.1mAb基因PCR结果如图5所示。
挑取LB琼脂培养平皿中克隆,在Amp抗性LB培养基中37℃摇菌过夜,以lμl菌液为模板,通过上述针对轻链、重链可变区设计的引物,用PCR法筛选重组阳性E.coli克隆。
将所获得重组阳性E.coli克隆摇菌,菌液送交上海生物工程技术服务有限公司完成基因序列测定,轻链可变区的基因序列如SEQIDNO.3所示,重链可变区的基因序列如SEQIDNO.4所示。
3、FMU-MUC1-No.1mAb轻链和重链可变区的核苷酸序列及同源性分析
3.1确定测序无误后,在GenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库中,进行核苷酸序列同源性分析(Blastn)。
在GenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库中,进行核苷酸序列同源性分析(Blastn)。
如图6所示,FMU-MUC1-No.1mAb轻链可变区基因与同源性最高对比序列可达289/299(98%);
如图7所示,FMU-MUC1-No.1mAb重链可变区基因与同源性最高对比序列可达283/286(99%)。
同源性分析表明,编码FMU-MUC1-No.1mAb的轻、重链可变区的核苷酸序列,尽管与其它基因序列有一定同源性,但未发现与本发明完全相同的基因序列,表明本发明在基因序列上具有惟一性。
3.2将可变区基因翻译成氨基酸序列,进行氨基酸序列分析
单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.1,重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。
在non-redundantGenbankCDStranslations+PDB+SwissProt+PIR+PRF蛋白质数据库中,进行氨基酸序列同源性分析(Blastp)。
分析结果表明:
如图8所示,FMU-MUC1-No.1mAb轻链氨基酸序列与同源性最高对比序列可达91/99(92%);
如图9所示,FMU-MUC1-No.1mAb重链氨基酸序列与同源性最高对比序列可达81/98(83%)。
同源性分析表明,FMU-MUC1-No.1mAb轻、重链可变区的氨基酸序列,尽管与其它蛋白氨基酸序列有一定同源性,但未发现与本发明完全相同的氨基酸序列,表明本发明在氨基酸序列上也具有惟一性。
3.3利用IMGT/V-QUEST分析可变区结构,确定CDR区。
将测序所得FMU-MUC1-No.1mAb轻链和重链可变区序列,在IMGT/V-QUEST网站(http://imgt.cines.fr/IMGT_vquest/vquest)进行分析,得出其CDR区。
轻链可变区的3个互补决定区(CDR)序列,如SEQIDNO.1划线部分所示,具体为:
CDR1:Gly-Phe-Thr-Phe-Asn-Tyr-Trp;
CDR2:Ile-Arg-Leu-Ile-Ser-Asn-Asn-Tyr-Val-Pro;
CDR3:Ser-Phe-Gly-Asn-Ser-Phe-Ala-Tyr;
重链可变区的3个互补决定区(CDR)序列,如SEQIDNO.2划线部分所示,具体为:
CDR1:Ser-Ser-Val-Ser-Tyr;
CDR2:Leu-Thr-Ser;
CDR3:Gln-Gln-Trp-Ser-Ser-Asn-Pro-Leu-Thr。
4.基因工程抗体设计
基于抗MUC1单抗FMU-MUC1-No.1mAb的表达、纯化以及序列分析,设计构建以下生物制品
1)单链抗体的构建:可将本发明的FMU-MUC1-No.1mAb轻、重链可变区基因通过linker连接,***原核或真核表达载体,转化宿主菌或转染真核细胞,用于制备可对MUC1有靶向作用的单链抗体。
2)人-鼠抗MUC1嵌合抗体的构建:可将本发明的FMU-MUC1-No.1mAb轻、重链可变区基因***通用型嵌合抗体表达载体中,获得含嵌合基因的载体转染真核细胞,用于制备可对MUC1有靶向作用的嵌合抗体。
3)人源化抗体的构建:可将本发明的FMU-MUC1-No.1mAb轻、重链可变区基因的CDR区移植到人源抗体可变区的骨架区(FR)中,形成互补决定区(CDR)移植抗体(CDR-graftedantibody),也称重构抗体(reshapingantibody)或人源化抗体(humanizedantibody)。
利用CDR移植技术改造抗体,可以获得既保持鼠源性亲本mAb特异性,又更加接近人抗体的新型抗体,用于制备可对MUC1有靶向作用的人源化抗体。
4)可根据本发明的基因序列及其编码的氨基酸序列,制备针对MUC1功能表位的其它生物制品。
5)可应用本发明的高特异性、高亲和力FMU-MUC1-No.1mAb制备测定MUC1表达阳性的乳腺癌以及胰腺癌、肺癌、胃肠道癌、甲状腺癌等肿瘤的ELISA诊断试剂盒,可望在乳腺癌等MUC1阳性表达肿瘤的早期诊断检验中有广泛的应用价值。
Claims (2)
1.一种抗MUC1单克隆抗体,包括轻链和重链,其特征在于,所述轻链的可变区的3个互补决定区(CDR)序列分别为:
CDR1:Gly-Phe-Thr-Phe-Ser-Asn-Tyr-Trp;
CDR2:Ile-Arg-Leu-Ile-Ser-Asn-Asn-Tyr-Val-Pro;
CDR3:Ser-Phe-Gly-Asn-Ser-Phe-Ala-Tyr;
所述重链的可变区的3个互补决定区(CDR)序列分别为:
CDR1:Ser-Ser-Val-Ser-Tyr;
CDR2:Leu-Thr-Ser;
CDR3:Gln-Gln-Trp-Ser-Ser-Asn-Pro-Leu-Thr;
所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1,重链可变区的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示;
编码轻链可变区的基因序列如SEQ.ID.NO.3所示,编码重链可变区的基因序列如SEQ.ID.NO.4所示。
2.权利要求1所述的抗MUC1单克隆抗体在构建针对MUC1的基因工程抗体或分子诊断和治疗试剂中的应用。
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