JP7129990B2 - 組換え酵母及びその使用 - Google Patents
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Description
Yunyunらは、E.coliにおいてゲルマクレンAの生合成経路を構築したが、得られた組換え株により合成されたゲルマクレンAの収量は最高でもわずか6.32mg/Lであり、工業化からは程遠い(β-エレメンの前駆体-ゲルマクレンA-の微生物生合成の研究、Gao Yunyun、2012、杭州師範大学)。
ゲルマクレンAシンテターゼをコードする核酸又は融合タンパク質をコードする核酸を酵母に導入することであり、
及び/又は、
ゲルマクレンAシンテターゼをコードする核酸を酵母に導入することが、ゲルマクレンAシンテターゼをコードする核酸を含む発現カセットを酵母に導入することであり、
融合タンパク質をコードする核酸を酵母に導入することが、融合タンパク質をコードする核酸を含む発現カセットを酵母に導入することであり、
及び/又は、
ゲルマクレンAシンテターゼをコードする核酸を含む発現カセットは、プロモーター、ゲルマクレンAシンテターゼをコードする核酸、及びターミネーターを含み、
及び/又は、
融合タンパク質をコードする核酸を含む発現カセットは、プロモーター、融合タンパク質をコードする核酸、及びターミネーターを含み、
又は
プロモーターは、TEF1もしくはMF1もしくはPGK1から選択され、ターミネー
ターがCYC1もしくはADH1であり、
又は
プロモーターがTEF1であり、またターミネーターがCYC1であり、
又は
プロモーターがMF1であり、またターミネーターがCYC1であり、
又は
プロモーターがPGK1であり、またターミネーターがADH1である。
上記組換え株において、ゲルマクレンAシンテターゼをコードする核酸の発現カセットは、プラスミドの形で酵母に導入、
又は、融合タンパク質をコードする核酸の発現カセットは、プラスミドの形及び/又は染色体内に組み込まれた形で酵母内へ導入される。
融合タンパク質は以下のSynSmFPS-GGGS-STpGMAS、SynSmFPS-YGQ-STpGMAS、SynSmFPS-PGGH-STpGMAS、SynSmFPS-YRSQI-STpGMAS、SynSmFPS-VIPFIS-STpGMAS、SynSmFPS-FLYLKF-STpGMAS、SynSmFPS-WRFSPKLQ-STpGMAS、SynSmFPS-HHVQESQCISTV-STpGMAS、SynSmFPS-WRFSPKLQ-STpGMAS、ERG20-GGGS-LsLTC2の少なくとも一つから選択され;
融合タンパク質は好ましくはSynSmFPS-8A005-STpGMASであり、
特に好ましい融合タンパク質は、3種の融合タンパク質:SynSmFPS-WRFSPKLQ(8A005)-STpGMAS、ERG20-GGGS-LsLTC2、SynSmFPS-GGGS-STpGMASである。
融合タンパク質をコードする核酸を発現する発現カセットは以下の
PTEF1-SynSmFPS-GGGS-STpGMAS-TCYC1、
PTEF1-SynSmFPS-YGQ-STpGMAS-TCYC1、
PTEF1-SynSmFPS-PGGH-STpGMAS-TCYC1、
PTEF1-SynSmFPS-YRSQI-STpGMAS-TCYC1、
PTEF1-SynSmFPS-VIPFIS-STpGMAS-TCYC1、
PTEF1-SynSmFPS-FLYLKF-STpGMAS-TCYC1、
PTEF1-SynSmFPS-WRFSPKLQ(8A005)-STpGMAS-TCYC1、
PTEF1-SynSmFPS-HHVQESQCISTV-STpGMAS-TCYC1又は
PMF1-SynSmFPS-WRFSPKLQ(8A005)-STpGMAS-T
CYC1の少なくとも1つから選択される。
融合タンパク質をコードする核酸を発現する発現カセットは好ましくはPMF1-SynSmFPS-8A005-STpGMAS-TCYC1である。
融合タンパク質をコードする核酸を発現する特に好ましい発現カセットは以下の3種:PMF1-SynSmFPS-8A005-STpGMAS-TCYC1、PPGK1-ERG20-GGGS-LsLTC2-TADH1及びPTEF1-SynSmFPS-GGGS-STpGMAS-TCYC1である。
pRS313-LEU2-PTEF1-STpGMAS-TCYC1、
pRS425-LEU2-PTEF1-STpGMAS-TCYC1から選択する。
ゲルマクレンAシンテターゼをコードする核酸の発現カセットを発現するベクターは以下の
pRS425-LEU2-PTEF1-SynSmFPS-GGGS-STpGMAS-TCYC1、
pRS425-LEU2-PTEF1-SynSmFPS-YGQ-STpGMAS-TCYC1、
pRS425-LEU2-PTEF1-SynSmFPS-PGGH-STpGMAS-TCYC1、
pRS425-LEU2-PTEF1-SynSmFPS-YRSQI-STpGMAS-TCYC1、
pRS425-LEU2-PTEF1-SynSmFPS-VIPFIS-STpGMAS-TCYC1、
pRS425-LEU2-PTEF1-SynSmFPS-FLYLKF-STpGMAS-TCYC1、
pRS425-LEU2-PTEF1-SynSmFPS-WRFSPKLQ-STpGMAS-TCYC1、もしくは
pRS425-LEU2-PTEF1-SynSmFPS-HHVQESQCISTV-STpGMAS-TCYC1、又は
pRS425-LEU2-PMF1-SynSmFPS-WRFSPKLQ-STpGMAS-TCYC1から選択する。
する核酸の発現カセット、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸の発現カセット、アセチル-CoAシンテターゼをコードする核酸の発現カセット、及び別の前記マーカー遺伝子(his3)を、相同組換えにより元の酵母に導入することである。
組換え株ELE-001は、pRS313-LEU2-PTEF1-STpGMAS-TCYC1を酵母FPP-001に導入して得られる株である。
組換え株ELE-002は、pRS425-LEU2-PTEF1-STpGMAS-TCYC1を酵母FPP-001に導入して得られる株である。
組換え株ELE-011は、pRS425-LEU2-PTEF1-SynSmFPS-GGGS-STpGMAS-TCYC1を酵母FPP-001に導入して得られる株である。
組換え株ELE-012は、pRS425-LEU2-PTEF1-SynSmFPS-3A001-STpGMAS-TCYC1を酵母FPP-001に導入して得られる株である。
組換え株ELE-013は、pRS425-LEU2-PTEF1-SynSmFPS-4A001-STpGMAS-TCYC1を酵母FPP-001に導入して得られる株である。
組換え株ELE-014は、pRS425-LEU2-PTEF1-SynSmFPS-5A002-STpGMAS-TCYC1を酵母FPP-001に導入して得られる株である。
組換え株ELE-015は、pRS425-LEU2-PTEF1-SynSmFPS-6A005-STpGMAS-TCYC1を酵母FPP-001に導入して得られる株である。
組換え株ELE-016は、pRS425-LEU2-PTEF1-SynSmFPS-6B004-STpGMAS-TCYC1を酵母FPP-001に導入して得られる株である。
組換え株ELE-017はpRS425-LEU2-PTEF1-SynSmFPS-8A005-STpGMAS-TCYC1を酵母FPP-001に導入して得られる株である。
組換え株ELE-018は、pRS425-LEU2-PTEF1-SynSmFPS-12A003-STpGMAS-TCYC1を酵母FPP-001に導入して得られる株である。
組換え株ELE-019は、pRS425-LEU2-PMF1-SynSmFPS-8A005-STpGMAS-TCYC1を酵母FPP-001に導入して得られる株である。
組換え株ELE-020は、pRS425-LEU2-PMF1-SynSmFPS-8A005-STpGMAS-TCYC1、次いでPPGK1-ERG20-GGGS-
LsLTC2-TADH1、PTEF1-SynSmFPS-GGGS-STpGMAS-TCYC1、rDNA-TRP1-up及びrDNA-TRP1-downを相同組換えにより、酵母FPP-001に導入して得られる株である。
ここで、組換え株ELE-020は、本発明の保護範囲内でもある、サッカロマイセス・セレビシエCGMCC No.14829である。
Collection Center、CGMCC)に寄託してある。本寄託先の住所は中国北京市朝陽区北辰西路1号院3号楼である。本株名は、サッカロマイセス・セレビシエ、ラテン名がSaccharomyces cerevisiaeであり、またその寄託番号はCGMCC No.14829である。
1)組換え株を発酵して発酵産物を取得する工程、
2)発酵産物を有機溶液で抽出し、有機相を回収する工程、及び
3)有機相を加熱してβ-エレメンを取得する工程、
を含む。
調合前に、以下の工程をさらに含む:
a)固体選択培地中の組換え株を活性化する工程、
b)液体選択培地中での振盪培養後、組換え株を種培地に移して培養し、種液を得る工程。
ここで固体又は液体選択培地は、SD-Ura-His-Leu培地である。
1.標的遺伝子の調製
(1)ADH2、ALD6、ASC1、MF1、TEF1及びCYC1の取得
酵母NK2-SQのゲノムDNA(China Journal of Chinese
Materia Medica、Lin Tingting、Wang Dong、Dai Zhubo、Zhang Xueli、Huang Luqi、2016、41(6):1008-1015)を鋳型として抽出し、表1における遺伝子増幅で必要とされるプライマーを用いて増幅し、所望サイズを有するADH2、ALD6、ASC1遺伝子断片、プロモーターMF1、TEF1およびターミネーターCYC1を得た。
Nanjing GenScript Biotechnology Co.,Ltd.により、SynSmFPS(配列番号2、タンジン(Salvia miltiorrhiza)由来)及びSTpGMAS(配列番号3、ナツシロギク(Tanacetum parthenium)由来)遺伝子の配列に従って全長プライマーを設計し、さらに鋳型DNAをOVERLAP法を用いて形成した。SynSmFPS(配列番号2)及びSTpGMAS(配列番号3)の二重鎖DNAをPCR増幅法により得て、続いてPCR産物をクローニングベクターpUC57(Nanjing GenScript Biotechnology Co.,Ltd.)に形質転換、クローニングし、SynSmFPS遺伝子とSTpGMAS遺伝子をそれぞれ含むpUC57-SynSmFPSおよびpUC57-STpGMASクローニングプラスミドを構築した。
レタスの葉を200mg採取し、液体窒素で粉砕し、続いてその全RNAをCTAB法(臭化セチルトリメチルアンモニウム法)によって抽出した。すなわち、1mlの2×C
TAB抽出液(2%CTAB、100mMのTris-HCl、PH8.0、20mMのEDTA溶液(エチレンジアミン四酢酸)及び1.4MのNaCl溶液)を1.5mlの遠心分離管に加えた。65℃の予備加熱後、20μLの2-メルカプトエタノールを加え、少量のレタス葉粉末(約50mg)をこれに加え、続いてこれらをよく混合、65℃で10分維持し、5回振盪し、12、000rpmで10分、4℃で遠心分離した。得られた上清を取り除き、等量のクロロホルム/イソアミルアルコールで抽出し、12、000rpmで10分、4℃で遠心分離した。得られた上清を取り除き、等量のクロロホルム/イソアミルアルコールで抽出し、12、000rpmで10分、4℃で遠心分離した。得られた上清を取り除き、1/6量のクロロホルム/イソアミルアルコールで抽出し、15、000rpmで30分、4℃で遠心分離した。得られた上清を取り除き、これに1/4量の10mol/L LiClを加え、4℃で一晩維持し、15、000rpmで30分、4℃で遠心分離した。上清を廃棄し、得られた沈殿物を75%エタノールで2回洗浄し、無水エタノールで1回洗浄し、スーパークリーンベンチ上に15分(室温)置いた。これを20μLのmilliQ DEPC-処理水(この溶媒はmilliQ純水であり、溶質はピロ炭酸ジエチルであり、ピロ炭酸ジエチル:水の容積比は1:1000であった)に溶解し、これに対して1/10量の2mol/LのNaAC(pH4.0)と2容量の無水エタノールを加え、-20℃で2時間維持し、12、000rpmで10分、4℃で遠心分離した。得られた上清は廃棄し、得られた沈殿物を75%エタノールで2回洗浄し、無水エタノールで1回洗浄し、スーパークリーンベンチ上に15分(室温)置き、これに15μLのmilliQ DEPC-処理水を加え、沈殿物を完全に溶解させ、-70℃で保存した。
(1)プラスミドpM2-ADH2
上記「1.標的遺伝子の調製」における増幅により得たADH2及びプラスミドpM2-tHMG1(中国特許ZL201310399947.Xに記載)をSexA1(NEB Co.,Ltd(北京)から購入)とAsc1(NEB Co.,Ltd(北京)から購入)を用いて二重酵素消化し、1052bpのADH2酵素消化産物及び4738bpの酵素消化プラスミドpM2-tHMG1基本骨格を得て、ADH2酵素消化産物を次いで酵素消化プラスミドpM2-tHMG1基本骨格にライゲートし、組換えプラスミドpM2-ADH2を得た。
上記「1.標的遺伝子の調製」における増幅により得たACS1及びプラスミドpM4-AtCPR1(中国特許ZL201310399947.Xに記載)をSexA1とAsc1を用いて二重酵素消化し、2201bpのACS1酵素消化産物及び5061bpの酵素消化プラスミドpM4-AtCPR1基本骨格を得て、ACS1酵素消化産物を次いで酵素消化プラスミドpM4-AtCPR1基本骨格にライゲートし、組換えプラスミドpM4-ACS1を得た。
上記「1.標的遺伝子の調製」における増幅により得たALD6及びプラスミドpM3-ERG9(中国特許ZL201310399947.Xに記載)をSexA1とAsc1を用いて二重酵素消化し、1511bpのALD6酵素消化産物及び4598bpの酵素消化プラスミドpM3-ERG9基本骨格を得て、ALD6酵素消化産物を次いで酵素消化プラスミドpM3-ERG9基本骨格にライゲートし、組換えプラスミドpM3-ALD6を得た。
上記「1.標的遺伝子の調製」における増幅により得たTEF1をSexA1を用いて酵素消化し、440bpのTEF1酵素消化産物を得た。
上記「1.標的遺伝子の調製」における増幅により得たCYC1をAsc1を用いて酵素消化し、322bpのCYC1酵素消化産物を得た。
pUC57-STpGMASをSexA1とAsc1を用いて酵素消化し、また1694bpのSTpGMASを回収した。
ション系に加えた。これらは室温で2時間反応させ、ライゲーション産物を得た。
High-Fidelity PCR Master Mix with HF緩衝液キット、NEB)に加えた。増幅条件は、予備変性を98℃で3分(1サイクル)、変性を98℃で10秒、アニーリングを58℃で10秒、伸長を72℃で1.5分(30サイクル)さらに伸長を72℃で10分(1サイクル)とした。2456bpのPCR増幅産物が得られた。
とした。
pUC57-SynSmFPS及びpUC57-STpGMASを鋳型として用い、1080bpのSynSmFPS-GGGS及び1704bpのGGGS-STpGMASを表4のプライマーを用いる増幅により得た。
μLとなるよう添加する蒸留水を含む。増幅条件は、予備変性を98℃で3分(1サイクル)、変性を98℃で10秒、アニーリングを58℃で10秒、伸長を72℃で2分(30サイクル)、伸長を72℃で10分(1サイクル)とした。
上記「1.標的遺伝子の調製」にて得たMF1及び上記項目(5)において構築したプラスミドpRS425-LEU2-PTEF1-SynSmFPS-GGGS-STpGMAS-TCYC1をそれぞれ、BamH1(TaKaRaより購入)とSexA1を用いて二重酵素消化した。814bpの標的プロモーター遺伝子MF1及び9898bpのベクター断片pRS425-LEU2-...-SynSmFPS-GGGS-STpGMAS-TCYC1をゲルから精製し、この2つ(各50ng)を、2μLの10×T4DNAリガーゼ反応緩衝液(NEB)、1μLのT4DNAリガーゼ(NEB、400,
000付着端単位/ml)、及び20μLとなるよう添加する蒸留水を含むライゲーション系に加えた。これらを室温で2時間反応させライゲーション産物を得て、Trans10コンピテント細胞を形質転換し、プラスミドを抽出、配列決定により確認した。得られたプラスミドで正しい配列と一致したものを、pRS425-LEU2-PMF1-SynSmFPS-GGGS-STpGMAS-TCYC1と名付けた。
ERG20-GGGSとGGGS-LsLTC2を共に鋳型として用い、約2744bpのERG20-GGGS-LsLTC2断片を、表5のプライマー(SexA1-ERG20及びLsLTC2-Asc1)を用いる増幅により得た。
NK2-SQゲノムDNAとpRS313を鋳型として用い、1252bpのNDT80(配列番号13)及び1168bpのHIS3(配列番号14)を、表6のプライマーを用いる増幅によって得た。
Phusion High-Fidelity DNAポリメラーゼ(2.5U/μL、0.5μL)及び総量50μLとなるよう添加する蒸留水を含む。増幅条件は、予備変性を98℃で3分(1サイクル)、変性を98℃で10秒、アニーリングを58℃で10秒、伸長を72℃で1分(30サイクル)、さらに伸長を72℃で10分(1サイクル)とした。
NK2-SQゲノムDNAとpRS314(Sikorski、R.S.及びHieter,P.1989,Genetics122(1):19-27)をそれぞれ鋳型として用い、表8のプライマーを用いる増幅によってrDNA(配列番号9)及びTRP1(配列番号10)を得た。
1.酵母コンピテント細胞の調製
元の株をそれぞれ対応する培地(表13)で30℃、250rpmで一晩培養した。1mLの培養懸濁液(OD約0.6~10)を1.5mLのEP管に加え、10,000gで1分、4℃で遠心分離した。得られた上清を廃棄し、沈殿物を滅菌水で洗浄(4℃)し、同条件下で遠心分離し、得られた上清を廃棄した。1mLの処理溶液(10mMのLiAc(酢酸リチウム)、10mMのDTT(ジチオスレイトール)、0.6Mのソルビトール、10mMのTris-HCl(トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩酸塩緩衝液、pH7.5)、DTTを処理溶液使用直前に加えた)を酵母に加え、これを25℃で20分維持した。遠心分離後、上清を廃棄し、1mLの1Mソルビトール(0.22μmの水性膜を通してろ過、滅菌した)を再懸濁した酵母に加え、これを遠心分離し、最終容量が約90μLとなるまで上清を廃棄した(1Mソルビトールで2回再懸濁)。
1)NDT80-HIS3-up、PPGK1-ADH2-TADH1、PTDH3-ACS1-TTPI1、PTEF1-ALD6-TCYC1及びNDT80-HIS3-downの調製
PPGK1-ADH2-TADH1、PTDH3-ACS1-TTPI1及びPTEF
1-ALD6-TCYC1は、アルコールデヒドロゲナーゼ2、アセチル-CoAシンテターゼ1、及びアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ6をそれぞれ担持する、発現カセットであり、NDT80-HIS3-up及びNDT80-HIS3-downは、それぞれHIS3の上流及び下流ホモロジーアームであり、断片はそれぞれ以下の方法に従って増幅した。
元株サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)NK2-SQをSD-Ura液体培地(0.8%酵母選択培地SD-Ura-Trp-His(Beijing FunGenome Technology Co.,Ltd.)、2%グルコース、0.005%His、0.01%Trp)で一晩培養し、コンピテント細胞に調製した。次いで、表9の形質転換断片M1、M2、M3、M4及びM5を総量5μg(モル比=1:1:1:1:1)で加え、よく混合し電気ショックカップに移して、電気的なショックを2.7kvで5.7ms与え、これに1mLの1Mソルビトールを加え、30℃で1時間蘇生させ、SD-Ura-His培地上に広げ、30℃で36時間以上培養した。スクリーニング培地組成の成分は、0.8%酵母選択培地SD-Ura-Trp-His(Beijing FunGenome Technology Co.,Ltd.)、2%グルコース及び0.01%Trpであった。真陽性クローンはPCR
により同定しFPP-001株と名付けた。
元株サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)FPP-001をSD-Ura-His液体培地で一晩培養し、コンピテント細胞に調製した。次いで、プラスミドpRS313-LEU2-PTEF1-STpGMAS-TCYC1及びpRS425-LEU2-PTEF1-STpGMAS-TCYC1をそれぞれ加え、よく混合し電気ショックカップに移して、電気的なショックを2.7kvで5.7ms与え、これに1mLの1Mソルビトールを加え、30℃で1時間蘇生させ、SD-Ura-His-Leu培地上に広げて、30℃で36時間以上培養した。スクリーニング培地組成の成分は、0.8%酵母選択培地SD-Ura-Trp-His(Beijing FunGenome Technology Co.,Ltd.)、2%グルコース及び0.01%Trpであった。真陽性クローンはPCRにより同定し、それぞれELE-001株(これにプラスミドpRS313-LEU2-PTEF1-STpGMAS-TCYC1を導入した)とELE-002株(これにプラスミドpRS425-LEU2-PTEF1-STpGMAS-TCYC1を導入した)と名付けた。
FPP-001コンピテント細胞を上記項目3の工程に従って調製した。次いで、これにプラスミドpRS425-LEU2-PTEF1-SynSmFPS-GGGS-STpGMAS-TCYC1を加え、よく混合し電気ショックカップに移して、電気的なショックを2.7kvで5.7ms与え、これに1mLの1Mソルビトールを加え、30℃で1時間蘇生させ、SD-Ura-His-Leu培地上に広げ、30℃で36時間以上培養した。真陽性クローンはPCRにより同定しELE-011株と名付けた。
プラスミドpRS425-LEU2-PTEF1-SynSmFPS-GGGS-STpGMAS-TCYC1を鋳型として用い、PCR増幅を表11のプライマーを用いて行い、異なるプライマーに対応する増幅産物を得た。次いで、異なるプライマーに対応する増幅産物をそれぞれ酵母FPP-001に導入し、それ自身の相同組換えを実施し、組換え株ELE-012~ELE-018をそれぞれ得た。ベクター中の融合タンパク質SynSmFPS-GGGS-STpGMASのリンカーペプチドGGGSは、それぞれ3A001、4A001、5A002、6A005、6B004、8A005、12A003と置換した(表10に示す通り)。
1)PPGK1-ERG20-GGGS-LsLTC2-TADH1、PTEF1-SynSmFPS-GGGS-STpGMAS-TCYC1、rDNA-TRP1-up及びrDNA-TRP1-downの調製
PPGK1-ERG20-GGGS-LsLTC2-TADH1およびPTEF1-SynSmFPS-GGGS-STpGMAS-TCYC1は、酵母ファルネシルピロ燐酸
シンターゼとレタス由来ゲルマクレンAシンテターゼとの融合タンパク質、コドン最適化タンジン(Salvia miltiorrhiza)由来ファルネシルピロ燐酸シンターゼとコドン最適化ナツシロギク(Tanacetum parthenium)由来ゲルマクレンAシンテターゼとの融合タンパク質をそれぞれ担持する発現カセットであり、rDNA-TRP1-up及びrDNA-TRP1-downはそれぞれ、rDNAの上流及び下流相同アームであり、これら断片を、下記方法に従い増幅した。
M1(rDNA-TRP1-up)、
M2(PPGK1-ERG20-GGGS-LsLTC2-TADH1)、
M3(PTEF1-SynSmFPS-GGGS-STpGMAS-TCYC1)、
M4(rDNA-TRP1-down)。
全ての上記操作株の情報を表13に示す。
1.操作株培養物及び産物の抽出
実施例2にて調製した全操作酵母株を対応固形選択培地SD-Ura-His-Leuにて活性化し、種溶液を対応液体選択培地SD-Ura-His-Leu(30℃、25
0rpm、16h)にて調製し、15mLの対応液体選択培地を含む100mL容三角フラスコに1%量を接種し、250rpmで振盪し、30℃で1日培養した。次いで、1.5mLのn-ドデカンをこれに加え、振盪、培養を5日間継続して行った。最後に、三角フラスコ内の液体を50mLの遠心分離管に移し、遠心分離を5,000rpmで5分行い、有機相を回収して使用した。
1)β-エレメン変換
上記有機相サンプルを通風室内の油槽中、100~380℃(180℃)で1時間加熱し、変換材料を得た。
変換材料をn-ヘキサンで10倍希釈し、有機ナイロン膜(0.22μm)でろ過し、GC-MSを用いて検出した。試験機器は、Agilent GCMSD Agilent 7890A/5975Cであり、GC-MS測定条件は、入口温度250℃、注入量1μL、スプリットレス、溶媒遅延3分であり、カラムはHP-5ms(30m×0.25mm)であり、クロマトグラフィー条件は、45℃で1分、10℃/分で300℃まで予熱し、5分維持し、MS条件は、Full Scanで50~750amuであった。China National Institutes for Food and Drug Controlから購入した標準β-エレメン(Cat.No.100268)を用いて定性及び定量分析を行った。図2は、実施例2にて調製した全操作酵母株が産生したβ-エレメンのGC-MS試験のクロマトマップである。
操作株ELE-001及びELE-002は、FPP-001に基づく低コピー数及び高コピー数のSTpGMASの導入により得られた。ここで、ELE-001のβ-エレメンの収量は9.3mg/Lに達し、またELE-002のβ-エレメンの収量は22.1mg/Lに達した。
操作株ELE-011は、FPP-001に基づく高コピー数の融合タンパク質遺伝子SynSmFPS-GGGS-STpGMASの導入により得られ、β-エレメンの収量は101.1mg/Lに達した。
1)培地の組成
塩化カルシウム母液:19.2g/Lの塩化カルシウム二水和物の水溶液。
操作株ELE-019は、項目1の方法に従って活性化した。プレート上のモノクローナルコロニーを採取し、SD-Ura-His-Leu培地を含む試験管に接種し、250rpmで振盪し、30℃で一晩培養した。500μLの株培養物を、50mLのSD-Ura-His-Leu培地を含む250mL容の三角フラスコにピペッティングし、250rpmで振盪、30℃で24時間培養した。
び/又はゲルマクレンAの工業生産に好適であり、抗癌原料β-エレメンの生合成に有望な株や研究基盤を提供する。
Claims (28)
- in vivoでゲルマクレンAシンテターゼの融合タンパク質を含む又は発現する酵
母の組換え株であり、
前記ゲルマクレンAシンテターゼの融合タンパク質が、
(1)SynSmFPS-YRSQI-STpGMAS、
(2)SynSmFPS-VIPFIS-STpGMAS、
(3)SynSmFPS-WRFSPKLQ-STpGMAS、並びに
(4)SynSmFPS-WRFSPKLQ-STpGMAS、ERG20-GGGS-LsLTC2及びSynSmFPS-GGGS-STpGMASの組み合わせ
から成る群から選択される1つ又は複数の融合タンパク質であって、
前記SynSmFPSは、配列番号2で表されるタンジン(Salvia milt
iorrhiza)由来ファルネシルピロ燐酸シンターゼ遺伝子がコードするものであり、
前記STpGMASは、配列番号3で表されるナツシロギク(Tanacetumparthenium)由来ゲルマクレンAシンテターゼ遺伝子がコードするものであり、
前記ERG20は、配列番号11中1位~1056位の配列で表される酵母由来ファルネシルピロ燐酸シンターゼ遺伝子がコードするものであり、
前記LsLTC2は、配列番号12中13位~1686位の配列で表されるレタス由来ゲルマクレンAシンテターゼ遺伝子がコードするものであり、
前記組換え株が、元の酵母と比較してアルコールデヒドロゲナーゼ、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ及びアセチル-CoAシンテターゼの含量及び/又は活性が増加した株である
組換え株。 - 前記融合タンパク質をコードする核酸が前記ゲルマクレンAシンテターゼをコードする核酸、及び前記ファルネシルピロ燐酸シンターゼをコードする核酸を含む、
請求項1に記載の組換え株。 - 前記融合タンパク質をコードする核酸が、異なる宿主に由来する前記ゲルマクレンAシンテターゼをコードする少なくとも2つの核酸、及び異なる宿主に由来する前記ファルネシルピロ燐酸シンターゼをコードする少なくとも2つの核酸を含む、
請求項2に記載の組換え株。 - 前記ゲルマクレンAシンテターゼをコードする核酸が、配列番号3に示す核酸又は配列番号12の13位から1686位に示す核酸を含み、及び
前記ファルネシルピロ燐酸シンターゼをコードする核酸が、配列番号2に示す核酸又は配列番号11の1位から1056位に示す核酸を含む、
請求項2又は3に記載の組換え株。 - in vivoで前記ゲルマクレンAシンテターゼの融合タンパク質を含む又は発現す
る組換え株が、前記融合タンパク質をコードする核酸が導入された組換え株である、
請求項1~4のいずれか一項に記載の組換え株。 - 前記融合タンパク質をコードする核酸が導入された組換え株が、該核酸を含む発現カセットが導入された組換え株である、
請求項5に記載の組換え株。 - 前記融合タンパク質をコードする核酸を含む前記発現カセットが、プロモーター、前記融合タンパク質をコードする核酸、及びターミネーターを含む、
請求項6に記載の組換え株。 - 前記プロモーターがTEF1、MF1又はPGK1であり、及び前記ターミネーターがCYC1又はADH1である、請求項7に記載の組換え株。
- 1つ又は複数のマーカー遺伝子をさらに発現する、請求項1~8のいずれか一項に記載の組換え株。
- 前記マーカー遺伝子がhis3又はtrp1である、請求項9に記載の組換え株。
- 前記融合タンパク質をコードする核酸を含む前記発現カセットが導入された組換え株が、該発現カセットを発現するベクターが導入された組換え株である、
請求項6~10のいずれか一項に記載の組換え株。 - 前記融合タンパク質をコードする核酸を含む前記発現カセットが導入された組換え株が、該発現カセットを含むプラスミドが導入された、及び/又は該発現カセットがその染色体に組み込まれた組換え株である、
請求項6~11のいずれか一項に記載の組換え株。 - 前記元の酵母と比較してアルコールデヒドロゲナーゼ、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ及びアセチル-CoAシンテターゼの含量及び/又は活性が増加した前記株が、前記元の酵母と比較してアルコールデヒドロゲナーゼをコードする核酸、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸及びアセチル-CoAシンテターゼをコードする核酸のコピー数が増加した株である、
請求項1~12のいずれか一項に記載の組換え株。 - 前記元の酵母と比較して前記アルコールデヒドロゲナーゼをコードする核酸、前記アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸、及び前記アセチル-CoAシンテターゼをコードする核酸のコピー数が増加した株が、前記アルコールデヒドロゲナーゼをコー
ドする核酸の発現カセット、前記アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸の発現カセット、前記アセチル-CoAシンテターゼをコードする核酸の発現カセット、及び前記マーカー遺伝子が、相同組換えを用いて導入された前記元の酵母の株である、
請求項13に記載の組換え株。 - 前記元の酵母がサッカロマイセス・セレビシエである、請求項1~14のいずれか一項に記載の組換え株。
- 前記サッカロマイセス・セレビシエが、サッカロマイセス・セレビシエNK2-SQである、請求項15に記載の組換え株。
- 前記組換え株が、サッカロマイセス・セレビシエCGMCC No.14829である
、請求項1~16のいずれか一項に記載の組換え株。 - 前記ゲルマクレンAシンテターゼの遺伝子が、Helianthus annuus L.、Tanacetum parthenium、Lactuca sativa Lin
n.、Artemisia carvifolia、又はシアノバクテリアから得られる
ものであり;及び
前記ファルネシルピロ燐酸シンターゼの遺伝子が、Salvia miltiorrh
iza、酵母、Acanthopanax senticosus(Rupr.Maxi
m.)Harms、又はEucommiaulmoides Oliv.から得られるも
のである、
請求項1~17のいずれか一項に記載の組換え株。 - 前記ゲルマクレンAシンテターゼの遺伝子が、Tanacetum partheni
um又はLactuca sativa Linn.から得られるものであり;及び
前記ファルネシルピロ燐酸シンターゼの遺伝子が、Salvia miltiorrh
iza又は酵母から得られるものである、
請求項18に記載の組換え株。 - β-エレメン及び/又はゲルマクレンAの生産における使用のための、請求項1~19のいずれか一項に記載の組換え株。
- 請求項1~19のいずれか一項に記載の組換え株を用いる発酵によりゲルマクレンAを得る工程を含む、ゲルマクレンAの生産方法。
- 1)請求項1~19のいずれか一項に記載の組換え株を用いる発酵により発酵産物を取得する工程、
2)前記発酵産物を有機溶媒で抽出し、有機相を回収する工程、及び
3)前記有機相を加熱してβ-エレメンを取得する工程、
を含む、
β-エレメンの生産方法。 - 前記発酵が、まず前記組換え株を種培地で培養して種液を得て、次いで前記種液を発酵培地に接種して発酵培養を行い、前記発酵培養の産物を得ることを含む、
請求項21又は22に記載の方法。 - 前記発酵培養の間、流加培地を前記発酵培養を行う発酵系に加える、請求項23に記載の方法。
- 前記発酵系内の溶存酸素値が60%を超える場合に、前記発酵系内のグルコース濃度が5g/Lに達するまで、前記流加培地を前記発酵系に添加する、請求項24に記載の方法
。 - 請求項23に記載の方法であって、
前記種培地と前記発酵培地の調合物が、容量1Lにつき、25gのグルコース、15gの硫酸アンモニウム、6.15gの硫酸マグネシウム七水和物、0.72gの硫酸亜鉛七水塩、8gのリン酸二水素カリウム、2mLの塩化カルシウム母液、10mLの微量金属塩母液、12mLのビタミン母液、1gのトリプトファンを含み、
前記塩化カルシウム母液が、塩化カルシウム二水和物の19.2g/L水溶液であり、
前記微量金属塩母液の調合物が、容量1Lにつき、19.1gのエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム、10.2gの硫酸亜鉛七水塩、0.5gの塩化マンガン四水和物、0.86gの塩化コバルト六水和物、0.78gの硫酸銅五水和物、0.56gのモリブデン酸ナトリウム二水和物、5.12gの亜硫酸鉄7水和物を含み、
前記ビタミン母液の調合物が、容量1Lにつき、0.05gのビオチン、0.2gのp-アミノ安息香酸ナトリウム、1gのナイアシン、1gのパントテン酸カルシウム、1gの塩酸ピリドキシン、1gのチアミン塩酸塩、25gのイノシトールを含む、
方法。 - 前記流加培地の調合物が、容量1Lにつき、800gのグルコース、5.125gの硫酸マグネシウム七水和物、3.5gの硫酸カリウム、0.28gの硫酸ナトリウム、9gのリン酸二水素カリウム及び1gのトリプトファンを含む、請求項24又は25に記載の方法。
- 前記有機溶媒がn-ドデカンであり、前記加熱の条件が100~380℃で1時間の加熱である、請求項22~27のいずれか一項に記載の方法。
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