JP7126687B2 - 微小管含有集合体形成方法および微小管含有集合体形成キット - Google Patents
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Description
本発明の第1実施形態に係る微小管含有集合体形成方法では、(a)表面に第1デオキシリボ核酸を修飾した微小管と、(b)第1デオキシリボ核酸と相補的関係を有する第2デオキシリボ核酸を表面上に有するデオキシリボ核酸集合体とを液中で接触させて、微小管を含む第1集合体を形成させる。
微小管は、直径24nm程度の細胞骨格線維であって、GTP結合チューブリンタンパク質サブユニットからなる会合体である。微小管の各サブユニットは、α-チューブリンおよびβ-チューブリンのヘテロ二量体である。α,βチューブリンからなるヘテロ二量体が繊維状につながったものをプロトフィラメントと呼び、これが螺旋の形で11-16本程度集まって管状の構造を取ったものが微小管となる。なお、チューブリンは2つのGTP分子に2つの異なる部位で結合する。3つのチューブリンは、不変のグリシンリッチ領域を共有し、その領域はヌクレオチド結合部位の1つへのアクセスの制御に関与していると考えられている。
デオキシリボ核酸集合体は、例えば、DNAオリガミ等であって、二次元的な形状(例えば、円形、正方形、長方形、星形、三角形等の形状)を有していてもよいし、三次元的な形状(例えば、立方体等の形状)を有していてもよい。なお、このDNAオリガミは、非常に長い一本鎖DNA(足場鎖と呼ばれる)を織物の横糸のように使い、二重らせん形成の相手となる200本以上の多数の短いDNA(ステープル鎖と呼ばれる)を縦糸として横糸を橋掛けしながら織り込んでいくことで形成することができ、その形状はDNAの塩基配列を変化させることより自在に変化させることができる。なお、このDNAオリガミについては、Paul W.K., Rothemund. Nature 2006, 440, 297や日本ロボット学会誌Vol.28,No. 10, pp.1155~1157, 2010等に詳しい。
モータータンパク質は、アデノシン三リン酸(ATP)の加水分解によって生じる化学エネルギーを運動に変換するタンパク質のことであって、例えば、アクチン上を動くミオシンや、微小管上を動くキネシンやダイニンが挙げられる。
本発明の第2実施形態に係る微小管含有集合体形成方法では、(a)微小管と、(b)デオキシリボ核酸集合体とを含む液中に(c)モータータンパク質を添加して、微小管を含む集合体を形成させる。
第2実施形態に係る微小管は、未修飾の微小管であって、第1デオキシリボ核酸の一本鎖が表面に修飾されていることはない。微小管については、第1実施形態で説明した通りであるため、ここでは省略する。
第2実施形態に係るデオキシリボ核酸集合体は、第1実施形態に係るデオキシリボ核酸集合体と同様のものである。デオキシリボ核酸集合体の表面にデオキシリボ核酸の一本鎖を修飾する手法については後ほど、実施例を示しながら詳述する。
第2実施形態に係るモータータンパク質は、第1実施形態に係るモータータンパク質と同様であるため、以下説明を省略する。
以下、実施例を示して本発明をより詳細に説明する。ただし、本発明は、以下に示す実施例に限定されることはない。
(1)DNA修飾微小管の調製
銅フリークリック反応により、微小管にDNA一本鎖を修飾した。その後、DNA修飾微小管を観察する目的でDNAを蛍光染料で標識処理した。具体的には、以下の通りである。
高濃度のPIPES緩衝液(1M PIPES,20mM EGTAおよび10mM MgCl2の混合液であって、KOHでpHが6.8に調整されている。)を用いてブタ脳からチューブリンを精製した。
N3-NHS-PEGエステルを用いてアジド基標識チューブリンを調製した。このように、N3-NHS-PEGエステルがチューブリンのアミノ基(-NH2)と反応すると、安定なアミド結合が形成され、N3-チューブリンが調製される。なお、このとき、NHS(N-ヒドロキシスクシンイミド)が遊離する。
200μLのチューブリン、38.8μLの2倍脳再結合緩衝液(BRB80)、5.6μLの200mM MgCl2および5.6mLの100mM GTPを小型の遠沈管に投入して溶液を調製した(なお、ここでは、標識処理および測定は、200μLのチューブリンを用いて行われた。)。なお、2倍BRB80は、160mM PIPES,2.0mM MgCl2および2.0mM EGTAの混合液であって、KOHでpHが6.8に調整されている。そして、その溶液は、氷上で5分間インキュベートされた。その後、その溶液は、2℃の温度下、35,000rpmの速度で遠心分離処理された。なお、遠心分離処理開始前に、ローターおよび遠心分離機の内部の温度を2℃に保った。遠心分離処理完了後、固形のペレットを捨てて、液部分を採取した。そして、その液部分に27.6μLの乾燥ジメチルスルホキシド(DMSO)(100%DMSO)を加え、次いで、それらを37℃の温度の水槽中で混ぜてから15分間インキュベートした。さらに、320μLの20.0mM N3-NHS-PEGエステル溶液(乾燥DMSO中)をチューブリンに添加し、37℃の温度の水槽中で混ぜてから40分間インキュベートした。なお、このインキュベーション中、10分おきに(すなわち3回)撹拌を行った。そして、その溶液を37℃の温度下、54,000rpmで5分間、遠心分離処理した。上澄み(液部分)を捨てて、ペレットの体積を以下の通りに測定した。溶液(上澄みとペレット)の総体積は309.6μL(250.0μL+27.6μL+32.0μL)であった。すなわち、ペレットの体積=総体積-上澄みの体積であった。その体積のペレットに1倍のBRB80(80mM PIPES,1.0mM MgCl2および1.0mM EGTAの混合液であって、KOHでpHが6.8に調整されている。)を加えて2倍にし、マイクロピペットで溶液を調製した。なお、ペレットを溶解させる際、泡が立たないように注意した。そして、氷上で1時間、その溶液をインキュベートした。その後、その溶液を4℃の温度下、35,000rpmで5分間、遠心分離処理した。遠心分離処理完了後、固形のペレットを捨てて液部分を採取した。この段階で、チューブリン溶液(チューブリン)の体積は、36.0μLであった。その後、そのチューブリン溶液に、36.0μLのチューブリン、7.0μLの2倍BRB80、1.0μLの200mM MgCl2、1.0μLの100mM GTPおよび5.0μLの乾燥DMSOを加えた。次いで、それらを37℃の温度の水槽中で15分間インキュベートした。そして、その溶液を37℃の温度下、54,000rpmで5分間、遠心分離処理した。上澄み(液部分)を捨てて、ペレットの体積を以下の通りに測定した。上澄みを捨てる前に、上澄みの体積を測定した。そして、その溶液(上澄みとペレット)の総体積は139.1μLであった。すなわち、ペレットの体積=総体積-上澄みの体積であった。その体積のペレットに同体積の1倍BRB80を加えて、マイクロピペットでペレットを溶解させた。そして、氷上で1時間、その溶液をインキュベートした。その後、その溶液を4℃の温度下、35,000rpmで5分間、遠心分離処理した。遠心分離処理完了後、固形のペレットを捨てて液部分を採取した。この液部分が、目的のアジド基標識チューブリンである。
紫外線分光光度計(Nanodrop2000c)を用いてアジド基標識チューブリンの濃度を測定した。アジド基標識チューブリンが吸光を示す280.0nm波長で吸光度を測定した。その結果、アジド基標識チューブリンの濃度の濃度は506.73μMであった。
DNA修飾微小管を調製する目的で、先ず、重合試薬GTP(グアノシン-5'-三リン酸)またはGMPCPP(グアノシン-5’[(a,b)-メチレノ]三リン酸)のプレミックスを用いてチューブリンを重合し、アジド基標識微小管を調製した。なお、GTPのプレミックスは10.0μLの2倍BRB80、2.0μLの純水、1.0μLの100.0mM GTP、2.0μLの200.0mM MgCl2および5.0μLのDMSOを混ぜ合わせて調製し、GMPCPPのプレミックスは5.0μLの2倍BRB80、3.0μLの純水、1.0μLの100.0mM GMPCPPおよび1.0μLの200.0mM MgCl2を混ぜ合わせて調製した。具体的には、4.0μLのアジド基標識チューブリンに1.0μLのプレミックスを添加して37℃の温度下、30分間インキュベートしてアジド基標識微小管を調製した。
DNA修飾微小管の存在を確認する目的で、DNA修飾微小管の吸光度を測定した。その措定結果を図1に示す。なお、サンプルの解重合後のDNAの最大吸収波長は260.0nmであり、微小管の最大吸収波長は280nmであった。微小管に対するDNAの濃度および標識比は、ピークの逆重畳処理およびガウス分布関数を用いることによって見積もられた。なお、標識比は、~90%-100%のBeer-lambert法から決定されたDNAおよび微小管の濃度から計算された。そして、調製されたDNA修飾微小管は、暗所に保管された。このDNA修飾微小管は、1週間の間使用することができる。
足場鎖としてのM13 mp18 Single Strand DNA(タカラバイオ株式会社製,製品コード3518,鎖長7,249,参考文献:Yanish-Perron, C.,Vieira,J., and Messing, J.Gene. (1985) 33: 103-119),5nM~10nM、ステープル鎖としての各1本鎖DNA(16~67塩基長の化学合成1本鎖DNA(塩基配列:[配列表]の記載参照。表面に露出させるCAACAACAACAACAA(CAA単位の5回繰り返し)ユニットを含む)、計177本) 5等量~100等量、液量 50μL~100μLを濃度条件内に収まるよう全て混合した。
20nM、200nMおよび2,000nMの各DNA修飾微小管に4nMのDNA修飾DNAオリガミチューブを添加したところ、24時間後に十数μmサイズの放射状の集合体が形成された(図6および図7参照。)。また、この集合体中にキネシンを添加したところ、更に大きなサイズの集合体が形成された(図8参照)。このため、本実施例において、DNAオリガミチューブに対して多数の微小管を固定することが明らかとなった。
Claims (5)
- (a)表面に第1デオキシリボ核酸を修飾した微小管と、(b)前記第1デオキシリボ核酸と相補的関係を有する第2デオキシリボ核酸を表面上に有するデオキシリボ核酸集合体とを液中で接触させて、前記微小管を含む第1集合体を形成する、微小管含有集合体形成方法。
- 前記微小管を含む第1集合体に(c)モータータンパク質を接触させて、前記微小管を含む第2集合体を形成し、
前記第2集合体は、第1集合体の集合形態とは異なる集合形態を有する
請求項1に記載の微小管含有集合体形成方法。 - (a)表面に第1デオキシリボ核酸を修飾した微小管と、(b)前記第1デオキシリボ核酸と相補的関係を有する第2デオキシリボ核酸を表面上に有するデオキシリボ核酸集合体と、(c)モータータンパク質とを液体中で接触させて、前記微小管を含む集合体を形成する、微小管含有集合体形成方法。
- (a)表面に第1デオキシリボ核酸を修飾した微小管と、
(b)前記第1デオキシリボ核酸と相補的関係を有する第2デオキシリボ核酸を表面上に有するデオキシリボ核酸集合体と
を備える、微小管含有集合体形成キット。 - (c)モータータンパク質をさらに備える
請求項4に記載の微小管含有集合体形成キット。
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