TWI730327B - 腫瘤標誌物、甲基化檢測試劑、試劑盒及其應用 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及生物技術領域，特別涉及腫瘤標誌物、甲基化檢測試劑、試劑盒及其應用。本發明通過研究發現：通過檢測SOX21基因啟動子區的甲基化水平，可以很好的從正常人的糞便標本中區分出結直腸癌標本。本發明就是利用含有該基因的甲基化檢測試劑來檢測結直腸癌的，並且對腸癌的檢測敏感性和特異性非常高。

Description

腫瘤標誌物、甲基化檢測試劑、試劑盒及其應用
本發明涉及生物技術領域，特別涉及腫瘤標誌物、甲基化檢測試劑、試劑盒及其應用。
結直腸癌，又稱為大腸癌，是一種常見的消化道惡性腫瘤。其發病率在我國逐年升高，在我國部分沿海地區比如上海和廣州，大腸癌發病率已躍居第二位，僅次於肺癌。目前認為腸癌的形成是遺傳缺陷和表觀遺傳缺陷累積的結果。結直腸癌早期發病隱匿，常無明顯症狀，晚期可出現便血、腹痛、腹瀉等症狀。而當出現症狀就診時常常是晚期，這給病人帶來極大的痛苦和昂貴的治療費用。因此早發現、早診斷、早治療是降低結直腸癌發病率和死亡率的一項重要措施。
篩查可以早期發現腸癌和癌前病變，並去除病灶，從而阻止腸癌的發生。目前大腸癌的篩查方法主要有隱血試驗和腸鏡檢查。隱血試驗存在易受食物影響或對腺瘤檢出率不高的問題。腸鏡雖是腸癌診斷金標準，但作為篩查手段使用時人群依從性不高。因此急需一種準確性高、依從性高的腸癌篩查方法。
糞便基因檢測作為一種新的腸癌篩查方法，現在越來越受到重視。該方法（Cologuard®）於2016年納入美國的腸癌篩查指南。該方法具有方便、無創、對腸癌和癌前病變腺瘤的檢出率高等特點。要做成對腸癌檢測高性能的糞便基因檢測試劑盒，主要需要克服兩大障礙：糞便DNA的提取和標誌物選擇。一方面，糞便中成分複雜，對下游反應的抑制物多，還有許多細菌DNA，要從這樣的混合物中提取出人的目標基因，需要一套高敏的基因提取和純化方法；另一方面，目前和腸癌相關的標誌物很多，尤其是DNA甲基化標誌物，因為研究表明，DNA甲基化是腫瘤形成的早期事件。但很多甲基化標誌物在細胞、組織層面表現很好，當用於糞便、血液等篩查媒介時，其對腸癌的敏感性和特異性就降下來了，比如vimentin基因，其在組織中的敏感性有83%，在糞便標本中就降到了46%，類似的還有 SFRP1、SFRP2等基因，這樣的標誌物無法滿足真正用於腸癌臨床檢測的需求。因此，挑選在糞便中對腸癌有極高檢測敏感性和特異性的標誌物是腸癌糞便基因檢測的關鍵，並且這樣的標誌物有望真正用於腸癌的臨床檢測。
有鑑於此，本發明提供一種腫瘤標誌物、捕獲序列、引子對、探針、甲基化檢測試劑、試劑盒及其應用。該腫瘤標誌物在糞便中對腸癌的敏感性與組織中敏感性接近。
本發明的另一個目的在於提供一種無創檢測腫瘤的標誌物、捕獲序列、引子對、探針、甲基化檢測試劑、試劑盒及方法。
為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：
本發明提供了SOX21基因在製備腫瘤標誌物中的應用。
在本發明的一些具體實施方案中，所述SOX21基因的序列與Genebank Accession No. NC_000013.11 所示的序列具有至少97.8%的同一性。
在本發明的一些具體實施方案中，所述SOX21基因的序列與Genebank Accession No. NC_000013.11 所示的序列具有至少98.9%的同一性。
在本發明的一些具體實施方案中，所述的SOX21基因的序列與Genebank Accession No. NC_000013.11 所示的序列具有至少99.9%的同一性。
在本發明的一些具體實施方案中，所述的SOX21基因的序列與Genebank Accession No. NC_000013.11 所示的序列具有100%的同一性。
在本發明的一些具體實施方案中，所述腫瘤為結直腸腫瘤。
在本發明的一些具體實施方案中，所述腫瘤為結直腸癌或腺瘤。
在本發明的一些具體實施方案中，待測樣本為組織、體液或***物。
在本發明的一些具體實施方案中，所述組織為腸組織。
在本發明的一些具體實施方案中，所述體液包括但不限於血液、血清、血漿、細胞外液、組織液、淋巴液、腦脊液或房水。
在本發明的一些具體實施方案中，所述***物為痰液、唾液、尿液或糞便。
本發明還提供了SOX21基因的甲基化檢測試劑在製備腫瘤檢測試劑或者試劑盒中的應用。
所述的SOX21基因的甲基化檢測試劑可以是現有技術中的甲基化檢測試劑，現有技術中，已經有多種方法可以檢測目的基因的甲基化，如甲基化特異性PCR（MSP）、甲基化特異性定量PCR（qMSP）、甲基化DNA特異性結合蛋白的PCR，定量PCR以及DNA芯片、甲基化敏感的限制性內切酶、重亞硫酸鹽測序法或者焦磷酸測序等等。每種檢測方法均有其相對應的試劑，這些試劑均可以用本發明檢測SOX21基因的甲基化。
本發明還提供了一種捕獲序列，所述捕獲序列具有如下所示的核苷酸序列中的任意一項：
I、具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；
II、具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列經修飾、取代、缺失或添加一個或多個鹼基獲得的核苷酸序列或具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的CpG島獲得的功能相近的核苷酸序列；
III、與SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%同一性的序列或具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的CpG島獲得的功能相近的核苷酸序列；
IV、如I、II或III所示序列的互補序列。
本發明還提供了一種引子對，上游引子具有如下所示的核苷酸序列中的任意一項：
V、具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
VI、具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列經修飾、取代、缺失或添加一個或多個鹼基獲得的核苷酸序列；
VII、與SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%同一性的序列或具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的CpG島獲得的功能相近的核苷酸序列；
VIII、如V、VI或VII所示序列的互補序列；
下游引子具有如下所示的核苷酸序列中的任意一項：
IX、具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；
X、具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列經修飾、取代、缺失或添加一個或多個鹼基獲得的核苷酸序列；
XI、與SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%同一性的序列或具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列的CpG島獲得的功能相近的核苷酸序列；
XII、如IX、X或XI所示序列的互補序列。
本發明還提供了一種探針，所述探針具有如下所示的核苷酸序列中的任意一項：
XIII、具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；
XIV、具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列經修飾、取代、缺失或添加一個或多個鹼基獲得的核苷酸序列；
XV、與SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%同一性的序列或具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列的CpG島獲得的功能相近的核苷酸序列；
XVI、如XIII、XIV或XV所示序列的互補序列。
本發明還提供了SOX21基因的甲基化檢測試劑，包括針對SOX21基因的捕獲序列、引子和／或探針。
在本發明的一些具體實施方案中，包括針對SOX21基因的CpG島獲得的捕獲序列、引子和／或探針。
在本發明的一些具體實施方案中，本發明提供的甲基化檢測試劑包括針對SOX21基因的啟動子區或所述啟動子區附近區域的CpG島獲得的捕獲序列、引子和／或探針。
在本發明的一些具體的實施方案中，引子和／或探針通過甲基化特異性定量PCR（quantitative Methylation-Specific PCR,qMSP）檢測SOX21基因的甲基化。
在本發明的一些具體的實施方案中，本發明提供的甲基化檢測試劑通過檢測SOX21基因的基因體、基因間區或啟動子區及啟動子區附近區域的甲基化水平。
腫瘤組織中存在的甲基化被認為是具有潛在臨床價值的DNA表觀修飾。基因體以、基因間區、啟動子或其附近區域均存在甲基化，且這些區域的甲基化均可能與腫瘤相關。目前，在多種腫瘤中已經證實，抑癌基因啟動子或其附近區域的CpG島異常甲基化導致了轉錄失活。
在本發明的一些具體實施方案中，本發明提供的甲基化檢測試劑中所述捕獲序列具有如下所示的核苷酸序列中的任意一項：
I、具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；
II、具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列經修飾、取代、缺失或添加一個或多個鹼基獲得的核苷酸序列或具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的CpG島獲得的功能相近的核苷酸序列；
III、與SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%同一性的序列或具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的CpG島獲得的功能相近的核苷酸序列；
IV、如I、II或III所示序列的互補序列。
在本發明的一些具體實施方案中，本發明提供的甲基化檢測試劑中，所述引子中的上游引子具有如下所示的核苷酸序列中的任意一項：
V、具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
VI、具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列經修飾、取代、缺失或添加一個或多個鹼基獲得的核苷酸序列；
VII、與SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%同一性的序列或具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的CpG島獲得的功能相近的核苷酸序列；
VIII、如V、VI或VII所示序列的互補序列。
在本發明的一些具體實施方案中，本發明提供的甲基化檢測試劑中，所述引子中的下游引子具有如下所示的核苷酸序列中的任意一項：
IX、具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；
X、具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列經修飾、取代、缺失或添加一個或多個鹼基獲得的核苷酸序列；
XI、與SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%同一性的序列或具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列的CpG島獲得的功能相近的核苷酸序列；
XII、如IX、X或XI所示序列的互補序列。
在本發明的一些具體實施方案中，本發明提供的甲基化檢測試劑中所述探針具有如下所示的核苷酸序列中的任意一項：
XIII、具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；
XIV、具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列經修飾、取代、缺失或添加一個或多個鹼基獲得的核苷酸序列；
XV、與SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%同一性的序列或具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列的CpG島獲得的功能相近的核苷酸序列；
XVI、如XIII、XIV或XV所示序列的互補序列。
本發明還提供了一種檢測腫瘤的試劑盒，包括所述的捕獲序列、引子對、探針或甲基化檢測試劑。
在本發明的一些具體實施方案中，本發明提供的試劑盒包括：劃分成其內接收試劑的一個或多個容器。
在本發明的一些具體實施方案中，本發明提供的試劑盒包括：第一容器，其包含捕獲序列；第二容器，其包含用於擴增的引子對；第三容器，其包含探針。
在本發明的一些具體實施方案中，本發明提供的試劑盒還包括試劑盒中的常用試劑，如qMSP中常用轉化劑，用於將非甲基化的胞嘧啶鹼基轉化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶鹼基保持不變。所述的轉化劑包括但不限於亞硫酸氫鹽、重亞硫酸氫鹽或肼鹽等等。又如擴增SOX21基因中常用的DNA 聚合酶、dNTPs、Mg²⁺離子和緩衝液等等。
本發明還提供了一種腫瘤的檢測方法，通過檢測SOX21基因的甲基化水平，區分正常樣本和腫瘤樣本。
在本發明的一些具體實施方案中，其包含以下步驟：
（1）檢測受試者SOX21基因的甲基化水平；
（2）將受試者SOX21基因的甲基化水平與正常對照樣本的甲基化水平相比較；
（3）根據所述受試者SOX21基因的甲基化水平與所述基因的正常對照水平相比的升高，指示所述受試者患有或者有風險患上腫瘤，以區分正常樣本和腫瘤樣本。
在本發明的一些具體實施方案中，本發明通過檢測SOX21基因的基因體、基因間區或啟動子區及啟動子區附近區域的甲基化水平。
在本發明的一些具體實施方案中，本發明通過檢測SOX21基因啟動子區及啟動子區附近區域的甲基化水平，區分正常樣本和腫瘤樣本。
在本發明的一些具體實施方案中，所述甲基化水平通過甲基化特異性PCR，或者甲基化特異性定量PCR（qMSP），或者甲基化DNA特異性結合蛋白的PCR、定量PCR、以及DNA芯片，或者甲基化敏感的限制性內切酶，或者重亞硫酸鹽測序法，或者焦磷酸測序檢測。
在本發明的一些具體實施方案中，通過甲基化特異性定量PCR（qMSP）檢測甲基化水平。
在本發明的一些具體實施方案中，甲基化水平採用所述的捕獲序列、引子對、探針、甲基化檢測試劑或所述的試劑盒檢測。
在本發明的一些具體實施方案中，步驟（1）中，檢測受試者SOX21基因的甲基化水平包含以下步驟：
採用磁珠捕獲法提取待測樣品的DNA；
待測樣品的DNA採用亞硫酸氫鹽、重亞硫酸氫鹽或肼鹽進行轉化；
甲基化特異性定量PCR（qMSP）檢測。
在本發明的一些具體實施方案中，步驟a)中，採用磁珠捕獲法提取待測樣品的DNA包括以下步驟；
取待測樣本在保護液中混合研磨、離心、取上清；
上清再離心，取上清，加入裂解液和帶有特定互補寡核苷酸捕獲序列的磁珠至上清液中孵育；
棄部分上清後洗下磁珠轉移至乾淨離心管，加入洗液，室溫100~2000 rpm孵育0.5~5 min，置於磁力架上吸去上清，重複3次；
用緩衝液將目標基因DNA洗脫。
在本發明的一些具體實施方案中，檢測標準為：根據界值判斷腫瘤標本和正常標本，糞便標本中的Ct值的界值為32~42，優選地，糞便標本中的Ct值的界值為32.45，所述糞便標本的Ct值小於所述Ct值的界值則判斷為腫瘤標本，所述糞便標本的Ct值大於等於所述Ct值的界值則判斷為正常標本；組織標本中甲基化水平值的界值為1~10，優選地，組織標本中甲基化水平值的界值為2.02，所述組織標本的甲基化水平值大於所述甲基化水平值的界值則判斷為腫瘤標本，所述組織標本的甲基化水平值小於等於所述甲基化水平值的界值則判斷為正常標本。該界值可根據實際情況進行調整。
本發明還提供了一種腫瘤的檢測系統，所述的系統包含有以下構件：
SOX21基因的甲基化檢測構件；
數據處理構件；
結果輸出構件。
在本發明的一些具體實施方案中，所述的甲基化檢測構件含有熒光定量PCR儀、PCR儀、測序儀中的一種或多種；
在本發明的一些具體實施方案中，所述的甲基化檢測構件還含有所述的捕獲序列、引子對、探針、甲基化檢測試劑或試劑盒。
在本發明的一些具體實施方案中，所述的數據處理構件被配置於a. 接收待測樣本以及正常對照樣本的測試數據；b.儲存待測樣本以及正常對照樣本的測試數據；c.比對同種類型的待測樣本以及正常對照樣本的測試數據；d.根據比對結果，響應於測試者罹患腫瘤的概率或者可能性。
在本發明的一些具體實施方案中，所述的結果輸出構件用於輸出測試者罹患腫瘤的概率或者可能性。
在本發明的一些具體實施方案中，數據處理構件的判斷標準為：
根據界值判斷腫瘤標本和正常標本，糞便標本中的Ct值的界值為32~42，優選地，糞便標本中的Ct值的界值為32.45，所述糞便標本的Ct值小於所述Ct值的界值則判斷為腫瘤標本，所述糞便標本的Ct值大於等於所述Ct值的界值則判斷為正常標本；組織標本中甲基化水平值的界值為1~10，優選地，組織標本中甲基化水平值的界值為2.02，所述組織標本的甲基化水平值大於所述甲基化水平值的界值則判斷為腫瘤標本，所述組織標本的甲基化水平值小於等於所述甲基化水平值的界值則判斷為正常標本。該界值可根據實際情況進行調整。
在本發明的一些具體實施方案中，本發明所述腫瘤為結直腸腫瘤。
在本發明的一些具體實施方案中，本發明所述腫瘤為結直腸癌或腺瘤。
在本發明的一些具體實施方案中，本發明提供的待測樣本或者樣本類型為組織、體液或***物。
在本發明的一些具體實施方案中，所述組織為腸組織。
在本發明的一些具體實施方案中，所述體液包括血液、血清、血漿、細胞外液、組織液、淋巴液、腦脊液或房水。
在本發明的一些具體實施方案中，所述***物為痰液、尿液、唾液或糞便。
本發明通過研究發現：通過檢測SOX21基因啟動子區的甲基化水平，可以很好的從正常人的糞便標本中區分出結直腸癌標本。本發明就是利用含有該基因的甲基化檢測試劑來檢測結直腸癌的，並且對腸癌的檢測敏感性和特異性非常高。
與現有的檢測腸癌的標誌物相比，本發明提供的標誌物和技術方案能夠以很高的敏感性和特異度來檢測出結直腸癌，並且在糞便中和組織中對腸癌的檢出效果接近，具體有以下幾點：
在上述的一個技術方案中，SOX21基因的甲基化檢測試劑在糞便標本中能夠在特異性為95.2%時，檢測出80%的結直腸癌，檢出效果與組織中結果相近，可以簡便地糞便做為檢測樣本，對結直腸癌進行可靠的診斷。糞便樣品獲得非常容易，取樣無創簡單，而且不會對病人造成任何的痛苦和不便。
在上述的一個技術方案中，SOX21基因的甲基化檢測試劑在組織標本中能夠在特異性為95.2%時，檢測出85.7%的結直腸癌。
上述的一個技術方案中含有SOX21基因的甲基化檢測試劑和提取檢測方法能非常方便、準確地判斷出結直腸癌和正常人，該基因的甲基化檢測試劑有望用於糞便基因檢測試劑盒，並服務於腸癌的臨床檢測。
上述的一個技術方案中的試劑／試劑盒是通過甲基化水平來檢測和診斷癌症，越來越多的研究證實甲基化改變是腫瘤發生過程中的早期事件，檢測甲基化異常更易發現早期病變。
本發明公開了一種腫瘤標誌物、甲基化檢測試劑、試劑盒及其應用，本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發明內容、精神和範圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。
本發明提供的腫瘤標誌物、甲基化試劑、試劑盒及其應用中所用原料、輔料及試劑均可由市場或者合成購得。
只要有可檢測差異性甲基化的CpG位點，SOX21基因的任何核酸片段可以用於本發明。CpG島是核酸序列中CpG富集區域。CpG島開始於啟動子的上游，向下游延伸至轉錄區域。在啟動子上的CpG島的甲基化通常抑制基因的表達。啟動子內的CpG島為甲基化的一部分，基因體中的CpG open sea存在保守的DNA甲基化靶標。最近的研究揭示了非啟動子區域（如基因體和UTR）甲基化對基因表達的協同效應，基因體甲基化可能是癌症中潛在的治療靶點。
通常來說，CpG島是指富含CpG二核苷酸的一些區域，通常位於啟動子及其附近的區域，本發明中的CpG島，不僅指啟動子及其附近的區域富含CpG二核苷酸，也包括雜合甲基化的CpG位點，或者是孤立的CpG位點。
通常，含CpG的核酸是DNA。然而，本發明可適用，例如，包含DNA、或者DNA和含有mRNA的RNA的樣品，其中DNA或者RNA可以是單鏈的或者雙鏈的，或者DNA-RNA雜交鏈也可能包括在樣品中。
本發明中的「引子」或「探針」是指一種寡核苷酸，其包含與靶核酸分子(例如靶基因)的至少6個連續核苷酸的序列互補的區域。在一些實施方案中，引子或探針包含與靶分子的至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20個連續或不連續的分塊核苷酸的序列互補的區域。當引子或探針包含與靶分子的至少x個連續核苷酸互補的區域時，所述引子或探針與靶分子的至少x個連續核苷酸至少95％互補。在一些實施方案中，引子或探針與靶分子至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％互補。
本發明中的「檢測」同診斷，除了結直腸腫瘤的早期診斷，還包括結直腸腫瘤中期和晚期的診斷，且也包括結直腸腫瘤篩選、風險評估、預後、疾病識別、病症階段的診斷和治療性靶標的選擇。
結直腸腫瘤標誌物SOX21的應用使得結直腸腫瘤的早期診斷成為可能。當確定在癌症細胞中甲基化的基因在臨床上或形態學上正常表像的細胞中甲基化時，這就表明該正常表像的細胞向癌症發展。這樣，結直腸癌可在早期通過在正常表像的細胞中的結直腸腫瘤特異性基因SOX21的甲基化而診斷。
其中，早期診斷指的是在轉移之前發現癌症的可能性，優選在可觀察到組織或者細胞的形態學變化之前。
除了結直腸腫瘤的早期診斷，本發明的試劑／試劑盒還有希望用於結直腸腫瘤篩選、風險評估、預後診斷、疾病識別、病症階段的診斷和治療性靶標的選擇。
作為病症階段可選的實施方式，可通過在結直腸腫瘤在不同階段或時期的進展可通過從樣品中獲取的SOX21的甲基化程度的測量進行診斷。通過比較從結直腸癌的每個階段的樣品中分離出的核酸的SOX21基因甲基化程度與從沒有細胞增殖性異常的腸組織中的樣品中分離出的一個或多個核酸的SOX21基因甲基化程度，可檢測樣品中結直腸腫瘤的具體階段。
下面結合實施例，進一步闡述本發明：
實施例1
選取163例糞便標本（80例結直腸癌，83例正常，均經腸鏡或病理確診），進行研磨離心，加入100 µl捕獲磁珠（含有SOX21基因的捕獲序列），並按如下技術方案操作，最後得到Bisulfite轉化後的DNA 15 µl。然後進行qMSP檢測SOX21的甲基化水平。
技術方案如下：
1）收集有腸鏡結果的正常人和結直腸腫瘤病人的糞便標本，按1g糞便：4mL保護液混合研磨後5000 rpm離心10 min，取上清棄沉澱；
2）取出10 mL上清再次離心，取上清3.2 mL加入2 mL裂解液和100 µl捕獲磁珠M1，92 ℃孵育10 min，然後室溫放置1 h；
3）置於磁力架上棄部分上清後洗下磁珠轉移至2 mL離心管，加入800 µl洗液W1，室溫1300 rpm孵育1 min，置於磁力架上吸去上清，重複3次；
4）加入55 µl洗脫液，92 ℃ 1300 rpm孵育10 min，置於磁力架上，3 min內轉移50 µl洗脫液至新的EP管中；
5）用EZ DNA Methylation Kit（Zymo Research）對上一步驟中的DNA片段進行甲基化處理，最後的洗脫液15 µl用於qMSP檢測。
qMSP反應體系：25 µl（無核酸酶水8.2 µl，5×Colorless GoTaq Flexi Buffer 5 µl，MgCl₂（25 mM）5 µl，dNTPs（10 mM）1 µl，GoTaq Hot Start polymerase 0.5 µl，Forward primer（100 µm）0.125 µl ，Reverse primer（100 µm）0.125 µl，Probe（100 µm）0.05 µl， DNA 5 µl）。反應程序：95 ℃ 4 min，（95 ℃ 20 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s）× 45 Cycles， 37 ℃ 30 s。
最後根據標準曲線計算基因在標本中的拷貝數。
SOX21基因發生甲基化的位點相對恒定，主要位於啟動子區或附近的CpG島上。針對這些區域設計了其中一組捕獲序列、引子和探針，並用於SOX21基因甲基化檢測試劑中。
試劑中含有的捕獲序列、引子探針如下：
SOX21的捕獲序列（SEQ ID NO:1）： 5’-CGGGCCGCCTTAGTGTCTCCGGCCGAGCGCTCGAGCAGGT -3’
SOX21的qMSP引子探針： Forward Primer（SEQ ID NO:2）：5’-GAACGTAAAGGGTAAATTGTCG-3’ Reverse Primer（SEQ ID NO:3）：5’-CCTTAATATCTCCGACCGAACG -3’ Probe（SEQ ID NO:4）：5’-CGGGGAGGGGGTATCGTCGAG -3’
糞便實驗中，SOX21基因檢測結直腸癌的ROC曲線如圖1所示：
對於結直腸癌，SOX21基因的檢測敏感性是80%（64/80），特異性為95.2%（79/83），ROC曲線下面積是0.926（95% CI：0.885-0.968，p＜0.0001）
糞便實驗中，SOX21基因標準曲線擴增圖譜如圖2所示：
標曲擴增效率為96%，線性度R² = 1。
[ 表 1]
Figure 108117746-A0304-0001
 表1 註：「無擴增」表示無擴增曲線，無Ct數據，屬於大於界值的範圍。
實施例 2
選取105對結直腸癌與癌旁正常組織標本（均經腸鏡或病理確診），根據Protocol，分別用QIAamp DNA Kit（QIAGEN）提取組織DNA，然後用EZ DNA Methylation Kit（Zymo Research）轉化DNA。
然後進行qMSP檢測SOX21的甲基化水平。
qMSP反應體系和反應程序同實施例1的糞便實驗。最後根據標準曲線計算基因在標本中的甲基化水平值：（Target/ACTB）*100。所用的qMSP引子探針同實施例1。
組織實驗中，SOX21基因檢測結直腸癌的ROC曲線如圖3所示：
對於結直腸癌，SOX21基因的檢測敏感性是85.7%（90/105），特異性為95.2%（100/105），ROC曲線下面積是0.930（95% CI：0.89–0.971，p ＜ 0.0001）。
[ 表 2]
Figure 108117746-A0304-0002
對比例 1
目前有研究用QIAamp DNA Stool Mini Kit（QIAGEN）對糞便標本的DNA進行提取，然後用甲基化特異性PCR（MSP）或定量甲基化特異性PCR（qMSP）來定性或定量檢測標本中標誌物的水平。其中通過MSP來檢測結直腸癌因需要跑電泳，操作更不方便，且有產物污染風險；通過QIAamp DNA Stool Mini Kit來提取糞便中的DNA為人和細菌的總DNA，真正人的腫瘤DNA極少，不利於後續PCR檢測。
對比例 2
有研究表明SFRP1基因甲基化與腸癌有關，在糞便中檢測該基因的甲基化程度，可以檢出結直腸癌。在53例糞便標本（29例腸癌、7例腺瘤、17例正常）實驗中，在特異性為86%時，可檢出89%的結直腸腫瘤。（Zhang W, Bauer M, Croner RS, Pelz JO, Lodygin D, Hermeking H, Sturzl M, Hohenberger W, Matzel KE. DNA stool test for colorectal cancer: Hypermethylation of the secreted frizzled-related protein-1 gene. DISEASES OF THE COLON & RECTUM 2007; 50(10): 1618-26; discussion 1626-7.）
在19對組織和36例糞便標本中同樣檢測了SFRP1基因的甲基化水平，靶基因提取方法同實施例1和2。19對組織實驗中，SFRP1基因檢測結直腸癌的ROC曲線如圖4所示：
對於結直腸癌組織，SFRP1基因的檢測敏感性是89%，特異性為95%，ROC曲線下面積是0.972（95% CI：0.929–1，p ＜ 0.001）。
36例糞便實驗中，SFRP1基因檢測結直腸癌的ROC曲線如圖5所示：
對於結直腸癌，SFRP1基因的檢測敏感性是67%，特異性為94%，ROC曲線下面積是0.892（95% CI：0.790–0.994，p ＜ 0.0001）。
由此可見，SFRP1基因對結直腸癌組織具有較高的檢測敏感性和特異性，而在糞便標本中其敏感性就大幅降低了。
以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。
無。
為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。
圖1示實施例1糞便實驗中，SOX21基因檢測結直腸癌的ROC曲線；
圖2示實施例1糞便實驗中，SOX21基因標準曲線擴增圖譜；
圖3示實施例2組織實驗中，SOX21基因檢測結直腸癌的ROC曲線；
圖4示對比例2的19對組織實驗中，SFRP1基因檢測結直腸癌的ROC曲線；
圖5示對比例2的36例糞便實驗中，SFRP1基因檢測結直腸癌的ROC曲線。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002

Claims (19)

  1. 一種引子對，其中，上游引子具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；下游引子具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。
  2. 一種SOX21基因的甲基化檢測試劑在製備腫瘤檢測試劑或者試劑盒中的應用；該SOX21基因的甲基化檢測試劑具有引子對，其中，上游引子具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，下游引子具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；該腫瘤為結直腸癌；檢測試劑所針對的待測樣本為糞便。
  3. 如請求項2所述的應用，該SOX21基因的序列與Genebank Accession No.NC_000013.11所示的序列具有100%的同一性。
  4. 一種SOX21基因的甲基化檢測試劑，包括SOX21基因的甲基化檢測的捕獲序列、引子和/或探針；該引子中的上游引子具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；該引子中的下游引子具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。
  5. 如請求項4所述的甲基化檢測試劑，該捕獲序列具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
  6. 如請求項4所述的甲基化檢測試劑，該探針具有SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。
  7. 如請求項4所述的甲基化檢測試劑，該SOX21基因的序列與Genebank Accession No.NC_000013.11所示的序列具有100%的同一性。
  8. 一種試劑盒，包括如請求項1所述的引子對或請求項4所述的甲基化檢測試劑。
  9. 如請求項8所述的試劑盒，該試劑盒包括：第一容器，其包含捕獲序列；第二容器，其包含用於擴增的引子對；第三容器，其包含探針。
  10. 一種如請求項1所述的引子對或請求項4所述的甲基化檢測試劑在製備檢測腫瘤的試劑盒中的應用；該腫瘤為結直腸癌；檢測所針對的待測樣本為糞便。
  11. 一種如請求項1所述的引子對、請求項4所述的甲基化檢測試劑或請求項8所述的試劑盒在檢測腫瘤中的應用；該腫瘤為結直腸癌；檢測所針對的樣本為糞便。
  12. 一種腫瘤的檢測方法，包括步驟：(1)檢測受試者SOX21基因的甲基化水平； (2)將受試者SOX21基因的甲基化水平與正常對照樣本的甲基化水平相比較；(3)根據該受試者SOX21基因的甲基化水平與正常對照樣本的甲基化水平相比的升高，指示該受試者患有或者有風險患上腫瘤，以區分正常樣本和腫瘤樣本；該甲基化水平採用如請求項1所述的引子對、請求項4所述的甲基化檢測試劑或請求項8所述的試劑盒檢測；該腫瘤為結直腸癌；檢測樣本類型為糞便。
  13. 如請求項12所述的檢測方法，步驟(1)中，檢測受試者SOX21基因的甲基化水平包含以下步驟：a)採用磁珠捕獲法提取待測樣品的DNA；b)待測樣品的DNA採用亞硫酸氫鹽、重亞硫酸氫鹽或肼鹽進行轉化；c)甲基化特異性定量PCR檢測。
  14. 如請求項13所述的檢測方法，步驟a)中，採用磁珠捕獲法提取待測樣品的DNA包括以下步驟；取待測樣本在保護液中混合研磨、離心、取上清；上清再離心，取上清，加入裂解液和帶有特定互補寡核苷酸捕獲序列的磁珠至上清液中孵育；棄部分上清後洗下磁珠轉移至乾淨離心管，加入洗液，室溫100-2000rpm孵育0.5-5min，置於磁力架上吸去上清，重複3次；用緩衝液將目標基因DNA洗脫。
  15. 如請求項12所述的檢測方法，其中檢測標準為：根據界值判斷腫瘤標本和正常標本，糞便標本中的Ct值的界值為32.45，該糞便標本的Ct值小於該Ct值的界值則判斷為腫瘤標本，該糞便標本的Ct值大於等於該Ct值的界值則判斷為正常標本。
  16. 一種腫瘤的檢測系統，包含：(1)SOX21基因的甲基化檢測構件；(2)數據處理構件；(3)結果輸出構件；該甲基化檢測構件還含有如請求項1所述的引子對，或者如請求項4所述的甲基化檢測試劑，或者如請求項8所述的試劑盒；該腫瘤為結直腸癌；檢測樣本類型為糞便。
  17. 如請求項16所述的檢測系統，該數據處理構件被配置於a.接收待測樣本以及正常對照樣本的測試數據；b.儲存待測樣本以及正常對照樣本的測試數據；c.比對同種類型的待測樣本以及正常對照樣本的測試數據；d.根據比對結果，響應於測試者罹患腫瘤的概率或者可能性。
  18. 如請求項16所述的檢測系統，該結果輸出構件用於輸出測試者罹患腫瘤的概率或者可能性。
  19. 如請求項16所述的檢測系統，數據處理構件的判斷標準為：根據界值判斷腫瘤標本和正常標本；糞便標本中的Ct值的界值為32.45，該糞便標本的Ct值小於該Ct值的界值則判斷為腫瘤標本，該糞便標本的Ct值大於等於該Ct值的界值則判斷為正常標本。
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