JP7118072B2

JP7118072B2 - Ｃｄ９６／ｔｉｇｉｔ発現が低下した遺伝子改変型ｎｋ－９２細胞

Info

Publication number: JP7118072B2
Application number: JP2019536893A
Authority: JP
Inventors: フランシスコナヴァロ; ハンスクリンゲマン
Original assignee: イミュニティーバイオインコーポレイテッド
Priority date: 2017-01-06
Filing date: 2018-01-05
Publication date: 2022-08-15
Anticipated expiration: 2038-01-05
Also published as: US20200123503A1; IL267543B1; AU2018206401A1; WO2018129346A1; CN110168078A; CA3048907A1; IL267543A; EP3565889A1; EP3565889A4; JP2020505015A; KR20190095959A; CA3048907C; AU2018206401B2; KR102528384B1

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2017年1月6日に出願された米国仮特許出願第62/443,621号；2017年2月16日に出願された米国仮特許出願第62/459,877号；および2017年2月16日に出願された米国仮特許出願第62/459,873号の優先権の恩典を主張するものである。各出願は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み入れられる。

発明の背景
細胞ベースの免疫療法はがん治療のための強力なツールである。キメラ抗原受容体を発現する遺伝子操作された初代T細胞（CAR-T細胞）を用いた、リンパ系悪性腫瘍患者の治療での初期の成功は、がん治療にかなり明るい見通しを示してきた。ナチュラルキラー（NK）細胞の使用に基づく免疫療法もまた開発されつつあるが、NK細胞ベースの免疫療法の分野はT細胞を用いるものほど進歩していない。

NK-92は、非ホジキンリンパ腫に罹患した患者の血液中で発見され、その後エクスビボで不死化された、細胞溶解性のがん細胞株である。NK-92細胞は、NK細胞に由来するものの、正常なNK細胞によって提示される主要な抑制性受容体を欠いている一方で、活性化受容体の大部分を保持している。しかしながら、NK-92細胞は正常な細胞を攻撃することもないし、ヒトにおいて許容できない免疫拒絶反応を誘発することもない。NK-92細胞株は、例えばWO1998/49268（特許文献1）および米国特許出願第20020068044号（特許文献2）において、特徴付けられている。

上述したように、活性型NK-92（aNK）細胞のユニークな特徴は、それらが複数の活性化受容体（NKp30、NKp46、2B4、NKGD、E、CD28、CD226）を発現するが、現在知られている抑制性KIR受容体のほとんどを欠くことである（Maki et al., J Hematother Stem Cell Res. 10:369-83, 2001（非特許文献1））。このユニークな表現型は、aNK細胞の広範な抗腫瘍活性の主要因であり得る。活性化受容体CD226は、DNAM1の別名でも知られており、ネクチンおよびネクチン様ファミリータンパク質に結合する受容体のファミリーに属し、NK細胞が介在する細胞傷害性を制御する上で決定的な役割を果たす（Shibuya et al., Immunity. 4:573-81, 1996（非特許文献2））。このファミリーは抑制性受容体CD96およびTIGITをも含み（Martinet et al., Nat Rev Immunol. 15:243-54, 2015（非特許文献3））、これらもまたaNK細胞によって発現される。これら3つの受容体は全て、共通のリガンドであるCD155（ポリオウイルス受容体PVRとしても知られる）を共有し、それらはCD155に異なる親和性で結合する（Martinet et al., 前掲）。CD155発現は多くの場合腫瘍細胞においてアップレギュレートされており、その過剰発現はがんの浸潤性および転移と関連している（Hirota et al., Oncogene 24:2229-35, 2005; Sloan et al., BMC Cancer 4:73, 2004（非特許文献4および5））。CD96およびTIGITもまた、NK細胞において抑制性の免疫チェックポイントとして関与している（Chan et al., Nat Immunol. 15:431-8, 2014（非特許文献6））。

NK-92細胞はまた、ある種のがんの治療において有望な治療剤としても評価されている。本発明は、がんを治療するためのNK-92ベースの治療法の進歩を提供するものである。

WO1998/49268 米国特許出願第20020068044号

Maki et al., J Hematother Stem Cell Res. 10:369-83, 2001 Shibuya et al., Immunity. 4:573-81, 1996 Martinet et al., Nat Rev Immunol. 15:243-54, 2015 Hirota et al., Oncogene 24:2229-35, 2005 Sloan et al., BMC Cancer 4:73, 2004 Chan et al., Nat Immunol. 15:431-8, 2014

発明の局面の概要
一局面において、本開示は、CD96の発現を阻害する改変を含むCD96改変型NK-92細胞を提供する。いくつかの態様では、CD96改変型NK-92細胞は、CD96を標的としかつその発現を阻害する干渉RNAを含む。いくつかの態様では、CD96改変型NK-92細胞によって発現されるCD96の量は、CD96を標的とした変更を有さないNK-92細胞と比較して、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも50％、少なくとも60％、もしくは少なくとも80％、またはそれ以上減少する。いくつかの態様では、CD96改変型NK-92細胞は、NK-92細胞におけるノックダウンまたはノックアウトによって作製される。

いくつかの態様において、CD96改変型NK-92細胞は、細胞表面に少なくとも1つのFc受容体、または少なくとも1つのキメラ抗原受容体（CAR）、または少なくとも1つのFc受容体と少なくとも1つのCARの両方を発現する。いくつかの態様では、少なくとも1つのFc受容体は、CD16、または176位（1位としてN末端メチオニンを含む前駆体の全長ヒトCD16を参照して番号付けされた）にバリンを有するCD16ポリペプチドである。いくつかの態様では、少なくとも1つのFc受容体は、SEQ ID NO:13のアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、かつ176位にバリンを含む。いくつかの態様では、少なくとも1つのFc受容体は、FcγRIIIである。いくつかの態様では、CARはFcεRIγの細胞質ドメインを含む。いくつかの態様では、CARは腫瘍関連抗原を標的とする。いくつかの態様において、CD96改変型NK-92細胞はサイトカインをさらに発現する。いくつかの態様では、サイトカインはインターロイキン-2またはその変異体である。いくつかの態様では、サイトカインは小胞体に標的指向される。

別の局面において、本開示は、対照NK-92細胞と比較して低下したレベルのCD96を発現するNK-92細胞を作製する方法を提供し、その方法は、NK-92細胞におけるCD96の発現を遺伝的に改変する段階を含む。いくつかの態様では、CD96の発現を遺伝的に改変する段階は、改変されるNK-92細胞を、CD96を標的とする干渉RNAと接触させることを含む。いくつかの態様では、CD96を標的とする干渉RNAは、siRNA、shRNA、マイクロRNA、または一本鎖干渉RNAである。

いくつかの態様では、CD96の発現を遺伝的に改変する段階は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、Taleエフェクタードメインヌクレアーゼ（TALEN）、またはCRISPR/Casシステムを用いて、CD96遺伝子を改変することを含む。いくつかの態様では、CD96遺伝子の発現を遺伝的に改変する段階は、（i）NK-92細胞に、CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeat）関連（Cas）タンパク質を導入する段階、および（ii）改変されるNK-92細胞に1つまたは複数のリボ核酸を導入する段階を含み、該リボ核酸は、CD96遺伝子配列の標的モチーフにハイブリダイズするようにCasタンパク質を誘導し、該標的モチーフが切断される。いくつかの態様では、Casタンパク質はタンパク質の形態でNK-92細胞に導入される。いくつかの態様では、Casタンパク質は、Cas核酸コード配列を導入することによってNK-92細胞に導入される。いくつかの態様では、Casタンパク質はCas9である。いくつかの態様では、該標的モチーフは20ヌクレオチドのDNA配列である。いくつかの態様では、該標的モチーフは、CD96遺伝子配列（アクセッション番号NM_198196転写変異体1）の第2エクソン内にあり、この標的モチーフはCD96転写変異体2（アクセッション番号NM_005816）およびCD96転写変異体3（アクセッション番号NM_001318889）によって共有される。いくつかの態様では、該1つまたは複数のリボ核酸はSEQ ID NO：1～4からなる群より選択される。

さらなる局面において、本明細書では、例えば上記のような、CD96改変型NK-92細胞を複数含む組成物を提供する。いくつかの態様では、該組成物は生理学的に許容される賦形剤をも含む。

さらなる局面において、本明細書では、本明細書例えば前段落に記載した、CD96改変型NK-92細胞のいずれかを複数含む改変型NK-92細胞株を提供する。いくつかの態様では、該細胞株の細胞は10回未満の集団倍加（population doubling）を受けている。いくつかの態様では、該細胞株の細胞は、10U/ml未満のIL-2を含有する培養液中で培養される。

別の局面において、本明細書では、それを必要とする患者におけるがんを治療する方法を提供し、該方法は、本明細書例えば前段落に記載した、CD96改変型NK-92細胞株のいずれかを治療有効量で該患者に投与し、それによってがんを治療することを含む。いくつかの態様では、該方法は治療用抗体、例えば治療用モノクローナル抗体を投与することをさらに含む。いくつかの態様では、患者の体表面積1m²あたり約1×10⁸～約1×10¹¹個の細胞を患者に投与する。

さらなる局面において、本開示は、がんを治療するためのキットを提供し、該キットは、（a）本明細書例えば前段落に開示したような、CD96改変型NK-92細胞の組成物または細胞株のいずれか、および（b）使用説明書を含む。いくつかの態様では、該キットは生理学的に許容される賦形剤をさらに含む。

別の局面において、本開示はまた、TIGITの発現を阻害する改変を含むTIGIT改変型NK-92細胞を提供する。いくつかの態様では、TIGIT改変型NK-92細胞は、TIGITを標的としかつその発現を阻害する干渉RNAを含む。いくつかの態様では、TIGIT改変型NK-92細胞によって発現されるTIGITの量は、TIGITを標的とした変更を有さないNK-92細胞と比較して、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも50％、少なくとも60％、もしくは少なくとも80％、またはそれ以上減少する。いくつかの態様では、TIGIT改変型NK-92細胞は、NK-92細胞におけるTIGITのノックダウンまたはノックアウトによって作製される。

いくつかの態様において、TIGIT改変型NK-92細胞は、細胞表面に少なくとも1つのFc受容体、または少なくとも1つのキメラ抗原受容体（CAR）、または少なくとも1つのFc受容体と少なくとも1つのCARの両方を発現する。いくつかの態様では、少なくとも1つのFc受容体は、CD16、または176位（1位としてN末端メチオニンを含む前駆体の全長ヒトCD16を参照して番号付けされた）にバリンを有するCD16ポリペプチドである。いくつかの態様では、少なくとも1つのFc受容体は、SEQ ID NO:13のアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、かつ176位にバリンを含む。いくつかの態様では、少なくとも1つのFc受容体はFcγRIIIである。いくつかの態様では、CARはFcεRIγの細胞質ドメインを含む。いくつかの態様では、CARは腫瘍関連抗原を標的とする。いくつかの態様において、TIGIT改変型NK-92細胞はサイトカインをさらに発現する。いくつかの態様では、サイトカインはインターロイキン-2またはその変異体である。いくつかの態様では、サイトカインは小胞体に標的指向される。

別の局面において、本開示は、対照NK-92細胞と比較して低下したレベルのTIGITを発現するNK-92細胞を作製する方法を提供し、該方法は、NK-92細胞におけるTIGITの発現を遺伝的に改変する段階を含む。いくつかの態様では、TIGITの発現を遺伝的に改変する段階は、改変されるNK-92細胞を、TIGITを標的とする干渉RNAと接触させることを含む。いくつかの態様では、TIGITを標的とする干渉RNAは、siRNA、shRNA、マイクロRNA、または一本鎖干渉RNAである。

いくつかの態様では、TIGITの発現を遺伝的に改変する段階は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、Taleエフェクタードメインヌクレアーゼ（TALEN）、またはCRISPR/Casシステムを用いて、TIGIT遺伝子を改変することを含む。いくつかの態様では、TIGIT遺伝子の発現を遺伝的に改変する段階は、（i）NK-92細胞に、CRISPR関連（Cas）タンパク質を導入する段階、および（ii）改変されるNK-92細胞に1つまたは複数のリボ核酸を導入する段階を含み、該リボ核酸は、TIGIT遺伝子配列の標的モチーフにハイブリダイズするようにCasタンパク質を誘導し、該標的モチーフが切断される。いくつかの態様では、Casタンパク質はタンパク質の形態でNK-92細胞に導入される。いくつかの態様では、Casタンパク質は、Cas核酸コード配列を導入することによってNK-92細胞に導入される。いくつかの態様では、Casタンパク質はCas9である。いくつかの態様では、該標的モチーフは20ヌクレオチドのDNA配列である。いくつかの態様では、該標的モチーフは、TIGIT遺伝子配列（アクセッション番号NM_173799転写体）の第2エクソン内にある。いくつかの態様では、該1つまたは複数のリボ核酸はSEQ ID NO：5～8からなる群より選択される。

さらなる局面において、本開示は、本明細書例えば前段落に記載した、TIGIT改変型NK-92細胞を複数含む組成物をさらに提供する。いくつかの態様では、該組成物は生理学的に許容される賦形剤をも含む。

別の局面において、本明細書では、複数個の、本明細書例えば前段落に記載した、TIGIT改変型NK-92細胞のいずれかを含む改変型NK-92細胞株を提供する。いくつかの態様では、該細胞株の細胞は10回未満の集団倍加を受けている。いくつかの態様では、該細胞株の細胞は、10U/ml未満のIL-2を含有する培養液中で培養される。

別の局面において、本開示は、それを必要とする患者におけるがんを治療する方法をさらに提供し、該方法は、本明細書例えば前段落に記載したTIGIT改変型NK-92細胞株を治療有効量で該患者に投与し、それによってがんを治療することを含む。いくつかの態様では、該方法は治療用抗体、例えば治療用モノクローナル抗体を投与することをさらに含む。いくつかの態様では、患者の体表面積1m²あたり約1×10⁸～約1×10¹¹個の細胞を患者に投与する。

さらなる局面において、本開示は、がんを治療するためのキットを提供し、該キットは、（a）本明細書例えば前段落に開示したような、TIGIT改変型NK-92細胞の組成物または細胞株のいずれか、および(b)使用説明書を含む。いくつかの態様では、該キットは生理学的に許容される賦形剤をさらに含む。

さらなる局面において、本明細書では、CD96の発現を阻害する改変およびTIGITの発現を阻害する改変を含む改変型NK-92を提供する。いくつかの態様では、この改変型NK-92細胞は、CD96を標的としかつCD96の発現を阻害する干渉RNA；およびTIGITを標的としかつTIGITの発現を阻害する干渉RNAを含む。いくつかの態様では、該細胞によって発現されるCD96の量は、CD96改変を有さない対応するNK-92細胞と比較して、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、もしくは少なくとも80％、またはそれ以上減少し；かつ該細胞によって発現されるTIGITの量は、TIGIT改変を有さない対応するNK-92細胞と比較して、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、もしくは少なくとも80％、またはそれ以上減少する。いくつかの態様では、この改変型NK-92細胞は、該細胞におけるCD96発現のノックダウンまたはノックアウトおよびTIGIT発現のノックダウンまたはノックアウトによって作製される。さらなる態様では、該改変型NK細胞は、細胞表面に少なくとも1つのFc受容体、または少なくとも1つのキメラ抗原受容体（CAR）、または少なくとも1つのFc受容体と少なくとも1つのCARの両方を発現する。いくつかの態様では、少なくとも1つのFc受容体は、CD16、または176位（1位としてN末端メチオニンを含む前駆体の全長ヒトCD16を参照して番号付けされた）にバリンを有するCD16ポリペプチドである。いくつかの態様では、少なくとも1つのFc受容体はFcγRIIIである。特定の態様では、少なくとも1つのFc受容体は、SEQ ID NO:13のアミノ酸19～254に対して少なくとも90％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、かつSEQ ID NO:13を参照して番号付けされた176位にバリンを含む。さらなる態様では、改変型NK-92はFcεRIγの細胞質ドメインを含むCARを発現する。いくつかの態様では、CARは腫瘍関連抗原を標的とする。さらなる態様では、改変型NK-92細胞は、インターロイキン-2またはその変異体などの、サイトカインをさらに発現する。いくつかの態様では、サイトカイン、例えばIL-2は、小胞体に標的指向される。

さらなる局面において、本開示は、本明細書例えば前段落に記載した、CD96およびTIGITの発現が低下した改変型NK-92細胞を複数含む組成物を提供する。いくつかの態様では、そのような組成物は生理学的に許容される賦形剤を含む。

別の局面において、本開示は、本明細書例えば前段落に記載した、CD96およびTIGITの発現が低下した改変型NK-92細胞を複数含む細胞株を提供する。いくつかの態様では、該細胞は10回未満の集団倍加を受けている。

他の局面において、本開示は、CD96およびTIGITの発現を低下させるために本明細書に記載のように改変されたNK-92細胞を用いてがんを治療するためのキット、組成物ならびに方法を提供する。したがって、いくつかの態様において、本明細書では、それを必要とする患者におけるがんを治療する方法を提供し、該方法は、CD96とTIGITの両方の発現を低下させるように改変されたNK-92細胞を含む組成物または細胞株を治療有効量で該患者に投与し、それによってがんを治療することを含む。いくつかの態様では、該方法は治療用抗体、例えば治療用モノクローナル抗体を投与することをさらに含む。いくつかの態様では、患者の体表面積1m²あたり約1×10⁸～約1×10¹¹個の細胞を患者に投与する。

さらなる局面において、本開示は、低下したレベルのCD96およびTIGITを発現するNK-92細胞を作製する方法を提供する。いくつかの態様では、CD96およびTIGIT標的遺伝子のそれぞれの発現を遺伝的に改変する段階は、改変されるNK-92細胞を、各標的遺伝子を標的とする干渉RNAと接触させることを含む。いくつかの態様では、1つまたは複数の標的遺伝子のそれぞれを標的とする干渉RNAは、siRNA、shRNA、マイクロRNA、または一本鎖干渉RNAである。特定の態様では、CD96およびTIGIT標的遺伝子のそれぞれの発現を遺伝的に改変する段階は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、Taleエフェクタードメインヌクレアーゼ（TALEN）、またはCRISPR/Casシステムを用いて、各標的遺伝子を改変することを含む。いくつかの態様では、該標的遺伝子のそれぞれの発現を遺伝的に改変する段階は、（i）NK-92細胞に、CRISPR関連（Cas）タンパク質を導入する段階、および（ii）改変されるNK-92細胞に1つまたは複数のリボ核酸を導入する段階を含み、該リボ核酸は、1つまたは複数の標的遺伝子のそれぞれの配列の標的モチーフにハイブリダイズするようにCasタンパク質を誘導し、該標的モチーフが切断される。ある態様では、Casタンパク質はタンパク質の形態でNK-92細胞に導入される。他の態様では、Casタンパク質は、Casコード配列を導入することによってNK-92細胞に導入される。例示的なCasタンパク質としてはCas9が挙げられる。いくつかの態様では、該標的モチーフは20ヌクレオチドのDNA配列である。該標的モチーフは、例えば、各標的遺伝子のエクソンであり得る。いくつかの態様では、CD96中の標的モチーフにハイブリダイズする1つまたは複数のリボ核酸は、SEQ ID NO：1～4からなる群より選択され、TIGIT中の標的モチーフにハイブリダイズする1つまたは複数のリボ核酸は、SEQ ID NO：5～8からなる群より選択される。

さらなる局面において、本開示は、CD226の発現を阻害する改変を含むCD226改変型NK-92細胞を提供する。いくつかの態様では、CD226改変型NK-92細胞は、CD226を標的としかつその発現を阻害する干渉RNAを含む。いくつかの態様では、CD226改変型NK-92細胞によって発現されるCD226の量は、CD226を標的とした変更を有さないNK-92細胞と比較して、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも50％、少なくとも60％、もしくは少なくとも80％、またはそれ以上減少する。いくつかの態様では、CD226改変型NK-92細胞は、NK-92細胞におけるCD226のノックダウンまたはノックアウトによって作製される。いくつかの態様では、CD226の発現を遺伝的に改変する段階は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、Taleエフェクタードメインヌクレアーゼ（TALEN）、またはCRISPR/Casシステムを用いて、CD226遺伝子を改変することを含む。いくつかの態様では、CD226遺伝子の発現を遺伝的に改変する段階は、（i）NK-92細胞に、CRISPR関連（Cas）タンパク質を導入する段階、および（ii）改変されるNK-92細胞に1つまたは複数のリボ核酸を導入する段階を含み、該リボ核酸は、CD226遺伝子配列の標的モチーフにハイブリダイズするようにCasタンパク質を誘導し、該標的モチーフが切断される。いくつかの態様では、Casタンパク質はタンパク質の形態でNK-92細胞に導入される。いくつかの態様では、Casタンパク質は、Cas核酸コード配列を導入することによってNK-92細胞に導入される。いくつかの態様では、Casタンパク質はCas9である。いくつかの態様では、該標的モチーフは20ヌクレオチドのDNA配列である。

[本発明1001]
1つまたは複数の標的遺伝子の発現を阻害する1つまたは複数の変更を含む改変型NK-92細胞であって、該1つまたは複数の標的遺伝子がCD96およびTIGITからなる群より選択される、改変型NK-92細胞。
[本発明1002]
CD96遺伝子がCD96の発現を阻害するように遺伝的に変更されている、本発明1001の改変型NK-92細胞。
[本発明1003]
CD96を標的としかつCD96の発現を阻害する干渉RNAを含む、本発明1002の改変型NK-92細胞。
[本発明1004]
前記細胞内でCD96発現をノックダウンまたはノックアウトすることによって作製される、本発明1002の改変型NK-92細胞。
[本発明1005]
前記細胞によって発現されるCD96の量が、CD96改変を有さない対応するNK-92細胞と比較して、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、または少なくとも80％減少する、本発明1002の改変型NK-92細胞。
[本発明1006]
TIGIT遺伝子がTIGITの発現を阻害するように遺伝的に変更されている、本発明1001の改変型NK-92細胞。
[本発明1007]
TIGITを標的としかつTIGITの発現を阻害する干渉RNAを含む、本発明1006の改変型NK-92細胞。
[本発明1008]
前記細胞内でTIGIT発現をノックダウンまたはノックアウトすることによって作製される、本発明1006の改変型NK-92細胞。
[本発明1009]
前記細胞によって発現されるTIGITの量が、TIGIT改変を有さない対応するNK-92細胞と比較して、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、または少なくとも80％減少する、本発明1006の改変型NK-92細胞。
[本発明1010]
CD96遺伝子とTIGIT遺伝子の両方が、TIGITの発現を阻害するように遺伝的に変更されている、本発明1001の改変型NK-92細胞。
[本発明1011]
CD96を標的としかつCD96の発現を阻害する干渉RNAと、TIGITを標的としかつTIGITの発現を阻害する干渉RNAとを含む、本発明1010の改変型NK-92細胞。
[本発明1012]
前記細胞内でCD96発現をノックダウンまたはノックアウトすることおよびTIGIT発現をノックダウンまたはノックアウトすることによって作製される、本発明1010の改変型NK-92細胞。
[本発明1013]
前記細胞によって発現されるCD96の量が、CD96改変を有さない対応するNK-92細胞と比較して、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、または少なくとも80％減少し、かつ
前記細胞によって発現されるTIGITの量が、TIGIT改変を有さない対応するNK-92細胞と比較して、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、または少なくとも80％減少する、
本発明1010、1011または1012の改変型NK-92細胞。
[本発明1014]
少なくとも1つのFc受容体、または少なくとも1つのキメラ抗原受容体（CAR）、または少なくとも1つのFc受容体と少なくとも1つのCARの両方を細胞表面上に発現する、本発明1001～1013のいずれかの改変型NK-92細胞。
[本発明1015]
前記少なくとも1つのFc受容体が、CD16、またはSEQ ID NO:13を参照して番号付けされた176位にバリンを有するCD16ポリペプチドである、本発明1014の改変型NK-92細胞。
[本発明1016]
前記少なくとも1つのFc受容体が、SEQ ID NO:13のアミノ酸19～254に対して少なくとも90％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、かつSEQ ID NO:13を参照して番号付けされた176位にバリンを含む、本発明1015の改変型NK-92細胞。
[本発明1017]
前記少なくとも1つのFc受容体がFcγRIIIである、本発明1014の改変型NK-92細胞。
[本発明1018]
前記CARがFcεRIγの細胞質ドメインを含む、本発明1014の改変型NK-92細胞。
[本発明1019]
前記CARが腫瘍関連抗原を標的とする、本発明1018の改変型NK-92細胞。
[本発明1020]
サイトカインをさらに発現する、本発明1001～1019のいずれかの改変型NK-92細胞。
[本発明1021]
サイトカインがインターロイキン-2またはその変異体である、本発明1020の改変型NK-92細胞。
[本発明1022]
サイトカインが小胞体に標的指向される、本発明1020または1021の改変型NK-92細胞。
[本発明1023]
本発明1001～1022のいずれかの改変型NK-92細胞を複数含む、組成物。
[本発明1024]
生理学的に許容される賦形剤をさらに含む、本発明1023の組成物。
[本発明1025]
本発明1001～1022のいずれかの改変型NK-92細胞を複数含む、NK-92細胞株。
[本発明1026]
前記細胞が10回未満の集団倍加を受けている、本発明1025の細胞株。
[本発明1027]
それを必要とする対象におけるがんを治療する方法であって、本発明1024の組成物または本発明1025もしくは1026の細胞株を治療有効量で該対象に投与し、それによってがんを治療する段階を含む、方法。
[本発明1028]
抗体を投与する段階をさらに含む、本発明1027の方法。
[本発明1029]
患者の体表面積1m ² あたり約1×10 ⁸ ～約1×10 ¹¹ 個の細胞が患者に投与される、本発明1027または1028の方法。
[本発明1030]
（a）本発明1023もしくは1024の組成物または本発明1025もしくは1026の細胞株を含む、がんを治療するためのキット。
[本発明1031]
対照NK-92細胞と比較して低下したレベルの1つまたは複数の標的遺伝子を発現するNK-92細胞を作製する方法であって、NK-92細胞における1つまたは複数の標的遺伝子の発現を遺伝的に改変する段階を含み、
該1つまたは複数の標的遺伝子がCD96およびTIGITからなる群より選択される、方法。
[本発明1032]
1つまたは複数の標的遺伝子のそれぞれの発現を遺伝的に改変する段階が、改変されるNK-92細胞を、該1つまたは複数の標的遺伝子のそれぞれを標的とする干渉RNAと接触させることを含む、本発明1031の方法。
[本発明1033]
1つまたは複数の標的遺伝子のそれぞれを標的とする干渉RNAが、siRNA、shRNA、マイクロRNA、または一本鎖干渉RNAである、本発明1032の方法。
[本発明1034]
1つまたは複数の標的遺伝子のそれぞれの発現を遺伝的に改変する段階が、該1つまたは複数の標的遺伝子のそれぞれを、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、Taleエフェクタードメインヌクレアーゼ（TALEN）、またはCRISPR/Casシステムを用いて改変することを含む、本発明1031の方法。
[本発明1035]
1つまたは複数の標的遺伝子のそれぞれの発現を遺伝的に改変する段階が、
（i）NK-92細胞に、CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeat）関連（Cas）タンパク質を導入する段階、および
（ii）改変されるNK-92細胞に1つまたは複数のリボ核酸を導入する段階
を含み、
該リボ核酸が、該1つまたは複数の標的遺伝子のそれぞれの配列の標的モチーフにハイブリダイズするようにCasタンパク質を誘導し、該標的モチーフが切断される、
本発明1001の方法。
[本発明1036]
Casタンパク質がタンパク質の形態でNK-92細胞に導入される、本発明1035の方法。
[本発明1037]
Casコード配列を導入することによって、Casタンパク質がNK-92細胞に導入される、本発明1035の方法。
[本発明1038]
Casタンパク質がCas9である、本発明1035の方法。
[本発明1039]
前記標的モチーフが20ヌクレオチドのDNA配列である、本発明1035の方法。
[本発明1040]
前記標的モチーフが、該1つまたは複数の標的遺伝子のそれぞれのエクソン内にある、本発明1035の方法。
[本発明1041]
CD96中の標的モチーフにハイブリダイズする1つまたは複数のリボ核酸がSEQ ID NO：1～4からなる群より選択され、TIGIT中の標的モチーフにハイブリダイズする1つまたは複数のリボ核酸がSEQ ID NO：5～8からなる群より選択される、本発明1035の方法。
[本発明1042]
CD96とTIGITが両方とも標的とされる、本発明1031～1041のいずれかの方法。
前述の概要および後述の詳細な説明は例示的かつ説明的なものであり、特許請求の範囲に記載された本発明のさらなる説明を提供するためのものである。他の目的、利点および新規な特徴は、以下の発明の詳細な説明から当業者には容易に明らかとなろう。

図1は、NK-92細胞が、活性化CD226受容体ならびに抑制性CD96受容体および抑制性TIGIT受容体を発現することを示すデータを提供する。NK-92細胞におけるCD226、CD96およびTIGIT発現のフローサイトメトリー分析は、「材料および方法」に記載されるように行った。図2は、親NK-92細胞およびノックアウトNK-92細胞におけるCD226、CD96およびTIGIT受容体の発現を示すデータを提供する。親Cas9-NK-92細胞またはネクチン受容体ノックアウトNK-92細胞におけるCD226、CD96およびTIGIT発現のフローサイトメトリー分析は、「材料および方法」に記載されるように行った。特異的抗体で染色されたサンプルのMFI（平均蛍光強度）値も示される。図3は、MCF-7、SKBR-3、およびDaudi腫瘍細胞におけるCD155発現を示すデータを提供する。MCF-7、SKBR-3、およびDaudi細胞におけるCD155発現のフローサイトメトリー分析は、「材料および方法」に記載されるように行った。図4は、CD96 KO NK-92細胞およびCD96/TIGIT KO NK-92細胞がCD155陽性腫瘍標的に対してより高い細胞傷害能を持つことを示すデータを提供する。親NK-92細胞またはネクチン受容体KO NK-92細胞がCD155陽性のMCF-7腫瘍細胞（上）またはSKBR-3腫瘍細胞（下）を死滅させる能力は、4時間の細胞傷害性アッセイにおいて異なるエフェクター対標的（E：T）比で評価した。各セットの棒は、左から右へ、以下の細胞種を表す：NK-92-WT、NK-92-Cas9、CD226-KO、CD96-KO、TIGIT-KO、CD96/TIGITダブルノックアウト。棒グラフは、3回の独立した実験の平均+/-SEMを示す。p値はスチューデントのｔ検定を用いて計算した。（*）、親NK-92細胞に対してp＜0.05を示す；（**）、親NK-92細胞に対してp＜0.01を示す。（#）、CD96-KO細胞に対してp＜0.05を示す。図5は、CD96 KO NK-92細胞およびCD96/TIGIT KO NK-92細胞の増大した細胞傷害能がネクチン結合受容体の喪失に特異的であることを示すデータを提供する。親NK-92細胞またはネクチン受容体KO NK-92細胞がCD155陰性Daudi腫瘍細胞を死滅させる能力は、4時間の細胞傷害性アッセイにおいて異なるエフェクター対標的（E：T）比で評価した。各セットの棒は、左から右へ、以下の細胞種を表す：NK-92-WT、NK-92-Cas9、CD226-KO、CD96-KO、TIGIT-KO、CD96/TIGITダブルノックアウト。棒グラフは、4回の独立した実験の平均+/-SEMを示す。p値はスチューデントのｔ検定を用いて計算した。（*）、親NK-92細胞に対してp＜0.05を示す。図6は、NK細胞の機能におけるTIGITおよびCD96の役割を示す概略図である。

発明の詳細な説明
一局面では、本発明は、CD96発現が低下したCD96改変型NK-92細胞および/またはTIGIT発現が低下したTIGIT改変型NK-92細胞、ならびにそのような細胞を作製する方法を提供する。本開示によるCD96改変型NK-92細胞はNK-92細胞中にCD96を標的とした変更を有し、かつTIGIT改変型NK-92細胞はNK-92細胞中にTIGITを標的とした変更を有する。本発明はさらに、がんの治療のためにこれらの改変型NK-92細胞を使用する方法を提供する。

専門用語
特に他で定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味を有する。

本明細書および添付の特許請求の範囲では、以下の意味を有すると定義されるいくつかの用語について言及することにする。

本明細書で使用する専門用語は、特定の態様を説明することを目的としたにすぎず、本発明を限定することを意図したものではない。本明細書で使用する場合、単数形「a」、「an」および「the」は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数形をも含むことが意図される。

全ての数値表示、例えばpH、温度、時間、濃度、量、分子量は、範囲を含めて、適宜に、0.1もしくは1.0きざみで（＋）または（－）に変化する近似値である。必ずしも明示的に記載されているわけではないが、全ての数値表示は用語「約」により先行され得ることが理解されよう。また、必ずしも明示的に記載されているわけではないが、本明細書に記載された試薬は単なる例示であり、その等価物が当技術分野で公知であることも理解されよう。

「任意の」または「任意で」は、その後に記載される事象または状況が起こっても起こらなくてもよいことを意味し、この記載には、事象または状況が起こる場合と、それが起こらない場合とが含まれる。

用語「含む」は、前記組成物および方法が列挙された要素を含むが、他の要素を排除しないことを意味するものである。組成物および方法を定義するために使用するときの「から本質的になる」とは、指定された材料または工程、ならびに特許請求の範囲に記載の本発明の基本的かつ新規な特徴に実質的に影響を及ぼさないものを指す。「からなる」とは、痕跡量よりも多量の他の成分を排除し、記載された実質的な方法工程を意味するものとする。これらの移行語（transition term）の各々によって定義される態様は、本発明の範囲内である。

用語「ナチュラルキラー（NK）細胞」とは、特定の抗原刺激の非存在下で、かつMHCクラスによる拘束なしに、標的細胞を死滅させる免疫系の細胞を指す。標的細胞は、腫瘍細胞またはウイルス保有細胞であり得る。NK細胞は、CD56表面マーカーの存在およびCD3表面マーカーの非存在によって特徴付けられる。

用語「NK-92細胞」は、元来は非ホジキンリンパ腫の患者から得られたNK細胞株、NK-92を指す。本発明において、別段の指示がない限り、用語「NK-92」は、元のNK-92細胞株、ならびに（例えば、外因性遺伝子の導入により）改変されているNK-92細胞株、NK-92細胞のクローン、およびNK-92細胞を指すことを意図している。NK-92細胞ならびにその例示的かつ非限定的な改変型は、米国特許第7,618,817号、第8,034,332号、および第8,313,943号に記載されており、これらの全てはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。

本明細書で使用する用語「CD96を標的とした変更」とは、CD96タンパク質レベルの低下をもたらすNK-92細胞中のCD96のDNAまたはRNAの構造もしくは特性の変化、例えばCD96発現のノックアウトまたはノックダウンを指す。したがって、CD96を標的とした変更は、CD96遺伝子またはCD96遺伝子転写産物を標的とし得る。ヒトCD96タンパク質配列の例は、Uniprotein番号P40200で入手可能である。ヒトCD96は3番染色体上にあり、HGNCによって領域3q13.13-q13.2にマッピングされる。CD96は、Genome Reference Consortium Human Build 38 patch release 7（GRCh38.p7）アセンブリによれば、位置Chr 3 NC_000003.12 (111542079..111665996)にある。用語「CD96」はまた、CD96遺伝子によってコードされる、転写変異体2および3などの、アレル変異体をも包含する。

用語「CD96改変型NK-92細胞」は、CD96発現量の低下をもたらすCD96を標的とした変更を有するNK-92細胞を指す。遺伝的に改変されたNK-92細胞はさらに、他の遺伝的変更、例えばTIGIT発現を減少させる改変、または自殺遺伝子、Fc受容体もしくはキメラ抗原受容体（CAR）をコードするトランスジーンを含み得る。

用語「CD96非改変型NK-92細胞」は、CD96を標的とした変更のないNK-92細胞を指す。

本明細書で使用する用語「TIGITを標的とした変更」とは、TIGITタンパク質レベルの低下をもたらすNK-92細胞中のTIGITのDNAまたはRNAの構造もしくは特性の変化、例えばTIGIT発現のノックアウトまたはノックダウンを指す。したがって、TIGITを標的とした変更は、TIGIT遺伝子またはTIGIT遺伝子転写産物を標的とし得る。ヒトTIGITタンパク質配列の例は、Uniprotein番号Q495A1で入手可能である。ヒトTIGITは3番染色体上にあり、領域3q13. 31にマッピングされる。TIGITは、Genome Reference Consortium Human Build 38 patch release 7（GRCh38.p7）アセンブリによれば、chr3 NC_000003.12 (114293986..114310288)にある。用語「TIGIT」はまた、TIGIT染色体座位の遺伝子によってコードされる例示的な参照配列のアレル変異体をも包含する。

用語「TIGIT改変型NK-92細胞」は、TIGIT発現量の低下をもたらすTIGITを標的とした変更を有するNK-92細胞を指す。遺伝的に改変されたNK-92細胞はさらに、他の遺伝的変更、例えばCD96発現を減少させる改変、またはFc受容体、自殺遺伝子もしくはキメラ抗原受容体（CAR）をコードするトランスジーンを含み得る。

用語「TIGIT非改変型NK-92細胞」は、TIGITを標的とした変更のないNK-92細胞を指す。

用語「非照射NK-92細胞」は、照射されていないNK-92細胞を指す。照射は該細胞を成長および増殖できないようにする。いくつかの態様では、患者の治療に先立って、投与用のNK-92細胞を治療施設またはどこか他の場所で照射することが考えられる。というのは、最適な活性を維持するために、照射と注入の間の時間は4時間を超えないようにした方がよいからである。あるいは、NK-92細胞は別の機構によって不活性化されてもよい。

本明細書で使用される、NK-92細胞の「不活性化」は、それらが増殖できないようにする。不活性化はまた、NK-92細胞の死滅にも関連し得る。NK-92細胞は、それらが治療応用において病理に関連した細胞の生体外サンプルを効果的にパージした後で、あるいはそれらが哺乳動物の体内に存在する多くのまたは全ての標的細胞を効果的に死滅させるのに十分な時間体内に存在した後で、不活性化され得ることが想定される。不活性化は、非限定的な例として、NK-92細胞が感受性を示す不活性化剤を投与することによって誘導することができる。

本明細書で使用される用語「細胞傷害性」および「細胞溶解性」とは、NK細胞のようなエフェクター細胞の活性を記述するために使用する場合、同義であることが意図される。一般に、細胞傷害活性は、様々な生物学的、生化学的、または生物物理学的機構のいずれかによって標的細胞を死滅させることに関係する。細胞溶解は、より具体的には、該エフェクターが標的細胞の原形質膜を溶解し、それによってその物理的完全性を破壊するという活性を指す。それは結果的に標的細胞の死滅をもたらす。理論に拘束されるものではないが、NK細胞の細胞傷害効果は細胞溶解によるものであると考えられる。

細胞/細胞集団に関しての用語「死滅させる」は、その細胞/細胞集団の死につながるであろうあらゆる種類の操作を含むことが意図される。

用語「Fc受容体」は、Fc領域として知られる抗体の一部に結合することによって免疫細胞の防御機能に寄与する、特定の細胞（例えば、ナチュラルキラー細胞）の表面上に見出されるタンパク質を指す。細胞のFc受容体（FcR）への抗体のFc領域の結合は、抗体媒介食作用または抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ADCC）を介して細胞の食作用または細胞傷害活性を刺激する。FcRは、それらが認識する抗体のタイプに基づいて分類される。例えば、Fcガンマ受容体（FCγR）はIgGクラスの抗体に結合する。FCγRIII-A（CD16とも呼ばれる）は、IgG抗体に結合してADCCを活性化する低親和性Fc受容体である。FCγRIII-Aは典型的にはNK細胞上に見出される。

用語「ポリヌクレオチド」、「核酸」および「オリゴヌクレオチド」は交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはその類似体のいずれかのヌクレオチドの任意の長さのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造をとることができ、既知または未知の任意の機能を果たし得る。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、ESTまたはSAGEタグ）、エクソン、イントロン、メッセンジャーRNA（mRNA）、トランスファーRNA、リボソームRNA、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたDNA、任意の配列の単離されたRNA、核酸プローブおよびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体などの修飾ヌクレオチドを含むことができる。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリヌクレオチドのアセンブリの前または後に付与され得る。ヌクレオチドの配列には非ヌクレオチド成分が介在してもよい。ポリヌクレオチドは、重合の後に、例えば標識成分とのコンジュゲーションにより、さらに修飾することができる。この用語はまた、二本鎖分子と一本鎖分子の両方を指す。他に指定または要求されない限り、ポリヌクレオチドである本発明の任意の実施態様は、二本鎖形態と、二本鎖形態を構成することが知られるまたは予測される2本の相補的一本鎖形態の各々との両方を包含する。

ポリヌクレオチドは、4種のヌクレオチド塩基：アデニン(A)；シトシン(C)；グアニン(G)；チミン(T)；ポリヌクレオチドがRNAである場合はチミンに代えてウラシル(U)、の特定の配列から構成される。したがって、用語「ポリヌクレオチド配列」は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット表記である。

用語「同一性パーセント」は、2つのペプチド間または2つの核酸分子間の配列同一性を指す。同一性パーセントは、比較のためにアライメントされ得る各配列中の位置を比較することによって決定することができる。比較された配列中のある位置が同じ塩基またはアミノ酸で占められる場合、これらの分子はその位置で同一である。本明細書で使用する語句「相同性」もしくは「変異型」ヌクレオチド配列、または「相同性」もしくは「変異型」アミノ酸配列とは、少なくとも特定のパーセンテージの、ヌクレオチドレベルまたはアミノ酸レベルでの、同一性により特徴付けられる配列を指す。相同性ヌクレオチド配列は、本明細書に記載のヌクレオチド配列の天然に存在するアレル変異体および突然変異体をコードする配列を含む。相同性ヌクレオチド配列は、ヒト以外の哺乳動物種のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。相同性アミノ酸配列は、保存的アミノ酸置換を含みかつそのポリペプチドが同じ結合および/または活性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、相同性ヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、比較配列と少なくとも60％以上、例えば、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％以上を有する。いくつかの態様では、相同性ヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、比較配列と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％または99％の同一性を有する。いくつかの態様では、相同性アミノ酸配列は、15個以下、10個以下、5個以下または3個以下の保存的アミノ酸置換を有する。同一性パーセントは、例えば、Smith-Watermanアルゴリズム（Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482-489）を使用する、Gapプログラム（Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for UNIX, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.）により、デフォルト設定を用いて、決定することができる。

用語「発現する」は、RNAまたはタンパク質といった遺伝子産物が産生されることを指す。用語「一過性の発現」は、細胞のゲノムに組み込まれないポリヌクレオチドからの発現を指す。

用語「サイトカイン」は、免疫系の細胞に影響を与える一般的なクラスの生物学的分子を指す。本発明を実施する際に使用される例示的なサイトカインとしては、限定するものではないが、インターフェロンおよびインターロイキン（IL）、特にIL-2、IL-12、IL-15、IL-18およびIL-21が挙げられる。

用語「ベクター」は、例えば形質転換のプロセスによって、許容細胞内に配置されたときにベクターが複製され得るように、インタクトなレプリコンを含む非染色体性の核酸を指す。ベクターは、細菌などの、ある細胞型で複製することができるが、哺乳動物細胞などの、別の細胞で複製する能力は限られている。ベクターはウイルス性または非ウイルス性であり得る。核酸を送達するための例示的な非ウイルスベクターには、以下が含まれる：裸のDNA；単独でまたはカチオン性ポリマーとの組み合わせで、カチオン性脂質と複合体を形成したDNA；アニオン性およびカチオン性リポソーム；不均一なポリリシン、一定の長さのオリゴペプチド、ポリエチレンイミンなどのカチオン性ポリマーと縮合したDNAを含むDNA-タンパク質複合体および粒子であって、場合によっては、リポソーム内に含まれるもの；ならびにウイルスおよびポリリシン-DNAを含む三元複合体の使用。

用語「標的モチーフ」は、結合に必要な十分な条件が存在するという条件で、結合分子が結合するであろう核酸の一部を規定する核酸配列を指す。

用語「干渉RNA」は、標的遺伝子の発現をノックダウンすることを目的としたRNA干渉機構の誘導を生じさせることができる、二本鎖または一本鎖のRNA核酸分子を指す。

用語「患者」、「対象」、「個体」などは、本明細書では交換可能に使用され、本明細書に記載の方法に適している、インビトロまたはインサイチュを問わない任意の動物またはその細胞を指す。特定の非限定的な態様では、患者、対象、または個体はヒトである。

用語「レシピエント」は、治療中に、改変型または非改変型に関わらず、NK-92細胞を投与される患者を指す。

用語「治療する」または「治療」は、ヒトなどの対象における本明細書に記載の疾患または障害の治療を包含し、以下を含む：(i)疾患または障害を抑制すること、すなわち、その発症を阻止すること；(ii)疾患または障害を軽減すること、すなわち、障害の退縮を引き起こすこと；(iii)障害の進行を遅らせること；および/または(iv)疾患または障害の1つまたは複数の症状を抑制する、軽減する、またはその進行を遅らせること。

NK-92細胞などの治療物質を「投与する」またはそれらの「投与」という用語は、意図した機能を果たすために治療物質を導入または送達する任意の経路を含む。投与は、該物質の送達に適したどのような経路で行ってもよい。したがって、送達経路は、静脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下送達を含み得る。いくつかの態様では、NK-92細胞は、例えば腫瘍への注入によって、腫瘍に直接投与される。

用語「接触させる」（すなわち、ポリヌクレオチド配列を、CRISPR関連（Cas）タンパク質および/またはリボ核酸と接触させる）は、細胞内でCasタンパク質および/またはリボ核酸を一緒にインビトロでインキュベートすること（例えば、培養中の細胞にCasタンパク質またはCasタンパク質をコードする核酸を添加すること）を含むことを意図している。いくつかの態様では、用語「接触させる」は、微生物（すなわち、細菌）中に天然に存在し得る本明細書に開示のCasタンパク質および/またはリボ核酸への細胞のインビボ曝露を含むことを意図しない。標的ポリヌクレオチド配列を、本明細書に開示のCasタンパク質および/またはリボ核酸と接触させる段階は、任意の適切な方法で実施することができる。例えば、細胞を接着培養で、または懸濁培養で処理することができる。本明細書に開示のCasタンパク質および/またはリボ核酸と接触させた細胞は、同時に、またはその後、増殖因子もしくは分化誘導剤などの別の作用物質と、または細胞を安定化させるもしくは細胞をさらに分化させる環境と、接触させることもできることが理解されよう。

本明細書で使用する用語「ノックアウト」は、標的ポリヌクレオチド配列の機能を妨げるやり方で、標的ポリヌクレオチド配列の全部または一部を欠失することを含む。例えば、ノックアウトは、標的ポリヌクレオチド配列の機能性ドメインに欠失を誘導することにより標的ポリヌクレオチド配列を変更することによって達成することができる。当業者は、本明細書に記載される詳細に基づいて標的ポリヌクレオチド配列またはその一部をノックアウトするために、例えばCRISPR/Casシステム、ZFN、TALEN、TgAgoなどの、様々な遺伝的アプローチを使用する方法を容易に理解するであろう。

本明細書で使用する用語「ノックダウン」とは、発現を低下させる遺伝的改変を含まない対応する対照細胞における標的mRNAまたは対応タンパク質の発現と比較したときの、遺伝的に改変された細胞における標的mRNAまたは対応タンパク質の発現の測定可能な低下を指す。当業者は、本明細書に記載される詳細に基づいて標的ポリヌクレオチド配列またはその一部をノックダウンするために、例えばsiRNA、shRNA、マイクロRNA、アンチセンスRNA、または他のRNA媒介阻害技術などの、様々な遺伝的アプローチを使用する方法を容易に理解するであろう。

用語「減少する」、「低下した」、「低下」、および「減少」とは全て、基準レベルと比較して少なくとも10％の減少、例えば基準レベルと比較して、少なくとも約20％、もしくは少なくとも約30％、もしくは少なくとも約40％、もしくは少なくとも約50％、もしくは少なくとも約60％、もしくは少なくとも約70％、もしくは少なくとも約80％、もしくは少なくとも約90％、もしくは最大100％かつ100％含む（すなわち、基準サンプルと比較して、存在しないレベル）減少、または10～100％の間での減少を指すように本明細書で使用される。

用語「がん」は、白血病、リンパ腫、がん腫、および肉腫を含めて、哺乳動物に見られるあらゆる種類のがん、新生物、または悪性腫瘍を指す。例示的ながんとしては、脳腫瘍、乳がん、子宮頸がん、大腸がん、頭頸部がん、肝臓がん、腎臓がん、肺がん、非小細胞肺がん、メラノーマ、中皮腫、卵巣がん、肉腫、胃がん、子宮がん、および髄芽腫が挙げられる。さらなる例としては、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、卵巣がん、横紋筋肉腫、原発性血小板増加症、原発性マクログロブリン血症、原発性脳腫瘍、がん、悪性膵臓インスリノーマ、悪性カルチノイド、膀胱がん、前がん性皮膚病変、精巣がん、リンパ腫、甲状腺がん、神経芽細胞腫、食道がん、尿生殖器がん、悪性高カルシウム血症、子宮内膜がん、副腎皮質がん、膵臓内分泌腺および外分泌腺の新生物、前立腺がんなどがある。

NK-92細胞
NK-92細胞株は、非ホジキンリンパ腫と診断された50歳男性の末梢血単核球（PBMC）から樹立されたIL-2依存性のヒトNK細胞株である（Gong, et al., Leukemia. 8:652-8 (1994)）。NK-92細胞株は、CD56^bright、CD2、CD7、CD11a、CD28、CD45、およびCD54表面マーカーを発現するが、CD1、CD3、CD4、CD5、CD8、CD10、CD14、CD16、CD19、CD20、CD23およびCD34マーカーを提示しない。正常なNK細胞とは異なって、NK-92はほとんどのキラー細胞抑制性受容体（KIR）の発現を欠いている（Maki, et al., J Hematother Stem Cell Res. 10:369-83 (2001)）。全てのNK細胞によって発現される活性化機能と抑制能力を備えたKIR受容体であるKIR2DL4のみが、NK-92細胞の表面上に検出された。

培養下のNK-92細胞の増殖は、組換えインターロイキン-2（rIL-2）の存在に依存しており、1IU/mL程度の低用量でも増殖を維持するのに十分である。IL-7およびIL-12は長期増殖を支持しないし、IL-1α、IL-6、腫瘍壊死因子α、インターフェロンαおよびインターフェロンγを含めて、試験した他のサイトカイン類も支持しない。NK-92は、1：1の低いエフェクター：標的（E：T）比でさえも高い細胞傷害性を有する。Gong, et al., 前掲。

NK-92細胞には、限定するものではないが、例えば、米国特許第7,618,817号、第8,034,332号、および第8,313,943号、米国特許出願公開第2013/0040386号に記載されるものが含まれ、これらの全てはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。NK-92細胞は当業者に知られており、NantKwest社から容易に入手可能である。例示的なNK-92細胞株としては、野生型NK-92、NK-92-CD16、NK-92-CD16-γ、NK-92-CD16-ζ、NK-92-CD16(F176V)、NK-92MI、およびNK-92CIが挙げられる。

CD96の発現低下
本開示は、CD96の発現を阻害するCD96を標的とした変更を含むCD96改変型NK-92細胞を提供する。いくつかの態様では、CD96改変型NK-92細胞はCD96遺伝子の破壊によって作製される。CD96遺伝子を破壊する方法としては、限定するものではないが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、Taleエフェクタードメインヌクレアーゼ（TALEN）、およびCRISPR/Casシステムを利用する方法がある。

CRISPR
いくつかの態様では、CD96のノックアウトまたはノックダウンは、CRISPR/CAS方法論を用いて行われる。CRISPR/Casシステムは、Casタンパク質と、CD96遺伝子配列中の標的モチーフへとCasタンパク質を誘導しかつ標的モチーフにハイブリダイズすることができる少なくとも1～2つのリボ核酸とを含む。その後、Casタンパク質は標的モチーフを切断して、二本鎖切断または一本鎖切断の結果をもたらす。細胞内の標的ポリヌクレオチド配列を変更することができるCRISPR/Casシステムであれば、どれを使用してもよい。ある態様では、CRISPR/CasシステムはCRISPRタイプIシステムであり、ある態様では、CRISPR/CasシステムはCRISPRタイプIIシステムである。ある態様では、CRISPR/CasシステムはCRISPRタイプVシステムである。

本発明で使用されるCasタンパク質は、天然に存在するCasタンパク質またはその機能性誘導体であり得る。「機能性誘導体」は、それらが対応する天然配列ポリペプチドと共通の生物学的活性を有するという条件で、天然配列の断片ならびに天然配列ポリペプチドの誘導体およびその断片を含むが、これらに限定されない。本明細書で意図される生物学的活性は、DNA基質を断片へと加水分解する機能性誘導体の能力である。用語「誘導体」は、ポリペプチドのアミノ酸配列変異体、共有結合修飾体、およびその融合体、例えばCasタンパク質誘導体を包含する。Casポリペプチドまたはその断片の適切な誘導体には、Casタンパク質またはその断片の突然変異体、融合体、共有結合修飾体などがあるが、これらに限定されない。

いくつかの態様では、本発明で使用するCasタンパク質はCas9またはその機能性誘導体である。いくつかの態様では、Cas9タンパク質は化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）由来である。Cas9は、crRNAに相補的でない標的DNAを切断するRuvC様ドメインと、crRNAに相補的な標的DNAを切断するHNHヌクレアーゼドメインとを含む、2つのエンドヌクレアーゼドメインを含む。Cas9の二本鎖エンドヌクレアーゼ活性はまた、プロトスペーサー関連モチーフ（protospacer-associated motif：PAM）として知られる短い保存された配列（2～5ヌクレオチド）が標的配列中の標的モチーフのすぐ3'側に続くことが必要である。

いくつかの態様では、Casタンパク質はポリペプチドの形態でNK-92細胞に導入される。特定の態様では、Casタンパク質は、当技術分野において周知の細胞透過性ポリペプチドまたは細胞透過性ペプチドにコンジュゲートまたは融合され得る。細胞透過性ペプチドの非限定的な例には、Milletti F, Cell-penetrating peptides: classes, orgin and current landscape. Drug Discov. Today 17: 850-860, 2012に記載のものが含まれ、その関連する開示内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。場合によっては、非改変NK-92細胞がCasタンパク質を産生するように遺伝子操作される。

いくつかの態様では、Casタンパク質がガイドRNAによって誘導される標的遺伝子中の標的モチーフは、長さが17～23bpである。いくつかの態様では、標的モチーフは少なくとも20bpの長さである。いくつかの態様では、標的モチーフは20ヌクレオチドのDNA配列である。いくつかの態様では、標的モチーフは20ヌクレオチドのDNA配列であり、かつCasタンパク質によって認識されるプロトスペーサー関連モチーフ（PAM）として知られる短い保存配列のすぐ前にある。いくつかの態様では、PAMモチーフはNGGモチーフである。いくつかの態様では、標的遺伝子の標的モチーフはエクソン内にある。

いくつかの態様では、標的モチーフは、本発明のCRISPR/Casシステムのオフターゲット作用を最小にするように選択され得る。いくつかの態様では、標的モチーフは、細胞内の他の全てのゲノムヌクレオチド配列と比較したとき、それが少なくとも2つのミスマッチを含むように選択される。いくつかの態様では、標的モチーフは、細胞内の他の全てのゲノムヌクレオチド配列と比較したとき、それが少なくとも1つのミスマッチを含むように選択される。当業者であれば、オフターゲット作用を最小にするのに適切な標的モチーフを選択するために様々な技術が使用され得ることを理解するであろう（例えば、バイオインフォマティクス解析）。

Casタンパク質を標的遺伝子配列中の標的モチーフに誘導しかつその標的モチーフにハイブリダイズすることができるリボ核酸は、シングルガイドRNA（「sgRNA」）と呼ばれる。sgRNAは、当業者には理解されるように、使用する特定のCRISPR/Casシステムおよび標的ポリヌクレオチドの配列に応じて選択され得る。いくつかの態様では、該1～2つのリボ核酸はまた、標的ポリヌクレオチド配列以外の核酸配列とのハイブリダイゼーションを最小にするように選択され得る。いくつかの態様では、該1～2つのリボ核酸は、細胞内の他の全てのゲノムヌクレオチド配列と比較したとき、少なくとも2つのミスマッチを含む標的モチーフにハイブリダイズする。いくつかの態様では、該1～2つのリボ核酸は、細胞内の他の全てのゲノムヌクレオチド配列と比較したとき、少なくとも1つのミスマッチを含む標的モチーフにハイブリダイズする。いくつかの態様では、該1～2つのリボ核酸は、Casタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフに直接隣接した標的モチーフにハイブリダイズするように設計される。いくつかの態様では、該1～2つのリボ核酸のそれぞれは、標的モチーフ間に位置する変異アレルに隣接する、Casタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフに直接隣接した標的モチーフにハイブリダイズするように設計される。ガイドRNAはまた、例えばウェブサトイcrispr.mit.eduで、容易に入手可能なソフトウェアを用いて設計することもできる。1つまたは複数のsgRNAは、Casタンパク質が存在するNK-92細胞に、当技術分野で公知の方法に従って、トランスフェクションにより導入され得る。いくつかの態様では、CD96を標的とするsgRNAは、SEQ ID NO:1～4からなる群より選択される1つまたは複数のsgRNAである。

遺伝子発現を低下させるためにCRISPR/Casシステムを使用する方法は、種々の刊行物、例えば米国特許出願公開第2014/0170753号に記載されており、その開示内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。

ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）
いくつかの態様では、CD96を標的とした変更を含む改変型NK-92細胞は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）を用いて、NK-92細胞中のCD96をノックアウトすることによって作製される。ZFNは、FokIエンドヌクレアーゼの非特異的切断ドメイン（N）とジンクフィンガータンパク質（ZFP）を含む融合タンパク質である。標的遺伝子中の特定の座位を認識するためには1対のZNFが関わっており、一方は改変される部位の上流の配列を認識し、他方は下流の配列を認識する。そしてZFNのヌクレアーゼ部分がその特定の座位で切断して、標的CD96遺伝子のノックアウトを引き起こす。遺伝子発現を低下させるためにZFNを使用する方法は周知であり、例えば、米国特許第9,045,763号に、さらにDurai et al., 「Zinc Finger Nucleases: Custom-Designed Molecular Scissors for Genome Engineering of Plant and Mamalian cells」, Nucleic Acid Research 33 (18):5978-5990 (2005)にも開示されており、それらの開示内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。

転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）
いくつかの態様では、標的とした変更を含むCD96改変型NK-92細胞は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）を用いて、CD96をノックアウトすることによって作製される。TALENは、それらがゲノム部位付近に1対として結合して、特定の部位でゲノムを切断するように同じ非特異的ヌクレアーゼFoKIを誘導するという点でZFNと類似するが、DNAトリプレットを認識する代わりに、各ドメインは単一のヌクレオチドを認識する。遺伝子発現を低下させるためにZFNを使用する方法もまた周知であり、例えば、米国特許第9,005,973号に、さらにChristian et al. 「Targeting DNA Double-Strand Breaks with TAL Effector Nulceases」, Genetics 186(2): 757-761 (2010)にも開示されており、それらの開示内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。

NK-92細胞におけるCD96発現のノックダウン
いくつかの態様では、標的とした変更を含むCD96改変型NK-92細胞は、干渉RNAでCD96をノックダウンすることによって作製される。干渉RNAは、インビボで導入されると、他のタンパク質とRNA誘導サイレンシング複合体（「RISC」）を形成して、RNA干渉（RNAi）として知られるプロセスを開始する。RNAiプロセスの間、RISCは一本鎖干渉RNAまたは二本鎖干渉RNAの一方の鎖を取り込む。取り込まれた鎖は、RISCが相補的mRNA転写産物を認識する鋳型として作用する。相補的mRNAが同定されると、RISCのタンパク質成分が活性化してmRNAを切断し、その結果、標的遺伝子発現のノックダウンが生じる。標的遺伝子の発現をノックダウンするために使用される干渉RNA分子の非限定的な例には、siRNA、短鎖ヘアピン型RNA（shRNA）、一本鎖干渉RNA、およびマイクロRNA（miRNA）が含まれる。これらの干渉RNAを使用する方法は当業者に周知である。

一態様では、干渉RNAはsiRNAである。siRNAは、典型的には30ヌクレオチド長未満の二本鎖RNAである。siRNAによる遺伝子サイレンシングは、siRNAの一方の鎖がRNA誘導サイレンシング複合体（RISC）として知られるリボ核タンパク質複合体に取り込まれることから開始する。RISCに取り込まれた鎖は、取り込まれたsiRNA鎖に少なくとも部分的に相補的なmRNA分子を同定し、その後RISCがこれらの標的mRNAを切断するか、またはそれらの翻訳を阻害する。

一態様では、干渉RNAはマイクロRNAである。マイクロRNAは小さな非コードRNA分子であり、それはmRNA分子内の相補的配列とハイブリダイズすることができ、その結果、mRNAの切断、またはそのポリ（A）尾部の短縮によるmRNAの不安定化をもたらす。

一態様では、干渉RNAは一本鎖干渉RNAである。この一本鎖もまた、二本鎖siRNAより効率は劣るものの、二本鎖siRNAと同様の方法でmRNAサイレンシングをもたらすことができる。一本鎖干渉RNAは、典型的には、上記の二本鎖siRNAの場合と同様に、約19～約49ヌクレオチドの長さを有する。

短鎖ヘアピン型RNAまたは低分子ヘアピン型RNA（shRNA）は、タイトなヘアピンターンを持つ人工的なRNA分子であり、それが細胞内で生成するsiRNAを介して標的遺伝子発現をサイレンシングするために使用され得る。細胞内でのshRNAの発現は、典型的には、プラスミドの送達によって、またはウイルスもしくは細菌のベクターを介して達成される。適切なベクターには、アデノ随伴ウイルス（AAV）、アデノウイルス、およびレンチウイルスが含まれるが、これらに限定されない。shRNAは、それが比較的低い分解率および代謝回転を有するという点で、siRNAの有利なメディエーターである。

本発明で使用される干渉RNAは、1つまたは複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換または修飾によって天然のRNAとは異なり得る。非ヌクレオチド材料が干渉RNAにその5'末端、3'末端、または内部のいずれかで結合されていてもよい。天然に存在するRNAと比較して干渉RNAが含み得る修飾の非限定的な例は、米国特許第8,399,653号に開示されており、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。そうした修飾は一般に、以下を目的として設計される：干渉RNAのヌクレアーゼ耐性を増大させる；細胞への取り込みを改善する；細胞ターゲティングを高める；干渉RNAの追跡を助ける；安定性をさらに改善する；またはインターフェロン経路の活性化の可能性を低減させる。例えば、干渉RNAはオーバーハングの末端にプリンヌクレオチドを含むことができる。ピロリジンリンカーによるsiRNA分子のセンス鎖の3'末端へのコレステロールのコンジュゲーションもまた、例えば、siRNAに安定性を付与する。

本発明で使用される干渉RNAは、典型的には約10～60、10～50、または10～40（二本鎖）ヌクレオチドの長さであり、より典型的には約8～15、10～30、10～25、または10～25（二本鎖）ヌクレオチドの長さ、約10～24（二本鎖）ヌクレオチドの長さである（例えば、二本鎖siRNAの各相補的配列は10～60、10～50、10～40、10～30、10～25、または10～25ヌクレオチドの長さ、約10～24、11～22、または11～23ヌクレオチドの長さであり、二本鎖siRNAは約10～60、10～50、10～40、10～30、10～25、または10～25塩基対の長さである）。

RNAiの対象となる遺伝子中の標的モチーフを選択するための技術は、当業者に公知であり、例えば、Tuschl, T. et al.,「The siRNA User Guide」, 2004年5月6日改訂、ロックフェラー大学ウェブサイトで入手可能；Technical Bulletin #506, 「siRNA Design Guidelines」, Ambion社、Ambionウェブサイト；および他のウェブベースの設計ツール、例えば、Invitrogen、Dharmacon、Integrated DNA Technologies、Genscript、またはProligoウェブサイトで入手可能である。初期検索パラメータは、G/C含有量35～55％およびsiRNA長さ19～27ヌクレオチドを含み得る。標的配列は、mRNAのコード領域または5'もしくは3'非翻訳領域に位置し得る。その標的配列を使用して、本明細書に記載されるような干渉RNA分子を誘導することができる。

ノックアウトまたはノックダウンの効率は、当技術分野において周知の方法、例えば、定量的PCR、ウェスタンブロット、フローサイトメトリーなどを用いて、CD96 mRNAまたはタンパク質の量を測定することによって評価することができる。いくつかの態様では、ノックアウトまたはノックダウンの効率を評価するために、CD96タンパク質のレベルが評価される。特定の態様では、標的遺伝子の発現低下の効率は、CD96を標的とした変更を有さない対応するNK-92細胞と比較して、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも50％、少なくとも60％、もしくは少なくとも80％、もしくは少なくとも90％、またはそれ以上である。ある態様では、該低下の効率は約10％～約90％である。ある態様では、該低下の効率は約30％～約80％である。ある態様では、該低下の効率は約50％～約80％である。いくつかの態様では、該低下の効率は約80％以上である。

TIGITの発現低下
本開示はさらに、TIGITの発現を阻害するTIGITを標的とした変更を含むTIGIT改変型NK-92細胞を提供する。いくつかの態様では、TIGIT改変型NK-92細胞はTIGIT遺伝子の破壊によって作製される。TIGIT遺伝子を破壊する方法としては、限定するものではないが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、Taleエフェクタードメインヌクレアーゼ（TALEN）、およびCRISPR/Casシステムを利用する方法がある。

CRISPR
いくつかの態様では、TIGITのノックアウトまたはノックダウンは、CRISPR/CAS方法論を用いて行われる。CRISPR/Casシステムは、Casタンパク質と、TIGIT遺伝子配列中の標的モチーフへとCasタンパク質を誘導しかつ標的モチーフにハイブリダイズすることができる少なくとも1～2つのリボ核酸とを含む。その後、Casタンパク質は標的モチーフを切断して、二本鎖切断または一本鎖切断の結果をもたらす。細胞内の標的ポリヌクレオチド配列を変更することができるCRISPR/Casシステムであれば、どれを使用してもよい。ある態様では、CRISPR/CasシステムはCRISPRタイプIシステムであり、ある態様では、CRISPR/CasシステムはCRISPRタイプIIシステムである。ある態様では、CRISPR/CasシステムはCRISPRタイプVシステムである。

本発明で使用されるCasタンパク質は、天然に存在するCasタンパク質またはその機能性誘導体であり得る。「機能性誘導体」は、それらが対応する天然配列ポリペプチドと共通の生物学的活性を有するという条件で、天然配列の断片ならびに天然配列ポリペプチドおよびその断片の誘導体を含むが、これらに限定されない。本明細書で意図される生物学的活性は、DNA基質を断片へと加水分解する機能性誘導体の能力である。用語「誘導体」は、ポリペプチドのアミノ酸配列変異体、共有結合修飾体、およびその融合体、例えばCasタンパク質の誘導体を包含する。Casポリペプチドまたはその断片の適切な誘導体には、Casタンパク質またはその断片の突然変異体、融合体、共有結合修飾体などがあるが、これらに限定されない。

いくつかの態様では、本発明で使用するCasタンパク質はCas9またはその機能性誘導体である。いくつかの態様では、Cas9タンパク質は化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）由来である。Cas9は、crRNAに相補的でない標的DNAを切断するRuvC様ドメインと、crRNAに相補的な標的DNAを切断するHNHヌクレアーゼドメインとを含む、2つのエンドヌクレアーゼドメインを含む。Cas9の二本鎖エンドヌクレアーゼ活性はまた、プロトスペーサー関連モチーフ（protospacer-associated motif：PAM）として知られる短い保存配列（2～5ヌクレオチド）が標的配列中の標的モチーフのすぐ3'側に続くことを必要とする。

いくつかの態様では、Casタンパク質はポリペプチドの形態でNK-92細胞に導入される。特定の態様では、Casタンパク質は、当技術分野において周知の細胞透過性ポリペプチドまたは細胞透過性ペプチドにコンジュゲートまたは融合され得る。細胞透過性ペプチドの非限定的な例には、Milletti F, 「Cell-penetrating peptides: classes, orgin and current landscape.」 Drug Discov. Today 17: 850-860, 2012に記載のものが含まれ、その関連する開示内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。場合によっては、未改変のNK-92細胞がCasタンパク質を産生するように遺伝子操作される。

いくつかの態様では、標的モチーフは、本発明のCRISPR/Casシステムのオフターゲット作用を最小にするように選択され得る。いくつかの態様では、標的モチーフは、細胞内の他の全てのゲノムヌクレオチド配列と比較したとき、それが少なくとも2つのミスマッチを含むように選択される。いくつかの態様では、標的モチーフは、細胞内の他の全てのゲノムヌクレオチド配列と比較したとき、それが少なくとも1つのミスマッチを含むように選択される。当業者には理解されるように、オフターゲット作用を最小にするために、様々な技術を使用して適切な標的モチーフを選択することが可能である（例えば、バイオインフォマティクス解析）。

Casタンパク質を標的遺伝子配列中の標的モチーフに誘導しかつその標的モチーフにハイブリダイズすることができるリボ核酸は、シングルガイドRNA（「sgRNA」）と呼ばれる。sgRNAは、当業者には理解されるように、使用する特定のCRISPR/Casシステムおよび標的ポリヌクレオチドの配列に応じて選択することができる。いくつかの態様では、該1～2つのリボ核酸はまた、標的ポリヌクレオチド配列以外の核酸配列とのハイブリダイゼーションを最小にするように選択され得る。いくつかの態様では、該1～2つのリボ核酸は、細胞内の他の全てのゲノムヌクレオチド配列と比較したとき、少なくとも2つのミスマッチを含む標的モチーフにハイブリダイズする。いくつかの態様では、該1～2つのリボ核酸は、細胞内の他の全てのゲノムヌクレオチド配列と比較したとき、少なくとも1つのミスマッチを含む標的モチーフにハイブリダイズする。いくつかの態様では、該1～2つのリボ核酸は、Casタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフに直接隣接した標的モチーフにハイブリダイズするように設計される。いくつかの態様では、該1～2つのリボ核酸のそれぞれは、標的モチーフ間に位置する変異アレルに隣接するCasタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフに直接隣接した標的モチーフにハイブリダイズするように設計される。ガイドRNAはまた、例えばウエブサイトcrispr.mit.eduで、容易に入手可能なソフトウェアを用いて設計することもできる。1つまたは複数のsgRNAは、Casタンパク質が存在するNK-92細胞に、当技術分野で公知の方法に従って、トランスフェクションにより導入され得る。いくつかの態様では、TIGITを標的とするsgRNAは、SEQ ID NO:5～8からなる群より選択される1つまたは複数のsgRNAである。

遺伝子発現を低下させるためにCRISPR/Casシステムを使用する方法は、種々の刊行物、例えば米国特許公開第2014/0170753号に記載されており、その開示内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。

ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）
いくつかの態様では、TIGITを標的とした変更を含む改変型NK-92細胞は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）を用いて、NK-92細胞中のTIGITをノックアウトすることによって作製される。ZFNは、FokIエンドヌクレアーゼの非特異的切断ドメイン（N）とジンクフィンガータンパク質（ZFP）を含む融合タンパク質である。標的遺伝子中の特定の座位を認識するためには1対のZNFが関わっており、一方は改変される部位の上流の配列を認識し、他方は下流の配列を認識する。そしてZFNのヌクレアーゼ部分がその特定の座位で切断して、標的TIGIT遺伝子のノックアウトを引き起こす。遺伝子発現を低下させるためにZFNを使用する方法は周知であり、例えば、米国特許第9,045,763号に、さらにDurai et al., 「Zinc Finger Nucleases: Custom-Designed Molecular Scissors for Genome Engineering of Plant and Mamalian cells」 Nucleic Acid Research 33 (18):5978-5990 (2005)にも開示されており、それらの開示内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。

転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）
いくつかの態様では、標的とした変更を含むTIGIT改変型NK-92細胞は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）を用いて、TIGITをノックアウトすることによって作製される。TALENは、それがゲノム部位付近に1対として結合し、同じ非特異的ヌクレアーゼFoKIを特定の部位でゲノムを切断するように誘導するという点でZFNと類似するが、DNAトリプレットを認識する代わりに、各ドメインは単一のヌクレオチドを認識する。遺伝子発現を低下させるためにZFNを使用する方法もまた周知であり、例えば、米国特許第9,005,973号に、さらにChristian et al. 「Targeting DNA Double-Strand Breaks with TAL Effector Nulceases」 Genetics 186(2): 757-761 (2010)にも開示されており、それらの開示内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。

NK-92細胞におけるTIGIT発現のノックダウン
いくつかの態様では、標的とした改変を含むTIGIT改変型NK-92細胞は、干渉RNAで1つのTIGITをノックダウンすることによって作製される。干渉RNAは、インビボで導入されると、他のタンパク質とRNA誘導サイレンシング複合体（「RISC」）を形成して、RNA干渉（RNAi）として知られるプロセスを開始する。RNAiプロセスの間、RISCは一本鎖干渉RNAまたは二本鎖干渉RNAの一方の鎖を取り込む。取り込まれた鎖は、RISCが相補的mRNA転写産物を認識する鋳型として作用する。相補的mRNAが同定されると、RISCのタンパク質成分が活性化してmRNAを切断し、その結果、標的遺伝子発現のノックダウンが生じる。標的遺伝子の発現をノックダウンするために使用される干渉RNA分子の非限定的な例には、siRNA、短鎖ヘアピン型RNA（shRNA）、一本鎖干渉RNA、およびマイクロRNA（miRNA）が含まれる。これらの干渉RNAを使用する方法は当業者に周知である。

一態様では、干渉RNAはsiRNAである。siRNAは、典型的には30ヌクレオチド長未満の二本鎖RNAである。siRNAによる遺伝子サイレンシングは、siRNAの一方の鎖がRNA誘導サイレンシング複合体（RISC）として知られるリボ核タンパク質複合体に取り込まれることから開始する。RISCに取り込まれた鎖は、取り込まれたsiRNA鎖に少なくとも部分的に相補的なmRNA分子を同定し、その後RISCはこれらの標的mRNAを切断するか、またはそれらの翻訳を阻害する。

一態様では、干渉RNAはマイクロRNAである。マイクロRNAは小さな非コードRNA分子であり、それはmRNA分子内の相補的配列とハイブリダイズすることができ、その結果、mRNAの切断、またはそのポリ（A）テールの短縮によるmRNAの不安定化をもたらす。

短鎖ヘアピン型RNAまたは低分子ヘアピン型RNA（shRNA）は、細胞内で生成されるsiRNAを介した標的遺伝子発現のサイレンシングに使用することができる、タイトなヘアピンターンをもつ人工RNA分子である。細胞内でのshRNAの発現は、典型的には、プラスミドの送達によって、またはウイルスもしくは細菌のベクターを介して達成される。適切なベクターには、アデノ随伴ウイルス（AAV）、アデノウイルス、およびレンチウイルスが含まれるが、これらに限定されない。shRNAは、それが比較的低い分解速度および代謝回転を有するという点で、siRNAの有利なメディエーターである。

本明細書で使用される干渉RNAは、1つまたは複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換または修飾によって天然のRNAとは異なり得る。非ヌクレオチド材料が5'末端、3'末端、または内部のいずれかで干渉RNAに結合していてもよい。天然に存在するRNAと比較して干渉RNAが含み得る修飾の非限定的な例は、米国特許第8,399,653号に開示されており、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。そうした修飾は一般に、以下を目的として設計される：干渉RNAのヌクレアーゼ耐性を増大させる；細胞への取り込みを改善する；細胞ターゲティングを高める；干渉RNAの追跡を助ける；安定性をさらに改善する；またはインターフェロン経路の活性化の可能性を低減させる。例えば、干渉RNAはオーバーハングの末端にプリンヌクレオチドを含み得る。ピロリジンリンカーによるsiRNA分子のセンス鎖の3'末端へのコレステロールのコンジュゲーションもまた、例えば、siRNAに安定性を付与する。

本明細書で使用される干渉RNAは、典型的には約10～60、10～50、または10～40（二本鎖）ヌクレオチドの長さであり、より典型的には約8～15、10～30、10～25、または10～25（二本鎖）ヌクレオチドの長さ、約10～24（二本鎖）ヌクレオチドの長さである（例えば、二本鎖siRNAの各相補的配列は10～60、10～50、10～40、10～30、10～25、または10～25ヌクレオチドの長さ、約10～24、11～22、または11～23ヌクレオチドの長さであり、二本鎖siRNAは約10～60、10～50、10～40、10～30、10～25、または10～25塩基対の長さである）。

RNAiの対象となる遺伝子中の標的モチーフを選択するための技術は、当業者に公知であり、例えば、2004年5月6日に改訂されたTuschl, T. et al.,「The siRNA User Guide」に開示されており、ロックフェラー大学ウェブサイト；Technical Bulletin #506, 「siRNA Design Guidelines,」Ambion社, Ambionウェブサイト；および他のウェブベースの設計ツール、例えばInvitrogen、Dharmacon、Integrated DNA Technologies、Genscript、またはProligoウェブサイトで入手可能である。初期検索パラメータは、G/C含有量35～55％およびsiRNA長さ19～27ヌクレオチドを含み得る。標的配列は、mRNAのコード領域または5'もしくは3'非翻訳領域に位置し得る。その標的配列を使用して、本明細書に記載のものなどの干渉RNA分子を誘導することができる。

ノックアウトまたはノックダウンの効率は、当技術分野において周知の方法、例えば、定量的PCR、ウェスタンブロット、フローサイトメトリーなどを用いて、TIGIT mRNAまたはタンパク質の量を測定することによって評価することができる。いくつかの態様では、ノックアウトまたはノックダウンの効率を評価するために、TIGITタンパク質のレベルが評価される。特定の態様では、標的遺伝子の発現低下の効率は、TIGITを標的とした変更を有さない対応するNK-92細胞と比較して、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも50％、少なくとも60％、もしくは少なくとも80％、もしくは少なくとも90％、またはそれ以上である。ある態様では、該低下の効率は約10％～約90％である。ある態様では、該低下の効率は約30％～約80％である。ある態様では、該低下の効率は約50％～約80％である。いくつかの態様では、該低下の効率は約80％以上である。

CD96およびTIGITの発現が低下するように改変されたNK-92細胞
さらなる局面において、本明細書では、CD96発現を低下または排除するためのCD96を標的とした変更とTIGIT発現を低下または排除するためのTIGITを標的とした変更を含むNK-92細胞を提供する。そのような細胞は、CD96を標的とした変更またはTIGITを標的とした変更に関して個別に上述したように作製することができる。

CD226発現が低下するように改変されたNK-92細胞
いくつかの態様において、本明細書では、例えば実施例のセクションに記載されるような比較実験で使用するために、CD226発現が低下するように遺伝的に改変された改変型NK-92細胞を提供する。いくつかの態様では、そのような改変型NK-92細胞は、CD226発現を低下または排除するためのCD226を標的とした変更を含む。そのような細胞は、CD96またはTIGITの発現が低下するように改変されたNK-92細胞に関して上述した技術のいずれかを用いて作製することができる。例示的な方法、およびそのような方法を用いて作製された細胞は、本出願の「実施例」のセクションに記載される。

さらなる改変
Fc受容体
いくつかの態様では、CD96を標的とした変更またはTIGITを標的とした変更を含むNK-92細胞は、細胞表面上にFc受容体を発現するようにさらに改変される。例えば、さらなる改変型NK-92細胞がモノクローナル抗体と共に投与されるいくつかの態様では、Fc受容体は、ADCCを介して標的細胞を死滅させる抗体と協調してNK細胞が機能することを可能にする。いくつかの態様では、Fc受容体はIgG Fc受容体FcγRIIIである。

Fc受容体の非限定的な例を以下に提供する。これらのFc受容体は、それらの好ましいリガンド、親和性、発現、および抗体に結合した後の効果の点で異なっている。

（表１）例示的なFc受容体

いくつかの態様では、Fc受容体はCD16である。いくつかの態様では、Fc受容体は、SEQ ID NO:13に記載の例示的なヒトCD16ポリペプチド配列の前駆体型に対して番号付けされた、176位にバリンが存在するCD16の高親和性形態である。いくつかの態様では、該CD16は、SEQ ID NO:13のアミノ酸19～254に対して少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、または少なくとも95％の同一性を有し、かつSEQ ID NO:13を参照して番号付けされた176位にバリンを含む。

キメラ抗原受容体
いくつかの態様では、CD96改変型NK-92細胞またはTIGIT改変型NK-92細胞は、細胞表面にキメラ抗原受容体（CAR）を発現するようにさらに操作される。任意で、CARは腫瘍特異的抗原に対して特異的である。腫瘍特異的抗原は、非限定的な例として、US 2013/0189268、WO 1999024566 A1、US 7098008、およびWO 2000020460 A1に記載されており、それらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。腫瘍特異的抗原としては、NKG2D、CS1、GD2、CD138、EpCAM、EBNA3C、GPA7、CD244、CA-125、ETA、MAGE、CAGE、BAGE、HAGE、LAGE、PAGE、NY-SEO-1、GAGE、CEA、CD52、CD30、MUC5AC、c-Met、EGFR、FAB、WT-1、PSMA、NY-ESO1、AFP、CEA、CTAG1B、CD19およびCD33が挙げられるが、これらに限定されない。さらなる非限定的な腫瘍関連抗原およびそれらに関連する悪性腫瘍は、表2に見出すことができる。

（表２）腫瘍特異的抗原および関連する悪性腫瘍

いくつかの態様では、CARはCD19、CD33またはCSPG-4を標的とする。いくつかの態様では、CARは特定のがんの種類に関連する抗原を標的とする。例えば、そのがんは、以下からなる群より選択することができる：白血病［例えば、急性白血病（例：急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病（例：骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、赤白血病））および慢性白血病（例：慢性骨髄性（顆粒球性）白血病、および慢性リンパ性白血病）］、真性赤血球増加症、リンパ腫（例：ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、固形腫瘍、例えば、限定するものではないが、肉腫およびがん腫、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸がん、膵臓がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮がん、基底細胞がん、腺がん、汗腺がん、皮脂腺がん、乳頭がん、乳頭腺がん、嚢胞腺がん、髄様がん、気管支原性がん、腎細胞がん、肝がん、胆管がん、絨毛がん、セミノーマ、胚性がん腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、肺がん、小細胞肺がん、膀胱がん、上皮がん、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽細胞腫および網膜芽腫。

CARは、例えば、特許公開番号WO 2014039523、US 20140242701、US 20140274909、US 20130280285、およびWO 2014099671に記載されるように操作され得る；それらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。任意で、該CARはCD19 CAR、CD33 CARまたはCSPG-4 CARである。

サイトカイン
いくつかの態様では、本発明は、少なくとも1つのサイトカインを発現するようにさらに改変されたCD96改変型NK-92細胞およびTIGIT改変型NK-92細胞を提供する。そのような細胞では、細胞内のサイトカインの発現を小胞体に向かわせることができる。いくつかの態様では、少なくとも1つのサイトカインは、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21またはその変異体である。一態様では、サイトカインはIL-2である。特定の態様では、IL-2は、小胞体に標的指向される変異体である。

一態様において、IL-2は、IL-2を小胞体に向かわせるシグナル配列と共に発現される。理論に拘束されるべきではないが、IL-2を小胞体に向かわせることは、オートクリン活性化に十分なレベルでのIL-2の発現を可能にするが、IL-2を細胞外に放出することはない。Konstantinidis et al 「Targeting IL-2 to the endoplasmic reticulum confines autocrine growth stimulation to NK-92 cells」 Exp Hematol. 2005 Feb;33(2):159-64を参照されたい。

いくつかの態様では、自殺遺伝子をCD96改変型またはTIGIT改変型NK-92細胞に挿入して、該細胞の未制御の増殖を防止することもできる。いくつかの態様では、自殺遺伝子はicaspase 9である。

トランスジーン発現
本開示には、上記のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、例えば、Casタンパク質、CD16、Fc受容体、CAR、および/またはIL-2と顕著な配列同一性を共有する配列も含まれる。こうした配列もまた、非改変型NK-92細胞に導入することができる。いくつかの態様では、該配列は、それらのそれぞれの天然配列に対して少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも88％、少なくとも95％、少なくとも98％、または少なくとも99％の配列同一性を有する。

トランスジーン（例えば、Casタンパク質、CD16、Fc受容体、CAR、および/またはIL-2）は、当業者に公知のいずれかの機構によって発現プラスミドに導入され得る。トランスジーンは同じまたは異なる発現プラスミドに導入することができる。好ましい態様では、これらのトランスジーンは同じプラスミドで発現される。

トランスジーンは、例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション、ヌクレオフェクション、または「遺伝子銃」などの、当技術分野で公知の一過性トランスフェクション法を用いてNK-92細胞に導入することができる。

これらのトランスジーンを発現させるために、いくつものベクターを使用することができる。ある態様では、ベクターはレトロウイルスベクターである。ある態様では、ベクターはプラスミドベクターである。使用できる他のウイルスベクターには、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、ポックスウイルスベクターなどが含まれる。

併用療法
いくつかの態様では、本開示のCD96改変型またはTIGIT改変型NK-92細胞は、治療用抗体および/または他の抗がん剤と組み合わせて使用される。治療用抗体を用いて、感染している細胞またはがん関連マーカーを発現している細胞を標的とすることができる。がん治療用のモノクローナル抗体の例を表3に示す。

（表３）例示的な治療用モノクローナル抗体

抗体は多くの作用機序を通してがんを治療し得る。FcRをも発現する本開示のCD96改変型またはTIGIT改変型NK細胞などの免疫細胞が、CD16のようなFc受容体を介して、標的細胞に結合している抗体に結合すると、抗体依存性細胞傷害（ADCC）が起こる。したがって、いくつかの態様では、FcRを発現するCD96改変型またはTIGIT改変型NK-92細胞は、特定のがん関連タンパク質に対する抗体と一緒に患者に投与される。このようなNK-92細胞の投与は、モノクローナル抗体の投与と同時に、または逐次的に実施することができる。いくつかの態様では、対象をモノクローナル抗体で治療した後に、その対象に該NK-92細胞を投与する。あるいは、CD96改変型またはTIGIT改変型NK-92細胞を、モノクローナル抗体と同時に、例えば24時間以内に、投与することができる。

いくつかの態様では、CD96改変型またはTIGIT改変型NK-92細胞は静脈内に投与される。いくつかの態様では、そのような改変型NK-92細胞は骨髄に直接注入され得る。

治療
本明細書に記載のCD96改変型またはTIGIT改変型NK-92細胞で患者を治療する方法も提供される。いくつかの態様では、患者はがんまたは感染症に罹患している。上述したように、CD96改変型またはTIGIT改変型NK-92細胞は、患者のがん細胞の表面に発現される抗原を標的とするCARを発現するようにさらに改変され得る。いくつかの態様では、上記で説明したように、CD96改変型またはTIGIT改変型NK-92細胞はまた、Fc受容体、例えばCD16、を発現させることもできる。本明細書に開示するさらなる態様では、患者はCD96改変型またはTIGIT改変型NK-92細胞および抗体で治療される。

改変型NK-92細胞は、細胞の絶対数で個体に投与することができ、例えば、約1000個/注入から約100億個/注入までの細胞を該個体に投与することができ、例えば、注入1回あたり約、少なくとも約、または多くとも約、1×10⁸、1×10⁷、5×10⁷、1×10⁶、5×10⁶、1×10⁵、5×10⁵、1×10⁴、5×10⁴、1×10³、5×10³個（など）のNK-92細胞、またはいずれか2つの数値間の任意の範囲（両端を含む）で投与することができる。

他の態様では、約1000個/注入/m²から約100億個/注入/m²までの細胞を前記個体に投与することができ、例えば、注入1回あたり約、少なくとも約、または多くとも約、1×10⁸個/m²、1×10⁷個/m²、5×10⁷個/m²、1×10⁶個/m²、5×10⁶個/m²、1×10⁵個/m²、5×10⁵個/m²、1×10⁴個/m²、5×10⁴個/m²、1×10³個/m²、5×10³個/m²（など）のNK-92細胞、またはいずれか2つの数値間の任意の範囲（両端を含む）で投与することができる。

他の態様では、改変型NK-92細胞は細胞の相対数で前記個体に投与することができ、例えば、個体1キログラムあたり約1000個から約100億個までの細胞を該個体に投与することができ、例えば、個体1キログラムあたり約、少なくとも約、または多くとも約、1×10⁸、1×10⁷、5×10⁷、1×10⁶、5×10⁶、1×10⁵、5×10⁵、1×10⁴、5×10⁴、1×10³、5×10³個（など）のNK-92細胞、またはいずれか2つの数値間の任意の範囲（両端を含む）で投与することができる。

他の態様では、総用量は、体表面積1m²によって算出され、例えば、1m²あたり約1×10¹¹、1×10¹⁰、1×10⁹、1×10⁸、1×10⁷個、またはいずれか2つの数値間の任意の範囲（両端を含む）を含む。平均的な人は約1.6～約1.8m²である。好ましい態様では、約10億～約30億個のNK-92細胞が患者に投与される。他の態様では、1回あたりに注入されるNK-92細胞の量は、体表面積m²によって計算され、例えば、1m²あたり1×10¹¹、1×10¹⁰、1×10⁹、1×10⁸、1×10⁷個を含む。平均的な人は1.6～1.8m²である。

改変型NK-92細胞と、任意で他の抗がん剤は、がん患者に1回投与することができ、または治療の間に複数回、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22もしくは23時間ごとに1回、または1、2、3、4、5、6もしくは7日ごとに1回、または1、2、3、4、5、6、7、8、9、10週もしくはそれ以上ごとに1回、またはいずれか2つの数値間の任意の範囲（両端を含む）ごとに1回投与することができる。

いくつかの態様では、CD96改変型またはTIGIT改変型NK-92細胞は、改変型NK-92細胞および媒体、例えばヒト血清またはその同等物、を含む組成物として投与される。いくつかの態様では、媒体はヒト血清アルブミンを含む。いくつかの態様では、媒体はヒト血漿を含む。いくつかの態様では、媒体は約1％～約15％のヒト血清またはヒト血清同等物を含む。いくつかの態様では、媒体は約1％～約10％のヒト血清またはヒト血清同等物を含む。いくつかの態様では、媒体は約1％～約5％のヒト血清またはヒト血清同等物を含む。好ましい態様では、媒体は約2.5％のヒト血清またはヒト血清同等物を含む。いくつかの態様では、血清はヒトAB血清である。いくつかの態様では、ヒト治療薬での使用を容認できる代用血清がヒト血清の代わりに使用される。そのような代用血清は当技術分野で公知であるか、または将来開発される可能性がある。15％を上回る濃度のヒト血清を使用することができるが、約5％を超える濃度は桁違いの費用がかかると考えられる。いくつかの態様では、NK-92細胞は、NK-92細胞および細胞の生存を支持する等張液を含む組成物として投与される。いくつかの態様では、NK-92細胞は、凍結保存サンプルから再調製されている組成物として投与される。

薬学的に許容される組成物は、様々な担体および賦形剤を含み得る。様々な水性担体、例えば緩衝生理食塩水など、を使用することができる。これらの溶液は無菌であり、一般的に望ましくない物質を含まない。適切な担体および賦形剤ならびにそれらの製剤は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第21版, David B. Troy編, Lippicott Williams & Wilkins (2005)に記載されている。薬学的に許容される担体とは、生物学的にまたは他の点で望ましくないものではない材料を意味し、すなわち、その材料は、望ましくない生物学的作用を引き起こすことなく、またはそれが含まれる薬学的組成物の他の成分と有害な方法で相互作用することなく、対象に投与される。対象に投与する場合、担体は、活性成分の分解を最小限に抑え、かつ対象において有害な副作用を最小限にするように任意選択される。本明細書で使用するとき、薬学的に許容されるという用語は、生理学的に許容されるおよび薬理学的に許容されると同義に用いられる。薬学的組成物は、一般に緩衝化および貯蔵中の保存のための作用剤を含み、また、投与経路に応じて、適切な送達のための緩衝剤および担体を含み得る。

インビボまたはインビトロで使用するためのこれらの組成物は、細胞に用いられる滅菌技術によって滅菌され得る。該組成物は、生理学的条件に近づけるために、必要に応じて許容される補助物質を含むことができ、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムのようなpH調整・緩衝剤、毒性調整剤などを含み得る。これらの製剤および/または他の薬剤中の細胞の濃度は様々であり得、選択される特定の投与方法および対象のニーズに従って、主に体液量、粘度、体重などに基づいて選択されるであろう。

一態様では、CD96改変型またはTIGIT改変型NK-92細胞は、治療下のがんに対する1つまたは複数の他の治療と組み合わせて患者に投与される。いくつかの態様では、治療下のがんに対する2つ以上の他の治療には、例えば、抗体、放射線、化学療法、幹細胞移植、またはホルモン療法が含まれる。

上記で説明したように、一態様では、CD96改変型またはTIGIT改変型NK-92細胞は、患部細胞を標的とする抗体と組み合わせて投与される。一態様では、CD96改変型NK-92細胞またはTIGIT改変型NK-92細胞と抗体は、患者に一緒に、例えば同じ製剤で、別々に、例えば別個の製剤で、同時に投与されるか、または別々に、例えば異なる服薬スケジュールでもしくは1日の異なる時間に、投与され得る。別々に投与する場合は、抗体を静脈内または経口投与などの任意の適切な経路で投与することができる。

キット
本明細書に記載されるような、ある量のCD96改変型NK-92細胞またはTIGIT改変型NK-92細胞を含む組成物を用いて、がんまたは感染症を治療するためのキットも開示される。いくつかの態様では、本開示のキットはまた、少なくとも1つのモノクローナル抗体を含み得る。

特定の態様では、前記キットは、CD96改変型NK-92またはTIGIT改変型細胞の投与前に、投与と同時に、または投与後に投与されることになっている、治療活性化合物または薬物などの追加の化合物を含み得る。そのような化合物の例には、抗体、ビタミン、ミネラル、フルドロコルチゾン、イブプロフェン、リドカイン、キニジン、化学療法剤などが含まれる。

様々な態様では、キットの使用説明書は、がんまたは感染症の治療においてキットの構成要素を使用するための指示を含むであろう。該説明書は、CD96改変型またはTIGIT改変型NK-92細胞の扱い方（例えば、解凍および/または培養）に関する情報をさらに含んでもよい。該説明書は、投与量および投与頻度に関するガイドラインをさらに含み得る。

開示された方法および組成物に使用され得るか、それと組み合わせて使用され得るか、その調製において使用され得るか、またはその産物である、材料、組成物、および成分が開示される。これらおよび他の材料は本明細書に開示されており、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、グループなどが開示される場合、これらの化合物の様々な個々のおよび集合的な組み合わせと順列の具体的な言及は、明示的に開示されていないことがあるが、それぞれは本明細書で具体的に企図されて説明されていることが理解されよう。例えば、ある方法が開示されて論じられ、その方法を含むいくつかの分子に対してなされ得る多くの改変が論じられる場合、その方法および可能な改変のありとあらゆる組み合わせと順列は、そうでないと具体的に示されない限り、具体的に企図されている。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせもまた、具体的に企図されて開示されている。この概念は、本開示の全ての局面、例えば、限定するものではないが、開示された組成物を使用する方法のステップ、に適用される。したがって、実施できる様々な追加のステップがある場合、これらの追加のステップのそれぞれは開示された方法の任意の特定の方法ステップまたは方法ステップの組み合わせと共に実施することができ、そしてそのような組み合わせまたは組み合わせのサブセットのそれぞれは具体的に企図されて開示されていると見なされるべきであることが理解されよう。

以下の実施例は例示的な目的のみのためのものであり、かつそれらは請求される発明の限定として解釈されるべきではない。意図された発明を当業者が成功裏に実施することを同様に可能にする、当業者が利用可能な多様な代替技術および手順が存在する。

実施例1
材料および方法
細胞培養
NK-92細胞を、5％ヒト血清（Valley Biomedical社, カタログ番号HP1022）および組換えヒトIL-2（500IU/ml；Prospec社, カタログ番号Cyt-209）を補充したX-VIVO 10培養液（Lonza社, カタログ番号BE04-743Q）中で維持した。MCF-7、SKBR-3およびDaudi細胞株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC, Rockville, MD)から購入して、10％FBS（Gibco社, カタログ番号10438026）および1％ペニシリン/ストレプトマイシン（Gibco社, カタログ番号15070-063）を補充したRPMI-1640培養液（ThermoScientific社, カタログ番号61870-127）中で維持した。

Cas9-NK-92細胞の作製
Cas9タンパク質を安定的に発現するNK-92細胞は、NK-92親細胞にEdit-R Cas9レンチウイルスを感染させることによって作製した。簡単に説明すると、Edit-R Cas9レンチウイルスストックを作製するために、10cmペトリ皿あたり7×10⁶個の293T細胞に、以下の量のプラスミドをトランスフェクトした：7.5μgのEdit-R-Cas9（Dharmacon社, カタログ番号CAS10138）、5μgのpCMV-ΔR8.2、および2.5μgのpCMV-VSV.G。トランスフェクションは、リポフェクタミン3000（Life Technologies社, カタログ番号L3000-008）を用いてメーカーの指示に従って行った。トランスフェクションの48時間後にウイルス上清を回収し、System Biosciences社からのPEG-it Virus Precipitation Solution（カタログ番号LV810A-1）を用いて10倍に濃縮した。5×10⁵個のNK-92細胞に、スピノキュレーション（840g、35℃で99分）によって、TransDux（System Biosciences社, カタログ番号LV850A-1）の存在下に、24ウェルプレートで最終培養液1ml中の100μlの濃縮ウイルスを感染させた。形質導入の48時間後、Cas9を発現する細胞を、15μg/mlのブラスチシジン（InvivoGen社, カタログ番号ant-bl-1）の存在下で該細胞を増殖させることによって選択した。

pT7-Guide-IVT CD96、TIGIT、およびCD226 sgRNA構築物の作製
ガイドRNAを、MITウェブツールhttpアドレスcrispr.mit.eduを用いて設計した。以下に各遺伝子の標的配列を示す。

CD96
sgRNAは、CD96（NM_198196, 転写変異体1）の第2エクソンを標的とする。

TIGIT
sgRNAは、TIGIT（NM_173799）の第2エクソンを標的とする。

CD226
sgRNAは、CD226（NM_006566, 転写変異体1）の第3エクソンを標的とする。

標的部位は、pT7-Guide-IVTプラスミド（Origene社, カタログ番号GE100025）にクローニングされた。pT7-Guide-IVTの2つのBsmBI部位を用いて、メーカーの指示に従って、該オリゴをクローニングした。インビトロ転写されたCD96、TIGIT、およびCD226 sgRNAを、MEGAshortscript（商標）T7キット（Life Technologies社, カタログ番号AM1354）を用いて、メーカーの指示に従って作製した。

CD96、TIGIT、CD226シングルノックアウトおよびCD96/TIGITダブルノックアウトNK-92細胞の作製
MaxCyte GTエレクトロポレーターを用いたエレクトロポレーションにより、インビトロ転写されたsgRNAをCas9-NK-92細胞にトランスフェクトした。簡単に説明すると、NK-92-3-OCプロトコルを用いて、5×10⁶個のCas9-NK-92細胞に10μgのインビトロ転写sgRNAをトランスフェクトした。各標的遺伝子について最も効率的なsgRNAを決定するために初期実験を行った。これらの実験ではsgRNA 1～4をCas9-NK-92細胞にトランスフェクトし、トランスフェクションの48時間後にフローサイトメトリーで標的遺伝子の発現を分析して、各sgRNAのノックアウト効率を決定した。

CD96、TIGIT、およびCD226シングルノックアウトNK-92細胞を作製するために、Cas9-NK-92細胞に、10μgのインビトロ転写CD96 sgRNA-2、TIGIT sgRNA-2、およびCD226 sgRNA-1をそれぞれトランスフェクトした。CD96/TIGITダブルノックアウトNK-92細胞は、10μgのインビトロ転写CD96 sgRNA-2およびTIGIT sgRNA-2を同時トランスフェクトすることによって作製した。全ての場合に、トランスフェクションの48時間後に限界希釈法で細胞をプレーティングした。その細胞を15日間増殖させた後、個々のクローンを選択し、増殖させ、標的遺伝子の発現をフローサイトメトリーで調べた。

フローサイトメトリー
細胞表面タンパク質のサイトフルオロメトリー分析（cytofluorometric analysis）は、以下の表に示したフルオロフォアコンジュゲート化抗体を用いる直接免疫染色によって行った。簡単に説明すると、10⁵個の細胞を100μlのフローサイトメトリー染色緩衝液（PBS、1％BSA）中の推奨量の抗体で4℃、暗所にて30分間染色した。細胞をフローサイトメトリー染色緩衝液で2回洗浄し、200μlのフローサイトメトリー染色緩衝液中に再懸濁した。サンプルをMACSQuant 10フローサイトメーター（Miltenyi社）で処理し、FlowJoソフトウェアを用いてデータを解析した。

細胞傷害性アッセイ
標的細胞を、蛍光色素PKH67-GL（Sigma-Aldrich社, Saint Louis, MO）を用いて、メーカーの指示に従って染色した。標的およびエフェクターを、96ウェルプレート（Falcon BD社, Franklin Lakes, NJ）において異なるエフェクター対標的比で合わせて、短時間遠心分離し、5％ヒト血清を補充したX-VIVO 10（Lonza社, カタログ番号04-743Q）培養液中で5％CO2インキュベーター内、37℃で4時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を1％BSA/PBS緩衝液中10μg/mlのヨウ化プロピジウム（PI, Sigma-Aldrich社）で染色し、直ちにフローサイトメトリーにより分析した。死滅した標的細胞は、PKH67-GLおよびPIについて二重陽性として同定した。また、標的細胞およびエフェクター細胞をPIで別々に染色して、自発的細胞溶解を評価した。NKを介した細胞傷害性のパーセンテージは、エフェクターを含むサンプル中のPKH(+)/PI(+)細胞のパーセンテージから、標的細胞単独（自発的溶解）についてのPKH(+)/PI(+)細胞のパーセンテージを差し引くことによって得た。

結果
CD96、TIGIT、CD226シングルノックアウトおよびCD96/TIGITダブルノックアウトNK-92細胞の作製
NK-92細胞株は、非ホジキンリンパ腫の50歳白人男性患者の末梢血から樹立されたナチュラルキラー様細胞株である（Gong et al., Leukemia 8:652-8 1994）。NK-92細胞はCD2、CD56およびCD57について陽性であり、CD3およびCD16について陰性である（Gong et al., 参照）。それらの増殖はIL-2依存性であり、それらは広範囲の腫瘍標的に対して強力なインビトロ細胞傷害性を発揮する。NK-92細胞は、現在知られている抑制性KIR受容体の大部分を欠いている（Maki et al., 前掲）。しかし、それらはCD226、CD96、およびTIGITを発現しており（図1）、これらはネクチンおよびネクチン様タンパク質と結合しかつNK細胞機能を調節する上で重要な役割を果たす受容体のファミリーのメンバーである。CD226は、DNAM1としても知られており、NK細胞の細胞傷害性を媒介するのに重要な活性化受容体であり（Shibuya et al., 前掲）、一方CD96およびTIGITは、NK機能活性を抑える抑制性免疫チェックポイントとして作用することが示されている（Chan et al., Nat Immunol. 15:431-8, 2014; Sarhan et al., Cancer Res. 76:5696-5706, 2016）。抗腫瘍能力を高めるために、これらの抑制性受容体の1つまたは複数を欠くNK-92変異体を作製した。

CRISPR/Cas9システムを用いて、CD96、TIGIT、またはCD226の発現を欠くNK-92細胞を作製した。シングルCD96、TIGIT、およびCD226ノックアウト、またはダブルCD96/TIGITノックアウトのNK-92細胞を「材料および方法」で上述したように作製した。図2は、選択されたシングルまたはダブルKOクローンにおけるこれらの受容体の発現を示す。注目すべきことに、シングルまたはダブルKO細胞上の非標的受容体の発現は、親NK-92細胞のそれと同等であった（図2のMFI値を参照のこと）。

CD96およびCD96/TIGITノックアウトNK-92細胞はCD155陽性腫瘍標的に対してより高い細胞傷害能を有する
活性化CD226受容体と抑制性CD96およびTIGIT受容体は、共通のリガンドであるCD155（ポリオウイルス受容体PVRとしても知られる）を共有しており、それらは異なる親和性でリガンドCD155に結合する（Martinet et al., 前掲）。CD155発現は多くの場合腫瘍細胞においてアップレギュレートされており、その過剰発現はがんの浸潤性および転移と関連している（Hirota et al., Sloan et al., 両方とも前掲）。そのために、CD155陽性腫瘍標的に対する親細胞およびネクチン受容体ノックアウト細胞の細胞傷害能を最初に試験した。MCF-7およびSKBR-3は、CD155発現について陽性である2つの乳がん細胞株である（図3）。活性化受容体としてのCD226の役割と一致して、CD226-KO NK-92細胞によるMCF-7またはSKBR-3の死滅は、ほぼ完全に無効にされた（図4）。

重要なことには、CD96-KO NK-92細胞は、親NK-92細胞と比較して10～15％高い細胞傷害活性を有する（図4）。TIGIT-KO NK-92細胞は、MCF-7またはSKBR-3細胞を死滅させるその能力において親NK-92細胞と有意に異ならなかったが、ダブルCD96/TIGIT KO細胞はCD96-KO NK-92細胞または親NK-92細胞のそれよりも高い細胞傷害能（図4に示すように、CD96-KO NK-92細胞または親NK-92細胞よりもそれぞれ10～15％および17～29％高い細胞傷害活性）を有していた。したがって、これらのデータから、CD96はTIGIT発現の欠如を補完する可能性があるが、両方の受容体は、腫瘍標的の効率的な死滅に必要とされるCD226を介した活性化シグナルを抑えることに活発に寄与していることが示される。

重要なことに、CD155陽性腫瘍標的に対するCD96 KO NK-92細胞およびCD96/TIGIT KO NK-92細胞のより高い細胞傷害活性は、ネクチン受容体の欠如に特有であって、これらのクローンの固有のより高い細胞傷害活性に特有であるわけではない。なぜなら、CD155陰性Daudi腫瘍細胞（図3）に対するそれらの細胞傷害活性は、親NK-92細胞のそれと有意に異ならなかったからである（図5）。注目すべきことに、CD226-KO NK-92細胞は、最も低いE：T比ではDaudi細胞をあまり効率的に死滅させなかった。このことは、Daudi細胞が、やはり活性化受容体CD226によって認識される、CD155以外の、追加のリガンドを発現している可能性があることを示唆する（図5）。

本明細書に記載される実施例および態様は例示目的のみのためであること、そしてそれらを踏まえた様々な修飾または変更が当業者に示唆されるであろうが、それらもまた本出願の精神および範囲内にありかつ添付の特許請求の範囲内に含まれるべきであること、が理解されよう。本明細書に引用された全ての刊行物、配列アクセッション番号、特許、および特許出願は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み入れられる。

例示的なCD16配列：SEQ ID NO:13 高親和性変異型免疫グロブリンガンマFc領域受容体IIIaアミノ酸配列（前駆体型）。該前駆体型の176位は、19位のArgで始まる成熟型ポリペプチドの158位に対応する。176位のValには下線が引かれている。

Claims

CD96の発現を阻害する遺伝的変更およびTIGITの発現を阻害する遺伝的変更を含む、改変型NK-92細胞。
CD96を標的としかつCD96の発現を阻害する干渉RNAを含む、請求項1に記載の改変型NK-92細胞。
前記細胞内でCD96発現をノックダウンまたはノックアウトすることによって作製される、請求項1に記載の改変型NK-92細胞。
前記細胞によって発現されるCD96の量が、CD96改変を有さない対応するNK-92細胞と比較して、少なくとも80％減少する、請求項2または3に記載の改変型NK-92細胞。
TIGITを標的としかつTIGITの発現を阻害する干渉RNAを含む、請求項１に記載の改変型NK-92細胞。
前記細胞内でTIGIT発現をノックダウンまたはノックアウトすることによって作製される、請求項１に記載の改変型NK-92細胞。
前記細胞によって発現されるTIGITの量が、TIGIT改変を有さない対応するNK-92細胞と比較して、少なくとも80％減少する、請求項5または6に記載の改変型NK-92細胞。
CD96を標的としかつCD96の発現を阻害する干渉RNAと、TIGITを標的としかつTIGITの発現を阻害する干渉RNAとを含む、請求項1に記載の改変型NK-92細胞。
前記細胞内でCD96発現をノックダウンまたはノックアウトすることおよびTIGIT発現をノックダウンまたはノックアウトすることによって作製される、請求項1に記載の改変型NK-92細胞。
前記細胞によって発現されるCD96の量が、CD96改変を有さない対応するNK-92細胞と比較して、少なくとも80％減少し、かつ
前記細胞によって発現されるTIGITの量が、TIGIT改変を有さない対応するNK-92細胞と比較して、少なくとも80％減少する、
請求項8または9に記載の改変型NK-92細胞。
CD96発現およびTIGIT発現がノックアウトされる、請求項1に記載の改変型NK-92細胞。
少なくとも1つのFc受容体、または少なくとも1つのキメラ抗原受容体（CAR）、または少なくとも1つのFc受容体と少なくとも1つのCARの両方を細胞表面上に発現する、請求項1～11のいずれか一項に記載の改変型NK-92細胞。
前記少なくとも1つのFc受容体が、CD16、またはSEQ ID NO:13を参照して番号付けされた176位にバリンを有するCD16ポリペプチドである、請求項12に記載の改変型NK-92細胞。
前記少なくとも1つのFc受容体が、SEQ ID NO:13のアミノ酸19～254に対して少なくとも90％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、かつSEQ ID NO:13を参照して番号付けされた176位にバリンを含む、請求項13に記載の改変型NK-92細胞。
前記少なくとも1つのFc受容体がFcγRIIIである、請求項12に記載の改変型NK-92細胞。
前記CARがFcεRIγの細胞質ドメインを含む、請求項12に記載の改変型NK-92細胞。
前記CARが腫瘍関連抗原を標的とする、請求項16に記載の改変型NK-92細胞。
サイトカインをさらに発現する、請求項1～17のいずれか一項に記載の改変型NK-92細胞。
サイトカインがインターロイキン-2またはその変異体である、請求項18に記載の改変型NK-92細胞。
サイトカインが小胞体に標的指向される、請求項18または19に記載の改変型NK-92細胞。
請求項1～20のいずれか一項に記載の改変型NK-92細胞を複数含む、組成物。
生理学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項21に記載の組成物。
請求項1～20のいずれか一項に記載の改変型NK-92細胞を複数含む、NK-92細胞株。
前記細胞が10回未満の集団倍加を受けている、請求項23に記載の細胞株。
それを必要とする対象におけるがんを治療するための薬学的組成物であって、治療有効量の請求項22に記載の組成物または請求項23もしくは24に記載の細胞株を含む、薬学的組成物。
抗体と組み合わせて使用するための、請求項25に記載の薬学的組成物。
患者の体表面積1m²あたり1×10⁸～1×10¹¹個の細胞が患者に投与されるように使用するための、請求項25または26に記載の薬学的組成物。
（a）請求項21もしくは22に記載の組成物または請求項23もしくは24に記載の細胞株を含む、がんを治療するためのキット。
対照NK-92細胞と比較して低下したレベルのCD96およびTIGITを発現するNK-92細胞を作製する方法であって、NK-92細胞におけるCD96およびTIGITの発現を遺伝的に改変する段階を含む、方法。
CD96およびTIGITの発現を遺伝的に改変する段階が、改変されるNK-92細胞を、CD96を標的とする干渉RNAおよびTIGITを標的とする干渉RNAと接触させることを含む、請求項29に記載の方法。
干渉RNAが、siRNA、shRNA、マイクロRNA、または一本鎖干渉RNAである、請求項30に記載の方法。
CD96およびTIGITの発現を遺伝的に改変する段階が、それぞれの遺伝子を、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、Taleエフェクタードメインヌクレアーゼ（TALEN）、またはCRISPR/Casシステムを用いて改変することを含む、請求項30に記載の方法。
CD96およびTIGIT標的遺伝子のそれぞれの発現を遺伝的に改変する段階が、
（i）NK-92細胞に、CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeat）関連（Cas）タンパク質を導入する段階、および
（ii）改変されるNK-92細胞にリボ核酸を導入する段階
を含み、
該リボ核酸が、該CD96およびTIGIT標的遺伝子のそれぞれの配列の標的モチーフにハイブリダイズするようにCasタンパク質を誘導し、該標的モチーフが切断される、
請求項29に記載の方法。
Casタンパク質がタンパク質の形態でNK-92細胞に導入される、請求項33に記載の方法。
Casコード配列を導入することによって、Casタンパク質がNK-92細胞に導入される、請求項33に記載の方法。
Casタンパク質がCas9である、請求項33、34または35に記載の方法。
それぞれの遺伝子内の前記標的モチーフが20ヌクレオチドのDNA配列である、請求項33、34、35または36に記載の方法。
前記標的モチーフが、該1つまたは複数の標的遺伝子のそれぞれのエクソン内にある、請求項33、34、35、36または37に記載の方法。
CD96中の標的モチーフにハイブリダイズする前記リボ核酸がSEQ ID NO：1～4からなる群より選択され、TIGIT中の標的モチーフにハイブリダイズする前記リボ核酸がSEQ ID NO：5～8からなる群より選択される、請求項33～38のいずれか一項に記載の方法。