JP7108551B2

JP7108551B2 - リンパ球に形質導入を行うための方法及び組成物、並びにその制御された増加

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Publication number: JP7108551B2
Application number: JP2018568183A
Authority: JP
Inventors: イアンフロストグレゴリー; ジョセフオナッファージェイムズ; エイチ．グイビンガギアベ; クンドゥアニルバン
Original assignee: エクスマバイオテックコーポレイション
Priority date: 2016-03-19
Filing date: 2017-03-19
Publication date: 2022-07-28
Anticipated expiration: 2037-03-19
Also published as: US10596274B2; MX2018011345A; CU20180109A7; WO2017165245A3; EP3430136A2; AU2021250935A1; SG10202104509PA; CU24649B1; RU2755059C2; US20170296678A1; IL261713B1; KR102457098B1; AU2017236796A1; KR20180127638A; CN108884460A; IL261713A; RU2018136607A; JP2019509063A; BR112018069075A2; CN116426490A

Description

関連出願の相互参照
本願は、米国仮出願第６２／３９０，０９３号（２０１６年３月１９日出願）、米国仮出願第６２／３６０，０４１号（２０１６年７月８日出願）、及び、米国仮出願第６２／４６７，０３９号（２０１７年３月３日出願）に基づく優先権の利益を主張する。これらの出願は、その全体が引用により本開示に組み込まれる。

配列表
本願はここにおいて、本願と同時提出の電子形式の配列表の内容を、引用により組み込む。電子形式の配列表はテキスト（.txt）ファイル（名称「F1_001_Sequence_listing.txt」、２０１７年３月１６日作成、ファイルサイズ２３０ＫＢ）として提供され、その全体が引用により本開示に組み込まれる。

本開示は免疫学の分野に関し、より具体的には、Ｔリンパ球又は他の免疫細胞の遺伝子改変と、レトロウイルスの作製方法及び遺伝子発現の制御方法とに関する。

対象（例えば患者）から単離されたリンパ球をインビトロで活性化し、遺伝子操作することにより、組み込まれた遺伝的プログラムに基づき、他の細胞及び環境と関連付けるよう再指令する合成タンパク質を発現させることが可能である。斯かる合成タンパク質の例として、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が挙げられる。現在使用されているＣＡＲとしては、細胞外認識ドメイン（例えば抗原結合ドメイン）、膜貫通ドメイン、及び、複製不能レトロウイルスによりコードされる１又は２以上の細胞内シグナル伝達ドメインの融合体が挙げられる。

レトロウイルスは非***細胞への感染には有効性を示すものの、静止ＣＤ４及びＣＤ８リンパ球はこれらのベクターによる遺伝子形質導入に対して不応性である。斯かる困難性を克服するために、通常はこれらの細胞を予めインビトロで刺激試薬を用いて活性化し、ＣＡＲ遺伝子ベクターによる遺伝子改変が生じるようにする。刺激及び形質導入の後、得られた遺伝子操作細胞をインビトロで増幅してから、リンパ球枯渇患者に再導入する。インビボで抗原と遭遇すると、免疫細胞内において、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達部分が活性化関連応答及び細胞溶解性分子の放出を誘発し、腫瘍細胞死を誘導する。

こうした現行の方法では、Ｔ細胞を患者に再注入する前に、体外で煩雑なＴ細胞の操作及び増幅Ｔ細胞の作製が必要になると共に、Ｔ細胞の生着を促進するために、リンパ球枯渇化学療法によってサイトカインを除去し、競合する受容体を枯渇させる必要がある。また、斯かるＣＡＲ治療剤は、いったん体内に導入してしまうと、その増殖速度をインビボで制御することはできず、また、腫瘍外でも発現されているような標的に対しては安全に標的化することができない。結果として、現在のＣＡＲ治療剤の注入は、通常エクスビボで１２～２８日間増殖させた細胞を１×１０^５～１×１０^８細胞／ｋｇの用量で用い、これを腫瘍外標的毒性（off tumor on target toxicity）が一般に許容されるような標的、例えば腫瘍標的に対して標的化する。このように比較的長時間エクスビボで増殖させることにより、細胞の生存性や増殖不能の問題が生じると共に、サンプルの同一性に加えて規模拡大性（scalability）の問題もある。従って、より安全且つより有効で規模の拡大も可能なＴ細胞又はＮＫ細胞治療が、強く求められていた。

一側面によれば、本開示では、対象のリンパ球を遺伝子操作し、増加させるための方法であって、
Ａ．対象の静止Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を、事前のエクスビボでの刺激を行うことなく、エクスビボで組換レトロウイルスと接触させ、ここで前記組換レトロウイルスが
ｉ．Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞に結合し、斯かる細胞への組換レトロウイルスの膜融合を促進することが可能なシュードタイピング要素を、その表面に含むと共に、
ii．Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞内で活性なプロモーターに作動式に連結された、１又は２以上の転写単位を含むポリヌクレオチドを含み、ここで前記１又は２以上の転写単位は、インビボ制御要素により制御される第１の改変シグナル伝達ポリペプチドをコードし、ここで前記第１の改変シグナル伝達ポリペプチドは、リンパ増殖性要素を含み、
ここで前記接触により、前記組換レトロウイルスによる前記静止Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞の少なくとも一部の形質導入が促進されて、遺伝子操作Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞が産生され、
Ｂ．前記遺伝子操作Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を、前記対象に導入し、
Ｃ．前記遺伝子操作Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を、インビボにおいて、前記インビボ制御要素に結合して前記第１の改変シグナル伝達ポリペプチドの発現に作用する化合物に暴露することにより、インビボでのリンパ球の増加、生着、及び／又は、持続性を促進及び／又は増強し、これにより前記対象のリンパ球を遺伝子操作し、増加させることを含む方法が提供される。例示的な態様によれば、エクスビボで刺激を行うことなく形質導入が実施される。

上記側面において、また、リンパ球を遺伝子操作し、増加させる方法及び細胞治療を行う方法の任意の側面において、最も広い側面で規定されていない場合には、一部の態様において、前記ポリヌクレオチドが更に、抗原特異的標的化領域（ＡＳＴＲ）、膜貫通ドメイン、及び細胞内活性化ドメインを含む第１のキメラ抗原受容体を含む第２の改変シグナル伝達ポリペプチドをコードする転写単位を含む。

他の側面において、本開示では、対象に養子細胞治療を実施する方法であって、
Ａ．前記対象から血液を採取し、
Ｂ．前記対象の血液に由来する静止Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を、エクスビボで組換レトロウイルスと接触させ、ここで前記組換レトロウイルスは、
ｉ．Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞に結合し、斯かる細胞への組換レトロウイルスの膜融合を促進することが可能なシュードタイピング要素を、その表面に含むと共に、
ii．Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞内で活性なプロモーターに作動式に連結された、１又は２以上の転写単位を含むポリヌクレオチドを含み、ここで前記１又は２以上の転写単位は、インビボ制御要素により発現が制御される、リンパ増殖性要素を含む第１の改変シグナル伝達ポリペプチドと、抗原特異的標的化領域（ＡＳＴＲ）、膜貫通ドメイン、及び細胞内活性化ドメインを含むキメラ抗原受容体を含む第２の改変シグナル伝達ポリペプチドとをコードし、
ここで前記接触の結果、前記静止Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞の少なくとも一部が遺伝子操作され、
Ｃ．前記遺伝子操作Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を、前記対象に再導入し、ここで前記対象内で、前記遺伝子操作Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞のインビボでの増加、生着及び／又は維持が達成されると共に、前記方法の前記血液の採取から前記遺伝子操作Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞の再導入までの工程が、２４時間以内で実施され、これにより前記対象に養子細胞治療が実施されることを含む方法が提供される。

他の側面によれば、本開示では、対象に養子細胞治療を実施する方法であって、
Ａ．対象から血液を採取し、
Ｂ．静止Ｔ細胞及び／又は静止ＮＫ細胞を含む末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離し、
Ｃ．前記対象の静止Ｔ細胞及び／又は静止ＮＫ細胞を、エクスビボで組換レトロウイルスと接触させ、ここで前記組換レトロウイルスは、その表面に、静止Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞に結合し、当該細胞に対する組換レトロウイルスの膜融合を促進することが可能なシュードタイピング要素を含み、ここで前記接触によって、前記組換レトロウイルスによる前記静止Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞の形質導入が促進されて、遺伝子操作Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞が産生され、
Ｄ．前記対象からの血液採取後２４時間以内に、前記遺伝子操作細胞を前記対象に再導入することにより、前記対象において養子細胞治療を実施することを含む方法が提供される。

他の側面によれば、本開示では、対象の静止リンパ球に形質導入を行う方法であって、対象の静止Ｔ細胞及び／又は静止ＮＫ細胞を、エクスビボで組換レトロウイルスに接触させ、ここで前記組換レトロウイルスは、その表面に、静止Ｔ細胞及び／又は静止ＮＫ細胞に結合し、当該細胞に対する組換レトロウイルスの膜融合を促進することが可能なシュードタイピング要素を含み、ここで前記接触によって、前記組換レトロウイルスによる前記静止Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞の形質導入が促進されて、遺伝子操作Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞が産生されることを含む方法が提供される。この側面の例示的な態様によれば、本方法の結果として、前記静止Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞の少なくとも１０、２０、又は２５％、或いはＴ細胞及び／又はＮＫ細胞の１０％～７０％又は２０％～５０％が形質導入される。

他の側面によれば、本開示では、単離血液由来の静止Ｔ細胞及び／又は静止ＮＫ細胞に形質導入を行う方法であって、
Ａ．対象から血液を採取し、
Ｂ．静止Ｔ細胞及び／又は静止ＮＫ細胞を含む末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離し、
Ｃ．前記対象の静止Ｔ細胞及び／又は静止ＮＫ細胞を、エクスビボで組換レトロウイルスと接触させ、ここで前記組換レトロウイルスは、その表面に、静止Ｔ細胞及び／又は静止ＮＫ細胞に結合し、当該細胞に対する組換レトロウイルスの膜融合を促進することが可能なシュードタイピング要素を含み、ここで前記接触によって、前記静止Ｔ細胞及び／又は静止ＮＫ細胞の少なくとも５％について、前記組換レトロウイルスによる形質導入が促進されて、遺伝子操作Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞が産生されることにより、静止Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞への形質導入が行われることを含む方法が提供される。

一側面によれば、本開示では、組換レトロウイルスであって、
Ａ．Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞に結合し、当該細胞に対する組換レトロウイルスの膜融合を促進することが可能な１又は２以上のシュードタイピング要素、
Ｂ．Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞内で活性なプロモーターに作動式に連結された、１又は２以上の転写単位を含むポリヌクレオチド（ここで前記１又は２以上の転写単位は、抗原特異的標的化領域、膜貫通ドメイン、及び細胞内活性化ドメインを含むキメラ抗原受容体を含む、第１の改変シグナル伝達ポリペプチドと、リンパ増殖性要素を含む第２の改変シグナル伝達ポリペプチドとをコードする）（但し、前記第１の改変シグナル伝達ポリペプチド及び／又は前記第２の改変シグナル伝達ポリペプチドの発現は、インビボ制御要素によって制御される）、並びに、
Ｃ．前記レトロウイルスの表面に存在する活性化要素（但し、前記活性化要素は、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞に結合可能であるが、前記組換レトロウイルス内のポリヌクレオチドによってコードされるものではない）
を含む組換レトロウイルスが提供される。

他の側面において、本開示では、組換レトロウイルスであって、
Ａ．当該ウイルスの表面に存在し、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞に結合して、斯かる細胞への組換レトロウイルスの膜融合を促進することが可能な、麻疹ウイルスＦポリペプチド及び／又は麻疹ウイルスＨポリペプチドの細胞質ドメイン欠失変異体を含むシュードタイピング要素、
Ｂ．Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞内で活性なプロモーターに作動式に連結された、１又は２以上の転写単位を含むポリヌクレオチド（ここで前記１又は２以上の転写単位は、抗原特異的標的化領域、膜貫通ドメイン、及び細胞内活性化ドメインを含むキメラ抗原受容体を含む、第１の改変シグナル伝達ポリペプチドと、構成的に活性なＩＬ－７受容体変異体を含む、第２の改変シグナル伝達ポリペプチドとをコードする）（但し、前記ＩＬ－７受容体変異体の発現は、ヌクレオシド類似体抗ウイルス薬に結合するリボスイッチによって制御される）、並びに、
Ｃ．組換レトロウイルスの表面で発現され、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞に対する結合能力を有する、ＣＤ３に結合可能なポリペプチド及びＣＤ２８に結合可能なポリペプチド（但し、前記ポリペプチドは、前記組換レトロウイルス内のポリヌクレオチドによってコードされるものではない）
を含む組換レトロウイルスが提供される。この側面の例示的な態様によれば、前記ヌクレオシド類似体抗ウイルス薬が前記リボスイッチに結合することで、前記ＩＬ－７受容体変異体の発現が増加する。

本開示にて提供される方法又は組成物の側面の何れかにおいて、最も広い側面で既に規定されていない場合には、前記１又は２以上の組換レトロウイルスは更に、静止Ｔ細胞及び／又は静止ＮＫ細胞を活性化する能力を有する活性化要素を、その表面に含む。

本開示においてＴ細胞及び／又はＮＫ細胞、或いは、静止Ｔ細胞又は静止ＮＫ細胞を要件とする方法又は組成物の側面の何れにおいても、一部の例示的な態様によれば、前記細胞はＴ細胞である。

本開示にて提供される方法及び組成物の何れかにおいて、前記組換レトロウイルスは、通常は複製欠損である。即ち、本ウイルスは複製能力を有さない。例示的な態様によれば、前記レトロウイルスはレンチウイルス、例えば複製欠損ＨＩＶレンチウイルスである。

本開示における、リンパ球を遺伝子操作し、増加させる方法、又は、養子細胞治療を実施する方法、又は類似の方法に関する側面の何れかの例示的な態様によれば、１０～７５％、又は１０～７０％、又は１０～６０％、又は１０～５０％、又は１０～２５％、又は２０～７５％、又は２０～５０％、又は少なくとも１０％、２０％、又は２５％の静止Ｔ細胞が形質導入され、０～７５％のＮＫ細胞が形質導入される。他の態様によれば、５～８０％、又は１０～８０％、又は１０～７０％、又は１０～６０％、又は１０～５０％、又は１０～２５％、又は１０～２０％、又は２０～５０％の静止ＮＫ細胞が形質導入される。

本開示における、リンパ球を遺伝子操作し、増加させる方法、又は、養子細胞治療を実施する方法、又は類似の方法に関する側面、或いは、本開示にて提供される何れかの組成物の何れかの例示的な態様によれば、最も広い側面で明示的に規定されていない場合には、前記第２の改変シグナル伝達ポリペプチドの発現が前記インビボ制御要素によって制御される。

本開示における、リンパ球を遺伝子操作し、増加させる方法、又は、細胞治療を実施する方法、又は類似の方法に関する側面の何れかの例示的な態様によれば、前記方法の最も広い側面で明示的に規定されていない場合には、前記接触の時間は、下限が１５、３０又は４５分間又は１、２、３、４、５、６、７、又は８時間、上限が６、８、１０、１２、１８、２４、３６、４８、及び７２時間の範囲で実施することができる。例えば、例示的な態様によれば、前記接触は２～２４時間、又は４～１２時間、又は４～８時間に亘って実施される。

本開示における、リンパ球を遺伝子操作し、増加させる方法、又は、養子細胞治療を実施する方法、又は類似の方法に関する側面の何れかの例示的な態様によれば、最も広い側面で明示的に規定されていない場合には、前記方法が更に、インビボにおいて前記インビボ制御要素に結合して、前記第１の改変シグナル伝達ポリペプチド（及び任意により前記第２の改変シグナル伝達ポリペプチド）の発現に作用し、リンパ球の増加、生着、及び／又は、持続性を促進する化合物に、インビボにおいて前記遺伝子操作Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を暴露することを含んでいてもよい。

本開示における、リンパ球を遺伝子操作し、増加させる方法、又は、養子細胞治療を実施する方法、又は類似の方法に関する側面の何れかの例示的な態様によれば、最も広い側面で明示的に規定されていない場合には、前記遺伝子操作Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞が、前記対象への導入又は再導入以前にエクスビボで生じる細胞***は、８、７、６、５、４、３回以内である。

本開示における、リンパ球を遺伝子操作し、増加させる方法、又は、細胞治療を実施する方法、又は類似の方法に関する側面の何れかの例示的な態様によれば、最も広い側面で明示的に規定されていない場合には、遺伝子操作Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞のインビボでの増加、生着、及び／又は、持続性は、前記インビボ制御要素に結合する化合物の存在又は不在に依存し、また、例示的な態様によれば、前記インビボ制御要素に結合する化合物の存在に依存する。

本開示における、リンパ球を遺伝子操作し、増加させる方法、又は、養子細胞治療を実施する方法、又は類似の方法に関する側面の何れかの例示的な態様によれば、最も広い側面で明示的に規定されていない場合には、前記接触の実施前の７、１４、又は２１日間以内、前記接触の間、及び／又は、前記遺伝子操作Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞の前記対象への導入後の７、１４、又は２１日間以内に亘って、前記対象がリンパ枯渇剤に露出されない。他の態様によれば、前記接触の間、前記対象がリンパ枯渇剤に露出されない。

本開示における、リンパ球を遺伝子操作し、増加させる方法、又は、細胞治療を実施する方法、又は類似の方法に関する側面の何れかの例示的な態様によれば、最も広い側面で明示的に規定されていない場合には、前記静止Ｔ細胞及び／又は静止ＮＫ細胞が、１５分間から１２時間に亘って、前記組換レトロウイルスと接触される。

本開示における、リンパ球を遺伝子操作し、増加させる方法、又は、養子細胞治療を実施する方法、又は類似の方法に関する側面の何れかの例示的な態様によれば、最も広い側面で明示的に規定されていない場合には、前記方法は更に、前記接触後且つ前記導入前に、前記Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞から前記組換レトロウイルスを分離する工程を含む。本開示における、リンパ球を遺伝子操作し、増加させる方法、又は、細胞治療を実施する方法、又は類似の方法に関する側面の何れかの例示的な態様によれば、最も広い側面で明示的に規定されていない場合には、前記暴露工程が、前記接触前又は接触時、及び／又は、前記遺伝子操作Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞の前記対象への導入後に、一回用量の前記化合物を前記対象に投与することを含む。

本開示における、リンパ球を遺伝子操作し、増加させる方法、又は、養子細胞治療を実施する方法、又は類似の方法に関する側面の何れかの例示的な態様によれば、最も広い側面で明示的に規定されていない場合には、前記方法が、前記Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞をエクスビボで前記組換レトロウイルスと接触させる前に、前記Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を含む血液を前記対象から採取することを含み、ここで前記導入が再導入である。例えば、２０～２５０ｍＬの血液が前記対象から抜き取られる。

本開示における、リンパ球を遺伝子操作し、増加させる方法、又は、細胞治療を実施する方法、又は類似の方法に関する側面の何れかの例示的な態様によれば、最も広い側面で明示的に規定されていない場合には、前記対象から血液を採取する時点と、前記遺伝子操作Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を前記対象に再導入する時点との間で経過する時間が、８、１２、２４、又は４８時間を超えない。

本開示における、リンパ球を遺伝子操作し、増加させる方法、又は、細胞治療を実施する方法、又は類似の方法に関する側面の何れかの例示的な態様によれば、最も広い側面で明示的に規定されていない場合には、前記対象から血液を採取する時点と、前記遺伝子操作Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を前記対象に再導入する時点との間で経過する時間の下限が４又は８時間であり、上限が１２、２４、３６、又は４８時間の範囲である。

本開示における、リンパ球を遺伝子操作し、増加させる方法、又は、養子細胞治療を実施する方法、又は類似の方法に関する側面の何れかの例示的な態様によれば、最も広い側面で明示的に規定されていない場合には、血液の採取後且つ再導入前の全工程が閉鎖系で実施され、処理全体に亘ってヒトが前記閉鎖系を監視する。他の態様によれば、血液の採取後且つ再導入前の工程が閉鎖系で実施され、前記閉鎖系が前記対象のいる部屋である。

本開示にて提供される、１又は２以上の改変シグナル伝達ポリペプチドを含む方法及び組成物の何れかの例示的な態様によれば、最も広い側面で規定されていない場合には、前記改変シグナル伝達ポリペプチドの一つが、抗原特異的標的化領域（ＡＳＴＲ）と、前記ＡＳＴＲを前記リンパ増殖性要素に連結する膜貫通ドメインとを更に含む。この改変シグナル伝達ポリペプチドのＡＳＴＲが第１の腫瘍抗原と結合しうると共に、存在する場合には、前記第２の改変シグナル伝達ポリペプチドのＡＳＴＲが第２の腫瘍抗原と結合しうる。例示的な態様によれば、前記第１の改変シグナル伝達ポリペプチド及び／又は前記第２の改変シグナル伝達ポリペプチドが、更に共刺激ドメインを含む。更に、前記第１の改変シグナル伝達ポリペプチド及び／又は前記第２の改変シグナル伝達ポリペプチドが、更に柄部を含む。更に、前記第１の改変シグナル伝達ポリペプチドが更に、細胞内活性化ドメインを含む。前記第１の改変シグナル伝達ポリペプチド及び／又は前記第２の改変シグナル伝達ポリペプチドの細胞内活性化ドメインは、ＣＤ３ζに由来するものであってもよい。

本開示にて提供されるリンパ増殖性要素を含む方法及び組成物の何れかの例示的な態様によれば、前記リンパ増殖性要素が、Ｔ細胞生存モチーフを含んでいてもよい。前記Ｔ細胞生存モチーフが、ＩＬ－７受容体、ＩＬ－１５受容体、又はＣＤ２８の全体又は機能断片を含んでいてもよい。他の態様によれば、前記リンパ増殖性要素が、サイトカイン又はサイトカイン受容体ポリペプチド、又はシグナル伝達ドメインを含むその断片を含んでいてもよい。例えば、前記リンパ増殖性要素が、同種のインターロイキン受容体ポリペプチドにリンカーを介して共有結合されているインターロイキンポリペプチドを含んでいてもよい。或いは、前記リンパ増殖性要素が、ＩＬ－７受容体の細胞内シグナル伝達ドメイン、ＩＬ－１２受容体の細胞内シグナル伝達ドメイン、ＩＬ－２３の細胞内シグナル伝達ドメイン、ＩＬ－２７の細胞内シグナル伝達ドメイン、ＩＬ－１５受容体の細胞内シグナル伝達ドメイン、ＩＬ－２１受容体の細胞内シグナル伝達ドメイン、又は形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）デコイ受容体の細胞内シグナル伝達ドメインであってもよい。他の例示的な態様によれば、前記リンパ増殖性要素が構成的に活性である。更に、前記リンパ増殖性要素が、変異型ＩＬ－７受容体又はその断片を含んでいてもよく、斯かる変異型ＩＬ－７受容体又はその断片が更に、構成的に活性な変異型ＩＬ－７受容体又は構成的に活性なその断片を含んでいてもよい。

本開示にて提供される１又は２以上の組換レトロウイルスを含む方法及び組成物の何れかの例示的な態様によれば、最も広い側面で明示的に規定されていない場合には、前記組換レトロウイルスがその表面に、
Ａ．ＣＤ３に結合可能な膜結合性ポリペプチド；及び／又は
Ｂ．ＣＤ２８に結合可能な膜結合性ポリペプチド
を含む活性化要素を含んでいてもよい。

更に、前記ＣＤ３に結合可能な膜結合性ポリペプチドが、異種ＧＰＩアンカー付着配列と融合されていてもよいＣＤ３に結合可能なポリペプチドであってもよく、前記ＣＤ２８に結合可能な膜結合性ポリペプチドが、異種ＧＰＩアンカー付着配列と融合されていてもよいＣＤ２８に結合可能なポリペプチドであってもよい。ある態様によれば、前記ＣＤ２８に結合可能な膜結合性ポリペプチドが、ＣＤ８０、ＣＤ８６、又はＡｋｔのＣＤ２８媒介活性化を誘導しうるその機能断片、例えば前記ＣＤ８０の細胞外ドメインである。

本開示にて提供される組換レトロウイルスを含む方法及び組成物の何れかの例示的な態様によれば、前記のＣＤ３に結合可能な膜結合性ポリペプチドが、ＣＤ１４ＧＰＩアンカー付着配列に結合した抗ＣＤ３ｓｃＦｖであってもよく、前記ＣＤ２８に結合可能な膜結合性ポリペプチドが、ＣＤ１６ＢＧＰＩアンカー付着配列に結合したＣＤ８０又はその細胞外ドメインであってもよい。本開示にて提供される組換レトロウイルスを含む方法及び組成物の何れかの例示的な態様によれば、前記組換レトロウイルスがその表面に、ＣＤ１４ＧＰＩアンカー付着配列に結合した抗ＣＤ３ｓｃＦｖ、ＧＰＩアンカー付着配列に結合したＣＤ８０又はその細胞外ドメイン、ＣＤ１６Ｂ、及びＧＰＩアンカー付着配列を含むＩＬ－７又はその活性断片とＤＡＦとの融合ポリペプチドを含んでいてもよい。本開示にて提供される組換レトロウイルスを含む方法及び組成物の何れかの例示的な態様によれば、前記のＩＬ－７又はその活性断片とＤＡＦとの融合体、前記抗ＣＤ３ｓｃＦＶ、及び前記ＣＤ８０、又はその細胞外ドメインが、各々ＤＡＦシグナル配列を含む。

本開示にて提供される１又は２以上の組換レトロウイルスを含む方法及び組成物の何れかの例示的な態様によれば、最も広い側面で明示的に規定されていない場合には、前記組換レトロウイルスがその表面に、膜結合サイトカインを含んでいてもよい。前記膜結合サイトカインが、ＩＬ－７、ＩＬ－１５又はその活性断片であってもよい。他の態様によれば、前記膜結合サイトカインが、ＩＬ－７又はその活性断片とＤＡＦとの融合ポリペプチドである。例えば、前記融合ポリペプチドが、ＤＡＦシグナル配列（配列番号１０７のヌクレオチド１～３１）、シグナル配列を欠くＩＬ－７（配列番号１０７のヌクレオチド３２～１８７）、及びそのＧＰＩアンカー付着配列を含むＤＡＦの断片（配列番号１０７のヌクレオチド１８８～５２７）を含んでいてもよい。

本開示にて提供される方法及び組成物の側面の何れかの例示的な態様によれば、前記シュードタイピング要素が、１又は２以上の異種エンベロープタンパク質を含んでいてもよい。他の例によれば、前記シュードタイピング要素が、Ｔ細胞によって認識される１又は２以上のウイルスポリペプチドを含んでいてもよい。前記１又は２以上のシュードタイピング要素が、麻疹ウイルスＦポリペプチド、麻疹ウイルスＨポリペプチド、及び／又は、その断片を含んでいてもよい。前記１又は２以上のシュードタイピング要素が、麻疹ウイルスＦポリペプチド及び／又は麻疹ウイルスＨポリペプチドの細胞質ドメイン欠失変異体であってもよい。

本開示にて提供されるインビボ制御要素を含む方法及び組成物の何れかの例示的な態様によれば、前記インビボ制御要素は、前記リンパ増殖性要素である。ここで前記リンパ増殖性要素は、前記Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞の増殖を促進する活性が、前記化合物の不在下では不活性であり、或いは活性が低減されてなる。また、前記化合物は、前記リンパ増殖性要素に結合し、前記リンパ増殖性要素の活性を誘導する分子シャペロンである。

本開示にて提供されるインビボ制御要素を含む方法及び組成物の何れかの例示的な態様によれば、前記インビボ制御要素が、リボスイッチを含むポリヌクレオチドであってもよい。前記リボスイッチが、ヌクレオシド類似体に結合可能であってもよく、前記インビボ制御要素に結合する化合物が、ヌクレオシド類似体である。前記ヌクレオシド類似体が、抗ウイルス剤であってもよい。前記抗ウイルス剤が、アシクロビル又はペンシクロビルであってもよい。

本開示にて提供される、ＡＳＴＲを含む改変シグナル伝達ポリペプチドを含む方法及び組成物の何れかの例示的な態様によれば、前記改変シグナル伝達ポリペプチドの一方又は両方のＡＳＴＲが、腫瘍関連抗原に結合しうる。ある例示的な態様によれば、前記第２の改変されたポリペプチドの抗原特異的標的化領域が、微小環境制限抗原特異的標的化領域である。

本開示にて提供される１又は２以上の組換レトロウイルスを含む方法及び組成物の何れかの例示的な態様によれば、最も広い側面で明示的に規定されていない場合には、前記組換レトロウイルスは、モノクローナル抗体承認済生物製剤のための認識ドメインをコードしうる。ある態様によれば、前記認識ドメインが、前記キメラ抗原受容体と同じ転写産物から発現されると共に、前記認識ドメインが、リボソームスキッピング及び／又は切断シグナルによって前記キメラ抗原受容体から隔てられてなる。前記リボソームスキッピング及び／又は切断シグナルが、２Ａ－１であってもよい。前記認識ドメインが、ＥＧＦＲ又はそのエピトープを認識する抗体によって認識されるポリペプチドを含んでいてもよい。本開示にて提供される他の制御機構のように、前記認識ドメインが、ＥＧＦＲ抗体によって認識されるＥＧＦＲ変異体であり、形質導入Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞の表面に発現されていてもよい。関連する態様によれば、前記認識ドメインが、ＥＧＦＲ又はそのエピトープを認識する抗体によって認識されるポリペプチドを含んでいてもよい。

本開示にて提供されるリンパ増殖性要素を含む方法又は組成物の何れにおいても、前記リンパ増殖性要素が、ＳＴＡＴ５経路を刺激し、又はＳＯＣＳ経路を阻害するｍｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡであってもよい。例えば、前記ｍｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡが、ＡＢＣＧ１、ＳＯＣＳ、ＴＧＦｂＲ２、ＳＭＡＤ２、ｃＣＢＬ、及びＰＤ１からなる群より選択されるタンパク質をコードする核酸に結合するｍｉＲＮＡである。本開示にて提供される組換レトロウイルス又は形質導入細胞、又はこれを含む方法の何れかについての例示的な態様によれば、斯かる組換レトロウイルス又は形質導入細胞は、ｍｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを、例えばイントロン内にコードしていてもよく、ある態様によれば、１、２、３、又は４の態様では、以下の標的内因性Ｔ細胞発現遺伝子のうち１又は２以上をコードする核酸に結合する：ＰＤ－１；ＣＴＬＡ４；ＴＣＲ α；ＴＣＲ β；ＣＤ３ζ；ＳＯＣＳ；ＳＭＡＤ２；ｍｉＲ－１５５；ＩＦＮ γ；ｃＣＢＬ；ＴＲＡＩＬ２；ＰＰ２Ａ；又はＡＢＣＧ１。例えば、一の態様によれば、以下のｍｉＲＮＡの組み合わせが、組換レトロウイルス又は形質導入細胞のゲノム内に含まれていてもよい：ＴＣＲ α、ＣＤ３ζ、ＩＦＮ γ、及びＰＤ－１；他の態様では、ＳＯＣＳ１、ＩＦＮ γ、ＴＣＲ α、及びＣＤ３ζ。

本開示にて提供される方法及び組成物の何れかの例示的な態様によれば、前記組換レトロウイルス、哺乳類細胞、及び／又は、パッケージング細胞が、Ｖｐｘポリペプチドを含んでいてもよい。前記Ｖｐｘポリペプチドは、例えば融合ポリペプチドであってもよく、ある例では、特にパッケージング細胞内では、膜結合Ｖｐｘポリペプチドであってもよい。

本開示にて提供される方法又は組成物の何れにおいても、前記１又は２以上のシュードタイピング要素が、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ－Ｇ）エンベロープタンパク質、ネコ内因性ウイルス（ＲＤ１１４）エンベロープタンパク質、オンコレトロウイルス両種指向性エンベロープタンパク質、又はオンコレトロウイルス同種志向性エンベロープタンパク質又はその機能断片を含んでいてもよい。

他の側面によれば、本開示では、遺伝子操作されたＴ細胞及び／又はＮＫ細胞であって、
ａ．リンパ増殖性要素を含む第１の改変シグナル伝達ポリペプチド、及び、
ｂ．抗原特異的標的化領域（ＡＳＴＲ）、膜貫通ドメイン、及び細胞内活性化ドメインを含むキメラ抗原受容体を含む第２の改変シグナル伝達ポリペプチド
を含む細胞が提供される。

本開示にて提供される哺乳類パッケージング細胞を含む方法（例えば、組換レトロウイルスパッケージング系の側面や、組換レトロウイルスを作製する方法等）の何れかにおいて、前記パッケージ可能なＲＮＡゲノムは、プロモーターに作動式に連結されたポリヌクレオチドによってコードされ、ここで前記プロモーターが、構成的に活性であるか、或いは前記第１のトランス活性化因子又は前記第２のトランス活性化因子により誘導されうる。前記パッケージ可能なＲＮＡゲノムが、プロモーターに作動式に連結されたポリヌクレオチドによりコードされていてもよく、ここで前記プロモーターは、前記第２のトランス活性化因子によって誘導されてもよい。本開示において前記第１及び／又は第２の改変シグナル伝達ポリペプチドの発現を誘導するのに使用されるプロモーターは、通常は標的細胞、例えばリンパ球、ＰＢＬ、Ｔ細胞、及び／又はＮＫ細胞等において活性であるが、例示的な態様によれば、前記パッケージング細胞株では活性を有さない。前記第２のトランス活性化因子は、前記標的細胞に結合してこれを活性化する能力を有する活性化要素の発現を制御しうる。本開示にて提供される哺乳類パッケージング細胞を含む方法（例えば、組換レトロウイルスパッケージング系の側面や、組換レトロウイルスを作製する方法等、例えば、ある態様ではパッケージ可能なＲＮＡゲノム）の何れかにおいて、前記パッケージ可能なＲＮＡゲノムの発現が、前記第２のトランス活性化因子によって制御されてもよい。

更に、前記パッケージ可能なＲＮＡゲノムが、５’側から３’側に向かって、
１．）５’側末端反復配列（長末端リピート）又はその活性断片、
２．）レトロウイルスシス作用型ＲＮＡパッケージング要素をコードする核酸配列、
３．）第１の標的ポリペプチドをコードする核酸配列、
４．）前記標的細胞内で活性なプロモーター、及び
５．）３’側末端反復配列（長末端リピート）又はその活性断片
を含んでいてもよい。

ある態様によれば、前記の第１の標的ポリペプチドをコードする核酸配列が、パッケージング及びアセンブリのためのレトロウイルス成分をコードするＲＮＡとは逆向きに配置される。

本開示にて提供される、哺乳類パッケージング細胞を含む方法（例えば、組換レトロウイルスパッケージング系の側面や、組換レトロウイルスを作製する方法等）の何れかにおいて、前記第１の標的ポリペプチドが、第１の改変シグナル伝達ポリペプチドを含み、ここで前記第１の改変シグナル伝達ポリペプチドは、リンパ増殖性要素を含む。前記パッケージ可能なＲＮＡゲノムが更に、第２の標的ポリペプチドをコードする核酸配列を含んでいてもよい。前記第２の標的ポリペプチドが、
１．）第１の抗原特異的標的化領域、
２．）第１の膜貫通ドメイン、及び、
３．）第１の細胞内活性化ドメイン
を含むキメラ抗原受容体を含む、第２の改変シグナル伝達ポリペプチドを含んでいてもよい。

本開示にて提供される、哺乳類パッケージング細胞を含む方法（例えば、組換レトロウイルスパッケージング系の側面や、組換レトロウイルスを作製する方法等）の何れかにおいて、前記哺乳類細胞、例えば前記パッケージング細胞が、Ｖｐｘをコードする核酸配列を、例えば前記第２の転写単位上に、或いは任意の第３の転写単位上に、或いは前記第１の誘導型プロモーターに作動式に連結された更なる転写単位上に含んでいてもよい。パッケージング細胞等の前記哺乳類細胞は、２９３細胞であってもよい。

本開示にて提供される、哺乳類パッケージング細胞を含む方法（例えば、組換レトロウイルスパッケージング系の側面や、組換レトロウイルスを作製する方法等）の何れかにおいて、第１のリガンドがラパマイシンであってもよく、第２のリガンドがテトラサイクリン又はドキソルビシンであってもよい。或いは、前記第１のリガンドがテトラサイクリン又はドキソルビシンであってもよく、前記第２のリガンドがラパマイシンであってもよい。

ある側面によれば、本開示では、本開示にて提供される組換レトロウイルスの何れかによって形質導入された細胞が提供される。前記細胞は、例えばリンパ球、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞であってもよい。例示的な態様によれば、前記細胞はヒト細胞である。

一側面によれば、本開示では、対象の遺伝子操作Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を増加させる方法であって、
ａ．）前記対象から得られた単離された静止Ｔ細胞及び／又は静止ＮＫ細胞を、本開示に示す態様の何れかの組換レトロウイルスと接触させ、
ｂ．）前記遺伝子操作Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を、前記対象に導入し、
ｃ．）有効量のアシクロビル、アシクロビルプロドラッグ、ペンシクロビル、又はペンシクロビルプロドラッグを、前記対象に提供し、ここで前記対象において、アシクロビル、アシクロビルプロドラッグ、ペンシクロビル、又はペンシクロビルプロドラッグの投与に伴い、前記遺伝子操作Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞が増加し、こうして前記対象の前記遺伝子操作Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞が増加される
ことを含む方法が提供される。

他の側面において、本開示では、対象において遺伝子操作Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞の増加、生着、及び／又は、持続を停止する方法であって、
ａ．）前記対象から得られた単離された無活動（quiescent）Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を、本開示に示す態様の何れかの組換レトロウイルスと接触させ、
ｂ．）前記遺伝子操作Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を前記対象に導入し、
ｃ．）有効量のアシクロビル、アシクロビルプロドラッグ、ペンシクロビル、又はペンシクロビルプロドラッグを前記対象に投与することにより、前記対象において前記遺伝子操作Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を増加させ、ここでアシクロビル、アシクロビルプロドラッグ、ペンシクロビル、又はペンシクロビルプロドラッグの投与に伴い、前記対象において前記遺伝子操作Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞が増加し、こうして前記対象における前記遺伝子操作Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞が増加し、
ｄ．）アシクロビル、アシクロビルプロドラッグ、ペンシクロビル、又はペンシクロビルプロドラッグの投与を停止し、ここでアシクロビル、アシクロビルプロドラッグ、ペンシクロビル、又はペンシクロビルプロドラッグの投与の停止に伴い、前記対象において前記遺伝子操作Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞が増殖を停止し、これにより前記対象における前記遺伝子操作Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞の増加、増加、及び／又は、持続が制御される
ことを含む方法が提供される。

他の側面において、本開示では、対象において癌を治療する方法であって、
ａ．前記対象から得られた単離された無活動（quiescent）Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を、本開示に示す態様の何れかに係る組換ベクターと接触させ、
ｂ．前記遺伝子操作Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を、前記対象に導入し、
ｃ．有効量のアシクロビル、アシクロビルプロドラッグ、ペンシクロビル、又はペンシクロビルプロドラッグを前記対象に投与することにより、前記対象において前記遺伝子操作Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を増加させ、ここでアシクロビル、アシクロビルプロドラッグ、ペンシクロビル、又はペンシクロビルプロドラッグの投与に伴い、前記対象において前記遺伝子操作Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞が増加し、ここで前記対象において、前記遺伝子操作Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞内の前記キメラ抗原受容体が、癌細胞に結合することにより、前記対象の癌が治療される
ことを含む方法が提供される。

他の側面において、本開示では、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞内で活性なプロモーターに作動式に連結された１又は２以上の転写単位を含む組換ポリヌクレオチドを含む形質導入Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞であって、ここで前記１又は２以上の転写単位は、インビボ制御要素により制御される第１の改変シグナル伝達ポリペプチドをコードし、ここで前記第１の改変シグナル伝達ポリペプチドが、構成的に活性なＩＬ－７受容体変異体を含み、ここで前記インビボ制御要素は、インビボで化合物に結合する能力を有し、及び／又は、結合するように設計され、及び／又は、結合するように構成されてなる、形質導入Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞が提供される。

他の側面において、本開示では、哺乳類細胞を含むレトロウイルスパッケージング系であって、前記哺乳類細胞が、
Ａ．構成型プロモーターから発現されて、第１のリガンド及び第１の誘導型プロモーターと結合する能力を有し、これと作動式に連結された核酸配列の発現に対し、前記第１のリガンドの不在時と比較して、前記第１のリガンドの存在時において影響を及ぼす、第１のトランス活性化因子、
Ｂ．第２のリガンド及び第２の誘導型プロモーターと結合する能力を有し、これと作動式に連結された核酸配列の発現に対し、前記第２のリガンドの不在時と比較して、前記第２のリガンドの存在時において影響を及ぼす、第２のトランス活性化因子、並びに、
Ｃ．レトロウイルス粒子のためのパッケージ可能なＲＮＡゲノムを含み、
ここで前記第１のトランス活性化因子が、前記第２のトランス活性化因子及びレトロウイルスＲＥＶタンパク質の発現を制御し、ここで前記第２のトランス活性化因子が、ｇａｇポリペプチド、ｐｏｌポリペプチド、及び、標的細胞に結合して当該細胞への膜融合を促進する能力を有する１又は２以上のシュードタイピング要素の発現を制御し、ここで前記レトロウイルスタンパク質がレトロウイルスから誘導される、含むレトロウイルスパッケージング系が提供される。この側面のある態様は、本開示にて提供される他の側面について規定される要素の態様の何れかを含んでいてもよい。

他の側面において、本開示では、組換レトロウイルスを作製する方法であって、前記方法が、
Ａ．パッケージング細胞の集団を培養することにより、第１のトランス活性化因子を蓄積させ、ここで前記パッケージング細胞が、第１の構成型プロモーターにより発現される第１のトランス活性化因子を含み、ここで前記第１のトランス活性化因子が、第１のリガンド及び第１の誘導型プロモーターと結合する能力を有すると共に、これと作動式に連結された核酸配列の発現に対し、前記第１のリガンドの不在時と比較して、前記第１のリガンドの存在時において影響を及ぼし、且つ、ここで第２のトランス活性化因子及びレトロウイルスＲＥＶタンパク質の発現が、前記第１のトランス活性化因子によって制御され、
Ｂ．蓄積された第１のトランス活性化因子を含む前記パッケージング細胞集団を、前記第１のリガンドの存在下でインキュベートすることにより、前記第２のトランス活性化因子及び前記レトロウイルスＲＥＶタンパク質を蓄積させ、ここで前記第２のトランス活性化因子が、第２のリガンド及び第２の誘導型プロモーターと結合する能力を有し、これと作動式に連結された核酸配列の発現に対し、前記第２のリガンドの不在時と比較して、前記第２のリガンドの存在時において影響を及ぼし、
Ｃ．蓄積された第２のトランス活性化因子及びレトロウイルスＲＥＶタンパク質を含む前記パッケージング細胞集団を、前記第２のリガンドの存在下でインキュベートすることにより、ｇａｇポリペプチド、ｐｏｌポリペプチド、及び１又は２以上のシュードタイピング要素の発現を誘導し、これにより前記組換レトロウイルスを作製する
ことを含み、
ここでパッケージ可能なＲＮＡゲノムが、第３のプロモーターに作動式に連結されたポリヌクレオチドによってコードされ、ここで前記第３のプロモーターが、構成的に活性であるか、或いは前記第１のトランス活性化因子又は前記第２のトランス活性化因子により誘導されうると共に、前記１又は２以上のシュードタイピング要素が、標的細胞に結合し、及び／又は、当該細胞への組換レトロウイルスの膜融合を促進する能力を有する、方法が提供される。

本開示にて提供される組換レトロウイルスを作製するためのレトロウイルスパッケージング系及び方法の側面のある態様によれば、前記哺乳類細胞が更に、標的細胞に結合して当該細胞を活性化することが可能な活性化要素を含み、前記第１のトランス活性化因子が、前記活性化要素の発現を制御する。前記活性化要素は、前記レトロウイルスの表面に存在し、ここで前記活性化要素が、ＣＤ３に結合可能な膜結合性ポリペプチド、及び／又は、ＣＤ２８に結合可能な膜結合性ポリペプチドを含んでいてもよい。前記ＣＤ３に結合可能な膜結合性ポリペプチドが、異種ＧＰＩアンカー付着配列に融合された、ＣＤ３に結合可能なポリペプチドであり、前記ＣＤ２８に結合可能な膜結合性ポリペプチドが、異種ＧＰＩアンカー付着配列に融合された、ＣＤ２８に結合可能なポリペプチドである。ある態様によれば、前記ＣＤ２８に結合可能な膜結合性ポリペプチドが、ＣＤ８０、ＣＤ８６、又はＡｋｔのＣＤ２８媒介活性化を誘導しうるその機能断片、例えばＣＤ８０の細胞外ドメインを含む。他の態様によれば、ＣＤ３に結合可能な膜結合性ポリペプチドは、ＣＤ１４ＧＰＩアンカー付着配列に結合した抗ＣＤ３ｓｃＦｖであり、前記ＣＤ２８に結合可能な膜結合性ポリペプチドは、ＣＤ１６ＢＧＰＩアンカー付着配列に結合したＣＤ８０、又はその細胞外断片である。

本開示にて提供されるレトロウイルスパッケージング系及び組換レトロウイルスを作製する方法の側面のある態様によれば、前記哺乳類細胞が更に、膜結合サイトカインを含み、前記第１のトランス活性化因子が、前記膜結合サイトカインの発現を制御する。前記膜結合サイトカインは、例えばＩＬ－７、ＩＬ－１５又はその活性断片であってもよい。ある態様によれば、前記膜結合サイトカインが、ＩＬ－７又はその活性断片とＤＡＦとの融合ポリペプチドであってもよい。例えば、前記融合ポリペプチドが、ＤＡＦシグナル配列と、シグナル配列を欠くＩＬ－７、更にそれに続くＤＡＦの残基３６～５２５を含んでいてもよい。

本開示にて提供されるレトロウイルスパッケージング系及び組換レトロウイルスを作製する方法の側面のある態様によれば、前記哺乳類細胞が、その細胞膜に結合した状態で、ＣＤ１４ＧＰＩアンカー付着配列に結合した抗ＣＤ３ｓｃＦｖと、ＣＤ１６ＢＧＰＩアンカー付着配列に結合したＣＤ８０又はその細胞外断片とを含む活性化要素、並びに、ＧＰＩアンカー付着配列を含むＩＬ－７又はその活性断片とＤＡＦとの融合ポリペプチドを含む膜結合サイトカインを含む。ここで前記第１のトランス活性化因子が、前記の活性化要素及び膜結合サイトカインの各々の発現を制御する。ある態様によれば、前記のＩＬ－７又はその活性断片とＤＡＦとの融合体、前記抗ＣＤ３ｓｃＦＶ、及び前記ＣＤ８０、又はその細胞外断片が各々、ＤＡＦシグナル配列を含む。

本開示にて提供されるレトロウイルスパッケージング系及び組換レトロウイルスを作製する方法の側面のある態様によれば、前記哺乳類細胞が更に、Ｖｐｘポリペプチドを含む。これらの態様又は他の態様によれば、前記１又は２以上のシュードタイピング要素が、Ｔ細胞によって認識される１又は２以上のウイルスポリペプチドを含む。前記１又は２以上のシュードタイピング要素が、麻疹ウイルスＦポリペプチド、麻疹ウイルスＨポリペプチド、及び／又は、その断片を含んでいてもよい。一部の例示的な態様によれば、前記１又は２以上のシュードタイピング要素は、麻疹ウイルスＦポリペプチド及び／又は麻疹ウイルスＨポリペプチドの細胞質ドメイン欠失変異体である。

本開示にて提供されるレトロウイルスパッケージング系及び組換レトロウイルスを作製する方法の側面のある態様によれば、前記パッケージ可能なＲＮＡゲノムが、第３のプロモーターに作動式に連結されたポリヌクレオチドによってコードされ、ここで前記第３のプロモーターが、構成的に活性であるか、或いは前記第１のトランス活性化因子又は前記第２のトランス活性化因子により誘導されうる。例示的な態様によれば、前記パッケージ可能なＲＮＡゲノムが、第３のプロモーターに作動式に連結されたポリヌクレオチドによってコードされ、ここで前記第３のプロモーターが、前記第２のトランス活性化因子によって誘導されうる。

本開示にて提供されるレトロウイルスパッケージング系及び組換レトロウイルスを作製する方法の側面のある態様によれば、前記パッケージ可能なＲＮＡゲノムが更に、５’側から３’側に向かって、
ａ）５’側末端反復配列（長末端リピート）又はその活性断片、
ｂ）レトロウイルスシス作用型ＲＮＡパッケージング要素をコードする核酸配列、
ｃ）第１の標的ポリペプチド、及び任意により第２の標的ポリペプチドをコードする核酸配列、
ｄ）前記第１の標的ポリペプチド及び前記任意の第２のポリペプチドと作動式に連結された、前記標的細胞内では活性であるが前記パッケージング細胞株内では不活性な第４のプロモーター、並びに、
ｅ）３’側末端反復配列（長末端リピート）又はその活性断片
を含む。

本開示にて提供される、直前に記載のコンストラクトを含むレトロウイルスパッケージング系及び組換レトロウイルスを作製する方法の側面のある態様によれば、前記第３のプロモーターは、前記第４のプロモーターにより促進される転写又は発現とは逆方向の転写又は発現を誘導する。

本開示にて提供されるレトロウイルスパッケージング系及び組換レトロウイルスを作製する方法の側面のある態様によれば、前記パッケージ可能なＲＮＡゲノムが、本開示に示す態様の何れかの組換レトロウイルスをコードし、ここで前記第１の標的ポリペプチド及び前記第２の標的ポリペプチドが、それぞれ前記第１の改変シグナル伝達ポリペプチド及び前記第２の改変シグナル伝達ポリペプチドである。ある態様によれば、例えば、前記パッケージ可能なＲＮＡゲノムが更に、前記第１の改変シグナル伝達ポリペプチド又は前記第２の改変シグナル伝達ポリペプチドをコードする核酸と作動式に連結されたインビボ制御要素を含む。例示的な態様によれば、前記インビボ制御要素がリボスイッチである。例示的な態様によれば、前記リボスイッチが化合物に結合しうると共に、前記インビボ制御要素に結合する化合物がヌクレオシド類似体である。また、前記ヌクレオシド類似体が抗ウイルス薬、例えばアシクロビル又はペンシクロビルであってもよい。

本開示にて提供されるレトロウイルスパッケージング系及び組換レトロウイルスを作製する方法の側面のある態様によれば、前記パッケージ可能なＲＮＡゲノムが更に、ｍｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含むイントロンを含む。前記イントロンが、前記第４のプロモーターの下流に隣接して存在していてもよい。

本開示にて提供されるレトロウイルスパッケージング系及び組換レトロウイルスを作製する方法の側面のある態様によれば、前記標的細胞がＴ細胞及び／又はＮＫ細胞であってもよい。

本開示にて提供されるレトロウイルスパッケージング系及び組換レトロウイルスを作製する方法の側面のある態様によれば、前記１又は２以上のシュードタイピング要素が、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ－Ｇ）エンベロープタンパク質、ネコ内因性ウイルス（ＲＤ１１４）エンベロープタンパク質、オンコレトロウイルス両種指向性エンベロープタンパク質、又はオンコレトロウイルス同種志向性エンベロープタンパク質又はその機能断片を含む。

本開示にて提供されるレトロウイルスパッケージング系及び組換レトロウイルスを作製する方法の側面のある態様によれば、前記パッケージ可能なＲＮＡゲノムのサイズは、１１，０００ＫＢ以下、又は１０，０００ＫＢ以下である。本開示にて提供されるレトロウイルスパッケージング系及び組換レトロウイルスを作製する方法の側面のある態様によれば、前記第１の標的ポリペプチドが、第１の改変シグナル伝達ポリペプチドを含み、ここで前記第１の改変シグナル伝達ポリペプチドは、リンパ増殖性要素を含み、前記第２の標的ポリペプチドが、ＣＡＲを含む第２の改変シグナル伝達ポリペプチドを含む。

一側面によれば、本開示では、標的ポリヌクレオチドの発現を制御するための単離ポリヌクレオチドであって、前記単離ポリヌクレオチドが、プロモーター及びリボスイッチに作動式に連結された標的ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを含み、前記リボスイッチが、
ａ．）ヌクレオシド類似体抗ウイルス薬に結合可能であると共に、グアニン又は２’－デオキシグアノシンへの結合が、前記ヌクレオシド類似体抗ウイルス薬への結合と比較して制限されてなるアプタマードメイン、及び、
ｂ．）前記標的ポリヌクレオチドの発現を制御することが可能な機能スイッチングドメインを含み、
前記ヌクレオシド類似体に前記アプタマードメインが結合すると、前記機能スイッチングドメインの発現制御活性が誘導又は抑制されることにより、前記標的ポリヌクレオチドの発現が制御される、単離ポリヌクレオチドが提供される。

本開示にて提供されるインビボ制御要素を含む方法及び組成物の何れかの例示的な態様によればが、リボスイッチを含むポリヌクレオチドであってもよい。前記リボスイッチが、ヌクレオシド類似体に結合可能であってもよく、前記インビボ制御要素に結合する化合物は、ヌクレオシド類似体である。前記ヌクレオシド類似体が、抗ウイルス剤であってもよい。前記抗ウイルス剤が、アシクロビル又はペンシクロビルであってもよい。前記リボスイッチは、ペンシクロビルよりもアシクロビルに対して優先的に結合してもよく、アシクロビルよりもペンシクロビルに対して優先的に結合してもよい。前記リボスイッチは、３７℃を超える温度で、３７．５℃、３８℃、３８．５℃、又は３９℃で、例えば３９℃超で、前記ヌクレオシド類似体抗ウイルス薬への結合が低減されてもよい。前記リボスイッチの長さは、下限が３５、４０、４５、及び５０ヌクレオチド、上限が６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、及び１００ヌクレオチドであってもよく、例えば４５～８０ヌクレオチドであってもよい。本開示にて提供されるリボスイッチを含む方法及び組成物の何れかの例示的な態様によれば、前記リボスイッチによって制御される前記標的ポリヌクレオチドが、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及び／又は、ポリペプチドをコードする領域を含んでいてもよい。前記標的ポリヌクレオチドは、リンパ増殖性要素をコードしていてもよい。前記標的ポリヌクレオチドが、プロモーターに作動式に連結されていてもよい。前記標的ポリヌクレオチドが、ポリペプチドをコードする領域を含んでいてもよく、前記ポリペプチドが、抗原特異的標的化領域、膜貫通ドメイン、及び細胞内活性化ドメインを含むキメラ抗原受容体を含んでいてもよい。本開示にて提供されるリボスイッチを含む方法及び組成物の何れかの例示的な態様によれば、前記機能スイッチングドメインは、例えば内部リボソーム侵入部位、ウイルス遺伝子コンストラクト内のｍＲＮＡ前駆体スプライスドナーのアクセス可能性、翻訳、転写の終了、転写産物分解、ｍｉＲＮＡ発現、又はｓｈＲＮＡ発現を制御することにより、前記標的ポリヌクレオチドの発現を制御するものであってもよい。前記リボスイッチが、リボザイムを含んでいてもよい。本開示にて提供されるリボスイッチを含む方法及び組成物の何れかの例示的な態様によれば、前記単離ポリヌクレオチドが、分子クローニングベクター又は発現ベクターであってもよい。本開示にて提供されるリボスイッチを含む方法及び組成物の何れかの例示的な態様によれば、前記単離ポリヌクレオチドが、レトロウイルスゲノム内に、或いは哺乳類の染色体又はその断片内に組み込まれていてもよい。

本開示にて提供される他の側面は、対象のリンパ球を遺伝子操作し、増加させるための方法であって、
Ａ．前記対象から血液を採取し、
Ｂ．前記対象の血液由来のＴ細胞及び／又はＮＫ細胞を、エクスビボで組換レトロウイルスと接触させ、ここで前記組換レトロウイルスが、
ｉ．Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞に結合し、斯かる細胞への組換レトロウイルスの膜融合を促進することが可能な、麻疹ウイルスＦポリペプチド及び／又は麻疹ウイルスＨポリペプチドの細胞質ドメイン欠失変異体を含むシュードタイピング要素を、その表面に含むと共に、
ii．組換レトロウイルスの表面で発現されると共に、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞に結合する能力を有する、ＣＤ３に結合可能なポリペプチド及びＣＤ２８に結合可能なポリペプチド（但し、前記ポリペプチドは、前記組換レトロウイルス内のポリヌクレオチドによってコードされるものではない）を含み、更に、
iii．Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞内で活性なプロモーターに作動式に連結された、１又は２以上の転写単位を含むポリヌクレオチドを含み、
ここで前記１又は２以上の転写単位は、構成的に活性なＩＬ－７受容体変異体及び抗原特異的標的化領域（ＡＳＴＲ）を含む第１の改変シグナル伝達ポリペプチド、膜貫通ドメイン、並びに細胞内活性化ドメインを含むキメラ抗原受容体を含む第２の改変シグナル伝達ポリペプチドをコードし、
ここで前記ＩＬ－７受容体変異体の発現は、ヌクレオシド類似体抗ウイルス薬に結合するリボスイッチによって制御され、ここで前記ヌクレオシド類似体抗ウイルス薬が前記リボスイッチに結合することで、前記ＩＬ－７受容体変異体の発現が増加し、
ここで前記接触の結果、前記静止Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞の少なくとも一部が遺伝子操作され、
Ｃ．前記遺伝子操作Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を、前記対象に再導入し、
Ｄ．前記遺伝子操作Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を、インビボで前記ヌクレオシド類似体抗ウイルス薬に暴露することにより、前記Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞の増加を促進し、ここで前記方法の前記血液の採取から前記遺伝子操作Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞の再導入までの工程が、２４時間以内で実施され、及び／又は、事前のエクスビボでの刺激を要さずに実施され、これにより前記対象のリンパ球を遺伝子操作し、増加させる
ことを含む方法である。

この方法の側面の例示的な態様によれば、前記レトロウイルスはレンチウイルスである。他の例示的な態様によれば、前記組換レトロウイルスは、Ｔ細胞を遺伝子的に修飾する。他の例示的な態様によれば、前記ＣＤ３に結合可能なポリペプチド、及び、前記ＣＤ２８に結合可能なポリペプチドが各々、異種ＧＰＩアンカー付着配列に連結されてなる。ある例によれば、前記ＣＤ３に結合可能なポリペプチドが、抗ＣＤ３ｓｃＦｖＦｃ又は抗ＣＤ３ｓｃＦｖであってもよく、前記ＣＤ２８に結合可能なポリペプチドが、ＣＤ８０であってもよい。前記抗ＣＤ３ｓｃＦｖＦｃ又は抗ＣＤ３ｓｃＦｖ及びＣＤ８０は更に各々、ＤＡＦシグナル配列に連結されていてもよい。他の例示的な態様によれば、前記組換レトロウイルスが、更にその表面に、ＤＡＦと共有結合されたサイトカインを含む融合ポリペプチドを含む。ある例によれば、前記サイトカインが、ＩＬ－７又はＩＬ－１５であってもよく、前記融合ポリペプチドが、ＤＡＦシグナル配列、シグナル配列を欠くＩＬ－７、及び、ＧＰＩアンカー付着配列を含むＤＡＦの断片を含んでいてもよい。

直前に記載のこの方法の側面の他の例示的な態様によれば、前記リボスイッチが更に、前記キメラ抗原受容体の発現を制御すると共に、その制御が、前記リボスイッチのヌクレオシド類似体抗ウイルス薬への結合により制御される。ある例によれば、前記ヌクレオシド類似体抗ウイルス薬は、アシクロビル及び／又はペンシクロビルである。他の態様によれば、前記構成的に活性なＩＬ－７が、ｍｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡによって置換されていてもよい。ある例によれば、前記ｍｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡが、核酸によりイントロン内でコードされていてもよい。

本開示で提供される他の側面は、組換レトロウイルスであって、
Ａ．Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞に結合し、斯かる細胞への組換レトロウイルスの膜融合を促進することが可能な、麻疹ウイルスＦポリペプチド及び／又は麻疹ウイルスＨポリペプチドの細胞質ドメイン欠失変異体を含むシュードタイピング要素を、その表面に含むと共に、
Ｂ．Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞内で活性なプロモーターに作動式に連結された、１又は２以上の転写単位を含むポリヌクレオチド（ここで前記１又は２以上の転写単位は、抗原特異的標的化領域、膜貫通ドメイン、及び細胞内活性化ドメインを含むキメラ抗原受容体を含む、第１の改変シグナル伝達ポリペプチドと、構成的に活性なＩＬ－７受容体変異体を含む、第２の改変シグナル伝達ポリペプチドとをコードする）（ここで前記ＩＬ－７受容体変異体の発現は、ヌクレオシド類似体抗ウイルス薬に結合するリボスイッチによって制御され、ここで前記ヌクレオシド類似体抗ウイルス薬が前記リボスイッチに結合することで、前記ＩＬ－７受容体変異体の発現が増加する）、並びに、
Ｃ．ＣＤ３に結合可能なポリペプチド及びＣＤ２８に結合可能なポリペプチド（ここで前記ポリペプチドは、組換レトロウイルスの表面で発現されると共に、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞に結合可能であるが、前記組換レトロウイルス内のポリヌクレオチドによってコードされるものではない）
を含む組換レトロウイルスである。

直前に記載の組換レトロウイルスの側面の例示的な態様によれば、前記レトロウイルスはレンチウイルスである。前記方法の他の例示的な態様によれば、前記ＣＤ３に結合可能なポリペプチド、及び、前記ＣＤ２８に結合可能なポリペプチドが各々、異種ＧＰＩアンカー付着配列に連結されてなる。ある例によれば、前記ＣＤ３に結合可能なポリペプチドが、抗ＣＤ３ｓｃＦｖＦｃ又は抗ＣＤ３ｓｃＦｖであってもよく、前記ＣＤ２８に結合可能なポリペプチドが、ＣＤ８０であってもよい。前記抗ＣＤ３ｓｃＦｖＦｃ又は抗ＣＤ３ｓｃＦｖ及びＣＤ８０は更に各々、ＤＡＦシグナル配列に連結されていてもよい。他の例示的な態様によれば、前記組換レトロウイルスが、更にその表面に、ＤＡＦと共有結合されたサイトカインを含む融合ポリペプチドを含む。ある例によれば、前記サイトカインが、ＩＬ－７又はＩＬ－１５であってもよく、前記融合ポリペプチドが、ＤＡＦシグナル配列、シグナル配列を欠くＩＬ－７、及び、ＧＰＩアンカー付着配列を含むＤＡＦの断片を含んでいてもよい。

他の直前に記載の組換レトロウイルスの側面の例示的な態様によれば、前記リボスイッチが更に、前記キメラ抗原受容体の発現を制御すると共に、その制御が、前記リボスイッチの前記ヌクレオシド類似体抗ウイルス薬への結合により制御される。ある例によれば、前記ヌクレオシド類似体抗ウイルス薬が、アシクロビル及び／又はペンシクロビルである。他の態様によれば、前記構成的に活性なＩＬ－７が、ｍｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡによって置換されていてもよい。前記ｍｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡが、核酸によりイントロン内でコードされていてもよい。

本開示において提供される他の側面は、組換レトロウイルスを作製する方法であって、
Ａ．パッケージング細胞の集団を培養することにより、第１のトランス活性化因子を蓄積させ、ここで前記パッケージング細胞が、構成型プロモーターから発現される前記第１のトランス活性化因子を含み、ここで前記第１のトランス活性化因子が、第１のリガンド及び第１の誘導型プロモーターと結合する能力を有すると共に、これと作動式に連結された核酸配列の発現に対し、前記第１のリガンドの不在時と比較して、前記第１のリガンドの存在時において影響を及ぼし、且つ、ここで第２のトランス活性化因子及びレトロウイルスＲＥＶタンパク質の発現が、前記第１のトランス活性化因子によって制御され、
Ｂ．蓄積された第１のトランス活性化因子を含む前記パッケージング細胞集団を、前記第１のリガンドの存在下でインキュベートすることにより、前記第２のトランス活性化因子及び前記レトロウイルスＲＥＶタンパク質並びに活性化要素を、通常はその表面に蓄積させ、ここでＣＤ３に結合可能なポリペプチド及びＣＤ２８に結合可能なポリペプチドを含み、ここで前記第２のトランス活性化因子が、第２のリガンド及び第２の誘導型プロモーターと結合する能力を有し、これと作動式に連結された核酸配列の発現に対し、前記第２のリガンドの不在時と比較して、前記第２のリガンドの存在時において影響を及ぼし、
Ｃ．蓄積された第２のトランス活性化因子及びレトロウイルスＲＥＶタンパク質を含む前記パッケージング細胞集団を、前記第２のリガンドの存在下でインキュベートすることにより、ｇａｇポリペプチド、ｐｏｌポリペプチド、及び、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞に結合し、当該細胞に対する組換レトロウイルスの膜融合を促進する能力を有するシュードタイピング要素の発現を誘導し、ここで前記シュードタイピング要素が、麻疹ウイルスＦポリペプチド及び／又は麻疹ウイルスＨポリペプチドの細胞質ドメイン欠失変異体を含み、
ここでパッケージ可能なＲＮＡゲノムが、第３のプロモーターに作動式に連結されたポリヌクレオチドによってコードされ、ここで前記プロモーターが、前記第２のトランス活性化因子によって誘導されうるものであり、
ここで前記パッケージ可能なＲＮＡゲノムが、５’側から３’側に向かって、
ｉ．５’側末端反復配列（長末端リピート）又はその活性断片、
ii．レトロウイルスシス作用型ＲＮＡパッケージング要素をコードする核酸配列、
iii．切断シグナルで隔てられた、キメラ抗原受容体を含む第１の改変シグナル伝達ポリペプチドと、構成的に活性なＩＬ－７受容体変異体を含む第２の改変シグナル伝達ポリペプチドとをコードする核酸配列、
iv．Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞内で活性な第４のプロモーター、並びに
ｖ．３’側末端反復配列（長末端リピート）又はその活性断片
を含み、
ここで前記パッケージ可能なＲＮＡゲノムが更に、ヌクレオシド類似体抗ウイルス薬に結合するリボスイッチを含み、ここで前記リボスイッチが前記ヌクレオシド類似体抗ウイルス薬に結合することで、前記リボスイッチ前記ＩＬ－７受容体変異体の発現が増加し、これにより前記組換レトロウイルスが作製される
ことを含む、方法である。

前記方法の例示的な態様によれば、前記リボスイッチが更に、前記キメラ抗原受容体の発現を制御すると共に、その制御が、前記リボスイッチの前記ヌクレオシド類似体抗ウイルス薬への結合により制御される。他の例示的な態様によれば、前記ヌクレオシド類似体抗ウイルス薬が、アシクロビル及び／又はペンシクロビルである。他の例示的な態様によれば、前記パッケージ可能なＲＮＡゲノムが更に、認識ドメインを含み、ここで前記認識ドメインが、ＥＧＦＲ又はそのエピトープを認識する抗体によって認識されるポリペプチドを含む。他の例示的な態様によれば、前記第１のリガンドがラパマイシンであり、前記第２のリガンドがテトラサイクリン又はドキソルビシンであるか、或いは前記第１のリガンドがテトラサイクリン又はドキソルビシンであり、前記第２のリガンドがラパマイシンである。他の例示的な態様によれば、前記パッケージング細胞が更に、Ｖｐｘをコードする核酸配列を、前記第２の転写単位上、又は任意の第３の転写単位上に、或いは前記第１の誘導型プロモーターに作動式に連結された更なる転写単位上に含む。他の例示的な態様によれば、前記ＣＤ３に結合可能なポリペプチド、及び、前記ＣＤ２８に結合可能なポリペプチドが各々、異種ＧＰＩアンカー付着配列に連結されてなる。ある例によれば、前記ＣＤ３に結合可能なポリペプチドが、抗ＣＤ３ｓｃＦｖＦｃ又は抗ＣＤ３ｓｃＦｖ、又は抗ＣＤ３ｓｃＦｖであってもよく、前記ＣＤ２８に結合可能なポリペプチドが、ＣＤ８０であってもよい。前記抗ＣＤ３ｓｃＦｖＦｃ又は抗ＣＤ３ｓｃＦｖ及びＣＤ８０は更に各々、ＤＡＦシグナル配列に連結されていてもよい。他の例示的な態様によれば、ＤＡＦと共有結合されたサイトカインを含む融合ポリペプチドの発現も誘導される。ある例によれば、前記サイトカインがＩＬ－７又はＩＬ－１５であってもよく、前記融合ポリペプチドが、ＤＡＦシグナル配列、シグナル配列を欠くＩＬ－７、及び、ＧＰＩアンカー付着配列を含むＤＡＦの断片を含んでいてもよい。他の例示的な態様によれば、前記リボスイッチが更に、前記キメラ抗原受容体の発現を制御すると共に、その制御が、前記リボスイッチの前記ヌクレオシド類似体抗ウイルス薬への結合により制御される。ある例によれば、前記ヌクレオシド類似体抗ウイルス薬が、アシクロビル及び／又はペンシクロビルである。他の態様によれば、前記構成的に活性なＩＬ－７が、ｍｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡによって置換されていてもよい。前記ｍｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡが、核酸によりイントロン内でコードされていてもよい。例示的な態様によれば、作製されるレトロウイルスは、レンチウイルスである。

他の側面によれば、本開示では、遺伝子操作されたリンパ球であって、
Ａ．構成的に活性なＩＬ－７受容体変異体を含む第１の改変シグナル伝達ポリペプチド、並びに
Ｂ．抗原特異的標的化領域（ＡＳＴＲ）、膜貫通ドメイン、及び細胞内活性化ドメインを含むキメラ抗原受容体を含む第２の改変シグナル伝達ポリペプチド
を含むリンパ球が提供される。

上記の遺伝子操作されたリンパ球の側面の例示的な態様によれば、前記遺伝子操作されたリンパ球は、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞である。ある態様によれば、前記リンパ球がＴ細胞である。他の例示的な態様によれば、前記第１の改変シグナル伝達ポリペプチド及び／又は前記第２の改変シグナル伝達ポリペプチドの発現が、ヌクレオシド類似体抗ウイルス薬に結合するリボスイッチによって制御され、ここで前記ヌクレオシド類似体抗ウイルス薬が前記リボスイッチに結合することで、前記ＩＬ－７受容体変異体の発現が増加する。他の態様によれば、前記構成的に活性なＩＬ－７受容体は、ｍｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡによって置換されていてもよい。前記ｍｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡは更に、核酸によりイントロン内でコードされていてもよい。

他の側面によれば、本開示では、遺伝子操作されたＴ細胞及び／又はＮＫ細胞であって、
Ａ．リンパ増殖性要素を含む第１の改変シグナル伝達ポリペプチド、並びに、
Ｂ．抗原特異的標的化領域（ＡＳＴＲ）、膜貫通ドメイン、及び細胞内活性化ドメインを含むキメラ抗原受容体を含む第２の改変シグナル伝達ポリペプチド
を含むＴ細胞及び／又はＮＫ細胞が提供される。

前記遺伝子操作されたＴ細胞及び／又はＮＫ細胞の側面の例示的な態様によれば、前記リンパ増殖性要素は、構成的に活性であると共に、ある例によれば、構成的に活性な変異型ＩＬ－７受容体又はその断片である。他の例示的な態様によれば、前記第１の改変シグナル伝達ポリペプチド及び／又は前記第２の改変シグナル伝達ポリペプチドの発現が、インビボ制御要素によって制御される。ある例によれば、前記インビボ制御要素が、リボスイッチを含むポリヌクレオチドである。ある例によれば、前記リボスイッチがヌクレオシド類似体に結合可能であり、前記ヌクレオシド類似体が存在する場合には、前記第１の改変シグナル伝達ポリペプチド及び／又は前記第２の改変されたポリペプチドが発現される。他の例示的な態様によれば、前記遺伝子操作されたＴ細胞及び／又はＮＫ細胞は、活性化要素、シュードタイピング要素、及び／又は、膜結合サイトカインを、その表面に有する。ある例によれば、前記活性化要素が、ＣＤ３に結合可能な膜結合性ポリペプチド、及び／又は、ＣＤ２８に結合可能な膜結合性ポリペプチドを含む。ある態様によれば、前記活性化要素が、異種ＧＰＩアンカー付着配列に連結された抗ＣＤ３ｓｃＦｖ、及び／又は、異種ＧＰＩアンカー付着配列に連結されたＣＤ８０を含む。例示的な態様によれば、前記シュードタイピング要素が、麻疹ウイルスＦポリペプチド、麻疹ウイルスＨポリペプチド、及び／又は、麻疹ウイルスＦポリペプチド及び／又は麻疹ウイルスＨポリペプチドの細胞質ドメイン欠失変異体を含む。他の態様によれば、前記膜結合サイトカインが、ＤＡＦ又はＧＰＩアンカー付着配列を含むその断片に連結されたＩＬ－７又はその断片を含む融合ポリペプチドを含む。

一側面によれば、本開示では、対象のリンパ球を遺伝子操作し、増加させるための方法であって、
Ａ．対象の静止Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を、通常は事前のエクスビボでの刺激を要することなく、エクスビボで組換レトロウイルスと接触させ、ここで前記組換レトロウイルスが、
ｉ．Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞に結合し、斯かる細胞への組換レトロウイルスの膜融合を促進することが可能なシュードタイピング要素を、その表面に含むと共に、
ii．Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞内で活性なプロモーターに作動式に連結された、１又は２以上の転写単位を含むポリヌクレオチド（ここで前記１又は２以上の転写単位は、インビボ制御要素により制御される、リンパ増殖性要素を含む第１の改変シグナル伝達ポリペプチドをコードすると共に、任意によりインビボ制御要素によって制御されてもよい、第２の改変シグナル伝達ポリペプチドを任意によりコードし、ここで前記第２の改変シグナル伝達ポリペプチドが、細胞内活性化ドメインを含むと共に、任意によりＣＡＲの他の構成成分をコードし、
ここで前記接触により、前記組換レトロウイルスによる前記静止Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞の少なくとも一部の形質導入が促進されて、遺伝子操作Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞が産生され、
Ｂ．前記遺伝子操作Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を、前記対象に導入し、
前記遺伝子操作Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞をインビボで、前記インビボ制御要素として機能する化合物に暴露することにより、前記第１の改変シグナル伝達ポリペプチドの発現に作用させると共に、インビボでリンパ球の増加、生着、及び／又は、持続性を促進し、これにより前記対象のリンパ球を遺伝子操作し、増加させる
ことを含む方法が提供される。

例示的な態様によれば、エクスビボで刺激せずに、前記形質導入が実施される。例示的な態様によれば、前記化合物は、分子シャペロン、例えば小分子シャペロンである。例示的な態様によれば、前記リンパ増殖性要素に前記分子シャペロンが結合することで、前記リンパ増殖性要素の増殖活性が増強される。前記分子シャペロンの前記対象への投与は、前記対象からの血液の採取前、前記接触の間、及び／又は、前記Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞の前記対象への導入後に行うことができる。当然ながら、前記化合物がインビボ制御要素である側面においては、斯かる化合物は通常、リンパ増殖性要素及び／又はＣＡＲの構成成分に結合する能力を有し、前記方法の実施時には実際に斯かるリンパ増殖性要素又はＣＡＲ構成成分に結合する。本開示にて提供される、組換レトロウイルスによるＴ細胞及び／又はＮＫ細胞のトランスフェクションを含む方法に関連する他の態様及び教示は、分子シャペロン態様を含むこの側面にも同様に適用される。

他の側面において、本開示では、微小環境制限抗原特異的標的化領域を選択する方法であって、
ａ．ポリペプチドディスプレイライブラリーのポリペプチドを、通常の生理的条件下での結合アッセイと、異常な条件下での結合アッセイとに供し、
ｂ．結合活性前記生理的条件と比較して、前記異常な条件で、結合活性に増加を生じるポリペプチドを選択することにより、前記微小環境制限抗原特異的標的化領域を選択する
ことにより、前記ポリペプチドディスプレイライブラリーのパニングを行うことを含む方法が提供される。

他の側面において、本開示では、微小環境制限抗原特異的標的化領域を単離する方法であって、
ａ）ポリペプチドライブラリーを、異常な条件下で、固体支持体に結合した標的抗原と接触させ、ここで、前記標的抗原に結合するポリペプチドを発現するクローンは、前記標的抗原を介して前記固体支持体に結合したまま維持され、
ｂ）前記固体支持体を、結合したポリペプチドと共に、生理的条件下でインキュベートし、
ｃ）前記生理的条件下で前記固体支持体から溶出するクローンを採取することにより、前記微小環境制限抗原特異的標的化領域を単離する
ことにより、前記ポリペプチドライブラリーのパニングを行うことを含む方法が提供される。

他の側面において、本開示では、標的抗原に結合するキメラ抗原受容体であって、
ａ）ポリペプチドライブラリーのパニングにより選択されると共に、通常の生理的環境と比べ、異常な条件下において、結合アッセイによる活性が上昇する、少なくとも１つの微小環境制限抗原特異的標的化領域、
ｂ）膜貫通ドメイン、及び、
ｃ）細胞内活性化ドメイン
を含むキメラ抗原受容体が提供される。

他の側面において、本開示では、標的抗原に結合するキメラ抗原受容体であって、
ａ）通常の生理的環境と比べ、異常な条件において、前記標的抗原に対する結合の上昇を示す微小環境制限抗原特異的標的化領域であって、前記標的に結合する微小環境制限抗原特異的標的化領域、
ｂ）膜貫通ドメイン、及び
ｃ）細胞内活性化ドメイン
を含むキメラ抗原受容体が提供される。

本開示にて提供される、微小環境制限抗原特異的標的化領域（ＡＳＴＲ）を含む方法及び組成物の何れかの例示的な態様によれば、前記ＡＳＴＲは、前記通常の条件と比較して、前記異常な条件では、前記アッセイにおける前記標的抗原への結合親和性が、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％増加する者であってもよい。前記異常な条件は、例えば低酸素、酸性ｐＨ、高濃度の乳酸、高濃度のヒアルロナン、高濃度のアルブミン、高濃度のアデノシン、高濃度のＲ－２－ヒドロキシグルタレート（glutarate）、高濃度のＰＡＤ酵素、高圧、高酸化、及び低栄養素利用可能性であってもよい。前記微小環境制限ＡＳＴＲは、ｐＨ７．４と比べ、ｐＨ６．７において、抗原結合が増加するものであってもよい。前記微小環境制限ＡＳＴＲは、対応する生理的条件下と比べ、腫瘍環境下及び／又はインビトロ腫瘍代替アッセイ条件下において、抗原結合が増加するものであってもよい。前記標的は、４－１ＢＢ、ＳＴ４、腺癌抗原、α－フェトプロテイン、ＡＸＬ、ＢＡＦＦ、Ｂ－リンパ腫細胞、Ｃ２４２抗原、ＣＡ－１２５、炭酸脱水酵素９（ＣＡ－IX）、Ｃ－ＭＥＴ、ＣＣＲ４、ＣＤ１５２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２００、ＣＤ２２、ＣＤ２２１、ＣＤ２３（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ２８、ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８）、ＣＤ３３、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＥＡ、ＣＮＴ０８８８、ＣＴＬＡ－４、ＤＲＳ、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３、ＦＡＰ、フィブロネクチンエクストラドメイン－Ｂ、葉酸受容体１、ＧＤ２、ＧＤ３ガングリオシド、糖タンパク質７５、ＧＰＮＭＢ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＧＦ、ヒト拡散因子（scatter factor）受容体キナーゼ、ＩＧＦ－１受容体、ＩＧＦ－Ｉ、ＩｇＧ１、Ｌｌ－ＣＡＭ、ＩＬ－１３、ＩＬ－６、インシュリン様成長因子Ｉ受容体、インテグリンｎＳＰ１、インテグリンｎｖＰ３、ＭＯＲＡｂ－００９、ＭＳ４Ａ１、ＭＵＣ１、ムチンＣａｎＡｇ、Ｎ－グリコリルノイラミン酸、ＮＰＣ－１Ｃ、ＰＤＧＦ－Ｒａ、ＰＤＬ１９２、ホスファチジルセリン、前立腺癌細胞、ＲＡＮＫＬ、ＲＯＮ、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２ＳＣＨ９００１０５、ＳＤＣ１、ＳＬＡＭＦ７、ＴＡＧ－７２、テネイシン（tenascin）Ｃ、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－Ｐ、ＴＲＡＩＬ－Ｒ１、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、腫瘍抗原ＣＴＡＡ１６．８８、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦＲ－１、ＶＥＧＦＲ２、及びビメンチン。前記ＡＳＴＲが、であってもよい抗体、抗原、リガンド、リガンドの受容体結合ドメイン、受容体、受容体のリガンド結合ドメイン、又はアフィボディ（affibody）であってもよい。前記ＡＳＴＲは、全長抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、（Ｆａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、及び、二価単鎖抗体又は二重特異性抗体（diabody）であってもよい。前記ＡＳＴＲが、抗体由来の重鎖及び軽鎖を含んでいてもよい。前記抗体が、単鎖可変断片であってもよい。ある態様によれば、前記重鎖及び軽鎖が、リンカーにより隔てられていてもよい。この場合、前記リンカーの長さは６～１００アミノ酸長である。ある態様によれば、前記重鎖が、前記キメラ抗原受容体上で軽鎖のＮ末端に位置するものであってもよい。ある態様によれば、前記軽鎖が、前記キメラ抗原受容体上で重鎖のＮ末端に位置するものであってもよい。

ポリペプチドディスプレイライブラリーを含む方法の何れかの例示的な態様によれば、前記ポリペプチドディスプレイライブラリーが、ファージディスプレイライブラリー又は酵母ディスプレイライブラリーであってもよい。前記ポリペプチドディスプレイライブラリーが、抗体ディスプレイライブラリーであってもよい。前記抗体ディスプレイライブラリーが、ヒト又はヒト化抗体ディスプレイライブラリーであってもよい。前記抗体ディスプレイライブラリーが、ナイーブライブラリーであってもよい。前記方法が、採取したファージを細菌細胞に感染させて、精製されたファージディスプレイライブラリーを生成すると共に、前のサイクルで得られた斯かる精製ファージディスプレイライブラリーを用いて、前記接触、インキュベート、及び採取を１～１０００サイクル繰り返すことを含んでいてもよい。

本開示にて提供される、微小環境制限ＡＳＴＲの単離又は選択を含む方法の何れかの例示的な態様によれば、前記方法が、前記微小環境制限抗原特異的標的化領域をコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定することにより、前記微小環境制限ＡＳＴＲのポリペプチド配列を決定することを含んでいてもよい。前記方法が、前記微小環境制限ＡＳＴＲ、膜貫通ドメイン、及び細胞内活性化ドメインを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを作成することにより、微小環境制限生物製剤キメラ抗原受容体を作製することを含んでいてもよい。前記ライブラリーが、単鎖抗体ライブラリーであってもよい。

前記の微小環境制限ＡＳＴＲを単離する方法が、前記パニングを１～１０００回繰り返されることを含んでいてもよい。前記の微小環境制限ＡＳＴＲを単離する方法が、パニングの各ラウンドの間において、単離された微小環境制限抗原特異的標的化領域をコードするポリヌクレオチドを変異させることなく実施されるものであってもよい。前記の微小環境制限ＡＳＴＲを単離する方法が、パニングの各ラウンドの間において、抗原特異的標的化領域をコードするポリヌクレオチド又はそれを含む宿主生物の培養、高忠実度増幅、及び／又は、希釈により実施されるものであってもよい。前記方法が、繰り返しの前に、前記選択及び／又は単離された微小環境制限抗原特異的標的化領域に対して突然変異誘発を行うことを含んでいてもよい。前記方法が、パニングの１又は２以上のラウンドの後に、長リード（long read）ＤＮＡ配列決定により、前記選択及び／又は単離された微小環境制限抗原特異的標的化領域、及び／又は、それをコードするポリヌクレオチドの配列を決定することを含んでいてもよい。前記方法が、前記単離された微小環境制限ＡＳＴＲの増幅の前後に、その配列を決定することを含んでいてもよい。前記の微小環境制限ＡＳＴＲを単離する方法が、前記パニングを繰り返すことなく実施されるものであってもよい。前記の微小環境制限ＡＳＴＲを単離する方法が、前記微小環境制限ＡＳＴＲの単離後に、前記単離された微小環境制限ＡＳＴＲをコードするポリヌクレオチドに突然変異導入を行うことなく実施されるものであってもよい。

本開示にて提供される、微小環境制限ＡＳＴＲを有するキメラ抗原受容体を含む組成物の何れかの例示的な態様によれば、前記微小環境制限ＡＳＴＲが、抗体ライブラリーのパニングにより同定されてもよい。ある態様によれば、前記微小環境制限ＡＳＴＲは、ファージディスプレイ又は酵母ディスプレイライブラリーのパニングにより同定される。ある態様によれば、前記キメラ抗原受容体は、二重特異的ＡＳＴＲを含む。

本開示において、他の側面に関して提供されるのは、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞内で活性なプロモーターに作動式に連結された１又は２以上の転写単位を含む組換ポリヌクレオチドを含む形質導入Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞であって、ここで前記１又は２以上の転写単位が、インビボ制御要素により制御される第１の改変シグナル伝達ポリペプチドをコードし、ここで前記第１の改変シグナル伝達ポリペプチドが、構成的に活性なＩＬ－７受容体変異体を含み、ここで前記インビボ制御要素は、インビボで化合物に結合する能力を有し、又は、インビボで化合物に結合するように構成される。

本開示において、他の側面に関して提供されるのは、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞内で活性なプロモーターに作動式に連結された１又は２以上の転写単位を含む組換ポリヌクレオチドを含む組換レトロウイルスであって、ここで前記１又は２以上の転写単位は、インビボ制御要素により制御される第１の改変シグナル伝達ポリペプチドをコードし、ここで前記第１の改変シグナル伝達ポリペプチドが、構成的に活性なＩＬ－７受容体変異体を含み、ここで前記インビボ制御要素は、インビボで化合物に結合する能力を有し、又は、インビボで化合物に結合するように構成される組換レトロウイルスである。

本開示において、他の側面に関して提供されるのは、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞に対して形質導入を行う方法であって、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞内で活性なプロモーターに作動式に連結された１又は２以上の転写単位を含む組換ポリヌクレオチドを含む組換レトロウイルスに、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を接触させ、ここで前記１又は２以上の転写単位は、インビボ制御要素により制御される第１の改変シグナル伝達ポリペプチドをコードし、ここで前記第１の改変シグナル伝達ポリペプチドが、構成的に活性なＩＬ－７受容体変異体を含み、ここで前記インビボ制御要素は、形質導入条件下で、インビボで化合物に結合する能力を有し、これにより、前記Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞に対して形質導入を行うことを含む方法である。

先行する段落において提供された、形質導入Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞の側面、組換レトロウイルスの側面、及び、方法の側面の例示的な態様によれば、前記組換ポリヌクレオチドが更に、抗原特異的標的化領域（ＡＳＴＲ）、膜貫通ドメイン、及び細胞内活性化ドメインを含む第１のキメラ抗原受容体を含む第２の改変シグナル伝達ポリペプチドをコードする転写単位を含む。他の例示的な態様によれば、前記リンパ増殖性要素が、変異型ＩＬ－７受容体又はその断片を含む。他の例示的な態様によれば、前記インビボ制御要素が、リボスイッチを含むポリヌクレオチドである。ある例によれば、前記リボスイッチがヌクレオシド類似体に結合可能であり、前記インビボ制御要素に結合する化合物がヌクレオシド類似体である。ある例によれば、前記ヌクレオシド類似体は抗ウイルス剤、例えばアシクロビル又はペンシクロビルである。ある態様によれば、前記抗ウイルス剤はアシクロビルである。他の例示的な態様によれば、前記の構成的に活性なＩＬ－７受容体変異体は、ＥＧＦＲ又はそのエピトープに連結される。他の例示的な態様によれば、前記構成的に活性なＩＬ－７受容体変異体は、ｅＴａｇを含む。他の例示的な態様によれば、前記構成的に活性なＩＬ－７受容体変異体が、ＰＰＣＬ挿入物を含む。他の例示的な態様によれば、前記構成的に活性なＩＬ－７受容体変異体が、野生型ヒトＩＬ－８受容体の位置２４３に相当する位置に、ＰＰＣＬ挿入物を含む。他の例示的な態様によれば、前記形質導入Ｔ細胞又はＮＫ細胞は、形質導入Ｔ細胞である。

図１は、パッケージング細胞（１００）と、前記パッケージング細胞（１００）により産生される組換レトロウイルス（２００）とを含む例示組成物の概略を示す図である。図１において、本発明の諸側面をコードすることが可能な種々のベクター（組換ポリヌクレオチド（１１０）と呼ぶ）は、組換レトロウイルス（２００）内にパッケージ化され、斯かる組換レトロウイルス（２００）は、そのゲノム内に、リンパ増殖性要素を含む第１の改変シグナル伝達ポリペプチドを含むと共に、ある態様によれば、キメラ抗原受容体、即ちＣＡＲである第２の改変シグナル伝達ポリペプチドを更に含む。前記組換レトロウイルスは、その膜上に、前記レトロウイルスが標的細胞に結合してこれと融合するのを可能にするシュードタイピング要素（非限定的な態様によれば、麻疹ウイルスヘマグルチニン（Ｈ）ポリペプチド及び麻疹ウイルス融合（Ｆ）ポリペプチド、又はその細胞質ドメイン欠失変異体）（２４０）；静止Ｔ細胞に結合してこれを活性化する能力を有する活性化要素（非限定的な態様によれば、ＣＤ２８に結合可能なポリペプチド及びＣＤ３に結合可能なポリペプチドを有する活性化要素）（それぞれ２１０及び２２０）；並びに膜結合サイトカイン（非限定的な態様によれば、ＩＬ－７・ＤＡＦ融合ポリペプチド）（２３０）を発現する。符号（２５０）、（２６０）、（２７０）、（２８０）、及び（２９０）を付した部分は、それぞれＳｒｃ－ＦＬＡＧ－Ｖｐｘ、ＨＩＶｇａｇマトリックス、ＨＩＶｇａｇカプシド、ＲＮＡ、及びＨＩＶｐｏｌである。

図２は、パッケージング細胞によって産生された（２００）組換レトロウイルスと、前記組換レトロウイルス（２００）によってトランスフェクトされた静止Ｔ細胞（３００）とを含む、例示組成物の概略を示す図である。前記レトロウイルスの表面に存在するこれらの要素は、静止Ｔ細胞の表面の受容体及び／又はリガンドに結合する。前記シュードタイピング要素は、前記レトロウイルスの前記Ｔ細胞への結合及び融合を容易にするために、結合性ポリペプチド及び融合性ポリペプチド（非限定的な態様では、麻疹ウイルスヘマグルチニン（Ｈ）ポリペプチド及び麻疹ウイルス融合（Ｆ）ポリペプチド）、又はその細胞質ドメイン欠失変異体）を含んでいてもよい。非限定的な態様では、前記レトロウイルスはその表面に、前記Ｔ細胞・受容体複合体及び任意により共受容体（３２０）と結合することにより、前記静止Ｔ細胞を活性化する能力を有する活性化要素（非限定的な態様では、ＣＤ２８に結合可能なポリペプチド及びＣＤ３に結合可能なポリペプチドを有する活性化要素）を含む。更に、前記レトロウイルスの表面に存在する膜結合サイトカイン（非限定的な態様では、ＩＬ－７・ＤＡＦ融合ポリペプチド）は、前記静止Ｔ細胞の表面のＩＬ－７Ｒα（３１０）に結合する。前記レトロウイルスは前記Ｔ細胞と融合し、前記リンパ増殖性要素（例示的な態様によれば、構成的に活性なＩＬ－７Ｒα）を含む前記第１の改変シグナル伝達ポリペプチド（３７０）をコードするポリヌクレオチドは、サイトゾル内で逆転写されてから核に移行し、前記活性化Ｔ細胞のＤＮＡ内に組み込まれる。ある態様によれば、前記ウイルスと共にパッケージされたＳｒｃ－ＦＬＡＧ－Ｖｐｘ（２５０）は、前記静止Ｔ細胞のサイトゾルに侵入して、ＳＡＭＨＤ１（３５０）の分解を促進する結果、逆転写に利用可能な細胞質ｄＮＴＰのプールを増大させる。ある態様によれば、前記ポリヌクレオチドは更に、ＣＡＲを含む第２の改変シグナル伝達ポリペプチド（３６０）をコードしていてもよい。ある態様によれば、前記リンパ増殖性要素は、その発現を制御するインビボ制御要素にある化合物が結合すると発現される（非限定的な例によれば、前記インビボ制御要素は、ヌクレオシド類似体に結合するリボスイッチである）。ある態様によれば、前記ＣＡＲの発現は、前記インビボ制御要素によっても制御される。一部（３３０）はＳＬＡＭ及びＣＤ４６である。一部（３４０）はＣＤ３である。

図３Ａ～３Ｅは、ベクター系の概略を示す図である。図３Ａは、ＮＦκＢｐ６５アクチベータードメイン（ｐ６５ＡＤ）に連結されたＦＲＢドメインと、３つのＦＫＢＰリピートに連結された、構成的に発現されるＺＦＨＤ１ＤＮＡ結合ドメインとをコードするポリヌクレオチド配列を含むコンストラクトを示す。図３Ａに示すコンストラクトは、更に、ラパマイシン誘導型ＺＦＨＤ１／ｐ６５ＡＤプロモーターの下、ＨＩＶ１ＲＥＶ及びＶｐｘをＳｒｃＦｌａｇＶｐｘ融合体として含む。図３Ｂは、前記ＺＦＨＤ１／ｐ６５ＡＤプロモーターの制御下、aｒｔＴＡ配列をコードするポリヌクレオチドを含むコンストラクトを示す。図３Ｃは、ｌｏｘＰ部位に挟まれたピューロマイシン耐性遺伝子と、ｌｏｘ２２７２部位に挟まれた細胞外ＭＹＣタグとをコードするポリヌクレオチドを含むコンストラクトを示す。何れの選択可能マーカーも、ＦＲＴ部位に挟まれたＢｉＴＲＥプロモーターの制御下に置かれる。図３Ｄは、ＴＲＥプロモーターの制御下にある、ｌｏｘＰ部位に挟まれたＲＦＰをコードすると共に、前記ＴＲＥプロモーターとＲＦＰの５’側ｌｏｘＰ部位との間に単一のＦＲＴ部位をコードするポリヌクレオチドを含むコンストラクトを示す。図３Ｅは、ＴＲＥプロモーターの制御下にある、ｌｏｘＰ部位に挟まれたＧＦＰをコードすると共に、前記ＴＲＥプロモーターとＧＦＰの５’側ｌｏｘＰ部位との間に単一のＦＲＴ部位をコードするポリヌクレオチドを含むコンストラクトを示す。図３Ｃ～３Ｅのコンストラクトは、他のポリヌクレオチド配列が前記パッケージング細胞株のゲノム内に挿入される際のランディングパッド（landing pads）として機能する。同上。同上。

図４Ａ～４Ｃは、コンストラクトの概略を示す図である。図４Ａは、ＣＤ１４ＧＰＩアンカー付着部位を有する抗ＣＤ３（クローンＵＣＨＴ１）ｓｃＦｖＦｃ、ＣＤ１６ＢＧＰＩアンカー付着部位を有し、ＣＤ２８に結合可能なＣＤ８０細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、及び、ＨＥＫ２９３Ｓゲノム内への組み込みのためにトランスポゾン配列で挟まれたポリヌクレオチド領域を有する、崩壊促進因子（ＤＡＦ）に連結されたＩＬ－７をコードする、３シストロン性ポリヌクレオチドを含むコンストラクトを示す。図４Ｂは、ＢｉＴＲＥプロモーターと、ｇａｇ及びｐｏｌポリペプチドを一方向にコードするポリヌクレオチド領域と、麻疹ウイルスＦΔｘ及びＨΔｙタンパク質を逆方向にコードするポリヌクレオチド領域とを有するポリヌクレオチドを含むコンストラクトを示す。図４Ｃは、ＣＡＲ及びリンパ増殖性要素ＩＬ７Ｒα－ｉｎｓＰＰＣＬを、ＨＥＫ２９３Ｓ細胞内では活性でないＣＤ３Ｚプロモーターの制御下でコードするポリヌクレオチド配列を含むコンストラクトを示す。ここで前記のＣＡＲとＩＬ７Ｒα－ｉｎｓＰＰＣＬとは、Ｔ２Ａリボゾーム性スキップ配列をコードするポリヌクレオチド配列によって隔てられてなり、前記ＩＬ７Ｒα－ｉｎｓＰＰＣＬは、アシクロビルリボスイッチ制御性のリボザイムを有する。前記ＣＡＲ含有コンストラクトは更に、ｃＰＰＴ／ＣＴＳ、ＲＲＥ配列、及び、ＨＩＶ-１Ｐｓｉ（Ψ）をコードするポリヌクレオチド配列を含む。ゲノムに組み込まれるべき前記ＣＡＲ含有コンストラクトのポリヌクレオチド配列は、その全体がＦＲＴ部位に挟まれてなる。同上。

図５Ａ～５Ｃは、選択的リボスイッチ制御用のヌクレオシド類似体である、アシクロビル（図５Ａ）、ペンシクロビル（図５Ｂ）、及び２’－デオキシグアノシン（図５Ｃ）の分子構造を示す。

図６は、メソプラズマ・フローラム（Mesoplasma florum）Ｉ－Ａ型デオキシグアノシンリボスイッチ制御領域、及び関連する遺伝子産物を示す。前記配列は、Ｍ．フローラムＬ１ゲノムＤＮＡ（ＡＥ０１７２６３．１）ｎｔ６２４３９６～ｎｔ６２５６７０の逆相補的配列であり、これはＭ．フローラムＷ３７ゲノムＤＮＡ（ＣＰ００６７７８．１）ｎｔ６３６２７７～ｎｔ６３７５５０と同一である。初回スクリーニングのために使用されたデオキシグアノシン結合アプタマー配列を太字下線で示す。下流遺伝子産物（クラスＩｂのリボヌクレオチドレダクターゼ（好気性）、βサブユニット）を大文字で示す。

図７は、指向進化戦略のために標的化されたＭ．フローラムＩ－Ａ型デオキシグアノシンリボスイッチアプタマー領域を示す。白長円内のヌクレオチドはランダム化の対象とした。縞長円内のヌクレオチドは挿入／欠失及びランダム化の対象とした。

図８Ａ及び８Ｂは、Ｍ．フローラムＩ－Ａ型デオキシグアノシンリボスイッチアプタマーのスクリーニングライブラリーを示す。図８Ａにおいて、実線ボックス内のヌクレオチドはランダム化の標的とした配列領域であり、点線ボックス内のヌクレオチドは挿入／欠失及びランダム化の標的とした配列領域である。図８Ｂは、変異（「ランダムヌクレオチド」（「Ｎ」））及び欠失／挿入により生成された配列候補を示す。

図９は、ＰＣＲ増幅を可能とするべく付加された追加の塩基対及びライブラリースクリーニングのためのインビトロ転写用Ｔ７プロモーター付加のための追加の塩基対に対する逆相補配列として合成された、Ｍ．フローラムＩ－Ａ型デオキシグアノシンリボスイッチアプタマーのオリゴライブラリーを示す。対応するＴ７プロモーター増幅プライマー及び逆増幅プライマーも示す。

図１０は、枯草菌（Bacillus subtilis）グアノシンｘｐｔリボスイッチ制御領域及び関連遺伝子産物を示す。前記配列は、Ｂ．スブチリス亜種スブチリス６０５１－ＨＧＷゲノムＤＮＡ（ＣＰ００３３２９．１）ｎｔ２３１９４３９～ｎｔ２３２０３５３の逆相補配列である。初回スクリーニングに使用されたグアノシン結合アプタマー配列を太字下線で示す。下流遺伝子産物（キサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼｘｐｔ）を大文字で示す。

図１１は、指向進化戦略の標的としたＢ．スブチリスグアノシンｘｐｔリボスイッチアプタマー領域を示す。白長円内のヌクレオチドはランダム化の標的とした。縞長円内のヌクレオチドは挿入／欠失及びランダム化の標的とした。

図１２Ａ及び１２Ｂは、Ｂ．スブチリスグアノシンｘｐｔリボスイッチアプタマーのスクリーニングライブラリーを示す。図１２Ａにおいて、実線のボックス内のヌクレオチドはランダム化の標的とした配列領域であり、点線ボックス内のヌクレオチドは挿入／欠失及びランダム化の標的とした配列領域である。図１２Ｂは、変異（ランダムヌクレオチド（“Ｎ”））及び欠失／挿入により生成された配列候補を示す。

図１３は、ＰＣＲ増幅を可能とするべく付加された追加の塩基対及びライブラリースクリーニング用インビトロ転写のためのＴ７プロモーター付加物に対する逆相補鎖として合成された、Ｂ．スブチリスグアノシンｘｐｔリボスイッチアプタマーオリゴライブラリーを示す。対応するＴ７プロモーター増幅プライマー及び逆増幅プライマーも併せて示す。

図１４は選択ライブラリーの構成を示す。前記ライブラリーは、既知のグアノシン及びデオキシグアノシン結合ＲＮＡ（Pikovskaya, 2013）に基づいて構築した。

図１５は、酸化グラフェン（ＧｒＯ）アプタマー選択を示す図である。工程（１）では、ＲＮＡが転写及び精製された。工程（２）では、精製されたＲＮＡを溶出させた。工程（３）では、アプタマーを反標的（counter-target）及び緩衝剤とインキュベートした。工程（４）では、反標的又は緩衝剤成分と結合した配列を酸化グラフェンで除去した。工程（５）では、遠心分離によって上清内の非特異的反応性種を分画し、次いで廃棄した。更に５分間ずつ二度洗浄し、残渣の反標的結合配列及び緩衝剤結合配列を除去した。工程（６）では、アシクロビルの１×選択緩衝剤中溶液を陽性選択用ＧｒＯ結合ライブラリーに加え、陽性標的との相互作用を通じてＧｒＯからアプタマー配列候補を脱着させた。工程（７）では、最後の遠心分離工程により、上清内の前記標的結合配列を、ＧｒＯに依然として吸着されている非反応性配列から分離した。工程（８）では、選択された配列を逆転写し、得られたライブラリーをＰＣＲで増幅し、次いで転写することにより、次回選択ラウンド用のライブラリーを調製した。

図１６は、酸化グラフェン平行評価を示す図である。平行評価を経た濃縮ライブラリーを等量ずつ４つに分割した。次に、ライブラリー試料を酸化グラフェンに加えてインキュベートし、前記ライブラリーを酸化グラフェンに担持させた。５分間ずつ２回洗浄し、非結合材料を除去した。陽性（アシクロビル）及び特別標的（ペンシクロビル）試料については、各標的を個別に１×選択緩衝剤で１μＭに希釈して調製した。反標的については、陽性標的を１０μＭの各反標的の溶液で置換した。陰性試料については、陽性標的を等体積のヌクレアーゼを含まない水で置換した。その後、各試料を対応する酸化グラフェン調製物に加えてインキュベートした。インキュベーション後、試料を遠心分離して上清を除去し、NanoDrop-1000分光光度計（Thermo Fisher Scientific；Wilmington, DE）を用いた読み取りによって、ライブラリーが回収されていることを確認した。残存するライブラリー試料を変性ＰＡＧＥにより分析した。Gel-Starによる染色／脱染後にゲルの画像を撮影した。予想されるライブラリーサイズに対応するバンドを回収し、平行評価の追跡ラウンドに供した。陰性、半標的、及び特別標的試料については、担持前のインキュベーション時に半標的を陽性標的アシクロビルで置換した。前記第２の平行評価から回収した材料を配列決定及び分析に供した。

図１７は、アシクロビルに対する７つのアプタマー候補を示す。各アプタマーの自由エネルギーは、３７℃、１ＭＮａ^＋の条件で、Quikfold 3.0（Zuker 2003）により計算した。配列は専用アルゴリズムを用いて同定した。各配列の下線で示す領域はＰＣＲプライマーのアニーリング領域である。

図１８は、ペンシクロビルに対する７つのアプタマー候補を示す。各アプタマーの自由エネルギーは、３７℃、１ＭＮａ^＋の条件で、Quikfold 3.0（Zuker 2003）により計算した。配列は専用アルゴリズムを用いて同定した。各配列の下線で示す領域はＰＣＲプライマーのアニーリング領域である。

図１９Ａは、ＰＢＭＣ中での発現時のリンパ増殖／生存活性の試験に用いたＩＬ７Ｒα変異体の概略図である。図１９Ｂは、ＩＬ－２の存在及び不在下でのＰＢＭＣの％生存率を示す棒グラフである。

図２０は、ＶＳＶ－Ｇ又は切断型のＭＶ（Ｅｄ）Ｆ及びＨポリペプチドを有する偽型のレンチウイルスを用いて形質導入された陰性選択且つ未刺激のＴ細胞について、形質導入効率をＭＯＩに対してプロットしたグラフを示す。明確化のために記号を入れ違いに配置している。

図２１は、ＥＦ－１αプロモーターイントロン内のＣＤ３ζを標的化するｍｉＲＮＡが、ＣＤ３複合体の発現をノックダウンできることを示すグラフである。

定義
本開示で使用する場合、「キメラ抗原受容体」又は「ＣＡＲ」又は「ＣＡＲｓ」という語は、例えばＴ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、幹細胞等の細胞に抗原特異性を移植する、改変された受容体を意味する。本発明のＣＡＲは、少なくとも１つの抗原特異的標的化領域（ＡＳＴＲ）及び細胞内活性化ドメイン（ＩＡＤ）を含む。更に、柄部、膜貫通ドメイン（ＴＭ）、及び１又は２以上の共刺激ドメイン（ＣＳＤ）を含んでいてもよい。他の態様によれば、前記ＣＡＲは二重特異的ＣＡＲ、即ち二つの異なる抗原又はエピトープに対して特異を有するＣＡＲである。前記ＡＳＴＲが標的抗原に特異的に結合した後、前記ＩＡＤは細胞内シグナル伝達を活性化する。例えば、前記ＩＡＤは、Ｔ細胞の特異性及び反応性の対象を、ＭＨＣに制限されることなく、選択された標的に設定しなおし、抗体の抗原結合特性を活用することができる。ＭＨＣに制限されない抗原認識によって、ＣＡＲを発現するＴ細胞に、抗原処理とは独立に抗原を認識する能力を付与し、これにより腫瘍回避の主要な機序を迂回することが可能となる。更にＣＡＲは、Ｔ細胞で発現された場合に、内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のα及びβ鎖と二量体を形成しないという点でも有利である。

本開示で使用する場合、「微小環境」という語は、組織又は身体の部分又は領域であって、斯かる組織の他の領域又は身体の領域と比べて、定常的又は一時的に、物理的又は化学的な相違を有する部分又は領域を意味する。例えば、「腫瘍微小環境」とは、本開示で使用する場合、腫瘍がその中に存在する環境であって、腫瘍内の非細胞領域及び腫瘍性組織のすぐ外部の領域であるが、癌細胞自身の細胞内区画には属さない環境を意味する。斯かる腫瘍微小環境とは、悪性経過が生存し、及び／又は、膨張し、及び／又は、拡大するための構造的及び／又は機能的な環境を形成する条件を含む、任意且つ全ての腫瘍環境の条件を意味しうる。例えば、腫瘍微小環境は、例えば、これらに制限されるものではないが、圧力、温度、ｐＨ、イオン強度、浸透圧、オスモル濃度、酸化的ストレス、１又は２以上の溶質の濃度、電解質の濃度、グルコースの濃度、ヒアルロナンの濃度、乳酸又は乳酸塩の濃度、アルブミンの濃度、アデノシンのレベル、Ｒ－２－ヒドロキシグルタレート（glutarate）のレベル、ピルビン酸の濃度、酸素の濃度、及び／又は、酸化剤、還元剤、若しくは共因子の存在、並びに当業者であれば理解しうる他の条件等の種々の条件における改変を含んでいてもよい。

本開示では相互交換可能に使用されるが、「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という語は、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド何れかのヌクレオチドの任意の長さの多量体型を意味する。即ち、この語は、これらに限定されるものではないが、一本鎖、二本鎖、又は多重鎖のＤＮＡ又はＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ-ＲＮＡハイブリッド、或いは、プリン及びピリミジン塩基、又は他の天然塩基、化学的若しくは生化学的に改変された非天然塩基、又は誘導型のヌクレオチド塩基を含むポリマーを含む。

本開示で使用する場合、「抗体」という語は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含み、また、無傷抗体と、抗原に対する特異結合を保持する抗体断片とを含む。斯かる抗体断片は、これらに限定されるものではないが、抗原結合（Ｆａｂ）断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、Ｆａｂ’－ＳＨ断片、（Ｆａｂ’）２Ｆｖ断片、Fd断片、組換ＩｇＧ（rＩｇＧ）断片、単鎖抗体断片、例えば単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、二価ｓｃＦｖ、三価ｓｃＦｖ、及び単一ドメイン抗体断片（例えばｓｄＡｂ、ｓｄＦｖ、ナノボディ等）であってもよい。この語は、遺伝子改変及び／又はその他の改変を受けた形態の免疫グロブリン、例えばイントラボディ（intrabodies）、ペプチボディ（peptibodies）、キメラ抗体、単鎖抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、融合タンパク質、例えば抗体の抗原特異的標的化領域と非抗体タンパク質との融合体、ヘテロコンジュゲート抗体、多重特異的抗体、例えば二重特異的抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、タンデム・ジｓｃＦｖ、タンデム・トリｓｃＦｖ等を含む。別途記載しない限り、「抗体」という語は、その機能的抗体断片をも含むと解すべきである。また、この語は、無傷又は全長の抗体、例えば任意のクラス若しくはサブクラスの抗体、例えばＩｇＧ及びそのサブクラス、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、及びＩｇＤ等を含む。

本開示で使用する場合、「抗体断片」という語は、無傷抗体の一部、例えば無傷抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；ダイアボディ；直鎖抗体（Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995)）；単鎖抗体分子；並びに抗体断片から形成される多重特異的抗体が挙げられる。抗体をパパインで消化すると、各々単一の抗原結合部位を有する２つの「Ｆａｂ」断片と呼ばれる相同な抗原結合断片と、容易に結晶化する能力を反映して「Ｆｃ」断片と呼ばれる残部とが得られる。一方、ペプシン処置により得られるＦ（ａｂ’）２断片は、２つの抗原結合部位を有し、抗原を架橋する能力を維持する。

本開示では相互交換可能に使用されるが、「単鎖Ｆｖ」、「ｓｃＦｖ」、又は「ｓＦｖ」抗体断片という語は、単一のポリペプチド鎖に存在する抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含む。ある態様によれば、Ｆｖポリペプチドは更に、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカー又はスペーサを含み、これによりｓＦｖは抗原結合時に所望の構造をとることが可能となる。ｓＦｖの概説としては、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)を参照のこと。

本開示で使用する場合、「天然」ＶＨ及びＶＬドメインとは、宿主から単離されたＶＨ及びＶＬドメインであって、特定の条件、例えば米国特許第８７０９７５５Ｂ２号及び国際特許公報第ＷＯ／２０１６／０３３３３１Ａ１号等に記載の条件下で生成されるｓｃＦｖ形態において、その親和性を改変するための更なる分子進化を受けていないものを意味する。

本開示で使用する場合、「親和性」（affinity）という語は、二剤の可逆的結合の平衡定数を意味し、解離定数（Ｋｄ）として表される。ある抗体の親和性は、これと無関係のアミノ酸配列を有する抗体に対する親和性と比較して、例えば少なくとも１倍以上、少なくとも２倍以上、少なくとも３倍以上、少なくとも４倍以上、少なくとも５倍以上、少なくとも６倍以上、少なくとも７倍以上、少なくとも８倍以上、少なくとも９倍以上、少なくとも１０倍以上、少なくとも２０倍以上、少なくとも３０倍以上、少なくとも４０倍以上、少なくとも５０倍以上、少なくとも６０倍以上、少なくとも７０倍以上、少なくとも８０倍以上、少なくとも９０倍以上、少なくとも１００倍以上、又は少なくとも１０００倍以上、又はそれよりも大きい値であってもよい。抗体の標的タンパク質に対する親和性は、例えば約１００ナノモル（ｎＭ）～約０．１ｎＭ、約１００ｎＭ～約１ピコモル（ｐＭ）、又は約１００ｎＭ～約１フェムトモル（ｆＭ）、またはそれ以上であってもよい。本開示で使用する場合、「結合力」（avidity）という語は、二以上の剤の複合体が希釈後の解離に対して示す抵抗性を意味する。「免疫反応性」及び「優先的結合」という語は、本開示では抗体及び／又は抗原結合断片に関して相互交換可能に使用される。

本開示で使用する場合、「結合」（binding）という語は、例えば共有結合、静電結合、疎水結合、イオン結合、及び／又は、例えば塩橋と水橋との間の相互作用による水素結合等、各種の相互作用による２つの分子間の直接的な会合を意味する。非特異結合とは、親和性が約１０^－７Ｍ未満の結合、例えば親和性１０^－６Ｍ、１０^－５Ｍ、１０^－４Ｍ等の結合を意味する。

本開示で使用する場合、「細胞表面発現系」又は「細胞表面提示系」という用語は、細胞の表面におけるタンパク質又はその部分の提示又は発現を意味する。通常は、所望のタンパク質が細胞表面タンパク質と融合されたものを発現する細胞が生成される。例えば、タンパク質は膜貫通ドメインとの融合タンパク質として発現される。

本開示で使用する場合、「要素」という語は、ポリペプチド、例えばポリペプチドの融合体、ポリペプチドの部分領域、及びその機能的変異体又はその断片、並びにポリヌクレオチド、例えばマイクロＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ、及びその機能的変異体又はその断片を含む。

本開示で使用する場合、「領域」という語は、ポリペプチド又はポリヌクレオチドの部分を意味する。

本開示で使用する場合、「ドメイン」とは、機能的及び／又は構造的特性を有するポリペプチド又はポリヌクレオチドの領域のことである。

本開示で使用する場合、「柄部」及び「柄部ドメイン」という語は、構造的柔軟性を提供すると共にポリペプチド領域に隣接してこれを隔離する、柔軟なポリペプチドコネクター領域を意味する。これらは天然又は合成ポリペプチからなっていてもよい。柄部は、免疫グロブリン（例えばＩｇＧｌ）のヒンジ又はヒンジ領域に由来するものであってもよい。これは一般に、ヒトＩｇＧｌのＧｌｕ２１６からＰｒｏ２３０まで広がるものとして定義される（Burton (1985) Molec. Immunol., 22:161-206）。他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域については、重鎖内ジスルフィド（Ｓ－Ｓ）結合を形成する最初及び最後のシステイン残基を同じ位置に配置することで、ＩｇＧ１配列とアラインすることができる。柄部は天然のものでも非天然のものでもよく、例えばこれらに制限されるものではないが、米国特許第５，６７７,４２５号に開示される改変ヒンジ領域を含んでいてもよい。柄部は、任意のクラス又はサブクラスの抗体に由来する完全ヒンジ領域を含んでいてもよい。柄部は、構造的柔軟性を提供すると共にポリペプチド領域に隣接してこれを隔離する、ＣＤ８、ＣＤ２８、又は他の受容体に由来する領域を含んでいてもよい。

本開示で使用する場合、「単離された」という語は、物質がその元の環境（例えば、天然であれば天然環境）から取り出されることを意味する。例えば、生存する動物内に存在する天然ポリヌクレオチド又はポリペプチドは単離されていないが、天然の系において共存する物質の一部又は全部から分離された同一のポリヌクレオチド又はポリペプチドは、単離されたものである。斯かるポリヌクレオチドはベクターの一部であってもよく、及び／又は、斯かるポリヌクレオチド又はポリペプチドは組成物の一部であってもよい。斯かるベクター又は組成物はその天然環境の一部ではないという点で、斯かるポリヌクレオチド又はポリペプチドは単離されたものである。

本開示で使用する場合、「ポリペプチド」は、ペプチド結合により連結されたアミノ酸残基鎖を指す。ポリペプチドは固定された構造に折り畳まれたものではなく、また、翻訳後修飾も受けていない。「タンパク質」は、ポリペプチドが固定された構造に折り畳まれたものである。本開示では「ポリペプチド」及び「タンパク質」は相互交換可能に使用される。

本開示で使用する場合、ポリペプチドは、ポリペプチドの天然環境に混在する成分、例えば前記ポリペプチドの診断又は治療用途と干渉しうる物質、例えば酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様及び非タンパク質様溶質等が除去されて、「精製された」ものであってもよい。ポリペプチドは、（１）ローリー法で決定される抗体の重量で９０％以上、９５％以上、又は９８％以上、例えば９９％超まで精製されていてもよく、（２）スピニングカップ・シークエネーターを用いてＮ末端又は内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで精製されていてもよく、又は（３）還元または非還元条件下、クマシーブルー又はシルバー染色を用いて、ナトリウムドデシル硫酸塩ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）により均質であるとされる程度まで精製されていてもよい。

本開示で使用する場合、「免疫細胞」という語は、通常は骨髄で産生される造血幹細胞（ＨＳＣ）から誘導される白色血液細胞（白血球）を含む。「免疫細胞」は、例えばリンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）及びミエロイド由来細胞（好中球、好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ、樹状細胞）を含む。

本開示で使用する場合、「Ｔ細胞」は、ＣＤ３を発現するあらゆる種類の免疫細胞、例えばＴ－ヘルパー細胞（ＣＤ４^＋細胞）、細胞毒性Ｔ細胞（ＣＤ８^＋細胞）、Ｔ－制御性細胞（Ｔｒｅｇ）、及びγ－ΔＴ細胞を含む。

本開示で使用する場合、「細胞毒性細胞」は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫ－Ｔ細胞、γδＴ細胞、ＣＤ４^＋細胞の亜集団、及び好中球を含む。これらは細胞毒性応答を媒介しうる細胞である。

本開示で使用する場合、「幹細胞」という語は、一般に、多能性（pluripotent）又は多能性（multipotent）幹細胞を含む。「幹細胞」は、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ）；間葉性幹細胞（ＭＳＣ）；人工多能性（pluripotent）幹細胞（ｉＰＳ）；及び予定性（committed）前駆細胞（造血性幹細胞（ＨＳＣ）；骨髄由来細胞等）を含む。

本開示で使用する場合、「処置」（treatment）、「処置する」（treating）等の語は、所望の薬理学的及び／又は生理学的作用を得ることを意味する。この作用は、疾患又はその症状を完全に又は部分的に回避するという点で予防的なものであってもよく、及び／又は、疾患及び／又はその疾患に関連する副作用を部分的又は完全に治癒するという点で治療的なものであってもよい。本開示で使用する場合、「処置」とは、ヒト等の哺乳類におけるある疾患の任意の処置を包含し、（ａ）その疾患の素因を有するがまだその疾患を有すると診断されていない対象において、その疾患が発症するのを回避すること；（ｂ）その疾患を抑制する、即ちその発症を防止すること；及び（ｃ）その疾患を緩和する、即ち、その疾患の退行を生じさせること、を含む。

本開示では相互交換可能に使用されるが、「個人」、「対象」、「宿主」、及び「患者」という語は、哺乳類を意味する。例としては、これらに制限されるものではないが、ヒト、マウス（例えばラット、マウス等）、ウサギ目（例えばウサギ等）、非ヒト霊長目、ヒト、イヌ科、ネコ科、有蹄目（例えばウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ等）等が挙げられる。

本開示で使用する場合、「治療有効量」又は「効果量」という語は、哺乳類又は他の対象に投与した場合に、疾患に対して前記の処置を発揮するのに十分な剤の量、又は、二剤の合計量を意味する。「治療有効量」は、剤、処置の対象となる疾患及びその重症度、年齢、体重等に応じて異なる。

本開示で使用する場合、「進化」又は「進化させる」という語は、１又は２以上の突然変異生成法を用いて、異なるポリペプチドをコードする異なるポリヌクレオチドを生成することを意味する。ここで得られるポリペプチドは、それ自身が改善された生物学的分子であるか、及び／又は、他の改善された生物学的分子の生成に寄与する。「生理的」又は「通常の」又は「通常の生理的」条件とは、例えば、これらに制限されるものではないが、圧力、温度、ｐＨ、イオン強度、浸透圧、オスモル濃度、酸化的ストレス、１又は２以上の溶質の濃度、電解質の濃度、グルコースの濃度、ヒアルロナンの濃度、乳酸又は乳酸塩の濃度、アルブミンの濃度、アデノシンのレベル、Ｒ－２－ヒドロキシグルタレート（glutarate）のレベル、ピルビン酸の濃度、酸素の濃度、及び／又は、酸化剤、還元剤、若しくは共因子の存在、並びに、対象の投与部位において、又は対象の作用部位の組織又は器官において、通常の範囲内にあると考えられる他の条件等のことである。

本開示で使用する場合、「遺伝子操作細胞」には、外因性核酸を含む細胞が含まれる。ここで前記の外因性核酸は、前記細胞のゲノムに組み込まれているか否かを問わない。

本開示で使用する場合、「ポリペプチド」とは、タンパク質分子の一部又は全部を含むと共に、翻訳後修飾又は他の修飾を含んでいてもよい。

本開示で使用する場合、シュードタイピング要素とは、１又は２以上のポリペプチドを含み、前記標的宿主細胞を特定してこれに結合する「結合性ポリペプチド」、通常は糖タンパク質を含んでいてもよく、並びに、前記レトロウイルスと標的宿主細胞膜との融合を媒介することにより、レトロウイルスゲノムの前記標的宿主細胞への侵入を可能にする、１又は２以上の「融合性ポリペプチド」を含んでいてもよい。本開示で使用する場合、「結合性ポリペプチド」は、「Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞結合性ポリペプチド」又は「標的結合要素」と呼ぶ場合もあり、「融合性ポリペプチド」は、「融合性要素」と呼ぶ場合もある。

「静止」リンパ球、例えば静止Ｔ細胞等は、細胞周期のＧ０期にあり、Ｋｉ－６７等の活性化マーカーを発現しないリンパ球を意味する。静止リンパ球は、特異的抗原と未だ遭遇していないナイーブＴ細胞と、過去に抗原と遭遇して変化した記憶Ｔ細胞の双方を含んでいてもよい。「静止」リンパ球は「無活動」（quiescent）リンパ球と呼ぶ場合もある。

本開示で使用する場合、「白血球枯渇」（lymphodepletion）には、白血球枯渇剤の投与等により、対象のリンパ球の数を減少させる方法が含まれる。また、白血球枯渇は、身体の一部又は全身の分割放射線療法により達成してもよい。白血球枯渇剤は、哺乳類に投与された場合に、当該哺乳類の機能的リンパ球の数を減少させることが可能な化合物又は組成物であってもよい。斯かる剤の一例は、１又は２以上の化学治療剤である。斯かる剤及び用量は既知であり、処置の対象に応じて担当の医師が適宜選択すればよい。白血球枯渇剤の例としては、これらに限定されるものではないが、フルダラビン、シクロホスファミド、クラドリビン、デニロイキン・ジフチトクス、又はこれらの組み合わせが挙げられる。

当然ながら、本開示並びに本開示にて提供される側面及び態様は、開示される具体例に限定されるものではなく、もちろん変更してもよい。また、これも当然ながら、本開示で使用される用語法は、具体例及び態様を開示することを目的とするに過ぎず、限定を意図するものではない。本開示の範囲を決定するのは、あくまでも添付の特許請求の範囲である。

数値範囲を供する場合、当然ながら、斯かる範囲の上限と下限との間に介在する各価（文脈上明らかに他のことが意味されるのでない限り、下限の単位の１０分の１の有効数字で）や、前記明示範囲内の他の任意の明示された値及び介在する値も、本開示の中に含まれる。これらの部分範囲の上限及び下限は、斯かる部分範囲に独立に含まれていてもよく、これらの値も本発明に含まれるが、前記明示範囲から個別に除外される場合にはその対象となる。前記明示範囲が上下限の一方又は両方を除外する場合には、これらの一方又は両方を除外した範囲に含まれる範囲も本発明に含まれる。ある範囲について複数の低い値及び複数の高い値が与えられている場合、当業者であれば認識するように、選択された範囲には、前記高い値未満の任意の低い値が含まれる。本開示における見出しは何れも読者の便宜のためであって、限定のためではない。

別途定義しない限り、本開示で使用される全ての技術的及び化学的用語は、本発明雅俗する分野の当業者が通常理解する意味と同一の意味を有する。本開示に記載のものと類似又は同一の方法及び材料も本発明の実施及び試験に使用することができるが、本開示では好ましい方法及び材料を記載する。本開示において何らかの方法及び／又は材料との関連で引用する公報は、当該方法及び／又は材料を開示及び記載するものとして、何れも援用により本開示に組み込まれる。

留意すべきこととして、本開示及び添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「一つの」（a, an）及び「前記」（the）は、文脈上明らかに他のことが意味されるのでない限り、複数を包含するものとする。即ち、例えば「一つのキメラ抗原受容体」（a chimeric antigen receptor）は、斯かるキメラ抗原受容体及び当業者に公知のその等価物が複数存在する場合を含む、等々。更に留意すべきこととして、何らかの任意の要素を含まないものとして請求項を記載する場合がある。即ち、本記載は、請求項に列記する要素との関係で「単独の」（solely）や「のみ」（only）等の排他的な用語法を使用したり、否定的表現を使用したりすることを予告するものである。

本発明の複数の特徴を明確化のために複数の個別の態様として記載している場合でも、これらの特徴を組み合わせて単一の態様として提示することも可能である。これとは逆に、本発明の種々の特徴を簡便のために単一の態様として記載している場合でも、これらの特徴を個別に、又は適切な部分集合の組み合わせとして提示することも可能である。本発明に属する態様の全ての組み合わせが本発明に包含され、且つ、各々の組み合わせが個別且つ明示的に開示されているかのように本開示に示されるものとする。更に、種々の態様及びその要素の全ての部分集合の組み合わせも本発明に包含され、且つ、各々の部分集合の組み合わせが個別且つ明示的に開示されているかのように本開示に示されるものとする。

詳細な説明
本開示は、これらの従来技術の課題を克服するために、リンパ球を遺伝子的に改変するための方法及び組成物、並びに、養子細胞治療を実施するための方法であって、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を形質導入することを含む方法を提供する。本形質導入は、エクスビボで遙かに短い時間、例えば２４、１２、又は８時間以下しか要さず、また、ある態様によれば、事前のエクスビボでの刺激も不要である。これらの方法は、対象由来の血液を閉鎖系でエクスビボ処理するのに適しており、対象と同一の部屋で実施されるものであってもよく、及び／又は、ある態様によれば、前記方法の実施の全ての時点で、対象の視界の範囲内で、対象の血液又はその単離血液細胞に対して実施されるものであってもよい。より具体的に、本開示の側面及び態様は、現在の養子細胞治療に伴う課題を解決するために、静止Ｔ細胞及び／又は静止ＮＫ細胞を形質導入する方法であって、通常は組換レトロウイルスの静止Ｔ細胞及び／又は静止ＮＫ細胞への結合及び融合を促進し、惹いては前記組換レトロウイルスによる前記静止Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞の遺伝子改変を促進するシュードタイピング要素を使用する方法を提供する。更に、本開示にて提供される方法は、本分野の課題を克服するべく、例示的な態様によれば、キメラ抗原受容体と、その発現がインビボ制御要素により制御されるリンパ増殖性要素とを用いる。ここで、前記対象を前記インビボ制御要素に結合する化合物に暴露し、或いは斯かる暴露を終了することにより、前記遺伝子操作Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞の増加がインビボで促進される。

本開示に記載されるこれらの改良やその他の改良の結果として、一側面によれば、本開示では対象の、例えば疾患又は障害を有する患者の、静止Ｔ細胞及び／又は静止ＮＫ細胞を改変する方法が提供される。本方法では、前記対象由来の血液を採集し、静止Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を組換レトロウイルスと接触させて遺伝子操作し、前記遺伝子操作細胞を通常は従来の方法よりも短い時間で、例えば２４時間以内で、また、ある非限定的な態様によれば１２時間以内で、及び／又は、遺伝子操作Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞の集団をエクスビボで増加させることなく、例えば前記遺伝子操作静止Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞がエクスビボで４回を超える細胞***を生じないうちに、前記対象に再導入する。即ち、本開示にて提供される方法は、現在のＣＡＲ治療よりも遙かに短い時間で実施することができるため、エクスビボ工程の時間全体に亘って対象が診察室にいることも可能となる。これにより、閉鎖系でのエクスビボ工程の効率が改善され、患者試料の汚染や混合の可能性が低減されると共に、臨床実験室でより簡便に実施することが可能となる。

従って、図１及び２は、本開示にて提供される方法において使用される例示組成物の概略図である。図１はパッケージング細胞（１００）及び斯かるパッケージング細胞（２００）によって産生された組換レトロウイルスの図である。前記パッケージング細胞（１００）は、そのゲノム内に組み込まれた組換ポリヌクレオチド（１１０）を含み、斯かる組換ポリヌクレオチドは、レトロウイルスタンパク質及び種々の異なる膜結合性ポリペプチドを、トランス活性化因子により調節される誘導型プロモーターの制御下で発現する組換転写要素を含む。ここで、トランス活性化因子は、リガンドに結合し、リガンドにより活性化される。これらのトランス活性化因子、誘導型プロモーター、及びリガンドは、前記組換レトロウイルスの膜に組み込まれる細胞膜結合性ポリペプチドと、前記レトロウイルスのパッケージング及びアセンブリに必要なレトロウイルス成分の、連続的な発現及び蓄積を誘導するのに使用される。

以下に詳細に説明する種々のポリヌクレオチドが連続的に誘導発現される結果、図１に示す例示的なパッケージング細胞（１００）が産生される。例示的な方法では、この細胞を用いて組換レトロウイルスを産生し、これを本開示にて提供される静止Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞のトランスフェクションを行う方法（図２の（３００））に使用してもよい。非限定的な例示態様によれば、前記パッケージング細胞（１００）は、そのゲノム内に、パッケージ可能なレトロウイルスＲＮＡゲノムをコードする核酸を含む。斯かるレトロウイルスＲＮＡゲノムは、レトロウイルスのパッケージング及びアセンブリに必要なレトロウイルスゲノムの要素の少なくとも一部（非限定的な例として、レトロウイルスｐｓｉ要素、レトロウイルスｇａｇポリペプチド、及びレトロウイルスｐｏｌポリペプチド）を含む。

前記パッケージング細胞の細胞膜に組み込まれ、又は関連付けられた膜結合性ポリペプチドの一部は、前記レトロウイルスに組み込まれ、又は関連付けられるが、前記レトロウイルスゲノムによりコードされるものではない。例えば、前記パッケージング細胞及びこれから形成される組換レトロウイルスは、レトロウイルスＶｐｘポリペプチド（２５０）（これは、非限定的な例によれば、膜関連融合タンパク質、例えばＳｒｃ－ＦＬＡＧ－Ｖｐｘポリペプチド等として発現されてもよい）；結合性ポリペプチド及び融合性ポリペプチドを含みうるシュードタイピング要素（２４０）（これは、非限定的な態様によれば、麻疹ウイルスヘマグルチニン（Ｈ）ポリペプチド及び麻疹ウイルス融合（Ｆ）ポリペプチド、又はその細胞質ドメイン欠失変異体を含む）を含むと共に；任意により１又は２以上の活性化要素（２１０、２２０）（これは、非限定的な態様によれば、ＣＤ３に結合可能な膜結合性ポリペプチド及びＣＤ２８に結合可能な膜結合性ポリペプチドを含む）；及び／又は、任意により膜結合サイトカイン（２３０）（これは、非限定的な態様によれば、ＤＡＦ又はその断片に連結されたＩＬ－７である）を含んでいてもよい融合ポリペプチドである。これら膜結合性ポリペプチドの他の種々の具体的な種類も、本開示にて提供される。

前記パッケージング細胞による前記転写要素の連続的な発現の結果として、組換レトロウイルスが産生される。前記パッケージング細胞のゲノムの内部に存在し、通常は当該ゲノム内に組み込まれ、前記組換レトロウイルスのゲノムとなるＲＮＡレトロウイルスゲノムには、レトロウイルスの産生、感染、及び宿主細胞（通常は静止Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞である）ゲノムへの組み込みに必要なレトロウイルス成分（非限定的な例として、レトロウイルスＧａｇ及びＰｏｌポリヌクレオチドが挙げられる）が含まれる。更に、前記レトロウイルスゲノムは、本開示にて提供される１又は通常は２つの改変シグナル伝達ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。斯かる改変シグナル伝達ポリペプチドの一つは、通常はリンパ増殖性要素（非限定的な例によれば、構成型インターロイキン７受容体変異体）をコードし、他の改変シグナル伝達ポリペプチドは、通常はキメラ抗原受容体をコードする。

続いて、前記組換レトロウイルス（２００）を用いて、本開示にて提供される方法により、静止Ｔ細胞及び／又は静止ＮＫ細胞（３００）に形質導入を行う。図２に示すように、前記静止Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞（３００）が前記組換レトロウイルス（２００）と接触すると、上で論じた前記レトロウイルス表面に存在する膜ポリペプチドが、前記静止Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞（３００）の表面の受容体及び／又はリガンドに結合する。例えば、前記シュードタイピング要素（これは、上に示したように、静止Ｔ細胞及び／又は静止ＮＫ細胞の表面の分子に結合する結合性ポリペプチドと、融合性ポリペプチドとを含んでいてもよい）が、前記レトロウイルス（２００）の前記Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞膜への結合及び融合を促進する。活性化要素（２１０、２２０）は、前記Ｔ細胞受容体複合体に関与し、前記静止Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞（３００）を活性化する。斯かるプロセスは、その後の接触又はインキュベーションに伴い、時間をかけて進行する。更に、前記膜結合サイトカイン（２３０）が前記レトロウイルスの表面に存在し、前記静止Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞（３００）の表面のサイトカイン受容体（３１０）に結合することにより、更に結合及び活性化を促進する。即ち、理論に束縛されるものではないが、本開示にて提供される例示的な態様によれば、これらの組換レトロウイルス（２００）の構成成分のうち１又は２以上による結果として、前記レトロウイルス（２００）に存在しない要素によるエクスビボでの刺激又は活性化は必要とされない。ひいてはこれにより、本開示にて提供されるこれらの例示的な方法に要するエクスビボでの時間を削減することが可能となる。

前記Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞（２００）に結合すると、前記レトロウイルスは続いて前記Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞（３００）と融合し、前記レトロウイルスに含まれるポリペプチド及び核酸が前記Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞（３００）に侵入する。上に示したように、前記レトロウイルスにおけるこれらのポリペプチドの一つはＶｐｘポリペプチド（２５０）である。Ｖｐｘポリペプチド（２５０）は、細胞質内の遊離ｄＮＴＰを分解するＳＡＭＨＤ１制限因子（３５０）に結合して、その分解を促進する。即ち、ＶｐｘがＳＡＭＨＤ１を分解すると、細胞質内の遊離ｄＮＴＰ濃度が上昇し、逆転写活性が増加して、前記レトロウイルスゲノムの逆転写及び前記Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞ゲノム内への組み込みが促進される。

前記レトロウイルスゲノムの前記Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞（２００）への組み込みの後、前記Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞ゲノムは、をコードする核酸を含む前記リンパ増殖性要素をコードするシグナル伝達ポリペプチド（３７０）と、任意により前記ＣＡＲをコードするシグナル伝達ポリペプチド（３６０）とを含むことになる。前記リンパ増殖性要素の発現、及び任意により前記ＣＡＲの発現は、インビボ制御要素の制御により行われる。Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞（３００）に形質導入を行った対象に対して、前記インビボ制御要素に結合する化合物を投与し、斯かる化合物に暴露させると、前記リンパ増殖性要素の発現により、更には任意により前記ＣＡＲの発現及びその標的細胞への結合の結果として、前記Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞の増殖（３００）がインビボで促進される。即ち、本開示の組換レトロウイルスにより形質導入されたＴ細胞及び／又はＮＫ細胞は、増殖を誘導し、及び／又は、細胞死を阻害する１又は２以上のシグナルを有する。これにより、例示的な態様によれば、従来の方法では必要とされてきた、形質導入Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を対象に戻す前に宿主のリンパを枯渇させる作業を回避することができる。これにより、例示的な態様によれば、形質導入Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を対象に再導入する前に必要な処置の期間を短縮することができる。即ち、例示的な態様によれば、対象からの血液を採集してから、対象へ血液を再導入するまでに要する時間は、３６時間以内、２４時間、１２時間、又はある例によれば８時間以内である。これは、従来法のＣＡＲ－Ｔプロセスを根本から変更するものである。更に、前記インビボ制御要素により、本開示にて提供される安全機序の一つも提供される。例えば、前記化合物の投与を中止することにより、前記リンパ増殖性要素及び任意により前記ＣＡＲの発現を下方制御し、更には停止することができ、惹いては前記形質導入Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞並びにその子孫に対する増殖及び／又は生存シグナルを終了させることができる。

養子細胞治療を実施するための方法
特定の側面によれば、本開示では、対象に養子細胞治療を実施するための方法が提供される。一例によれば、前記方法は、
Ａ．対象から血液を採取し、
Ｂ．静止Ｔ細胞及び／又は静止ＮＫ細胞を含む末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離し、
Ｃ．前記対象の静止Ｔ細胞及び／又は静止ＮＫ細胞を、エクスビボで組換レトロウイルスと接触させ、ここで前記組換レトロウイルスは、その表面に、静止Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞に結合し、当該細胞に対する組換レトロウイルスの膜融合を促進することが可能なシュードタイピング要素を含み、ここで前記接触によって、前記組換レトロウイルスによる前記静止Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞の形質導入が促進されて、遺伝子操作Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞が産生され、
Ｄ．前記対象から血液を採取してから３６、２４、１２、又は８時間以内に、前記遺伝子操作細胞を前記対象に再導入することにより、前記対象において養子細胞治療を実施する
ことを含んでいてもよい。

本開示にて提供される一部の側面によれば、類似の工程を有する方法は、対象のリンパ球を遺伝子操作し、増加させるための方法と呼ばれる。当業者には明らかなように、養子細胞治療を実施するための方法及び組成物に関する本開示での議論は、対象のリンパ球を遺伝子操作し、増加させるための方法にも適用される。

通常は、本開示の養子細胞治療方法は、自家移植により実施される。自家移植では、細胞治療を受けるべき対象、又は斯かる対象由来の試料から、細胞を単離し、及び／又は、他の方法により調製する。即ち、ある側面によれば、前記細胞は、処置を必要とする対象、例えば患者に由来すると共に、単離及び処理の後、同一の対象に投与される。本開示に開示される方法及び組成物のある態様によれば、疾患又は障害を有する対象は医療施設に入り、そこで既知の方法、例えば静脈穿刺を用いて、前記対象の血液が採取される。ある態様によれば、対象から採取される血液の体積は、下限が１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、又は１００ｍＬ以上、上限が２００、２５０、３００、３５０、４００、５００、７５０、１０００、２０００、又は２５００ｍＬ以下の範囲である。ある態様によれば、１０～４００ｍＬが前記対象から採取される。ある態様によれば、２０～２５０ｍＬの血液が前記対象から採取される。ある態様によれば、血液は新鮮な状態で処理される。本発明に開示される態様の何れかによれば、新鮮な血液は、対象から採取されてから１５、３０、４５、６０、９０、１２０、１５０、又は１８０分間以内の血液であってもよい。ある態様によれば、血液は保存されることなく、本開示にて提供される方法にて処理される。

前記Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞と前記組換レトロウイルスとの接触により、通常は前記Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞の前記組換レトロウイルスによる形質導入が促進される。本開示を通じて、形質導入Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞は、エクスビボで形質導入された細胞の子孫であって、エクスビボでの形質導入の際に前記細胞内に導入された核酸又はポリヌクレオチドの少なくとも一部を保持する細胞を含む。形質導入細胞を「再導入する」（reintroducing）旨を規定する本開示の方法において、当然ながら斯かる細胞は、対象の血液から採取された段階では、通常は形質導入された状態ではない。本開示に示す側面の何れかにおいて、対象は例えば動物、哺乳類であってもよく、例示的な態様によればヒトであってもよい。

理論に束縛されるものではないが、非限定的な例示の方法によれば、例えば構成的に活性なＩＬ７変異体等、前記Ｔ細胞又はＮＫ細胞のゲノムに組み込まれうるリンパ増殖性要素をコードするポリヌクレオチドを、静止Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞にエクスビボで送達すると、宿主に対するリンパ球枯渇処理を要することなく、インビボで増加させることが可能な駆動要素を、細胞に付与することが可能となる。即ち、例示的な態様によれば、前記対象がリンパ枯渇剤に露出されない期間は、前記接触前の１、２、３、４、５、６、７、１０、１４、２１、若しくは２８日、又は１、２、３、若しくは６ヶ月間、前記接触の間、及び／又は、前記遺伝子操作Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞の前記対象への再導入後の１、２、３、４、５、６、７、１０、１４、２１、若しくは２８日間、又は、１、２、３、若しくは６ヶ月間である。更に、非限定的な例示の態様によれば、本開示にて提供される方法は、組換レトロウイルスを対象の静止Ｔ細胞及び／又は静止ＮＫ細胞に接触させる工程の間、及び／又は、エクスビボでの方法の全体を通じて、前記対象をリンパ枯渇剤に暴露することなく実施されるものであってもよい。

それゆえ、対象において遺伝子操作Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を増加させるインビボの方法は、本開示の一部態様の特徴である。例示的な態様によれば、斯かる方法は、エクスビボでの増幅を含まず、或いは実質的に増幅を含まない。

対象からの血液の採取から、エクスビボでのＴ細胞及び／又はＮＫ細胞の形質導入を経て、同対象への血液の再導入に至る方法／プロセス全体が、本開示の非限定的な例示の態様によれば、４８時間未満、３６時間未満、２４時間未満、１２時間未満、１１時間未満、１０時間未満、９時間未満、８時間未満、７時間未満、６時間未満、５時間未満、４時間未満、３時間未満、又は２時間未満の期間内に実施される。他の態様によれば、対象からの血液の採取から、エクスビボでのＴ細胞及び／又はＮＫ細胞の形質導入を経て、同対象への血液の再導入に至る方法／プロセス全体が、本開示の非限定的な例示の態様によれば、１時間～１２時間、又は２時間～８時間、又は４時間～１２時間、又は４時間～２４時間、又は８時間～２４時間、又は８時間～３６時間、又は８時間～４８時間、又は１２時間～２４時間、又は１２時間～３６時間、又は１２時間～４８時間、或いは、下限が１５、３０、６０、９０、１２０、１８０、及び２４０分間以上、上限が１２０、１８０、及び２４０、３００、３６０、４２０、及び４８０分間以内の期間内に実施される。他の態様によれば、対象からの血液の採取から、エクスビボでのＴ細胞及び／又はＮＫ細胞の形質導入を経て、同対象への血液の再導入に至る方法／プロセス全体が、下限が１、２、３、４、６、８、１０、及び１２時間以上、上限が８、９、１０、１１、１２、１８、２４、３６、又は４８時間以内の期間内に実施される。ある態様によれば、接触を生じさせる期間の後、前記遺伝子操作Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞が前記組換レトロウイルスから分離される。

本開示にて提供される養子細胞治療のための方法、並びにこれに関連する、静止Ｔ細胞及び／又は静止ＮＫ細胞をインビボで増加させる前にエクスビボで改変するための方法は、従来法よりも遙かに短い時間で実施可能であるために、患者の管理及び安全並びに製剤の製造可能性を根本的に改善することが可能となる。従って、斯かるプロセスを治療目的でインビボで実施する場合に、これを認可する責任を有する規制当局の観点からも、斯かるプロセスは好適であると期待できる。例えば、非限定的な例によれば、前記対象は、遺伝子操作Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を患者に再導入するまでの間、試料の処理時を通じて、その血液又は試料を処理する機器と同じ同一の建物（例えば点滴診療所）又は部屋にいることが可能となる。非限定的な例示の態様によれば、前記対象は、対象からの採血後、エクスビボでのＴ細胞及び／又はＮＫ細胞の形質導入を経て、対象への血液の再導入までの全方法／プロセスを通じて、処理中の血液又は試料と同じ箇所に、及び／又は、そこから１００、５０、２５、又は１２フィート、或いは手の届く距離にいることができる。他の非限定的な例示的な態様によれば、対象からの採血後、エクスビボでのＴ細胞及び／又はＮＫ細胞の形質導入を経て、対象への血液の再導入までの全方法／プロセスを通じて、或いは継続的に、対象が覚醒していることができ、及び／又は、処理中の対象の血液又は細胞を少なくとも一人が監視していればよいこととなる。本開示にて提供される改善ゆえに、養子細胞治療のための、及び／又は、静止Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を形質導入するための方法／プロセス全体が、対象からの採血後、エクスビボでのＴ細胞及び／又はＮＫ細胞の形質導入を経て、対象への血液の再導入まで、ヒトによる継続的な監視の下で実施されるものであってもよい。他の非限定的な例示的な態様によれば、対象からの採血後、エクスビボでのＴ細胞及び／又はＮＫ細胞の形質導入を経て、対象への血液の再導入まで、全方法／プロセスを通じて、血液細胞が無人の部屋でインキュベートされることはない。他の非限定的な例示的な態様によれば、対象からの採血後、エクスビボでのＴ細胞及び／又はＮＫ細胞の形質導入を経て、対象への血液の再導入までの全方法／プロセスが、前記対象のすぐ側で、及び／又は、前記対象と同一の部屋で、及び／又は、前記対象のベッドや椅子の隣で実施される。これにより、試料の素性の取り違えを防止できると共に、数日又は数週間も斯かる長期間の高価なインキュベーションも防止できる。更に、本開示にて提供される方法は、前記対象に再導入される血液試料及びその構成成分が、使い捨ての単回使用の構成要素としか接触しないような、閉鎖型・自動型の血液処理系にも容易に適用可能である。

本開示にて提供される養子細胞治療を実施するための方法は、通常は静止Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を形質導入する方法を含む。斯かる方法は、それ自体、本開示の個別の側面を構成する。当業者であれば理解するように、本開示にて提供されるＴ細胞及び／又はＮＫ細胞の形質導入の詳細は、斯かる工程を含む任意の側面にも適用可能である。従って、特定の側面によれば、本開示では、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞、通常は静止Ｔ細胞及び／又は静止ＮＫ細胞に対して形質導入を行う方法であって、前記静止Ｔ細胞及び／又は静止ＮＫ細胞を組換レトロウイルスと接触させ、ここで前記組換レトロウイルスは、通常はその表面に、前記静止Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞に結合し、当該細胞に対する組換レトロウイルスの膜融合を促進する能力を有するシュードタイピング要素を含み、ここで前記接触（及び接触条件下でのインキュベーション）により、前記静止Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞の前記組換レトロウイルスによる形質導入が促進されることにより、前記遺伝子操作されたＴ細胞及び／又はＮＫ細胞が産生されることを含む方法が提供される。斯かる方法の更なる態様は、レトロウイルス、リンパ増殖性要素、ＣＡＲ、シュードタイピング要素、リボスイッチ、活性化要素、膜結合サイトカイン、ｍｉＲＮＡ、及び／又は、本開示に示す他の要素の態様の何れかを含んでいてもよい。Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞に形質導入をするための斯かる方法は、インビトロで実施されるものでもよく、エクスビボで実施されるものでもよい。

養子細胞治療のための方法、及び、エクスビボでの静止Ｔ細胞及び／又は静止ＮＫ細胞の形質導入を含む、本開示にて提供される任意の方法において、前記細胞を組換レトロウイルスに接触させる前に、通常は血液細胞から好中球／顆粒球を分離する。ある態様によれば、例えばＴ細胞及び／又はＮＫ細胞等の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を含む末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、例えばアフェレーシス及び／又は密度勾配遠心分離等を用いて、血液試料の他の構成成分から分離する。ある態様によれば、ＰＢＭＣ及び／又はＴ細胞及び／又はＮＫ細胞が処理され、組換レトロウイルスと接触され、形質導入され、又はトランスフェクトされる前に、好中球が除去される。処置の対象との関係において、前記細胞は同種及び／又は自家であってもよい。

非限定的な例として、ある態様によれば、ＰＢＭＣはSepax又はSepax ２細胞処理系（BioSafe）を用いて単離される。ある態様によれば、ＰＢＭＣはCliniMACS Prodigy Cell Processor（Miltenyi Biotec）を用いて単離される。ある態様によれば、自動型アフェレーシスセパレーターが用いられる。これは、前記対象から血液を採取し、得られた血液から特定の細胞型（例えばＰＢＭＣ等）を選り分け、残余を対象に戻す装置である。密度勾配遠心分離は、アフェレーシス後に実施されてもよい。ある態様によれば、ＰＢＭＣは白血球除去（leukoreduction）フィルターデバイスを用いて単離される。ある態様によれば、その後に電磁ビーズ活性化細胞選別法を用いて、細胞表現型（即ち陽性選択）に基づき、特定の細胞集団をＰＢＭＣ、例えばＰＢＬ又はそのサブセット等を精製する。他の精製方法を使用することも可能である。例としては、細胞動員時にＴ細胞が遭遇する環境を模した基質を用い、Ｔ細胞を接着及び遊走させる基質接着法や、不所望の細胞を標的とした抗体複合体を用いて、不所望の細胞を標的化して除去する陰性選択が挙げられる。ある態様によれば、赤血球ロゼット形成（red blood cell rosetting）を用いて細胞を精製してもよい。

本開示における関連する側面の何れかの例示的な態様によれば、ＰＢＬはＴ細胞及び／又はＮＫ細胞を含む。本開示の特定の態様、例えばリンパ球を改変する方法や養子細胞治療を実施する方法において、本開示の組換レトロウイルスと接触されるＴ細胞及び／又はＮＫ細胞は、主に静止Ｔ細胞である。ある態様によれば、前記Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞は、その９５～１００％が静止細胞（Ｋｉ－６７－）からなる。ある態様によれば、組換えレトロウイルスと接触される前記Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞のうち静止細胞の割合は、下限が９０、９１、９２、９３、９４、及び９５％以上、上限が９６、９７、９８、９９、又は１００％以下である。ある態様によれば、前記Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞は、ナイーブ細胞を含む。

本開示に開示される方法及び組成物のある態様によれば、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞をエクスビボで組換レトロウイルスと接触させ、対象への再導入時に前記対象において標的化された免疫応答を誘発するように、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を遺伝子的に改変する。接触期間中、前記組換レトロウイルスはＴ細胞及び／又はＮＫ細胞を識別してこれに結合することで、前記レトロウイルスと宿主細胞膜とが融合し始める。続いて、形質導入のプロセスにより、前記組換レトロウイルスの遺伝物質が前記Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞に侵入し、宿主細胞ＤＮＡに組み込まれる。レンチウイルスによる形質導入の方法は既知である。斯かる方法例は、例えばWang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; Cooper et al. (2003) Blood. 101:1637-1644; Verhoeyen et al. (2009) Methods Mol Biol. 506: 97-114; and Cavalieri et al. (2003) Blood. 102(2): 497-505等に記載されている。

本開示にて提供される方法の多くは、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞の形質導入を含む。Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞をエクスビボでレンチウイルス等のレトロウイルスにより形質導入する方法は、本技術分野で公知である。例示的な態様によれば、本開示にて提供される方法は、エクスビボでの刺激や活性化を要しない。即ち、従来法に共通して必要であったこの工程を、本発明では回避することができる。但し、エクスビボでの刺激分子、例えば抗ＣＤ３及び／又は抗ＣＤ２８ビーズが、前記形質導入時に存在していてもよい。しかし、本開示にて提供される方法の例によれば、エクスビボでの刺激は不要である。特定の例示的な方法によれば、感染多重度（ＭＯＩ）が３～１０、ある態様によればＭＯＩ単位５～１０のレンチウイルス等のレトロウイルスを使用することができる。

前記形質導入反応が、本開示で議論するような閉鎖系、例えばSepax系等であってもよい。ここで、前記形質導入反応を、斯かる系を設定した使い捨て袋の中で実施してもよい。前記対象から採取した血液試料に由来するＰＢＭＣ等の血液細胞を、前記接触工程（即ち前記形質導入反応）の間は通常は存在しない好中球等の顆粒球からの単離及び／又は精製後すぐに、本開示に示す組換レトロウイルスと袋の中で接触させてもよい。

前記レトロウイルスを、単離されたＰＢＭＣを入れた袋に投入することにより、ＰＢＭＣと接触させてもよい。前記対象からの採血後、ＰＢＭＣ等の血液細胞を形質導入反応用袋に投入するまでの時間は、例えば３０分間～４時間、３０分間～２時間、又は約１時間である。培地や、前記対象に由来するヒト血清アルブミン、ヒトＡＢ＋血清、及び／又は、血清等の添加剤を、前記形質導入反応混合物に加えてもよい。培地は通常は存在する。例としては、本技術分野で公知のエクスビボ処理用の培地（非限定的な例として、Ｘ－ＶＩＶＯ 15(Lonza)又はＣＴＳ培地（Thermo Fisher Scientific）等）が挙げられる。補助用のサイトカインを前記形質導入反応混合物に加えてもよい。例としてはＩＬ２、ＩＬ７、又はＩＬ１５、或いはＨＳＡに含まれるものが挙げられる。

前記形質導入反応混合物は、２３～３９℃の間で、例示的な態様では３７℃でインキュベートすることができる。ある態様によれば、融合／形質導入を早めるために、前記形質導入反応を３７～３９℃で実施することができる。前記形質導入反応にｄＧＴＰを加えても良い。前記形質導入反応混合物は、１～１２時間、ある態様によれば６～１２時間インキュベートすることができる。形質導入後、前記形質導入Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を前記対象に再注射する前に、前記形質導入反応混合物から前記細胞を洗浄することができる。前記形質導入細胞を前記対象に再注射する前に、斯かる系、例えばSepax機器を用いて、例えば１０～５０ｍＬの洗浄溶液により、細胞を洗浄することができる。ある態様によれば、ＰＢＭＣ及び／又はＴ細胞及び／又はＮＫ細胞を処理し、組換レトロウイルスと接触させ、形質導入し、又はトランスフェクトする前に、好中球が除去される。

養子細胞治療を実施する例示的な態様によれば、血液を対象から採集して血液袋に入れ、血液袋を細胞処理系、例えばSepax細胞処理系に連結する。前記細胞処理系を用いて単離されたＰＢＭＣを、袋に採取し、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を形質導入するのに十分な条件で前記組換レトロウイルスと接触させ、インキュベートする。インキュベーション後、ＰＢＭＣ及び組換レトロウイルスの混合物を含む袋を細胞処理系に連結し、ＰＢＭＣを洗浄する。洗浄されたＰＢＭＣを袋に採取し、前記対象に再注入する。ある態様によれば、血液の採取から形質導入Ｔ及び／又はＮＫ細胞の再注入までの方法全体が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１５、１８、又は２４時間内に実施される。例示的な態様によれば、方法全体が１２時間以内に実施される。

ある態様によれば、前記組換レトロウイルスのための標的細胞はＰＢＬである。ある態様によれば、前記標的細胞はＴ細胞及び／又はＮＫ細胞である。ある態様によれば、前記Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞及び／又はキラーＴ細胞である。

ある態様によれば、本開示にて提供される組換レトロウイルスは、その表面に、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞に結合して組換レトロウイルスの膜融合を促進するシュードタイピング要素を有する。他の態様によれば、前記組換レトロウイルスは、その表面に、静止Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞に結合する活性化要素を有する。更に他の態様によれば、前記組換レトロウイルスは、その表面に膜結合サイトカインを有する。ある態様によれば、前記組換レトロウイルスは、１又は２以上の改変シグナル伝達ポリペプチドをコードする１又は２以上の転写単位を有するポリヌクレオチドを含み、そのうち１又は２以上はリンパ増殖性要素を含む。他の態様によれば、２つのシグナル伝達ポリペプチドを用いる場合、一方はリンパ増殖性要素を含み、他方は通常は抗原特異的標的化領域（ＡＳＴＲ）、膜貫通ドメイン、及び細胞内活性化ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。本開示に示すように、通常は本開示にて提供される組換レトロウイルスの表面と関連付けられた活性化要素は、静止Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞と接触することができ、且つ、十分な時間に亘って、且つ静止Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を活性化するのに適切な条件で、接触される。当然ながら、斯かる活性化は、本開示の方法の接触工程の間に亘って生じる。更に、これも当然ではあるが、本開示の方法において、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞に結合するシュードタイピング要素が組換レトロウイルスの表面に存在するある態様によれば、前記シュードタイピング要素の結合によって、活性化が誘導されてもよい。これらの態様において、活性化要素は任意である。

シュードタイピング要素、活性化要素、膜結合サイトカイン、改変シグナル伝達ポリペプチド、リンパ増殖性要素、及びＣＡＲに関する更なる詳細は、本開示の他の箇所にて提示される。

本開示に開示される方法及び組成物のある態様によれば、血液から採取された総リンパ球の５～９０％が形質導入される。ある態様によれば、形質導入されるリンパ球の％は、下限が５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、及び６０％、上限が５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、及び９０％の間である。ある態様によれば、形質導入されるリンパ球の％は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、又は少なくとも６０％である。

本開示に開示される方法及び組成物のある態様によれば、前記遺伝子操作Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞は、更なるエクスビボでの操作、例えばＴ細胞及び／又はＮＫ細胞の刺激及び／又は活性化等を行うことなく、前記対象に戻し導入され、再導入される、又は再注入される。従来技術の方法によれば、前記遺伝子操作Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を前記対象に導入する前に、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞の刺激／活性化のため、又は、遺伝子操作Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞の増加のために、エクスビボでの操作が用いられる。従来技術の方法によれば、これは通常は数日から数週間かかるため、初回採血から数日～数週間後に、対象に血液点滴のために再来院してもらう必要がある。本開示に開示される方法及び組成物のある態様によれば、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を前記組換レトロウイルスに接触させる前に、当該Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８固体支持体、例えば抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆ビーズ等への暴露によるエクスビボでの刺激を受けない。それゆえ、本開示では、エクスビボでの増幅を含まない方法が提供される。他の態様によれば、遺伝子操作Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞は、エクスビボで増幅されず、又は少数の細胞***（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０回の細胞***）分しか増幅されず、代わりにインビボで、即ち前記対象内でのみ、或いは主に前記対象内で増幅される。ある態様によれば、前記細胞の更なる増加を可能とするために、更なる培地を加えることはない。ある態様によれば、ＰＢＬを前記組換レトロウイルスと接触させている間、ＰＢＬの細胞産生は生じない。例示的な態様によれば、ＰＢＬがエクスビボにある間、ＰＢＬの細胞産生は生じない。従前の養子細胞治療の方法では、遺伝子操作Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞の再点滴の前に、対象にリンパ球枯渇を実施しない。ある態様によれば、採血の前に、患者又は対象にリンパ球枯渇を実施しない。ある態様によれば、遺伝子操作Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞の再点滴の前に、患者又は対象にリンパ球枯渇を実施しない。

本発明に開示される態様の何れかによれば、対象に再導入されるＴ細胞及び／又はＮＫ細胞の数は、下限が１×１０^３、２．５×１０^３、５×１０^３、１×１０^４、２．５×１０^４、５×１０^４、１×１０^５、２．５×１０^５、５×１０^５、１×１０^６、２．５×１０^６、５×１０^６、及び１×１０^７細胞／ｋｇ、上限が５×１０^４、１×１０^５、２．５×１０^５、５×１０^５、１×１０^６、２．５×１０^６、５×１０^６、１×１０^７、２．５×１０^７、５×１０^７、及び１×１０^８細胞／ｋｇの範囲である。例示的な態様によれば、対象に再導入されるＴ細胞及び／又はＮＫ細胞の数は、下限が１×１０^４、２．５×１０^４、５×１０^４、及び１×１０^５細胞／ｋｇ、上限が２．５×１０^４、５×１０^４、１×１０^５、２．５×１０^５、５×１０^５、及び１×１０^６細胞／ｋｇの範囲である。ある態様によれば、対象に再導入されるＰＢＬの数は、下限が５×１０^５未満、１×１０^６、２．５×１０^６、５×１０^６、１×１０^７、２．５×１０^７、５×１０^７、及び１×１０^８細胞、上限が２．５×１０^６、５×１０^６、１×１０^７、２．５×１０^７、５×１０^７、１×１０^８、２．５×１０^８、５×１０^８、及び１×１０^９細胞の範囲であってもよい。ある態様によれば、７０ｋｇの対象又は患者への再点滴に使用できるＴ細胞及び／又はＮＫ細胞の数は、７×１０^５～２．５×１０^８細胞である。他の態様によれば、形質導入に使用できるＴ細胞及び／又はＮＫ細胞の数は、約７×１０^６±１０％である。

本開示に示す方法によれば、採血から遺伝子操作Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞の再点滴までの養子細胞治療手順全体を、従前の方法よりも短い時間で実施することができ、有利である。ある態様によれば、養子細胞治療手順全体が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１５、１８、又は２４時間未満の時間で実施されるものであってもよい。例示的な態様によれば、養子細胞治療手順全体が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２時間未満の時間で実施されるものであってもよい。ある態様によれば、養子細胞治療手順全体が、下限が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、又は１５時間、上限が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１５、１８、又は２４時間の範囲で実施されるものであってもよい。

本開示にて提供されるある態様によれば、対象から血液試料を採集し、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を組換レトロウイルスと接触させ、及び／又は、遺伝子操作Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を前記対象に導入する工程は、閉鎖系で行われる。閉鎖系は、汚染に対して概ね或いは完全に閉鎖されている培養プロセスである。本発明の利点の一つは、本開示ではＣＡＲ治療を閉鎖系で行う方法が提供されるという点である。前記細胞処理手順の安全性及び取締管理における最大のリスクの一つは、従来の開放細胞培養系に見られるような環境への頻繁な暴露による汚染のリスクである。特に抗生物質の不在下において斯かるリスクを軽減するため、使い捨て（単回使用）器具の使用に焦点を当てた市販のプロセスが開発されてきた。しかし、たとえ無菌条件下でこうした器具を使用しても、成長培地をサンプルし、或いは追加の成長培地を加えるために、フラスコを開放することに伴う汚染のリスクは常に存在する。斯かる課題を克服するために、本開示では閉鎖系プロセス、即ち、製品が外部環境に暴露されないように設計され、そのように操作可能なプロセスが提供される。外部環境は通常は無菌ではないから、これは重要である。材料の移送は無菌連結部又は管溶接を通じて行う。期待交換用の通気は、環境暴露を避けるために、気体透過性膜等の他の追加部品を用いて、０．２μｍのフィルターを通じて行われる。

ある態様によれば、前記閉鎖系は、前記対象のインビボ循環系に連結されたエクスビボ循環系を含む。これにより、血液が採取されると、前記対象に再導入される前に、エクスビボ循環系で循環される。ある態様によれば、エクスビボ循環系は、ＰＢＬを単離するための系又は装置、及び／又は、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を単離するための系又は装置を、前記細胞を前記組換レトロウイルスに暴露させるための系又は装置との組み合わせで含む。ある態様によれば、前記閉鎖系は、前記Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を外気に暴露することはない。

斯かる閉鎖系の方法は、市販のデバイスを用いて実施してもよい。例えば、前記方法を、閉鎖系でのＴ細胞産生に適合したデバイスで実施してもよい。斯かるデバイスは、Ｇ－Ｒｅｘ^{（登録商標）}、WAVE Bioreactor^{（登録商標）}、OriGen PermaLife^{（登録商標）}バッグ、及びVueLife^{（登録商標）}バッグを含む。

本開示に開示される方法及び組成物のある態様によれば、遺伝子操作Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞は対象内で、本開示にて提示されるインビボ制御要素に結合する化合物に暴露される。ここで、前記インビボ制御要素は、前記組換レトロウイルスにより導入される遺伝物質の一部である。ある態様によれば、前記インビボ制御要素がリボスイッチであってもよく、前記化合物が前記リボスイッチの前記アプタマードメインに結合してもよい。ある態様によれば、前記インビボ制御要素が、分子シャペロンであってもよい。本発明に開示される態様の何れかによれば、前記化合物が、ヌクレオシド類似体であってもよい。ある態様によれば、前記ヌクレオシド類似体が、でヌクレオシド類似体抗ウイルス薬あってもよい。ここで抗ウイルス薬とは、米国食品医薬品局により抗ウイルス治療用に承認された化合物、又は、米国で抗ウイルス臨床試験に供された化合物である。例示的な態様によれば、前記化合物が、アシクロビル又はペンシクロビルであってもよい。ある態様によれば、前記化合物が、ファムシクロビル（ペンシクロビルの経口プロドラッグ）又はバラシクロビル（アシクロビルの経口プロドラッグ）であってもよい。前記化合物が前記インビボ制御要素に結合すると、導入された遺伝物質の発現に影響を与え、惹いては遺伝子操作Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞の増幅に影響を与える。

ある態様によれば、前記ヌクレオシド類似体抗ウイルス薬又はプロドラッグ、例えばアシクロビル、バラシクロビル、ペンシクロビル、又はファムシクロビルは、前記対象の血液からのＰＢＬの単離の前、単離と同時、及び／又は、単離の後に、また、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を組換レトロウイルスと接触させる前に、前記対象に投与される。ある態様によれば、前記ヌクレオシド類似体抗ウイルス薬又はプロドラッグは、血液からのＰＢＬの単離の前、又は、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞の組換レトロウイルスとの接触の前、下限が５、１０、１５、３０、及び６０分間、上限が１．５、２、３、４、５、６、８、１２、又は２４時間の範囲の時間内に、前記対象に投与される。他の態様によれば、前記ヌクレオシド類似体抗ウイルス薬又はプロドラッグは、本開示にて提供される方法による血液からのＰＢＬの単離、並びに、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞の組換レトロウイルスとの接触の後、下限が１．５、２、３、４、５、６、８、１２、又は２４時間、上限が１／2、１、２、３、４、５、６、７、１０、１４、２１、又は２８日間の範囲の時間内に、前記対象に投与される。ある態様によれば、前記ヌクレオシド類似体抗ウイルス薬又はプロドラッグは、本開示にて提供される方法による血液からのＰＢＬの単離、並びに、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞の組換レトロウイルスとの接触の後、少なくとも１．５、２、３、４、５、６、８、１２、又は２４時間、又は少なくとも２、３、４、５、６、７、１０、１４、２１、又は２８日間に亘って、前記対象に投与される。ある態様によれば、前記ヌクレオシド類似体抗ウイルス薬又はプロドラッグは、ＰＢＬの前記対象への再注入後、少なくとも１、２、３、４、５、７、１０、１４、２１、２８、３０、６０、９０、又は１２０日間、或いは、５、６、９、１２、２４、３６、４８、６０、７２、８４、９６、１２０ヶ月に亘って、或いは無期限の間だ、前記対象に投与される。本発明に開示される態様の何れかによれば、前記ヌクレオシド類似体抗ウイルス薬又はプロドラッグは、ＰＢＬの再点滴の前、及び／又は、ＰＢＬの再点滴の間、及び／又は、ＰＢＬの再注入の後に投与されてもよい。

ある態様によれば、前記インビボ制御要素に結合する化合物は、毎日1回、2回、3回、又は4回、前記対象に投与される。ある態様によれば、一日用量の前記化合物が１週間、２週間、４週間、３ヶ月、６ヶ月、１年に亘って、或いは対象の疾患、例えば癌が無くなるまで、又は無期限に亘って投与される。例示的な態様によれば、斯かる薬物は、ヌクレオシド類似体に結合するヌクレオシド類似体抗ウイルス薬、例えばリボスイッチである。斯かる薬物の更なる詳細は、本開示にて提供される。

小分子薬物と生物製剤の何れについても、薬物を送達する方法は本技術分野で公知であり、斯かる方法を本開示にて提供される方法において使用してもよい。任意の斯かる方法を、本発明の方法に使用するための薬物又は候補化合物又は抗体に使用することができる。一般的な投与経路の例としては、非侵襲的経口（口を介した経路）、局所（皮膚）、経粘膜（経鼻、口腔内／舌下、経膣、眼内、及び直腸内）、並びに吸入経路が挙げられる。多くのタンパク質及びペプチド薬物、例えばモノクローナル抗体等は、注射又はナノニードルアレイにより送達する必要がある。例えば、多くの免疫接種はタンパク質薬物の送達に基づいており、注射で投与されることが多い。

改変シグナル伝達ポリペプチド
ある態様によれば、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞への接触に用いられる組換レトロウイルスは、１又は２以上の改変シグナル伝達ポリペプチドをコードする１又は２以上の転写単位を有するポリヌクレオチドを有し、そのうち１又は２以上はリンパ増殖性要素を含む。ある態様によれば、シグナル伝達ポリペプチドは、以下の何れかの組み合わせを含む：細胞外抗原結合ドメイン（又は抗原特異的標的化領域若しくはＡＳＴＲ）、柄部、膜貫通ドメイン、細胞内活性化ドメイン、リンパ増殖性要素、調節ドメイン（例えば共刺激ドメイン）、及びＴ細胞生存モチーフ。例示的な態様によれば、改変シグナル伝達ポリペプチドの少なくとも１つ、２つ、又は全てがＣＡＲである。ある態様によれば、２つのシグナル伝達ポリペプチドを用いる場合、一方がリンパ増殖性要素をコードし、他方が、抗原特異的標的化領域（ＡＳＴＲ）、膜貫通ドメイン、及び細胞内活性化ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする。他の態様によれば、ＣＡＲが、抗原特異的標的化領域に連結されたリンパ増殖性要素を含んでいてもよい。他の態様によれば、前記リンパ増殖性要素が構成的に活性なインターロイキン受容体、例えばＩＬ－７Ｒαの既知の変異体である場合、結合はリガンドの存在に依存しないので、抗原特異的標的化領域は必要とされない。当業者であれば斯かる系を再構成して、前記リンパ増殖性要素及び前記ＣＡＲを個別のポリヌクレオチドに、類似又は非類似の制御要素と共に配置し、本開示に開示される方法及び組成物に供することが可能である。当業者であれば理解するように、斯かる改変ポリペプチドを、組換ポリペプチドと呼ぶことも可能である。

抗原特異的標的化領域
ある態様によれば、改変シグナル伝達ポリペプチドは、特異結合対の部分を含む。これは通常はＡＳＴＲであるが、本開示では抗原結合ドメインと呼ぶ場合もある。特異結合対としては、これらに限定されるものではないが、抗原抗体結合対、リガンド受容体結合対等が挙げられる。即ち、本開示の改変シグナル伝達ポリペプチドに適した特異結合対の部分は、抗体、抗原、リガンド、リガンドの受容体結合ドメイン、受容体、受容体のリガンド結合ドメイン、及びアフィボディ（affibody）であるＡＳＴＲを含む。

本開示の改変シグナル伝達ポリペプチドにおける使用に適したＡＳＴＲは、任意の抗原結合性ポリペプチドであってもよい。ある態様によれば、前記ＡＳＴＲは、抗体、例えば全長抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、（Ｆａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、及び、二価単鎖抗体又は二重特異性抗体（diabody）である。

ある態様によれば、前記ＡＳＴＲは、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である。ある態様によれば、前記重鎖は、前記改変シグナル伝達ポリペプチドにおける前記軽鎖のＮ末端側に位置する。他の態様によれば、前記軽鎖は、前記改変シグナル伝達ポリペプチドにおける前記重鎖のＮ末端側に位置する。本開示の態様の何れかによれば、本開示においてより詳細に論じるように、前記重鎖及び軽鎖が、リンカーにより隔てられていてもよい。本開示の態様の何れかによれば、前記重鎖又は軽鎖が、前記改変シグナル伝達ポリペプチドのＮ末端側に存在してもよく、通常は他のドメイン、例えばシグナル配列又はペプチドのＣ末端側にある。

他の抗体系認識ドメイン（ｃＡｂＶＨＨ（ラクダ科抗体可変ドメイン）及びそのヒト化版、ＩｇＮＡＲＶＨ（サメ抗体可変ドメイン）及びそのヒト化版、ｓｄＡｂＶＨ（単一ドメイン抗体可変ドメイン）及びラクダ科化（camelized）抗体可変ドメインも、前記改変シグナル伝達ポリペプチドと共に、本開示の改変シグナル伝達ポリペプチドを用いた方法における使用に適している。ある例によれば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）系認識ドメイン、例えば単鎖ＴＣＲ（ｓｃＴｖ、ＶαＶβを含む単鎖二ドメインＴＣＲ）も、使用に適している。

ある態様によれば、前記ＡＳＴＲが多重特異的抗体、例えば二重特異的抗体であってもよい。多重特異的抗体は、少なくとも２つの異なる部位に対する結合特異性を有する。ある態様によれば、斯かる結合特異性の一方は、ある標的抗原に対するものであり、他方は他の標的抗原に対するものである。ある態様によれば、二重特異的抗体は、ｔａ標的抗原の２つの異なるエピトープに結合してもよい。また、二重特異的抗体を用いて、標的抗原を発現する細胞に細胞毒性剤を局在化させてもよい。二重特異的抗体は、全長抗体として調製してもよく、抗体断片として調製してもよい。

本開示の改変シグナル伝達ポリペプチドにおける使用に適したＡＳＴＲは、種々の抗原結合特異性を有していてもよい。ある例によれば、前記抗原結合ドメインは、標的細胞により発現（合成）される抗原に存在するエピトープに特異的である。一例によれば、前記標的細胞は、癌細胞関連抗原である。癌細胞関連抗原としては、例えば、乳癌細胞、Ｂ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫細胞、卵巣癌細胞、前立腺癌細胞、中皮腫、肺癌細胞（例えば小細胞性肺癌細胞）、非ホジキンＢ－細胞リンパ腫（Ｂ－ＮＨＬ）細胞、卵巣癌細胞、前立腺癌細胞、中皮腫細胞、肺癌細胞（例えば、小細胞肺癌細胞）、メラノーマ細胞、慢性リンパ球性白血病細胞、急性リンパ球性白血病細胞、神経芽細胞腫細胞、グリオーマ、膠芽腫、髄芽腫、大腸癌細胞等に関連する抗原が挙げられる。癌細胞関連抗原は、非癌性細胞が発現するものであってもよい。

改変シグナル伝達ポリペプチドのＡＳＴＲが結合可能な抗原の非限定的な例としては、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＤ３０、ＥＲＢＢ２、ＣＡ１２５、ＭＵＣ－１、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＣＤ４４表面接着分子、メソテリン、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲvIII、血管内皮成長因子受容体－２（ＶＥＧＦＲ２）、高分子メラノーマ関連抗原（ＨＭＷ－ＭＡＡ）、ＭＡＧＥ－Ａｌ、ＩＬ－１３Ｒ－ａ２、ＧＤ２、Ａｘｌ、Ｒｏｒ２等が挙げられる。

ある例によれば、改変シグナル伝達ポリペプチドでの使用に適した特異結合対の要素は、受容体のリガンドであるＡＳＴＲである。リガンドとしては、これらに限定されるものではないが、サイトカイン（例えばＩＬ－１３等）；成長因子（例えばヘレグリン（heregulin）；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）等）；インテグリン結合ペプチド（例えば配列Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐを含むペプチド）等が挙げられる。

改変シグナル伝達ポリペプチドにおける特異結合対の要素がリガンドである場合、前記改変シグナル伝達ポリペプチドは、前記特異結合対の第２の要素の存在下で活性化されるものであってもよく、ここで特異結合対の第２の要素は、前記リガンドの受容体である。例えば前記リガンドがＶＥＧＦである場合、特異結合対の第２の要素が、可溶性ＶＥＧＦ受容体等のＶＥＧＦ受容体であってもよい。

前記のように、ある例によれば、改変シグナル伝達ポリペプチドに含まれる特異結合対の要素は、例えばリガンド受容体、共受容体等の受容体であるＡＳＴＲである。前記受容体は、受容体のリガンド結合断片であってもよい。適切な受容体としては、これらに限定されるものではないが、成長因子受容体（例えばＶＥＧＦ受容体）；キラー細胞レクチン様受容体サブファミリーＫ、メンバー１（ＮＫＧ２Ｄ）ポリペプチド（ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、及びＵＬＢ６の受容体）；サイトカイン受容体（例えばＩＬ－１３受容体；ＩＬ－２受容体等）；ＣＤ２７；天然細胞毒性受容体（ＮＣＲ）（例えばＮＫＰ３０（ＮＣＲ３／ＣＤ３３７）ポリペプチド（受容体 for ＨＬＡ－Ｂ関連転写産物３（ＢＡＴ３）及びＢ７－Ｈ６）等）等が挙げられる。

柄部
ある態様によれば、前記改変シグナル伝達ポリペプチドは、柄部を含む。斯かる柄部は、前記改変シグナル伝達ポリペプチドの細胞外に存在するＡＳＴＲと膜貫通ドメインとの間の部分に存在する。ある例によれば、前記柄部は、野生型ＣＤ８柄部領域（ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡ）（配列番号７９）と少なくとも８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％同一性を有し、野生型ＣＤ２８柄部領域（ＦＣＫＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰ）（配列番号８０）と少なくとも８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％同一性を有し、又は、野生型免疫グロブリン重鎖柄部領域と少なくとも８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％同一性を有する。改変シグナル伝達ポリペプチドにおいて、斯かる柄部を使用することにより、前記抗原特異的標的化領域、通常は改変シグナル伝達ポリペプチド全体の、標的抗原に対する高い結合性を維持することが可能となる。

前記柄部領域は、約４アミノ酸～約５０アミノ酸、例えば、約４ａａ～約１０ａａ、約１０ａａ～約１５ａａ、約１５ａａ～約２０ａａ、約２０ａａ～約２５ａａ、約２５ａａ～約３０ａａ、約３０ａａ～約４０ａａ、又は約４０ａａ～約５０ａａの長さを有していてもよい。

ある例によれば、改変シグナル伝達ポリペプチドの柄部は、少なくとも１つのシステインを含む。例えば、ある例によれば、前記柄部が、前記配列Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ（配列番号６２）を含んでいてもよい。存在する場合、第１の改変シグナル伝達ポリペプチドの柄部のシステインは、第２の改変シグナル伝達ポリペプチドの柄部とのジスルフィド結合に利用可能であってもよい。

柄部は、本技術分野で公知の免疫グロブリンのヒンジ領域のアミノ酸配列を含んでいてもよい。例えばTan et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:162; and Huck et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14:1779を参照のこと。非限定的な例として、免疫グロブリンのヒンジ領域が、以下のアミノ酸配列の何れかのうち少なくとも１０、１５、２０、又は全てのアミノ酸に対して、少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有するドメインを含んでいてもよい。ＤＫＴＨＴ（配列番号６３）；ＣＰＰＣ（配列番号６２）；ＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲ（配列番号６４）（例えばGlaser et al. (2005) J. Biol. Chem. 280:41494参照）；ＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴ（配列番号６５）；ＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰ（配列番号６６）；ＫＣＣＶＤＣＰ（配列番号６７）；ＫＹＧＰＰＣＰ（配列番号６８）；ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号６９）（ヒトＩｇＧ１ヒンジ）；ＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号７０）（ヒトＩｇＧ２ヒンジ）；ＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＣＰＲＣＰ（配列番号７１）（ヒトＩｇＧ３ヒンジ）；ＳＰＮＭＶＰＨＡＨＨＡＱ（配列番号７２）（ヒトＩｇＧ４ヒンジ）等。前記柄部が、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のヒンジ領域のアミノ酸配列を有するヒンジ領域を含んでいてもよい。前記柄部が、野生型（天然）ヒンジ領域と比べて、１又は２以上のアミノ酸の置換及び／又は挿入及び／又は欠失を含んでいてもよい。例えば、ヒトＩｇＧ１ヒンジのＨｉｓ２２９が、Ｔｙｒで置換されていてもよい。この場合、前記柄部は、配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＹＴＣＰＰＣＰを含む（例えばYan et al. (2012) J. Biol. Chem. 287:5891参照）。前記柄部が、ヒトＣＤ８由来のアミノ酸配列を含んでいてもよい。例えば、前記柄部が、アミノ酸配列ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤ（配列番号７３）、又はその変異体を含んでいてもよい。

膜貫通ドメイン
本開示の改変シグナル伝達ポリペプチドは、真核細胞膜に挿入される膜貫通ドメインを含んでいてもよい。斯かる膜貫通ドメインは、前記ＡＳＴＲと前記共刺激ドメイントの間に介挿されていてもよい。前記膜貫通ドメインは、前記柄部と前記共刺激ドメイントの間に介挿されていてもよい。この場合、前記キメラ抗原受容体は、アミノ末端（Ｎ末端）側からカルボキシル末端（Ｃ末端）側に向かって、ＡＳＴＲ；柄部；膜貫通ドメイン、及び活性化ドメインを含むことになる。

ポリペプチドを真核（例えば哺乳類）細胞の細胞膜へ挿入させることが可能な膜貫通（ＴＭ）ドメインは、本開示に示す側面及び態様における使用に適している。本開示にて提供される側面又は態様の何れかに適したＴＭドメインの非限定的な例としては、以下の何れかのＴＭドメインの少なくとも１０、１５、２０、又は全てのアミノ酸と少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有するドメインが挙げられる。ａ）ＣＤ＊ α（ＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣ（配列番号４６））；ｂ）ＣＤ８ β（ＬＧＬＬＶＡＧＶＬＶＬＬＶＳＬＧＶＡＩＨＬＣＣ（配列番号４７））；ｃ）ＣＤ４（ＡＬＩＶＬＧＧＶＡＧＬＬＬＦＩＧＬＧＩＦＦＣＶＲＣ（配列番号４８））；ｄ）ＣＤ３Ｚ（ＬＣＹＬＬＤＧＩＬＦＩＹＧＶＩＬＴＡＬＦＬＲＶ（配列番号４９）；ｅ）ＣＤ２８（ＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶ（配列番号５０））；ｆ）ＣＤ１３４（ＯＸ４０）：（ＶＡＡＩＬＧＬＧＬＶＬＧＬＬＧＰＬＡＩＬＬＡＬＹＬＬ（配列番号５１））；ｇ）ＣＤ７（ＡＬＰＡＡＬＡＶＩＳＦＬＬＧＬＧＬＧＶＡＣＶＬＡ（配列番号５２））、ｈ）ＣＤ８ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣ（配列番号７５）、及びｉ）ＣＤ２８ＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶ（配列番号７６）。

非限定的な例として、本発明の一側面の膜貫通ドメインは、前記配列番号４６膜貫通ドメイン、前記ＣＤ８β膜貫通ドメイン、前記ＣＤ４膜貫通ドメイン、前記ＣＤ３ζ膜貫通ドメイン、前記ＣＤ２８膜貫通ドメイン、前記ＣＤ１３４膜貫通ドメイン、又は前記ＣＤ７膜貫通ドメインに対し、少なくとも８０、９０、又は９５％の配列同一性を有していてもよい。

細胞内活性化ドメイン
本開示の改変シグナル伝達ポリペプチドにおける使用に適した細胞内活性化ドメインは、活性化されると、通常は１又は２以上のサイトカインの産生；細胞死の増加；及び／又は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、γδＴ細胞、及び／又は、好中球の増殖促進を誘導する。本開示では、活性化を行うドメイン（activating domain）を活性化ドメイン（activation domain）と言う場合もある。

ある態様によれば、前記細胞内活性化ドメインは、以下に説明するＩＴＡＭモチーフを少なくとも１つ（例えば１、２、３、４、５、６等）含む。ある態様によれば、前記細胞内活性化ドメインは、ＤＡＰ１０／ＣＤ２８型シグナル伝達鎖を含む。ある態様によれば、前記細胞内活性化ドメインは、膜結合改変シグナル伝達ポリペプチドに共有結合されておらず、代わりに細胞質内に拡散している。非限定的な例として、本発明の一側面の細胞内活性化ドメインは、以下に説明するＣＤ３Ｚ、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ７９Ａ、ＤＡＰ１２、ＦＣＥＲｌＧ、ＤＡＰ１０／ＣＤ２８、又はＺＡＰ７０ドメインに対して、少なくとも８０％、９０％、又は９５％の配列同一性を有していてもよい。

本開示の改変シグナル伝達ポリペプチドにおける使用に適した細胞内活性化ドメインとしては、免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）含有細胞内シグナル伝達ポリペプチドが挙げられる。ＩＴＡＭモチーフはＹＸ_１Ｘ_２Ｌ／Ｉで表される。ここでＸ_１及びＸ_２は各々独立に任意のアミノ酸である。ある例によれば、改変シグナル伝達ポリペプチドの細胞内活性化ドメインは、１、２、３、４、又は５つのＩＴＡＭモチーフを含む。ある例によれば、細胞内活性化ドメイン内にＩＴＡＭモチーフは２度反復して登場し、第１及び第２のＩＴＡＭモチーフは６～８のアミノ酸により互いに隔てられている。例えば、（ＹＸ_１Ｘ_２Ｌ／Ｉ）（Ｘ_３）_ｎ（ＹＸ_１Ｘ_２Ｌ／Ｉ）となる。ここでｎは６～８の整数であり、６～８個のＸ_３は各々、任意のアミノ酸であってよい。ある例によれば、改変シグナル伝達ポリペプチドの細胞内活性化ドメインは、３つのＩＴＡＭモチーフを含む。

適切な細胞内活性化ドメインは、ＩＴＡＭモチーフを含むポリペプチドに由来するＩＴＡＭモチーフ含有部分であってもよい。例えば、適切な細胞内活性化ドメインは、任意のＩＴＡＭモチーフ含有タンパク質由来のＩＴＡＭモチーフ含有ドメインであってもよい。即ち、適切な細胞内活性化ドメインは、その元となる完全タンパク質の全長配列を含む必要はない。適切なＩＴＡＭモチーフ含有ポリペプチドの例としては、これらに限定されるものではないが、ＣＤ３Ｚ（ＣＤ３ζ）；ＣＤ３Ｄ（ＣＤ３Δ）；ＣＤ３Ｅ（ＣＤ３ε）；ＣＤ３Ｇ（ＣＤ３γ）；ＣＤ７９Ａ（抗原受容体複合体関連タンパク質α鎖）；ＤＡＰ１２；及びＦＣＥＲｌＧ（Ｆｃε受容体Ｉγ鎖）等が挙げられる。

ある例によれば、前記細胞内活性化ドメインは、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３ζ鎖（別名ＣＤ３Ｚ、Ｔ細胞受容体Ｔ３ζ鎖、ＣＤ２４７、ＣＤ３－ＺＥＴＡ、ＣＤ３Ｈ、ＣＤ３Ｑ、Ｔ３Ｚ、ＴＣＲＺ等）に由来する。例えば、適切な細胞内活性化ドメインは、以下のアミノ酸配列（２アイソフォーム）のうち少なくとも１０、１５、２０、又は全てのアミノ酸に対し、或いは、以下のアミノ酸配列の何れかに由来する約１００アミノ酸～約１１０アミノ酸（ａａ）、約１１０ａａ～約１１５ａａ、約１１５ａａ～約１２０ａａ、約１２０ａａ～約１３０ａａ、約１３０ａａ～約１４０ａａ、約１４０ａａ～約１５０ａａ、又は約１５０ａａ～約１６０ａａの連続した配列に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するドメインを含んでいてもよい。

式中ＩＴＡＭモチーフを太字下線で示す。

同様に、適切な細胞内活性化ドメインポリペプチドは、全長ＣＤ３ζアミノ酸配列のＩＴＡＭモチーフ含有部分を含んでいてもよい。即ち、適切な細胞内活性化ドメインは、以下の配列のうち少なくとも１０、１５、２０、又は全てのアミノ酸に対し、或いは、以下のアミノ酸配列の何れかに由来する約１００アミノ酸～約１１０アミノ酸（ａａ）、約１１０ａａ～約１１５ａａ、約１１５ａａ～約１２０ａａ、約１２０ａａ～約１３０ａａ、約１３０ａａ～約１４０ａａ、約１４０ａａ～約１５０ａａ、又は約１５０ａａ～約１６０ａａの連続した配列に対し、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するドメインを含んでいてもよい。

式中ＩＴＡＭモチーフを太字下線で示す。

ある例によれば、前記細胞内活性化ドメインが、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３Δ鎖（別名ＣＤ３Ｄ；ＣＤ３－ＤＥＬＴＡ；Ｔ３Ｄ；ＣＤ３抗原、Δサブユニット；ＣＤ３Δ；ＣＤ３ｄ抗原、Δポリペプチド（ＴｉＴ_３複合体）；ＯＫＴ３、Δ鎖；Ｔ細胞受容体Ｔ３Δ鎖；Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３Δ鎖等）に由来する。即ち、適切な細胞内活性化ドメインは、以下の配列のうち少なくとも１０、１５、２０、又は全てのアミノ酸に対し、或いは、以下のアミノ酸配列の何れかに由来する約１００アミノ酸～約１１０アミノ酸（ａａ）、約１１０ａａ～約１１５ａａ、約１１５ａａ～約１２０ａａ、約１２０ａａ～約１３０ａａ、約１３０ａａ～約１４０ａａ、約１４０ａａ～約１５０ａａ、又は約１５０ａａ～約１６０ａａの連続した配列に対し、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するドメインを含んでいてもよい。

式中ＩＴＡＭモチーフを太字下線で示す。

同様に、適切な細胞内活性化ドメインポリペプチドは、全長ＣＤ３Δアミノ酸配列のＩＴＡＭモチーフ含有部分を含んでいてもよい。即ち、適切な細胞内活性化ドメインは、以下の配列の少なくとも１０、１５、２０、又は全てのアミノ酸に対し、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するドメインを含んでいてもよい。

式中ＩＴＡＭモチーフを太字下線で示す。

ある例によれば、前記細胞内活性化ドメインは、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３ε鎖（別名ＣＤ３ｅ、Ｔ細胞表面抗原Ｔ３／Ｌｅｕ－４ε鎖、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３ε鎖、ＡＩ５０４７８３、ＣＤ３、ＣＤ３ε、Ｔ３ｅ等）に由来する。即ち、適切な細胞内活性化ドメインは、以下の配列のうち少なくとも１０、１５、２０、又は全てのアミノ酸に対し、或いは、以下のアミノ酸配列に由来する約１００アミノ酸～約１１０アミノ酸（ａａ）、約１１０ａａ～約１１５ａａ、約１１５ａａ～約１２０ａａ、約１２０ａａ～約１３０ａａ、約１３０ａａ～約１４０ａａ、約１４０ａａ～約１５０ａａ、又は約１５０ａａ～約１６０ａａ連続した配列に対し、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するドメインを含んでいてもよい。

式中ＩＴＡＭモチーフを太字下線で示す。

同様に、適切な細胞内活性化ドメインポリペプチドは、全長ＣＤ３εアミノ酸配列のＩＴＡＭモチーフ含有部分を含んでいてもよい。即ち、適切な細胞内活性化ドメインは、以下の配列のうち少なくとも１０、１５、２０、又は全てのアミノ酸に対し、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するドメインを含んでいてもよい。

式中ＩＴＡＭモチーフを太字下線で示す。

ある例によれば、前記細胞内活性化ドメインは、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３γ鎖（別名ＣＤ３Ｇ、Ｔ細胞受容体Ｔ３γ鎖、ＣＤ３－ＧＡＭＭＡ、Ｔ３Ｇ、γポリペプチド（ＴｉＴ３複合体）等）に由来する。即ち、適切な細胞内活性化ドメインは、以下の配列のうち少なくとも１０、１５、２０、又は全てのアミノ酸に対し、或いは、以下のアミノ酸配列に由来する約１００アミノ酸～約１１０アミノ酸（ａａ）、約１１０ａａ～約１１５ａａ、約１１５ａａ～約１２０ａａ、約１２０ａａ～約１３０ａａ、約１３０ａａ～約１４０ａａ、約１４０ａａ～約１５０ａａ、又は約１５０ａａ～約１６０ａａの連続した配列に対し、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するドメインを含んでいてもよい。

式中ＩＴＡＭモチーフを太字下線で示す。

同様に、適切な細胞内活性化ドメインポリペプチドは、全長ＣＤ３γアミノ酸配列のＩＴＡＭモチーフ含有部分を含んでいてもよい。即ち、適切な細胞内活性化ドメインは、以下の配列のうち少なくとも１０、１５、２０、又は全てのアミノ酸に対し、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するドメインを含んでいてもよい。

式中ＩＴＡＭモチーフを太字下線で示す。

ある例によれば、前記細胞内活性化ドメインは、ＣＤ７９Ａ（別名Ｂ－細胞抗原受容体複合体関連タンパク質α鎖；ＣＤ７９ａ抗原（免疫グロブリン関連α）；ＭＢ－１膜糖タンパク質；Ｉｇ－α；膜結合免疫グロブリン関連タンパク質；表面ＩｇＭ関連タンパク質等）に由来する。即ち、適切な細胞内活性化ドメインは、以下の配列のうち少なくとも１０、１５、２０、又は全てのアミノ酸に対して、或いは、以下の何れかのアミノ酸配列に由来する約１００アミノ酸～約１１０アミノ酸（ａａ）、約１１０ａａ～約１１５ａａ、約１１５ａａ～約１２０ａａ、約１２０ａａ～約１３０ａａ、約１３０ａａ～約１４０ａａ、約１４０ａａ～約１５０ａａ、又は約１５０ａａ～約１６０ａａの連続した配列に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するドメインを含んでいてもよい。

式中ＩＴＡＭモチーフを太字下線で示す。

同様に、適切な細胞内活性化ドメインポリペプチドは、全長ＣＤ７９Ａアミノ酸配列のＩＴＡＭモチーフ含有部分を含んでいてもよい。即ち、適切な細胞内活性化ドメインは、以下の配列のうち少なくとも１０、１５、２０、又は全てのアミノ酸に対し、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するドメインを含んでいてもよい。

式中ＩＴＡＭモチーフを太字下線で示す。

ある例によれば、前記細胞内活性化ドメインは、ＤＡＰ１２（別名ＴＹＲＯＢＰ；ＴＹＲＯタンパク質チロシンキナーゼ結合タンパク質；ＫＡＲＡＰ；ＰＬＯＳＬ；ＤＮＡＸ－活性化タンパク質１２；ＫＡＲ関連タンパク質；ＴＹＲＯタンパク質チロシンキナーゼ結合タンパク質；キラー活性化受容体関連タンパク質；キラー活性化受容体関連タンパク質等）に由来する。例えば、適切な細胞内活性化ドメインは、以下の配列のうち少なくとも１０、１５、２０、又は全てのアミノ酸に対して、或いは、以下のアミノ酸配列の何れかに由来する約１００アミノ酸～約１１０アミノ酸（ａａ）、約１１０ａａ～約１１５ａａ、約１１５ａａ～約１２０ａａ、約１２０ａａ～約１３０ａａ、約１３０ａａ～約１４０ａａ、約１４０ａａ～約１５０ａａ、又は約１５０ａａ～約１６０ａａの連続した配列に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するドメインを含んでいてもよい（４アイソフォーム）。

式中ＩＴＡＭモチーフを太字下線で示す。

同様に、適切な細胞内活性化ドメインポリペプチドは、全長ＤＡＰ１２アミノ酸配列のＩＴＡＭモチーフ含有部分を含んでいてもよい。即ち、適切な細胞内活性化ドメインは、以下の配列のうち少なくとも１０、１５、２０、又は全てのアミノ酸に対し、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するドメインを含んでいてもよい。

式中ＩＴＡＭモチーフを太字下線で示す。

ある例によれば、前記細胞内活性化ドメインは、ＦＣＥＲｌＧ（別名ＦＣＲＧ；Ｆｃε受容体Ｉγ鎖；Ｆｃ受容体γ－鎖；ｆｃ－εＲＩ－γ；ｆｃＲγ；ｆｃｅＲＩγ；高親和性免疫グロブリンε受容体サブユニットγ；免疫グロブリンＥ受容体、高親和性、γ鎖等）に由来する。例えば、適切な細胞内活性化ドメインは、以下の配列のうち少なくとも１０、１５、２０、又は全てのアミノ酸に対して、或いは、以下のアミノ酸配列に由来する約５０アミノ酸～約６０アミノ酸（ａａ）、約６０ａａ～約７０ａａ、約７０ａａ～約８０ａａ、又は約８０ａａ～約８８ａａの連続した配列に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するドメインを含んでいてもよい。

式中ＩＴＡＭモチーフを太字下線で示す。

同様に、適切な細胞内活性化ドメインポリペプチドは、全長ＦＣＥＲ１Ｇアミノ酸配列のＩＴＡＭモチーフ含有部分を含んでいてもよい。即ち、適切な細胞内活性化ドメインは、以下の配列のうち少なくとも１０、１５、２０、又は全てのアミノ酸に対し、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するドメインを含んでいてもよい。

式中ＩＴＡＭモチーフを太字下線で示す。

本開示の改変シグナル伝達ポリペプチドにおける使用に適した細胞内活性化ドメインは、ＤＡＰ１０／ＣＤ２８型シグナル伝達鎖を含む。ＤＡＰ１０シグナル伝達鎖の例としては、以下のアミノ酸配列が挙げられる。

ある態様によれば、適切な細胞内活性化ドメインは、以下の配列のうち少なくとも１０、１５、２０、又は全てのアミノ酸に対し、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するドメインを含む。

ＣＤ２８シグナル伝達鎖の例としては、以下のアミノ酸配列が挙げられる。

ある態様によれば、適切な細胞内ドメインは、以下の配列のうち少なくとも１０、１５、２０、又は全てのアミノ酸に対し、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するドメインを含む。

本開示の改変シグナル伝達ポリペプチドにおける使用に適した細胞内活性化ドメインは、ＺＡＰ７０ポリペプチドを含む。例えば、適切な細胞内活性化ドメインは、以下の配列のうち少なくとも１０、１５、２０、又は全てのアミノ酸に対して、或いは、以下のアミノ酸配列に由来する約３００アミノ酸～約４００アミノ酸、約４００アミノ酸～約５００アミノ酸、又は約５００アミノ酸～６１９アミノ酸の連続した配列に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するドメインを含んでいてもよい。

リンパ増殖性要素
末梢Ｔリンパ球数は、細胞が継続的に追加されるにもかかわらず、成人期を通じて顕著に安定なレベルで維持される。これは、胸腺からの遊出と、抗原遭遇に対する増殖、更には抗原抹消後の抗原特異的エフェクターの除去に菌する細胞の消失による（Marrak, P. et al. 2000. Nat Immunol 1:107-111; Freitas, A.A. et al. 2000. Annu Rev Immunol 18:83-111）。末梢Ｔ細胞区画のサイズは、増殖及び生存の双方に影響を及ぼす多重の因子により調節される。しかし、リンパ球減少環境では、末梢Ｔ細胞区画のサイズを維持する「急性恒常性増殖」機序により、Ｔリンパ球は同種の抗原とは独立に***する。Ｔ細胞をインビトロで増幅し、リンパ球枯渇対象に導入する養子細胞治療では、対象又は患者におけるリンパ球減少の条件が確立されてきた。その結果、移送されたＴ細胞の生着及び抗腫瘍機能が増強される。しかし、免疫機能不全や死を含む重篤な副作用を引き起こす可能性があることから、対象の白血球枯渇は望ましくない。

研究の示すところによれば、白血球枯渇は、恒常性サイトカインにとって細胞の廃棄場として機能する内因性リンパ球を除去することにより、サイトカインを開放して養子導入細胞の生存及び増殖の誘導に向かわせる。一部のサイトカイン、例えばＩＬ－７及びＩＬ－１５等は、Ｔ細胞の抗原に依存しない増殖を媒介することが知られており、これにより非リンパ球減少環境の恒常性増殖を誘発する能力を有する。しかし、これらのサイトカイン及びその受容体は、恒常的にリンパ増殖性障害を防止する固有の制御機構を有する。

本開示にて提供される側面の多くは、リンパ増殖性要素又はそれをコードする核酸を、通常は改変シグナル伝達ポリペプチドの一部として含む。本開示の例示的な態様によれば、通常は前記静止Ｔ細胞及び／又は静止ＮＫ細胞を、前記リンパ増殖性要素を改変シグナル伝達ポリペプチドの一部としてコードするゲノムを有するレトロウイルスで形質導入することにより、リンパ増殖性要素を静止Ｔ細胞及び／又は静止ＮＫ細胞に導入する。前記リンパ増殖性要素が、サイトカインであってもよく、更なる例示的な態様によれば、サイトカイン受容体又はそのシグナル伝達ドメインを含む断片であって、ＳＴＡＴ３経路、ＳＴＡＴ４経路、又は更なる例示的な態様によれば、Ｊａｋ／ＳＴＡＴ５経路を活性化するものであってもよい。即ち、リンパ増殖性要素は、非限定的な例によれば、サイトカイン受容体又はそのシグナル伝達ドメインを含む活性断片、例えばインターロイキン受容体又はそのシグナル伝達ドメインを含む活性断片であって、ＳＴＡＴ５を活性化するものであってもよい。即ち、リンパ増殖性要素は、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞の増殖を誘導するポリペプチドである。例示的なリンパ増殖性要素は、ＳＴＡＴ５を活性化することにより、増殖を誘導する。即ち、斯かるリンパ増殖性要素の断片は、例示的な態様によればＳＴＡＴ５を活性化することにより、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞の増殖を誘導する能力を保持する。

本開示にて提示される方法及び組成物のあるものによれば、対象のリンパ枯渇を要することなく、リンパ増殖性要素を用いて、遺伝子操作Ｔ細胞の増殖又は増加をインビボで促進する。即ち、対象の静止Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞に通常は形質導入することにより、斯かるＴ細胞及び／又はＮＫ細胞にリンパ増殖性要素を挿入することを含む、本開示にて提供される方法の非限定的な例示的な態様は、前記方法の実施前、実施時、又は実施後に前記対象のリンパ球を枯渇させることなく、或いは、斯かる方法の実施前の対象からの採血前、採血中、及び／又は採血後に前記対象のリンパ球を枯渇させることなく、或いは、前記対象由来のＴ細胞又はＮＫ細胞のエクスビボでの遺伝子改変前、改変時、及び／又は改変後に前記対象のリンパ球を枯渇させることなく、或いは、前記遺伝子操作Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞の前記対象への再導入前、再導入時、及び／又は再導入後に前記対象のリンパ球を枯渇させることなく、実施されるものであってもよい。Ｔ細胞の増殖をインビボで促進する因子は、サイトカイン及びその受容体を含む。ここで受容体は通常、リガンド結合ドメイン及びシグナル伝達ドメインを含む。ある態様によれば、本開示に開示される方法及び組成物において使用される前記リンパ増殖性要素は、サイトカイン及び／又はサイトカイン受容体である。前記サイトカインがインターロイキンであってもよく、前記サイトカイン受容体がインターロイキン受容体であってもよい。前記リンパ増殖性要素が、サイトカインの機能断片、及び／又は、サイトカイン受容体の機能断片、例えばそのシグナル伝達ドメイン等であってもよい。ここで前記断片は、例えばＳＴＡＴ５を活性化することにより、Ｔ細胞の増殖を促進する能力を有する。

ある態様によれば、本開示の方法及び組成物におけるサイトカインリンパ増殖性要素は、以下のうち１又は２以上を含む。インターロイキン－７（ＩＬ－７）又はその受容体（ＩＬ－７Ｒ）、又はそのシグナル伝達ドメイン；インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）又はその受容体（ＩＬ－１２Ｒ）、又はそのシグナル伝達ドメイン；インターロイキン－２３（ＩＬ－２３）又はＩＬ－１２Ｒβ１及びＩＬ－２３Ｒからなるその受容体、又はそのシグナル伝達ドメイン；インターロイキン－２７（ＩＬ－２７）又はその受容体（ＩＬ－２７Ｒ）、又はそのシグナル伝達ドメイン；インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）又はその受容体（ＩＬ－１５Ｒ）、又はそのシグナル伝達ドメイン；インターロイキン－２１（ＩＬ－２１）又はその受容体（ＩＬ－２１Ｒ）、又はそのシグナル伝達ドメイン；又は形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）又はその受容体（ＴＧＦβＲ）又はそのシグナル伝達ドメイン；又はＴＧＦβデコイ受容体（ＴＧＦ－β顕性陰性受容体II（ＤＮＲII））。ある態様によれば、前記リンパ増殖性要素が、前記ＩＬ－１２Ｒ又はＴＧＦβデコイ受容体（ＴＧＦ－β顕性陰性受容体II（ＤＮＲII））である。

ＩＬ－７は前記ＩＬ－７受容体に結合する。この受容体は、ＩＬ－７Ｒα及び共通のγ鎖受容体からなるヘテロダイマーである。結合の結果、胸腺内でのＴ細胞成長及び末梢内での生存に重要なシグナルのカスケードが作動する。ＩＬ－７のＩＬ－７受容体への結合により、Ｊａｋ／ＳＴＡＴ５経路が活性化されることが知られている。

ＩＬ－１２は、ナイーブＴ細胞のＴｈ１細胞への分化に関与し（Hsieh CS et al. 1993. Science. 260(5107):547-9）Ｔ細胞刺激因子として知られている。ＩＬ－１２はＩＬ－１２受容体に結合する。この受容体は、ＩＬ－１２Ｒ－β１及びＩＬ－１２Ｒ－β２によって形成されるヘテロダイマー受容体である。IＬ１２はＳＴＡＴ４を活性化することによって作用するが、Ｔ細胞ではＳＴＡＴ５も同様に活性化することが知られている（Ahn, H., et al. 1998. J. Immun. 161:5893-5900）。ＩＬ－１２ファミリーは、サイトカインＩＬ－１２、ＩＬ－２３、及びＩＬ－２７からなる。ＩＬ－２３の受容体は、ＩＬ－１２Ｒ β１及びＩＬ－２３Ｒからなる。ＩＬ－２７は２つの独立の遺伝子、即ちEpstein-Barrウイルス誘導性遺伝子３（EBI3）及びＩＬ－２７p２８からなるヘテロダイマーサイトカインである。ＩＬ－２７はＩＬ－２７受容体と相互作用する。

ＩＬ－１５は、構造及び機能がＩＬ－２に類似するＴ及びＮＫ細胞刺激因子である。何れのサイトカインもＴ細胞の増殖を誘導する。また、これらに共通の機能は、両受容体とも前記ＩＬ－２／ＩＬ－１５Ｒβ及び共通のγ鎖を使用することによるものと考えられる。ＩＬ－１５のシグナル伝達経路は、ＩＬ－１５Ｒα受容体への結合から始まり、その後は細胞表面にＩＬ－１５Ｒβγｃ複合体を有する周囲の細胞への提示が行われる。結合により、ＩＬ－１５βサブユニットはＪａｎｕｓキナーゼ１（Ｊａｋ１）及びγｃサブユニットＪａｎｕｓキナーゼ３（Ｊａｋ３）を活性化する。これにより、ＳＴＡＴ３及びＳＴＡＴ５のリン酸化及び活性化が生じる。

ＩＬ－２１は、活性化ヒトＣＤ４^＋Ｔ細胞及びＮＫＴ細胞で発現され、ＩＬ－２１の発現は、Ｔヘルパー細胞のＴｈ２及びＴｈ１７サブセットにおいて上方調節される。ＩＬ－２１受容体（ＩＬ－２１Ｒ）は、Ｔ、Ｂ及びＮＫ細胞の表面で発現され、ＩＬ－２Ｒ又はＩＬ－１５等の他のＩ型サイトカインの受容体と構造上類似している。ＩＬ－２１Ｒは、ＩＬ－２１と結合するには、共通のγ鎖（γｃ）との二量体形成が必要である。ＩＬ－２１と結合する際、前記ＩＬ－２１受容体はＪａｋ／ＳＴＡＴ経路を通じて機能し、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、及びＳＴＡＴ５を活性化する。

ＴＧＦβデコイ受容体s（ＴＧＦ-β顕性陰性受容体II（ＤＮＲII））は、ＴＧＦβ結合の天然受容体と競合することにより、ＴＧＦβシグナル伝達を阻害する。ＴＧＦβ－ＤＮＲIIは、ＲIIの細胞外ＴＧＦβ結合ドメイン及び膜貫通ドメインを含むキナーゼ失活切断型のＲIIである。ＴＧＦβ－ＤＮＲIIはリガンドに結合するが、ＲＩをリン酸化及び活性化せず、それによりＳｍａｄリン酸化を減衰又は消失させることもない。

ＩＬ－７Ｒαの機能獲得変異は、Ｂ及びＴ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ及びＴ－ＡＬＬ）の対象において確認されている（Zenatti PP, et al. 2011. Nat Genet 43:932-939; Snochat, C. et al. 2011. J Exp Med 208:901-908; McElroy, C.A. et al. 2012. PNAS 109(7):2503-2508）。斯かる変異は、ＩＬ－７Ｒα ＴＭＤのＮ末端領域に挿入及び欠失を含み、前記配列の殆ど全てが余分なＣｙｓ残基とＳ１６５からＣ１６５への変異とを含んでいる。斯かるシステインの結果として、受容体の構成型活性化が生じる。Ｔ－ａｌｌ群の斯かる変異の一部は、ＪＡＫ１を活性化していた。これらの機能獲得型ＩＬ－７Ｒ変異体を、本開示にて提供される側面の何れかにおいて、リンパ増殖性要素として使用してもよい。

従って、ある態様によれば、前記リンパ増殖性要素が、変異型ＩＬ－７受容体である。他の態様によれば、変異型ＩＬ－７受容体が構成的に活性であり、前記サイトカインリガンドの不在下でＪＡＫ－ＳＴＡＴ５経路を活性化する。更に他の態様によれば、変異型ＩＬ－７受容体が、２３７～２５４の位置に、システイン残基を含む１～１０のアミノ酸の挿入を含み、これによりＳＴＡＴ５経路を構成的に活性化する能力が付与される。ある態様によれば、変異型ＩＬ－７受容体は、ＩＬ－７Ｒα－ｉｎｓＰＰＣＬ（配列番号８２で表される）である。

ある態様によれば、前記リンパ増殖性要素は、キメラサイトカイン受容体である。例としては、これらに制限されるものではないが、通常は対応する活性化された野生型サイトカイン受容体と同一のＳＴＡＴ経路、例えばＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、及び例示的な態様によれば、ＳＴＡＴ５等を構成的に活性化する、その受容体に繋留されたサイトカイン等が挙げられる。ある態様によれば、キメラサイトカイン受容体は、その同族受容体又はその断片にリンカーを介して繋留又は共有結合された、インターロイキン又はその断片である。ある態様によれば、キメラサイトカイン受容体は、ＩＬ－７Ｒαに繋留されたＩＬ－７である。他の態様によれば、キメラサイトカイン受容体は、ＩＬ－７Ｒαのドメイン、例えばＩＬ－７Ｒαの細胞外ドメイン及び／又は膜貫通ドメインに繋留されたＩＬ－７である。ある態様によれば、リンパ増殖性要素は、サイトカインに繋留されていないサイトカイン受容体であり、本開示にて提供される実際の例示的な態様によれば、リンパ増殖性要素は、サイトカインに繋留されていない構成的に活性なサイトカイン受容体である。これらのキメラＩＬ－７受容体は、通常は発現されるとＳＴＡＴ５を構成的に活性化する。

ある態様によれば、前記リンパ増殖性要素は、サイトカイン又はサイトカイン受容体ではなく、ＳＴＡＴ５経路を刺激するｍｉＲＮＡである。斯かるｍｉＲＮＡは、通常はＳＯＣＳ経路における負の調節因子を分解することにより、ＳＴＡＴ５の活性化を増強する。ある態様によれば、前記ｍｉＲＮＡは、増殖に影響を与えるタンパク質であり、例としては、これらに制限されるものではないが、ＡＢＣＧ１、ＳＯＣＳ１、ＴＧＦｂＲ２、ＳＭＡＤ２、ｃＣＢＬ、及びＰＤ１等が挙げられる。本開示に示す例示的な態様によれば、斯かるｍｉＲＮＡは、パッケージング細胞及び／又は組換レトロウイルスゲノムのイントロン内に存在するものであってもよく、その発現は通常、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞内で活性なプロモーターにより誘導される。理論に束縛されるものではないが、転写単位がイントロンを含むことで、発現の増強及び／又は転写産物の安定性に繋がると考えられる。それゆえ、レトロウイルスゲノムのイントロン内にｍｉＲＮＡを配置する能力は、レトロウイルス、例えばレンチウイルスゲノム等のサイズ制限の下で、最大の活性を得るという従来技術の課題を克服する利点を、本開示の教示に付与することになる。ある態様によれば、本開示にて提供される方法を用いて、各々ＡＢＣＧ１、ＳＯＣＳ１、ＴＧＦｂＲ２、ＳＭＡＤ２、ｃＣＢＬ、及びＰＤ１のうち１又は２以上をコードする核酸に結合する１又は２以上のｍｉＲＮＡを含む、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のｍｉＲＮＡ、例示的な態様によれば２～５、例えば４つのｍｉＲＮＡを、前記組換レトロウイルスゲノムに含有させ、標的細胞に対して、例えばＴ細胞及び／又はＮＫ細胞に対して送達することができる。実際に、本開示にて提供される１、２、３、又は４のｍｉＲＮＡを単一のイントロン、例えばＥＦ１ａイントロン内に入れて送達してもよい。

ＡＢＣＧ１は、胸腺細胞及び末梢リンパ球の増殖に対して負の制御を行う、ＡＴＰ結合カセットトランスポーターである（Armstrong et al. 2010. J Immunol 184(1):173-183）。

ＳＯＣＳ１は、サイトカインシグナル伝達の負の調節因子であるＳＯＣＳ（サイトカインシグナル伝達抑制因子）ファミリーであり、Ｊａｋ／Ｓｔａｔ経路、例えばＳＴＡＴ５等を抑制する。ＳＯＣＳ１は、ＪＡＢ（Ｊａｎｕｓキナーゼ結合タンパク質）、ＳＳＩ－１（Ｓｔａｔ誘導性Ｓｔａｔ阻害剤１）、及びＴＩＰ３（Ｔｅｃ相互作用タンパク質）とも呼ばれる。

ＴＧＦｂＲ２は、セリン／トレオニンタンパク質キナーゼファミリーの一員であり、ＴＧＦ-βに結合して、タンパク質をリン酸化する複合体を形成し、その後に核内に侵入して、増殖関連遺伝子の転写を調節する。

ＳＭＡＤ２は、形質転換成長因子（ＴＧＦ）－βのシグナルを媒介し、複数の細胞過程、例えば細胞増殖、アポトーシス、分化等を制御する。

ｃＣＢＬは、ＺＡＰ－７０の脱リン酸化及び不活性化により、ＴＣＲの内部移行を介して、ＴＣＲシグナル伝達を阻害するＥ３ユビキチンリガーゼである。

ＰＤ１（ＣＤ２７９）は、Ｔ細胞及びＰｒｏＢ細胞で発現される細胞表面受容体である。ＰＤ－１は、ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２という２つのリガンドに結合する。ＰＤ－１を通じたシグナル伝達は、細胞の活性化を阻害する機能を有する。

本開示に開示される方法及び組成物の一部によれば、前記リンパ増殖性要素の発現は、ある化合物のインビボ制御要素に対する結合によって誘導され、更には（本開示の別の個所で論じるように）斯かる結合に依存する場合もある。非限定的な態様では、この要素はリボスィッチである。ある態様によれば、前記リンパ増殖性要素は、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞で活性なプロモーターから発現される。本開示にて提供される方法及び組成物に関して、当業者であれば理解するように、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞内で活性な既知のプロモーターを用いて、第１の改変シグナル伝達ポリペプチド又は第２の改変シグナル伝達ポリペプチド、又はその構成成分を発現してもよい。例示的な態様によれば、斯かるプロモーターは、パッケージング細胞株、例えば本開示に示すパッケージング系では、活性を有さない。ある態様によれば、斯かるプロモーターは、ＥＦ１ａプロモーター又はマウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）プロモーターである（Jones et al., Human Gene Therapy (2009) 20: 630-40）。例示的な態様によれば、斯かるプロモーターは、Ｔ細胞特異的ＣＤ３ζプロモーターである。

ある態様によれば、前記リンパ増殖性要素は、微小環境に制限されている。例えば、前記リンパ増殖性要素は、異常条件と生理的条件とで、対応するサイトカインに対する結合が異なる変異型受容体であってもよい。例えば、通常の生理的環境よりも腫瘍環境下でより強くＩＬ７に結合するＩＬ－７Ｒを用いてもよい。

ある態様によれば、前記リンパ増殖性要素が、認識又は排出ドメインに連結されていてもよい。斯かる認識又は排出ドメインを本開示でより詳細に説明する。斯かる融合は、特に切断型又は他の変異型のリンパ増殖性要素を使用する場合に、レトロウイルスゲノムに必要とされるポリヌクレオチドが少なくて済むという利点を有する。斯かる利点は、より多くの機能的要素をコードする核酸をレトロウイルスゲノムに含められることに繋がるため、本開示にて提供される例示的な態様においては重要である。他の態様によれば、前記リンパ増殖性要素は、共刺激ドメイン及び／又は細胞内活性化ドメインに連結される。本開示に示すリンパ増殖性要素は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又は細胞内活性化ドメイン、或いはその共刺激ドメインではない。しかし、ある態様によれば、リンパ増殖性要素が、抗原特異的標的化領域（ＡＳＴＲ）に連結され、前記ＡＳＴＲの抗原に対する結合により活性化されてもよい。更に他の態様によれば、改変シグナル伝達ポリペプチドは、ＡＳＴＲ、細胞内活性化ドメイン（例えばＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン）、共刺激ドメイン、及びリンパ増殖性ドメインを含んでいてもよい。共刺激ドメイン、細胞内活性化ドメイン、ＡＳＴＲ、及び他のＣＡＲドメインに関する更なる詳細は、本開示の別の箇所で論じる。

本開示の例示的な態様によれば、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞生存要素が、静止Ｔ細胞及び／又は静止ＮＫ細胞に導入される。この導入は、通常は前記静止Ｔ細胞及び／又は静止ＮＫ細胞に対して、前記Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞生存要素を改変シグナル伝達ポリペプチドの一部としてコードするゲノムを有するレトロウイルスを形質導入することにより行う。ある態様によれば、リンパ増殖性要素が、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞生存要素でもある。上で論じたように、前記リンパ増殖性要素の一部は、増殖を促進するのみならず、細胞生存も促進する。ある態様によれば、前記Ｔ細胞及び／又はＮＫ生存モチーフは、リンパ増殖性要素ではない。例えば、前記Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞生存モチーフが、ＣＤ２８Ｔ細胞生存モチーフ又はＣＤ１３７細胞生存モチーフであってもよい。斯かるＴ細胞生存モチーフが、例えばｓｃＦＶ等のＡＳＴＲを含む改変シグナル伝達ポリペプチドに見いだされるものであってもよい。例示的な態様によれば、前記Ｔ細胞生存モチーフは、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン又はＣＤ２８膜貫通ドメインを介してｓｃＦｖに連結されたＣＤ２８Ｔ細胞生存モチーフ又はＣＤ１３７モチーフであってもよい。ある態様によれば、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含むポリペプチド配列を含む。ある態様によれば、前記ポリペプチド配列は、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインである。

調節ドメイン
調節ドメインは、前記改変シグナル伝達ポリペプチド内の前記細胞内活性化ドメインの作用を変更しうる。例えば、活性化ドメインの下流作用を促進又は阻害したり、応答の性質を変更したりする。本開示の改変シグナル伝達ポリペプチドにおける使用に適した調節ドメインには、共刺激ドメインが含まれる。前記改変シグナル伝達ポリペプチドに含有させるのに適したに適した調節ドメインは、約３０アミノ酸～約７０アミノ酸（ａａ）の長さを有していてもよい。例えば、調節ドメインは、約３０ａａ～約３５ａａ、約３５ａａ～約４０ａａ、約４０ａａ～約４５ａａ、約４５ａａ～約５０ａａ、約５０ａａ～約５５ａａ、約５５ａａ～約６０ａａ、約６０ａａ～約６５ａａ、又は約６５ａａ～約７０ａａの長さを有していてもよい。他の場合では、調節ドメインは、約７０ａａ～約１００ａａ、約１００ａａ～約２００ａａ、又は２００ａａ超の長さを有していてもよい。

共刺激ドメインは通常、活性化ドメインに対する応答の性質を強化及び／又は改変する。本開示の改変シグナル伝達ポリペプチドにおける使用に適した共刺激ドメインは、通常は受容体に由来するポリペプチドである。ある態様によれば、共刺激ドメインはホモ二量体を形成する。対象共刺激ドメインは、膜貫通タンパク質の細胞内部分であってもよい（即ち、前記共刺激ドメインは、膜貫通タンパク質に由来するものであってもよい）。適切な共刺激ポリペプチドの非限定的な例としては、これらに限定されるものではないが、４－ｌＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、Ｌｃｋ結合を欠失したＣＤ２８（ＩＣΔ）、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＢＴＬＡ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＧＩＴＲ、及びＨＶＥＭが挙げられる。例えば、本発明の一側面の共刺激ドメインは、４－ｌＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、Ｌｃｋ結合を欠失したＣＤ２８（ＩＣΔ）、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＢＴＬＡ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＧＩＴＲ、又はＨＶＥＭの共刺激ドメインに対して、少なくとも８０％、９０％、又は９５％の配列同一性を有していてもよい。例えば、本発明の一側面の共刺激ドメインは、適切な共刺激ポリペプチドの共刺激ドメインに対して、少なくとも８０％、９０％、又は９５％の配列同一性を有していてもよい。斯かる適切な共刺激ポリペプチドの非限定的な例としては、これらに限定されるものではないが、４－ｌＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、Ｌｃｋ結合を欠失したＣＤ２８（ＩＣΔ）、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＢＴＬＡ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＧＩＴＲ、及びＨＶＥＭが挙げられる。例えば、本発明の一側面の共刺激ドメインは、４－ｌＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、Ｌｃｋ結合を欠失したＣＤ２８（ＩＣΔ）、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＢＴＬＡ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＧＩＴＲ、又はＨＶＥＭの共刺激ドメインに対して、少なくとも８０％、９０％、又は９５％の配列同一性を有していてもよい。

改変シグナル伝達ポリペプチドへの内包に適した共刺激ドメインは、約３０アミノ酸～約７０アミノ酸（ａａ）の長さを有していてもよい。例えば、共刺激ドメインは、約３０ａａ～約３５ａａ、約３５ａａ～約４０ａａ、約４０ａａ～約４５ａａ、約４５ａａ～約５０ａａ、約５０ａａ～約５５ａａ、約５５ａａ～約６０ａａ、約６０ａａ～約６５ａａ、又は約６５ａａ～約７０ａａの長さを有していてもよい。他の場合では、前記共刺激ドメインは、約７０ａａ～約１００ａａ、約１００ａａ～約２００ａａ、又は２００ａａ超の長さを有していてもよい。

ある例によれば、前記共刺激ドメインは、膜貫通タンパク質ＣＤ１３７（別名ＴＮＦＲＳＦ９；ＣＤ１３７；４－ｌＢＢ；ＣＤｗｌ３７；ＩＬＡ；等）の細胞内部分に由来する。例えば、適切な共刺激ドメインは、以下のアミノ酸配列：ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号１）に由来する少なくとも１０、１５、２０、又は全てのアミノ酸に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するドメインを含んでいてもよい。これらの態様の一部によれば、前記共刺激ドメインの長さは、約３０ａａ～約３５ａａ、約３５ａａ～約４０ａａ、約４０ａａ～約４５ａａ、約４５ａａ～約５０ａａ、約５０ａａ～約５５ａａ、約５５ａａ～約６０ａａ、約６０ａａ～約６５ａａ、又は約６５ａａ～約７０ａａである。

ある例によれば、前記共刺激ドメインは、膜貫通タンパク質ＣＤ２８（別名Ｔｐ４４）の細胞内部分に由来する。例えば、適切な共刺激ドメインは、以下のアミノ酸配列：ＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳ（配列番号２）の少なくとも１０、１５、２０、又は全てのアミノ酸に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するドメインを含んでいてもよい。これらの態様の一部によれば、前記共刺激ドメインの長さは、約３０ａａ～約３５ａａ、約３５ａａ～約４０ａａ、約４０ａａ～約４５ａａ、約４５ａａ～約５０ａａ、約５０ａａ～約５５ａａ、約５５ａａ～約６０ａａ、約６０ａａ～約６５ａａ、又は約６５ａａ～約７０ａａである。

ある例によれば、前記共刺激ドメインは、膜貫通タンパク質Ｌｃｋ結合を欠失したＣＤ２８（ＩＣΔ）の細胞内部分に由来する。例えば、適切な共刺激ドメインは、以下のアミノ酸配列：ＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＡＹＡＡＡＲＤＦＡＡＹＲＳ（配列番号３）に由来する少なくとも１０、１５、２０、又は全てのアミノ酸に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するドメインを含んでいてもよい。これらの態様の一部によれば、前記共刺激ドメインの長さは、約３０ａａ～約３５ａａ、約３５ａａ～約４０ａａ、約４０ａａ～約４５ａａ、約４５ａａ～約５０ａａ、約５０ａａ～約５５ａａ、約５５ａａ～約６０ａａ、約６０ａａ～約６５ａａ、又は約６５ａａ～約７０ａａである。

ある例によれば、前記共刺激ドメインは、膜貫通タンパク質ＩＣＯＳ（別名ＡＩＬＩＭ、ＣＤ２７８、及びＣＶＩＤｌ）の細胞内部分に由来する。例えば、適切な共刺激ドメインは、以下のアミノ酸配列：ＴＫＫＫＹＳＳＳＶＨＤＰＮＧＥＹＭＦＭＲＡＶＮＴＡＫＫＳＲＬＴＤＶＴＬ（配列番号４）に由来する少なくとも１０、１５、２０、又は全てのアミノ酸に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するドメインを含んでいてもよい。これらの態様の一部によれば、前記共刺激ドメインの長さは、約３０ａａ～約３５ａａ、約３５ａａ～約４０ａａ、約４０ａａ～約４５ａａ、約４５ａａ～約５０ａａ、約５０ａａ～約５５ａａ、約５５ａａ～約６０ａａ、約６０ａａ～約６５ａａ、又は約６５ａａ～約７０ａａである。

ある例によれば、前記共刺激ドメインは、膜貫通タンパク質ＯＸ４０（別名ＴＮＦＲＳＦ４、ＲＰ５－９０２Ｐ８．３、ＡＣＴ３５、ＣＤ１３４、ＯＸ－４０、ＴＸＧＰｌＬ）の細胞内部分に由来する。例えば、適切な共刺激ドメインは、以下のアミノ酸配列：ＲＲＤＱＲＬＰＰＤＡＨＫＰＰＧＧＧＳＦＲＴＰＩＱＥＥＱＡＤＡＨＳＴＬＡＫＩ（配列番号５）に由来する少なくとも１０、１５、２０、又は全てのアミノ酸に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するドメインを含んでいてもよい。これらの態様の一部によれば、前記共刺激ドメインの長さは、約３０ａａ～約３５ａａ、約３５ａａ～約４０ａａ、約４０ａａ～約４５ａａ、約４５ａａ～約５０ａａ、約５０ａａ～約５５ａａ、約５５ａａ～約６０ａａ、約６０ａａ～約６５ａａ、又は約６５ａａ～約７０ａａである。

ある例によれば、前記共刺激ドメインは、膜貫通タンパク質ＣＤ２７（別名Ｓ１５２、Ｔ１４、ＴＮＦＲＳＦ７、及びＴｐ５５）の細胞内部分に由来する。例えば、適切な共刺激ドメインは、以下のアミノ酸配列：ＨＱＲＲＫＹＲＳＮＫＧＥＳＰＶＥＰＡＥＰＣＲＹＳＣＰＲＥＥＥＧＳＴＩＰＩＱＥＤＹＲＫＰＥＰＡＣＳＰ（配列番号６）に由来する少なくとも１０、１５、２０、又は全てのアミノ酸に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するドメインを含んでいてもよい。これらの態様の一部によれば、前記共刺激ドメインの長さは、約３０ａａ～約３５ａａ、約３５ａａ～約４０ａａ、約４０ａａ～約４５ａａ、約４５ａａ～約５０ａａである。

ある例によれば、前記共刺激ドメインは、膜貫通タンパク質ＢＴＬＡ（別名ＢＴＬＡｌ及びＣＤ２７２）の細胞内部分に由来する。例えば、適切な共刺激ドメインは、以下のアミノ酸配列：ＣＣＬＲＲＨＱＧＫＱＮＥＬＳＤＴＡＧＲＥＩＮＬＶＤＡＨＬＫＳＥＱＴＥＡＳＴＲＱＮＳＱＶＬＬＳＥＴＧＩＹＤＮＤＰＤＬＣＦＲＭＱＥＧＳＥＶＹＳＮＰＣＬＥＥＮＫＰＧＩＶＹＡＳＬＮＨＳＶＩＧＰＮＳＲＬＡＲＮＶＫＥＡＰＴＥＹＡＳＩＣＶＲＳ（配列番号７）に由来する少なくとも１０、１５、２０、又は全てのアミノ酸に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するドメインを含んでいてもよい。

ある例によれば、前記共刺激ドメインは、膜貫通タンパク質ＣＤ３０（別名ＴＮＦＲＳＦ８、ＤｌＳ１６６Ｅ、及びＫｉ－１）の細胞内部分に由来する。例えば、適切な共刺激ドメインは、以下のアミノ酸配列：ＲＲＡＣＲＫＲＩＲＱＫＬＨＬＣＹＰＶＱＴＳＱＰＫＬＥＬＶＤＳＲＰＲＲＳＳＴＱＬＲＳＧＡＳＶＴＥＰＶＡＥＥＲＧＬＭＳＱＰＬＭＥＴＣＨＳＶＧＡＡＹＬＥＳＬＰＬＱＤＡＳＰＡＧＧＰＳＳＰＲＤＬＰＥＰＲＶＳＴＥＨＴＮＮＫＩＥＫＩＹＩＭＫＡＤＴＶＩＶＧＴＶＫＡＥＬＰＥＧＲＧＬＡＧＰＡＥＰＥＬＥＥＥＬＥＡＤＨＴＰＨＹＰＥＱＥＴＥＰＰＬＧＳＣＳＤＶＭＬＳＶＥＥＥＧＫＥＤＰＬＰＴＡＡＳＧＫ（配列番号８）に由来する約１００アミノ酸～約１１０アミノ酸（ａａ）、約１１０ａａ～約１１５ａａ、約１１５ａａ～約１２０ａａ、約１２０ａａ～約１３０ａａ、約１３０ａａ～約１４０ａａ、約１４０ａａ～約１５０ａａ、約１５０ａａ～約１６０ａａ、又は約１６０ａａ～約１８５ａａに対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するドメインを含んでいてもよい。

ある例によれば、前記共刺激ドメインは、の細胞内部分に由来する膜貫通タンパク質ＧＩＴＲ（別名ＴＮＦＲＳＦ１８、ＲＰ５－９０２Ｐ８．２、ＡＩＴＲ、ＣＤ３５７、及びＧＩＴＲ－Ｄ）。例えば、適切な共刺激ドメインは、以下のアミノ酸配列：ＨＩＷＱＬＲＳＱＣＭＷＰＲＥＴＱＬＬＬＥＶＰＰＳＴＥＤＡＲＳＣＱＦＰＥＥＥＲＧＥＲＳＡＥＥＫＧＲＬＧＤＬＷＶ（配列番号９）に由来する少なくとも１０、１５、２０、又は全てのアミノ酸に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するドメインを含んでいてもよい。これらの態様の一部によれば、前記共刺激ドメインの長さは、約３０ａａ～約３５ａａ、約３５ａａ～約４０ａａ、約４０ａａ～約４５ａａ、約４５ａａ～約５０ａａ、約５０ａａ～約５５ａａ、約５５ａａ～約６０ａａ、約６０ａａ～約６５ａａ、又は約６５ａａ～約７０ａａである。

ある例によれば、前記共刺激ドメインは、膜貫通タンパク質ＨＶＥＭ（別名ＴＮＦＲＳＦ１４、ＲＰ３－３９５Ｍ２０．６、ＡＴＡＲ、ＣＤ２７０、ＨＶＥＡ、ＨＶＥＭ、ＬＩＧＨＴＲ、及びＴＲ２）の細胞内部分に由来する。例えば、適切な共刺激ドメインは、以下のアミノ酸配列：ＣＶＫＲＲＫＰＲＧＤＶＶＫＶＩＶＳＶＱＲＫＲＱＥＡＥＧＥＡＴＶＩＥＡＬＱＡＰＰＤＶＴＴＶＡＶＥＥＴＩＰＳＦＴＧＲＳＰＮＨ（配列番号１０）に由来する少なくとも１０、１５、２０、又は全てのアミノ酸に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するドメインを含んでいてもよい。これらの態様の一部によれば、前記第１及び第２のポリペプチドの共刺激ドメインの長さは、約３０ａａ～約３５ａａ、約３５ａａ～約４０ａａ、約４０ａａ～約４５ａａ、約４５ａａ～約５０ａａ、約５０ａａ～約５５ａａ、約５５ａａ～約６０ａａ、約６０ａａ～約６５ａａ、又は約６５ａａ～約７０ａａである。

リンカー
ある例によれば、前記改変シグナル伝達ポリペプチドは、２つの隣接するドメインの間にリンカーを含む。例えば、膜貫通ドメインと第１の共刺激ドメインとの間にリンカーが存在してもよい。他の例として、ＡＳＴＲが抗体であってもよく、リンカーが、その重鎖と軽鎖との間に存在してもよい。他の例として、前記ＡＳＴＲと膜貫通ドメインと共刺激ドメインとの間にリンカーが存在してもよい。他の例として、第２のポリペプチドの共刺激ドメインと細胞内活性化ドメインとの間にリンカーが存在してもよい。他の例として、ＡＳＴＲと細胞内シグナル伝達ドメインとの間にリンカーが存在してもよい。

リンカーペプチドは種々のアミノ酸配列を有していてもよい。タンパク質がスペーサペプチドにより連結されていてもよい。斯かるスペーサは通常、柔軟な性質を有するが、他の化学的結合も除外されるものではない。リンカーはペプチドでもよく、その長さは約１～約１００アミノ酸長、又は約１～約２５アミノ酸長であってもよい。これらのリンカーを、リンカーをコードする合成のオリゴヌクレオチドを用いて生成し、タンパク質を連結してもよい。ある程度の柔軟性を有するペプチドリンカーを使用してもよい。連結ペプチドは事実上任意のアミノ酸配列を有することができるが、ここで留意すべきは、適切なリンカーは、結果として概ね柔軟なペプチドに繋がるような配列を有するという点である。小型アミノ酸、例えばグリシンやアラニンを用いることで、柔軟なペプチドを製造することができる。斯かる配列の作成は、当業者であれば定型的な作業で行うことができる。

適切なリンカーは容易に選択可能であり、その長さは適切な範囲で種々任意の長さとすることができる。例えば、１アミノ酸（例えばＧｌｙ）～２０アミノ酸、２アミノ酸～１５アミノ酸、３アミノ酸～１２アミノ酸、例えば４アミノ酸～１０アミノ酸、５アミノ酸～９アミノ酸、６アミノ酸～８アミノ酸、又は７アミノ酸～８アミノ酸、例えば１、２、３、４、５、６、又は７アミノ酸とすることができる。

柔軟なリンカーの例としては、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン－セリンポリマー（例えば（ＧＳ）_ｎ、ＧＳＧＧＳ_ｎ、ＧＧＧＳ_ｎ、及びＧＧＧＧＳ_ｎ、ここでｎは１以上の整数である。）、グリシン－アラニンポリマー、アラニン－セリンポリマー、及び本技術分野で公知の他の柔軟なリンカー等が挙げられる。興味深いのはグリシン及びグリシン・セリンポリマーである。これらのアミノ酸は何れも比較的構造性が弱く、複数の構成成分間で中立なテザーとして機能しうるからである。特に興味深いのはグリシンポリマーである。グリシンはアラニンよりも更に容易にφ－ψ空間にアクセスできる上に、より長い側鎖を有する残基よりも制限が少ないからである（Scheraga, Rev. Computational Chem. 11173-142 (1992)参照）。柔軟なリンカーの例としては、これらに限定されるものではないが、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５３）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５４）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５５）、ＧＧＳＧ（配列番号５６）、ＧＧＳＧＧ（配列番号５７）、ＧＳＧＳＧ（配列番号５８）、ＧＳＧＧＧ（配列番号５９）、ＧＧＧＳＧ（配列番号６０）、ＧＳＳＳＧ（配列番号６１）等が挙げられる。通常の当業者であれば理解するように、上述の何れかの要素にコンジュゲートされたペプチドの構成は、全体又は部分的に柔軟なリンカーを含んでいてもよい。すなわち、リンカーは、柔軟なリンカーに加えて、柔軟性が劣る構造を有する１又は２以上の部分を含みうる。

キメラ抗原受容体
本発明の側面の一部によれば、改変シグナル伝達ポリペプチドは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＣＡＲをコードするポリヌクレオチドである（簡便のためキメラ抗原受容体を「ＣＡＲ」と呼ぶ）。ある態様によれば、本開示のＣＡＲは、：ａ）少なくとも１つの抗原特異的標的化領域（ＡＳＴＲ）；ｂ）膜貫通ドメイン、及びｃ）細胞内活性化ドメインを含む。例示的な態様によれば、ＣＡＲの抗原特異的標的化領域は、前記標的抗原に対する抗体のｓｃＦｖ部分である。

本開示のＣＡＲは、哺乳類細胞等の真核細胞の細胞膜に存在するものであってもよい。ここで、適切な哺乳類細胞としては、これらに限定されるものではないが、細胞毒性細胞、Ｔリンパ球、幹細胞、幹細胞の子孫、前駆細胞、前駆細胞の子孫、並びに、ＮＫ細胞、ＮＫ-Ｔ細胞、及びマクロファージが挙げられる。本開示のＣＡＲは、真核細胞の細胞膜に存在する場合、特定の条件下でＡＳＴＲに結合する１又は２以上の標的抗原の存在下で活性である。標的抗原は、特異結合対の第２の要素である。前記特異結合対の標的抗原は、例えば可溶性（例えば細胞に結合していない）因子；標的細胞等の細胞表面に存在する因子；固体表面に存在する因子；脂質二重膜に存在する因子；等であってもよい。ＡＳＴＲが抗体であり、特異結合対の第２の要素が抗原である場合、斯かる抗原は、例えば可溶性（例えば細胞に結合していない）抗原；標的細胞等の細胞表面に存在する抗原；固体表面に存在する抗原；脂質二重膜に存在する抗原；等であってもよい。

ある例によれば、本開示のＣＡＲは、真核細胞の細胞膜に存在すると共に、１又は２以上の標的抗原によって活性化されると、前記細胞の少なくとも１つの核酸の発現を増加させる。例えば、ある例によれば、本開示のＣＡＲは、真核細胞の細胞膜に存在すると共に、１又は２以上の標的抗原によって活性化されると、前記細胞の少なくとも１つの核酸の発現を、前記１又は２以上の標的抗原の不在下における前記核酸の転写レベルと比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、又は１０倍超増加させうる。

一例として、前記本開示のＣＡＲは、免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）含有細胞内シグナル伝達ポリペプチドを含んでいてもよい。

本開示のＣＡＲは、真核細胞の細胞膜に存在すると共に、１又は２以上の標的抗原によって活性化されると、ある例によれば、前記細胞による１又は２以上のサイトカインの産生を増加させる。例えば、本開示のＣＡＲは、真核細胞の細胞膜に存在すると共に、１又は２以上の標的抗原によって活性化されると、前記細胞による１又は２以上のサイトカインの産生を、前記１又は２以上の標的抗原の不在下で前記細胞により産生されるサイトカイン量と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、又は１０倍超増加させうる。産生量を増加させうるサイトカインとしては、これらに限定されるものではないが、インターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－ａ）、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１０；ケモカイン；成長因子；等が挙げられる。

ある例によれば、本開示のＣＡＲは、真核細胞の細胞膜に存在すると共に、１又は２以上の標的抗原によって活性化されると、前記細胞内の核酸の転写を増加させうると共に、前記細胞によるサイトカインの産生をも増加させうる。

ある例によれば、本開示のＣＡＲは、真核細胞の細胞膜に存在すると共に、１又は２以上の標的抗原によって活性化されると、前記ＣＡＲの前記第１のポリペプチドの前記抗原結合ドメインが結合する抗原を細胞表面に発現する標的細胞に対する前記細胞の細胞毒性活性を増加させる。例えば、前記真核細胞が細胞毒性細胞（例えばＮＫ細胞又は細胞毒性Ｔリンパ球等）である場合、本開示のＣＡＲは、前記細胞の細胞膜に存在すると共に、１又は２以上の標的抗原によって活性化される場合、１又は２以上の標的抗原を細胞表面に発現する標的細胞に対する前記細胞の細胞毒性活性を増加させる。例えば、前記真核細胞がＮＫ細胞又はＴリンパ球である場合、本開示のＣＡＲは、前記細胞の細胞膜に存在すると共に、１又は２以上の標的抗原によって活性化されると、前記細胞の細胞毒性活性を、前記１又は２以上の標的抗原の不在下における前記細胞の細胞毒性活性と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、又は１０倍以上増加させうる。

ある例によれば、本開示のＣＡＲは、真核細胞の細胞膜に存在すると共に、１又は２以上の標的抗原によって活性化されると、他のＣＡＲ活性化関連事象、例えば増殖や増加を引き起こしうる（何れも細胞***又は抗アポトーシス応答の増加による）。

ある例によれば、本開示のＣＡＲは、真核細胞の細胞膜に存在すると共に、１又は２以上の標的抗原によって活性化されると、他のＣＡＲ活性化関連事象、例えば細胞内シグナル伝達調節、細胞分化、又は細胞死等を引き起こしうる。

本開示のＣＡＲは、真核細胞膜内に、第１及び第２のポリペプチドが互いに共有結合で連結されていない状態で存在してもよい。本開示のＣＡＲは、真核細胞膜内に、膜内の他のポリペプチドと共有結合されていない状態で、単一のヘテロダイマーとして存在してもよい。或いは、第１の本開示のＣＡＲが、第２の本開示のＣＡＲと、共有結合又は非共有結合で連結されたヘテロダイマーとして、真核細胞膜内に存在してもよい。ある例によれば、前記第１及び第２のＣＡＲは、第１のＣＡＲの第１のポリペプチド及び第２のＣＡＲの第１のポリペプチドの双方の柄部に存在するシステイン環で形成されるジスルフィド結合を介して共有結合されていてもよい。

ある例によれば、本開示のＣＡＲが真核細胞膜内に存在し、ここで前記ＣＡＲの第１のポリペプチドが抗体断片を含み、前記ＣＡＲの第２のポリペプチドがサイトカイン受容体に由来するドメインを形質導入するシグナルを含んでいてもよい。これにより、二量体形成時に、前記ＣＡＲがヘテロダイマー化シグナル伝達抗体（signalobody）ＣＡＲ、例えば少なくとも２つの独立のポリペプチドからなるシグナル伝達抗体（signalobody）を構成することになる。ここで「シグナル伝達抗体」（signalobody）とは、本技術分野で公知のように、抗体断片とシグナル伝達サイトカイン受容体に由来するドメインとから構成される単一のキメラマクロ分子である。特定の例によれば、本開示のヘテロダイマー化シグナル伝達抗体（signalobody）ＣＡＲは、真核細胞の細胞膜に存在する場合、二量体化剤（dimerizer）により二量体を形成すると共に、オリゴマー化抗原等の抗原により活性化されて、ヘテロダイマー化シグナル伝達抗体（signalobody）ＣＡＲのオリゴマー化を誘導してもよい。斯かるヘテロダイマー化シグナル伝達抗体（signalobody）ＣＡＲのリガンド誘導性オリゴマー化は、シグナル伝達を活性化（例えば増加）又は長期化（例えば維持）しうる。例えば、ヘテロダイマー化シグナル伝達抗体（signalobody）ＣＡＲのリガンド誘導性オリゴマー化により、細胞応答を誘発するシグナルが発せられてもよい。ある例によれば、複数のヘテロダイマー化シグナル伝達抗体（signalobody）ＣＡＲを組み合わせて用いることで、所望の細胞応答を誘発することができる。

ある態様によれば、本開示のＣＡＲは、微小環境に制限されている。この特性は通常、前記ＣＡＲのＡＳＴＲドメインが微小環境に制限された性質を有する結果である。即ち、本開示のＣＡＲは、微小環境下では、通常の生理的環境条件下と比べて、１又は２以上の標的抗原に対する結合親和性が低められていてもよく、また、例示的な態様によれば、斯かる結合親和性が高められていてもよい。

配列の組換え
特定の例によれば、部位特異的組換え技術を用いることにより、改変シグナル伝達ポリペプチド（本開示では組換ポリペプチドという場合もある）の配列を、細胞内において再編成又は削除してもよい。ある態様によれば、特定の改変シグナル伝達ポリペプチドに対する細胞活性化関連応答を、部位特異的組換えにより改変してもよい。例えば、第１の活性化関連応答を誘発する改変シグナル伝達ポリペプチドの第１の細胞内活性化ドメインを、第２の活性化関連応答を誘発する第２の細胞内活性化ドメインと交換してもよい。当業者には明らかなように、細胞内において部位特異的組換えを用い、改変シグナル伝達ポリペプチドの任意のドメイン又は配列を、本開示に示す任意の他のドメイン又は配列と交換してもよい。これも当業者には明らかなように、部位特異的組換え技術を用いることにより、改変シグナル伝達ポリペプチドの任意のドメイン又は配列を、細胞内で削除してもよい。斯かる配列及びドメインの交換や切除は、本技術分野では公知である。例えば、Tone et al. (2013) Biotechnology and Bioengineering, 3219-3226に記載のシグナル伝達抗体（signalobody）のドメインスイッチングを参照。本文献の開示は援用により本開示に組み込まれる。インビボで部位特異的組換えを実施する際の機序及び必要条件も、本技術分野では公知である。例えば、Grindley et al. (2006) Annual Review of Biochemistry, 567-605及びTropp (2012) Molecular Biology (Jones & Bartlett Publishers, Sudbury, MA) を参照。これらの文献の開示は援用により本開示に組み込まれる。

ある態様によれば、前記改変シグナル伝達ポリペプチドは、上で論じた複数の異なるドメインの全てを連結し、融合タンパク質とすることにより生成される。前記改変シグナル伝達ポリペプチドは通常、本開示にて議論する前記改変シグナル伝達ポリペプチドの複数の異なるドメインをそれぞれコードするポリヌクレオチド配列を含む転写単位により生成される。ある態様によれば、標的細胞上の抗原を認識してこれに結合する機能を有する本発明のＡＳＴＲは、微小環境に制限されている。

本発明におけるＡＳＴＲとして、少なくともその標的抗原への結合ドメインに全部又は一部を使用するのに適した野生型又は天然のタンパク質は、タンパク質ライブラリーを生成し、斯かるライブラリーから前記標的抗原に対して所望の結合親和性を有するタンパク質をスクリーニングすることにより、見出すことができる。野生型タンパク質は、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより見出すことができる。ｃＤＮＡライブラリーは、宿主細胞の集団に挿入されたクローン化ｃＤＮＡ（相補性ＤＮＡ）断片の組み合わせであり、これらは組合せとして、生物のトランスクリプトームのある部分を構成する。ｃＤＮＡは完全に転写されたｍＲＮＡから製造されるため、生物において発現されているタンパク質のコーディング配列を含む。ｃＤＮＡライブラリーの情報は、前記ライブラリーから前記標的抗原に対して所望の結合親和性を有するタンパク質をスクリーニングすることにより、所望の特性を有するタンパク質を発見するための強力且つ有用なツールとなる。

組み合わせ
ある態様によれば、前記組換レトロウイルスにより提供されるポリヌクレオチドは、１又は２以上の改変シグナル伝達ポリペプチドの特定の組み合わせをコードする、１又は２以上の転写単位を有する。本開示にて提供される方法及び組成物の一部によれば、遺伝子操作Ｔ細胞は、前記組換レトロウイルスによるＴ細胞の形質導入後、１又は２以上の改変シグナル伝達ポリペプチドの組み合わせを有する。当然ながら、第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、第３のポリペプチド等の呼称は便宜上のものであり、「第１のポリペプチド」上の要素と「第２のポリペプチド」上の要素は、単に便宜上第１及び第２と呼ばれるにすぎない異なるポリペプチド上にあることを意味するに過ぎず、通常は更なる要素や工程がこれら個々のポリペプチドに加えられる。ある態様によれば、前記第１の改変シグナル伝達ポリペプチドは、抗原に結合する能力を有する細胞外抗原結合ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを含む。他の態様によれば、前記第１の改変シグナル伝達ポリペプチドは、更にＴ細胞生存モチーフ及び／又は膜貫通ドメインを含む。ある態様によれば、前記第１の改変シグナル伝達ポリペプチドは共刺激ドメインを含まないのに対し、他の態様では、前記第１の改変シグナル伝達ポリペプチドは共刺激ドメインを含む。

ある態様によれば、第２の改変シグナル伝達ポリペプチドは、リンパ増殖性遺伝子産物と、任意により細胞外抗原結合ドメインとを含む。ある態様によれば、前記第２の改変シグナル伝達ポリペプチドは、Ｔ細胞生存モチーフ、細胞内シグナル伝達ドメイン、及び１又は２以上の共刺激ドメインのうち、１又は２以上を含む。他の態様によれば、２つの改変シグナル伝達ポリペプチドを用いる場合、少なくとも1つはＣＡＲである。

一の態様によれば、前記１又は２以上の改変シグナル伝達ポリペプチドは、Ｔ細胞特異的プロモーター又は汎用プロモーターの下、同一の転写産物下で発現される。斯かる転写産物において、前記改変シグナル伝達ポリペプチドをコードする複数の核酸は、１又は２以上の内部リボゾーム性侵入部位（ＩＲＥ）又は１又は２以上のプロテアーゼ切断ペプチドをコードする核酸により隔てられてなる。

ある態様によれば、前記ポリヌクレオチドは、２つの改変シグナル伝達ポリペプチドをコードする。ここで前記第１の改変シグナル伝達ポリペプチドは、第１の抗原に結合する能力を有する第１の細胞外抗原結合ドメインと、第１の細胞内シグナル伝達ドメインとを含むが、共刺激ドメインは含まない。前記第２のポリペプチドは、ＶＥＧＦに結合する能力を有する第２の細胞外抗原結合ドメインと、第２の細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば共刺激分子のシグナル伝達ドメイン等とを含む。ある態様によれば、前記第１の抗原は、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、又はＢＣＭＡである。ある態様によれば、前記第１の細胞外抗原結合ドメインは、抗体又はその断片（例えばｓｃＦｖ等）、例えばＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、又はＢＣＭＡに特異的な抗体又はその断片を含む。ある態様によれば、ＶＥＧＦに結合する第２の細胞外抗原結合ドメインは、ＶＥＧＦの受容体、即ちＶＥＧＦＲである。ある態様によれば、ＶＥＧＦＲはＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、又はＶＥＧＦＲ３である。ある態様によれば、ＶＥＧＦＲはＶＥＧＦＲ２である。

ある態様によれば、前記ポリヌクレオチドは、２つの改変シグナル伝達ポリペプチドをコードし、ここで前記第１の改変シグナル伝達ポリペプチドは、細胞外腫瘍抗原結合ドメインとＣＤ３ζシグナル伝達ドメインとを含み、前記第２の改変シグナル伝達ポリペプチドは、抗原結合ドメイン（その抗原は血管新生又は脈管形成因子である）と、１又は２以上の共刺激分子シグナル伝達ドメインとを含む。ここでいう血管新生因子は、例えばＶＥＧＦであってもよい。前記１又は２以上の共刺激分子シグナル伝達モチーフは、例えばＣＤ２７、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、及び４－１ＢＢの各々に由来する共刺激シグナル伝達ドメインを含んでいてもよい。

ある態様によれば、前記ポリヌクレオチドは、２つの改変シグナル伝達ポリペプチドをコードし、ここで前記第１の改変シグナル伝達ポリペプチドは、細胞外腫瘍抗原結合ドメイン及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含み、前記第２のポリペプチドは、ＶＥＧＦに結合する能力を有する抗原結合ドメインと、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、及び４－１ＢＢの各々に由来する共刺激シグナル伝達ドメインを含む。更なる態様によれば、前記の第１のシグナル伝達ポリペプチド又は第２のシグナル伝達ポリペプチドが、更にＴ細胞生存モチーフを含む。ある態様によれば、前記Ｔ細胞生存モチーフは、ＩＬ－７受容体（ＩＬ－７Ｒ）の細胞内シグナル伝達ドメイン、ＩＬ－１２受容体の細胞内シグナル伝達ドメイン、ＩＬ－１５受容体の細胞内シグナル伝達ドメイン、ＩＬ－２１受容体の細胞内シグナル伝達ドメイン、又は、形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）受容体若しくはＴＧＦβ デコイ受容体（ＴＧＦ-β顕性陰性受容体II（ＤＮＲII））の細胞内シグナル伝達ドメインであり、或いはこれらのドメインに由来する。

ある態様によれば、前記ポリヌクレオチドは、２つの改変シグナル伝達ポリペプチドをコードし、ここで前記第１の改変シグナル伝達ポリペプチドは、細胞外腫瘍抗原結合ドメイン及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含み、前記第２の改変シグナル伝達ポリペプチドは、ＶＥＧＦに結合する能力を有する抗原結合ドメインと、ＩＬ－７受容体細胞内Ｔ細胞生存モチーフと、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、及び４－１ＢＢの各々に由来する共刺激シグナル伝達ドメインとを含む。

ある態様によれば、３つ以上のシグナル伝達ポリペプチドが前記ポリヌクレオチドによりコードされる。ある態様によれば、前記改変シグナル伝達ポリペプチドのただ一つのみが、腫瘍関連抗原又は腫瘍特異的抗原に結合する抗原結合ドメインを含む。残る前記改変シグナル伝達ポリペプチドは各々、腫瘍関連抗原又は腫瘍特異的抗原以外の抗原に結合する抗原結合ドメインを含む。他の態様によれば、前記改変シグナル伝達ポリペプチドのうち２つ以上が、１又は２以上の腫瘍関連抗原又は腫瘍特異的抗原に結合する抗原結合ドメインを含み、前記改変シグナル伝達ポリペプチドのうち少なくとも１つが、腫瘍関連抗原又は腫瘍特異的抗原に結合しない抗原結合ドメインを含む。

ある態様によれば、腫瘍関連抗原又は腫瘍特異的抗原は、Ｈｅｒ２、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、癌抗原－１２５（ＣＡ－１２５）、ＣＡ１９－９、カルレチニン、ＭＵＣ－１、上皮膜タンパク質（ＥＭＡ）、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ）、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ９９、ＣＤ１１７、クロモグラニン、サイトケラチン、デスミン、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、肉眼的嚢胞性疾患液性タンパク質（ＧＣＤＦＰ－１５）、ＨＭＢ－４５抗原、タンパク質メラン－Ａ（Ｔリンパ球によって認識されるメラノーマ抗原；ＭＡＲＴ－１）、ｍｙｏ－Ｄ１、筋肉特異的アクチン（ＭＳＡ）、神経フィラメント、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、胎盤アルカリ性ホスファターゼ、シナプトフィジン、チログロブリン、甲状腺転写因子－１、ピルビン酸キナーゼイソ酵素Ｍ２型の二量体形態（腫瘍Ｍ２－ＰＫ）、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ７０、ＧＤ２（ガングリオシドＧ２）、ＥｐｈＡ２、ＣＳＰＧ４、ＣＤ１３８、ＦＡＰ（線維芽細胞活性化タンパク質）、ＣＤ１７１、κ、λ、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、インテグリンανβ３（ＣＤ６１）、ガラクチン、Ｋ－Ｒａｓ（Ｖ－Ｋｉ－ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス発癌遺伝子）、Ｒａｌ－Ｂ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ１２３、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥｐＣＡＭ、胎児性ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ３、ＨＬＡ－Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ－Ａ１＋ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＩＬ－１１Ｒα、ＩＬ－１３Ｒα２、ルイス－Ｙ、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＲＡＭＥ、ＲＯＲ１、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、ＶＥＧＦＲ２、ＥＧＦＲｖIII（上皮成長因子変異体III）、***タンパク質１７（Sp17）、メソテリン、ＰＡＰ（前立腺酸ホスファターゼ）、プロステイン（prostein）、ＴＡＲＰ（Ｔ細胞受容体γ代替リーディングフレームタンパク質）、Ｔｒｐ－ｐ８、ＳＴＥＡＰ１（前立腺１の６回膜貫通上皮抗原）、異常rasタンパク質、又は異常p５３タンパク質である。

ある態様によれば、前記第１の改変シグナル伝達ポリペプチドは、第１の抗原に結合する第１の細胞外抗原結合ドメインと、第１の細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、第２の改変シグナル伝達ポリペプチドは、を含む第２の抗原に結合する第２の細胞外抗原結合ドメイン、又は前記第２の抗原に結合する受容体と、第２の細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、ここで前記第２の改変シグナル伝達ポリペプチドは、共刺激ドメインを含まない。ある態様によれば、前記第１の抗原結合ドメイン及び前記第２の抗原結合ドメインは独立に、受容体の抗原結合部分又は抗体の抗原結合部分である。ある態様によれば、前記第１の抗原結合ドメイン又は前記第２の抗原結合ドメインの一方又は両方が、ｓｃＦｖ抗体断片である。ある態様によれば、前記第１の改変シグナル伝達ポリペプチド及び／又は前記第２の改変シグナル伝達ポリペプチドが、更に膜貫通ドメインを含む。ある態様によれば、前記第１の改変シグナル伝達ポリペプチド又は前記第２の改変シグナル伝達ポリペプチドが、Ｔ細胞生存モチーフ、例えば本開示に記載のＴ細胞生存モチーフの何れかを含む。

他の態様によれば、前記第１の改変シグナル伝達ポリペプチドは、ＨＥＲ２に結合する第１の細胞外抗原結合ドメインを含み、前記第２の改変シグナル伝達ポリペプチドは、ＭＵＣ－１に結合する第２の細胞外抗原結合ドメインを含む。

他の態様によれば、前記第２の改変シグナル伝達ポリペプチドの第２の細胞外抗原結合ドメインは、インターロイキンに結合する。

他の態様によれば、前記第２の改変シグナル伝達ポリペプチドの第２の細胞外抗原結合ドメインは、損傷関連分子パターン分子（ＤＡＭＰ；別名アラーミン）に結合する。他の態様によれば、ＤＡＭＰは、ヒートショックタンパク質、クロマチン関連タンパク質高移動度群スクエア１（ＨＭＧＢ１）、Ｓ１００Ａ８（別名ＭＲＰ８、又はカルグラニュリンＡ）、Ｓ１００Ａ９（別名ＭＲＰ１４、又はカルグラニュリンＢ）、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）、デオキシリボ核酸、アデノシン三リン酸、尿酸、又はヘパリン硫酸である。

ある態様によれば、前記第２の抗原は、腫瘍細胞が提示する抗原に結合する抗体の抗原である。

ある態様によれば、前記第２の改変シグナル伝達ポリペプチドを介したシグナル伝達活性化は、抗原によるものではなく、低酸素症と関連する。ある態様によれば、低酸素症は、低酸素症誘導因子－１α（ＨＩＦ－１α）、ＨＩＦ－１β、ＨＩＦ－２α、ＨＩＦ－２β、ＨＩＦ－３α、又はＨＩＦ－３βの活性化によって誘導される。

ある態様によれば、前記１又は２以上の改変シグナル伝達ポリペプチドの発現は、本開示にてより詳細に説明ルウインビボ制御要素によって制御される。

追加の配列
ＣＡＲ等の改変シグナル伝達ポリペプチドは、１又は２以上の追加のポリペプチドドメインを含んでいてもよい。斯かるドメインとしては、これらに限定されるものではないが、シグナル配列；エピトープタグ；親和性ドメイン；及び検出可能なシグナルを生成するポリペプチド等が挙げられる。本開示にて提供される側面又は態様の何れかにおける追加のドメインの非限定的な例としては、以下に説明するようなシグナル配列、エピトープタグ、親和性ドメイン、又は検出可能なシグナルを生成するポリペプチドの何れかと、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するドメインが挙げられる。

対象ＣＡＲにおける、例えば対象ＣＡＲの第１のポリペプチドにおける使用に適したシグナル配列としては、例えば、任意の真核生物シグナル配列が挙げられる。これには、天然シグナル配列、合成（例えば人工）シグナル配列等が含まれる。ある態様によれば、斯かるシグナル配列は、ＣＤ８シグナル配列ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ（配列番号７４）であってもよい。

適切なエピトープタグとしては、これらに限定されるものではないが、ヘマグルチニン（ＨＡ；例えば、ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ；配列番号３７）；ＦＬＡＧ（例えばＤＹＫＤＤＤＤＫ；配列番号３８）；ｃ－ｍｙｃ（例えば、ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ；配列番号３９）等が挙げられる。

親和性ドメインとしては、同定や精製に有用な、例えば固体支持体に固定化された、結合パートナーと相互作用しうるペプチド配列が挙げられる。単一のアミノ酸（例えばヒスチジン）が多数連続してなる配列をコードするＤＮＡ配列を、発現されるタンパク質と連結すると、ニッケルセファロース等の樹脂カラムに対する高親和性結合により、組換タンパク質を一段階で精製することが可能となる。親和性ドメインの例としては、Ｈｉｓ５（ＨＨＨＨＨ；配列番号４０）、ＨｉｓＸ６（ＨＨＨＨＨＨ；配列番号４１）、ｃ－ｍｙｃ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ；配列番号３９）、Ｆｌａｇ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ；配列番号３８）、Ｓｔｒｅｐタグ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ；配列番号４２）、ヘマグルチニン、例えばＨＡタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ；配列番号３７）、ＧＳＴ、チオレドキシン、セルロース結合ドメイン、ＲＹＩＲＳ（配列番号４３）、Ｐｈｅ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－Ｔｈｒ（配列番号４４）、キチン結合ドメイン、Ｓ－ペプチド、Ｔ７ペプチド、ＳＨ２ドメイン、Ｃ末端ＲＮＡタグ、ＷＥＡＡＡＲＥＡＣＣＲＥＣＣＡＲＡ（配列番号４５）、金属結合ドメイン、例えば亜鉛結合ドメイン若しくはカルシウム結合ドメイン、例えばカルシウム結合タンパク質由来のもの、例えばカルモジュリン、トロポニンＣ、カルシニューリンＢ、ミオシン軽鎖、リカバリン、Ｓ－モデュリン（modulin）、ビジニン、ＶＩＬＩＰ、ニューロカルシン、ヒポカルシン、フリクエニン、カルトラクチン、カルパイン大型サブユニット、Ｓ１００タンパク質、パルブアルブミン、カルビンディンＤ９Ｋ、カルビンディンＤ２８Ｋ、及びカルレチニン、インテイン類、ビオチン、ストレプトアビジン、ＭｙｏＤ、Ｉｄ、ロイシンジッパー配列、及びマルトース結合タンパク質等が挙げられる。

適切な検出可能なシグナル産生タンパク質としては、例えば蛍光タンパク質；検出可能なシグナルを産物として生成する反応を触媒する酵素；等が挙げられる。

適切な蛍光タンパク質としては、これらに限定されるものではないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又はその変異体、ＧＦＰの青色蛍光変異体（ＢＦＰ）、ＧＦＰのシアン色蛍光変異体（ＣＦＰ）、ＧＦＰの黄色蛍光変異体（ＹＦＰ）、高感度ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、高感度ＣＦＰ（ＥＣＦＰ）、高感度ＹＦＰ（ＥＹＦＰ）、ＧＦＰＳ６５Ｔ、エメラルド、トパーズ（ＴＹＦＰ）、ヴィーナス、シトリン（citrine）、ｍシトリン、ＧＦＰｕｖ、不安定化ＥＧＦＰ（ｄＥＧＦＰ）、不安定化ＥＣＦＰ（ｄＥＣＦＰ）、不安定化ＥＹＦＰ（ｄＥＹＦＰ）、ｍＣＦＰｍ、セルレアン（Cerulean）、Ｔ－サファイア、ＣｙＰｅｔ、ＹＰｅｔ、ｍＫＯ、ＨｃＲｅｄ、ｔ－ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ－モノマー、Ｊ－Ｒｅｄ、ダイマー２、ｔ－ダイマー２（１２）、ｍＲＦＰｌ、ポシロポリン（pocilloporin）、ウミシイタケ（Renilla）ＧＦＰ、モンスターＧＦＰ、ｐａＧＦＰ、カエデ（Kaede）タンパク質、及びキンドリングタンパク質、フィコビリンタンパク質、及びフィコビリンタンパク質コンジュゲート、例えばＢ－フィコエリトリン、Ｒ－フィコエリトリン、及びアロフィコシアニン等が挙げられる。他の蛍光タンパク質の例としては、mHoneydew、mBanana、mOrange、dTomato、tdTomato、mTangerine、mStrawberry、mCherry、mGrapel、mRaspberry、mGrape2、mPlum（Shaner et al. (2005) Nat. Methods 2:905-909）等が挙げられる。花虫類（Anthozoan）種由来の種々の蛍光及び色素タンパク質、例えばMatz et al. (1999) Nature Biotechnol. 17:969-973に記載のものも使用に適している。

適切な酵素としては、これらに限定されるものではないが、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）、β－ガラクトシダーゼ（ＧＡＬ）、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、β－グルクロニダーゼ、インベルターゼ、キサンチンオキシダーゼ、ホタルルシフェラーゼ、グルコースオキシダーゼ（ＧＯ）等が挙げられる。

認識及び／又は排出ドメイン
本開示にて提供される組換レトロウイルスの何れかは、認識又は排出ドメインをコードする核酸を、本開示にて提供される改変シグナル伝達ポリペプチドの何れかをコードする核酸の一部として、或いは斯かる核酸とは別に、含んでいてもよい。即ち、本開示にて提供される改変シグナル伝達ポリペプチドの何れかは、認識又は排出ドメインを含んでいてもよい。例えば、本開示に示すＣＡＲの何れかは、認識又は排出ドメインを含んでいてもよい。更に、認識又は排出ドメインが、本開示に示すリンパ増殖性要素の何れかと一緒に発現されてもよく、更には斯かる増殖性要素の何れかと融合していてもよい。前記認識又は排出ドメインは、前記Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞では発現されるが、前記レトロウイルスでは発現されない。

ある態様によれば、前記認識又は排出ドメインは、単純ヘルペスウイルス由来酵素チミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）又は誘導型カスパーゼ９に由来するものであってもよい。ある態様によれば、前記認識又は排出ドメインは、改変された内因性細胞表面分子、例えば米国特許８，８０２,３７４号に開示のもの等を含んでいてもよい。斯かる改変された内因性細胞表面分子は、例えば任意の細胞表面関連受容体、リガンド、糖タンパク質、細胞接着分子、抗原、インテグリン、又は表面抗原分類（cluster of differentiation：ＣＤ）等が改変されたものであってもよい。ある態様によれば、斯かる改変された内因性細胞表面分子は、切断型チロシンキナーゼ受容体である。一側面によれば、斯かる切断型チロシンキナーゼ受容体は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーの一員（例えば、ＥｒｂＢ１、ＥＲＢＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４等）である。ある態様によれば、前記認識ドメインは、ＥＧＦＲメンバーの細胞外ドメインを認識する抗体によって認識されるポリペプチドであってもよい。ある態様によれば、前記認識ドメインは、例えばＥＧＦＲファミリーメンバーの少なくとも２０の連続するアミノ酸、又は、例えばＥＧＦＲファミリーメンバーの２０～５０の連続するアミノ酸であってもよい。ＥＧＦＲメンバーの細胞外ドメインを認識する抗体によって認識され、適切な条件下で当該抗体と結合するポリペプチドの例として、例えば配列番号７８のポリペプチドが挙げられる。斯かる細胞外ＥＧＦＲエピトープを、本開示ではｅＴａｇと呼ぶ場合もある。例示的な態様によれば、斯かるエピトープは、市販の抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体によって認識される。

上皮成長因子受容体、別名ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ１、及びＨＥＲ１は、細胞外リガンドの上皮成長因子ファミリーメンバーの細胞表面受容体である。特定の癌において、ＥＧＦＲ活性が変化することが示唆されてきた。ある態様によれば、ヒト上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を含むＥＧＦＲポリペプチドをコードする遺伝子は、膜遠位ＥＧＦ結合ドメイン及び細胞質シグナル伝達尾部を含むポリペプチドをコードする核酸配列を除去することで構築されるが、抗ＥＧＦＲ抗体によって認識される細胞外膜近位エピトープは維持する。好ましくは、前記抗体は、既知の市販の抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体、例えばセツキシマブ、マツズマブ、ネシツムマブ、又はパニツムマブ等である。

他の報告によれば、ビオチン化セツキシマブを抗ビオチンマイクロビーズと組み合わせて免疫磁気選択法に用いることで、レンチウイルスによりＥＧＦＲｔ含有コンストラクトを形質導入されたＴ細胞を、前記細胞調製物に対する観察可能な毒性を生じることなく、集団の僅か２％から、純度９０％以上まで首尾よく濃縮することができた。他の報告によれば、この不活性ＥＧＦＲ分子の構成型発現は、協調的に発現されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、ＣＤ１９Ｒによって誘導されるＴ細胞表現型又はエフェクター機能に影響を及ぼさない。更に、他の報告によれば、フローサイトメトリー分析を用いて、ＥＧＦＲをマウスにおけるＴ細胞生着のインビボでの追跡マーカーとして、首尾よく用いることができた。更に、ＥＧＦＲは、Erbitux^{（登録商標）}媒介型抗体依存細胞毒性（ＡＤＣＣ）経路を通じて、自殺遺伝子として作用しうることが示された。本開示の発明者等は、レンチウイルスベクターを用いて、ｅＴａｇをＰＢＭＣで発現させることに成功すると共に、セツキシマブに暴露されたＰＢＭＣによるｅＴａｇのインビトロでの発現が、ＰＢＭＣの有効な排出機序を提供することを見出した。即ち、ＥＧＦＲは、非免疫原性選択ツール、追跡マーカー、及び、免疫治療の可能性を有する形質導入Ｔ細胞の自殺遺伝子として使用することができる。また、ＥＧＦＲ核酸は、本技術分野で周知の手法によって検出しうる。

本開示にて提供されるある態様によれば、ＥＧＦＲは、ＣＡＲを含む単一のポリペプチドの一部として、或いは、リンパ増殖性要素を含む単一のポリペプチドの一部として発現される。ある態様によれば、ＥＧＦＲ認識ドメインをコードするアミノ酸配列は、前記キメラ抗原受容体をコードするアミノ酸配列と、切断シグナル及び／又はリボゾーム性スキップ配列によって隔てられていてもよい。前記リボゾーム性スキップ及び／又は切断シグナルは、本技術分野で公知の任意のリボゾーム性スキップ及び／又は切断シグナルであってもよい。理論に束縛されるものではないが、前記リボゾーム性スキップ配列は、例えばアミノ酸配列ＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号７７）を有する２Ａ－１であってもよい。理論に束縛されるものではないが、切断シグナル及びリボゾーム性スキップ配列の他の例としては、ＦＭＤＶ２Ａ（Ｆ２Ａ）；ウマ鼻炎Ａウイルス２Ａ（略称Ｅ２Ａ）；ブタテッショウウイルス－１２Ａ（Ｐ２Ａ）；及びThosea asignaウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）が挙げられる。ある態様によれば、前記認識ドメインをコードするポリヌクレオチド配列は、前記ＣＡＲ又はリンパ増殖性要素と同一の転写産物内に存在してもよいが、前記ＣＡＲ又はリンパ増殖性要素をコードするポリヌクレオチド配列からは、内部リボソーム侵入部位によって隔てられていてもよい。

他の態様によれば、本開示において実験的に例証されるように、認識ドメインが、リンパ増殖性要素に融合された融合ポリペプチドの一部として発現されてもよい。斯かるコンストラクトは、特に本開示にて提供される他の「スペース削減」要素と組み合わせることで、個別のポリペプチドを用いる場合と比較して、使用するＲＮＡゲノムのゲノムスペースが少なくて済むという利点を提供する。例示的な一態様によれば、本開示の実験で立証されるように、ｅＴａｇは、ＩＬ７Ｒ・変異体と融合された融合ポリペプチドとして発現される。

シュードタイピング要素
本開示にて提供される方法及び組成物の多くは、シュードタイピング要素を含む。異種エンベロープ糖タンパク質によるレトロウイルスのシュードタイピングは、通常はウイルスの指向性を改変し、宿主細胞の形質導入を促進する。本開示で使用する場合、シュードタイピング要素は、前記標的宿主細胞を同定してこれに結合する１又は２以上のポリペプチド（通常は糖タンパク質）を含む結合性ポリペプチドと、レトロウイルス及び標的宿主細胞膜の融合を媒介する１又は２以上の「融合性ポリペプチド」とを含むことにより、レトロウイルスゲノムの標的宿主細胞への侵入を可能とする。本開示にて提供されるある態様によれば、シュードタイピング要素はポリペプチド／タンパク質として、或いは斯かるポリペプチド／タンパク質をコードする核酸配列として提供される。

ある態様によれば、前記シュードタイピング要素は、ネコ内因性ウイルス（ＲＤ１１４）エンベロープタンパク質、オンコレトロウイルス両種指向性エンベロープタンパク質、オンコレトロウイルス同種志向性エンベロープタンパク質、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ－Ｇ）エンベロープタンパク質、及び／又は、パラミクソウイルス麻疹エンベロープタンパク質Ｈ及びＦである。

ある態様によれば、前記シュードタイピング要素は、異なるタンパク質に由来する結合性ポリペプチド及び融合性ポリペプチドを含む。例えば、本開示の方法及び組成物の組換レトロウイルスは、麻疹ウイルス（ＭＶ）の融合（Ｆ）及びヘマグルチニン（Ｈ）ポリペプチドを有する偽型である。非限定的な例として、ＭＶの臨床野生型株や、Edmonston株（ＭＶ－Ｅｄｍ）等のワクチン株、又はその断片等であってもよい。理論に束縛されるものではないが、ヘマグルチニン（Ｈ）及び融合（Ｆ）ポリペプチドは何れも、宿主細胞への侵入に関与していると考えられる。ここで、Ｈタンパク質はＭＶを標的細胞の受容体ＣＤ４６、ＳＬＡＭ、及びネクチン４に結合させ、Ｆポリペプチドは前記レトロウイルス及び宿主細胞膜の融合を媒介する。特に前記標的細胞がＴ細胞及び／又はＮＫ細胞である例示的な態様によれば、結合性ポリペプチドは麻疹ウイルスＨポリペプチドであり、融合性ポリペプチドは麻疹ウイルスＦポリペプチドである。

ある研究によれば、切断型Ｆ及びＨポリペプチドを有する偽型のレンチウイルス粒子は、力価及び形質導入効率が顕著に上昇していた（Funke et al. 2008. Molecular Therapy. 16(8):1427-1436; Frecha et al. 2008. Blood. 112(13):4843-4852）。特に、Ｆ細胞質の尾部３０残基が切断された変異体（通称ＭＶ（Ｅｄ）－ＦΔ３０（配列番号１０５））が、最も高い力価を有していた。Ｈ変異体の場合、１８又は１９残基を除去した（ＭＶ（Ｅｄ）－ＨΔ１８（配列番号１０６）又はＭＶ（Ｅｄ）－ＨΔ１９）場合に、最適な切断型が得られたが、２４残基を切断した変異体も、除去した残基をアラニンで置換したか否かにかかわらず（ＭＶ（Ｅｄ）－ＨΔ２４（配列番号２３５）及びＭＶ（Ｅｄ）－ＨΔ２４＋Ａ）、最適な力価を有していた。

これらの形質導入Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を標的とするものを含む態様によれば、本開示の方法及び組成物の組換レトロウイルスは、麻疹ウイルス融合（Ｆ）及びヘマグルチニン（Ｈ）ポリペプチドの変異又は改変型を有する偽型であり、例によれば、麻疹ウイルスＦ及びＨポリペプチドの細胞質ドメイン欠失変異体を有する偽型である。ある態様によれば、変異型Ｆ及びＨポリペプチドは、その細胞質部分が切断された、即ちアミノ酸残基（或いは、斯かるタンパク質をコードする対応する核酸分子のコーディング核酸）が除去された「切断型Ｈ」又は「切断型Ｆ」ポリペプチドである。「ＨΔＹ」及び「ＦΔＸ」は、それぞれ斯かる切断型Ｈ及びＦポリペプチドを指す。ここで「Ｙ」は、細胞質ドメインのアミノ末端から除去された１～３４残基を指し、「Ｘ」は、細胞質ドメインのカルボキシ末端から除去された１～３５残基を指す。更なる態様によれば、「切断型Ｆポリペプチド」は、ＦΔ２４又はＦΔ３０であり、及び／又は、「切断型Ｈタンパク質」は、ＨΔ１４、ＨΔ１５、ＨΔ１６、ＨΔ１７、ＨΔ１８、ＨΔ１９、ＨΔ２０、ＨΔ２１＋Ａ、ＨΔ２４、及びＨΔ２４＋４Ａからなる群より選択され、より好ましくはＨΔ１８又はＨΔ２４である。例示的な態様によれば、切断型ＦポリペプチドはＭＶ（Ｅｄ）－ＦΔ３０であり、切断型ＨポリペプチドはＭＶ（Ｅｄ）－ＨΔ１８である。

ある態様によれば、融合性ポリペプチドは、単一のポリペプチドとして発現される複数の要素を含む。ある態様によれば、前記の結合性ポリペプチドと融合性ポリペプチドとは、同一の転写産物から翻訳されるが、個別のリボソーム結合部位から翻訳される。他の態様によれば、前記の結合性ポリペプチド及び融合性ポリペプチドは、切断ペプチド部位（これは、理論に束縛されるものではないが、文献で共通に述べられているように、翻訳後に切断される）又はリボゾーム性スキップ配列によって隔てられている。ある態様によれば、前記の結合性ポリペプチド及び融合性ポリペプチドが、個別のリボソーム結合部位から翻訳される結果、結合性ポリペプチドと比べて融合性ポリペプチドの量の方が多くなる。ある態様によれば、融合性ポリペプチドの結合性ポリペプチドに対する比は、少なくとも２：１、少なくとも３：１、少なくとも４：１、少なくとも５：１、少なくとも６：１、少なくとも７：１、又は少なくとも８：１である。ある態様によれば、融合性ポリペプチドの結合性ポリペプチドに対する比は、下限が１．５：１、２：１、又は３：１であり、上限が３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１。９：１又は１０：１である範囲に含まれる。

活性化要素
本開示の方法及び組成物の側面の多くは、活性化要素、又は、活性化要素をコードする核酸を含む。Ｔレンチウイルス（ＬＶ）による静止Ｔ細胞の形質導入に伴う制限は、進入前及び進入後の一連の障壁及び細胞制限因子によるものと考えられる（Strebel et al 2009. BMC Medicine 7:48）。斯かる制限の一つは、エンベロープ偽型ＬＶ粒子には、潜在的な受容体を認識して細胞膜との融合を媒介する能力が欠けている、という点である。しかし、特定の条件下であれば、主にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ＣＤ３複合体及びＣＤ２８の共刺激に基づき（Korin & Zack. 1998. Journal of Virology. 72:3161-8, Maurice et al. 2002. Blood 99:2342-50）、更にはサイトカインへの暴露を介して（Cavalieri et al 2003）、静止Ｔ細胞のＨＩＶ－１系レンチウイルスベクターによる形質導入が可能である。

Ｔリンパ球等の免疫系細胞は、受容体又は受容体複合体を介し、特異的抗原を認識してこれと相互作用する。斯かる受容体又は受容体複合体は、抗原を認識し、又は抗原と相互作用することにより、その細胞を活性化して身体内の数を増加させる。斯かる受容体の例としては、抗原特異的Ｔリンパ球受容体複合体（ＴＣＲ／ＣＤ３）が挙げられる。前記Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、Ｔリンパ球の表面で発現される。その構成成分の一つであるＣＤ３は、リガンドによるＴＣＲ占有後の細胞内シグナル伝達に関与する。抗原ＣＤ３複合体（ＴＣＲ／ＣＤ３）のＴリンパ球受容体は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）タンパク質が提示した抗原性ペプチドを認識する。ＭＨＣ及びペプチドの複合体は、抗原提示細胞及び他のＴリンパ球標的の表面で発現される。ＴＣＲ／ＣＤ３複合体が刺激される結果、Ｔリンパ球が活性化され、惹いては抗原特異的免疫応答が引き起こされる。ＴＣＲ／ＣＤ３複合体は、免疫系のエフェクター機能及び調節において中心的な役割を担っている。

Ｔリンパ球が完全に活性となるには、第２の共刺激シグナルも必要である。斯かるシグナルがないと、Ｔリンパ球はＴＣＲに結合した抗原に反応せず、或いは反応不顕性となってしまう。斯かる共刺激シグナルは、例えばＴリンパ球タンパク質であるＣＤ２８によって提供され、これは抗原産生細胞のＣＤ８０及びＣＤ８６と相互作用する。別のＴリンパ球タンパク質であるＩＣＯＳ（誘導型共刺激因子）は、ＩＣＯＳリガンドに結合すると共刺激シグナルを発する。

Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ＣＤ３複合体の活性化及びＣＤ２８による共刺激は、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８で被覆された固体表面（ビーズ等）へのエクスビボでの暴露によっても生じる。本開示に開示される方法及び組成物のある態様によれば、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８で被覆された固体表面へのエクスビボでの暴露によって、静止Ｔ細胞が活性化される。

本開示にて提供される方法及び組成物の一部の例示的な態様によれば、ＣＤ３及び／又はＣＤ２８に結合する能力を有するポリペプチドは、本開示の組換レトロウイルスに開示される方法及び組成物の表面に、「活性化要素」として提示される。これも本発明の側面となる。ＣＤ３及び／又はＣＤ２８に結合するポリペプチドは、その静止Ｔ細胞を活性化する能力ゆえに「活性化要素」と呼ばれる。

ある態様によれば、前記活性化要素は、ＣＤ３に結合可能なポリペプチドである。ある態様によれば、前記ＣＤ３に結合可能なポリペプチドは、ＣＤ３に結合する能力を保持する抗ＣＤ３抗体又はその断片である。例示的な態様によれば、前記抗ＣＤ３抗体又はその断片は、単鎖抗ＣＤ３抗体であり、例えば、これらに制限されるものではないが、抗ＣＤ３ｓｃＦｖである。他の例示的な態様によれば、前記ＣＤ３に結合可能なポリペプチドは、抗ＣＤ３ｓｃＦｖＦｃである。

抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体及び抗体断片としては、多数のものが入手可能であり、本発明に使用することができる。例としては、これらに制限されるものではないが、ＵＣＨＴ１、ＯＫＴ－３、ＨＩＴ３Ａ、ＴＲＸ４、Ｘ３５－３、ＶＩＴ３、ＢＭＡ０３０（ＢＷ２６４／５６）、ＣＬＢ－Ｔ３／３、ＣＲＩＳ７、ＹＴＨ１２．５、Ｆ１１１４０９、ＣＬＢ－Ｔ３．４．２、ＴＲ－６６、ＷＴ３１、ＷＴ３２、ＳＰｖ－Ｔ３ｂ、１１Ｄ８、ＸＩＩＩ－１４１、ＸＩＩＩ４６、ＸＩＩＩ－８７、１２Ｆ６、Ｔ３／ＲＷ２～８Ｃ８、Ｔ３／ＲＷ２４Ｂ６、ＯＫＴ３Ｄ、Ｍ－Ｔ３０１、ＳＭＣ２、及びＦ１０１．０１等が挙げられる。

ある態様によれば、前記活性化要素は、ＣＤ２８に結合可能なポリペプチドである。ある態様によれば、前記ＣＤ２８に結合可能なポリペプチドは、ＣＤ２８に結合する能力を保持する抗ＣＤ２８抗体又はその断片である。他の態様によれば、前記ＣＤ２８に結合可能なポリペプチドは、ＣＤ８０、ＣＤ８６、又は、ＣＤ２８に結合してＡｋｔのＣＤ２８媒介活性化を誘導する能力を有するその機能断片、例えばＣＤ８０の外部断片である。例示的な態様によれば、前記抗ＣＤ２８抗体又はその断片は、単鎖抗ＣＤ２８抗体であり、例えば、これらに制限されるものではないが、抗ＣＤ２８ｓｃＦｖである。他の例示的な態様によれば、前記ＣＤ２８に結合可能なポリペプチドは、ＣＤ８０又はＣＤ８０断片、例えばＣＤ８０の外部断片である。

抗ＣＤ２８抗体は、本技術分野で公知であり、非限定的な例として、モノクローナル抗体９．３、ＩｇＧ２ａ抗体（Dr. Jeffery Ledbetter, Bristol Myers Squibb Corporation, Seattle, Wash.）、モノクローナル抗体ＫＯＬＴ－２、ＩｇＧ１抗体、１５Ｅ８、ＩｇＧ１抗体、２４８．２３．２、ＩｇＭ抗体、及びＥＸ５．３Ｄ１０、ＩｇＧ２ａ抗体等が挙げられる。

例示的な態様によれば、活性化要素は２つのポリペプチド、即ち、ＣＤ３に結合可能なポリペプチドとＣＤ２８に結合可能なポリペプチドとを含む。

ある態様によれば、前記ＣＤ３又はＣＤ２８に結合可能なポリペプチドは、抗体、単鎖モノクローナル抗体又は抗体断片、例えば単鎖抗体断片である。即ち、前記抗体断片は、例えば、単鎖断片可変領域（ｓｃＦｖ）、抗体の抗体結合（Ｆａｂ）断片、単鎖抗原結合断片（ｓｃＦａｂ）、システインを有さない単鎖抗原結合断片（ｓｃＦａｂΔＣ）、断片可変領域（Ｆｖ）、抗原に隣接するエピトープに特異的なコンストラクト（ＣＲＡｂ）、又は、単一ドメイン抗体（ＶＨ又はＶＬ）等であってもよい。

ある態様によれば、活性化要素は、異種シグナル配列及び／又は異種膜付着配列に融合される。これらの配列は何れも、活性化要素を膜に誘導する作用を有する。異種シグナル配列により、前記活性化要素は小胞体に標的化され、小胞体において、異種膜付着配列により１又は数個の脂肪酸が共有結合により付加される（別名翻訳後脂質修飾）。これにより、異種膜付着配列に融合された活性化要素は、細胞膜の脂質ラフトにアンカーされる。ある態様によれば、翻訳後脂質修飾は、ミリストイル化、パルミトイル化、又はＧＰＩアンカレッジを介して生じる。ミリストイル化は、炭素数１４の飽和脂肪酸であるミリスチン酸を、真核細胞又はウイルスのタンパク質のＮ末端グリシンに共有結合で連結する翻訳後タンパク質修飾である。パルミトイル化は、Ｃ１６のアシル鎖をタンパク質のシステイン残基に対して、また、頻度はより劣るもののセリン及びトレオニン残基に対して、共有結合により連結する翻訳後タンパク質修飾である。ＧＰＩアンカレッジは、翻訳後修飾の際に、グリコシルホスファチジルイノシトール又はＧＰＩを、タンパク質のＣ末端に付着させることを意味する。

ある態様によれば、異種膜付着配列は、ＧＰＩアンカー付着配列である。異種ＧＰＩアンカー付着配列は、任意の既知のＧＰＩ-アンカー化タンパク質に由来するものであってもよい（概説として、Ferguson MAJ, Kinoshita T, Hart GW. Glycosylphosphatidylinositol Anchors. In: Varki A, Cummings RD, Esko JD, et al., editors. Essentials of Glycobiology. 2nd edition. Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2009. Chapter 11）。ある態様によれば、異種ＧＰＩアンカー付着配列は、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ４８、ＣＤ５５（ＤＡＦ）、ＣＤ５９、ＣＤ８０、及びＣＤ８７に由来するＧＰＩアンカー付着配列である。ある態様によれば、異種ＧＰＩアンカー付着配列は、ＣＤ１６に由来する。例示的な態様によれば、異種ＧＰＩアンカー付着配列は、Ｆｃ受容体ＦｃγＲIIIｂ（ＣＤ１６ｂ）又は分解促進因子（ＤＡＦ）、他の既知の補体崩壊促進因子又はＣＤ５５に由来する。

ある態様によれば、活性化要素の一方又は両方が、前記活性化要素の発現を細胞膜に誘導する異種シグナル配列を含む。パッケージング細胞株で活性な任意のシグナル配列を使用することができる。ある態様によれば、シグナル配列はＤＡＦシグナル配列である。例示的な態様によれば、活性化要素は、ＤＡＦシグナル配列とはそのＮ末端で連結され、ＧＰＩアンカー付着配列とはそのＣ末端で連結される。

例示的な態様によれば、前記活性化要素は、ＣＤ１４に由来するＧＰＩアンカー付着配列と融合された抗ＣＤ３ｓｃＦｖＦｃと、ＣＤ１６ｂに由来するＧＰＩアンカー付着配列と融合されたＣＤ８０とを含み、何れも本開示にて提供される組換レトロウイルスの表面で発現される。ある態様によれば、抗ＣＤ３ｓｃＦｖＦｃは、ＤＡＦシグナル配列とはそのＮ末端で連結され、ＣＤ１４に由来するＧＰＩアンカー付着配列とはそのＣ末端で連結される。また、ＣＤ８０は、ＤＡＦシグナル配列とはそのＮ末端で連結され、ＣＤ１６ｂに由来するＧＰＩアンカー付着配列とはそのＣ末端で連結される。そして何れも、本開示にて提供される組換レトロウイルスの表面で発現される。ある態様によれば、ＤＡＦシグナル配列は、ＤＡＦタンパク質のアミノ酸残基１～３０を含む。

膜結合サイトカイン
本開示にて提供される方法及び組成物の側面の一部態様は、膜結合サイトカイン、又は、膜結合サイトカインをコードするポリヌクレオチドを含む。サイトカインは、常にではないが通常は、分泌タンパク質である。天然に分泌されるサイトカインは、膜結合型となるように改変された融合タンパク質であってもよい。本開示に示す方法及び組成物には、膜結合サイトカイン融合ポリペプチドが含まれ、これらも本発明の一側面となる。ある態様によれば、組換レトロウイルスはその表面に、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞に結合してその増殖及び／又は生存を促進する能力を有する、膜結合サイトカイン融合ポリペプチドを有する。膜結合性ポリペプチドは通常は、組換レトロウイルスの膜に組み込まれており、斯かる組換レトロウイルスによって細胞を形質導入すると、これらのレトロウイルス及び宿主細胞膜が融合する結果、前記ポリペプチドが前記形質導入細胞の膜に結合される。

ある態様によれば、前記サイトカイン融合ポリペプチドは、ＩＬ－７、ＩＬ－１５又はその活性断片を含む。前記膜結合サイトカイン融合ポリペプチドは、通常は異種シグナル配列及び／又は異種膜付着配列と融合されたサイトカインである。ある態様によれば、異種膜付着配列は、ＧＰＩアンカー付着配列である。異種ＧＰＩアンカー付着配列は、任意の既知のＧＰＩ-アンカー化タンパク質に由来するものであってもよい（概説として、Ferguson MAJ, Kinoshita T, Hart GW. Glycosylphosphatidylinositol Anchors. In: Varki A, Cummings RD, Esko JD, et al., editors. Essentials of Glycobiology. 2nd edition. Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2009. Chapter 11）。ある態様によれば、異種ＧＰＩアンカー付着配列は、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ４８、ＣＤ５５（ＤＡＦ）、ＣＤ５９、ＣＤ８０、及びＣＤ８７に由来するＧＰＩアンカー付着配列である。ある態様によれば、異種ＧＰＩアンカー付着配列は、ＣＤ１６に由来する。例示的な態様によれば、異種ＧＰＩアンカー付着配列は、Ｆｃ受容体ＦｃγＲIIIｂ（ＣＤ１６ｂ）に由来する。ある態様によれば、ＧＰＩアンカーは、ＤＡＦのＧＰＩアンカーである。

例示的な態様によれば、前記膜結合サイトカインは、サイトカインがＤＡＦに融合された融合ポリペプチドである。ＤＡＦは、パッケージング細胞から出芽したレトロウイルスの膜に組み込まれた脂質ラフトに集積することが知られている。従って、理論に束縛されるものではないが、ＤＡＦ融合タンパク質は、組換レトロウイルス膜の一部となるパッケージング細胞の膜の一部に対して、優先的に標的化される。

非限定的な例示の態様によれば、前記サイトカイン融合ポリペプチドは、ＤＡＦに融合されたＩＬ－７又はその活性断片である。非限定的な具体的例示態様によれば、融合サイトカインポリペプチドは、ＤＡＦシグナル配列（ＤＡＦの残基１～３１）、シグナル配列を欠くＩＬ－７、及び、ＤＡＦの残基３６～５２５をこの順に含む。

インビボ制御要素
リボスイッチ
本開示にて提供される方法及び組成物の一部は、１又は２以上のリボスイッチ、或いは、１又は２以上のリボスイッチを含むポリヌクレオチドを含む。これらも本開示の個別の側面を構成する。リボスイッチは、遺伝子発現を制御するための細菌に共通の特徴であり、生物学的機能のＲＮＡ制御を達成する手段である。リボスイッチは、ｍＲＮＡの５’－非翻訳領域等に存在するポリヌクレオチドであって、リボスイッチ活性を誘導または抑制する小分子リガンドの結合を通じて、遺伝子発現の調節制御を可能とする。通常は、リボスイッチは斯かる小分子リガンドの生成に関与する遺伝子産物を制御することにより、フィードバックループを構成する。リボスイッチは通常はシス的に作用するが、トランス作用を有するリボスイッチも同定されている。天然のリボスイッチは２つのドメインからなる。三次元折り畳みＲＮＡ構造を介してリガンドに結合するアプタマードメインと、リガンドの不在又は存在に基づいてリボスイッチの活性を誘導又は抑制する機能スイッチングドメインである。即ち、リボスイッチによって、２種類のリガンド感受性の立体構造が達成され、これらがそれぞれオン及びオフの状態を表すことになる（Garst et al., ２０１１）。機能スイッチングドメインは、内部リボソーム侵入部位、レトロウイルス遺伝子コンストラクトのｍＲＮＡ前駆体スプライスドナーアクセス可能性、翻訳、転写の終了、転写産物分解、ｍｉＲＮＡ発現、又はｓｈＲＮＡ発現を制御することにより、ポリヌクレオチドの発現に対して影響を及ぼす（Dambach and Winkler 2009）。アプタマードメイン及び機能スイッチングドメインをモジュラー要素として用いることにより、ランダムＲＮＡライブラリーのスクリーニングにより同定される天然アプタマー、変異／進化させた天然アプタマー、又は完全合成アプタマーとして、遺伝子発現を制御する合成ＲＮＡデバイスを構成することができる（McKeague et al 2016）。

プリンリボスイッチファミリーは、最大のファミリーの一つであり、５００を超える配列が見つかっている（Mandal et al 2003；米国特許公開第２００８／０２６９２５８号；及び国際公開第２００６０５５３５１号）。プリンリボスイッチは何れも、３つの保存された螺旋要素／幹構造（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３）の間にループ／連結要素（Ｊ１－２、Ｌ２、Ｊ２－３、Ｌ３、Ｊ３－１）が介在する、類似した構造を有する。リボスイッチのプリンファミリーのアプタマードメインは、天然でも、種々のプリン化合物、例えばアデニン、グアニン、アデノシン、グアノシン、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン（図５）等により、配列の多様性に応じて多様な親和性／調節性を有する（Kim et al. 2007）。

一側面によれば、本開示では、プロモーター及びリボスイッチに作動式に連結された標的ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを含む、標的ポリヌクレオチドの発現を制御するための単離ポリヌクレオチドが提供される。ここで、前記リボスイッチは、ａ．）ヌクレオシド類似体抗ウイルス薬に結合可能であると共に、グアニン又は２’－デオキシグアノシンへの結合が、前記ヌクレオシド類似体抗ウイルス薬への結合と比較して制限されてなるアプタマードメインと、b.）前記標的ポリヌクレオチドの発現を制御することが可能な機能スイッチングドメインとを含み、ここで前記ヌクレオシド類似体に前記アプタマードメインが結合すると、前記機能スイッチングドメインの発現制御活性が誘導又は抑制されることにより、前記標的遺伝子の発現が制御される。ある態様によれば、前記標的ポリヌクレオチドは、ポリペプチドエンコーディング領域、ｍｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡであってもよい。非限定的な例によれば、前記リボスイッチは、インビボ活性を有する（例えば疾患の治療に有効な）ポリペプチドをコードする核酸、ｍｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡに、作動式に連結されてなる。例えば、斯かる非限定的な例によれば、前記リボスイッチは、キメラ抗原受容体をコードする核酸に、作動式に連結されてなる。本開示にて提供される非限定的な例によれば、前記標的ポリヌクレオチドは、本開示の種々の他の側面に含まれる１又は２以上の改変シグナル伝達ポリペプチドをコードする。これらの非限定的な例によれば、前記のリボスイッチ及び１又は２以上の改変シグナル伝達ポリペプチドをコードする標的ポリヌクレオチドは、パッケージング細胞、組換レトロウイルス、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞のゲノムに見出されるものであってもよい。

ある態様によれば、前記アプタマードメインの長さは、例えば下限が３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、及び７０ヌクレオチド、上限が３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、及び１００ヌクレオチドの範囲、例えば４５～８０ヌクレオチド長さ、４５～６０ヌクレオチド長、又は４５～５８ヌクレオチド長であってもよい。例示的な態様によれば、前記ヌクレオシド類似体抗ウイルス薬は、医薬リガンドであるアシクロビル（別名アシクログアノシン）又はペンシクロビルである（図５）。ある態様によれば、前記アプタマードメインは、前記ヌクレオシド類似体抗ウイルス薬に対する結合親和性が、ヌクレオシド又はヌクレオチドに対する結合親和性と比較して、例えば少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００倍であってもよい。

前記インビボ制御要素は、インビボにおいて、形質導入Ｔ細胞の増加を促進する。ある態様によれば、増加は制御要素の存在に依存する。しかし、他の態様によれば、形質導入Ｔ細胞の増加が、少なくとも部分的に他の因子により誘導されてもよい。斯かる他の因子としては、例えば前記対象におけるインターロイキンの存在や、組換Ｔ細胞のＣＡＲのＡＳＴＲがそのリガンドに結合すること等が挙げられる。

ある態様によれば、血液からのＰＢＬの単離前、単離中、及び／又は、単離後に、且つ、ヌクレオシド類似体抗ウイルス薬に結合し、１又は２以上の標的ポリヌクレオチドの発現を制御するインビボ制御要素（非限定的な例としてはリボスイッチが挙げられる）を含む組換レトロウイルスにＴ細胞及び／又はＮＫ細胞を接触させる前に、ヌクレオシド類似体抗ウイルス薬、例えばアシクロビル又はペンシクロビル等が対象に投与される。１又は２以上のポリペプチドをコードしうる１又は２以上の標的ポリヌクレオチドは、非限定的な例によれば、１又は２以上の改変シグナル伝達ポリペプチドであり、その少なくとも１つが、リンパ増殖性要素をコードする。ある態様によれば、前記ヌクレオシド類似体抗ウイルス薬、例えばアシクロビル又はペンシクロビル等は、血液からのＰＢＬの単離、又は、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞の組換レトロウイルスとの接触に先立ち、下限が５、１０、１５、３０、及び６０分間、及び、上限が１．５、２、３、４、５、６、８、１２、２４、４８、又は７２時間の範囲内の時間だけ早く、前記対象に投与される。ある態様によれば、前記ヌクレオシド類似体抗ウイルス薬、例えばアシクロビル又はペンシクロビル等は、血液からのＰＢＬの単離後、又は、本開示にて提供される方法によるＴ細胞及び／又はＮＫ細胞の組換レトロウイルスとの接触後、下限が１．５、２、３、４、５、６、８、１２、又は２４時間、上限が１／２、１、２、３、４、５、６、７、１０、１４、２１、又は２８日間の範囲内の時間だけ遅く、前記対象に投与される。ある態様によれば、前記ヌクレオシド類似体抗ウイルス薬、例えばアシクロビル又はペンシクロビル等は、血液からのＰＢＬの単離後、又は、本開示にて提供される方法によるＴ細胞及び／又はＮＫ細胞の組換レトロウイルスとの接触後、少なくとも１．５、２、３、４、５、６、８、１２、又は２４時間、又は少なくとも２、３、４、５、６、７、１０、１４、２１、又は２８日間だけ遅く、前記対象に投与される。ある態様によれば、前記ヌクレオシド類似体抗ウイルス薬、例えばアシクロビル又はペンシクロビル等は、ＰＢＬの前記対象への再注入後、少なくとも１、２、３、４、５、７、１０、１４、２１、２８、３０、６０、９０、又は１２０日間、又は５、６、９、１２、２４、３６、４８、６０、７２、８４、９６、１２０ヶ月だけ遅れて、又は無期限に遅れて、前記対象に投与される。本発明に開示される態様の何れかによれば、前記ヌクレオシド類似体抗ウイルス薬は、ＰＢＬの再点滴前及び／又は再点滴中及び／又は再点滴に投与してもよい。ある態様によれば、前記ヌクレオシド類似体抗ウイルス薬は、前記標的ポリヌクレオチドが関連する疾患の症状を対象が示さなくなるまで、或いは斯かる疾患に罹患しなくなるまで、対象に投与される。

ある態様によれば、前記アプタマードメインは、アシクロビル或いは他の抗ウイルス剤よりも、ペンシクロビルに対して優先的に結合してもよい。これにより、リボスイッチに影響を及ぼすことなく、同時に抗ウイルス治療を用いることが可能となる。ある態様によれば、前記アプタマードメインのペンシクロビルに対する結合親和性は、前記アプタマードメインのアシクロビル又は他の抗ウイルス剤に対する結合と比較して、例えば少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００倍超であってもよい。ある態様によれば、前記アプタマードメインは、ペンシクロビル或いは他の抗ウイルス剤よりも、アシクロビルに対して優先的に結合してもよい。これにより、リボスイッチに影響を及ぼすことなく、同時に抗ウイルス治療を用いることが可能となる。ある態様によれば、前記アプタマードメインのアシクロビルに対する結合親和性は、前記アプタマードメインのペンシクロビル又は他の抗ウイルス剤に対する結合と比較して、例えば少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００倍超であってもよい。ある態様によれば、ペンシクロビル（ファムシクロビル）及びアシクロビル（バラシクロビル）の経口プロドラッグを、対象に投与してもよい。

ある態様によれば、単離ポリヌクレオチドのアプタマードメインは、配列番号８７～９３の何れかの配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有し、或いは配列が同一であると共に、前記ヌクレオシド類似体抗ウイルス薬への結合と比較して、アシクロビルへの結合能力を維持すると共に、グアニン又は２’－デオキシグアノシンへの結合能力が低減されてなる。ここで前記アプタマードメインが、アシクロビルと結合すると前記機能スイッチングドメインの発現制御活性を誘発又は抑制する能力を保持する。ある態様によれば、単離ポリヌクレオチドのアプタマードメインは、配列番号９４～１００のアプタマードメインに対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有し、或いは配列が同一であると共に、前記ヌクレオシド類似体抗ウイルス薬への結合と比較して、ペンシクロビルへの結合能力を維持すると共に、グアニン又は２’－デオキシグアノシンへの結合能力が低減されてなる。ここで前記アプタマードメインが、ペンシクロビルと結合すると前記機能スイッチングドメインの発現制御活性を誘発又は抑制する能力を保持する。ある態様によれば、単離ポリヌクレオチドの一部領域又はリボスイッチの一部領域が、配列番号８７～１００の何れかの配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有し、或いは配列が同一である。

ある態様によれば、単離ポリヌクレオチドのアプタマードメインの一部領域を含むＤＮＡ配列は、配列番号１０８～２２１の何れかの配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有し、或いは配列が同一である。ある態様によれば、単離ポリヌクレオチドの一領域は、配列番号１０８～２２１の何れかの配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有し、或いは配列が同一である。

ある態様によれば、単離ポリヌクレオチドのアプタマードメインの一部領域を含むＤＮＡ配列は、配列番号１０８に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９１．８４％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有し、或いは配列が同一である。ある態様によれば、単離ポリヌクレオチドのアプタマードメインの一部領域を含むＤＮＡ配列は、配列番号１４７に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．８３％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有し、或いは配列が同一である。ある態様によれば、単離ポリヌクレオチドのアプタマードメインの一部領域を含むＤＮＡ配列は、配列番号１６４に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９３．８８％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有し、或いは配列が同一である。ある態様によれば、単離ポリヌクレオチドのアプタマードメインの一部領域を含むＤＮＡ配列は、配列番号１８３に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．８３％９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有し、或いは配列が同一である。ある態様によれば、単離ポリヌクレオチドのアプタマードメインの一部領域を含むＤＮＡ配列は、配列番号１９８に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９１．８４％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．８３％９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有し、或いは配列が同一である。

ある態様によれば、単離ポリヌクレオチドの一部領域は、配列番号２２２～２２６の何れかのコンセンサス配列を含んでいてもよい。ある態様によれば、単離ポリヌクレオチドの一部領域は、配列番号２２２～２２６の何れかの配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．８３％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有し、或いは配列が同一である。

本発明に開示される態様の何れかによれば、前記単離ポリヌクレオチドは、アシクロビル及び／又はペンシクロビルへの結合能力を保持する。本発明に開示される態様の何れかによれば、単離ポリヌクレオチドが、配列番号８７～１００又は配列番号１０８～２２１の何れかの配列の逆相補的配列であってもよい。本発明に開示される態様の何れかによれば、単離ポリヌクレオチドが、配列番号１０８～２２１のＤＮＡ配列又は配列番号１０８～２２１に対して相補的なＤＮＡ配列の転写産物又はＲＮＡ型であってもよい。本発明に開示される態様の何れかによれば、単離ポリヌクレオチドが、配列番号８７～１００の何れかのＲＮＡ配列の逆転写産物又はＤＮＡ型、又は、配列番号８７～１００の何れかのＲＮＡ配列の逆転写物に対して相補的なＤＮＡ鎖であってもよい。

本開示にて提供されるある態様によれば、リボスイッチ骨格を変異解析又は分子進化に用いてもよい。変異解析又は分子進化用に選択されるリボスイッチは、例えば細菌等の任意の既知の生物に由来するものであってもよい。ある態様によれば、メソプラズマ・フローラム（Mesoplasma florum）由来のＩ－Ａ型デオキシグアノシンリボスイッチを、分子進化に用いてもよい。ある態様によれば、誘導されたアプタマードメインが、メソプラズマ・フローラム（Mesoplasma florum）のＩ－Ａ型デオキシグアノシンリボスイッチ由来のアプタマードメイン（配列番号２３７）に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列同一性を有していてもよい。他の態様によれば、枯草菌（Bacillus subtilis）由来のｘｐｔリボスイッチを用いてもよい。ある態様によれば、誘導されたアプタマードメインが、枯草菌（Bacillus subtilis）のｘｐｔリボスイッチ由来のアプタマードメイン（配列番号２４３）に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列同一性を有していてもよい。

アプタマードメインをモジュラー要素として用い、ＲＮＡ転写産物に影響を与える機能スイッチングドメインと組み合わせてもよい。本発明に開示される態様の何れかによれば、前記リボスイッチは、内部リボゾーム性侵入部位（ＩＲＥＳ）、ｍＲＮＡ前駆体スプライスドナーアクセス可能性、翻訳、転写の終了、転写産物分解、ｍｉＲＮＡ発現、又はｓｈＲＮＡ発現のうち何れかの活性を制御することにより、ＲＮＡ転写産物に影響を及ぼすことができる。ある態様によれば、機能スイッチングドメインは、抗ＩＲＥＳのＩＲＥＳに対する結合を制御することができる（例えばOgawa, RNA (2011), 17:478-488参照。本文献の開示はその全体が引用により本開示に組み込まれる）。本発明に開示される態様の何れかによれば、小分子リガンドの存在又は不在により、リボスイッチのＲＮＡ転写産物に対する作用が引き起こされてもよい。ある態様によれば、前記リボスイッチが、リボザイムを含んでいてもよい。リボザイムを有するリボスイッチは、小分子リガンドの存在下で、標的ポリヌクレオチドの転写産物分解を抑制又は促進することができる。ある態様によれば、前記リボザイムは、ピストル型リボザイム、ハンマーヘッド型リボザイム、捻れ型リボザイム、ハチェット型リボザイム、又はＨＤＶ（デルタ肝炎ウイルス）リボザイムであってもよい。

本発明に開示される態様の何れかによれば、前記リボスイッチの標的ポリヌクレオチドに対する相対位置は、一般的なリボスイッチについて周知のように、種々の任意の位置で。ある態様によれば、前記リボスイッチは、ｍＲＮＡ前駆体スプライスドナーアクセス可能性を制御可能であり、前記標的ポリヌクレオチドの前に位置する。ある態様によれば、前記リボスイッチは、ポリ（Ａ）尾部の含有を制御可能であり、前記標的ポリヌクレオチドの後に位置する。ある態様によれば、前記リボスイッチは、抗ＩＲＥＳを制御可能であり、ＩＲＥＳの上流に位置する。非限定的な例示の態様によれば、本開示にて提供されるリボスイッチが、本開示にて提供される１又は２以上の改変シグナル伝達ポリペプチドをコードする核酸に対して、任意の位置に存在していてもよい。

ある態様によれば、前記リボスイッチが、３７．５℃、３８℃、３８．５℃、３９℃、３９．５℃、又は４０℃を超える温度で不安定化し、リガンドに対する反応性を喪失してもよい。ある態様によれば、分子進化を用いることにより、３７．５℃、３８℃、３８．５℃、３９℃、３９．５℃、又は４０℃を超える温度で不安定化するリボスイッチを選択してもよい。

ある態様によれば、前記標的ポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及び／又は、ポリペプチドをコードしうると共に、標的ポリヌクレオチドが、プロモーターに作動式に連結されてなる。ある態様によれば、前記標的ポリヌクレオチドは、リンパ増殖性要素をコードしうる。ある態様によれば、前記標的ポリヌクレオチドが、ｍｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡであってもよい。ある態様によれば、前記ｍｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡは、ＳＴＡＴ５経路を増強してもよく、或いはＳＯＣＳ経路を抑制してもよい。ある態様によれば、前記ｍｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡは、ＳＯＣＳ１、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦｂ、又はＰＤ－１の転写産物を標的とするものでもよい。ある態様によれば、前記ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－１５５である。ある態様によれば、前記標的ポリヌクレオチドはポリペプチドをコードし、前記ポリペプチドは、抗原特異的標的化領域、膜貫通ドメイン、及び細胞内活性化ドメインを含むＣＡＲを含んでいてもよい。

他の側面において、本開示では、プロモーター及びリボスイッチに作動式に連結された標的ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを含む、標的ポリヌクレオチドの発現を制御するための単離ポリヌクレオチドが提供される。ここで前記リボスイッチは、ａ．）前記アプタマードメインのグアニン又は２’－デオキシグアノシンに対する結合よりも、少なくとも２倍の高い結合親和性を以てヌクレオシド類似体抗ウイルス薬に結合可能なアプタマードメインと、ｂ．）前記標的ポリヌクレオチドの発現を制御することが可能な機能スイッチングドメインを含み、ここで前記ヌクレオシド類似体に前記アプタマードメインが結合すると、前記機能スイッチングドメインの発現制御活性が誘導又は抑制される。ある態様によれば、前記アプタマードメインは、前記アプタマードメインのグアニン又は２’－デオキシグアノシンに対する結合よりも、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００倍の高い結合親和性を以て、前記ヌクレオシド類似体抗ウイルス薬に結合する。ある態様によれば、前記アプタマードメインの長さは、下限が３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、及び７０ヌクレオチド長、上限が３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、及び１００ヌクレオチド長の範囲、例えば４５～８０ヌクレオチド長又は４５～５８ヌクレオチド長であってもよい。例示的な態様によれば、前記ヌクレオシド類似体抗ウイルス薬は、医薬リガンドであるアシクロビル（別名アシクログアノシン）又はペンシクロビルであってもよい。ある態様によれば、前記アプタマードメインは、ヌクレオシド又はヌクレオチドに対する結合親和性よりも、例えば少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００倍の高い結合親和性を以て、前記ヌクレオシド類似体抗ウイルス薬に結合してもよい。ある態様によれば、前記アプタマードメインが前記ヌクレオシド類似体へ結合することにより、前記リボスイッチの活性が誘導される。

ある態様によれば、前記アプタマードメインが、ペンシクロビルに対して特異性を有し、アシクロビル或いは他の抗ウイルス剤に対して反応性を欠いていてもよい。それにより、前記リボスイッチに影響を与えることなく、同時に抗ウイルス治療を行うことが可能となる。ある態様によれば、前記アプタマードメインは、前記アプタマードメインがアシクロビル又は他の抗ウイルス剤に結合する場合と比べて、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００倍の大きな結合親和性を以て、ペンシクロビルに結合可能である。ある態様によれば、前記アプタマードメインが、アシクロビルに対して特異性を有し、ペンシクロビル或いは他の抗ウイルス剤に対して反応性を欠いていてもよい。それにより、前記リボスイッチに影響を与えることなく、同時に抗ウイルス治療を行うことが可能となる。ある態様によれば、前記アプタマードメインは、前記アプタマードメインがペンシクロビル又は他の抗ウイルス剤に結合する場合と比べて、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００倍の大きな結合親和性を以て、アシクロビルに結合可能である。ある態様によれば、ペンシクロビル（ファムシクロビル）及びアシクロビル（バラシクロビル）の経口プロドラッグを、対象に投与してもよい。ある態様によれば、こうして誘導されるアプタマードメインが、メソプラズマ・フローラム（Mesoplasma florum）のＩ－Ａ型デオキシグアノシンリボスイッチ由来のアプタマードメインに対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列同一性を有していてもよい。ある態様によれば、こうして誘導されるアプタマードメインが、枯草菌（Bacillus subtilis）のｘｐｔリボスイッチ由来のアプタマードメインに対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列同一性を有していてもよい。本発明に開示される態様の何れかによれば、前記リボスイッチは、内部リボゾーム性侵入部位、レトロウイルス遺伝子コンストラクトのｍＲＮＡ前駆体スプライスドナーアクセス可能性、翻訳、転写の終了、転写産物分解、ｍｉＲＮＡ発現、又はｓｈＲＮＡ発現のうち何れかの活性を制御することにより、ＲＮＡ転写産物に影響を及ぼすことができる。ある態様によれば、前記機能スイッチングドメインは、抗ＩＲＥＳのＩＲＥＳに対する結合を制御することができる。本発明に開示される態様の何れかによれば、小分子リガンドの存在又は不在により、前記リボスイッチのＲＮＡ転写産物に対する作用が誘導されてもよい。ある態様によれば、前記リボスイッチが、リボザイムを含んでいてもよい。リボザイムを有するリボスイッチは、小分子リガンドの存在下で、所望の遺伝子の転写産物分解を抑制又は促進することができる。ある態様によれば、前記リボザイムが、ピストル型リボザイム、ハンマーヘッド型リボザイム、捻れ型リボザイム、ハチェット型リボザイム、又はthe ＨＤＶ（デルタ肝炎ウイルス）リボザイムであってもよい。ある態様によれば、前記リボスイッチが、３７．５℃、３８℃、３８．５℃、３９℃、３９．５℃、又は４０℃を超える温度で不安定化し、リガンドに対する反応性を喪失してもよい。ある態様によれば、分子進化を用いて、３７．５℃、３８℃、３８．５℃、３９℃、３９．５℃、又は４０℃を超える温度で不安定化するリボスイッチを選択してもよい。ある態様によれば、前記標的ポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及び／又は、ポリペプチドをコードしうる、ここで前記標的ポリヌクレオチドが、プロモーターに作動式に連結されてなる。ある態様によれば、前記標的ポリヌクレオチドは、リンパ増殖性要素をコードしうる。ある態様によれば、前記標的ポリヌクレオチドが、ｍｉＲＮＡであってもよく、任意により、前記ｍｉＲＮＡがＳＴＡＴ５経路を刺激し、又はＳＯＣＳ経路を抑制してもよい。ある態様によれば、前記ｍｉＲＮＡは、ＳＯＣＳ１、ＳＨＰ、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦｂ、又はＰＤ－１に由来する転写産物を標的とすることができる。これらの態様において、前記ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ－１５５であってもよい。ある態様によれば、前記標的ポリヌクレオチドが、ポリペプチドをコードすると共に、前記ポリペプチドが、抗原特異的標的化領域、膜貫通ドメイン、及び細胞内活性化ドメインを含むＣＡＲを含んでいてもよい。ＣＡＲの更なる態様については、本開示の別の箇所で論じる。

ある態様によれば、アプタマーの進化が、ランダム化された天然のプリン又はグアニンアプタマーライブラリーから、ＳＥＬＥＸ（指数関数的濃縮によるリガンドの体系的進化）法を用いたアプタマー選択により実施されるものであってもよい。例としては、これらに制限されるものではないが、選択プロセス及びスクリーニングに酸化グラフェンを用いる方法が挙げられる。他の態様によれば、ランダム突然変異生成法、例えばエラープローン（error prone）ＰＣＲを用いて、アプタマーコンストラクト又はリボスイッチコンストラクトを進化させてもよい。ここで、アプタマーは、インビトロでのスクリーニングにより、或いは哺乳類細胞において、本開示に記載の任意のリボスイッチ活性に組み込まれる。他の態様によれば、ヌクレオチドのランダムライブラリーを用いて、リボスイッチを進化させてもよい。本発明に開示される態様の何れかによれば、リボスイッチは、斯かるライブラリーをインビトロでスクリーニングすることにより、或いは哺乳類細胞において同定される。

ある態様によれば、こうして進化又は誘導されたアプタマードメインは、天然のリガンドの類似体に対する結合性が増加すると共に、天然のリガンドに対する結合性が減少していてもよい。ある態様によれば、前記アプタマードメインは、天然のリガンドの類似体に対する結合性が増加すると共に、天然のリガンドに対する結合性が減少するように構成されていてもよい。ある態様によれば、前記アプタマードメインは、プリンリボスイッチファミリーに由来するものであってもよい。ある態様によれば、天然のリガンドが、ヌクレオシド又はヌクレオチドであってもよく、類似体が、ヌクレオシド類似体又はヌクレオチド類似体であってもよい。ある態様によれば、前記ヌクレオシド類似体は、抗ウイルス薬である。例示的な態様によれば、前記アプタマードメインは、２’－デオキシグアノシン及びグアニンリボスイッチ骨格に由来するものであってもよく、こうして誘導されるアプタマードメインは、野生型リボスイッチと比較して、２’－デオキシグアノシン及びグアニンに対する結合性が弱められていてもよい。

ある態様によれば、前記リボスイッチは、レトロウイルス遺伝子コンストラクトのｍＲＮＡ前駆体スプライスドナーアクセス可能性を制御しうる。ここで、前記レトロウイルスコンストラクトは、汎用プロモーター又はＴ細胞特異的プロモーターの下、前記ＣＡＲ遺伝子又は他の所望の遺伝子を逆鎖から誘導する。他の態様によれば、前記リボスイッチは、前記レトロウイルス遺伝子コンストラクトにおいて、ＩＲＥＳを制御しうる。ここで、前記レトロウイルスコンストラクトは、ＣＡＲ遺伝子又は他の所望の遺伝子の翻訳を誘導する。他の態様によれば、前記リボスイッチは、ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又は遺伝子転写産物の転写終了を制御することができ、又は、転写産物の翻訳を制御することができる。他の態様によれば、前記ヌクレオシド類似体リボスイッチは、リボザイムと共に組み込まれて、前記ヌクレオシド類似体の存在下、前記ＣＡＲ遺伝子又は他の所望の遺伝子の転写産物分解を抑制又は促進してもよい。

ある態様によれば、プロモーター及びヌクレオシド類似体抗ウイルス薬に結合するリボスイッチに作動式に連結された標的ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを含む、前記標的ポリヌクレオチドの発現を制御するための単離ポリヌクレオチドは、分子クローニングベクターである。斯かる分子クローニングベクターは、本技術分野で公知の任意の種類の分子クローニングベクターであってよい。非限定的な例として、ベクターは、プラスミド、ウイルス、又はレトロウイルスであってもよく、これらは何れも発現ベクターであってもよい。斯かる発現ベクターは、本開示にて提供される上記の任意の標的ポリヌクレオチドをコードしうる。１又は２以上の制限部位及び／又は多重クローニング部位が、分子クローニングベクターに、本開示にて提供されるリボスイッチの５’側又は３’側に組み込まれていてもよい。それにより、前記リボスイッチは、制限部位及び／又は多重クローニング部位に挿入された標的ポリヌクレオチドに対して、作動式に連結されることになる。

分子シャペロン
一側面によれば、本開示では、対象のリンパ球を遺伝子操作し、増加させるための方法であって、
Ａ．対象の静止Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を、エクスビボで、通常は事前のエクスビボでの刺激を要さず、組換レトロウイルスと接触させ、ここで当該組換レトロウイルスは、
ｉ．Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞に結合し、斯かる細胞への組換レトロウイルスの膜融合を促進することが可能なシュードタイピング要素を、その表面に含むと共に、
ii．Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞内で活性なプロモーターに作動式に連結された、１又は２以上の転写単位を含むポリヌクレオチドを含み、ここで前記１又は２以上の転写単位は、インビボ制御要素により制御される第１の改変シグナル伝達ポリペプチドをコードし、ここで前記第１の改変シグナル伝達ポリペプチドは、リンパ増殖性要素及び／又はキメラ抗原受容体を含み、
ここで前記接触により、前記組換レトロウイルスによる前記静止Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞の少なくとも一部の形質導入が促進されて、遺伝子操作Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞が産生され、
Ｂ．前記遺伝子操作Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を、前記対象に導入し、
Ｃ．前記遺伝子操作Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を、前記インビボ制御要素として機能する化合物にインビボで暴露することにより、前記第１の改変シグナル伝達ポリペプチドの発現を誘発すると共に、前記リンパ球の増加をインビボで促進し、これにより前記対象のリンパ球を遺伝子操作し、増加させる
ことを含む方法が提供される。

例示的な態様によれば、エクスビボでの刺激を行うことなく、前記形質導入が実施される。例示的な態様によれば、前記化合物は、分子シャペロン、例えば小分子の分子シャペロンである。例示的な態様によれば、前記分子シャペロンが前記リンパ増殖性要素及び／又はＣＡＲ構成成分に結合することで、前記リンパ増殖性要素及び／又はＣＡＲの増殖活性が上昇する。血液を採取する前、接触の間、及び／又は、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を対象に導入した後に、前記分子シャペロンは、前記対象に投与することができる。この側面の一部態様には、対象から血液を採取することが含まれる。これらの態様において、前記導入は、再導入前に採取及び遺伝子操作された細胞の再導入である。例示的な態様によれば、本プロセス全体が、本開示に記載の他の側面と同様、従来技術の方法よりも短いプロセスである。例えば、本プロセス全体が、４８時間未満、２４時間未満、又は１２時間未満に完了してもよい。他の態様によれば、本プロセス全体を、下限が２、４、６、又は８時間、及び、上限が１２、２４、３６、又は４８時間の範囲内の時間で、完了することができる。

従って、本開示にて提供される方法及び組成物のある態様によれば、前記インビボ制御要素は、分子シャペロンである。本開示に記載の他のインビボ制御要素、例えばリボスイッチは、通常は本開示に記載の第１又は第２の改変シグナル伝達ポリペプチドのリンパ増殖性要素又は他の構成成分の発現に影響を与える化合物に結合するところ、斯かるインビボ制御要素を用いた他の態様と比較して、分子シャペロンは、インビボ制御要素であると同時に、それ自体が直接、本開示に記載の第１又は第２の改変シグナル伝達ポリペプチドのリンパ増殖性要素又は他の構成成分に対して、通常は結合することにより、影響を与える化合物である。分子シャペロンの投与を含む、本開示の方法の斯かる態様の例によれば、リンパ増殖性要素、膜結合サイトカイン、及び／又は、ＣＡＲ構成成分は、低活性又は不活性なリンパ増殖性要素、膜結合サイトカイン、及び／又は、ＣＡＲ構成成分であってもよい。この場合、これらが分子シャペロンと結合することで、その活性が上昇する。即ち、分子シャペロンが結合する標的は、通常は標的ポリペプチドである。ある態様によれば、示されるように、前記ポリペプチドが、分子シャペロン（例示的な態様によれば小分子の分子シャペロン）の結合によってその活性が影響を受ける、第１及び／又は第２の改変シグナル伝達ポリペプチド、又はそのポリペプチド構成成分であってもよい。ある態様によれば、前記ポリペプチドは、分子シャペロン（好ましくは小分子の分子シャペロン）によってその活性が調節される（例示的な態様によれば、上方調節される）リンパ増殖性要素を含んでいてもよい。本開示にて提供される方法による分子シャペロンは、変異型リンパ増殖性要素、及び／又は、不活性なＣＡＲ構成成分に結合することにより、それを活性化する化合物であってもよい。

他の態様によれば、リンパ増殖性要素又は他のシグナル伝達ドメインは、小分子合成シャペロンの存在下のみで細胞膜への移行を許容するように変異されてなる。他の態様によれば、斯かるシャペロンは増強剤（potentiator）として、前記リンパ増殖性要素又は他のシグナル伝達ドメイン又はタンパク質の安定性及び半減期を増強する。

当然ながら、本発明の側面及び態様は、本開示において詳細に提供される工程及び組成物の多くと同一の工程及び組成物を含む。従って、これも当然ながら、これら共通の要素に関する本明細書全体の教示が、分子シャペロンをインビボ制御要素として用いる側面及び態様にも適用される。斯かるインビボ制御要素は通常、本開示にて提供される他のインビボ制御要素、例えばリボスイッチ（これは例えば、通常は薬物等のリボスイッチに結合する分子を利用する）等に加えて、或いはこれら他のインビボ制御要素の代わりに、リンパ増殖性要素又は他の標的分子に直接結合する。

ある態様によれば、斯かる分子シャペロンは、標的の細胞内局在性、例えば、標的タンパク質（例えばリンパ増殖性要素及び／又はＣＡＲ構成成分等）の適切な折り畳み及び小胞体から細胞膜への移行、又はその表面における半減期を制御しうる化合物である。他の態様によれば、斯かる分子シャペロンは、機能不全な標的の機能的立体構造形成を促進しうる、即ち増強剤として作用しうる。天然変異型タンパク質に対するシャペロン又は増強剤として機能する分子の例としては、ルマカフトール及びアイバカフトールが挙げられる。これらタンパク質は、変異型ＣＦＴＲ塩素チャネル変異体、例えばＧ５５１Ｄ又はＦ５０８ｄｅｌ等に対して作用する。アイバカフトールは、Ｇ５５１Ｄ又はＦ５０８ｄｅｌ変異型イオンチャンネルの活性を促進するのに対して、ルマカフトールは変異型塩素チャネルの安定化及びその後のアイバカフトールによる増強作用を促進する。斯かるシャペロン依存型タンパク質は例えば、天然の機能的タンパク質から、分子シャペロンの存在下のみで機能活性を呈する分子をスクリーニングすることにより生成されてもよい。即ち、斯かるタンパク質は、シャペロンが存在する場合のみ活性である。斯かる特異的シャペロン活性に基づきスクリーニング可能な分子の例としては、通常のヒトタンパク質に対して活性を示さない小分子の抗ウイルス薬又は抗感染薬が挙げられる。従って、一の態様によれば、本開示の方法に使用される分子シャペロンは、通常のヒトタンパク質に対して活性を示さない小分子の抗ウイルス又は抗感染化合物である。

ある態様によれば、遺伝子操作されたリンパ球を斯かる分子シャペロンに暴露してもよく、及び／又は、対象に斯かる分子シャペロンを投与してもよい。ある態様によれば、前記化合物は、血液からのＰＢＬの単離前、単離中、及び／又は単離後、且つ、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞の組換レトロウイルスとの接触前に、対象に投与される。斯かる態様において、前記組換レトロウイルスは、分子シャペロン化合物に結合してこれにより調節される、低活性又は不活性なリンパ増殖性要素及び／又はＣＡＲ構成成分を含む。

養子細胞治療の方法の一部の場合も含め、本開示にて提供される、リンパ球を改変し、増加させる態様の何れかによれば、下限が５、１０、１５、３０、及び６０分間、及び、上限が１．５、２、３、４、５、６、８、１２、又は２４時間の範囲の時間に亘って、血液からのＰＢＬの単離前、又は、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞の組換レトロウイルスとの接触前に、前記化合物を対象に投与してもよい。ある態様によれば、下限が１．５、２、３、４、５、６、８、１２、又は２４時間、及び、上限が１／２、１、２、３、４、５、６、７、１０、１４、２１、又は２８日間の範囲の時間に亘って、血液からのＰＢＬの単離後、又は、本開示にて提供される方法によるＴ細胞及び／又はＮＫ細胞の組換レトロウイルスとの接触後、前記化合物を対象に投与する。ある態様によれば、少なくとも１．５、２、３、４、５、６、８、１２、又は２４時間、又は少なくとも２、３、４、５、６、７、１０、１４、２１、又は２８日間に亘って、血液からのＰＢＬの単離後、又は、本開示にて提供される方法によるＴ細胞及び／又はＮＫ細胞の組換レトロウイルスとの接触後、前記化合物を対象に投与する。ある態様によれば、ＰＢＬの前記対象への再注入後、少なくとも１、２、３、４、５、７、１０、１４、２１、２８、３０、６０、９０、又は１２０日間、又は、５、６、９、１２、２４、３６、４８、６０、７２、８４、９６、１２０ヶ月の時間を置いて、又は、無期限の時間をおいて、前記化合物を対象に投与する。本発明に開示される態様の何れかによれば、ＰＢＬの再点滴前及び／又は再点滴中及び／又は再注入後に、前記化合物を投与してもよい。

本開示に記載の態様の何れかにおいて、分子シャペロンは、化合物と結合してこれにより調節及び／又は活性化されるインビボ制御要素の中には存在しない。分子シャペロンは、インビボ制御要素であって、リンパ増殖性要素及び／又はＣＡＲの機能要素の活性を調節する化合物、好ましくは小分子化合物である。

組換レトロウイルスを作成するためのパッケージング細胞系／方法
一側面によれば、本開示では、哺乳類細胞を含むレトロウイルスパッケージング系であって、哺乳類細胞が：ａ）構成型プロモーターから発現されて、第１のリガンド及び第１の誘導型プロモーターと結合する能力を有し、これと作動式に連結された核酸配列の発現に対し、前記第１のリガンドの存在時には、前記第１のリガンドの不在時と比較して、影響を及ぼす、第１のトランス活性化因子；ｂ第２のリガンド及び第２の誘導型プロモーターと結合することができ、これと作動式に連結された核酸配列の発現に対し、第２のリガンドの存在下で、第２のリガンドの不在下と比較して影響を及ぼす、第２のトランス活性化因子；並びに、ｃ）レトロウイルス粒子のためのパッケージ可能なＲＮＡゲノムを含む、レトロウイルスパッケージング系が提供される。ここで、前記第１のトランス活性化因子が、前記第２のトランス活性化因子の発現を制御し、ここで前記第２のトランス活性化因子が、ウイルスパッケージングに含まれるレトロウイルスポリペプチドの発現、及び任意により、他のポリペプチドの発現を制御する。レトロウイルスポリペプチドの例としては、ｇａｇポリペプチド、ｐｏｌポリペプチド、及び／又は、シュードタイピング要素が挙げられる。他のポリペプチドとしては、前記組換レトロウイルスに包含又は提示されるペプチドであって、パッケージング細胞株、例えばＨＥＫ－２９３等に対して毒性を有すると考えられるペプチドが挙げられる。特定の側面によれば、前記第２のトランス活性化因子自体が、パッケージング細胞株に対して細胞毒性を有する。本開示にて詳細に論じるように、シュードタイピング要素は、通常は標的細胞の細胞膜に結合し、細胞膜への融合を促進する。即ち、理論に束縛されるものではないが、当該系は、レトロウイルスが産生され、収穫される時間に近い後の時間まで、前記哺乳類細胞の増殖又は生存を阻害しない、又は実質的に阻害しない、又は阻害しないと考えられる特定のポリペプチド／タンパク質、例えば非毒性タンパク質等を蓄積させる能力を提供すると共に、斯かる哺乳類細胞の集団を数日又は無期限に培養し、且つ、レトロウイルス産物には望ましいが、前記哺乳類細胞の生存及び／又は増殖を阻害する、又は阻害しうる、又は阻害するとの報告があるポリペプチド、例えば毒性ポリペプチド等の誘導を制御する。前記パッケージ可能なＲＮＡゲノムは、通常は、プロモーター（本開示では便宜上第３のプロモーターと呼ぶ場合もある）に作動式に連結されたポリヌクレオチドによりコードされ、ここで前記第３のプロモーターは、通常は前記第１のトランス活性化因子又は前記第２のトランス活性化因子により誘導される。例示的な態様によれば、前記パッケージ可能なＲＮＡゲノムが、第３のプロモーターに作動式に連結されたポリヌクレオチドによってコードされ、ここで前記第３のプロモーターが、前記第２のトランス活性化因子によって誘導されうる。それゆえ、前記レトロウイルスの収穫時期に近い後の時点で、前記パッケージ可能なＲＮＡゲノムが産生されてもよい。

当業者には当然ではあるが、前記レトロウイルスパッケージング系には、多数の異なるトランス活性化因子、リガンド、及び誘導型プロモーターを使用することができる。斯かる誘導型プロモーターとしては、多数の生物、例えば真核生物や原核生物から単離されたプロモーターや、これらの生物に由来するプロモーターを用いることができる。第１の生物に由来する誘導型プロモーターを第２の生物に用いる場合、例えば第１の生物が原核生物で第２の生物が真核生物である場合や、第１の生物が真核生物で第２の生物が原核生物である場合等、斯かるプロモーターの修飾は本技術分野で周知である。斯かる誘導型プロモーターの例や、斯かる誘導型プロモーターに基づくが追加の制御タンパク質も含む系の例としては、これらに限定されるものではないが、アルコール調節性プロモーター（例えばアルコールデヒドロゲナーゼI（ａｌｃＡ）遺伝子プロモーター、アルコールトランス活性化因子タンパク質（ＡｌｃＲ）に反応性のプロモーター等）、テトラサイクリン調節性プロモーター（例えばＴｅｔアクチベーター、ＴｅｔＯＮ、ＴｅｔＯＦＦ等のプロモーター系）、ステロイド調節性プロモーター（例えば、ラット糖質コルチコイド受容体プロモーター系、ヒトエストロゲン受容体プロモーター系、レチノイドプロモーター系、甲状腺プロモーター系、エクジソンプロモーター系、ミフェプリストンプロモーター系等）、金属調節性プロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター系等）、病因関連調節性プロモーター（例えばサリチル酸調節性プロモーター、エチレン調節性プロモーター、ベンゾチアジアゾール調節性プロモーター等）、温度調節性プロモーター（例えばヒートショック誘導型プロモーター（例えば、ＨＳＰ－７０、ＨＳＰ－９０、ダイズヒートショックプロモーター等）、光調節性プロモーター、合成誘導型プロモーター等が挙げられる。ある態様によれば、ミフェプリストン調節性系を用いてもよい。ある態様によれば、自己調節性フィードバックループを有するミフェプリストン誘導型系を用いてもよい。ある態様によれば、ＧＡＬ４制御性融合タンパク質は、トランスポゾン末端リピート並びにｌｏｘ及びＦＲＴ部位を含む単一のコンストラクトから発現される。ある態様によれば、ＧＡＬ４調節性融合タンパク質が、逆ｔｅｔトランス活性化因子（ｒｔＴＡ）及びＢｉＴＲＥの発現を制御する。ある態様によれば、ｌｏｘ及びＦＲＴ部位を有する他のコンストラクトが、ＧＡＬ４上流活性化配列（ＵＡＳ）と、mCherry等のレポーターを駆動するＥ１ｂＴＡＴＡボックスプロモーターとを含む。ある態様によれば、ＧＡＬ４制御性融合タンパク質の発現を制御するプロモーターと、標的ポリヌクレオチドの発現を制御するプロモーターとの双方において、ＧＡＬ４制御性融合タンパク質が、ＧＡＬ４上流活性化配列（ＵＡＳ）に結合する。ある態様によれば、ミフェプリストン、ドキシサイクリン、及びピューロマイシンが、パッケージング細胞株の誘導及び選択に用いられる。

ある態様によれば、トランス活性化因子の一方又は両方が、二以上のポリペプチドに分割されていてもよい。ある態様によれば、これら二以上のポリペプチドは、ＤＮＡ結合ドメインと、転写を刺激しうる活性化ドメインとを、個別のポリペプチド上に含んでいてもよい。この「活性化ドメイン」は、例えばＣＤ３に結合するポリペプチド等の「活性化要素」と混同してはならない。後者は、本開示にて詳細に論じるように、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を活性化する能力を有し、通常は斯かるＴ細胞及び／又はＮＫ細胞と接触することによりこれを活性化するものである。前記の個別のポリペプチドは更に、リガンドの付加により二量体を形成可能なポリペプチドとの融合体を含んでいてもよい。ある態様によれば、活性化ドメインは、ｐ６５活性化ドメイン又はその機能断片であってもよい。本開示に記載のパッケージング系の例示的な態様によれば、ＤＮＡ結合ドメインは、ＺＦＨＤ１又はその機能断片由来のＤＮＡ結合ドメインであってもよい。ある態様によれば、一方のポリペプチドが、ＦＫＢＰ、又はその機能的変異体、及び／又はその断片、又は複数のＦＫＢＰと融合されていてもよく、他方のポリペプチドが、ｍＴＯＲのＦＲＢドメイン、又はその機能的変異体、及び／又はその断片と融合されていてもよく、リガンドが、ラパマイシン又は機能的ラパログ（rapalog）であってもよい。ある態様によれば、ＦＲＢは、変異Ｋ２０９５Ｐ、Ｔ２０９８Ｌ、及び／又は、Ｗ２１０１Ｆを含む。ある態様によれば、前記の個別のポリペプチドは、ＦＫＢＰ又はその機能断片と、カルシニューリンＡ又はその機能断片とであってもよく、前記の二量体化剤が、ＦＫ５０６であってもよい。ある態様によれば、前記の個別のポリペプチドが、ＦＫＢＰ又はその機能断片と、ＣｙＰ－Ｆａｓ又はその機能断片とであってもよく、前記の二量体化剤が、ＦＫＣｓＡであってもよい。ある態様によれば、前記の個別のポリペプチドが、ＧＡＩ又はその機能断片と、ＧＩＤ１又はその機能断片とであってもよく、前記の二量体化剤が、ジベレリンであってもよい。ある態様によれば、前記の個別のポリペプチドが、Ｓｎａｐタグと、Ｈａｌｏタグ又はその機能断片とであってもよく、前記の二量体化剤が、ＨａＸＳであってもよい。ある態様によれば、前記の個別のポリペプチドは、同一のポリペプチドを含んでいてもよい。例えば、前記のＤＮＡ結合ドメイン及び活性化ドメインが、ＦＫＢＰ又はＧｙｒＢとの融合タンパク質として発現されてもよく、前記の二量体化剤が、それぞれＦＫ１０１２又はクーママイシンであってもよい。ある態様によれば、誘導型プロモーターが、ＤＮＡ結合ドメインが通常結合するＤＮＡ配列であってもよい。ある態様によれば、誘導型プロモーターが、前記ＤＮＡ結合ドメインが通常結合するＤＮＡ配列とは異なっていてもよい。ある態様によれば、何れかのトランス活性化因子が、ｒｔＴＡであってもよく、リガンドが、テトラサイクリン又はドキシサイクリンであってもよく、誘導型プロモーターが、ＴＲＥであってもよい。例示的な態様によれば、第１のトランス活性化因子が、ＦＲＢに融合されたｐ６５活性化ドメインと、３つのＦＫＢＰポリペプチドに融合されたＺＦＨＤ１ＤＮＡ結合ドメインとであり、第１のリガンドがラパマイシンであってもよい。更なる例示的な態様によれば、第２のトランス活性化因子が、ｒｔＴＡであってもよく、第２のリガンドが、テトラサイクリン又はドキシサイクリンであってもよく、誘導型プロモーターが、ＴＲＥであってもよい。

ある態様によれば、前記第１のトランス活性化因子は、コンセンサス配列を含む転写産物の核外輸送を制御する、例えばＨＩＶＲｅｖ等の要素の発現を制御しうると共に、前記コンセンサス配列が、Ｒｅｖ応答要素であってもよい。例示的な態様によれば、前記標的細胞がＴ細胞である。

ある態様によれば、前記シュードタイピング要素は、レトロウイルスエンベロープポリペプチドである。前記シュードタイピング要素は通常、本開示においてより詳細に論じるような、標的細胞に結合して標的細胞とウイルス膜との膜融合を促進するための、結合性ポリペプチド及び融合性ポリペプチドを含む。ある態様によれば、前記シュードタイピング要素は、ネコ内因性ウイルス（ＲＤ１１４）エンベロープタンパク質、オンコレトロウイルス両種指向性エンベロープタンパク質、オンコレトロウイルス同種志向性エンベロープタンパク質、及び／又は、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ－Ｇ）エンベロープタンパク質である。例示的な態様によれば、前記シュードタイピング要素は、本開示にてさらに詳細に論じるように、異なるタンパク質に由来する結合性ポリペプチド及び融合性ポリペプチドを含む。例えば、例示的な態様、特に前記標的細胞がＴ細胞及び／又はＮＫ細胞である態様によれば、結合性ポリペプチドは、麻疹ウイルス（例えば麻疹ウイルスのEdmonston株等）のヘマグルチニン（Ｈ）ポリペプチド、又はその細胞質ドメイン欠失変異体であり、融合性ポリペプチドは麻疹ウイルス（例えば麻疹ウイルスのEdmonston株等）の融合（Ｆ）ポリペプチド、又はその細胞質ドメイン欠失変異体である。ある態様によれば、融合性ポリペプチドは、単一のポリペプチドとして発現される複数の要素を含んでいてもよい。ある態様によれば、結合性ポリペプチド及び融合性ポリペプチドが、同一の転写産物の異なるリボソーム結合部位から翻訳されてもよく、或いは翻訳後の単一のポリペプチドが、本開示の別の箇所で論じるペプチド切断シグナル又はリボゾーム性スキップ配列を用いて、結合性ポリペプチドと融合性ポリペプチドとに切断されてもよい。結合性ポリペプチドが麻疹ウイルスＨポリペプチド又はその細胞質ドメイン欠失体であり、融合性ポリペプチドが麻疹ウイルスＦポリペプチド又はその細胞質ドメイン欠失体である一部の態様によれば、Ｆ及びＨポリペプチドが異なるリボソーム結合部位から翻訳される結果、Ｈポリペプチドの量と比較してＦポリペプチドの量が多くなる。ある態様によれば、Ｆポリペプチド（又はその細胞質ドメイン欠失体）のＨポリペプチド（又はその細胞質ドメイン欠失体）に対する比は、少なくとも２：１、少なくとも３：１、少なくとも４：１、少なくとも５：１、少なくとも６：１、少なくとも７：１、又は少なくとも８：１である。

ある態様によれば、前記第１のトランス活性化因子は、標的細胞（例えばＴ細胞）に結合して当該細胞を活性化することが可能な活性化要素の発現を制御しうる。本開示に示す活性化要素の何れかが発現されてもよい。例えば、これらの態様において、前記活性化要素は、ａ．）ＣＤ３に結合してＣＤ３を活性化することが可能な膜結合性ポリペプチド、及び／又は、ｂ．）膜結合ＣＤ２８に結合してこれを活性化することが可能なポリペプチドを含んでいてもよい。ある態様によれば、前記膜結合ＣＤ２８に結合してこれを活性化することが可能なポリペプチドは、ＣＤ８０、ＣＤ８６又はその機能断片、例えばＣＤ８０の細胞外ドメインである。

ある態様によれば、前記第２のトランス活性化因子は、１又は２以上の標的ポリペプチド（非限定的な例としては、本開示に示す任意の改変シグナル伝達ポリペプチド）をコードするＲＮＡの発現を制御しうる。留意すべき点として、前記レトロウイルスパッケージング系に関する側面、及び、組換レトロウイルスの作製方法に関する側面は、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞の形質導入のための組換レトロウイルスの作製に限定されず、組換レトロウイルスにより形質導入されうる任意の細胞型に適用可能であると考えられる。一部の例示的な態様によれば、斯かるＲＮＡは、例えばｇａｇやｐｏｌ等のレトロウイルス成分を、逆向きに夫君いている（例えば逆鎖において逆向きにコードする）。例えば、斯かるＲＮＡは、５’側から３’側に向かって、以下を含んでいてもよい：５’側末端反復配列（長末端リピート）又はその活性な切断断片；レトロウイルスシス作用型ＲＮＡパッケージング要素をコードする核酸配列；第１の標的ポリペプチド及び任意により第２の標的ポリペプチドをコードする核酸配列（斯かる標的ポリペプチドの例として、これらに制限されるものではないが、改変シグナル伝達ポリペプチドが挙げられる。これは、プロモーターにより誘導されてもよい。ある態様によれば、これはあくまでも便宜上「第４の」プロモーターと呼ばれる。）；標的細胞で活性なプロモーター；３’側末端反復配列（長末端リピート）又はその活性な切断断片。ある態様によれば、斯かるＲＮＡは、中央ポリプリン路（ｃＰＰＴ）／中央終了配列（ＣＴＳ）要素を含んでいてもよい。ある態様によれば、前記レトロウイルスシス作用型ＲＮＡパッケージング要素は、ＨＩＶＰｓｉであってもよい。ある態様によれば、前記レトロウイルスシス作用型ＲＮＡパッケージング要素が、Ｒｅｖ応答要素であってもよい。例示的な態様によれば、前記改変シグナル伝達ポリペプチドは、本開示に示す１又は２以上の改変シグナル伝達ポリペプチドである。

当然ながら、プロモーターの番号、例えば第１、第２、第３、第４等のプロモーターとは、あくまでも便宜上の番号である。あるプロモーターを「第４の」プロモーターと呼んでも、これは（斯かる他のプロモーターが明示的に述べられている場合を除き）更に追加のプロモーター、例えば第１、第２、又は第３のプロモーターが存在することを含意するものではない。

ある態様によれば、前記改変シグナル伝達ポリペプチドは、第１のリンパ増殖性要素を含んでいてもよい。適切なリンパ増殖性要素は、本開示の他の箇所に開示されている。非限定的な例として、前記リンパ増殖性要素は、本開示に示すｅＴａｇ等の認識ドメインとの融合体として発現されてもよい。ある態様によれば、前記パッケージ可能なＲＮＡゲノムが更に、本開示にて提供される何れかのＣＡＲの態様をコードするキメラ抗原受容体を含む、第２の改変されたポリペプチドをコードする核酸配列を含んでいてもよい。例えば、前記第２の改変されたポリペプチドは、第１の抗原特異的標的化領域、第１の膜貫通ドメイン、及び第１の細胞内活性化ドメインを含んでいてもよい。抗原特異的標的化領域、膜貫通ドメイン、及び細胞内活性化ドメインの例は、本開示の別の箇所で論じる。前記標的細胞がＴ細胞であるある態様によれば、本開示の別の箇所で論じるように、標的細胞で活性なプロモーターは、Ｔ細胞でも活性である。

ある態様によれば、前記パッケージ可能なＲＮＡゲノムが更に、本開示の他の箇所にて論じるようなリボスイッチを含んでいてもよい。ある態様によれば、改変シグナル伝達ポリペプチドをコードする核酸配列が、逆向きであってもよい。更なる態様によれば、前記パッケージ可能なＲＮＡゲノムが更に、リボスイッチを含んでいてもよく、任意により、前記リボスイッチが、逆向きであってもよい。本発明に開示される態様の何れかによれば、前記の任意の要素を含むポリヌクレオチドは、プライマー結合部位を含んでいてもよい。例示的な態様によれば、転写遮断薬又はポリＡ配列が、非調節性転写を防止又は低減する遺伝子の近くに配置されてもよい。本発明に開示される態様の何れかによれば、Ｖｐｘをコードする核酸配列が、第２の転写単位に存在してもよく、又は任意の第３の転写単位に存在してもよく、又は前記第１の誘導型プロモーターに作動式に連結された更なる転写単位に存在してもよい。

他の側面において、本開示では、組換レトロウイルスを作製する方法であって、パッケージング細胞の集団を培養することにより、第１のトランス活性化因子を蓄積させ、ここで前記パッケージング細胞は、構成型プロモーターから発現される前記第１のトランス活性化因子を含み、ここで前記第１のトランス活性化因子が、第１のリガンド及び第１の誘導型プロモーターと結合する能力を有すると共に、これと作動式に連結された核酸配列の発現に対し、前記第１のリガンドの不在時と比較して、前記第１のリガンドの存在時において影響を及ぼし、且つ、ここで第２のトランス活性化因子の発現が、前記第１のトランス活性化因子により調節され；蓄積された第１のトランス活性化因子を含む前記パッケージング細胞集団を、前記第１のリガンドの存在下でインキュベートすることにより、前記第２のトランス活性化因子を蓄積させ、ここで前記第２のトランス活性化因子が、第２のリガンド及び第２の誘導型プロモーターと結合する能力を有すると共に、これと作動式に連結された核酸配列の発現に対し、前記第２のリガンドの不在時と比較して、前記第２のリガンドの存在時において影響を及ぼし；蓄積された第２のトランス活性化因子を含む前記パッケージング細胞集団を、前記第２のリガンドの存在下でインキュベートすることにより、ウイルスパッケージングに含まれるレトロウイルスポリペプチド（例えばｇａｇポリペプチド、ｐｏｌポリペプチド、及び／又は、シュードタイピング要素等）の発現（更に任意により、前記組換レトロウイルスにより内包又は提示される哺乳類細胞の増殖又は生存を阻害すると考えられる他のポリペプチドの発現）を誘導することにより、前記組換レトロウイルスを作製することを含む方法が提供される。例示的な態様によれば、パッケージ可能なＲＮＡゲノムは、プロモーターに作動式に連結されたポリヌクレオチド（便宜上適宜「第３の」プロモーターと呼ぶ。）によってコードされる。ここで前記第３のプロモーターは、構成的に活性であってもよく、前記第１のトランス活性化因子、又は例示的な態様によれば、前記第２のトランス活性化因子によって誘導されてもよい。これにより、前記組換レトロウイルスが作製される。前記シュードタイピング要素は通常、標的細胞の細胞膜に結合して、標的細胞膜と組換レトロウイルス膜との融合を促進する能力を有する。前記シュードタイピング要素は、本技術分野で公知の任意のエンベロープタンパク質であってもよい。ある態様によれば、エンベロープタンパク質は、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ－Ｇ）エンベロープタンパク質、ネコ内因性ウイルス（ＲＤ１１４）エンベロープタンパク質、オンコレトロウイルス両種指向性エンベロープタンパク質、及び／又は、オンコレトロウイルス同種志向性エンベロープタンパク質であってもよい。当業者には当然ではあるが、前記の組換レトロウイルスの作製方法には、多数の異なるトランス活性化因子、リガンド、及び誘導型プロモーターを用いることができる。適切なトランス活性化因子、リガンド、及び誘導型プロモーターについては、上記を含め、本開示の別の箇所で論じる。更に、当業者にはこれも当然ではあるが、本開示にて提供されるレトロウイルスパッケージング系の側面に関連する本開示の上記の教示は、組換レトロウイルスの作製方法の側面にも同様に適用され、その逆も同様である。

ある態様によれば、前記第１のトランス活性化因子は、コンセンサス配列を含む転写産物の核外輸送を制御する要素の発現、例えばＨＩＶＲｅｖ等を制御しうると共に、コンセンサス配列が、Ｒｅｖ応答要素（ＲＲＥ）であってもよい。例示的な態様によれば、前記標的細胞は、通常はＴ細胞である。ある態様によれば、ＨＩＶＲＲＥ、及び、ＨＩＶＲｅｖをコードするポリヌクレオチド領域がそれぞれ、ＨＩＶ－２ＲＲＥ、及び、ＨＩＶ－２Ｒｅｖをコードするポリヌクレオチド領域によって置換されていてもよい。ある態様によれば、ＨＩＶＲＲＥ、及び、ＨＩＶＲｅｖをコードするポリヌクレオチド領域がそれぞれ、ＳＩＶＲＲＥ、及び、ＳＩＶＲｅｖをコードするポリヌクレオチド領域によって置換されていてもよい。ある態様によれば、ＨＩＶＲＲＥ、及び、ＨＩＶＲｅｖをコードするポリヌクレオチド領域がそれぞれ、ＲｅｍＲＥ、及び、βレトロウイルスＲｅｍをコードするポリヌクレオチド領域によって置換されていてもよい。ある態様によれば、ＨＩＶＲＲＥ、及び、ＨＩＶＲｅｖをコードするポリヌクレオチド領域がそれぞれ、ΔレトロウイルスＲｅｘＲＲＥ、及び、ΔレトロウイルスＲｅｘをコードするポリヌクレオチド領域によって置換されていてもよい。ある態様によれば、Ｒｅｖ様タンパク質は必要ではなく、ＲＲＥがシス作用型ＲＮＡ要素、例えば構成型輸送要素（ＣＴＥ）等によって置換されていてもよい。

ある態様によれば、前記シュードタイピング要素は、ウイルスエンベロープタンパク質である。前記シュードタイピング要素は通常は、標的細胞に結合に結合してウイルスと標的細胞膜との膜融合を促進するように、結合性ポリペプチド及び融合性ポリペプチドを含む。ある態様によれば、前記シュードタイピング要素が、ネコ内因性ウイルス（ＲＤ１１４）エンベロープタンパク質、オンコレトロウイルス両種指向性エンベロープタンパク質、オンコレトロウイルス同種志向性エンベロープタンパク質、及び／又は、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ－Ｇ）エンベロープタンパク質であってもよい。例示的な態様によれば、前記シュードタイピング要素は、本開示にてさらに詳細に論じるように、異なるタンパク質に由来する結合性ポリペプチド及び融合性ポリペプチドを含む。例えば、特に前記標的細胞がＴ細胞及び／又はＮＫ細胞である例示的な態様によれば、結合性ポリペプチドが、麻疹ウイルスＨポリペプチドの細胞質ドメイン欠失変異体であってもよく、融合性ポリペプチドが、麻疹ウイルスＦポリペプチドの細胞質ドメイン欠失変異体であってもよい。ある態様によれば、融合性ポリペプチドは、単一のポリペプチドとして発現される複数の要素を含んでいてもよい。ある態様によれば、前記の結合性ポリペプチド及び融合性ポリペプチドが、同一の転写産物の異なるリボソーム結合部位から翻訳されてもよく、或いは本開示の別の箇所で論じるように、翻訳後の単一のポリペプチドが、ペプチド切断シグナル又はリボゾーム性スキップ配列を用いて、結合性ポリペプチドと融合性ポリペプチドとに切断されてもよい。ある態様によれば、前記の結合性ポリペプチド及び融合性ポリペプチドが、異なるリボソーム結合部位から翻訳される結果、融合性ポリペプチドの量は、結合性ポリペプチドと比較して多くなる。ある態様によれば、融合性ポリペプチドの結合性ポリペプチドに対する比は、少なくとも２：１、少なくとも３：１、少なくとも４：１、少なくとも５：１、少なくとも６：１、少なくとも７：１、又は少なくとも８：１である。

ある態様によれば、前記第１のトランス活性化因子は、標的細胞（例えばＴ細胞）に結合して当該細胞を活性化することが可能な活性化要素の発現を制御しうる。これらの態様において、前記活性化要素は、ａ．）ＣＤ３に結合してＣＤ３を活性化することが可能な膜結合性ポリペプチド、及び／又は、ｂ．）膜結合ＣＤ２８に結合してこれを活性化することが可能なポリペプチドを含んでいてもよい。ある態様によれば、前記膜結合ＣＤ２８に結合してこれを活性化することが可能なポリペプチドは、ＣＤ８０、ＣＤ８６、又はその機能断片である。ある態様によれば、前記組換レトロウイルスは、前記活性化要素をレトロウイルス膜上に含み、前記レトロウイルスＲＮＡをヌクレオカプシド内に含み、これにより組換レトロウイルスを作製してもよい。

ある態様によれば、前記第２のトランス活性化因子は、５’側から３’側に向かって以下を含むＲＮＡの発現を制御しうる：５’側末端反復配列（長末端リピート）又はその活性な切断断片；レトロウイルスシス作用型ＲＮＡパッケージング要素をコードする核酸配列；第１の標的ポリペプチド（及び任意の第２の標的ポリペプチド：非限定的な例として、１又は２の改変シグナル伝達ポリペプチド）をコードする核酸配列；標的細胞で活性なプロモーター；及び、３’側末端反復配列（長末端リピート）又はその活性な切断断片。ある態様によれば、斯かるＲＮＡは、ｃＰＰＴ／ＣＴＳ要素を含んでいてもよい。ある態様によれば、斯かるＲＮＡは、プライマー結合部位を含んでいてもよい。ある態様によれば、前記レトロウイルスシス作用型ＲＮＡパッケージング要素は、ＨＩＶＰｓｉであってもよい。ある態様によれば、前記レトロウイルスシス作用型ＲＮＡパッケージング要素は、Ｒｅｖ応答要素であってもよい。本発明に開示される態様の何れかによれば、当業者であれば理解するように、ＲＮＡ上のレトロウイルス成分（例えばＲＲＥ及びＰｓｉ等）は、任意の位置に存在していてもよい。例示的な態様によれば、前記改変シグナル伝達ポリペプチドは、本開示に示す１又は２以上の改変シグナル伝達ポリペプチドである。

ある態様によれば、前記改変シグナル伝達ポリペプチドは、第１のリンパ増殖性要素を含んでいてもよい。適切なリンパ増殖性要素は、本開示の他の箇所に記載される。ある例示的な態様によれば、前記リンパ増殖性要素が、認識ドメイン（例えばｅＴａｇ等）に融合されたＩＬ－７受容体変異体であってもよい。ある態様によれば、前記パッケージ可能なＲＮＡゲノムが更に、本開示にて提供される任意のＣＡＲの態様をコードする、キメラ抗原受容体を含む第２の改変されたポリペプチドをコードする核酸配列を含んでいてもよい。例えば、前記第２の改変されたポリペプチドは、第１の抗原特異的標的化領域、第１の膜貫通ドメイン、及び第１の細胞内活性化ドメインを含んでいてもよい。抗原特異的標的化領域、膜貫通ドメイン、及び細胞内活性化ドメインの例については、本開示の別の箇所で論じる。前記標的細胞がＴ細胞であるある態様によれば、本開示の別の箇所で論じるように、標的細胞で活性なプロモーターは、Ｔ細胞で活性である。

ある態様によれば、前記パッケージ可能なＲＮＡゲノムが更に、本開示の他の箇所にて論じるようなリボスイッチを含んでいてもよい。ある態様によれば、前記改変シグナル伝達ポリペプチドをコードする核酸配列が、逆向きであってもよい。更なる態様によれば、前記パッケージ可能なＲＮＡゲノムが更に、リボスイッチを含んでいてもよく、任意により、前記リボスイッチが逆向きであってもよい。本発明に開示される態様の何れかによれば、前記の要素の何れかを含むポリヌクレオチドは、プライマー結合部位を含んでいてもよい。例示的な態様によれば、転写遮断薬又はポリＡ配列が、非調節性転写を防止又は低減する遺伝子の近傍に位置していてもよい。本発明に開示される態様の何れかによれば、Ｖｐｘをコードする核酸配列が、前記第２の転写単位に存在していてもよく、又は任意の第３の転写単位に存在していてもよく、又は前記第１の誘導型プロモーターに作動式に連結された更なる転写単位に存在していてもよい。

レトロウイルスを作製するパッケージング系又は方法の側面のある態様によれば、コードされるＲＮＡは、イントロンを含んでいてもよく、斯かるイントロンは、例えば前記標的ポリペプチドを発現するためのプロモーターと同一のプロモーターによって転写されてもよい。一部の例示的な態様によれば、斯かるイントロンは、１、２、３、又は４つのｍｉＲＮＡをコードしうる。レトロウイルスを作製するパッケージング系又は方法の側面に関する、これら及び他の態様によれば、前記パッケージ可能なＲＮＡゲノムは１１，０００ＫＢ以下であり、ある例によれば１０，０００ＫＢ以下のサイズである。

ある態様によれば、前記第１のトランス活性化因子は、１又は２以上の非毒性ポリペプチドの発現に作用しうる。ある態様によれば、前記第２のトランス活性化因子は、１又は２以上の毒性ポリペプチドの発現に作用しうる。例えば、前記第１のトランス活性化因子は、前記レトロウイルスタンパク質Ｒｅｖ及びＶｐｘの発現を誘導しうると共に、更に前記パッケージング細胞の細胞膜に輸送されるポリペプチドも誘導しうる。また、前記第２のトランス活性化因子は、前記レトロウイルスタンパク質ＧＡＧ、ＰＯＬ、ＭＶ（Ｅｄ）－ＦΔ３０、及び、ＭＶ（Ｅｄ）－ＨΔ１８又はＭＶ（Ｅｄ）－ＨΔ２４の何れかの発現を誘導しうると共に、レンチウイルスゲノムの発現も誘導しうる。ある態様によれば、前記第１のトランス活性化因子が、１又は２以上の毒性ポリペプチドの発現を誘導しうる、及び／又は、前記第２のトランス活性化因子が、１又は２以上の非毒性ポリペプチドの発現を誘導しうる。

他の側面において、本開示では、下記を含む哺乳類パッケージング細胞が提供される。ａ．）前記哺乳類パッケージング細胞のゲノム内に含まれ、第１のトランス活性化因子をコードする核酸配列を含む、第１の転写単位。ここで前記第１の転写単位は、構成型プロモーターに作動式に連結されてなり、ここで前記トランス活性化因子は、第１の誘導型プロモーターに結合すると共に、第１のリガンドの不在下と比較し、第１のリガンドの存在下で、これと作動式に連結された核酸配列の発現に作用する能力を有し、ここで前記第１のトランス活性化因子は、前記第１のリガンドに結合する能力を有する。b.）前記哺乳類パッケージング細胞のゲノム内に含まれ、レトロウイルスＲＥＶタンパク質をコードする核酸配列と、第２のトランス活性化因子をコードする核酸配列とを含む、第２の転写単位、及び任意の第３の転写単位。ここで第２のトランス活性化因子は、第２の誘導型プロモーターに結合すると共に、第２のリガンドの不在下と比較し、第２のリガンドの存在下で、これと作動式に連結された核酸配列の発現に作用する能力を有し、ここで前記第２のトランス活性化因子は、前記第２のリガンドに結合する能力を有し、ここで前記第２の転写単位、及び任意の前記第３の転写単位は、前記第１の誘導型プロモーターに作動式に連結されてなる。ｃ．）前記哺乳類パッケージング細胞のゲノム内に含まれ、レトロウイルスＧａｇポリペプチド及びレトロウイルスｐｏｌポリペプチド、並びに、結合性ポリペプチド及び融合性ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、第４の転写単位、及び任意の第５の転写単位。ここで結合性ポリペプチド及び融合性ポリペプチドは、標的細胞に結合して、標的細胞膜とレトロウイルス膜との融合を促進する能力を有し、ここで前記第４の転写単位、及び任意の前記第５の転写単位は、前記第２の誘導型プロモーターに作動式に連結されてなる。ｄ）前記哺乳類パッケージング細胞のゲノム内に含まれる、第６の転写単位。ここで第６の転写単位は、５’側から３’側に向かって、５’ＬＴＲ又はその活性な切断断片、レトロウイルスシス作用型ＲＮＡパッケージング要素をコードする核酸配列、ｃＰＰＴ／ＣＴＳ要素、改変シグナル伝達ポリペプチドをコードする核酸配列の逆相補鎖、イントロン、標的細胞で活性なプロモーター、及び３’ＬＴＲ又はその活性な切断断片を含み、ここで前記第６の転写単位は、前記第２の誘導型プロモーターに作動式に連結されてなる。

他の側面において、本開示では、組換レトロウイルスを作製する方法であって、以下を含む方法が提供される。１．）パッケージング細胞の集団を培養することにより、第１のトランス活性化因子を蓄積させる。ここで前記パッケージング細胞は、以下を含む。ａ．）前記哺乳類パッケージング細胞のゲノム内に含まれ、第１のトランス活性化因子をコードする核酸配列を含む、第１の転写単位。ここで前記第１の転写単位は、構成型プロモーターに作動式に連結されてなり、ここで前記トランス活性化因子は、第１の誘導型プロモーターに結合すると共に、第１のリガンドの不在下と比較し、第１のリガンドの存在下で、これと作動式に連結された核酸配列の発現に作用する能力を有し、ここで前記第１のトランス活性化因子は、前記第１のリガンドに結合する能力を有する。ｂ．）前記哺乳類パッケージング細胞のゲノム内に含まれ、レトロウイルスＲＥＶタンパク質をコードする核酸配列と第２のトランス活性化因子をコードする核酸配列とを含む、第２の転写単位、及び任意の第３の転写単位。ここで、第２のトランス活性化因子は、第２の誘導型プロモーターに結合すると共に、第２のリガンドの存在下で、第２のリガンドの不在下と比較して、これと作動式に連結された核酸配列の発現に作用する能力を有し、ここで前記第２のトランス活性化因子は、前記第２のリガンドに結合する能力を有し、ここで前記第２の転写単位、及び任意の前記第３の転写単位は、前記第１の誘導型プロモーターに作動式に連結されてなる。ｃ．）前記哺乳類パッケージング細胞のゲノム内に含まれ、レトロウイルスＧａｇポリペプチド及びレトロウイルスｐｏｌポリペプチドをコードする核酸配列、及び結合性ポリペプチド及び融合性ポリペプチドを含む、第４の転写単位、及び任意の第５の転写単位。ここで結合性ポリペプチド及び融合性ポリペプチドは、標的細胞に結合すると共に、レトロウイルス膜と標的細胞膜との融合を促進する能力を有し、ここで前記第４の転写単位、及び任意の前記第５の転写単位は、前記第２の誘導型プロモーターに作動式に連結されてなる。ｄ．）前記哺乳類パッケージング細胞のゲノム内に含まれる第６の転写単位。ここで第６の転写単位は、５’側から３’側に向かって、５’ＬＴＲ又はその活性な切断断片、プライマー結合部位（ＰＢＳ）、レトロウイルスシス作用型ＲＮＡパッケージング要素をコードする核酸配列、ｃＰＰＴ／ＣＴＳ要素、改変シグナル伝達ポリペプチドをコードする核酸配列の逆相補鎖、イントロン、標的細胞標的細胞で活性なプロモーター、３’ＬＴＲ又はその活性な切断断片を含み、ここで第５の転写単位は、前記第２の誘導型プロモーターに作動式に連結されてなる。２．）前記第１のトランス活性化因子を含む前記パッケージング細胞集団を、前記第１のリガンドの存在下でインキュベートすることにより、前記第２のトランス活性化因子及び前記レトロウイルスＲＥＶタンパク質を蓄積させる。３．）前記第２のトランス活性化因子及び前記レトロウイルスＲＥＶタンパク質を含む前記パッケージング細胞集団を、前記第２のリガンドの存在下でインキュベートすることにより、前記レトロウイルスＧａｇポリペプチド、前記レトロウイルスｐｏｌポリペプチド、前記結合性ポリペプチド、前記融合性ポリペプチド、及びレトロウイルスＲＮＡの発現を誘導する。ここでレトロウイルスＲＮＡは、５’側から３’側に向かって、５’ＬＴＲ又はその活性断片、前記ＰＢＳ、前記レトロウイルスシス作用型ＲＮＡパッケージング要素、前記改変シグナル伝達ポリペプチドをコードする核酸配列の逆相補鎖、前記標的細胞プロモーター、及び３’ＬＴＲ又はその活性な切断断片を含み、ここで組換レトロウイルスは、前記パッケージング細胞で形成されて当該細胞から放出され、ここで前記組換レトロウイルスは、前記結合性ポリペプチド及び／又は前記融合性ポリペプチドをレトロウイルス膜上に含むと共に、前記レトロウイルスＲＮＡをヌクレオカプシド内に含み、これにより組換レトロウイルスが作製される。

本開示にて提供される一側面によれば、前記レトロウイルスパッケージング系は、以下を含む哺乳類細胞を含んでいてもよい。１．）第１のトランス活性化因子構成型プロモーターから発現されて、第１のリガンド及び第１の誘導型プロモーターと結合する能力を有し、これと作動式に連結された核酸配列の発現に対し、前記第１のリガンドの不在時と比較して、前記第１のリガンドの存在時において影響を及ぼす。２．）第２のリガンド及び第２の誘導型プロモーターと結合すると共に、第２のリガンドの存在下で、第２のリガンドの不在下と比較して、これと作動式に連結された核酸配列の発現を変更する能力を有する、第２のトランス活性化因子。３．）レトロウイルス粒子のためのパッケージ可能なＲＮＡゲノム。ここで前記第１のトランス活性化因子が、前記第２のトランス活性化因子、ＨＩＶＲＥＶ、ＩＬ７ＧＰＩＤＡＦ、及び活性化要素の発現を制御すると共に、ここで前記第２のトランス活性化因子が、ｇａｇポリペプチド、ｐｏｌポリペプチド、レトロウイルスシス作用型ＲＮＡパッケージング要素、及び１又は２以上のエンベロープポリペプチドの発現を制御する。例示的な態様によれば、前記第１のトランス活性化因子が、ｐ６５活性化ドメインに融合されたＦＲＢドメインと、ＺＦＨＤ１ＤＮＡ結合ドメインに融合された１又は２以上のＦＫＢＰドメインとであってもよく、前記第１のリガンドが、ラパマイシンであってもよく、前記第１の誘導型プロモーターが、１又は２以上のＺＦＨＤ１結合部位であってもよい。例示的な態様によれば、前記第２のトランス活性化因子が、ｒｔＴＡタンパク質であってもよく、前記第２のリガンドが、テトラサイクリン又はドキシサイクリンであってもよく、前記第２の誘導型プロモーターが、ＴＲＥプロモーター又は双方向型ＴＲＥプロモーターであってもよい。例示的な態様によれば、前記レトロウイルスシス作用型ＲＮＡパッケージング要素は、ＨＩＶＰｓｉであってもよい。例示的な態様によれば、前記１又は２以上のエンベロープタンパク質は、麻疹ウイルスのＦ及びＨポリペプチドの細胞質ドメイン欠失変異体を含む。例示的な態様によれば、転写遮断薬又はポリＡ配列が、非調節性転写を防止又は低減する遺伝子の近傍に位置していてもよい。ある態様によれば、リボスイッチを有するラパマイシン－ドキシサイクリン誘導型レンチウイルスゲノムを用いてもよい（配列番号８３）。ある態様によれば、ラパマイシン－ドキシサイクリン誘導型ＧａｇＰＯＬＥＮＶを用いてもよい（配列番号８４）。ある態様によれば、ラパマイシン誘導型ＴＥＴアクチベーターを用いてもよい（配列番号８５）。ある態様によれば、ラパマイシンインデューサー誘導型ＲＥＶｓｒｃＶｐｘを用いてもよい（配列番号８６）。

本開示の一部の側面は、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞の形質導入用のレンチウイルス等のレトロウイルスの作製において、パッケージング細胞として使用される細胞であるか、細胞を含む。例によれば、斯かる細胞は、哺乳類細胞である。本発明に係るウイルス（例えば再指示型（redirected）レトロウイルス）のインビトロでの産生のためには、多種多様な細胞の中から任意の細胞を選択することができる。通常は真核細胞、特に哺乳類細胞、例えばヒト、サル、イヌ、ネコ、ウマ、及び齧歯類等の細胞が使用される。ある例によれば、前記細胞はヒト細胞である。更なる例示的な態様によれば、前記細胞は無限に再生可能であり、従って不死である。本発明において有利に使用しうる細胞の例としては、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞、Madin-Darbyイヌ腎臓細胞、ヒト胚性２９３Ｔ細胞、及び斯かる細胞に由来する任意の細胞、例えば２９３Ｔ細胞に由来するgpnlslacZ φＮＸ細胞等が挙げられる。トランスフェクション容易な細胞、例えばヒト胚性腎臓２９３Ｔ細胞等も使用できる。ここで「トランスフェクション容易な」（highly transfectable）とは、少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７０％、最も好ましくは少なくとも約８０％の細胞が、導入されたＤＮＡの遺伝子を発現しうることを意味する。

適切な哺乳類細胞としては、初代細胞及び不死化細胞株が挙げられる。適切な哺乳類細胞株としては、ヒト細胞株、非ヒト霊長目細胞株、齧歯類（例えばマウス、ラット等）細胞株等が挙げられる。適切な哺乳類細胞株としては、これらに限定されるものではないが、ＨｅＬａ細胞（例えば米国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）番号ＣＣＬ－２）、ＣＨＯ細胞（例えばＡＴＣＣ番号ＣＲＬ９６１８、ＣＣＬ６１、ＣＲＬ９０９６）、２９３細胞（例えばＡＴＣＣ番号ＣＲＬ－１５７３）、Ｖｅｒｏ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ－１６５８）、Ｈｕｈ－７細胞、ＢＨＫ細胞（例えばＡＴＣＣ番号ＣＣＬｌＯ）、ＰＣ１２細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１７２１）、ＣＯＳ細胞、ＣＯＳ－７細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５１）、ＲＡＴｌ細胞、マウスＬ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬI.３）、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３）、ＨＬＨｅｐＧ２細胞、Ｈｕｔ－７８、Ｊｕｒｋａｔ、ＨＬ－６０、ＮＫ細胞株（例えば、ＮＫL、ＮＫ９２、及びＹＴＳ）等が挙げられる。

本発明に開示される態様の何れかによれば、組換レトロウイルスを作製する方法は、哺乳類パッケージング細胞をコンフルエンスの５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％まで、或いはピーク細胞密度の２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％まで、或いはピーク細胞密度まで増殖させ、続いて得られた細胞を分割又は希釈することを含んでいてもよい。ある態様によれば、攪拌型タンク反応器を用いて、前記細胞を培養してもよい。ある態様によれば、当業者に公知の方法を用いて、前記細胞を少なくとも約１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１２、１：１５、又は１：２０の比率で分割してもよい。ある態様によれば、前記細胞をピーク細胞密度の２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％に希釈してもよい。ある態様によれば、細胞の分割又は希釈後、第１のリガンドを加える前に、細胞を１、２、３、４、５、６、７、８、１０、又は１６時間、或いは１、２、３、４、５、６、又は７日間培養してもよい。ある態様によれば、細胞を第１のリガンドの存在下で、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、２１、又は２８日間培養してもよい。例示的な態様によればが、第１のリガンドは、例えばラパマイシン又はラパログ（rapalog）である。ある態様によれば、第２のリガンドを加えて、細胞を少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、２１、又は２８日間培養してもよい。例示的な態様によれば、第２のリガンドは、例えばテトラサイクリン又はドキシサイクリンである。その培養条件は使用する細胞及びリガンドに依存し、その方法は本技術分野で公知である。ＨＥＫ２９３Ｓ細胞の培養及び誘導条件の具体的な例を実施例８に記す。

本開示に示すように、組換レトロウイルスは、遺伝子送達のための共通ツールである（Miller, Nature (1992) 357:455-460）。組換レトロウイルスは、再配置されていない核酸配列を、広範な齧歯類、霊長目、及びヒト体細胞に送達する能力を有することから、遺伝子を細胞に輸送するのに非常に適している。ある態様によれば、前記組換レトロウイルスは、αレトロウイルス属、βレトロウイルス属、γレトロウイルス属、δレトロウイルス属、εレトロウイルス属、レンチウイルス属、又はスプマウイルス属に由来するものであってもよい。本開示に示す方法での使用に適したレトロウイルスは多数存在する。例えば、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、藤波肉腫ウイルス（ＦｕＳＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏ－ＭＬＶ）、ＦＢＲマウス骨肉腫ウイルス（ＦＢＲＭＳＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（Ｍｏ－ＭＳＶ）、エーベルソンマウス白血病ウイルス（Ａ－ＭＬＶ）、トリ骨髄腫症ウイルス２９（ＭＣ２９）、及びトリ赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）等を用いることができる。レトロウイルスの詳細なリストは、例えばCoffin et al.（“Retroviruses” 1997 Cold Spring Harbor Laboratory Press Eds: J M Coffin, S M Hughes, H E Varmus pp 758-763）を参照。一部のレトロウイルスのゲノム構造の詳細は公知である。例として、ＨＩＶの詳細は、ＮＣＢＩＧｅｎｂａｎｋから入手可能である（ゲノム受入番号ＡＦ０３３８１９）。

例示的な態様によれば、前記組換レトロウイルスは、レンチウイルス属に由来するものであってもよい。ある態様によれば、前記組換レトロウイルスは、ＨＩＶ、ＳＩＶ、又はＦＩＶに由来するものであってもよい。更なる例示的な態様によれば、前記組換レトロウイルスは、レンチウイルス属のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に由来するものであってもよい。レンチウイルスは、共通のレトロウイルス遺伝子であるｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖに加えて、制御機能又は構造機能を有する他の遺伝子を含む複合型レトロウイルスである。レンチウイルスはその複雑さゆえに、潜伏感染過程のように、生活環の改変が可能である。典型的なレンチウイルスとしては、ＡＩＤＳの病原因子であるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）が挙げられる。インビボでは、ＨＩＶは滅多に***しない最終分化細胞、例えばリンパ球やマクロファージ等に感染可能である。

例示的な態様によれば、本開示にて提供される組換レトロウイルスは、Ｖｐｘポリペプチドを含む。Ｖｐｘポリペプチドは、パッケージング細胞株において、Ｖｐｘをコードする核酸をそのゲノムに導入した後、例えばレトロウイルス膜に組み込まれた細胞膜結合タンパク質として発現されてもよい（Durand et al., J. Virol. (2013) 87: 234-242）。レトロウイルス膜結合Ｖｐｘを、ウイルスプロテアーゼのためのプロセシング配列と共にコンストラクトとしてもよい。それにより、ウイルス粒子に組み込まれた遊離Ｖｐｘが放出される。こうした機能性を有するＶｐｘ融合体の例としては、Ｓｒｃ－ＦＬＡＧ－Ｖｐｘが挙げられる。これは、ｃ－Ｓｒｃの最初の１１アミノ酸の膜標的化ドメイン（ＭＧＳＳＫＳＫＰＫＤＰ）（配列番号２２７）、それに続くウイルスプロテアーゼ切断ドメインＫＡＲＶＬＡＥＡ（配列番号２２８）、及び、それに続くＦｌａｇタグ化Ｖｐｘを含む。

理論に束縛されるものではないが、Ｖｐｘポリペプチドは、制限因子ＳＡＭＨＤ１を分解して、逆転写プロセスの効率を刺激することにより、静止細胞の形質導入を促進する。従って、Ｖｐｘが組換レトロウイルス内に存在する、本開示にて提供される方法を用いて、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を形質導入すると、Ｖｐｘを含む組換レトロウイルスによる細胞の形質導入時に、Ｖｐｘが静止Ｔ細胞又は静止ＮＫ細胞の細胞質内に放出されると考えられる。その後、ＶｐｘがＳＡＭＨＤ１を分解することで、遊離ｄＮＴＰの増加を招き、惹いては前記レトロウイルスゲノムの逆転写が刺激される。

レトロウイルスゲノムサイズ
本開示にて提供される方法及び組成物において、前記組換レトロウイルスゲノム（非限定的な例によればレンチウイルスゲノム等）は、ウイルス粒子内に封入できるポリヌクレオチドの数に制限がある。本開示にて提供されるある態様によれば、前記ポリヌクレオチドエンコーディング領域によりコードされるポリペプチドが、機能活性を保持する短縮体又は他の欠失体であってもよい。こうしたポリヌクレオチドエンコーディング領域をコードするヌクレオチド数は、野生型ポリペプチドのポリヌクレオチドエンコーディング領域をコードするヌクレオチド数よりも少なくなる。ある態様によれば、ポリヌクレオチドエンコーディング領域によりコードされるポリペプチドが、単一のプロモーターにより発現可能な融合ポリペプチドであってもよい。ある態様によれば、単一の融合ポリペプチド及び単一のプロモーターから二以上の機能的ポリペプチドを生成するように、前記融合ポリペプチドは切断シグナルを有していてもよい。更に、最初のエクスビボでの形質導入の後には必要でない一部の機能は、前記レトロウイルスゲノムには含まれず、パッケージング細胞膜を介して前記ウイルス又はレトロウイルスの表面に設けられる。本開示では、これら種々の方策を用いて、レトロウイルスと共に封入される機能的要素を最大化する。

ある態様によれば、封入される組換レトロウイルスゲノムのサイズが、下限が１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、及び８，０００ヌクレオチド、及び、上限が２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、及び１１，０００ヌクレオチドの範囲内としてもよい。封入されるレトロウイルスゲノムは、本開示にて詳細に論じるような、第１及び第２の遺伝子改変（engineering）シグナル伝達ポリペプチドをコードする１又は２以上のポリヌクレオチド領域を含む。ある態様によれば、封入されるべき組換レトロウイルスゲノムが、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、又は１１，０００ヌクレオチド未満であってもよい。本開示の別の箇所で論ずる機能のうち、封入可能なものとしては、レトロウイルスのアセンブリ及びパッケージングに必要なレトロウイルス配列、例えばレトロウイルスｒｅｖ、ｇａｇ、及びｐｏｌコーディング領域、並びに５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲ又はその活性な切断断片、レトロウイルスシス作用型ＲＮＡパッケージング要素をコードする核酸配列、及びｃＰＰＴ／ＣＴＳ要素等が挙げられる。更に、例示的な態様によれば、本開示に記載の組換ウイルス又はレトロウイルスは、以下に挙げるレトロウイルスの機能領域のうち１又は２以上、或いは全てを含んでいてもよく、ある態様によればこれらを逆向きに含んでいてもよい：第１及び第２の遺伝子改変（engineering）シグナル伝達ポリペプチドをコードする、１又は２以上のポリヌクレオチド領域（その少なくとも１つは、リンパ増殖性要素を含むと共に、更にＡＳＴＲを含んでいてもよい。）；第２の改変シグナル伝達ポリペプチド（キメラ抗原受容体を含んでいてもよい。）；インビボ制御要素、例えばリボスイッチ等（これは通常、前記の第１及び／又は第２の遺伝子改変（engineering）シグナル伝達ポリペプチドの発現を制御する）；認識ドメイン、イントロン、標的細胞で活性なプロモーター、例えばＴ細胞、２Ａ切断シグナル、及び／又は、ＩＲＥＳ。

組換レトロウイルス
本開示にて提供される方法及び組成物、例えば、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を形質導入して遺伝子操作Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を作製するための方法及び組成物に関して、組換レトロウイルスが開示されている。これらの組換レトロウイルス自体が本発明の側面である。ある態様によれば、前記組換レトロウイルスは複製不能である。これは即ち、レトロウイルスがパッケージング細胞を離れると、もはや複製できないことを意味する。ある態様によれば、前記組換レトロウイルスは、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、ポックスウイルス、アビポックスウイルス、インフルエンザウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、又はシンドビスウイルスであってもよい。本開示に示す方法をどのように改変して、異なるレトロウイルスに使用するかは、当業者には明らかであろう。例えば、ある態様によれば、ＨＩＶＲＲＥ、及び、ＨＩＶＲｅｖをコードするポリヌクレオチド領域を、Ｎ末端ＲＧＧボックスＲＮＡ結合モチーフ及びＩＣＰ２７をコードするポリヌクレオチド領域によって置換してもよい。ある態様によれば、ＨＩＶＲｅｖをコードするポリヌクレオチド領域を、アデノウイルスＥ１Ｂ５５－ｋＤａ及びＥ４Ｏｒｆ６をコードする１又は２以上のポリヌクレオチド領域によって置換していてもよい。

即ち、ある態様によれば、本開示では、以下を含む組換レトロウイルスが提供される。（ｉ）Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞に結合し、斯かる細胞への組換レトロウイルスの膜融合を促進する能力を有するシュードタイピング要素。（ii）Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞内で活性なプロモーターに作動式に連結された、１又は２以上の転写単位を有するポリヌクレオチド。ここで前記１又は２以上の転写単位は、キメラ抗原受容体抗原特異的標的化領域、膜貫通ドメイン、及び細胞内活性化ドメインを含む第１の改変シグナル伝達ポリペプチドと、リンパ増殖性要素を含む第２の改変シグナル伝達ポリペプチドとをコードする。ここで前記第１の改変シグナル伝達ポリペプチド及び／又は前記第２の改変シグナル伝達ポリペプチドの発現は、インビボ制御要素によって制御される。（iii）前記レトロウイルスの表面に存在する活性化要素。ここで前記活性化要素は、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞に結合可能であるが、前記組換レトロウイルス内のポリヌクレオチドによってコードされるものではない。ある態様によれば、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞において活性であっても、パッケージング細胞株内では活性ではない。本発明に開示される態様の何れかによれば、前記の第１及び第２の改変シグナル伝達ポリペプチドのうち一方は、キメラ抗原受容体を有していてもよく、他方の改変シグナル伝達ポリペプチドは、リンパ増殖性要素を有していてもよい。

遺伝子操作Ｔ細胞及びＮＫ細胞
本開示に記載の方法及び組成物の態様によれば、遺伝子操作されたリンパ球が産生されるが、これらも本発明の別個の側面である。ある態様によれば、遺伝子操作リンパ球とは、リンパ増殖性要素を含む第１の改変シグナル伝達ポリペプチド、及び／又は、キメラ抗原受容体を含む第２の改変シグナル伝達ポリペプチドを発現するように遺伝子操作されたリンパ球、例えばＴ細胞及び／又はＮＫ細胞である。これは、抗原特異的標的化領域（ＡＳＴＲ）、膜貫通ドメイン、及び細胞内活性化ドメインを含む。

本開示に開示される方法及び組成物によれば、前記改変シグナル伝達ポリペプチドの一方又は両方の発現が、通常はインビボ制御要素によって制御され、ある態様によれば、前記インビボ制御要素が、リボスイッチを含むポリヌクレオチドである。ある態様によれば、前記リボスイッチがヌクレオシド類似体に結合可能であり、前記ヌクレオシド類似体が存在する場合には、前記改変シグナル伝達ポリペプチドの一方又は両方が発現される。

本開示に示す遺伝子操作リンパ球の表面には、ポリペプチドが発現されていてもよい。例としては、活性化要素として機能する１又は２以上のポリペプチド、シュードタイピング要素として機能する１又は２以上のポリペプチド、及び／又は、サイトカインを含む１又は２以上の融合ポリペプチド等が挙げられる。ある態様によれば、斯かる遺伝子操作リンパ球は、その表面に活性化要素を有する。斯かる活性化要素は、ＣＤ３に結合可能な膜結合性ポリペプチド、及び／又は、ＣＤ２８に結合可能な膜結合性ポリペプチドを有していてもよい。ある態様によれば、前記活性化要素は、抗ＣＤ３ｓｃＦｖＦｃ異種ＧＰＩアンカー付着配列に連結された、及び／又は、異種ＧＰＩアンカー付着配列に連結されたＣＤ８０である。ある態様によれば、斯かる遺伝子操作リンパ球は、その表面にシュードタイピング要素を有する。ある態様によれば、斯かる遺伝子操作リンパ球は、その表面に融合ポリペプチドを有し、斯かる融合ポリペプチドは、ＤＡＦに共有結合されているサイトカインである。ある態様によれば、前記サイトカインがＩＬ－７又はＩＬ－１５である。例示的な態様によれば、前記サイトカインはＩＬ－７である。ある態様によれば、前記サイトカインは、そのシグナル配列を欠失している。例示的な態様によれば、前記サイトカインは、そのシグナル配列の後のＤＡＦに挿入される。

核酸
本開示では、本開示のポリペプチドをコードする核酸を提供する。ある態様によれば、核酸はＤＮＡ、例えば組換発現ベクターである。ある態様によれば、核酸はＲＮＡ、例えばインビトロ合成ＲＮＡである。

ある例によれば、核酸によって、本開示のポリペプチドの産生、例えば哺乳類細胞における産生が提供される。他の場合では、対象となる核酸によって、本開示のポリペプチドをコードする核酸の増幅が提供される。

本開示のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、例えばプロモーターやエンハンサー等の転写制御要素に、作動式に連結されていてもよい。

適切なプロモーター及びエンハンサー要素は本技術分野で公知である。細菌細胞内での発現に適したプロモーターとしては、これらに限定されるものではないが、ｌａｃｌ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、λＰ及びｔｒｃ等が挙げられる。真核細胞での発現に適したプロモーターとしては、これらに限定されるものではないが、軽鎖及び／又は重鎖免疫グロブリン遺伝子プロモーター及びエンハンサー要素；サイトメガロウイルス前初期プロモーター；単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーター；初期及び後期ＳＶ４０プロモーター；レトロウイルスの側末端反復配列（長末端リピート）に存在するプロモーター；マウスメタロチオネイン－Ｉプロモーター；及び本分野で既知の種々の組織特異的プロモーター等が挙げられる。

適切な可逆的プロモーター、例えば可逆的誘導型プロモーター等も、本技術分野で公知である。斯かる可逆的プロモーターとしては、多様な生物、例えば真核生物や原核生物から単離され、又はこれらの生物に由来するものを使用できる。第１の生物に由来する可逆的プロモーターを第２の生物で使用する場合、例えば第１の生物が原核生物で第２の生物が真核生物の場合や、第１の生物が真核生物で第２の生物が原核生物の場合等における、プロモーターの修飾法は本技術分野で周知である。斯かる可逆的プロモーター、並びに斯かる可逆的プロモーターに基づくが追加の制御タンパク質を含む系としては、これらに限定されるものではないが、アルコール調節性プロモーター（例えば、アルコールデヒドロゲナーゼI（ａｌｃＡ）遺伝子プロモーター、アルコールトランス活性化因子タンパク質（ＡｌｃＲ）に対して反応性を有するプロモーター等）、テトラサイクリン調節性プロモーター（例えばＴｅｔアクチベーター、ＴｅｔＯＮ、ＴｅｔＯＦＦ等を含むプロモーター系）、ステロイド調節性プロモーター（例えばラット糖質コルチコイド受容体プロモーター系、ヒトエストロゲン受容体プロモーター系、レチノイドプロモーター系、甲状腺プロモーター系、エクジソンプロモーター系、ミフェプリストンプロモーター系等）、金属調節性プロモーター（例えばメタロチオネインプロモーター系等）、病因関連調節性プロモーター（例えばサリチル酸調節性プロモーター、エチレン調節性プロモーター、ベンゾチアジアゾール調節性プロモーター等）、温度調節性プロモーター（例えばヒートショック誘導型プロモーター（例えば、ＨＳＰ－７０、ＨＳＰ－９０、ダイズヒートショックプロモーター等）、光調節性プロモーター、合成誘導型プロモーター等）等が挙げられる。

ある例によれば、適切なプロモーターを含む遺伝子座、コンストラクト、又はトランス遺伝子は、誘導型系による誘導を介して不可逆的にスイッチされる。不可逆的スイッチの誘導に適した系は本技術分野で周知である。例としては、不可逆的スイッチの誘導は、Cre-lox媒介組換え法を利用して達成可能である（例えば、Fuhrmann-Benzakein, et al., PNAS (2000) 28:e99を参照。本文献の開示は引用により本開示に組み込まれる。）。本技術分野で既知のリコンビナーゼ、エンドヌクレアーゼ、リガーゼ、組換え部位等の任意の組み合わせを用いて、不可逆的にスイッチ可能なプロモーターを作製することができる。本開示の別の箇所に記載された、部位特異的組換えを行うための方法、機序、及び条件を利用して、不可逆的にスイッチされるプロモーターを作製することができる。斯かる知見は、本技術分野で周知である。例えば、Grindley et al. (2006) Annual Review of Biochemistry, 567-605や、Tropp (2012) Molecular Biology (Jones & Bartlett Publishers, Sudbury, MA)を参照のこと。これらの文献の開示は援用により本開示に組み込まれる。

ある例によれば、プロモーターは、ＣＤ８細胞特異的プロモーター、ＣＤ４細胞特異的プロモーター、好中球特異的プロモーター、又はＮＫ特異的プロモーターである。例えば、ＣＤ４遺伝子プロモーターを用いてもよい。例えば、Salmon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7739、及び、Marodon et al. (2003) Blood 101:3416等を参照のこと。他の例として、ＣＤ８遺伝子プロモーターを用いてもよい。Ｎｅｒｉ（ｐ４６）プロモーターを用いて、ＮＫ細胞特異的発現を達成してもよい。例えば、Eckelhart et al. (2011) Blood 117:1565を参照のこと。

ある態様によれば、酵母細胞における発現に適したプロモーターとしては、例えば構成型プロモーター、例えばＡＤＨｌプロモーター、ＰＧＫｌプロモーター、ＥＮＯプロモーター、ＰＹＫｌプロモーター等；又は調節可能なプロモーター、例えばＧＡＬＩプロモーター、ＧＡＬｌＯプロモーター、ＡＤＨ２プロモーター、ＰＨ０５プロモーター、ＣＵＰｌプロモーター、ＧＡＬ７プロモーター、ＭＥＴ２５プロモーター、ＭＥＴ３プロモーター、ＣＹＣｌプロモーター、ＨＩＳ３プロモーター、ＡＤＨｌプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰＤＨプロモーター、ＡＤＣｌプロモーター、ＴＲＰｌプロモーター、ＵＲＡ３プロモーター、ＬＥＵ２プロモーター、ＥＮＯプロモーター、ＴＰｌプロモーター、及びＡＯＸｌ（例えばPichiaで使用する場合）等が挙げられる。適切なベクター及びプロモーターの選択は、十分に当業者レベルの範囲内である。

原核宿主細胞における発現に適したプロモーターとしては、これらに限定されるものではないが、バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター；ｔｒｐプロモーター；ｌａｃオペロンプロモーター；ハイブリッドプロモーター、例えば、ｌａｃ／ｔａｃハイブリッドプロモーター、ｔａｃ／ｔｒｃハイブリッドプロモーター、ｔｒｐ／ｌａｃプロモーター、Ｔ７／ｌａｃプロモーター；ｔｒｃプロモーター；ｔａｃプロモーター等；ａｒａＢＡＤプロモーター；インビボ調節性プロモーター、例えばｓｓａＧプロモーター、又は関連するプロモーター（例えば米国特許公開第２００４／０１３１６３７号参照）、ｐａｇＣプロモーター（Pulkkinen and Miller, J. Bacterial., 1991: 173(1): 86-93; Alpuche-Aranda et al., PNAS, 1992; 89(21): 10079-83）、ｎｉｒＢプロモーター（Harborne et al. (1992) Mal. Micro. 6:2805-2813）、その他（例えば、Dunstan et al. (1999) Infect. Immun. 67:5133-5141; McKelvie et al. (2004) Vaccine 22:3243-3255; and Chatfield et al. (1992) Biotechnol. 10:888-892参照）；シグマ７０プロモーター、例えばコンセンサスシグマ７０プロモーター（例えばＧｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＸ７９８９８０、ＡＸ７９８９６１、及びＡＸ７９８１８３参照）；静止期プロモーター、例えばｄｐｓプロモーター、ｓｐｖプロモーター等；病原性島ＳＰＩ－２に由来するプロモーター（例えば国際公開第９６／１７９５１号参照）；ａｃｔＡプロモーター（例えばShetron-Rama et al. (2002) Infect. Immun. 70:1087-1096参照）；ｒｐｓＭプロモーター（例えばValdivia and Falkow (1996). Mal. Microbial. 22:367参照）；ｔｅｔプロモーター（例えばHillen,W. and Wissmann, A. (1989) In Saenger, W. and Heinemann, U. (eds), Topics in Molecular and Structural Biology, Protein-Nucleic Acid Interaction. Macmillan, London, UK, Vol. 10, pp. 143-162参照）；ＳＰ６プロモーター（例えばMelton et al. (1984) Nucl. Acids Res. 12:7035参照）等が挙げられる。原核生物（例えば大腸菌）における発現に適した強力なプロモーターとしては、これらに限定されるものではないが、Ｔｒｃ、Ｔａｃ、Ｔ５、Ｔ７、及びＰΛ等が挙げられる。細菌宿主細胞における使用に適したオペレーターの非限定的な例としては、ラクトースプロモーターオペレーター（Ｌａｃｉリプレッサータンパク質は、ラクトースに接触すると立体構造が変化し、これによりオペレーターへの結合を回避する。）、トリプトファンプロモーターオペレーター（ＴｒｐＲリプレッサータンパク質は、トリプトファンと複合体化すると、オペレーターに結合する立体構造を取る；トリプトファンの不在下では、ＴｒｐＲリプレッサータンパク質は、オペレーターに結合しない立体構造を取る）、及びｔａｃプロモーターオペレーター（例えばdeBoer et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25参照）等が挙げられる。

本開示のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、発現ベクター及び／又はクローニングベクター内に存在していてもよい。２つの独立したポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、同一のベクターにクローン化されていてもよく、個別のベクターにクローン化されていてもよい。発現ベクターは、選択可能なマーカー、複製起点、及び、ベクターの複製及び／又は維持を提供する他の特徴要素を含んでいてもよい。適切な発現ベクターとしては、プラスミド、ウイルスベクター等が挙げられる。

当業者には多数の適切なベクター及びプロモーターが知られている。対象となる組換コンストラクトの作製用に多数が市販されている。例として、以下の細菌ベクターが挙げられる。ｐＢｓ、ＰｈａｇｅＳｃｒｉｐｔ、ＰｓｉＸｌ７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ、ｐＢｓＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（Stratagene, La Jolla, CA, USA）；ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３－３、ｐＫＫ２３３－３、ｐＤＲ５４０、及びｐＲＩＴ５（Pharmacia, Uppsala, Sweden）。例として、以下の真核ベクターも挙げられる。ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳＶ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ＰＸＲｌ、ｐＳＧ（Stratagene）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、及びｐＳＶＬ（Pharmacia）。

発現ベクターは通常、異種タンパク質をコードする核酸配列の挿入を可能とするべく、適切な制限部位をプロモーター配列近傍に有する。発現宿主内で作動可能な選択可能なマーカーが存在していてもよい。適切な発現ベクターとしては、これらに限定されるものではないが、ウイルスベクター（例えばワクシニアウイルス；ポリオウイルス；アデノウイルスに基づくウイルスベクター（例えばLi et al., Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549, 1994; Borras et al., Gene Ther 6:515 524, 1999; Li and Davidson, PNAS 92:7700 7704, 1995; Sakamoto et al., H Gene Ther 5:1088 1097, 1999; 国際公開第９４／１２６４９号、国際公開第９３／０３７６９号；国際公開第９３／１９１９１号；国際公開第９４／２８９３８号；国際公開第９５／１１９８４号、及び国際公開第９５／００６５５号参照）；アデノ関連ウイルス（例えばAli et al., Hum Gene Ther 9:81 86, 1998, Flannery et al., PNAS 94:6916 6921, 1997; Bennett et al., Invest Opthalmol Vis Sci 38:2857 2863, 1997; Jomary et al., Gene Ther 4:683 690, 1997, Rolling et al., Hum Gene Ther 10:641 648, 1999; Ali et al., Hum Mol Genet 5:591 594, 1996；Srivastava、国際公開第９３／０９２３９号、Samulski et al., J. Vir. (1989) 63:3822-3828; Mendelson et al., Virol. (1988) 166:154-165; and Flotte et al., PNAS (1993) 90: 10613-10617参照）；ＳＶ４０；単純ヘルペスウイルス；γレトロウイルス；ヒト免疫不全ウイルス（例えばMiyoshi et al., PNAS 94:10319 23, 1997; Takahashi et al., J Virol 73:7812 7816, 1999参照）；レトロウイルスベクター（例えば、マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、並びに他のレトロウイルス、例えばラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血症ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、及び乳腺腫瘍ウイルス等に由来するベクター）等が挙げられる。

前記のように、ある態様によれば、本開示のポリペプチドをコードする核酸は、ある態様によればＲＮＡ、例えばインビトロで合成されたＲＮＡである。ＲＮＡのインビトロ合成の方法は、本技術分野で公知である。既知の方法を用いて、本開示のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＲＮＡを合成することができる。ＲＮＡを宿主細胞に導入する方法は、本技術分野で公知である。例えばZhao et al. (2010) Cancer Res. 15:9053参照。本開示のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＲＮＡの宿主細胞への導入は、インビトロ又はエクスビボで行ってもよく、インビボで行ってもよい。例えば、インビトロ又はエクスビボで、宿主細胞（例えばＮＫ細胞、細胞毒性Ｔリンパ球等）を、本開示のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＲＮＡと共に、電気穿孔することができる。

細胞
本開示は、標的哺乳類細胞を遺伝子改変する組換レトロウイルスを産生する哺乳類細胞株、及び、前記標的哺乳類細胞自体を産生する標的哺乳類細胞を提供する。

適切な哺乳類細胞としては、初代細胞及び不死化細胞株が挙げられる。適切な哺乳類細胞株としては、ヒト細胞株、非ヒト霊長目細胞株、齧歯類（例えばマウス、ラット等）細胞株等が挙げられる。適切な哺乳類細胞株としては、これらに限定されるものではないが、ＨｅＬａ細胞（例えば、米国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）番号ＣＣＬ－２）、ＣＨＯ細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ９６１８、ＣＣＬ６１、ＣＲＬ９０９６）、２９３細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ－１５７３）、Ｖｅｒｏ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ－１６５８）、Ｈｕｈ－７細胞、ＢＨＫ細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬｌＯ）、ＰＣ１２細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１７２１）、ＣＯＳ細胞、ＣＯＳ－７細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５１）、ＲＡＴｌ細胞、マウスL細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬI.３）、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３）、ＨＬＨｅｐＧ２細胞、Ｈｕｔ－７８、Ｊｕｒｋａｔ、ＨＬ－６０、ＮＫ細胞株（例えばＮＫL、ＮＫ９２、及びＹＴＳ）等が挙げられる。

ある例によれば、前記細胞は不死化細胞株ではなく、個人又はエクスビボ細胞から得られる細胞（例えば初代細胞等）である。例えば、ある例によれば、前記細胞は、個人から得られる免疫細胞である。他の例として、前記細胞は、個人から得られる幹細胞又は前駆細胞である。

免疫細胞を活性化する方法
本開示は、免疫細胞をインビトロ、インビボ、又はエクスビボで活性化する方法を提供する。前記方法は通常、微小環境制限本開示のＣＡＲを発現するように遺伝子操作された免疫細胞を、（インビトロ、インビボ、又はエクスビボで）１又は２以上の標的抗原と接触させることを含む。前記微小環境制限ＣＡＲは、１又は２以上の標的抗原の存在下で、免疫細胞を活性化することにより、活性化された免疫細胞を産生する。免疫細胞としては、例えば、細胞毒性Ｔリンパ球、ＮＫ細胞、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、Ｔ制御性（Ｔｒｅｇ）細胞、γδＴ細胞、ＮＫ－Ｔ細胞、好中球等が挙げられる。

遺伝子操作された免疫細胞（例えばＴリンパ球、ＮＫ細胞等）を、１又は２以上の標的抗原と接触させることで、免疫細胞によるサイトカインの産生量を、前記１又は２以上の標的抗原の不在下で前記免疫細胞により産生されるサイトカイン量と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、又は１０倍超、増加させることができる。産生量を増加させる対象となるサイトカインは、これらに限定されるものではないが、例えばＩＬ－２及びＩＦＮ－γが挙げられる。

遺伝子操作された細胞毒性細胞（例えば細胞毒性Ｔリンパ球等）をＡＡＲと接触させることで、細胞毒性細胞の細胞毒性活性を、前記１又は２以上の標的抗原の不在下における細胞毒性細胞の細胞毒性活性と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、又は１０倍超、増加させることができる。

遺伝子操作された細胞毒性細胞（例えば細胞毒性Ｔリンパ球等）を、１又は２以上の標的抗原と接触させることで、細胞毒性細胞の細胞毒性活性を、前記１又は２以上の標的抗原の不在下における細胞毒性細胞の細胞毒性活性と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、又は１０倍超、増加させることができる。

他の態様によれば、例えば宿主免疫細胞によっては、遺伝子操作された宿主細胞を抗原と接触させることで、細胞増殖、細胞生存、細胞死等を増加又は減少させることができる。

微小環境制限抗原特異的標的化領域を作製する方法
ある態様によれば、ＣＡＲの抗原結合ドメイン（本開示では別称「抗原特異的標的領域」又は「ＡＳＴＲ」ともいう）は、その同種の抗原と構成的に結合する。他の態様によれば、前記ＡＳＴＲは微小環境に制限されており、本開示にてより詳細に説明するような、例えば腫瘍微小環境内に存在するような特定の異常な条件下で優先的に、或いは斯かる条件下でのみ、同種の抗原に対して結合することができる。腫瘍微小環境の異常な条件下で優先的又は排他的に結合する微小環境制限ＡＳＴＲは、通常の生理的条件での同抗原への結合が低減するので、オン標的・オフ腫瘍（on-target off-tumor）作用を低減でき、状況によっては免疫アッセイによる検出レベル未満とすることができる、特定の側面によれば、本開示にて提供されるＣＡＲは、標的タンパク質に特異的に結合する微小環境制限ＡＳＴＲを含み、ここで前記ＡＳＴＲは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含むｓｃＦｖ断片である。

本開示に示す側面のある例示的な態様、例えば本開示に示す方法、細胞、細胞系列、レトロウイルス、ポリヌクレオチド、又はベクター等は、微小環境制限抗原特異的標的化領域を含むＣＡＲを含む。

従って、一側面によれば、本開示では、標的抗原に結合するキメラ抗原受容体であって：
ａ）通常の生理的環境と比べ、異常な条件において、前記標的抗原に対する結合の上昇を示す微小環境制限抗原特異的標的化領域であって、前記標的に結合する微小環境制限抗原特異的標的化領域、
ｂ）膜貫通ドメイン、及び
ｃ）細胞内活性化ドメイン
を含むキメラ抗原受容体が提供される。

他の側面において、本開示では、標的抗原に結合するキメラ抗原受容体であって、
ａ）ポリペプチドライブラリーのパニングにより選択されると共に、通常の生理的環境と比べ、異常な条件において、標的抗原結合アッセイによる活性が上昇する、少なくとも１つの微小環境制限抗原特異的標的化領域、
ｂ）膜貫通ドメイン、及び
ｃ）細胞内活性化ドメイン
を含むキメラ抗原受容体が提供される。

本開示に示す任意の側面の一部態様によれば、任意のキメラ抗原受容体が、微小環境に制限されており、それによって、通常の生理的環境と比べ、異常な条件において、結合活性の増加を示すように構成されていてもよい。本開示に示す任意の側面の例示的な態様によれば、前記微小環境制限ＡＳＴＲは、初回ポリペプチドライブラリーのメンバーに突然変異導入／進化を施すことなく、及び／又は、スクリーニングの任意の繰り返しラウンド時又はラウンド間に突然変異導入を行うことなく、初回ポリペプチドライブラリーから同定される。膜貫通ドメイン及び細胞内活性化ドメインの例としては、ＣＡＲとの関連で本開示に示した任意のドメインが挙げられる。

一側面によれば、本開示では、ポリペプチドディスプレイライブラリーのパニングを行うことを含む、微小環境制限ＡＳＴＲを選択する方法であって、前記パニングが、
ａ．前記ポリペプチドディスプレイライブラリーのポリペプチドを、通常の生理的条件下での標的抗原結合アッセイ、及び、異常な条件下での標的抗原結合アッセイに供し、
ｂ．前記生理的条件と比較して、前記異常な条件で標的抗原結合活性の上昇を示すポリペプチドを選択することにより、前記微小環境制限抗原特異的標的化領域を選択する
ことにより行われる方法が提供される。

他の側面において、本開示では、ポリペプチドライブラリーのパニングを行うことを含む、微小環境制限ＡＳＴＲ単離する方法であって、前記パニングが、
前記ポリペプチドライブラリーを、異常な条件下で、固体支持体に結合した標的抗原に接触させ、ここで、前記標的抗原に結合するポリペプチドを発現するクローンは、前記標的抗原を介して前記固体支持体に結合したまま維持され、
前記固体支持体を、結合したポリペプチドと共に、生理的条件下でインキュベートし、
前記生理的条件下で前記固体支持体から溶出するクローンを採取することにより、前記微小環境制限抗原特異的標的化領域を単離する
ことにより行われる方法が提供される。

本開示に示す任意の側面の例示的な態様では、前記微小環境制限抗原特異的標的化領域が、初回ポリペプチドライブラリーのメンバーのメンバーに突然変異導入／進化を施すことなく、及び／又は、スクリーニングの任意の繰り返しラウンド時又はラウンド間に突然変異導入を行うことなく、初回ポリペプチドライブラリーから同定される。

通常の生理的条件としては、温度、ｐＨ、浸透圧、オスモル濃度、酸化的ストレス、及び電解質濃度の条件であって、対象の投与部位又は作用部位の組織又は器官において通常の範囲と考えられる条件が挙げられる。異常な条件とは、これらの条件において、通常許容される範囲から逸脱している条件である。一側面によれば、微小環境制限抗原特異的標的化領域（即ちポリペプチド）は、通常の条件では実質的に不活性であるが、通常ではない条件下では活性であり、通常の条件のレベルと同等又はより優れたレベルである。例えば、一側面によれば、前記微小環境制限抗原特異的標的化領域は、身体温度では実質的に不活性であるが、より低い温度では活性である。他の側面において、前記微小環境制限抗原特異的標的化領域は、前記通常の条件下では、可逆的又は不可逆的に不活性化されてなる。更なる側面によれば、前記微小環境制限抗原特異的標的化領域は、治療タンパク質である。他の側面によれば、前記微小環境制限抗原特異的標的化領域は、薬物又は治療剤として使用される。更に他の側面によれば、前記微小環境制限抗原特異的標的化領域は、肺通過後の血液のように酸素の豊富な血液や、腎臓の血液のように低ｐＨ環境の血液では、概ね活性である。

ある態様によれば、単一ラウンドの選択によって、微小環境制限抗原特異的標的化領域が選択される。ある態様によれば、異常な条件下で抗原に結合し、生理的条件下では抗原に結合しない遊離ポリペプチド、又は斯かる特性を有する試験ポリペプチドを発現する細胞、又は斯かる特性を有する試験ポリペプチドで被覆されたファージを、初回又は以前のラウンドで同定した後、スクリーニング又はパニングを繰り返す。ある方法によれば、収集されたファージを用いて、細胞に感染させてもよい。ここで、収集されたファージを増幅するために、細胞にヘルパーファージを感染させてもよい。細胞表面のポリペプチドを試験する他の方法によれば、収集された細胞を培養して、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを増幅することにより、前記前記細胞により発現されるポリペプチドを「増幅」してもよい。ある態様によれば、同定されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをラウンド間で変異させるプロセスを経ることなく、同定されたポリペプチドを発現する細胞を培養することにより、増幅を行ってもよい。即ち、従前のラウンドで採集されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む細胞を増幅することで、斯かるポリペプチドを濃縮する。

斯かるパニング又はスクリーニングは、一回のみ実施してもよく、１～１０００回繰り返してもよい。例示的な態様によれば、パニングを１～２０回、又は２～１０回、又は２～５回繰り返す。

他の方法によれば、パニングのラウンド間に１又は２以上の変異／進化ラウンドを実施することにより、所期の抗原（即ち標的抗原）に対する微小環境制限ＡＳＴＲを実施する。ある方法によれば、例えばポリペプチド又はタンパク質ライブラリーを生成し、得られたポリペプチド又はタンパク質ライブラリーから、標的抗原に対して所望の結合親和性を示すポリペプチド又はタンパク質をスクリーニングすることにより、野生型タンパク質を同定する。野生型タンパク質が抗体である態様によれば、ポリクローナル又はモノクローナル抗体ライブラリー、例えばファージディスプレイ抗体ライブラリー、例えばファージディスプレイヒト化抗体ライブラリー等を生成し、斯かるライブラリーをスクリーニングすることにより、野生型抗体を発見することができる。

野生型タンパク質を、又は野生型タンパク質をコードする核酸配列を、突然変異生成プロセスに供することにより、変異ポリペプチドの集団を生成し、続いて任意により、この変異ポリペプチドの集団から、通常の生理的環境と比較して、腫瘍環境下及び／又はインビトロ腫瘍代替アッセイ条件下で、活性が増強した（例えば標的抗原に対する結合親和性が増加した）変異ＡＳＴＲを同定することにより、進化させたＡＳＴＲを生成することができる。斯かる方法の例は、国際公開第２０１６／０３３３３１号（“CONDITIONALLY ACTIVE CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS FOR MODIFIED T CELLS”）又は米国特許第８，７０９,７５５号に記載されている。なお、これらの文献は何れも、引用によりその全体が本開示に組み込まれる。微小環境制限抗体を生成する係る方法は、その全体が引用により本開示に組み込まれる。

他の態様によれば、微小環境制限抗原特異的ポリペプチド（即ち標的化領域、例えば抗体等）の同定は、例えば初回ポリペプチドライブラリーを生理的条件下に対し異常条件下にてスクリーニングし、生理的条件下ではなく異常条件下のみで優先的又は排他的に結合する試験ポリペプチドを、初回ポリペプチドライブラリーから得ることにより行うことができる。ある例では、このように初回ポリペプチドライブラリースクリーニングにより初回ポリペプチドライブラリーから同定及び単離された微小環境制限抗原特異的ポリペプチド（即ち標的化領域、例えば抗体等）は、生理的条件下ではなく異常条件下のみで、優先的又は排他的にその同種の抗原に結合する。斯かる例では、変異又は進化のラウンドは全く実施されない。従って、例示的な態様に係る方法は、スクリーニングのラウンド間（例えばパニングのラウンド間）に、単離された微小環境制限抗原特異的標的化領域をコードするポリヌクレオチドを変異させることなく実施され、或いは、生理的条件下に対し異常条件下にて、前記微小環境制限抗原特異的ポリペプチド（即ち標的化領域、例えば抗体等）を同定するための単一の結合アッセイを実施することにより行われる。斯かる方法は、スクリーニング及び／又はパニングのラウンド間に、変異／進化を行うことなく、抗原特異的標的化領域をコードするポリヌクレオチド又はそれを含む宿主生物を、培養、高忠実度増幅、及び／又は、希釈することにより、実施されるものであってもよい。更に、前記方法は、斯かるスクリーニング及び／又はパニングを繰り返すことなく実施されるものであってもよく、また、前記微小環境制限抗原特異的ポリペプチド（即ち標的領域、例えば抗体等）の単離後、単離された微小環境制限抗原特異的標的化領域をコードするポリヌクレオチドに突然変異導入／進化を行うことなく実施されるものであってもよい。

本開示にて提供される方法において、同種の結合パートナーに対するポリペプチドの結合を検出するためのアッセイとしては、細胞に基づくアッセイ、そしてとりわけ、細胞表面ディスプレイ系、例えば哺乳類細胞表面ディスプレイ系等を用いたアッセイが挙げられる。斯かる方法の例によれば、ポリペプチド又は変異ポリペプチドのライブラリー（例えば改変されたポリペプチドのライブラリー等）をコードする核酸を、細胞（例えば哺乳類細胞）内での発現に適したベクターに導入する。続いて、斯かるベクターで細胞をトランスフェクトし、得られた細胞により前記ポリペプチドを発現させる。表面にポリペプチドを発現する細胞のライブラリーを、可溶性又は表面結合性の同種の結合パートナーを含む溶液と接触させてもよい。結合活性の検出は、斯かる表面への細胞の結合を検出可能なアッセイを用いて行ってもよい。また、斯かるポリペプチド又はポリペプチドの機能活性を評価することにより、活性を評価してもよい。本開示にて提供される方法には、当業者に既知の任意の細胞に基づくアッセイを使用できる。例としては、細胞増殖アッセイ、細胞死アッセイ、フローサイトメトリー、細胞分離技術、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、位相差顕微鏡法、蛍光顕微鏡法、受容体結合アッセイ、細胞シグナル伝達アッセイ、免疫細胞化学、及びレポーター遺伝子アッセイ等が挙げられる。ある例では、斯かるアッセイは、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）アッセイである。

斯かるポリペプチド又はタンパク質は、哺乳類細胞により、分泌性可溶性分子、細胞表面分子、又は細胞内抗体として発現されてもよい。ある方法の例によれば、前記細胞の大部分又は全てが細胞表面に係止されたタンパク質ライブラリーのメンバーを提示するような条件下で、細胞をタンパク質ライブラリーによりトランスフェクトすることができる。任意により、トランスフェクトされた哺乳類細胞の大部分において、ゲノムにただ一つのみのプラスミドが組み込まれるような発現系を用いてもよい。即ち、トランスフェクトされた細胞の大部分（即ち、少なくとも約７０％、又は約８０％、又は約９０％）が、１つのポリペプチドの１又は２以上の分子を発現する。その検証は例えば、個々のトランスフェクト細胞を単離及び培養し、次いでその配列を増幅及び配列決定して、単一の配列が含まれているか否かを決定することにより行うことができる。

本開示にて提供される方法のある例では、前記ポリペプチドは、哺乳類細胞の表面に提示された抗体である。本開示に記載の任意の抗体、例えば全長、二価、機能的抗体、例えばＩｇＧ抗体を、哺乳類細胞の表面で発現させることができる。前記抗体は、断片、例えばＦａｂ断片又はｓｃＦｖ断片であってもよい。抗体は、例えばｓｃＦｖ－Ｆｃ等のＦｃ領域を含む断片であってもよく、或いは２つの重鎖と２つの軽鎖とを含む全長抗体であってもよい。当業者であれば、適切な抗体断片を選択することができる。例えば、哺乳類細胞により産生されるＳｃＦｖ－Ｆｃｓ及び全長抗体は、ｓｃＦｖ’ｓやＦａｂ断片と比較して、幾つかの利点を有しうる。

本開示にて提供される結合アッセイにおいて使用可能な固体支持体としては、リガンド、受容体又は抗原等のポリペプチドの結合パートナーに固定可能な任意の担体が挙げられる。通常はハイスループットスクリーニングを容易にするために、固体支持体に同種の結合パートナーを固定する。本開示にて提供される方法による固体支持体として使用可能な担体としては、これらに限定されるものではないが、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミロース、天然及び改変セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、並びに磁気固体支持体、例えば固体支持体、例えばマグネタイト等が挙げられる。固体支持体が、１又は２以上のビーズ又は粒子、マイクロスフェア、或いは試験管、プレート、フィルター膜等の表面、更には本技術分野で公知の他の固体支持体であってもよい。固体支持体系の例としては、これらに限定されるものではないが、扁平に形成された表面、例えばガラス、ケイ素、金属、ナイロン、セルロース、プラスチック等の表面、又は複合材料、例えばマルチウェルプレートや膜等の表面が挙げられる。或いは、ビーズの形態、例えばシリカゲル、制御された多孔ガラス、磁気ビーズ、又はセルロースビーズ等であってもよい。更には、斯かる方法を懸濁液に適用し、或いはカラムの形態で使用してもよい。ある態様によれば、前記微小環境制限抗原特異的ポリペプチド（即ち標的領域、例えば抗体等）が、固定化標的を用いたファージディスプレイ又は酵母表面ディスプレイ（Colby et al., "Engineering Antibody Affinity by Yeast Surface Display," Meth. Enzym. 388, 26 (2004)）抗体（例えばヒト化抗体）ライブラリーの抗原のバイオパニングにより同定及び単離される。例えば、本開示の方法において、ファージディスプレイ又は酵母表面ディスプレイを用いて、天然ヒト化抗体ライブラリー又は合成ヒト化抗体ライブラリーをパニングしてもよい。ある態様によれば、初回ファージディスプレイプロセスにおいて、ファージクローンを哺乳類ベクターに移送し、哺乳類細胞表面スクリーニング法に用いてもよい（例えばYoon et al., BMC Biotechnology 12:62; 1472-6750 (2012)参照）。ファージディスプレイにより微小環境制限抗原特異的標的領域を単離する方法の例を実施例２に示す。

本開示にて提供される方法を用いて同定される微小環境制限ＡＳＴＲとしては、抗体、抗原、リガンド、リガンドの受容体結合ドメイン、受容体、受容体のリガンド結合ドメイン、又はアフィボディ（affibody）等が挙げられる。微小環境制限ＡＳＴＲが抗体である態様の場合、全長抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、（Ｆａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、及び、二価単鎖抗体又は二重特異性抗体（diabody）の何れであってもよい。ここで前記抗原特異的標的化領域は、抗体由来の重鎖及び軽鎖を含む。ある態様によれば、前記微小環境制限ＡＳＴＲは、単鎖可変断片である。斯かる単鎖可変断片は、重鎖及び軽鎖がリンカーにより隔てられていてもよい。斯かるリンカーは、例えば６～１００アミノ酸長である。ある態様によれば、キメラ抗原受容体上で重鎖が軽鎖のＮ末端側に位置する。他の態様によれば、軽鎖が重鎖のＮ末端側に位置する。微小環境制限ＡＳＴＲが、二重特異的ＡＳＴＲであってもよい。

本開示にて提供される方法を用いて同定される微小環境制限ＡＳＴＲは、通常はポリペプチドであり、より具体的にはポリペプチド抗体である。例示的な態様によれば、単鎖抗体である。これらのポリペプチドは、通常の条件下と比較して、異常な条件下でより高い又は低い親和性で、その同種の抗原に対して結合しうる。例示的な態様によれば、通常の条件下よりも異常な条件下で、より高い親和性で結合しうる。ある態様によれば、これらのポリペプチドは、生理的（即ち通常の）条件下よりも異常な条件下で、１０％、２０％、２５％、５０％、７５％、９０％、９５％、又は９９％高い親和性を以て、その同種の抗原に対して結合しうる。ある態様によれば、本開示にて提供される方法で同定されるＡＳＴＲは、通常の生理的条件では、例えば陰性対照抗体等の陰性対照を用いて得られるバックグラウンドレベルを超える検出可能なレベルでは、その同種の抗原に対して結合しない。

本開示にて提供される方法を用いて単離される微小環境制限ＡＳＴＲをコードするヌクレオチド配列は、微小環境制限抗原特異的標的を発現する採集された細胞のヌクレオチドの配列決定により決定することができる。斯かるヌクレオチド配列情報を用いて、微小環境制限抗原特異的標的化領域、膜貫通ドメイン、及び細胞内活性化ドメインを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを作製することにより、微小環境制限生物製剤キメラ抗原受容体（ＭＲＢ－ＣＡＲ）を作製することができる。微小環境制限抗原特異的標的化領域をＣＡＲコンストラクト発現系にクローン化し、これを用いてゲノム内にＣＡＲを含む組換レンチウイルスを生成し、この組換レンチウイルスを用いてＴ細胞を形質導入し、生理学的条件と比較して腫瘍選択的環境下で死亡する標的細胞を発現するＣＡＲ媒介腫瘍抗原の試験に用いてもよい。

条件付き活性のための条件
本開示にて提供される方法によれば、１又は２以上のポリペプチド（例えば単鎖抗体等）の活性を、２つの異なる条件群の下で、２つの異なる生理環境（例えば疾患の微小環境と非疾患の微小環境の通常の生理条件）を模倣する１又は２以上の条件下で、スクリーニング又は試験する。斯かる条件は通常、インビトロにて模倣又は再現可能な条件である。ある条件群は、疾患に関連する微小環境を模倣する１又は２以上の条件を含んでいてもよい。疾患は細胞内及び細胞外の恒常性を変更しうる。例えば、疾患の微小環境は、腫瘍微小環境又は癌微小環境における１又は２以上の条件を模倣しうる。通常は、２つの条件群の下での活性の１又は２以上の差異は、分子の条件付き活性に繋がりうる。即ち、前記第１の条件群（例えば腫瘍微小環境の条件を模倣する条件）下で、前記第２の条件群（例えば通常又は非疾患の環境の条件を模倣する条件）下よりも大きな活性を示す分子は、微小環境に制限されている候補分子として同定される。

例えば本開示に記載の、或いは当業者に既知の２つの生理環境下で、異なる１又は２以上のパラメーターを変更することで、２つの条件群を選択することができる。斯かる条件では、これらに制限されるものではないが、化学的条件、生物学的条件、又は物理的条件が挙げられる。２つの条件群の間で変更しうるパラメーターとしては、例えば圧力、温度、ｐＨ、イオン強度、浸透圧、オスモル濃度、酸化的ストレス、濁度、光暴露（例えばＵＶ、赤外線、又は可視光線等）、１又は２以上の溶質の濃度、例えば電解質、グルコースの濃度、ヒアルロナンの濃度、乳酸又は乳酸塩の濃度、アルブミンの濃度、アデノシンのレベル、Ｒ－２－ヒドロキシグルタレート（glutarate）のレベル、ピルビン酸の濃度、酸素の濃度、及び／又は、酸化剤、還元剤、若しくは共因子の存在等から選択される、１又は２以上の条件が挙げられる。較正溶液の電解質及び緩衝系を変更することで、生理的条件、例えばｐＨ、緩衝能力、イオン環境、温度、グルコース濃度、及びイオン強度等を、模倣すべき生物学的環境に合わせて調整することができる。通常の生理環境を模倣する条件群を、本開示に記載の１又は２以上の条件において、疾患の微小環境（例えば腫瘍微小環境等）を模倣する条件群とは異なるものとして選択することができる。

例えば、以下に論じるように、腫瘍微小環境の種々のパラメーターは、非腫瘍微小環境と比較して異なる。斯かるパラメーターとしては、これらに制限されるものではないが、酸素濃度、圧力、共因子の存在、ｐＨ、ヒアルロナン濃度、乳酸濃度、アルブミン濃度、アデノシンのレベル、Ｒ－２－ヒドロキシグルタレート（glutarate）のレベル、ピルビン酸濃度等が挙げられる。これらのパラメーターの何れかを、非腫瘍又は通常の環境下で存在する条件と比較して、腫瘍又は癌の環境下で存在する１又は２以上の条件を模倣するように、インビトロで再現してもよい。模倣可能な通常の生理条件としては、身体の任意の場所（例えば消化管、皮膚、血管系、血液、及び細胞外マトリックス等）の健常組織又は非疾患組織に見いだされる環境が挙げられる。通常は、本開示に記載のアッセイにおいて、タンパク質の活性を評価するのに使用される緩衝剤を選択することにより、生理条件をインビトロで模倣してもよい。例えば、前記アッセイで活性を評価するのに使用されるアッセイ緩衝剤の差異により、疾患の微小環境（例えば腫瘍微小環境等）及び非疾患環境の１又は２以上の条件を模倣してもよい。それゆえ、微小環境制限ポリペプチドを同定する本開示の方法では、アッセイ緩衝剤の１又は２以上の成分又は特徴を、第１の条件下での活性を試験する第１のアッセイと第２の条件下での活性を試験する第２のアッセイとで変更し、或いは異なるように設定する。例えば、本開示にて議論するように、腫瘍微小環境の種々のパラメーターが、非腫瘍環境と比較して異なる。斯かるパラメーターとしては、これらに制限されるものではないが、酸素、圧力、共因子の存在、ｐＨ、ヒアルロナン濃度（例えばより高い又はより低いヒアルロナン濃度）、乳酸塩濃度（例えばより高い又はより低い乳酸塩濃度）、アルブミン濃度（例えばより高い又はより低いアルブミン濃度）、アデノシンのレベル（例えばより高い又はより低いアデノシンレベル）、Ｒ－２－ヒドロキシグルタレート（glutarate）のレベル（例えばより高い又はより低いＲ－２－ヒドロキシグルタレート（glutarate）レベル）、及び、ピルビン酸濃度（例えばより高い又はより低いピルビン酸濃度）等が挙げられる。より具体的に、腫瘍微小環境の条件としては、非腫瘍微小環境と比較して、例えばより低いｐＨ、より高いヒアルロナン濃度、より高い乳酸及びピルビン酸濃度、より高いアルブミン濃度、より高いアデノシンレベル、より高いＲ－２－ヒドロキシグルタレート（glutarate）レベル、低酸素症、より低いグルコース濃度、及び僅かに高い温度等が挙げられる。例えば、微小環境制限ＡＳＴＲは、通常の身体温度では実質的に不活性であるが、腫瘍微小環境のより高い温度では活性である。更に他の側面によれば、前記微小環境制限抗体は、通常の酸素豊富血液中では活性に劣るが、腫瘍内に存在するより酸素の少ない環境下ではより活性に優れる。更に他の側面によれば、前記微小環境制限抗体は、通常の生理的ｐＨ７．２～７．８では活性に劣るが、腫瘍微小環境に存在する酸性ｐＨ５．８～７．０又は６．０～６．８ではより活性に優れる。例えば、前記微小環境制限抗体はｐＨ７．４よりもｐＨ６．７ではより活性に優れる。当業者に既知の腫瘍微小環境の条件の中で、条件により活性なＡＳＴＲが異なる結合親和性を示すような、本発明で使用可能な条件は他にも存在する。これらインビボの腫瘍条件を模したインビトロアッセイ条件を、本開示ではインビトロ腫瘍代替アッセイ条件と呼ぶ。

特定のアッセイ緩衝剤を選択することで、これらの条件のうち任意の１又は２以上をインビトロで模倣することができる。疾患の微小環境を模倣するアッセイ緩衝剤の組成は、疾患の微小環境下において変更されていることが既知又は本開示に記載の１又は２以上の条件を除いて、通常の環境を模倣するアッセイ緩衝剤の組成と同じとなるように選択することができる。更に、２つの異なる条件群の下で１又は２以上のポリペプチドの活性をスクリーニング又は同定する際に、通常はインビボの微小環境を模倣する緩衝剤条件に関する条件のみを、前記アッセイで変更する。前記アッセイの他の条件、例えば時間、温度、及びインキュベーション条件等は、両条件群で同一とすることができる。通常は、疾患の微小環境を模倣する条件群と、通常の微小環境を模倣する条件群とで、同一の基準緩衝剤を用いるが、１又は２以上のパラメーターにおいて、緩衝剤組成の設計を異なるものとしてもよい。斯かるパラメーターとしては、例えばｐＨ、酸素、圧力、共因子の存在、ｐＨ、ヒアルロナン濃度（例えばより高い又はより低いヒアルロナン濃度）、乳酸塩濃度（例えばより高い又はより低い乳酸塩濃度）、アルブミン濃度（例えばより高い又はより低いヒアルロナン濃度）、及び／又は、ピルビン酸濃度（例えばより高い又はより低いピルビン酸濃度）等が挙げられる。疾患の微小環境を模倣する条件群と、通常の微小環境を模倣する条件群とにおいて、当業者に既知の任意の基準緩衝剤を用いることができる。

微小環境制限細胞を生成する方法
本開示は、微小環境制限細胞を生成する方法を提供する。斯かる方法は通常、本開示の微小環境制限ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクター（例えばプラスミド又はレトロウイルス等）又はＲＮＡ（例えばインビトロで転写されたＲＮＡ等）を用いて、哺乳類細胞を遺伝子的に改変することを含む。斯かる遺伝子操作細胞は、１又は２以上の標的抗原の存在下、微小環境に制限されていてもよい。斯かる遺伝子改変は、インビボ、インビトロ、又はエクスビボで実施することができる。前記細胞は、免疫細胞（例えばＴリンパ球、Ｔ－ヘルパー細胞、又はＮＫ細胞等）、幹細胞、前駆細胞等であってもよい。

ある例によれば、斯かる遺伝子改変は、エクスビボで実施される。例えば、Ｔリンパ球、幹細胞、Ｔ－ヘルパー細胞、又はＮＫ細胞を、個人から取得し、次いで、個人から取得した斯かる細胞を、本開示のＣＡＲを発現するように遺伝子操作する。斯かる遺伝子操作された細胞は、１又は２以上の標的抗原の存在下で微小環境に制限することが可能である。ある例によれば、斯かる遺伝子操作細胞を、エクスビボで活性化する。他の場合では、斯かる遺伝子操作細胞を個人（例えば前記細胞を取得した個人）に導入し、次いで斯かる遺伝子操作細胞をインビボで活性化する。例えば、斯かる個人の細胞表面に１又は２以上の標的抗原が存在する場合には、前記抗原を投与する必要は無い。斯かる遺伝子操作細胞が個人の細胞表面に存在する抗原と接触することで、遺伝子操作細胞が活性化される。例えば、遺伝子操作細胞がＴリンパ球である場合、斯かる遺伝子操作された細胞は、前記ＣＡＲが表面に結合する１又は２以上の標的抗原を発現する細胞に対して、細胞毒性を発揮する。

腫瘍微小環境感受性ＣＡＲ－Ｔ標的結合を一時的に低減する方法
本開示では、血管及び組織ｐＨを薬理学的に修飾することにより、腫瘍微小環境感受性ＣＡＲ－Ｔ標的結合を一時的に減少させる方法が提供される。ＣＡＲ-Ｔ細胞のｓｃＦｖを微小環境的に制御することにより、オン標的オフ腫瘍（on-target off-tumor）毒性に対する追加のレベルの保護を提供し、惹いては腫瘍限局環境条件がＴ細胞の関与を可能とすることが必要となる。一部のモノクローナル抗体治療においては魅力的であるが、養子細胞治療はそのＣＡＲ－Ｔ標的を一時的に許容する局所環境を生じる場合がある。例えば、局所組織にて活性化されるＣＡＲ-Ｔ細胞は、ＣＡＲコンストラクト内に存在する細胞質ドメインによっては、更に局所ｐＨを低下させる場合がある。他の例では、サイトカイン放出性症候群や、養子細胞治療に関連する他の罹患状態により、結果として血液の重炭酸緩衝能力が低下し、乳酸アシドーシスを生じる場合がある。静脈内注入により投与される養子細胞治療は、結果として一時的な肺での捕捉を招くことが知られている。一部の細胞治療では、注入速度の調節には溶存酸素の継続的な監視が欠かせない（Fischer et al. Stem Cells Dev. 2009 Jun; 18(5): 683-691）。肺捕捉の程度は細胞サイズ、活性化状態、細胞用量、及び注入速度に依存する。Cruz et al（Cytotherapy. 2010 Oct; 12(6): 743-749）は、３００を超えるＴ細胞注入からの知見として、用量を低減し、注入速度を低下させれば、肺捕捉を低減できると報告している。しかし、特定の強力なＣＡＲ-Ｔ細胞を用いた場合、肺内皮に低レベルで存在するＨｅｒ２等の標的でさえも（Morgan et al. Mol Ther. 2010 Apr; 18(4): 843-851）、注入後の肺における初回の高いＣＡＲ-Ｔ細胞濃度、及びこれら組織におけるこれらのＴ細胞標的の存在ゆえに。制御できないような即時の毒性を引き起こし、結果として患者の急速な悪化を招く可能性がある。他の場合では、他のオフ標的（off target）組織（例えば胆管等）におけるＴ細胞標的の存在が、制御不能なオン標的オフ腫瘍（on-target off-tumor）毒性を招く可能性があり（Lamers Mol Ther. 2013 Apr;21(4):904-12）、その結果、他の剤（例えばステロイドや細胞排出エピトープ等）を利用できる前に、重篤な器官毒性を招くおそれがある。静脈及び動脈血漿はアシドーシスに対する強力な緩衝能力を有するのに対し、養子細胞治療を受ける癌患者には、呼吸性アシドーシス、ショック・代謝性アシドーシス、及び虚血性アシドーシスの条件が生じる可能性がある。

ある態様によれば、特定の条件において血管ｐＨを一時的に上昇させることにより、微小環境において制御されるｓｃＦｖの抗原に対する親和性を低下させる方法が提供される。血液ｐＨが０．４Ｕシフトすると、特定のｓｃＦｖの親和性が１０分の一以下に低下する。ある態様によれば、治療時のｐＨの制御を、ＩＶ又は経口投与経路を通じて達成してもよい。ある態様によれば、結合親和性の不活性化を、重炭酸により達成してもよい。他の態様によれば、トリス－ヒドロキシルメチルアミノメタン（別名トロメタミン、トロメタモル、及びＴＨＡＭ）及びカルビカルブ（Carbicarb）^{（登録商標）}（及び重炭酸ナトリウム及び炭酸ナトリウムの等モル高張液）を用いて、オン標的オフ腫瘍（on-target off-tumor）毒性を軽減するのに十分なレベルまで血液ｐＨを上昇させてもよい。更に他の態様によれば、小分子プロトンポンプ阻害剤を用いて、オン標的オフ腫瘍（on-target off-tumor）毒性を軽減するのに十分なレベルまで血液ｐＨを上昇させることもできる。プロトンポンプ阻害剤としては、これらに限定されるものではないが、エソメプラゾール（Nexium）、エソメプラゾール及びナプロキセン（Vimovo）、ランソプラゾール（Prevacid）、オメプラゾール（Prilosec及びZegerid）、及びラベプラゾール（Aciphex）が挙げられる。プロトンポンプ阻害剤を長期間投与することにより、抗原結合ドメインの同種抗原に対する結合親和性を、数日、数週間、数か月、又は数年に亘って有効に改変することができる。他の態様によれば、トランスポーター及びポンプの転写、翻訳、膜発現、及び安定性を制御して血液ｐＨ及び／又は組織ｐＨを改変することによっても、抗原結合ドメインの同種抗原に対する親和性を改変することができる。ｐＨを改変するための斯かるトランスポーター及びポンプの例としては、これらに限定されるものではないが、プロトンポンプ、ナトリウムプロトン交換輸送体ファミリー（ＮＨＥ）、重炭酸トランスポーターファミリー（ＢＣＴ）、及びモノカルボン酸トランスポーターファミリーのメンバーが挙げられる。ある態様によれば、ｐＨ制御ｓｃＦｖを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞の患者への注入前又は注入と同時に、重炭酸、ＴＨＡＭ、又はカリカルブ（Caricarb）^{（登録商標）}を投与してもよい。斯かる処置によって、ＣＡＲ-Ｔ細胞の注入による一時的な肺捕捉により生じうる急性の細胞毒性を軽減することができる。

更なる態様
ある態様によれば、本開示にて提供される方法は、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞内で発現される１又は２以上の内因性遺伝子の発現を防止することを含む。本開示にて提供される方法は、斯かる方法に使用可能なｍｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを発現する組換レトロウイルスを作製できることを明らかにする。実際に、本開示にて提供される方法は、斯かるｍｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡが、イントロン（例えばＥｆ１ａイントロン等）内にコードされてもよいことを明らかにする。これは、パッケージ可能なレトロウイルスゲノムに含有可能な機能的要素を最大化できるという、本発明の方法による教示の利点を利用して、従来の教示による欠点を克服すると共に、斯かる組換レトロウイルスの養子Ｔ細胞治療における有効性を最大化するものである。

ある態様によれば、本開示にて提供される方法を用いることで、以下の標的内因性Ｔ細胞発現遺伝子のうち１又は２以上をコードする核酸に結合するｍｉＲＮＡを、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個、例示的な態様によれば２～５個、例えば４個、組換レトロウイルスゲノム内に含有させて、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞に送達することができる。実際に、本開示にて提供されるように、１、２、３、又は４個のｍｉＲＮＡを、単一のイントロン（例えばＥＦ１ａイントロン）内に入れて送達してもよい。Ｔ細胞で発現される標的内因性遺伝子としては、例えば以下が挙げられる（その不活性化により期待される非限定的な利点を括弧書きで付記する）。ＰＤ－１（不活性化防止）；ＣＴＬＡ４（不活性化防止）；ＴＣＲａ（安全性・自己免疫防止）；ＴＣＲｂ（安全性・自己免疫防止）；ＣＤ３Ｚ（安全性・自己免疫防止）；ＳＯＣＳ（不活性化防止）；ＳＭＡＤ２（不活性化防止）；ｍｉＲ－１５５（活性化促進）；ＩＦＮγ（ＣＲＳ低減）；ｃＣＢＬ（シグナル伝達延長）；ＴＲＡＩＬ２（致死防止）；ＰＰ２Ａ（シグナル伝達延長）；ＡＢＣＧ１（コレステロールのクリアランスの制限によるコレステロールマイクロドメイン濃度増加）。

ある態様によれば、類似の有用性が期待される標的遺伝子に対するｍｉＲＮＡを組み合わせてもよい。他の態様によれば、相補的な有用性を有する標的遺伝子に対するｍｉＲＮＡを組み合わせてもよい。ある態様によれば、斯かる組み合わせには、例えばＣＤ３Ｚ、ＰＤ１、ＳＯＣＳ１、及び／又は、ＩＦＮγが含まれてもよい。

処置方法
本開示は、ＣＡＲを用いた種々の処置方法を提供する。本開示のＣＡＲは、Ｔリンパ球又はＮＫ細胞に存在する場合、標的細胞に対する細胞毒性を媒介することができる。本開示のＣＡＲは、標的細胞に存在する抗原に結合することにより、前記ＣＡＲを産生するように遺伝子操作されたＴリンパ球又はＮＫ細胞による標的細胞の駆除を媒介することができる。前記ＣＡＲのＡＳＴＲが標的細胞の表面に存在する抗原に結合する。

本開示は、標的細胞を死滅させ、又は標的細胞の成長を抑制する方法であって、対象ＣＡＲを産生するように遺伝子操作された細胞毒性免疫エフェクター細胞（例えば細胞毒性Ｔ細胞、又はＮＫ細胞等）に標的細胞を接触させることにより、斯かるＴリンパ球又はＮＫ細胞に標的細胞の表面に存在する抗原を認識させ、前記標的細胞を死滅させることを媒介することを含む方法を提供する。

本開示は、疾患又は障害を有する個人の疾患又は障害を治療する方法であって、ａ．ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを、前記対象から得られた末梢血細胞に導入して、遺伝子改変された細胞毒性細胞を作製し、ｂ．得られた遺伝子改変細胞毒性細胞を前記対象に投与することを含む方法を提供する。

処置に適した対象
本開示に提示される方法及び組成物を用いた処置に適した対象は種々存在する。適切な対象としては、任意の個人（例えばヒト又は非ヒト動物）であって、疾患又は障害を有する個人、疾患又は障害を有すると診断された個人、疾患又は障害を発症するリスクを有する個人、疾患又は障害を過去に有していた経験があり、再発のリスクを有する個人、疾患又は障害の治療剤による治療を受けたが斯かる処置に応答しなかった個人、又は、疾患又は障害の治療剤による治療を受け、斯かる処置に初回は応答したが、その後再発した個人等が挙げられる。

免疫調節方法による処置に適した対象としては、自己免疫障害を有する個人、器官又は組織移植の受容者である個人、免疫不全の個人、及び、病原体に感染している個人等が挙げられる。

例示的な態様の例として、以下に非限定的な実施例をあげるが、これらはあくまでも例示を目的とするものであり、本開示の範囲及び趣旨を何ら限定するものではない。また、本開示にて記載又は請求される何れの発明も、本開示に記載の１又は２以上の特徴のあらゆる変形、組合せ、及び配列を包含すると解される。また、具体的な除外が本開示に明示的に記載されていない場合でも、任意の１又は２以上の特徴を請求項から明確に除外することができる。また、当業者が別途理解する場合を除き、ある方法に使用されるある試薬の開示は、本開示に示す具体的な方法又は本技術分野で公知の他の方法の何れかに従う、斯かる試薬を用いた方法と同義である（また、そのためのサポートを提供する）ことを意図しているものと解される。更に、当業者が別途理解する場合を除き、明細書及び／又は請求項がある方法を開示する場合、斯かる方法には、本開示に示す任意の１又は２以上の試薬を用いることができる。

実施例１．ヌクレオシド類似体抗ウイルス薬に特異的に応答するリボスイッチの作製
本実施例は、グアノシン及びデオキシグアノシンに結合する天然構造的リボスイッチに基づくライブラリーのスクリーニング法を提供する。これらのリボスイッチを骨格として使用することで、リガンドヌクレオシド類似体に特異的に結合するアプタマーの選択用の偏向ライブラリーを構築する。従前、等温滴定熱量計を用いて、これらの天然リボスイッチがその天然のリガンドに結合することが示された。追加の試験により、デオキシグアノシンスイッチは、ヌクレオシド類似体であるアシクロビル及びペンシクロビルとも弱い相互作用を生じることが示された結果、この配列は新たなライブラリーへと再設計された。斯かるリボスイッチの単一鎖領域を標的として変異させ、アシクロビル又はペンシクロビルに対して特異的に応答する変異配列を選択した。

材料
選択成分となるグアニン、グアノシン、デオキシグアノシン、アシクロビル、及びペンシクロビルはSigma-Aldrich（St. Louis, MO）から入手した。アシクロビルは初回標的であり、ペンシクロビルは特に興味ある被分析物として後のラウンドに使用され、グアニン、グアノシン、及びデオキシグアノシンは反標的として使用した。分画培地として使用する酸化グラフェン（ＧｒＯ）はAngstron Materials（Dayton, OH）から購入した。ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）及びＭｇＣｌ_２はAmersco LLC.（Solon, OH）から購入した。ＫＣｌはTeknova（Hollister, CA）から購入した。選択緩衝剤は５×濃度（１×は５０ｍＭＨＥＰＥＳ、１００ｍＭＫＣｌ、２０ｍＭＭｇＣｌ_２、ｐＨ７．３）で調製した。予備分析及びアプタマースクリーニングのために、標的、反標的、及びオリゴはヌクレアーゼを含まない水で再構成した。何れの標的についても、保存期間の最大化のため、アリコートは－２０℃で調製及び保存した。

アプタマーライブラリーの生成
初回アプタマーライブラリーテンプレートは、IBA GmbH（Gottingen, Germany）により、図１４に示す配列の逆相補鎖として合成された。図１４において、四角内のヌクレオチドは、既知の配列を一本鎖にしたものであり、原標的の類似体に対してよりよく結合するように、「変異」を導入してある。実線四角内のヌクレオチドは、置換変異を許容したヌクレオチドであり、点線四角内のヌクレオチドは、置換変異及び挿入又は欠失を許容したヌクレオチドである。プライマーは、IDT（Coralville, IA）により一本鎖ＤＮＡとして合成された。Ｔ７プライマー（配列番号２４０）をライブラリーテンプレート配列と組合せ、チタンＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Clontech; Mountain View, CA）によるプライマー伸長に供した。プライマー伸長された材料を、Ampliscribe T7高収率転写キット（Epicentre; Madison, WI）を用いた転写に供し、続いて８Ｍ尿素を用いた１０％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で精製してから選択に使用した。選択時には、逆プライマー（配列番号２４１）を用いて、SuperScript IV逆転写酵素（Invitrogen; Carlsbad, CA）によりライブラリーを逆転写し、チタンＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Clontech; Mountain View, CA）を用いて増幅した。配列番号２４８のアプタマーは、-３～-１のJ２-３ループ変異を有すると共に、～２．２５×１０^１０の多様性を有する。配列番号２５０のアプタマーは、０（native）～＋５のJ２-３ループ変異を有すると共に、～９．３８×１０^１４の多様性を有する。２つのオリゴヌクレオチド（配列番号２４９及び２５０）を１：４１６０の比で混合し、混合後のライブラリープールで等モルの多様性を得た結果、最終的な多様性は～９．３８×１０^１３となった。

ライブラリースクリーニング
酸化グラフェン－リガンドの体系的進化を用いて、指数関数的濃縮（ＧＯ－ＳＥＬＥＸ）アプローチにより、ライブラリースクリーニングを実施した（図１５）（Park et al., 2012）。π－π相互作用により酸化グラフェンに一本鎖核酸への高親和性を付与する利点を利用した（Zeng et al., 2015）。その目標は、１×選択緩衝剤又は反標的（グアニン、グアノシン、及びデオキシグアノシン）とは相互作用しないが、陽性標的アシクロビルに結合する配列を選択することである。

各ラウンドにおいて、所与の量のライブラリーに対し、１×選択緩衝剤内で再び折り畳みを生じさせた（９０℃で５分間の変性、４℃で５分間、続いて室温）。次に、再折り畳みライブラリーに反標的を加え、３７℃で３０分間インキュベートした。例外として、ラウンド１及び２では、反標的を加える時間を短くし（＜１分間）、ライブラリーがＧｒＯに付着するのを促進した。前記ライブラリーと反標的及び緩衝成分とを相互作用させた後、３７℃で１０分間のインキュベーションを行い、結合していないライブラリーをＧｒＯに付着させた（ラウンド開始時のライブラリーの質量と等量～１００倍量）。続いて、溶液を７，０００×ｇで遠心分離し、ＧｒＯを沈殿させた。反標的に結合した配列及び／又は緩衝剤を含む上清を除去した。続いて、沈殿物を２００μＬの１×選択緩衝剤で２度洗浄し、７，０００×ｇで遠心分離し、各洗浄後に上清を除去した。次に、陽性標的含有溶液を加え、表１に示す条件で、３７℃で最大～６０分間かけて、ＧｒＯからライブラリーを溶出させると共に、ライブラリーとの結合について実質的に前記標的を酸化グラフェンと競合させた。前記標的により強く結合した配列は、酸化グラフェンから脱着し、インキュベーションの終了時にも前記標的に結合したまま維持される。最後の遠心分離工程によって、酸化グラフェンに結合したままの非反応性ライブラリーから、遊離材料が分離されて上清内に移行する。

陽性選択の後、回収されたＲＮＡを、８Ｍ尿素を含む１０％変性ＰＡＧＥを用いて精製し、次いで分光光度計の読み取りを用いて定量し（表１）、SuperScript IVで逆転写し、ＰＣＲ with チタンＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲで増幅した。増幅産物をＲＮＡに転写し、次ラウンドの選択に供した。

選択時には三段階のストリンジェンシーを用いた（表１）。前述のように、最初の２ラウンドの選択では反標的に対するスクリーニングを含めず、ライブラリーのＧｒＯへの付着を最大化した。更に、大過剰量のアシクロビルを用いて陽性インキュベーションを行い、ライブラリーの回収を最大化した。即ち、低ストリンジェンシーを指定した。ライブラリーの回収を達成した後に、中ストリンジェンシー条件として、反標的インキュベーションを導入した。また、これら３つのラウンドの間、アシクロビルのライブラリーに対する比率を低減し、標的への結合についてライブラリーの競合を増加させた。１０％以上の回収が達成された後、最終ラウンドでは高ストリンジェンシーの選択を実施した。反標的／ライブラリー比は高いまま維持し、陽性標的／ライブラリー比は１：１にすると共に、陽性インキュベーション時間を短縮し、より早く結合する配列を選択した。２ラウンド超の高ストリンジェンシー条件の後にライブラリーの回収率が１０％超であることが示されたら、平行評価を実施した。

表１．選択及び評価条件。各ラウンドの選択又はインキュベーションに用いた条件と共に、各ラウンドで回収された試料と導入したライブラリーとの比率を回収率として示す。選択過程を通じてライブラリーの濃縮率を監視した。＊反標的を、延長されたインキュベーションではなく、付着のために使用。†プールされた反標的と共に付着前インキュベーションを実施。‡陽性標的であるアシクロビルと共に付着前インキュベーションを実施。これは交差反応を生じる種の回収率を最小化するために行った。この表では以下の略称を用いた。“X-Targets”は反標的；“(+) Targets”はアシクロビル又はペンシクロビル；“(+) Incubation Time (min)”は時間；“Library: (+) Targets”溶液はＧｒＯ上でインキュベートした。G0は第０世代、以下同様；R1は第１ラウンド、以下同様。平行評価（並行の1及び並行の2）では、以下と共にインキュベーションを実施した：(-) １×選択緩衝剤のみ、(X) 反標的を加えた１×選択緩衝剤、(+) アシクロビルを加えた１×選択緩衝剤、及び、(P) ペンシクロビルを加えた１×選択緩衝剤。

これら２つの平行評価では、評価対象ライブラリーを４つの等量の部分に分け、前述のような調製及び再折り畳みに供した（図１６）。各条件について、５０ｐモルのライブラリーを１×選択緩衝剤と混合し、再折り畳みを生じさせ（９０℃で５分間、４℃で５分間）、続いて１×選択緩衝剤中、２００μＬの１０μＭの反標的と混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。続いてこれらの試料を、試料中のライブラリーの質量と等量～１００倍量の酸化グラフェンに付着させ、３７℃で１０分間インキュベートした。その後、以前と同様に２００μＬの１×選択緩衝剤で洗浄した。酸化グラフェンに付着した試料を２００μLの適切な評価条件（第１の平行評価では、１×選択緩衝剤のみ、１０μＭのプールされた反標的、１μＭのペンシクロビル、１μＭのアシクロビル、又は、第２の平行評価では、０．５μＭアシクロビル；表１ではこれらの条件をそれぞれ：（－）；（Ｘ）；（Ｐ）；（＋）；及び（＋）と記す。）と共に、１×選択緩衝剤中、３７℃で３０分間インキュベートした。最終の遠心分離工程によって、脱着した反応性ライブラリーを非反応性の酸化グラフェン結合ライブラリーから分離した。この反応性ライブラリーを、分光光度計の読み取りを用いて定量し（表１）、８Ｍ尿素を含む１０％変性ＰＡＧＥを用いて検証し、第２の平行評価に供した。陽性試料の付着前インキュベーションには反標的を用いて、他の試料の前インキュベーションの各々については陽性標的アシクロビルを用いて、追跡評価を行った。これは、所与の試料中で交差反応を示す配列の発生を最小化するために行った（即ち、陽性試料中での反標的に対する反応性、陰性、反標的、又はペンシクロビル試料中でのアシクロビルに対する反応性）。第２の平行評価から回収された材料を、分光光度計の読み取りを用いて定量し（表１）、８Ｍ尿素を含む１０％変性ＰＡＧＥを用いて検証し、逆転写による配列決定、次いでＰＣＲによる二本鎖ＤＮＡの生成に供した。

配列決定
初回ライブラリーを１０ラウンド超のＧｒＯ系選択及び平行評価に供した（表１）。GO-ＳＥＬＥＸプロセスは、着目する所与の標的に結合する配列を選択し、非標的化合物又は緩衝成分に結合する配列を除去する多重ラウンドの選択を通じて、配列を濃縮するものである。その結果、配列決定される集団は、多コピーの潜在的なアプタマー候補を含むと期待される。

単一末端リード技術を用いた並行評価の後、Illumina MiSeqシステム（San Diego, CA）を用いて、アプタマーライブラリーの配列決定を行った。ディープシークエンシング及びそれに続くデータ分析により、従来のＳＥＬＥＸと比較してスクリーニングラウンドの数を低減した。従来のＳＥＬＥＸでは、多数のスクリーニングラウンドが必要であったため、スクリーニングプロセスにより誤りや偏向が生じる場合があった（Schutze et al., 2011）。以下の５つの試料を配列決定した：アシクロビルに反応した最終世代のライブラリー、反標的に反応した最終世代のライブラリー、１×選択緩衝剤（陰性条件）に反応した最終世代のライブラリー、アシクロビルに反応した最後から２番目の世代のライブラリー、及び、興味対象となる追加の標的であるペンシクロビルに反応した最終世代のライブラリーである。これらのデータ群から、アプタマー候補を同定するために、９５％の相同性を以て配列ファミリーを構築した（変異、欠失、及び挿入を考慮した配列類似性）。アシクロビルに反応したライブラリー由来の生配列は１，７１１，５３５個（うち１２４，６００個は独自配列）、ペンシクロビルに反応したライブラリー由来の生配列は２，０７４，８３２個（うち１１０，１４９個は独自配列）であった。

アプタマー候補の選択
配列ファミリーの構築は主に配列類似性に基づいて行った。即ち、ある配列の陽性標的集団内における頻度は考慮したが、類似の配列間のばらつきの度合いをより重視し、９５％の相同性を最低条件とした（即ち、ファミリーに属するのに全体配列に亘って１００％一致することは要求せず、最大２塩基のミスマッチ、挿入、又は欠失が存在してもよい）。ここから予想できるように、最もメンバー数の多いファミリーがアプタマー候補として上位にランクされる。ファミリーを構築した後、所与の集団内におけるファミリーの相対的な位置づけを考慮してもよい。即ち、陰性及び反標的集団に頻繁に表れるファミリーは、緩衝剤又は反標的成分との結合において非特異的相互作用を生じる度合いが高いことから、候補としては弱いと判断される。更に、濃縮率が高いファミリー（即ち最後の陽性集団と最後から２番目の陽性集団との間の比が大きいファミリー）は、濃縮率はある候補の集団内の他の成員との比較における結合親和性に関連付けられていることから（Levay et al., 2015; Wang et al., 2014）、候補として優先される。これらの条件の下、アシクロビル（表２）及びペンシクロビルとの結合について、幾つかの候補ファミリーが強力な候補であると考えられた。

表２．アシクロビル結合ＲＮＡリボスイッチの非ステム領域に対応するＤＮＡ配列。スクリーニングにおいて７つのファミリーが同定された。それらは５８２、７６９、７９５、９３５、９４６、９６１、及び９９６ファミリーで、各ファミリーは１～３９配列を有する。各ファミリー内の各配列の％同一性を、そのファミリーで最も多くみられる配列と比較した（５８２－１、７６９－１、７９５－１、９３５－１、９４６－１、９６１－１、及び９９６－１）。また、各ファミリー内の各配列の％同一性を、野生型配列とも比較した。

陽性標的アシクロビルからは、７つの強力な候補が得られた（配列番号８７～９３；ステム領域を含むＲＮＡ配列）。それらは、５８２－１（配列番号１０８）、７６９－１（配列番号１４７）、７９５－１（配列番号１６４）、９３５－１（配列番号１８３）、９４６－１（配列番号１９８）、９６１－１（配列番号２２０）、及び９９６－１（配列番号２２１）に対応する。各々をＦ１Ａと示す（図１７）。これらの配列は各ファミリーで最も多くみられる配列である（各ファミリーの全メンバーのＤＮＡ配列は：５８２（配列番号１０８～１４６）；７６９（配列番号１４７～１６３）；７９５（配列番号１６４～１８２）；９３５（配列番号１８３～１９７）；９４６（配列番号１９８～２１９）；９６１（配列番号２２０）；及び９９６（配列番号２２１）である）。コンセンサス配列は、全ての可能な置換又はギャップを、各ファミリーの各ヌクレオチドの位置に示す（配列番号２２２～２２６）。デオキシグアノシンに結合することが知られているＲＮＡに基づき、ライブラリーからアプタマーを同定することが目的であるから、強力な候補の反標的集団内における存在は最小限である必要があった。候補Ｆ１Ａ－７９５、Ｆ１Ａ－９３５、及びＦ１Ａ－９４６は反標的集団に検出されず、斯かる基準を最もよく満たしていた。Ｆ１Ａ－９９６及びＦ１Ａ－９６１は反標的集団に僅かに存在しており、この点では次善の候補と考えられた。更に、候補は陰性集団にも最小限しか存在しないことが求められる。これらの配列アシクロビルの影響なしにＧｒＯから脱着し、偽陽性を示しうるからである。Ｆ１Ａ－９３５及びＦ１Ａ－９４６は陰性集団にも存在せず、この基準に照らしても理想的であった。候補Ｆ１Ａ－７６９は最小限ではあるが陰性集団内に存在した。候補Ｆ１Ａ－９６１、Ｆ１Ａ－７９５、及びＦ１Ａ－９９６はより劣る結果であった。最後に考慮すべき条件は濃縮率であるが、Ｆ１Ａ－９３５、Ｆ１Ａ－９４６、及びＦ１Ａ－７６９は充分であった。候補Ｆ１Ａ－５８２は最も高い濃縮率を示したことから、他の基準では劣っていたものの、候補に加えた。これら４つの候補と比較して、残る候補は劣ってはいたものの、許容しうる特性を有していた。

追加の標的ペンシクロビルにより、７つの強力な候補が得られた（配列番号９４～１００）。これらはＦ１Ｐと命名された（図１８）。前回と同様、その目的はデオキシグアノシンに結合することが知られているＲＮＡに基づき、ライブラリーからアプタマーを同定することであり、ラウンド１０の後のアシクロビルへの結合性に基づくライブラリー濃縮からは逸脱していた。強力な候補は、交差反応性が最小であるために、アシクロビル及び反標的集団の両方において存在が最少である必要があった。候補Ｆ１Ｐ－９２３は第１の基準を満たしており、候補Ｆ１Ｐ－７１０は第２の基準を満たしており、候補Ｆ１Ｐ－５８４は両方の基準をある程度満たしていた。候補Ｆ１Ｐ－５８４も、アシクロビルに対する以前の世代の応答と比較すると、陰性条件に対するペンシクロビルへの偏向性（favorability）が中程度に優れており、濃縮性も中程度であった。残りの候補は、アシクロビルに対するペンシクロビルの偏向性が最小限、或いは、反標的に対するペンシクロビルの偏向性が最小限であった（それぞれ、Ｆ１Ｐ－８３７及びＦ１Ｐ－９３２；Ｆ１Ｐ－９９１及びＦ１Ｐ－７１８）。これら４つの候補は、偽陽性の可能性を最小化する陰性条件に対して、ペンシクロビルに幾分の偏向性を示したが、斯かる候補がペンシクロビル類似体と比較してペンシクロビルに選択性を示さない場合には、この基準はそれほど重要ではない。考慮すべき最後の条件である濃縮率について、Ｆ１Ｐ－９２３、Ｆ１Ｐ－９３２、及びＦ１Ｐ－５８４は十分に優れていた。

選択されたアプタマーを、定性的ＰＡＧＥによる評価に供した。個別に合成及び転写されたアプタマーを、生理的Ｍｇ^＋＋（０．５ｍＭ）下で、酸化グラフェン（ＧｒＯ）上での選択に供し、アシクロビル（＋）又は反標的（ｘ）の何れかで溶出させた。各試料について特異的に溶出されたアプタマー画分を、ＰＡＧＥでの分析に供した。

１００ｐモルの各アプタマー候補（試行回数／レーン当たり）を１×改変選択緩衝剤（５０ｍＭＨＥＰＥＳ、１００ｍＭＫＣｌ、０．５ｍＭＭｇＣｌ２、ｐＨ７．３）に再懸濁し、再び折り畳みを生じさせ（９０℃で５分、続いて４℃で５分）、続いて２００ｐモル（それぞれ）のプールされた反標的又は標的と共に３７℃で３０分間インキュベートした。最終ライブラリー濃度は０．５μＭであり、標的／反標的濃度は１μＭであった（インキュベーション体積は２００μｌであった）。

標的／反標的インキュベーション後、２５０μｇのＧｒＯ（Angstron Materials; Dayton, OH）を加えて、結合していない候補を吸収させた（３７℃で１０分間のインキュベーション）。

試料を７，０００×gで５分間の遠心分離に供した。上清を回収し、４０ｍＭＥＤＴＡを加えた２×ホルムアミドを用いて変性させ、８Ｍ尿素を含む１０％変性ＰＡＧＥ（提供者: American Bioanalysis; カタログ番号AB13021-01000. AB13022-01000）で泳動した。泳動緩衝剤は１×ＴＢＥとした（提供者: Amresco/VWR; カタログ番号0658-20L、ＤＩ水を用いて希釈）。ＤＮＡ勾配は２０／１００ＤＮＡ勾配とした（ＩＤＴ）。ゲルの染色はGel Star (Lonza, 50535)を用いて行い、青色光トランスイルミネーターを用いて画像化した。

この定性的ＰＡＧＥ評価では、候補Ｆ１Ａ－７６９、Ｆ１Ａ－７９５、Ｆ１Ａ－９４６、及びＦ１Ａ－９９６が選択的な陽性応答を示したと考えられた（アシクロビル標的存在下でのＧｒＯからアプタマーが良好に溶出し、それと比較して反標的存在下での溶出はより低く、或いは最低限であった）。

結論
１２ラウンドの反復スクリーニング及び平行評価の後に、アシクロビルについての強力な候補が同定された。２ラウンドのスクリーニング及び平行評価の後に、ペンシクロビルについての適切な候補が同定された。

実施例２：条件付ｓｃＦｖの単離
潜在的スプライス部位の偏向性（liabilities）を除去し、オーバーラップオリゴ合成により腫瘍抗原特異的ｓｃＦｖを合成し、アシクロビル反応性要素及び霊長目ＣＤ３ζプロモーターを含むＣＡＲシャトルコンストラクトにクローン化した。初回プロトタイプとして、ＣＤ８－αシグナルペプチド、柄部、及び膜貫通ドメインを有するＥＰＣＡＭ又はＥＲＢＢ２ｓｃＦｖの抗ＥＣＤを用いた。米国特許番号８，７０９,７５５号及びＰＣＴ出願国際公開第２０１６／０３３３３１Ａ１号に記載の方法、或いは許容及び非許容条件下でのヒトファージライブラリーからの直接選択により、固体腫瘍微小環境制限ＣＡＲ産物を産生した。簡単に述べると、Creative Biolabs (Shirley, NY）から入手したヒトＶＨ×ＶＬライブラリーを、以下の腫瘍許容条件下でパニングに供した：１００μｇ／ｍｌのヒアルロナン、１００ｋＤａの画分（Lifecore BioMedical, Chaska, MN）、２０ｍｇ／ｍｌの組換ＨＳＡ（Cyagen, Santa Clara, CA）、２５ｍＭの重炭酸ナトリウム緩衝剤中２００ｎｇ／ｍｌの組換ヒトＶＥＧＦ、２μＭアデノシン、１０ｍＭ乳酸ナトリウム、ｐＨ６．７、その後にビオチン化ヒトＩｇＧを結合したストレプトアビジン電磁ビーズ（ThermoFisher、Carlsbad, CA）でクリアランス。ビオチン化標的受容体ＥＣＤのＥＰＣＡＭ及びＥＲＢＢ２をコンジュゲートしたビーズに対し、３７℃で許容条件下で結合させ、続いて許容条件下で段階洗浄する。生理条件（１μｇ／ｍｌヒアルロナン、２０ｍｇ／ｍｌＨＳＡ、２５ｍＭ重炭酸、１ｍＭ乳酸ナトリウムｐＨ７．２）でファージを放出させ、次いで強固な変異体を酸で溶出させ、１Ｍトリスで急速に中和する。ファージを展開し、ゲノムＤＮＡを分離して、長リード（long read）配列決定を用いたＶＨ×ＶＬ鎖のディープシークエンシング分析に供する（PacBio, Menlo Park, CA）。パニングを繰り返して濃縮してもよい。ファージ培養プロセス時に標的に対する濃縮に対して優先的なリードの増幅を示すＶＨ×ＶＬ配列は、更なる分析から除外する。腫瘍許容条件下で濃縮されるが、生理条件下で放出される標的に選択的に結合するファージを選択し、更なる特性決定のために前記ＣＡＲコンストラクト発現系にクローン化し、レンチウイルスを生成し、Ｔ細胞に形質導入して、生理条件と比較して腫瘍選択的環境下で標的細胞の死滅作用を発現するＣＡＲ媒介腫瘍抗原の試験に供する。

実施例３：微小環境制限ｓｃＦｖを用いたＭＲＢ－ＣＡＲの生成
腫瘍微小環境に対する選択性の低いＶＨ及びＶＬ配列を、国際公開第２０１６／０３３３３１Ａ１号に記載の進化に供することにより、微小環境制限ＡＳＴＲを得た。通常の組織と比較してｐＨの低い腫瘍環境下で活性が上昇する、２つの腫瘍抗原Ａｘｌ又はＲｏｒ２の何れかに結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）（斯かる微小環境制限生物製剤を、本開示ではＭＲＢ－ＣＡＲと呼ぶ場合もある）を作製するべく、前記微小環境制限単鎖抗体の重鎖及び軽鎖を、他のＣＡＲドメインと共にレンチウイルス発現ベクターに導入し、ＭＲＢ－ＣＡＲを作製した。これらのＣＡＲは、アミノからカルボキシ末端にかけて、種々の組み合わせのモジュールを含んでいた。例えば、ＣＤ８シグナルペプチド（Ｐ１）（配列番号７４）；微小環境制限抗Ｒｏｒ２及び抗ＡｘｌＶＨ及びＶＬの組み合わせ；ＣＤ８（配列番号７５）又はＣＤ２８（配列番号７６）由来の柄部及び膜貫通ドメイン（Ｐ５）；ＣＤ１３７（配列番号１）又はＩＣΔ（配列番号３）由来の共刺激ドメイン（Ｐ６）；ＣＤ３Ｚ（配列番号１３）由来の活性化ドメイン（Ｐ７）；２Ａ－１リボゾーム性スキップ配列（配列番号７７）（Ｐ８）；及び例示のｅＴＡＧ（配列番号７８）（Ｐ９）。

候補ＣＡＲを発現する組換レンチウイルス粒子によってパンＴ細胞を形質導入し、トランスフェクト細胞の％を決定するべく、ＦＡＣＳを用いてｅＴａｇを発現する細胞の％を決定した。パンＴ細胞は、候補ＣＡＲをコードする組換レンチウイルス粒子によって首尾よく形質導入されており、これらの形質導入Ｔ細胞のアッセイによれば、ｐＨ７．４と比較してｐＨ６．７において条件付き活性を示した。

Ａｘｌ又はＲｏｒ２の何れかを発現する標的細胞に対する候補ＣＡＲの細胞毒性活性をｐＨ７．４（生理的ｐＨ）又はｐＨ６．７（ｐＨ代替腫瘍アッセイ条件）下で分析した。候補ＣＡＲの多くは、ｐＨ７．４よりもｐＨ６．７でより有効に標的細胞を溶解した。

実施例４．リガンド誘導型リボスイッチの構成
デオキシグアノシンリボスイッチアプタマー及びグアニンリボスイッチアプタマー（Pikovskaya, 2014;Kim, 2007）、又は他のプリンリボスイッチアプタマーを、オリゴヌクレオチドとして合成する。一例によれば、メソプラズマ・フローラム（Mesoplasma florum）由来のデオキシグアノシンＩＡリボスイッチ（図６の下線及び太字；図７）を選択し、進化させてアシクロビル反応性リボスイッチを生成する。他の例では、枯草菌（Bacillus subtilis）由来のグアニンｘｐｔリボスイッチ（図１０の下線及び太字；図１１）を選択し、進化させてアシクロビル反応性リボスイッチを生成する。これら２つの例の各々について、Ｐ２、Ｐ３、Ｊ１－２、及びＪ２－３部分内の標的となる配列位置を別のヌクレオチドとすることで、ランダムＲＮＡライブラリーが生成される（図７及び１１）。飽和突然変異生成では、図８Ａ～８Ｂ及び図９（Ｍ．フローラムＩＡ）並びに図１２Ａ～１２Ｂ及び１３（Ｂ．スブチリスｘｐｔ）に示すように、各部分の各標的配列位置に、他の３種の核酸、又は塩基の欠失、又は各標的配列位置に対し＋１の位置に４ヌクレオチドの塩基の挿入を許容する。プライマー伸長及び試薬調製に続いてＲＮＡ転写を行う。得られたＲＮＡライブラリーを、グアニン、グアノシン、及びデオキシグアノシンの存在下、酸化グラフェンとの陰性選択、続いてアシクロビル又はペンシクロビルとの陽性選択に供する。陰性及び陽性選択プロセスの間、ヒト細胞の生理学的マグネシウムレベル（０．５ｍＭ～１．２ｍＭ）を用い、温度は３７℃に維持する。回収されたアプタマーを逆転写し、ＰＣＲで増幅した上で、転写、続いて少なくとも８回の連続ラウンドの選択によるスクリーニングを行う。並行のアプローチとして、アプタマーを４０℃で追加の陰性スクリーニングに供する。得られた陽性プールを次世代配列決定及び分析に供する。個々のアプタマーを合成し、その親和性を、３５～４０℃で、ヒト細胞の生理学的マグネシウムレベルで、等温滴定熱量測定により評価する。陽性アシクロビル及びペンシクロビル特異的アプタマーの選択後、アプタマーをリボザイムハンマーヘッド及びピストルリボザイムと連結する。陽性アシクロビル選択によるアプタマーを、ピストルリボザイムと連結し、アシクロビル調節性リボザイムに評価に供する（Harris KA RNA. 2015 Nov;21(11):1852-8. doi: 10.1261/rna）。変異体をアシクロビルの存在下且つペンシクロビルの不在下で、ゲルシフト系ＰＡＧＥ精製に供する。更に、アシクログアノシン選択によるリボスイッチを、ＣＡＲ／ＩＬ－７コンストラクトの上流のスプライスアクセプターに対し、ループ内の３’側に配置する。スプライス部位の位置は、アシクロビルの不在下ではリボスイッチ複合体の中に束縛されているが、アシクロビルの存在下ではアクセス可能となり、機能的ＣＡＲ転写産物を生成する。

実施例５．インビボ増幅ドメインの構成
Ｔ細胞リンパ芽球性白血病（２４３ＩｎｓＰＰＣＬ（配列番号８２）；２４６ＩｎｓＫＣＨ（配列番号１０１）；２４１ＩｎｓＦＳＣＧＰ（配列番号１０２）；２４４ＩｎｓＣＨＬ（配列番号１０３）；及び２４４ＩｎｓＰＰＶＣＳＶＴ（配列番号１０４）（何れもShochat et al 2011, J. Exp. Med. Vol. 208 No. 5 901-908による）に由来する一連の構成的に活性なＩＬ７受容体（ＩＬ７Ｒ）膜貫通変異体を、オーバーラップオリゴヌクレオチド合成（DNA2.0, Newark, California）により合成する。合成された構成的に活性なＩＬ７Ｒ膜貫通変異体を、構成的に発現するレンチウイルスベクター骨格の中に、２Ａリボゾーム性スキップ配列の直後に挿入し、その後に、ＣＤ８A柄部（配列番号７９）及びリーダーペプチド（配列番号７４）を含む抗ＣＤ１９ＣＤ３ζ発現カセットを配置する。ＨＥＫ２９３パッケージング細胞をＩＬ７Ｒ膜貫通変異レンチウイルスベクターでトランスフェクトし、得られたレンチウイルスパッケージングコンストラクトを培養し、ウイルス上清を本技術分野で公知の方法により回収する。ＣＤ３／ＣＤ２８により刺激されたＴ細胞を、前記ウイルス上清により形質導入し、ＩＬ２欠損ＡＩＭＶ、ＣＴＳＯｐＴｍｉｚｅｒＴ細胞増加ＳＦＭ、又はＸ－ＶＩＶＯ１５培地で４週間培養する。毎週、同一のドナー由来の凍結ＰＢＭＣを補充する。増幅された、ＩＬ７Ｒ変異体を発現する形質導入Ｔ細胞を、ＦＡＣＳ選別によりクローン化し、配列決定ＲＴ－ＰＣＲ産物によりＩＬ７Ｒコンストラクトの配列を同定する。２４３ＩｎｓＰＰＣＬ変異体（ＰＰＣＬ）（配列番号８２）を選択して更なる進化に供し、条件付の活性なＣＡＲを生成する。

実施例６．ＣＡＲ－Ｔ活性化及び増幅のための補助成分のスクリーニング
一連のタンパク質コーディングドメイン（ＡＢＣＧ１、ＳＯＣＳ１、ＳＭＡＤ２、ＴＧＦＢＲ２、ｃＣＢＬ、及びＰＤ１）及びｍｉＲＮＡ配列を、ＣＤ３－プロモーター誘導性ＣＡＲカセットの逆鎖の合成イントロンに組み込むべくコンストラクト化する。ＣＤ３－プロモーター誘導性ＣＡＲカセット及びタンパク質コーディングドメイン又はｍｉＲＮＡ配列を含む各コンストラクトは、ディープシークエンシング用の独自のバーコードを含み、Gibsonアセンブリ及びその後の大腸菌への形質転換及びライブラリー増幅を用いて構築される。ウイルスストックを作製し、これを用いて、ＡＩＭＶ、ＣＴＳＯｐＴｍｉｚｅｒＴ細胞増幅ＳＦＭ、又はＸ－ＶＩＶＯ１５培地（ＩＬ２を含まないもの）の中で、ＣＤ３／ＣＤ２８刺激Ｔ細胞に形質導入し、４週間培養すると共に、ＤＮＡを逐次サンプリングして増幅及びディープシークエンシングに供し、コードの同定を行う。また、斯かるライブラリーをPACBio全長配列決定に供し、ライブラリーの多様性を決定すると共に、バーコード成分をデコードする。前記ｍｉＲＮＡ配列及びタンパク質コーディングドメインを、ＣＡＲＣＤ３ζドメインの相乗的活性化について評価する。

実施例７．選択的Ｔ細胞組み込み及びＰＢＭＣからの発現のためのレトロウイルスパッケージング及び標的静止Ｔ細胞への形質導入系の構築
一過性トランスフェクションによる高力価レンチウイルスベクターの産生は可能ではあるが、この方法は複製可能レトロウイルス（ＲＣＲ）を生成するリスクがあり、臨床用途に拡張することはできない。本例では、誘導型プロモーター及びそのレギュレーターをコードする複数のコンストラクトをＨＥＫ２９３懸濁可能細胞（ＨＥＫ２９３Ｓ）に同時に導入し、前記ウイルス成分、ＣＡＲ遺伝子、及びその制御性成分を安定に産生させることにより、安定なレトロウイルスパッケージング細胞株を生成する。２つの独立の誘導型系を用いて、遺伝子の発現を時間的に制御してもよい。一つの系は、２つの転写因子によるラパマイシン又はラパログ（rapalog）誘導性の二量体形成に基づく。一方の転写因子は、ＺＦＨＤ１ＤＮＡ結合ドメインに連結されたＦＫＰＢタンパク質の三コピーからなり、他方の転写因子は、ｐ６５活性化ドメインに連結されたＦＲＢタンパク質からなる。ラパマイシン又はラパログ（rapalog）は、転写因子と二量体を形成し、ＺＦＨＤ１／ｐ６５ＡＤを構成する。これにより、１２ｘＺＦＨＤ１結合部位における遺伝子転写を活性化する。

図３Ａ～３Ｅに示す一連のベクターは、ＨＥＫ２９３Ｓゲノムへの組み込みのためのフランキングトランスポゾン配列を用いて作製される。これらの配列は、いったん細胞のゲノム内に取り込まれると、Ｃｒｅ及び／又はｆｌｐリコンビナーゼを用いたその後の組み込みのための、制御性要素並びにｌｏｘ及び／又はＦＲＴ部位として機能する。本開示ではこれらをランディングパッド（landing pads）と称する。最初の５つのコンストラクトは、ピューロマイシン抵抗性、ＧＦＰ、ＲＦＰ、及び細胞外ＭＹＣタグをコードするポリヌクレオチド配列を含む。細胞外ＭＹＣタグは、Ｎ末端ＰＬｓｓ（ウシプロラクチンシグナルペプチド）を介して細胞膜に標的化され、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）Ｃ末端膜貫通アンカードメインを介して細胞膜にアンカーされる。また、最初の５つのコンストラクトは、構成型最小ＣＭＶ及び最小ＩＬ－２プロモーター、ラパマイシン調節性ＺＦＨＤ１系プロモーター、テトラサイクリン反応性要素（ＴＲＥ）プロモーター、又は双方向ＴＲＥ（ＢｉＴＲＥ）プロモーターを含んでいてもよい。図３Ａのコンストラクトは、ＮＦκＢｐ６５アクチベータードメイン（ｐ６５ＡＤ）に融合されたＦＲＢドメインと、構成的に発現される３つのＦＫＢＰリピートに融合されたＺＦＨＤ１ＤＮＡ結合ドメインとをコードするポリヌクレオチド配列を含む。また、図３Ａのコンストラクトは、ラパマイシン誘導型ＺＦＨＤ１／ｐ６５ＡＤプロモーターの制御下に、ＨＩＶ１ＲＥＶ及びＨＳＶＶＰ６５ドメインＳｒｃＦｌａｇＶｐｘを含む。図３Ｂのコンストラクトは、前記ＺＦＨＤ１／ｐ６５ＡＤプロモーターの制御下に、ｒｔＴＡ配列をコードするポリヌクレオチドを含む。図３Ｃのコンストラクトは、ｌｏｘＰ部位に挟まれたピューロマイシン耐性遺伝子及びｌｏｘ２２７２部位に挟まれた細胞外ＭＹＣタグをコードするポリヌクレオチドを含む。これらの選択可能なマーカーは何れも、ＦＲＴ部位に挟まれたＢｉＴＲＥプロモーターの制御下にある。図３Ｄのコンストラクトは、ＴＲＥプロモーターの制御下に、ｌｏｘＰ部位に挟まれたＧＦＰをコードするポリヌクレオチドを含む。また、図３Ｄのコンストラクトは、ＴＲＥプロモーターとＧＦＰの５’側ｌｏｘＰ部位との間に、単一のＦＲＴ部位を含む。図３Ｅのコンストラクトは、前記ＺＦＨＤ１／ｐ６５ＡＤプロモーターの制御下に、ｌｏｘＰ部位に挟まれたＲＦＰをコードするポリヌクレオチドを含む。また、図３Ｅのコンストラクトは、前記ＺＦＨＤ１／ｐ６５ＡＤプロモーターとＲＦＰの５’側ｌｏｘＰ部位との間に、単一のＦＲＴ部位を含む。図３Ｃ～３Ｅのコンストラクトは、他のポリヌクレオチド配列がパッケージング細胞株のゲノム内に挿入されるためのランディングパッド（landing pads）として機能する。挿入されるポリヌクレオチド配列をｌｏｘ部位に挟み、Ｃｒｅリコンビナーゼ及びこれらのｌｏｘＰ部位を用いてゲノムに挿入してもよい。これにより、斯かる配列の挿入と同時に、ピューロマイシン抵抗性、前記細胞外ＭＹＣタグ、ＧＦＰ、及びＲＦＰをコードするゲノム領域が除去されることになる。或いは、前記ポリヌクレオチド配列をＦＲＴ部位に挟み、ｆｌｐリコンビナーゼ及びこれらのＦＲＴ部位を用いてゲノムに挿入してから、ピューロマイシン抵抗性、前記細胞外ＭＹＣタグ、ＧＦＰ、及びＲＦＰ前記をコードするポリヌクレオチド配列のＣｒｅリコンビナーゼを用いた除去を行ってもよい。

ランディングパッド（landing pads）がゲノムに組み込まれたパッケージング細胞株を生成するために、ＨＥＫ２９３Ｓ細胞を、等モル濃度の５つのプラスミド（図３Ａ～３Ｅ）と、５μｇのインビトロ転写ピギーバックトランスポーゼースｍＲＮＡ、又は、５μｇのピギーバックトランスポーゼースを発現するためのプロモーターを含むプラスミドとで共トランスフェクトする。斯かる共トランスフェクトは、ＰＥＩの共存下、ＰＥＩに対するＤＮＡの比率が（ｗ／ｗ）２：１又は３：１となるよう、或いは、２～５μｇのピギーバックトランスポーゼースタンパク質の共存下で、陽イオン性ペプチド混合物を用いて行う。トランスフェクトされた細胞をピューロマイシンで選択する。この選択は、１００ｎｍのラパマイシン及び１ｕｇ／ｍＬのドキシサイクリンの存在下で２～５日間培養し、続いて蛍光活性化細胞選別により、ＧＦＰ及びＲＦＰを発現する細胞を収集することにより行う。選別した細胞を、ピューロマイシン、ラパマイシン、及びドキシサイクリンの不在下で５日間培養し、ＧＦＰ及びＲＦＰを発現する細胞を除去すると共に、mycビーズを用いてｍｙｃ陽性細胞を除去する。陰性選別細胞由来の個々のクローンから、ラパマイシン及びドキシサイクリンによるＧＦＰ及びＲＦＰ誘導をスクリーニングし、単一の細胞をクローン化する。クローン由来のＤＮＡを収穫し、組み込み分析のために配列決定を行う。ラパマイシン及びドキシサイクリンの不在下において制限されたバックグラウンドの発現を示すと共に、ラパマイシン及びドキシサイクリンの存在下でＧＦＰ及びＲＦＰにより強力な誘導型発現が見られたクローンを、増幅して保存する。

図３Ａ～３Ｅのコンストラクトがゲノムに組み込まれたＨＥＫ２９３Ｓ細胞を、コンストラクトでトランスフェクトする。本コンストラクトは、ＤＡＦシグナル配列／抗ＣＤ３ｓｃＦｖＦｃ（ＵＣＨＴ１）／ＣＤ１４ＧＰＩアンカー付着部位（配列番号２５２）、ＣＤ２８／ＣＤ１６ＢＧＰＩアンカー付着部位に結合しうるＤＡＦシグナル配列／ＣＤ８０細胞外ドメイン（配列番号２５３）、及びＤＡＦシグナル配列／ＩＬ－７／ＤＡＦ（配列番号１０７）、並びにＨＥＫ２９３Ｓゲノムへの組み込みのための、前記ポリヌクレオチド領域を挟み込むトランスポゾン配列をコードする３シストロン性ポリヌクレオチドを含む（図４Ａ）。トランスフェクション後、細胞をラパマイシン及びドキシサイクリンの不在下で２日間培養し、構成的に赤色を呈するコロニーを選択する。次に陽性コロニーを、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現するコンストラクトで一過的にトランスフェクトし、残存するゲノムＤＮＡ及びＲＦＰエンコーディング領域を除去する。ＢｉＴＲＥプロモーター並びにｇａｇ及びｐｏｌポリペプチドをコードするポリヌクレオチド領域を一方向に含み、麻疹ウイルスＦ及びＨタンパク質をコードするポリヌクレオチド領域を逆方向に含むポリヌクレオチドを含む他のコンストラクト（図４Ｂ）を同時にトランスフェクトする。斯かるコンストラクトがＣｒｅリコンビナーゼによりゲノムに組み込まれ、図４Ｂに示す組み込み配列を生成する。得られたコロニーのタンパク質発現を、ドキシサイクリン及びラパマイシンの存在下で評価し、ディープシークエンシングによりゲノム組み込みを分析する。残りのＴＲＥ反応性ＧＦＰ部位はレンチウイルスゲノム挿入のために維持される。

実施例８．レンチウイルスベクター及びレトロウイルスパッケージングの生成
実施例７で生成されたレトロウイルスパッケージング安定細胞株を、Ｆｌｐリコンビナーゼを発現するためのコンストラクト（図４Ｃ）、及び、ＣＡＲ及びリンパ増殖性要素ＩＬ７Ｒα－ｉｎｓＰＰＣＬをコードするポリヌクレオチド配列を、ＨＥＫ２９３Ｓ細胞では活性でないＣＤ３Ｚプロモーターの制御下に含むコンストラクトでトランスフェクトする。ここで、前記ＣＡＲ及びＩＬ７Ｒα－ｉｎｓＰＰＣＬは、Ｔ２Ａリボゾーム性スキップ配列をコードするポリヌクレオチド配列によって隔離され、前記ＩＬ７Ｒα－ｉｎｓＰＰＣＬは、アシクロビルリボスイッチ制御性のリボザイムを有する。前記ＣＡＲ含有コンストラクトは更に、ｃＰＰＴ／ＣＴＳ及びＲＲＥ配列と、ＨＩＶ-１Ｐｓｉをコードするポリヌクレオチド配列とを含む。ゲノムに組み込まれるべきＣＡＲ含有コンストラクトのポリヌクレオチド配列全体をＦＲＴ部位で挟み込む。ＣＡＲ含有コンストラクトが首尾よく組み込まれると、ＧＦＰの構成型発現が生じる。ＧＦＰはその後、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現するためのコンストラクトを用いた一過性トランスフェクションにより除去される。ＨＥＫ２９３Ｓ系列を血清不含有培地で培養する。攪拌型タンク反応器中でピーク細胞密度まで増殖させた後、細胞をピーク細胞密度の～７０％まで希釈し、１００ｎＭのラパマイシンで２日間処理して、早期遺伝子ＲＥＶ、Ｖｐｘ、並びにＣＤ３ｓｃＦｖＣＤ１６ＢＧＰＩ、ＣＤ２８ｓｃＦｖＣＤ１６ＢＧＰＩ、及びＩＬ－７ＳＤＧＰＩＤＡＦの発現を誘導する。続いて１ug／mLのドキシサイクリンを培地に加え、構造的要素の発現を誘導する。構造的要素としてはＧａｇＰｏｌ、ＭＶ（Ｅｄ）－ＦΔ３０、ＭＶ（Ｅｄ）－ＨΔ１８、及び治療標的を含むレンチウイルスゲノム等がある。ウイルス産生レベルをパッケージング配列のｑＰＣＲ及びｐ２４ＥＬＩＳＡで評価する。ウイルスの収穫は、細胞の深層濾過、ＴＦＦカートリッジを用いた濃縮／透析濾過、及びそれに続くバイアル化のための瞬間冷凍によって行う。

実施例９．末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の単離、形質導入、及び増幅
以下の例は、閉鎖系を用いたインビボでの増幅前のＰＢＭＣのエクスビボ処理を示す。一例として、対象から３０～２００ｍＬのヒト血液を採取し、クエン酸デキストロース溶液（ＡＣＤ）を抗凝血剤として加え、採血袋に入れる。或いは、血液をバキュテナーチューブ、シリンジ、又は同等品に採取し、空の採血袋又はＩＶ袋に入れる。全血を、NeatCellキット（カタログ番号CS-900.2, Omniamed）を用い、製造者の指示に従って、Sepax 2細胞処理系（BioSafe）で処理する。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は培養袋又はシリンジに採取する。アリコートを無菌的に取得して細胞計数に供し、生存細胞数を決定する。ＰＢＭＣをＧ－Ｒｅｘ100MCS 気体透過性細胞培養系デバイス（Wilson Wolf）に、最終濃度０．１～１．０×１０^６生存細胞／ｍｌとなるように、Ｘ－ＶＩＶＯ１５（カタログ番号08-879H, Lonza）又はＣＴＳＯｐＴｍｉｚｅｒ細胞増加ＳＦＭ（カタログ番号A1048501, Thermo Fisher Scientific）培地中、１０～３００ＩＵ／ｍｌＩＬ－２（カタログ番号202-IL-010, R&D Sysyems)で、最終体積が最大２００ｍＬとなるように移送する。更に、ＩＬ－２に対して、ＣＴＳ免疫細胞ＳＲ（カタログ番号A2596101, Thermo Fisher Scientific）を培地に加えてもよい。閉鎖型Ｇ－Ｒｅｘ気体透過性細胞培養系デバイスを、レトロネクチン（カタログ番号CH-296, Takara）、又は類似のフィブロネクチン由来同等物を用いて、製造者の指示に従ってあらかじめ被覆してもよい。

末梢血から単離されたＰＢＭＣをＰＡＬＬＰＢＭＣフィルターに付加し、フィルターにより１０ｍＬのＡＩＭＶ（Thermo Fisher Scientific）又はＸ－ＶＩＶＯ１５培地を用いて一回洗浄し、続いて１０～６０ｍＬの（実施例８で調製された）レンチウイルスストックを用い、５ｍＬ／ｈｒで３７℃で灌流する。次にＰＢＭＣを、ＡＩＭＶ、ＣＴＳＯｐＴｍｉｚｅｒＴ細胞増加ＳＦＭ、又は組換ヒトＤＮａｓｅ（Pulmozyme, Genentech）を含むＸ－ＶＩＶＯ１５培地で再び洗浄し、続いてＤＮａｓｅを含まない乳酸加リンガー液（カタログ番号L7500, Braun）で洗浄する。その後、ＰＢＭＣをフィルターを通じてシリンジに逆灌流する。続いて、細胞（細胞の標的レベルは５×１０^５～１×１０^６細胞／ｋｇ）を対象に静脈内注入により再注入する。

レトロウイルスゲノムに含まれるリボスイッチに応じて、ヌクレオシド類似体抗ウイルス薬又はヌクレオシド類似体抗ウイルスプロドラッグ（アシクロビル、バラシクロビル、ペンシクロビル、又はファムシクロビル）を対象に投与する。例えば、対象に治療有効量、例えば５００ｍｇのヌクレオシド類似体抗ウイルス薬又はプロドラッグを、経口で三回／日投与することができる。前記ヌクレオシド類似体抗ウイルス薬又はプロドラッグによる処置は、好ましくは再点滴の前、例えば２時間前に始める。また、再点滴の時点、又は再点滴の後二時間をおいて始めることもできる。斯かる処置は、少なくとも１、２、３、４、５、７、１０、１４、２１、２８、３０、６０、９０、１２０日間、或いは５、６、９、１２、２４、３６、又は４８ヶ月、或いはそれ以上継続することができる。斯かる処置は、前記ヌクレオシド類似体抗ウイルス薬又はプロドラッグの投与を、一日一回、二回、三回、又は四回行うことを含んでいてもよい。再点滴及び処置を開始した後、２、５、７、１１、１３、１８、２８、及び５６日目の再点滴後に、血液計数を通じて感染細胞の数を決定し、ｑＰＣＲを用いてウイルスゲノムを低領する。熱又はサイトカイン放出症候群を発症する対象については、ヌクレオシド類似体抗ウイルス薬又はプロドラッグの用量又は頻度を低減又は停止してもよい。１８日目までに感染Ｔ細胞が１０，０００～１００，０００まで増えなければ、ヌクレオシド類似体抗ウイルス薬又はプロドラッグの用量又は頻度を増加させてもよい。対象の臨床応答をＦＤＧＰＥＴイメージング及びシリアルＣＴスキャンにより測定してもよい。寛解が長期継続している場合や、総末梢Ｔ細胞数の３０％を超える過剰なＴ細胞の増加が生じた場合には、ヌクレオシド類似体抗ウイルス薬又はプロドラッグの経口投与量を低減又は停止してもよい。

実施例１０．血管又は組織ｐＨを上げるための治療介入
抗原結合ドメインの同種抗原に対する結合を低減するために、ＩＶボーラス又はＩＶ点滴によりＮａＨＣＯ_３を投与する。標準的な投与量は、初回用量が１ｍｇ／体重ｋｇ、その後は１０分間毎に０．５ｍｇ／ｋｇである。５０ミリリットルのＮａＨＣＯ_３をボーラス投与することで、血清ｐＨが約０．１ｐＨ単位上昇する。ｐＨが７．０の場合、ｐＨを７．４０に修正するには、ＮａＨＣＯ_３の５０ｍＥｑアンプルが４本必要となる。

実施例１１．ＰＢＭＣ中におけるＩＬ－７受容体リンパ増殖／生存要素の活性の検証
抗原に依存しないＴ細胞の生存を媒介するＩＬ－７Ｒα変異体の能力を検証するために、３０ｍＬのヒト血液を、抗凝血剤であるクエン酸デキストロース（ＡＣＤ）と共に、バキュテナーチューブに採取した。全血をFicoll-Pacque^{（登録商標）}（General Electric）を用いて、製造者の指示に従って密度勾配遠心分離することにより、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を得た。ＰＢＭＣの複数のアリコートを無菌的に１２ウェル組織培養プレートのウェルに移送し、Ｘ－Ｖｉｖｏ^{（登録商標）}１５培地（Lonza）を用いて、最終濃度を生存細胞５０万個／ｍＬ、最終体積を１ｍＬに調整した。一部の試料には組換ヒトインターロイキン－２（ＩＬ－２）（Novoprotein）を濃度１００ＩＵ／ｍｌで加えた。活性化用抗ＣＤ３Ａｂ（OKT3, Novoprotein）を濃度５０ｎｇ／ｍｌで加え、ＰＢＭＣをウイルス形質導入用に活性化した。プレートを標準加湿組織培養インキュベーター内で、３７℃及び５％二酸化炭素の環境下で一晩インキュベートした。一晩のインキュベーション後、所望の試験コンストラクト（図１９Ａ）を含むレンチウイルス粒子調製物を個々のウェルに対し、感染多重度（ＭＯＩ）が５となるように加えた。プレートを標準加湿組織培養インキュベーター内で、３７℃及び５％二酸化炭素の環境下で一晩インキュベートした。一晩のインキュベーションの後、１２ウェルプレートの各ウェルの内容物を採集し、遠心分離してペレットを得た。試料をＤ－ＰＢＳ＋２％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）で一回洗浄し、Ｘ－Ｖｉｖｏ１５^{（登録商標）}培地に再懸濁し、Ｇ－Ｒｅｘ^{（登録商標）}６ウェル気体透過性細胞培養デバイスのウェルに移送した（Wilson Wolf）。追加のＸ－Ｖｉｖｏ^{（登録商標）}１５培地を加えて、各ウェルの最終体積を３０ｍｌに調整した。各コンストラクトのマッチング対照試料をＧ－Ｒｅｘ^{（登録商標）}６ウェル気体透過性細胞培養デバイス（Wilson Wolf）に移送し、一部の対照試料については追加の培地を加えて、最終体積を３０ｍｌ、１００ＩＵ／ｍｌＩＬ－２とした。Ｇ－Ｒｅｘ^{（登録商標）}デバイスを標準加湿組織培養インキュベーター内で、３７℃及び５％二酸化炭素の環境下で７日間インキュベートした。培養中２～３日毎に、ＩＬ－２を含む対照試料に新鮮なＩＬ－２を加えた。ＩＬ－２を含まないマッチング用試験試料には補充しなかった。７日目に、試料を除去して細胞数を計数し、増幅時の生存率を求めた（Countess, Thermo Fisher）。

図１９Ａは試験されたＩＬ７Ｒαコンストラクトの概略図である。これらのコンストラクトを組換レンチウイルスゲノムに挿入した。得られた組換レトロウイルスを用いてＰＢＭＣに形質導入した。図１９Ａは、野生型ＩＬ７Ｒα（配列番号２２９）の概略図である。野生型ＩＬ７Ｒαは、シグナル配列（ＳＳ）、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）、及び細胞内ドメイン（ＩＣＤ）からなる。「１」はフィブロネクチンIII型ドメインの位置を示し、「２」はWSXWS モチーフの位置を示し、「３」はボックス１の位置を示し、「４」はタンパク質キナーゼC（PKC）リン酸化部位の位置を示し、「５」はボックス２の位置を示す。

変異体「Ａ」は、ＩｎｓＰＰＣＬを位置２４３に有する（Shochat et al 2011, J. Exp. Med. Vol. 208 No. 5 901-908）が、Ｓ１８５Ｃ変異を有しないＩＬ－７Ｒαで、ＧＦＰポリペプチド、ＧＳＧリンカー、及び（そのＮ末端に融合された）Ｐ２Ａリボゾーム性スキップ配列を有する転写産物において発現されていた。変異体「Ｂ」は、ＧＦＰポリペプチド、ＧＳＧリンカー、及び（そのＮ末端に融合された）Ｐ２Ａリボゾーム性スキップ配列を有すると共に、Ｍｙｃタグをシグナル配列と細胞外ドメインとの間に有するＩＬ－７ＲαＩｎｓＰＰＣＬである。変異体「Ｃ」は変異体「Ｂ」と類似しているが、その細胞内ドメインは位置２９２で切断されていた。変異体「Ｄ」は変異体「Ａ」類似しているが、その細胞内ドメインは位置２９２で切断されていた。変異体「Ｅ」は、Ｎ末端が切断されることにより、シグナル配列及び細胞外ドメインの大部分（残基１～２２８）が存在しないＩＬ－７ＲαＩｎｓＰＰＣＬ変異体である。また、変異体「Ｅ」は、アミノ末端から順にＧＦＰポリペプチド、ＧＳＧリンカー、Ｐ２Ａリボゾーム性スキップ配列、及び（そのＮ末端に融合された）ｅＴａｇを有する。アミノ酸残基の番号付けはＩＬ７Ｒα（ＮＣＢＩＧＩ番号００２１７６．２）に基づく。トリパンブルー色素排除を用いて、ＩＬ－２の存在下又は不在下における各変異体を含むＴ細胞の生存率を調べた。

図１９Ｂに示すように、ＰＢＭＣはインビトロでの生存にＩＬ－２を必要とする。図１９Ｂに示すように、トランスフェクトされていないＰＢＭＣの生存率は、ＩＬ－２の存在下で約８０％、ＩＬ－２の不在下では０％であった。ＩＬ－７ＲαＩｎｓＰＰＣＬの全長を有するＰＢＭＣ（図１９ＡのＩＬ－７Ｒα変異体Ａ及びＢ）の生存率は、ＩＬ－２の不在下でも２０％を超えており、構成的に活性なＩＬ－７ＲαＩｎｓＰＰＣＬ受容体の発現により、これらの細胞が生存活性を有していることが示唆された。更に、細胞内ドメイン（IＣＤ）が切断されたＩＬ－７ＲαＩｎｓＰＰＣＬ変異体を発現するＴ細胞（図１９ＡのＩＬ－７Ｒα 変異体Ｃ及びＤ）は、野生型ＩＬ－７受容体と比較して生存率が向上していた。最後に、図１９Ｂに示すＮ末端ＩＬ－７受容体変異体（図１９ＡのＩＬ－７Ｒα変異体Ｅ）は、これらの細胞において生存活性を示した。従って、この例は、ＩＬ－７受容体がＰＢＭＣで発現されると生存活性を発揮することを示している。

実施例１２．新たに単離された未刺激のヒトＴ細胞のＭｅＶｐｐによる形質導入効率
２９３Ｔ細胞（Lenti-X 293T, Clontech）をレンチウイルス発現ベクターで一過性トランスフェクションすることによりレンチウイルスを産生させた。斯かる細胞を、Freestyle 293発現培地（ThermoFisher Scientific）中での段階的成長による懸濁培養に適合させた。懸濁液中の細胞を１２５ｍＬエルレンマイアーフラスコに１×１０^６細胞／ｍＬ（３０ｍＬ）となるように播種し、直ぐに弱酸に溶解させたＰＥＩ（Polysciences）によるトランスフェクトに供した。

プラスミドＤＮＡを３０ｍＬの細胞に対し１．５ｍＬのOptimem培地で希釈した。ＶＳＶ－Ｇ偽粒子については、総ＤＮＡ（培養体積１μｇ／ｍＬ）は４種のプラスミドを以下のモル比で混合したものであった。２×ゲノムプラスミド、１×Ｒｅｖ含有プラスミド、１×ＶＳＶｇ含有プラスミド、及び１×Ｇａｇｐｏｌ含有プラスミド。ＭＶ（Ｅｄ）－ＦΔ３０／ＨΔ１８偽粒子については、総ＤＮＡ（培養体積１μｇ／ｍＬ）は以下の５種のプラスミドを以下のモル比で混合したものであった。２×ゲノムプラスミド、１×Ｒｅｖ含有プラスミド、（２／３、３分の２）×ＭＶ（Ｅｄ）－ＦΔ３０含有プラスミド、（１／３、３分の１）×ＭＶ（Ｅｄ）－ＨΔ１８含有プラスミド、及び１×Ｇａｇｐｏｌ含有プラスミド。ＭＶ（Ｅｄ）－ＦΔ３０／ＨΔ２４偽粒子については、総ＤＮＡ（培養体積１μｇ／ｍＬ）は以下の５種のプラスミドを以下のモル比で混合したものであった。２×ゲノムプラスミド、１×Ｒｅｖ含有プラスミド、（２／３、３分の２）×ＭＶ（Ｅｄ）－ＦΔ３０含有プラスミド、（１／３、３分の１）×ＭＶ（Ｅｄ）－ＨΔ２４含有プラスミド、及び１×Ｇａｇｐｏｌ含有プラスミド。これとは別に、ＰＥＩを１．５ｍＬのOptimemで２μｇ／ｍＬとなるように希釈した（培養体積、ＤＮＡに対し２：１の比）。室温で５分間インキュベーションした後、２つの溶液をよく混合し、室温で更に２０分間インキュベートした。最終体積（３ｍＬ）を細胞に加えた。その後、斯かる細胞を３７℃、１２０ｒｐｍ、及び５～８％のＣＯ_２下、４８時間インキュベートした。

４８時間後、１，０００ｇで１０分間の遠心分離により、上清を回収した。上清を新鮮な試験管に静かに移し、ＰＥＧ（PEG-IT, System Biosciences）溶液中１／４体積の上清を加えた。４℃で一晩のインキュベーションによりレンチウイルス偽型を沈殿させ、続いて４℃下、１，５００ｇで２０分間の遠心分離に供した。上清を除去し、ウイルスを１：１００体積のＰＢＳに再懸濁させた。形質導入から４８時間後、ウイルスを段階的希釈し、ＣＤ４６及びＳＬＡＭを発現するRaji細胞におけるＧＦＰ発現に基づき、フローサイトメトリーによりその力価を滴定した。

まず、San Diego Blood Bank, CAにより採集及び配布された新鮮な血液の軟膜から、濃縮末梢血Ｔ細胞を単離した。簡潔に呼べると、Ficoll－Ｐaque PLUS^{（登録商標）}（GE Healthcare Life Sciences）を用いたＰＢＭＣのSepMate^{（登録商標）}（Stell Cell^{（登録商標）}）系勾配密度分離を製造者の指示に従って実施した。次いで、未使用T-cell Dynabeads^{（登録商標）}キット（Invitrogen）を用い、製造者の指示に従って、新たに単離された総ＰＢＭＣから、未使用のＴ細胞を陰性選択によって更に濃縮した。単離後、２．６Ｅ５に濃縮され、新たに単離された未刺激の末梢血Ｔリンパ球に対し、異なるベクターを用い、種々の感染多重度（ＭＯＩ）で、それぞれ二組の試料に対して同様に形質導入した。形質導入は３７℃で、最終的に９６ウェルプレートフォーマットにより、１００ｕＬのＲＰＭＩ－２％ＨＩＦＣＳ中で１４ｈ行った。ベクターと１４ｈのインキュベーション後、細胞をＰＢＳ－２％ＨＩＦＣＳで三回洗浄し、最終的にＲＰＭＩ－１０％ＨＩＦＣＳ中０．５Ｅ６／ｍＬの細胞密度で、３７℃で３日目までインキュベートした。

ＶＳＶ－Ｇｐｐ又はＭｅＶｐｐとの形質導入から３日後、１Ｅ５の細胞を採集し、フローサイトメトリーによってＣＤ３＋細胞集団におけるＧＦＰの発現を分析した。図２０は、陰性選択Ｔ細胞及び未刺激のＴ細胞について、ＭＯＩに対する形質導入効率のプロットを示す。視認性を高めるためにマークは入れ違いとしてある。ＭＯＩが１の場合、ＭＶ（Ｅｄ）－ＦΔ３０／ＭＶ（Ｅｄ）－ＨΔ１８偽粒子（～７０－８０％）を用いると、ＶＳＶ－Ｇｐｐ（～０－５％）と比較して、未刺激のＴ細胞はより効率的に形質導入された。また、ＭＯＩが５（～７０－８０％）のＭＶ（Ｅｄ）－ＦΔ３０／ＭＶ（Ｅｄ）－ＨΔ２４シュードタイピング粒子を用いた場合、ＭＯＩが６（～５－１０％）のＶＳＶ－Ｇｐｐと比較して、未刺激のＴ細胞がより効率的に形質導入された。新たに単離された未刺激のヒトＴ細胞を偽型のレンチベクターにより形質導入した場合、その形質導入効率は、切断型ＭｅＶ－エンベロープポリペプチドをシュードタイピングに用いた場合の方が、ＶＳＶ－Ｇを用いた場合よりもはるかに高かった。

実施例１３．ＥＦ－１αプロモーターイントロンに挿入されたｍｉＲＮＡの機能性の実証
各々ｍｉＲ－１５５フレームワークを含む４つの分離したgblocks^{（登録商標）}遺伝子断片を設計した。各gblock^{（登録商標）}について、前記ＣＤ３ζｍＲＮＡ転写産物を標的とした独自のｍｉＲＮＡを用い、ｍｉＲ－１５５標的配列を置換した。各gblock^{（登録商標）}には４０bpの重畳配列を含め、これら４つのgblocks^{（登録商標）}の単鎖への組み立て及びＥＦ－１αプロモーターイントロンへの組み込みが容易となるように設計した。これらのgblocks^{（登録商標）}をGibson^{（登録商標）} Assembly ultra（NEBuilder, New England Biolabs, Inc.）の実施用に、市販キットを用いて組み立てた。

ＥＦ－１αプロモーター及びイントロンＡ（配列番号２５５）は、レンチウイルスベクター骨格に含まれるＧＦＰ及びｅＴａｇの発現を誘導するトランス遺伝子発現カセットの一部とした（ＧＦＰ及びセツキシマブによって認識される例示的なｅＴａｇを有するレンチウイルスベクター骨格を、本開示ではＦ０２と称する。）。配列番号２５５における各gblock^{（登録商標）}のヌクレオチド位置及びその対応する構成成分を表３に示す。４つのｍｉＲＮＡがレンチウイルスベクター骨格内で適切に組み立てられたことを、ＥＦ－１αプロモーターの全配列決定により確認した。

表３．配列番号２５５における特徴的なヌクレオチドの位置

懸濁ＨＥＫ２９３細胞に対する以下の４つのプラスミドを用いた一過性共トランスフェクションによって、ＣＤ３ζを標的とした４つのｍｉＲＮＡを含むレンチウイルスを産生した：ＣＤ３ζ ｍＲＮＡ転写産物を標的とする４つのｍｉＲＮＡを含むプラスミド、ＶＳＶ－Ｇを含むプラスミド、ＲＥＶを含むプラスミド、及びＧＡＧ－ＰＯＬを含むプラスミド。４８時間後にウイルス上清を採集し、２４時間かけてＰＥＧ沈殿させた。上清を遠心分離し、ペレット化したウイルスをＩＬ－２を含まない完全ＰＢＭＣ成長培地に再懸濁した。ウイルス力価は４８時間のＪｕｒｋａｔ細胞の形質導入により計算した。

形質導入のために、ＰＢＭＣを０日の時点で解凍し、１００Ｕ／ｍＬのｈｒＩＬ－２と共に２４時間インキュベートした。１日目に、ＣＤ３／ＣＤ２８をコンジュゲートしたビーズを用いてＰＢＭＣを活性化した。２日目に、活性化されたＰＢＭＣを、ｍｉＲＮＡを含むレンチウイルスにより、ＭＯＩが１０で形質導入された。細胞を１１日目まで増殖させ、新鮮なｈｒＩＬ－２を二日毎に追加した。７、９、及び１１日目に、１００万個の細胞をＦＡＣＳ分析用に採集した。

細胞のＣＤ３ε表面発現を調べるため、ＰＥにコンジュゲートされたＯＫＴ－３抗体（Biolegend）を用いて染色した。ＧＦＰ陽性集団（形質導入細胞）内のＰＥの平均蛍光強度（ＭＦ）に基づいて発現レベルを決定した。形質導入細胞の発現レベルを、野生型（Ｆ０２）ウイルスとＣＤ３z ｍｉＲＮＡを含むＦ０２ウイルスとの間で比較した。図２１は、ＣＤ３ζを標的化したｍｉＲＮＡＥＦ－１αプロモーターイントロンが、ＣＤ３複合体の発現をノックダウンできることを示している。

開示された態様、例、及び実験は、開示の範囲を限定することを意図するものでも、以下実験が実施した唯一且つ全ての実験であることを示すものでもない。使用する数値（例えば量、温度等）の正確さには万全を期したが、若干の実験誤差及び偏差が存在するはずである。記載された方法を実施する際には、実験が意図する基本的な側面を変更することなく、変更を加えてもよいと解すべきである。

当業者であれば、本開示の範囲及び主旨の範囲内で、多くの改変や他の態様に想到するであろう。実際に、記載された材料、方法、図、実験、例、及び態様には、本開示の基本的な側面を変更することなく、当業者であれば改変を加えることが可能である。開示された任意の態様を、他の開示された任意の態様と組み合わせて用いてもよい。

場合によっては、具体的な態様を参照しながら説明した概念もある。しかし、当業者であれば理解するように、添付の請求項に記載される発明の範囲から逸脱しない限りにおいて、種々の改変及び変更を加えてもよい。従って、本明細書及び図面は、限定的な意味ではなく、例示的な意味に解すべきであり、斯かる改変は何れも本発明の範囲に含まれることが意図される。

Claims

複製不能組換レトロウイルスであって、
Ａ．当該ウイルスは、その表面に１又は２以上のシュードタイピング要素を含み、
Ｂ．当該ウイルスは更に、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞において活性な１又は２以上のプロモーターと作動式に連結された１又は２以上の転写単位を含むポリヌクレオチドを含み、ここで前記１又は２以上の転写単位は、第１及び第２の改変シグナル伝達ポリペプチドをコードし、
ｉ．前記第１の改変シグナル伝達ポリペプチドは、リンパ増殖性要素を含み、前記リンパ増殖性要素は、サイトカイン受容体ポリペプチド又はそのシグナル伝達ドメインを含む断片を含み、ここで前記リンパ増殖性要素は、Ｔ及び／又はＮＫ細胞の増殖及び／又は生存を促進し、
ii．前記第２の改変シグナル伝達ポリペプチドは、キメラ抗原受容体を含み、前記キメラ抗原受容体は、抗原特異的標的化領域、膜貫通ドメイン、及び細胞内活性化ドメインを含み、
Ｃ．当該ウイルスは更に、その表面に活性化要素を含み、ここで前記活性化要素は、膜付着配列に融合されると共に、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞に結合する能力を有し、ここで前記活性化要素は、前記組換レトロウイルス内のポリヌクレオチドによってコードされたものではない、
複製不能組換レトロウイルス。
前記第１の改変シグナル伝達ポリペプチドが、前記組換レトロウイルスのゲノム内で、ウイルスＬＴＲ又はその活性断片に対して逆向きにコードされている、請求項１に記載の複製不能組換レトロウイルス。
前記１又は２以上のプロモーターのうち少なくとも１つが、前記複製不能組換レトロウイルスを作製するのに使用されるパッケージング系内で活性でない、請求項１に記載の複製不能組換レトロウイルス。
前記プロモーターのうち少なくとも１つが、ＥＦ１ａプロモーター、ＭＳＣＶプロモーター、又はＣＤ３ｚプロモーターである、請求項１に記載の複製不能組換レトロウイルス。
前記ポリヌクレオチドが更にイントロンを含む、請求項１に記載の複製不能組換レトロウイルス。
前記イントロンがｓｈＲＮＡ又は１又は２以上のｍｉＲＮＡをコードする、請求項５に記載の複製不能組換レトロウイルス。
前記イントロンがＥＦ１ａイントロンである、請求項５に記載の複製不能組換レトロウイルス。
前記１又は２以上の転写単位のうち第１の転写単位が、更にイントロンを含み、ここで、前記１又は２以上のプロモーターのうち少なくとも１つと、前記イントロンと、前記第１の転写単位の前記第１の改変シグナル伝達ポリペプチドをコードする核酸とが、前記組換レトロウイルスのゲノム内で、ウイルスＬＴＲ又はその活性断片に対して逆向きに存在する、請求項１に記載の複製不能組換レトロウイルス。
前記リンパ増殖性要素が、Ｓｔａｔ３経路、Ｓｔａｔ４経路、又はＳｔａｔ５経路を活性化する、請求項１に記載の複製不能組換レトロウイルス。
前記リンパ増殖性要素が、ＩＬ－７受容体の細胞内シグナル伝達ドメイン、ＩＬ－１２受容体の細胞内シグナル伝達ドメイン、ＩＬ－１５受容体の細胞内シグナル伝達ドメイン、又はＩＬ－２１受容体の細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項１に記載の複製不能組換レトロウイルス。
前記リンパ増殖性要素が、構成的に活性である、請求項１に記載の複製不能組換レトロウイルス。
前記構成的に活性なリンパ増殖性要素が、ＩＬ－７Ｒα変異体又はその機能断片である、請求項１１に記載の複製不能組換レトロウイルス。
前記構成的に活性なリンパ増殖性要素が、配列番号２２９のアミノ酸２２９～２９２を含むと共に、位置２４３にアミノ酸ＰＰＣＬが挿入されてなる、ＩＬ－７Ｒα変異体の機能断片である、請求項１２に記載の複製不能組換レトロウイルス。
前記リンパ増殖性要素が、承認済生物製剤のモノクローナル抗体の認識ドメインと融合されてなる、請求項１に記載の複製不能組換レトロウイルス。
前記リンパ増殖性要素の発現が、インビボの制御要素によって調節されてなる、請求項１に記載の複製不能組換レトロウイルス。
前記活性化要素が、
Ａ．ＣＤ３に結合可能なポリペプチド；及び／又は
Ｂ．ＣＤ２８に結合可能なポリペプチド
を含む、請求項１に記載の複製不能組換レトロウイルス。
前記活性化要素が前記ＣＤ３に結合可能なポリペプチドを含み、前記ＣＤ３に結合可能なポリペプチドが、異種ＧＰＩアンカー付着配列に融合されたＣＤ３結合性ポリペプチドであり、前記活性化要素が静止Ｔ細胞の表面のＣＤ３に結合し、当該静止Ｔ細胞を活性化させる能力を有する、請求項１６に記載の複製不能組換レトロウイルス。
前記膜結合性ＣＤ３に結合可能なポリペプチドが、抗ＣＤ３抗体である、請求項１６に記載の複製不能組換レトロウイルス。
前記抗ＣＤ３抗体が、ＧＰＩアンカー抗ＣＤ３ｓｃＦｖＦｃである、請求項１８に記載の複製不能組換レトロウイルス。
前記１又は２以上のシュードタイピング要素のうち少なくとも一つが、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ－Ｇ）エンベロープタンパク質、ネコ内因性ウイルス（ＲＤ１１４）エンベロープタンパク質、麻疹ウイルスＦポリペプチド、若しくは麻疹ウイルスＨポリペプチド、又はその機能断片であり、ここで前記１又は２以上のシュードタイピング要素は、前記複製不能組換レトロウイルスの粒子のＴ細胞膜への膜融合を促進する、請求項１に記載の複製不能組換レトロウイルス。
前記複製不能組換レトロウイルスが、レンチウイルス又はγレトロウイルスである、請求項１に記載の複製不能組換レトロウイルス。
前記複製不能組換レトロウイルスの粒子が、その表面に１又は２以上のシュードタイピング要素を含み、ここで前記１又は２以上のシュードタイピング要素の少なくとも１つが、前記活性化要素である、請求項１に記載の複製不能組換レトロウイルス。
Ｔ細胞又はＮＫ細胞を遺伝子的に改変する方法であって、前記Ｔ細胞又はＮＫ細胞をエクスビボで、請求項１に記載の複製不能組換レトロウイルスと接触させることにより、反応混合物を形成することを含み、ここで前記接触により、前記複製不能組換レトロウイルスの前記Ｔ細胞又はＮＫ細胞への融合、及びそれによる遺伝子的に改変されたＴ細胞又はＮＫ細胞の産生が促進される、方法。
Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を遺伝子的に改変する方法であって、
前記Ｔ細胞又はＮＫ細胞をエクスビボで複製不能組換レトロウイルスと接触させることにより、形質導入反応混合物を形成することを含み、
ここで、前記複製不能組換レトロウイルスが、
ａ）その表面に、シュードタイピング要素と、
ｂ）ＣＤ３に結合することが可能な、膜結合性ポリペプチドと、
ｃ）前記Ｔ細胞内で活性な１又は２以上のプロモーターと作動式に連結された１又は２以上の転写単位を含むポリヌクレオチドと
を含み、
ここで、前記１又は２以上の転写単位が、リンパ増殖性要素を含む第１の改変シグナル伝達ポリペプチドをコードし、
ここで、前記リンパ増殖性要素が、サイトカイン受容体ポリペプチド又はそのシグナル伝達ドメインを含む断片を含むと共に、Ｔ細胞の増殖及び／又は生存を促進し、
ここで、前記１又は２以上の転写単位がさらに、抗原特異的標的化領域、膜貫通ドメイン、及び細胞内活性化ドメインを含む第２の改変シグナル伝達ポリペプチドをコードし、
ここで、前記Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を前記形質導入反応混合物から洗浄除去する前に、前記接触を１５分間～１４時間に亘って行い、
ここで、前記接触により、前記複製不能組換レトロウイルスの前記Ｔ細胞又はＮＫ細胞への融合、及びそれによる遺伝子的に改変されたＴ細胞又はＮＫ細胞の産生が促進される、方法。