JP7100857B2 - 生体イメージング用半導体ｓｗｃｎｔ分散液及びその検査方法 - Google Patents
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Description
本発明は、生体イメージング用半導体単層カーボンナノチューブ（ＳＷＣＮＴ）分散液及びその検査方法に関する。
カーボンナノチューブ（以下、ＣＮＴともいう）は、炭素原子が平面的に六角形状に配置されて構成された炭素シート（いわゆる、グラファイトからなるシート）が円筒状に閉じた構造を有する炭素構造体である。このＣＮＴには、多層のもの及び単層のものがあるが、単層ＣＮＴ（以下、ＳＷＣＮＴともいう）の電子物性は、その巻き方（直径や螺旋度）に依存して、金属的性質又は半導体的性質を示すことが知られている。
半導体ＳＷＣＮＴは、生体透過性の良い近赤外領域（８００～２０００ｎｍ）で光吸収及び発光することから、細胞や生体の機能を検出する蛍光プローブとして有用なものであると期待されている。特に、１２００～１４００ｎｍの波長領域は、最も生体透過性が良い領域である。
その半導体ＳＷＣＮＴに酸素原子や官能基を導入することによって、発光波長を変化させることができる。例えば、ＳＷＣＮＴを界面活性剤で分散した水溶液にオゾンを添加した水を混合し、光を照射しながら化学反応させることによって、ナノチューブ壁中の炭素を一部酸素原子に置き換える技術が知られている（非特許文献１及び２）。このようにして酸素原子を導入した場合、ほとんどの酸素原子はＳＷＣＮＴの壁にエーテル結合し、ＳＷＣＮＴの発光エネルギーは元の発光エネルギーよりも約１５０ｍｅＶ小さくなる。このような化学修飾には、ＳＷＣＮＴの発光量子収率を増加するという利点もある。
しかし、非特許文献１及び２で報告されている発光波長の長波長化では、現在最も研究されているＳＷＣＮＴの一つであるカイラル指数（６，５）を有するＳＷＣＮＴに対して、その発光波長は、近赤外蛍光プローブとして最も好ましいとされている約１３００ｎｍ～１４００ｎｍより短い、約１１４０ｎｍ（約１．０８８ｅＶ）にピークを有するものが主な生成物であった。
これに対し、特許文献１には、大気中で半導体単層カーボンナノチューブに直接紫外線を照射することにより、オゾンを発生させて半導体単層カーボンナノチューブを酸化処理することを特徴とする近赤外発光する半導体単層カーボンナノチューブの製造方法が開示されている。
上記特許文献１によれば、グラム量のＳＷＣＮＴに対し短時間で簡便に酸素原子を導入することができ、また、その発光波長のピークを９８０ｎｍ（１．２６５ｅＶ）から１２８０±１３ｎｍ（０．９６８６±０．０１ｅＶ）に変化させることができる。
Ghosh et al., Science, 330, 1656-1659 (2010).
Miyauchi et al., Nat. Photonics, 7, 715-719 (2013).
しかし、上記特許文献１に記載の方法によって製造された半導体ＳＷＣＮＴを用いて、生体（マウス）に投与するための生体イメージング用分散液（生体用プローブ）を調製する場合、ロット単位で品質にばらつきを生じ、一定の性能が得られないという問題があった。例えば、ロットによって半導体ＳＷＣＮＴの分散が不十分であると、短時間で特定の部位（特に、肝臓）に集積してしまい、その他の領域での蛍光分布を検出することができず、また、半導体ＳＷＣＮＴが生体内で凝集することにより肺等に詰まり死に至るリスクがあるという問題があった。それゆえ、ロット単位での品質のばらつきの程度を、生体への投与前、好ましくは出荷前に判定する必要があった。
そこで本発明は、上記の状況に鑑み、異常な集積を呈するものや、所定の波長域で発光しない等、一定の性能が得られていないロットの分散液を、事前に判定することができる検査方法、及び当該検査を受けた生体イメージング用ＳＷＣＮＴ分散液を提供することを目的とする。
本発明者らが鋭意検討を行った結果、生体イメージング用ＳＷＣＮＴ分散液を評価する際に、一つの方法でＳＷＣＮＴの特性を測定しても、肝臓への集積性が認められる分散液を排除できないが、特定の分析方法を複数組み合わせて行うことにより、異常な集積を呈するロットの分散液であるか否かを判定可能になることを見い出した。すなわち、本発明の要旨は以下のとおりである。
（１）大気中で直接紫外線を照射することにより酸化処理された半導体単層カーボンナノチューブと、前記半導体単層カーボンナノチューブの表面をコーティングする両親媒性物質からなる分散剤とを含む半導体ＳＷＣＮＴ分散液について、
吸収分光法、フォトルミネッセンス法及び粒子径測定からなる群から選択される少なくとも２種類の方法を用いて、前記半導体単層カーボンナノチューブの平均粒子径が１０ｎｍより小さいこと、前記半導体単層カーボンナノチューブの孤立分散性が高いこと、及び／又は前記半導体単層カーボンナノチューブが酸化されていることが確認された前記半導体ＳＷＣＮＴ分散液のみから構成される、生体イメージング用半導体ＳＷＣＮＴ分散液。
（２）前記粒子径測定が、遠心沈降法による測定である上記（１）に記載の生体イメージング用半導体ＳＷＣＮＴ分散液。
（３）大気中で直接紫外線を照射することにより酸化処理された半導体単層カーボンナノチューブと、前記半導体単層カーボンナノチューブの表面をコーティングする両親媒性物質からなる分散剤とを含む生体イメージング用半導体ＳＷＣＮＴ分散液の検査方法であって、
吸収分光法、フォトルミネッセンス法及び粒子径測定からなる群から選択される少なくとも２種類の方法を用いて、前記半導体単層カーボンナノチューブの平均粒子径が１０ｎｍより小さいこと、前記半導体単層カーボンナノチューブの孤立分散性が高いこと、及び／又は前記半導体単層カーボンナノチューブが酸化されていることを確認する、生体イメージング用半導体ＳＷＣＮＴ分散液の検査方法。
（４）前記粒子径測定が、遠心沈降法による測定である上記（３）に記載の生体イメージング用半導体ＳＷＣＮＴ分散液の検査方法。
（１）大気中で直接紫外線を照射することにより酸化処理された半導体単層カーボンナノチューブと、前記半導体単層カーボンナノチューブの表面をコーティングする両親媒性物質からなる分散剤とを含む半導体ＳＷＣＮＴ分散液について、
吸収分光法、フォトルミネッセンス法及び粒子径測定からなる群から選択される少なくとも２種類の方法を用いて、前記半導体単層カーボンナノチューブの平均粒子径が１０ｎｍより小さいこと、前記半導体単層カーボンナノチューブの孤立分散性が高いこと、及び／又は前記半導体単層カーボンナノチューブが酸化されていることが確認された前記半導体ＳＷＣＮＴ分散液のみから構成される、生体イメージング用半導体ＳＷＣＮＴ分散液。
（２）前記粒子径測定が、遠心沈降法による測定である上記（１）に記載の生体イメージング用半導体ＳＷＣＮＴ分散液。
（３）大気中で直接紫外線を照射することにより酸化処理された半導体単層カーボンナノチューブと、前記半導体単層カーボンナノチューブの表面をコーティングする両親媒性物質からなる分散剤とを含む生体イメージング用半導体ＳＷＣＮＴ分散液の検査方法であって、
吸収分光法、フォトルミネッセンス法及び粒子径測定からなる群から選択される少なくとも２種類の方法を用いて、前記半導体単層カーボンナノチューブの平均粒子径が１０ｎｍより小さいこと、前記半導体単層カーボンナノチューブの孤立分散性が高いこと、及び／又は前記半導体単層カーボンナノチューブが酸化されていることを確認する、生体イメージング用半導体ＳＷＣＮＴ分散液の検査方法。
（４）前記粒子径測定が、遠心沈降法による測定である上記（３）に記載の生体イメージング用半導体ＳＷＣＮＴ分散液の検査方法。
本発明の検査方法によれば、吸収分光法、フォトルミネッセンス法及び粒子径測定のうち２種以上の方法を用いることで、異常な集積を呈するものや所定の波長領域で発光しない等、一定の性能が得られていないロットの分散液であるか否かを事前に判定することができ、所望の生体イメージング用ＳＷＣＮＴ分散液を提供することができる。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る方法の検査対象である生体イメージング用半導体ＳＷＣＮＴ分散液は、大気中で直接紫外線を照射することにより酸化処理された半導体ＳＷＣＮＴと、その半導体ＳＷＣＮＴの表面をコーティングする両親媒性物質からなる分散剤とを含む。
大気中で直接紫外線を照射することにより、オゾンを発生させ、半導体ＳＷＣＮＴに酸素原子が導入される。大気中で直接紫外線を照射して得られる半導体ＳＷＣＮＴは、発光エネルギーを２９６±１０ｍｅＶ低エネルギー側にシフトすることができ、特に、カイラル指数（６，５）を持つＳＷＣＮＴに適用すると、その発光波長のピークは約９８０ｎｍから１２８０±１３ｎｍへと変化し、近赤外蛍光プローブとして好ましい、生体透過性を有する波長領域に発光波長のピークを有するものとなる。
紫外線を照射することによる酸化処理について、上述の非特許文献１及び２等の従来の湿式による方法（ＳＷＣＮＴを水溶液中で反応させる方法）では、ほとんどの酸素はＳＷＣＮＴとエーテル結合するために２９０ｍｅＶを超える低エネルギーシフトは困難であった。これに対し、本発明の評価対象である半導体ＳＷＣＮＴでは、大気中で直接紫外線を照射することにより、導入された酸素原子はほとんどがエポキシドとしてＳＷＣＮＴに導入され、これによってＳＷＣＮＴの発光エネルギーを２９６±１０ｍｅＶ低エネルギー側にシフトさせることが可能となる。
半導体ＳＷＣＮＴの合成方法は特に限定されず、公知の化学気相成長法、アーク放電法、レーザー蒸発法等の方法を用いて適宜合成することができる。特に、触媒の存在下、化学気相成長法によって合成することが好ましい。
分散液における半導体ＳＷＣＮＴの平均粒子径は、１０ｎｍより小さいことが好ましく、好ましくは、６ｎｍ以上１０ｎｍ未満の範囲内である。平均粒子径が１０ｎｍより小さい微小な半導体ＳＷＣＮＴは、肺の血管等を閉塞することがなく、毒性が低い。ここで、半導体ＳＷＣＮＴの平均粒子径とは、遠心沈降法によって測定される、重量基準の粒度分布における平均径をいう。
大気中で直接紫外線を照射してオゾンを発生させる際には、密閉された空間内で行うことが好ましく、例えばＵＶオゾンクリーナ等の、紫外線を大気に照射することによってオゾンを発生させる装置が好ましく用いられる。また、紫外線の照射条件は、用いる装置によって異なるが、照射により半導体ＳＷＣＮＴが破壊されない条件下で行うことが好ましい。
また、大気中で半導体ＳＷＣＮＴに直接紫外線を照射するために、予め基材上に半導体ＳＷＣＮＴを膜状に形成しておくことが好ましく、特に、酸素原子が導入される半導体ＳＷＣＮＴに均一に化学反応を起こすために、半導体ＳＷＣＮＴを厚さ１μｍ程度の薄膜状にした状態で紫外線を照射することが好ましい。
半導体ＳＷＣＮＴの表面をコーティングする両親媒性物質からなる分散剤としては、特に限定されるものではなく、生体に対して毒性が小さく、半導体ＳＷＣＮＴとの親和性に優れるものであれば適宜用いることができる。具体的には、疎水性の脂質部位に親水性のＰＥＧが結合してなるポリエチレングリコール脂質誘導体、核酸、ウシ血清アルブミン等を挙げることができる。特に、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン－ＰＥＧ２０００（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００）等のポリエチレングリコール脂質誘導体が好ましく用いられる。
ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００等の分散剤によって半導体ＳＷＣＮＴの表面をコーティングすることにより、半導体ＳＷＣＮＴの分散状態が維持され、半導体ＳＷＣＮＴの粒子径が微小であることと相まって、半導体ＳＷＣＮＴが特定の臓器に集積することなく、また、肺の血管等を閉塞することがない。
酸化処理された半導体ＳＷＣＮＴと、両親媒性物質からなる分散剤との重量割合は、半導体ＳＷＣＮＴの表面が十分にコーティングされ、分散状態が維持できればよく特に限定されるものではないが、酸化処理された半導体ＳＷＣＮＴ：分散剤の重量比が、１：２～１：２０の範囲内であることが好ましい。
以上のような生体イメージング用半導体ＳＷＣＮＴ分散液を製造するに際しては、種々の方法を採用することができるが、まず、上述のように大気中で直接紫外線を照射することにより酸化処理された半導体ＳＷＣＮＴを、表面を分散剤でコーティングする前に、界面活性剤の溶液中に分散させることが好ましい。
ここで、界面活性剤としては、半導体ＳＷＣＮＴを分散できるものであれば良く、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、両性イオン界面活性剤、非イオン性界面活性剤等の公知の各種界面活性剤から適宜選択して用いることができる。
陰イオン界面活性剤としては、例えば、アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキルナフタレンスルホン酸塩、アルキルスルホン酸塩、ジアルキルスルホコハク酸塩、アルキル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、アルキルリン酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸塩、コール酸塩、デオキシコール酸塩、グリココール酸塩、タウロコール酸塩、タウロデオキシコール酸塩等を挙げることができる。
また、陽イオン界面活性剤としては、例えば、テトラアルキルアンモニウム塩、トリアルキルベンジルアンモニウム塩、アルキルピリジウム塩等を挙げることができる。
両性イオン界面活性剤としては、例えば、２－メタクロイルオキシホスホリルコリンのポリマーやポリペプチド等の両性イオン高分子、３－（Ｎ，Ｎ－ジメチルステアリルアンモニオ）－プロパンスルホネート、３－（Ｎ，Ｎ－ジメチルステアリルアンモニオ）プロパンスルホネート、３－（Ｎ，Ｎ－ジメチルミリスチルアンモニオ）プロパンスルホネート、３－［（３－コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルフォネート（ＣＨＡＰＳ）、３－［（３－コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－２－ヒドロキシプロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）、ｎ－ドデシル－Ｎ，Ｎ’－ジメチル－３－アンモニオ－１－プロパンスルホネート、ｎ－ヘキサデシル－Ｎ，Ｎ’－ジメチル－３－アンモニオ－１－プロパンスルホネート、ｎ－オクチルホスホコリン、ｎ－ドデシルホスホコリン、ｎ－テトラデシルホスホコリン、ｎ－ヘキサデシルホスホコリン、ジメチルアルキルベタイン、パーフルオロアルキルベタイン及びＮ，Ｎ－ビス（３－Ｄ－グルコナミドプロピル）－コラミド、レシチン等を挙げることができる。
さらに、非イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン多価アルコール脂肪酸部分エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル等を挙げることができる。
特に、半導体ＳＷＣＮＴの分散性に優れることから、ラウリルベンゼン硫酸ナトリウム（ＳＤＢＳ）等のアルキルベンゼンスルホン酸塩が好ましく用いられる。
半導体ＳＷＣＮＴを、界面活性剤の溶液中に分散させる方法としては、各種ホモジナイザー等を用いて行うことができる。
得られた分散液は、必要に応じて、遠心分離を行い、上澄みを回収することにより、半導体ＳＷＣＮＴの孤立分散性を高めることができる。孤立分散の半導体単層ＳＷＣＮＴは、生体に投与した場合に、蛍光量子収率の向上、ステルス性の向上、クリアランスの向上という利点があるため好ましい。
続いて、半導体ＳＷＣＮＴを界面活性剤の溶液中に分散させた分散液に、上述のポリエチレングリコール脂質誘導体等の両親媒性物質からなる分散剤を溶解させ、その後、得られた溶液から透析によって界面活性剤を除去することにより、半導体ＳＷＣＮＴの周囲に存在していた界面活性剤をポリエチレングリコール脂質誘導体等の分散剤によって置換し、半導体ＳＷＣＮＴの表面を分散剤によって十分にコーティングすることができる。
表面が分散剤でコーティングされた半導体ＳＷＣＮＴは、生体イメージング用半導体ＳＷＣＮＴ分散液として、生体に投与した場合に、分散状態が維持されるため、半導体ＳＷＣＮＴ自体の粒子径が微小であることと相まって、特定の臓器（主に、肝臓）に集積せず、ハレーションを低減することができる。また、肺の血管等を閉塞することがなく、ＳＤＢＳ等の界面活性剤が透析により除去されているため毒性が極めて低い。また、良好に分散することで、凝集性が低下し、発光する蛍光の光量低下を防ぐことができる。
以上のような生体イメージング用半導体ＳＷＣＮＴ分散液を検査するに際し、本発明では、吸光分光法、フォトルミネッセンス法及び粒子径測定からなる群から選択される少なくとも２種類の方法を用いて行う。
ここで、吸光分光法は、赤外線、可視、紫外線等を用いる方法を採用することができる。これにより、分散液中のＳＷＣＮＴ濃度及び分散状態を評価することができる。
また、フォトルミネッセンス法（ＰＬ法）として、光源、ステージ及び検出器等の測定系はそれぞれ一般的な構成を用いることができるが、半導体ＳＷＣＮＴが酸化され、生体透過性が良い１２００～１４００ｎｍの波長領域において発光することを確認するため、励起波長は４００ｎｍ～１０００ｎｍの範囲内（例えば９８０ｎｍ）とし、近赤外領域の発光を検出することが好ましい。
さらに、粒子径測定の方法としては、画像解析法、遠心沈降法、レーザー回折散乱法等の方法を適宜採用することができる。特に、重量基準の粒子径分布が得られる遠心沈降法により粒子径を測定することが好ましい。これにより、半導体ＳＷＣＮＴの平均粒子径が肺の血管等を閉塞しない１０μｍより小さいか否か、孤立分散性が高いか否か、さらに、半導体ＳＷＣＮＴの粒子径分布のうち１０ｎｍより小さいものの割合を評価することができる。
生体イメージング用半導体ＳＷＣＮＴ分散液は、生体に投与された場合に、凝集せず、特定の臓器以外の領域でも蛍光が観測できること、且つ蛍光の光量が大きいことが重要である。このような生体イメージング用分散液に特有の性能を評価するためには、吸光分光法、フォトルミネッセンス法及び粒子径測定のいずれか一つの方法では不適当であり、少なくとも２種類を組み合わせて総合的に評価する必要がある。好ましくは、粒子径測定と、吸光分光法及び／又はフォトルミネッセンス法とを組み合わせることが好ましい。これにより、生体イメージング用ＳＷＣＮＴ分散液を、品質がばらつくことなく良好な性能を維持した状態で提供することができる。
以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（製造例１）
カーボンナノチューブ（ＣｏＭｏＣＡＴ ＳＧ６５ｉ、平均直径０．８ｎｍ、以下「半導体ＳＷＣＮＴ」という）１ｍｇをエタノール１０ｍｌに加え、バスソニケーションに５分ほどかけて半導体ＳＷＣＮＴをエタノールに分散させた。続いて、減圧濾過器にオムニポアメンブレン（φ４７ｍｍ、５μｍポアをセットし、半導体ＳＷＣＮＴ／エタノール分散液を入れてろ過し、フィルター上に半導体ＳＷＣＮＴを均一に載せた。次に、半導体ＳＷＣＮＴをフィルターに載せたまま薬包紙で挟み、フィルターが丸まらないよう軽く重石をしながら６０℃で３０分乾燥させた。そして、フィルターに載せた半導体ＳＷＣＮＴをフィルターごと６０～７０秒オゾン処理した（光源は水銀ランプ、半導体ＳＷＣＮＴ上での紫外線強度は約１９ｍＷ／ｃｍ２）。
（製造例１）
カーボンナノチューブ（ＣｏＭｏＣＡＴ ＳＧ６５ｉ、平均直径０．８ｎｍ、以下「半導体ＳＷＣＮＴ」という）１ｍｇをエタノール１０ｍｌに加え、バスソニケーションに５分ほどかけて半導体ＳＷＣＮＴをエタノールに分散させた。続いて、減圧濾過器にオムニポアメンブレン（φ４７ｍｍ、５μｍポアをセットし、半導体ＳＷＣＮＴ／エタノール分散液を入れてろ過し、フィルター上に半導体ＳＷＣＮＴを均一に載せた。次に、半導体ＳＷＣＮＴをフィルターに載せたまま薬包紙で挟み、フィルターが丸まらないよう軽く重石をしながら６０℃で３０分乾燥させた。そして、フィルターに載せた半導体ＳＷＣＮＴをフィルターごと６０～７０秒オゾン処理した（光源は水銀ランプ、半導体ＳＷＣＮＴ上での紫外線強度は約１９ｍＷ／ｃｍ２）。
オゾン処理を行った後、半導体ＳＷＣＮＴをフィルターごと１０ｍｌの０．３％ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン－ＰＥＧ２０００（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００）水溶液に入れ、チップ型ホモジナイザーで氷冷しながら２０分間（ＯＮ：ＯＦＦ＝１秒：１秒）超音波破砕し、半導体ＳＷＣＮＴをＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００水溶液中に分散させた。続いて、フィルターを取り除いた半導体ＳＷＣＮＴ分散溶液を超遠心分離機（１０４，０００ｇ、３時間）にかけ、上澄みを回収し、生体イメージング用半導体ＳＷＣＮＴ分散液を製造した。
（製造例２）
カーボンナノチューブ（ＣｏＭｏＣＡＴ ＳＧ６５ｉ、平均直径０．８ｎｍ、以下「半導体ＳＷＣＮＴ」という）１ｍｇをエタノール１０ｍｌに加え、バスソニケーションに５分ほどかけて半導体ＳＷＣＮＴをエタノールに分散させた。続いて、減圧濾過器にオムニポアメンブレン（φ４７ｍｍ、５μｍポアをセットし、半導体ＳＷＣＮＴ／エタノール分散液を入れてろ過し、フィルター上に半導体ＳＷＣＮＴを均一に載せた。次に、半導体ＳＷＣＮＴをフィルターに載せたまま薬包紙で挟み、フィルターが丸まらないよう軽く重石をしながら６０℃で３０分乾燥させた。そして、フィルターに載せた半導体ＳＷＣＮＴをフィルターごと６０～７０秒オゾン処理した（光源は水銀ランプ、半導体ＳＷＣＮＴ上での紫外線強度は約１９ｍＷ／ｃｍ２）。
（製造例２）
カーボンナノチューブ（ＣｏＭｏＣＡＴ ＳＧ６５ｉ、平均直径０．８ｎｍ、以下「半導体ＳＷＣＮＴ」という）１ｍｇをエタノール１０ｍｌに加え、バスソニケーションに５分ほどかけて半導体ＳＷＣＮＴをエタノールに分散させた。続いて、減圧濾過器にオムニポアメンブレン（φ４７ｍｍ、５μｍポアをセットし、半導体ＳＷＣＮＴ／エタノール分散液を入れてろ過し、フィルター上に半導体ＳＷＣＮＴを均一に載せた。次に、半導体ＳＷＣＮＴをフィルターに載せたまま薬包紙で挟み、フィルターが丸まらないよう軽く重石をしながら６０℃で３０分乾燥させた。そして、フィルターに載せた半導体ＳＷＣＮＴをフィルターごと６０～７０秒オゾン処理した（光源は水銀ランプ、半導体ＳＷＣＮＴ上での紫外線強度は約１９ｍＷ／ｃｍ２）。
オゾン処理を行った後、半導体ＳＷＣＮＴをフィルターごと１０ｍｌの１％ＳＤＢＳ－Ｈ２Ｏに入れ、チップ型ホモジナイザーで氷冷しながら２０分間（ＯＮ：ＯＦＦ＝１秒：１秒）超音波破砕し、半導体ＳＷＣＮＴをＳＤＢＳ溶液中に分散させた。続いて、フィルターを取り除いた半導体ＳＷＣＮＴ分散溶液を超遠心分離機（１０４，０００ｇ、１時間）にかけ、上澄みを回収し、半導体ＳＷＣＮＴ孤立分散液を得た。
半導体ＳＷＣＮＴ孤立分散液に、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン－ＰＥＧ２０００（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００）を３ｍｇ／ｍｌになるよう添加し、バスソニケーションに５分ほどかけて、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００の粉末を溶解させた。そして、透析膜（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ、Ｇ２３５０７０）にこの溶液を入れ、２リットルの水で透析を行った。この過程で、ＳＤＢＳがＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００に置換される。
２時間後、透析外液を分析用に５ｍｌ採取した後に捨て、水と交換した。同様に、１晩後、２日後、３日後に水を交換し、それぞれ分析用にとっておいた透析外液の吸収スペクトルを測定して透析率を計算し、９５％以上のＳＤＢＳの溶出が確認できたところで、透析を終了し、目的の生体イメージング用半導体ＳＷＣＮＴ分散液を製造した。
（製造例３）
カーボンナノチューブ（ＣｏＭｏＣＡＴ ＳＧ６５ｉ、平均直径０．８ｎｍ、以下「半導体ＳＷＣＮＴ」という）１ｍｇをエタノール１０ｍｌに加え、バスソニケーションに５分ほどかけて半導体ＳＷＣＮＴをエタノールに分散させた。続いて、減圧濾過器にオムニポアメンブレン（φ４７ｍｍ、５μｍポアをセットし、半導体ＳＷＣＮＴ／エタノール分散液を入れてろ過し、フィルター上に半導体ＳＷＣＮＴを均一に載せた。次に、半導体ＳＷＣＮＴをフィルターに載せたまま薬包紙で挟み、フィルターが丸まらないよう軽く重石をしながら６０℃で３０分乾燥させた。そして、フィルターに載せた半導体ＳＷＣＮＴをフィルターごと６０～７０秒オゾン処理した（光源は水銀ランプ、半導体ＳＷＣＮＴ上での紫外線強度は約１９ｍＷ／ｃｍ２）。
（製造例３）
カーボンナノチューブ（ＣｏＭｏＣＡＴ ＳＧ６５ｉ、平均直径０．８ｎｍ、以下「半導体ＳＷＣＮＴ」という）１ｍｇをエタノール１０ｍｌに加え、バスソニケーションに５分ほどかけて半導体ＳＷＣＮＴをエタノールに分散させた。続いて、減圧濾過器にオムニポアメンブレン（φ４７ｍｍ、５μｍポアをセットし、半導体ＳＷＣＮＴ／エタノール分散液を入れてろ過し、フィルター上に半導体ＳＷＣＮＴを均一に載せた。次に、半導体ＳＷＣＮＴをフィルターに載せたまま薬包紙で挟み、フィルターが丸まらないよう軽く重石をしながら６０℃で３０分乾燥させた。そして、フィルターに載せた半導体ＳＷＣＮＴをフィルターごと６０～７０秒オゾン処理した（光源は水銀ランプ、半導体ＳＷＣＮＴ上での紫外線強度は約１９ｍＷ／ｃｍ２）。
オゾン処理を行った後、半導体ＳＷＣＮＴをフィルターごと１０ｍｌの１％ＳＤＢＳ－Ｈ２Ｏに入れ、チップ型ホモジナイザーで氷冷しながら２０分間（ＯＮ：ＯＦＦ＝１秒：１秒）超音波破砕し、半導体ＳＷＣＮＴをＳＤＢＳ溶液中に分散させた。続いて、フィルターを取り除いた半導体ＳＷＣＮＴ分散溶液を超遠心分離機（１０４，０００ｇ、３時間）にかけ、上澄みを回収し、半導体ＳＷＣＮＴ孤立分散液を得た。
半導体ＳＷＣＮＴ孤立分散液に、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン－ＰＥＧ２０００（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００）を３ｍｇ／ｍｌになるよう添加し、バスソニケーションに５分ほどかけて、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００の粉末を溶解させた。そして、透析膜（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ、Ｇ２３５０７０）にこの溶液を入れ、２リットルの水で透析を行った。この過程で、ＳＤＢＳがＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００に置換される。
２時間後、透析外液を分析用に５ｍｌ採取した後に捨て、水と交換した。同様に、１晩後、２日後、３日後に水を交換し、それぞれ分析用にとっておいた透析外液の吸収スペクトルを測定して透析率を計算し、９５％以上のＳＤＢＳの溶出が確認できたところで、透析を終了し、目的の生体イメージング用半導体ＳＷＣＮＴ分散液を製造した。
（吸収分光法及びフォトルミネッセンス法による測定）
製造例１～３で得られた生体イメージング用半導体ＳＷＣＮＴ分散液について、島津製作所紫外可視近赤外分光光度計ＵＶ－３１００を用い、吸収スペクトルを測定した。また、９８０ｎｍを励起波長として、堀場製作所Ｆｌｕｏｒｏｌｏｇ－３－２－ｉＨＲ３２０を用いて発光スペクトルを測定した。測定結果をそれぞれ図１及び図２に示す。なお、図１及び図２における吸光度及び発光強度は、分散液の濃度を規格化している。
（吸収分光法及びフォトルミネッセンス法による測定）
製造例１～３で得られた生体イメージング用半導体ＳＷＣＮＴ分散液について、島津製作所紫外可視近赤外分光光度計ＵＶ－３１００を用い、吸収スペクトルを測定した。また、９８０ｎｍを励起波長として、堀場製作所Ｆｌｕｏｒｏｌｏｇ－３－２－ｉＨＲ３２０を用いて発光スペクトルを測定した。測定結果をそれぞれ図１及び図２に示す。なお、図１及び図２における吸光度及び発光強度は、分散液の濃度を規格化している。
図１に示すように、５７０ｎｍ、９８０ｎｍに吸収ピークが存在し、遠心分離を施すことにより線幅が減少していることから孤立分散しているＳＷＣＮＴの割合が大きくなっていることがわかる。また、図２の発光スペクトルにおける約１３００ｎｍのショルダーから、大気中での紫外線の直接照射により半導体単層カーボンナノチューブが酸化処理され、特に、酸素原子がエポキシドとして導入されていることが示唆された。
また、図２に示すように、半導体ＳＷＣＮＴを界面活性剤（ＳＤＢＳ）の溶液中に分散させる工程を経た製造例２及び３の半導体ＳＷＣＮＴ分散液は、当該工程を経ないで直接ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００中に分散させた製造例１の半導体ＳＷＣＮＴ分散液に比べて、高い発光強度が得られた。この結果は、製造例２及び３では、製造例１に比べ半導体ＳＷＣＮＴの表面がＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００によって十分にコーティングされ、半導体ＳＷＣＮＴが凝集せず、より孤立分散性が高まったことによって発光量子効率が向上したためと考えられる。
なお、図１に示すように、製造例１に比べて、製造例２及び３の吸収波長は低波長側にシフトしていた。これは、バンドル状のＳＷＣＮＴに対し、孤立分散状態であるＳＷＣＮＴの割合が高まったためと推測される。
（粒子径測定）
製造例１～３で得られた生体イメージング用半導体ＳＷＣＮＴ分散液について、ＣＰＳ社製ディスク遠心式粒子径分布測定装置ＤＣ２４０００ＵＨＲを用い、遠心沈降法による粒子径測定を行った。その結果を図３に示す。図３の結果から、製造例１～３の生体イメージング用半導体ＳＷＣＮＴ分散液における半導体ＳＷＣＮＴの平均粒子径はそれぞれ、８ｎｍ、１０ｎｍ、及び６．５ｎｍであった。また、それぞれの生体イメージング用半導体ＳＷＣＮＴ分散液における粒子径が１０ｎｍより小さいものの割合はそれぞれ４４％、３０％、８４％であった。遠心分離を１時間行った製造例２に比べて、遠心分離を３時間行った製造例３における半導体ＳＷＣＮＴは、より孤立分散であることが確認された。
（ｉｎ ｖｉｖｏイメージング）
製造例３及び製造例１で得られた生体イメージング用半導体ＳＷＣＮＴ分散液を、ＳＷＣＮＴ濃度が２００μｇ／ｍｌになるように０．３％のＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００溶液で調製した後、０．１ｍｌマウスに投与し、０～６時間後の蛍光を島津製作所ＳＡＩ－１０００装置を用いて観察した。その結果を図４（製造例３）及び図５（製造例１）に示す。
（粒子径測定）
製造例１～３で得られた生体イメージング用半導体ＳＷＣＮＴ分散液について、ＣＰＳ社製ディスク遠心式粒子径分布測定装置ＤＣ２４０００ＵＨＲを用い、遠心沈降法による粒子径測定を行った。その結果を図３に示す。図３の結果から、製造例１～３の生体イメージング用半導体ＳＷＣＮＴ分散液における半導体ＳＷＣＮＴの平均粒子径はそれぞれ、８ｎｍ、１０ｎｍ、及び６．５ｎｍであった。また、それぞれの生体イメージング用半導体ＳＷＣＮＴ分散液における粒子径が１０ｎｍより小さいものの割合はそれぞれ４４％、３０％、８４％であった。遠心分離を１時間行った製造例２に比べて、遠心分離を３時間行った製造例３における半導体ＳＷＣＮＴは、より孤立分散であることが確認された。
（ｉｎ ｖｉｖｏイメージング）
製造例３及び製造例１で得られた生体イメージング用半導体ＳＷＣＮＴ分散液を、ＳＷＣＮＴ濃度が２００μｇ／ｍｌになるように０．３％のＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００溶液で調製した後、０．１ｍｌマウスに投与し、０～６時間後の蛍光を島津製作所ＳＡＩ－１０００装置を用いて観察した。その結果を図４（製造例３）及び図５（製造例１）に示す。
図４及び図５に示すように、製造例１の半導体ＳＷＣＮＴ分散液は肝臓への集積が認められたが、製造例３の半導体ＳＷＣＮＴ分散液は、投与後の時間が経過しても肝臓への集積は認められず、ハレーションを低減できることが明らかとなった。製造例２（図示せず）も製造例１と同様の傾向を示した。これは、製造例１では、半導体ＳＷＣＮＴを界面活性剤（ＳＤＢＳ）の溶液中に分散させる工程を経ないため、孤立分散性が低く、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００によるコーティングが不十分であり、半導体ＳＷＣＮＴが良好に分散せず一部凝集したためと考えられる。
製造例３の分散液は、吸収分光法、フォトルミネッセンス法及び粒子径測定の３つの方法で測定した結果、いずれも、（１）半導体ＳＷＣＮＴの平均粒子径が１０ｎｍより小さいと判定され、（２）半導体ＳＷＣＮＴの孤立分散性が高いと判定され、且つ、（３）半導体ＳＷＣＮＴが酸化されているものと判定された。
一方、製造例１の場合は、上記（１）～（３）がいずれも満たされなかった。
以上から、本発明に係る検査方法が、異常な集積を呈し、所望の波長領域で発光しない製造例（ロット）の分散剤であるかどうかを判定する方法として有効であるといえる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
Claims (4)
- 生体イメージング用半導体ＳＷＣＮＴ分散液の製造方法であって、
半導体単層カーボンナノチューブに大気中で直接紫外線を照射することにより酸化処理する工程と、
酸化処理した半導体単層カーボンナノチューブを、界面活性剤の溶液中に分散させる工程と、
得られた分散液に、両親媒性物質からなる分散剤を溶解させる工程と、
得られた溶液から、透析によって界面活性剤を除去する工程と、
吸収分光法及び／又はフォトルミネッセンス法と、粒子径測定とを用いて、前記半導体単層カーボンナノチューブの平均粒子径が１０ｎｍより小さいことと、前記半導体単層カーボンナノチューブの孤立分散性が、前記界面活性剤の溶液中に分散させる工程を経ずに前記酸化処理した半導体単層カーボンナノチューブを前記両親媒性物質からなる分散剤に直接溶解させたときの前記半導体単層カーボンナノチューブの孤立分散性に比べて高いこと、及び／又は前記半導体単層カーボンナノチューブが酸化されていることを検査する工程と、
を含む生体イメージング用半導体ＳＷＣＮＴ分散液の製造方法。 - 前記粒子径測定が、遠心沈降法による測定である請求項１に記載の生体イメージング用半導体ＳＷＣＮＴ分散液の製造方法。
- 前記界面活性剤が、アルキルベンゼンスルホン酸塩である請求項１又は２に記載の生体イメージング用半導体ＳＷＣＮＴ分散液の製造方法。
- 前記分散剤が、ポリエチレングリコール脂質誘導体である請求項１～３のいずれか一項に記載のイメージング用半導体ＳＷＣＮＴ分散液の製造方法。
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