JP7100057B2 - ゲノム編集のためのシステム及び方法 - Google Patents
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Description
一態様では、本発明は、以下のi)~v):
i) Cpf1タンパク質、及びガイドRNA;
ii) Cpf1タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物、及びガイドRNA;
iii) Cpf1タンパク質、及びガイドRNAをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物;
iv) Cpf1タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物、及びガイドRNAをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物;
v) Cpf1タンパク質をコードするヌクレオチド配列及びガイドRNAをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物
のうちの少なくとも1つを含む、細胞のゲノム中の標的配列の部位特異的改変のためのゲノム編集システムであって、
Cpf1タンパク質は、配列番号1~12のアミノ酸配列又は配列番号1~12のうちの1つに対して少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ガイドRNAは、Cpf1タンパク質を、細胞のゲノム中の標的配列に標的化させることができる、システムを提供する。
1. 定義
本発明において、本明細書で使用される科学用語及び技術用語は、他に明記しない限り、当業者によって一般に理解される意味を有する。また、本明細書で使用されるタンパク質及び核酸化学、分子生物学、細胞及び組織培養、微生物学、免疫学関連用語、及び実験室手順は、対応する分野で広く使用されている用語及び日常的処置である。例えば、本発明で使用される標準的な組換えDNA及び分子クローニング技術は当業者に周知であり、以下の文書により完全に記載されている: Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1989(本明細書において以降、「Sambrook」と呼ばれる)。一方、本発明をよりよく理解するために、関連する用語の定義及び説明を以下に提供する。
一態様では、本発明は、真核生物ゲノム編集における、配列番号1~12のうちの1つに対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、さらには100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むCpf1タンパク質の使用を提供する。
i) Cpf1タンパク質、及びガイドRNA;
ii) Cpf1タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物、及びガイドRNA;
iii) Cpf1タンパク質、及びガイドRNAをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物;
iv) Cpf1タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物、及びガイドRNAをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物;
v) Cpf1タンパク質をコードするヌクレオチド配列及びガイドRNAをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物
のうちの少なくとも1つを含む、細胞のゲノム中の標的配列の部位特異的改変のためのゲノム編集システムであって、
Cpf1タンパク質は、配列番号1~12のアミノ酸配列又は配列番号1~12のうちの1つに対して少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ガイドRNAは、Cpf1タンパク質を、細胞のゲノム中の標的配列に標的化させることができる、システムを提供する。
i) 5'-ATTTCTACtgttGTAGAT(配列番号25)-Nx-3';
ii) 5'-ATTTCTACtattGTAGAT(配列番号26)-Nx-3';
iii) 5'-ATTTCTACtactGTAGAT(配列番号27)-Nx-3';
iv) 5'-ATTTCTACtttgGTAGAT(配列番号28)-Nx-3';
v) 5'-ATTTCTACtagttGTAGAT(配列番号29)-Nx-3';
vi) 5'-ATTTCTACTATGGTAGAT(配列番号30)-Nx-3';
vii) 5'-ATTTCTACTGTCGTAGAT(配列番号31)-Nx-3';
viii) 5'-ATTTCTACTTGTGTAGAT(配列番号32)-Nx-3'; 及び
ix) 5'-ATTTCTACTGTGGTAGAT(配列番号33)-Nx-3'
(Nxは、x個の連続したヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を表し、Nは、独立して、A、G、C及びTから選択され; xは、18≦x≦35の整数であり、好ましくはx=23である)からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、配列Nx(スペーサー配列)は、標的配列の相補体に特異的にハイブリダイズすることができる。
i) 5'-ATTTCTACtgttGTAGAT(配列番号25)-Nx-3';
ii) 5'-ATTTCTACtattGTAGAT(配列番号26)-Nx-3';
iii) 5'-ATTTCTACtactGTAGAT(配列番号27)-Nx-3';
iv) 5'-ATTTCTACtttgGTAGAT(配列番号28)-Nx-3';
v) 5'-ATTTCTACtagttGTAGAT(配列番号29)-Nx-3';
vi) 5'-ATTTCTACTATGGTAGAT(配列番号30)-Nx-3';
vii) 5'-ATTTCTACTGTCGTAGAT(配列番号31)-Nx-3';
viii) 5'-ATTTCTACTTGTGTAGAT(配列番号32)-Nx-3'; 及び
ix) 5'-ATTTCTACTGTGGTAGAT(配列番号33)-Nx-3'
(Nxは、x個の連続したヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を表し、Nは、独立して、A、G、C及びTから選択され; xは、18≦x≦35の整数であり、好ましくはx=23である)からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、配列Nx(スペーサー配列)は、標的配列の相補体に特異的にハイブリダイズすることができる。
別の態様では、本発明は、細胞のゲノム中の標的配列を改変する方法であって、本発明のゲノム編集システムを細胞に導入するステップを含み、それにより、ガイドRNAは、Cpf1タンパク質を、細胞のゲノム中の標的配列に標的化させ、標的配列中の1つ以上のヌクレオチドの置換、欠失及び/又は付加をもたらす、方法を提供する。
i) 5'-ATTTCTACtgttGTAGAT(配列番号25)-Nx-3';
ii) 5'-ATTTCTACtattGTAGAT(配列番号26)-Nx-3';
iii) 5'-ATTTCTACtactGTAGAT(配列番号27)-Nx-3';
iv) 5'-ATTTCTACtttgGTAGAT(配列番号28)-Nx-3';
v) 5'-ATTTCTACtagttGTAGAT(配列番号29)-Nx-3';
vi) 5'-ATTTCTACTATGGTAGAT(配列番号30)-Nx-3';
vii) 5'-ATTTCTACTGTCGTAGAT(配列番号31)-Nx-3';
viii) 5'-ATTTCTACTTGTGTAGAT(配列番号32)-Nx-3'; 及び
ix) 5'-ATTTCTACTGTGGTAGAT(配列番号33)-Nx-3'
(Nxは、x個の連続したヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を表し、Nは、独立して、A、G、C及びTから選択され; xは、18≦x≦35の整数であり、好ましくはx=23である)からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、配列Nx(スペーサー配列)は、標的配列の相補体に特異的にハイブリダイズすることができる。
本発明はまた、疾患の治療における本発明のゲノム編集システムの使用を包含する。
本発明の範囲はまた、本発明のゲノム編集システム、及び説明書を含む、本発明の方法に使用するためのキットを含む。キットは、一般に、意図される使用及び/又はキットの内容物の使用方法を示すラベルを含む。ラベルという用語は、キット上若しくはキットと共に提供される又は他の方法でキットと共に提供される任意の記載された又は記録された材料を含む。
本発明は以下の態様も提供する。
[1] 以下のi)~v):
i) Cpf1タンパク質、及びガイドRNA;
ii) Cpf1タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物、及びガイドRNA; iii) Cpf1タンパク質、及びガイドRNAをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物;
iv) Cpf1タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物、及びガイドRNAをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物;
v) Cpf1タンパク質をコードするヌクレオチド配列及びガイドRNAをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物
のうちの少なくとも1つを含む、細胞のゲノム中の標的配列の部位特異的改変のためのゲノム編集システムであって、
Cpf1タンパク質は、配列番号1~12のアミノ酸配列又は配列番号1~12のうちの1つに対して少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ガイドRNAは、Cpf1タンパク質を、細胞のゲノム中の標的配列に標的化させることができる、システム。
[2] Cpf1タンパク質が、配列番号1~12のうちの1つに対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、さらには100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、[1]に記載のシステム。
[3] Cpf1タンパク質が、配列番号1~12のうちの1つに対して1つ以上のアミノ酸残基の置換、欠失又は付加を有するアミノ酸配列を含み、例えば、Cpf1タンパク質が、配列番号1~12のうちの1つに対して1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個のアミノ酸残基の置換、欠失又は付加を有するアミノ酸配列を含む、[1]に記載のシステム。
[4] Cpf1タンパク質が、アガトバクター・レクタリス(Agathobacter rectalis)、ラクノスピラ・ペクチノスチザ(Lachnospira pectinoschiza)、スネアチア・アムニイ(Sneathia amnii)、ヘルココッカス・クンツィイ(Helcococcus kunzii)、アルコバクター・ブツレリ(Arcobacter butzleri)、バクテロイデス門オーラル(Bacteroidetes oral)、オリバクテリウム属種(Oribacterium sp.)、ブチリビブリオ属種(Butyrivibrio sp.)、プロテオカテラ・スフェニスシ(Proteocatella sphenisci)、カンジダツス・ドジュカバクテリア(Candidatus Dojkabacteria)、シュードブチリビブリオ・キシラニボランス(Pseudobutyrivibrio xylanivorans)、シュードブチリビブリオ・ルミニス(Pseudobutyrivibrio ruminis)から選択される種に由来する、[1]に記載のシステム。
[5] Cpf1タンパク質が、配列番号1、配列番号2、配列番号4、配列番号8、配列番号11、及び配列番号12から選択されるアミノ酸配列を含む、[1]に記載のシステム。
[6] Cpf1タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、ゲノム編集されるべき細胞が由来する生物に対してコドン最適化される、[1]に記載のシステム。
[7] Cpf1タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、配列番号13~24から選択される、[1]に記載のシステム。
[8] ガイドRNAが、crRNAである、[1]に記載のシステム。
[9] crRNAのコード配列が、配列番号25~33のいずれか1つに示されるcrRNA足場配列を含み、好ましくは、配列番号30に示されるcrRNA足場配列を含む、[8]に記載のシステム。
[10] 標的配列が、以下の構造: 5'-TYYN-N X -3'又は5'-YYN-N X -3'(Nは、独立して、A、G、C及びTから選択され、Yは、C及びTから選択され; xは、15≦x≦35の整数であり; N x は、x個の連続したヌクレオチドを表す)を有する、[1]に記載のシステム。
[11] 細胞のゲノム中の標的配列を改変する方法であって、[1]~[10]のいずれかに記載のゲノム編集システムを細胞に導入するステップを含み、それにより、ガイドRNAは、Cpf1タンパク質を、細胞のゲノム中の標的配列に標的化させ、標的配列中の1つ以上のヌクレオチドの置換、欠失又は付加をもたらす、方法。
[12] 細胞が、哺乳動物、例えばヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ネコ; 家禽、例えばニワトリ、アヒル、ガチョウ; 単子葉植物及び双子葉植物を含む植物、例えばイネ、トウモロコシ、コムギ、モロコシ、オオムギ、ダイズ、ピーナッツ及びシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)などに由来する、[11]に記載の方法。
[13] 前記システムが、以下の方法: リン酸カルシウムトランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、ウイルス感染(例えば、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス及び他のウイルス)、遺伝子銃法、PEG媒介プロトプラスト形質転換、アグロバクテリウム媒介形質転換によって細胞に導入される、[11]~[12]のいずれかに記載の方法。
[14] 疾患の治療を必要とする対象においてその疾患を治療する方法であって、対象に、有効量の、[1]~[10]のいずれかに記載のゲノム編集システムを送達して、対象において疾患に関連する遺伝子を改変するステップを含む、方法。
[15] 疾患の治療を必要とする対象においてその疾患を治療するための医薬組成物の製造のための、[1]~[10]のいずれかに記載のゲノム編集システムの使用であって、ゲノム編集システムは、対象において疾患に関連する遺伝子を改変するためのものである、使用。
[16] [1]~[10]のいずれかに記載のゲノム編集システム及び薬学的に許容される担体を含む、疾患の治療を必要とする対象においてその疾患を治療するための医薬組成物であって、ゲノム編集システムは、疾患に関連する遺伝子を改変するためのものである、医薬組成物。
[17] 対象が、哺乳動物、例えばヒトである、[14]~[16]に記載の方法、使用又は医薬組成物。
[18] 疾患が、腫瘍、炎症、パーキンソン病、心血管疾患、アルツハイマー病、自閉症、薬物中毒、加齢黄斑変性、統合失調症、遺伝性疾患から選択される、[17]に記載の方法、使用又は医薬組成物。
[19] 配列番号25~33のいずれか1つに対応するcrRNA足場配列を含むか、又はそのコード配列が配列番号25~33のいずれか1つに示される配列を含む、crRNA。
[20] crRNAが、
i) 5'-ATTTCTACtgttGTAGAT(配列番号25)-N x -3';
ii) 5'-ATTTCTACtattGTAGAT(配列番号26)-N x -3';
iii) 5'-ATTTCTACtactGTAGAT(配列番号27)-N x -3';
iv) 5'-ATTTCTACtttgGTAGAT(配列番号28)-N x -3';
v) 5'-ATTTCTACtagttGTAGAT(配列番号29)-N x -3';
vi) 5'-ATTTCTACTATGGTAGAT(配列番号30)-N x -3';
vii) 5'-ATTTCTACTGTCGTAGAT(配列番号31)-N x -3';
viii) 5'-ATTTCTACTTGTGTAGAT(配列番号32)-N x -3'; 及び
ix) 5'-ATTTCTACTGTGGTAGAT(配列番号33)-N x -3'
(N x は、x個の連続したヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を表し、Nは、独立して、A、G、C及びTから選択され; xは、18≦x≦35の整数であり、好ましくはx=23である)から選択されるヌクレオチド配列によってコードされる、[19]に記載のcrRNA。
細胞培養及びトランスフェクション
HEK293T、HeLa細胞を、10%FBS(Gibco)及び100U/mlペニシリン及び100ug/mlストレプトマイシンを補充したDMEM培地(Gibco)中で培養し、マウスEpiSC細胞を、bFGFを補充したN2B27培地中で培養した。トランスフェクションの12時間前に、細胞をウェルあたり500,000個の密度で12ウェルプレートに播種した。12時間後、細胞の密度は約60%~70%であり、次いで、リポフェクタミン(Lipofectamine)LTX及びPLUS試薬(Invitrogen)を使用して1.5ug(Cpf1:crRNA=2:1)プラスミドを細胞にトランスフェクトし、培地を、トランスフェクションの前に無血清opti-MEM培地(Gibco)に交換した。トランスフェクション後、それを、トランスフェクション8~12時間後に血清添加DMED培地に交換した。トランスフェクション48時間後に、GFP陽性細胞を、遺伝子型決定のためにFACSによって選別した。
GFP陽性細胞をFACSによって選別し、バッファーL+1/100VプロテアーゼK(Biotool)を用いて55℃で30分間溶解し、95℃で5分間不活性化し、PCR検出に直接使用した。適切なプライマーをCpf1標的化部位の近くに設計し、増幅産物をDNA Clean & Concentrator(商標)-5キット(ZYMO Research)を使用して精製した。200ngの精製PCR産物を、1uLのNEBuffer2(NEB)に添加し、ddH2Oで10uLに希釈した。次いで、以前に報告された方法(Li, W., et al., Simultaneous generation and germline transmission of multiple gene mutations in rat using CRISPR-Cas systems. Nat Biotechnol, 2013. 31(8): p. 684-6)に従って、再アニールさせることによって、ヘテロ二量体を形成させた。再アニールされた生成物に、0.3uLのT7EIエンドヌクレアーゼ及び1/10VのNEBuffer2(NEB)を添加し、37℃で1時間30分間消化した。遺伝子型分析を、3%TAE-ゲル電気泳動によって実施した。インデルを、以前の論文(Cong, L., et al., Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science, 2013. 339(6121): p. 819-23)に報告された方法に従って計算した。
Cpf1真核生物発現ベクターをHeLa細胞に48時間トランスフェクトし、次いで、4%PFAで室温で10分間固定し; PBST(PBS+0.3%Triton X100)で3回洗浄し、2%BSA(+0.3%Triton X100)で室温で15分間ブロッキングし、一次抗体ラット抗-HA(Roche、1:1000)と共に一晩インキュベートし、PBSTで3回洗浄し、Cy3標識蛍光二次抗体(Jackson ImmunoResearch、1:1000)と共に室温で2時間インキュベートした。核をDAPI(Sigma、1:1000)で10分間染色し、PBSTで3回洗浄した。スライドを水性封入剤(Aqueous Mounting Medium)(Abcam)でマウントし、固定した。観察にはZeiss LSM780を使用した。
Cpf1をコードする遺伝子を、原核生物発現ベクターBPK2103/2104にクローニングした。C末端に融合した10×Hisタグを使用して、タンパク質を精製した。発現ベクターをBL21(DE3)大腸菌コンピテント細胞(Transgen)に形質転換した。IPTGが高発現を誘導したクローンを選択し、300mLのCmR+LB培地に接種し、OD600約0.4まで振とうしながら37℃で培養した。IPTGを1mMの最終濃度で添加し、発現を16℃で16時間誘導した。培養物を8000rpm、4℃で10分間遠心分離し、細菌ペレットを回収した。細菌を、40mL NPI-10(+1×EDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテル(Protease Inhibitor Cocktail)、Roche; +5%グリセロール)中で氷浴上で超音波処理破砕(合計時間15分、超音波処理2秒、休止5秒、出力100W)しながら溶解した。破砕後、遠心分離を8000rpm、4℃で10分間行い、上清を回収した。2mLのHis60 Ni Superflow Resin(Takara)を上清に添加し、4℃で1時間振とうし、ポリプロピレンカラム(Qiagen)によって精製した。重力流を使用して、融合His10タグを有しない望ましくないタンパク質を、それぞれ20mLのNPI-20、20mLのNPI-40及び10mLのNPI-100で完全に洗い流した。最後に、融合His10タグを持つCpf1タンパク質を、6×0.5mLのNPI-500でNiカラムから溶出させた。目的の溶出タンパク質を透析液(50mM Tris-HCl、300mM KCl、1mM DTT、20%グリセロール)に対して一晩透析した。透析後のタンパク質溶液を、100kDa Amicon Ultra-4、PLHK Ultracel-PL限外ろ過チューブ(Millipore)で濃縮した。タンパク質濃度を、Micro BCA(商標) Protein Assay Kit(Thermo Scientific(商標))を使用して決定した。
T7プロモーターを持つin vitro転写crRNA鋳型を合成し(BGI)、プロトコールに従ってHiScribe(商標) T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit(NEB)を使用して、crRNAをin vitroで転写した。転写が完了した後、crRNAをOligo Clean & Concentrator(商標)(ZYMO Research)によって精製し、NanoDrop(Thermo Scientific(商標))で濃度について測定し、-80℃で保存した。
異なる5'PAM配列を持つ標的配列を合成し、pUC19又はp11-LacY-wtx1ベクターにクローニングし、プライマーで増幅し、精製した。200ngの精製PCR産物を、それぞれ、NEBUffer3(NEB)反応システムで400ngのcrRNA及び50nMのCpf1タンパク質と37℃で1時間反応させた。次いで、それを、12%尿素-TBE-PAGEゲル又は2.5%アガロースゲルでの電気泳動により分析した。
実験で使用した標的配列を以下の表1に示す:
CRISPR/Cpf1(プレボテーラ属(Prevotella)及びフランシセラ属(Francisella)由来のクラスター化規則的配置短回文配列リピート1(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats from Prevotella and Francisella 1))は、プレボテーラ属(Prevotella)及びフランシセラ属(Francisella)で見られる獲得免疫機構であり、DNA編集のために首尾よく操作された(Zetsche, B., et al., Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell, 2015. 163(3): p. 759-71.)。CRISPR/Cas9とは異なり、Cpf1は1つのcrRNAのみをガイドとして必要とし、tracrRNAは不要であり、Cpf1タンパク質はTリッチPAM配列を使用する。
コドン最適化をヒトにおける発現のために行い、12個の選択されたタンパク質コード配列を合成し(BGI)、真核生物発現ベクター(pCAG-2AeGFP-SV40及びpCAG-2AeGFP-SV40_v4)及び原核生物発現ベクター(BPK2103-ccdB及びBPK2014-ccdB)にクローニングした。
同定されたCpf1タンパク質のPAM配列を決定するため、最初に、詳細な研究のためにBsCpf1タンパク質を選択した。
これらのCpf1タンパク質の適用性を拡張するために、いくつかのトランスフェクション実験をマウスEpiSC細胞株で行った。
この実施例では、各Cpf1タンパク質(表3)のゲノム編集効率を改善するために、哺乳動物ゲノム編集に使用することができる、新しく同定されたCpf1タンパク質のcRNA足場を最適化する。
Claims (2)
- 配列番号30のヌクレオチド配列によってコードされるcrRNA足場配列を含むか、又はそのコード配列が配列番号30に示される配列を含む、crRNA。
- crRNAが、5'-ATTTCTACTATGGTAGAT(配列番号30)-Nx-3'(Nxは、x個の連続したヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を表し、Nは、独立して、A、G、C及びTから選択され; xは、18≦x≦35の整数であり、好ましくはx=23である)のヌクレオチド配列によってコードされる、請求項1に記載のcrRNA。
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