CN105907785B - 化学合成的crRNA用于CRISPR/Cpf1***在基因编辑中的应用 - Google Patents

化学合成的crRNA用于CRISPR/Cpf1***在基因编辑中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了CRISPR/Cpf1***在基因编辑中的应用；所述CRISPR/Cpf1***中包括a1)或a2)：a1)化学合成的crRNA；a2)表达crRNA的载体。所述CRISPR/Cpf1***为c1)或c2)或c3)或c4)：c1)LbCRISPR/Cpf1***；c2)Lb2CRISPR/Cpf1***；c3)FnCRISPR/Cpf1***；c4)AsCRISPR/Cpf1***。实验证明，化学合成的crRNA能有效行使引导Cpf1剪切编辑特定靶位点的作用，且效率很高。载体表达的crRNA或化学合成的crRNA用于CRISPR/Cpf1***在基因编辑中均具有重要的应用价值。

Description

化学合成的crRNA用于CRISPR/Cpf1***在基因编辑中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及化学合成的crRNA用于CRISPR/Cpf1***在基因编辑中的应用。
背景技术
基因编辑是在基因组水平上进行精确修饰的一种技术，可完成基因定点删除(InDel)突变、基因定点***突变、多位点同时突变和小片段的删失等。基因编辑技术可用于基因功能及疾病发病机理研究、构建疾病动物模型、生物治疗、遗传和肿瘤相关疾病研究、整合病毒疾病研究和改良农畜牧物种。基因编辑技术是从根本上改变物种遗传物质DNA的工具，具有极其广泛的应用价值和发展前景。
锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)和CRISPR/Cas9***是三大基因编辑技术，本质上均是利用非同源末端链接途径(NHEJ)修复和同源重组(HR)修复，联合特异性DNA的靶向识别及核酸内切酶完成的DNA序列改变。NHEJ修复使基因产生***或删除突变，从而造成基因移码突变，以实现编码蛋白基因敲除，如果是基因组邻近位置两处双链断裂，NHEJ修复后则可造成基因组片段缺失。锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)和CRISPR/Cas9***三种编辑技术的共同点是含有靶点DNA序列的识别区域及DNA剪切功能区域。其中ZFN通过锌指结构域识别靶点DNA序列，TALEN识别靶点DNA序列的区域是重复可变双残基的重复，ZFN和TALEN的DNA剪切功能区域均为一种名为Fokl的核酸内切酶结构域，FokI结构需要形成二聚体才能发挥DSB剪切功能，所以ZFNs和TALEN均需要表达两个DNA靶向-FokI核酸内切酶结构融合蛋白。而CRISPR/Cas9***是存在于大多数细菌(约40％)和古细菌(约90％)中的一种后天免疫***，可用来消灭或对抗外来的质体或者噬菌体，并在自身基因组中留下外来基因片段作为“记忆”，在下一次外源DNA入侵时，表达的Cas9核酸酶在含有记忆片段的crRNA及tracrRNA的指导下切割与记忆片段一样且含有PAM的外源基因，发挥抵抗外源DNA片段入侵的免疫作用。利用CRISPR/Cas9***编辑生物基因组，可在靶标片段处造成不同形式的缺失或***，现已成功应用于人类细胞系、斑马鱼、大鼠、小鼠、果蝇等生物中。与ZFN和TALEN相比，CRISPR/Cas9***中蛋白质对DNA序列的识别要更加精确得多，降低了脱靶切割的几率，减低了细胞毒性，而且CRISPR/Cas9***的构建仅仅需要设计与靶序列互补的gRNA即可，更为简单和廉价，大大提高了基因操作的效率及简便性。但是，CRISPR/Cas9***也存在着一些不足，如Cas9蛋白不能对任意序列进行切割，其靶点3’端要求必须含有PAM序列(如SpCas9蛋白要求PAM序列为NGG)。
最新发现的CRISPR/Cpf1***(Zetsche B,Gootenberg JS et al.Cpf1is asingle RNA-guided endonuclease of a class 2CRISPR-Cas system.Cell.2015Oct 22；163(3):759-71.)和CRISPR/Cas9***同属CRISPR-Cas Class2***，但前者仅需要一条更短的crRNA即可实现基因编辑，更有潜力实现更简单、更精确的基因组工程操作。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何进行基因编辑。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了CRISPR/Cpf1***在基因编辑中的应用；所述CRISPR/Cpf1***中包括a1)或a2)：
a1)化学合成的crRNA；
a2)表达crRNA的载体。
所述a2)中，所述载体可为将所述crRNA的编码DNA***骨架载体的多克隆位点得到的重组载体。所述骨架载体可为克隆载体。所述克隆载体具体可为苏州吉玛基因股份有限公司的生产的质粒pU6gRNA。
所述a2)中，所述载体具体可为将质粒pU6gRNA的限制性内切酶BbsⅠ和EcoRⅠ识别序列间的片段(质粒pU6gRNA被限制性内切酶BbsⅠ和EcoRⅠ切成一个大片段和一个小片段，该DNA为该小片段)替换为所述crRNA的编码DNA得到的重组载体。
上述应用中，所述CRISPR/Cpf1***可为c1)或c2)或c3)或c4)：
c1)LbCRISPR/Cpf1***；
c2)Lb2CRISPR/Cpf1***；
c3)FnCRISPR/Cpf1***；
c4)AsCRISPR/Cpf1***。
所述AsCRISPR/Cpf1***来自Acidaminococcus_sp.BV3L6，其表达AsCpf1蛋白。所述FnCRISPR/Cpf1***来自Francisella_novicida，其表达FnCpf1蛋白。所述LbCRISPR/Cpf1***来自Lachnospiraceae bacterium ND2006，其表达LbCpf1蛋白。所述Lb2CRISPR/Cpf1***来自Lachnospiraceae_bacterium_MA2020，其表达的Lb2Cpf1蛋白。
所述AsCpf1蛋白可为h1)或h2)或h3)：
h1)氨基酸序列是序列表中序列6所示的蛋白质；
h2)在h1)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
h3)将序列表中序列6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
所述FnCpf1蛋白可为i1)或i2)或i3)：
i1)氨基酸序列是序列表中序列5所示的蛋白质；
i2)在i1)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
i3)将序列表中序列5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
所述LbCpf1蛋白可为j1)或j2)或j3)：
j1)氨基酸序列是序列表中序列3所示的蛋白质；
j2)在j1)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
j3)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
所述Lb2Cpf1蛋白可为k1)或k2)或k3)：
k1)氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白质；
k2)在k1)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
k3)将序列表中序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
为解决上述技术问题，本发明还提供了定向编辑基因组的方法。
本发明所提供的定向编辑基因组的方法可为方法一，可包括如下步骤：
(1)根据受体基因组中预期进行定向编辑的靶基因设计crRNA；
(2)化学合成所述crRNA；
(3)将所述化学合成的crRNA和编码Cpf1蛋白的基因导入所述受体，从而定向编辑所述受体基因组中的所述靶基因。
所述(1)和(3)中，所述靶基因具体可为hAAVS1基因(Gene ID：54776)和THUMPD3-AS1基因(Gene ID：440944)。根据所述hAAVS1基因的核苷酸序列选择靶序列Ⅰ，所述靶序列Ⅰ的核苷酸序列具体可为：5’-TCTGTCCCCTCCACCCCACAGTGG-3’。根据所述THUMPD3-AS1基因的核苷酸序列选择靶序列Ⅱ，所述靶序列Ⅱ的核苷酸序列具体可为：5’-GAGAACAAGCGCCTCCCACCCACA-3’。
所述(3)中，所述Cpf1蛋白可为所述AsCpf1蛋白、所述FnCpf1蛋白、所述LbCpf1蛋白或所述Lb2Cpf1蛋白。
所述(2)和(3)中，所述化学合成的crRNA具体可为e9)-e14)中的任一种：
e9)5’-AAUUUCUACUAAGUGUAGAUucuguccccuccaccccac-3’；
e10)5’-AAUUUCUACUAAGUGUAGAUgagaacaagcgccucccac-3’；
e11)5’-AAUUUCUACUAUUGUAGAUucuguccccuccaccccac-3’；
e12)5’-AAUUUCUACUAUUGUAGAUucuguccccuccaccccacagug-3’；
e13)5’-AAUUUCUACUAUUGUAGAUgagaacaagcgccucccac-3’；
e14)5’-AAUUUCUACUAUUGUAGAUgagaacaagcgccucccacccac-3’。
所述e9)或所述e10)，具体可和编码所述LbCpf1蛋白的基因导入所述受体。所述编码所述LbCpf1蛋白的基因可通过质粒的形式导入所述受体。所述质粒具体可为Addgene公司的质粒pcDNA3.1-hLbCpf1。所述受体可为293T细胞。
所述e11)或所述e12)或所述e13)或所述e14)，具体可和编码所述Lb2Cpf1蛋白的基因导入所述受体。所述编码所述Lb2Cpf1蛋白的基因可通过质粒的形式导入所述受体。所述质粒具体可为Addgene公司的质粒pcDNA3.1-hLb2Cpf1。所述受体可为293T细胞。
本发明所提供的定向编辑基因组的方法可为方法二，可包括如下步骤：
㈠根据受体基因组中预期进行定向编辑的靶基因设计crRNA；
㈡构建表达所述crRNA的重组载体；
㈢将所述重组载体和编码Cpf1蛋白的基因导入所述受体，从而定向编辑所述受体基因组中的所述靶基因。
所述㈡和㈢中，所述重组载体可为将所述crRNA的编码DNA***骨架载体的多克隆位点得到的重组载体。所述骨架载体可为克隆载体。所述克隆载体具体可为苏州吉玛基因股份有限公司的生产的质粒pU6gRNA。
所述㈡和㈢中，所述重组载体具体可为将质粒pU6gRNA的限制性内切酶BbsⅠ和EcoRⅠ识别序列间的片段(质粒pU6gRNA被限制性内切酶BbsⅠ和EcoRⅠ切成一个大片段和一个小片段，该DNA为该小片段)替换为所述crRNA的编码DNA得到的重组载体。
所述㈠和㈢中，所述靶基因具体可为hAAVS1基因(Gene ID：54776)和THUMPD3-AS1基因(Gene ID：440944)。根据所述hAAVS1基因的核苷酸序列选择靶序列Ⅰ，所述靶序列Ⅰ的核苷酸序列具体可为：5’-TCTGTCCCCTCCACCCCACAGTGG-3’。根据所述THUMPD3-AS1基因的核苷酸序列选择靶序列Ⅱ，所述靶序列Ⅱ的核苷酸序列具体可为：5’-GAGAACAAGCGCCTCCCACCCACA-3’。
所述㈢中，所述Cpf1蛋白可为所述AsCpf1蛋白、所述FnCpf1蛋白、所述LbCpf1蛋白或所述Lb2Cpf1蛋白。
所述㈠中，所述“根据受体基因组中预期进行定向编辑的靶基因设计crRNA”具体可为e1)-e8)中的任一种：
e1)5’-UAAUUUCUACUCUUGUAGAUucuguccccuccaccccacaguggUUUUUU-3’；
e2)5’-UAAUUUCUACUCUUGUAGAUGAGAACAAGCGCCUCCCACCCACAUUUUUU-3’；
e3)5’-UAAUUUCUACUGUUGUAGAUucuguccccuccaccccacaguggUUUUUU-3’；
e4)5’-UAAUUUCUACUGUUGUAGAUGAGAACAAGCGCCUCCCACCCACAUUUUUU-3’；
e5)5’-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUucuguccccuccaccccacaguggUUUUUU-3’；
e6)5’-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGAGAACAAGCGCCUCCCACCCACAUUUUUU-3’；
e7)5’-GAAUUUCUACUAUUGUAGAUucuguccccuccaccccacaguggUUUUUU-3’；
e8)5’-GAAUUUCUACUAUUGUAGAUGAGUUCUUGCGCCUCCCACCCACAUUUUUU-3’。
表达所述e1)或所述e2)的重组载体，具体可和编码所述AsCpf1蛋白的基因导入所述受体。所述编码所述AsCpf1蛋白的基因可通过质粒的形式导入所述受体。所述质粒具体可为Addgene公司的质粒pcDNA3.1-hAsCpf1。所述受体可为293T细胞。
表达所述e3)或所述e4)的重组载体，具体可和编码所述FnCpf1蛋白的基因导入所述受体。所述编码所述FnCpf1蛋白的基因可通过质粒的形式导入所述受体。所述质粒具体可为Addgene公司的质粒pcDNA3.1-hFnCpf1。所述受体可为293T细胞。
表达所述e5)或所述e6)的重组载体，具体可和编码所述LbCpf1蛋白的基因导入所述受体。所述编码所述LbCpf1蛋白的基因可通过质粒的形式导入所述受体。所述质粒具体可为Addgene公司的质粒pcDNA3.1-hLbCpf1。所述受体可为293T细胞。
表达所述e7)或所述e8)的重组载体，具体可和编码所述Lb2Cpf1蛋白的基因导入所述受体。所述编码所述Lb2Cpf1蛋白的基因可通过质粒的形式导入所述受体。所述质粒具体可为Addgene公司的质粒pcDNA3.1-hLb2Cpf1。所述受体可为293T细胞。
为解决上述技术问题，本发明还提供了定向编辑基因组的CRISPR/Cpf1***。
本发明所提供的定向编辑基因组的CRISPR/Cpf1***，该***中包括a1)或a2)：
a1)化学合成的crRNA；
a2)表达crRNA的载体。
所述a2)中，所述载体可为将所述crRNA的编码DNA***骨架载体的多克隆位点得到的重组载体。所述骨架载体可为克隆载体。所述克隆载体具体可为苏州吉玛基因股份有限公司的生产的质粒pU6gRNA。
所述a2)中，所述载体具体可为将质粒pU6gRNA的限制性内切酶BbsⅠ和EcoRⅠ识别序列间的片段(质粒pU6gRNA被限制性内切酶BbsⅠ和EcoRⅠ切成一个大片段和一个小片段，该DNA为该小片段)替换为所述crRNA的编码DNA得到的重组载体。
上述***中，所述CRISPR/Cpf1***可为上述任一所述LbCRISPR/Cpf1***或上述任一所述Lb2CRISPR/Cpf1***或上述任一所述FnCRISPR/Cpf1***或上述任一所述AsCRISPR/Cpf1***。
实验证明，重组载体表达的crRNA在AsCRISPR/Cpf1***、FnCRISPR/Cpf1***、LbCRISPR/Cpf1***和Lb2CRISPR/Cpf1***中均有一定的基因编辑能力，且上述各CRISPR/Cpf1***的基因编辑能力依次为：AsCRISPR/Cpf1***＞FnCRISPR/Cpf1***＞LbCRISPR/Cpf1***＞Lb2CRISPR/Cpf1***；化学合成的crRNA能有效行使引导Cpf1剪切编辑特定靶位点的作用，且效率很高，同时化学合成的crRNA在LbCRISPR/Cpf1***和Lb2CRISPR/Cpf1***中均有一定的基因编辑能力，并且化学合成的crRNA可直接转染，比通过构建重组载体转染便于操作，更可控，并且便于进行化学修饰。因此，重组载体表达的crRNA和/或化学合成的crRNA用于CRISPR/Cpf1***在基因编辑中均具有重要的应用价值。
附图说明
图1为实施例1步骤二中3的T7E1突变检测结果。
图2为实施例1步骤二中4的测序结果。
图3为实施例2步骤二中3的T7E1突变检测结果。
图4为实施例2步骤二中4的测序结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
质粒pcDNA3.1-hAsCpf1、质粒pcDNA3.1-hFnCpf1、质粒pcDNA3.1-hLbCpf1和质粒pcDNA3.1-hLb2Cpf1均为Addgene公司的产品，在下文中，质粒pcDNA3.1-hAsCpf1简称为质粒Y1681，质粒pcDNA3.1-hFnCpf1简称为质粒Y1682，质粒pcDNA3.1-hLbCpf1简称为质粒Y1683，质粒pcDNA3.1-hLb2Cpf1简称为质粒Y1684。
质粒pU6gRNA为苏州吉玛基因股份有限公司的产品，质粒pU6gRNA(环形)的核苷酸序列如序列表序列1所示。在下文中，质粒pU6gRNA简称为Y523。293T细胞为中国科学院细胞库产品，目录号为GNHu17。DMEM培养基和FBS均为Gibco公司的产品。细胞孔板为Corning公司的产品。Max酶为Vazyme公司产品，货号为P505。Genomic DNA Extraction kit为Takara公司产品，产品目录号为#9765。Trypsin-EDTA Solution为Hyclone公司，货号为SH30042.02。PBS缓冲液是用超纯水稀释PBS(10×)至10倍体积得到的；PBS(10×)为生工生物工程(上海)股份有限公司产品，货号为E607016。OPTI-MEM培养基为Gibco公司产品，产品目录号为#31985-070。lipofectamine 2000为thermo fisher-invitrogen公司产品，货号为11668-027。T7E1为T7E1突变检测试剂盒中的组件；T7E1突变检测试剂盒为苏州吉玛基因股份有限公司的产品。DNA Marker为Thermo Fisher公司产品，产品名称为GeneRuler DNALadder Mix，货号为SM0331。10×退火buffer：含10mM EDTA·2Na、1000mM NaCl的pH 8.0、100mM Tris-HCl缓冲液。
实施例1、检测AsCRISPR/Cpf1***、FnCRISPR/Cpf1***、LbCRISPR/Cpf1***和Lb2CRISPR/Cpf1***的基因编辑能力
选择hAAVS1基因(Gene ID：54776)和THUMPD3-AS1基因(Gene ID：440944)作为检测AsCRISPR/Cpf1***、FnCRISPR/Cpf1***、LbCRISPR/Cpf1***和Lb2CRISPR/Cpf1***的基因编辑能力的靶基因。其中AsCRISPR/Cpf1***来自Acidaminococcus_sp.BV3L6，其表达序列表中序列6所示的AsCpf1蛋白；FnCRISPR/Cpf1***来自Francisella_novicida，其表达序列表中序列5所示的FnCpf1蛋白；LbCRISPR/Cpf1***来自Lachnospiraceaebacterium ND2006，其表达序列表中序列3所示的LbCpf1蛋白；Lb2CRISPR/Cpf1***来自Lachnospiraceae_bacterium_MA2020，其表达序列表中序列4所示的Lb2Cpf1蛋白。
根据hAAVS1基因的核苷酸序列选择靶序列Ⅰ，根据THUMPD3-AS1基因的核苷酸序列选择靶序列Ⅱ。靶序列Ⅰ和靶序列Ⅱ的序列如下：
靶序列Ⅰ：5’-TCTGTCCCCTCCACCCCACAGTGG-3’；
靶序列Ⅱ：5’-GAGAACAAGCGCCTCCCACCCACA-3’。
一、质粒的构建
1、质粒Y1640的构建
(1)用限制性内切酶BbsⅠ和EcoRⅠ双酶切质粒pU6gRNA，回收约2955bp的载体骨架。
(2)由苏州吉玛基因股份有限公司合成引物Y1640-S：5’-CACCgTAATTTCTACTCTTGTAGAT
Figure BDA0000982483720000061
g-3’(单下划线为AscrRNA骨架序列，双下划线为靶序列Ⅰ，波浪线为终止序列)和引物Y1640-A：5’-aattc
Figure BDA0000982483720000062
ATCTACAAGAGTAGAAATTAc-3’(单下划线为AscrRNA骨架序列，双下划线为靶序列Ⅰ，波浪线为终止序列)，用去离子水分别将引物Y1640-S和引物Y1640-A稀释至100μM，得到引物Y1640-S稀释液和引物Y1640-A稀释液；然后进行退火反应，形成DNA分子Ⅰ。
退火体系：引物Y1640-S稀释液5μL、引物Y1640-S稀释液5μL、去离子水35μL、10×退火buffer(含)5μL。
退火程序：99℃10min，85℃5min，80℃5min，75℃5min，70℃5min，16℃保存。
(3)将载体骨架和DNA分子Ⅰ连接，得到质粒Y1640。
根据测序结果，对质粒Y1640进行结构描述如下：将质粒pU6gRNA的限制性内切酶BbsⅠ和EcoRⅠ识别序列间的片段(质粒pU6gRNA被限制性内切酶BbsⅠ和EcoRⅠ切成一个大片段和一个小片段，该DNA为该小片段)替换为DNA分子Ⅰ。质粒Y1640的核苷酸序列如序列表序列2所示。
2、质粒Y1641的构建
按照步骤1的方法，仅将DNA分子Ⅰ替换为DNA分子Ⅱ，其它步骤均不变，得到质粒Y1641。
DNA分子Ⅱ的制备方法如下：由苏州吉玛基因股份有限公司合成引物Y1641-S：5’-CACCgTAATTTCTACTCTTGTAGAT
Figure BDA0000982483720000063
g-3’(单下划线为AscrRNA骨架序列，双下划线为靶序列Ⅱ，波浪线为终止序列)和引物Y1641-A：5’-aattc
Figure BDA0000982483720000064
ATCTACAAGAGTAGAAATTAc-3’(单下划线为AscrRNA骨架序列，双下划线为靶序列Ⅱ，波浪线为终止序列)，用去离子水分别将引物Y1641-S和引物Y1641-A稀释至100μM，得到引物Y1641-S稀释液和引物Y1641-A稀释液；然后进行退火反应，形成DNA分子Ⅱ。
退火体系：引物Y1641-S稀释液5μL、引物Y1641-S稀释液5μL、去离子水35μL、10×退火buffer(含)5μL。
退火程序：99℃10min，85℃5min，80℃5min，75℃5min，70℃5min，16℃保存。
根据测序结果，对质粒Y1641进行结构描述如下：将质粒pU6gRNA的限制性内切酶BbsⅠ和EcoRⅠ识别序列间的片段(质粒pU6gRNA被限制性内切酶BbsⅠ和EcoRⅠ切成一个大片段和一个小片段，该DNA为该小片段)替换为DNA分子Ⅱ。
3、质粒Y1642的构建
按照步骤1的方法，仅将DNA分子Ⅰ替换为DNA分子Ⅲ，其它步骤均不变，得到质粒Y1642。
DNA分子Ⅲ的制备方法如下：由苏州吉玛基因股份有限公司合成引物Y1642-S：5’-CACCgTAATTTCTACTGTTGTAGAT g-3’(单下划线为FncrRNA骨架序列，双下划线为靶序列Ⅰ，波浪线为终止序列)和引物Y1642-A：5’-aattc
Figure BDA0000982483720000071
ATCTACAAGAGTAGAAATTAc-3’(单下划线为Fn crRNA骨架序列，双下划线为靶序列Ⅰ，波浪线为终止序列)，用去离子水分别将引物Y1642-S和引物Y1642-A稀释至100μM，得到引物Y1642-S稀释液和引物Y1642-A稀释液；然后进行退火反应，形成DNA分子Ⅲ。
退火体系：引物Y1642-S稀释液5μL、引物Y1642-S稀释液5μL、去离子水35μL、10×退火buffer(含)5μL。
退火程序：99℃10min，85℃5min，80℃5min，75℃5min，70℃5min，16℃保存。
根据测序结果，对质粒Y1642进行结构描述如下：将质粒pU6gRNA的限制性内切酶BbsⅠ和EcoRⅠ识别序列间的片段(质粒pU6gRNA被限制性内切酶BbsⅠ和EcoRⅠ切成一个大片段和一个小片段，该DNA为该小片段)替换为DNA分子Ⅲ。
4、质粒Y1643的构建
按照步骤1的方法，仅将DNA分子Ⅰ替换为DNA分子Ⅳ，其它步骤均不变，得到质粒Y1643；
DNA分子Ⅳ的制备方法如下：由苏州吉玛基因股份有限公司合成引物Y1643-S：5’-CACCgTAATTTCTACTGTTGTAGAT
Figure BDA0000982483720000072
g-3’(单下划线为FncrRNA骨架序列，双下划线为靶序列Ⅱ，波浪线为终止序列)和引物Y1643-A：5’-aattc ATCTACAAGAGTAGAAATTAc-3’(单下划线为Fn crRNA骨架序列，双下划线为靶序列Ⅱ，波浪线为终止序列)，用去离子水分别将引物Y1643-S和引物Y1643-A稀释至100μM，得到引物Y1643-S稀释液和引物Y1643-A稀释液；然后进行退火反应，形成DNA分子Ⅲ。
退火体系：引物Y1643-S稀释液5μL、引物Y1643-S稀释液5μL、去离子水35μL、10×退火buffer(含)5μL。
退火程序：99℃10min，85℃5min，80℃5min，75℃5min，70℃5min，16℃保存。
根据测序结果，对质粒Y1643进行结构描述如下：将质粒pU6gRNA的限制性内切酶BbsⅠ和EcoRⅠ识别序列间的片段(质粒pU6gRNA被限制性内切酶BbsⅠ和EcoRⅠ切成一个大片段和一个小片段，该DNA为该小片段)替换为DNA分子Ⅳ。
5、质粒Y1644的构建
按照步骤1的方法，仅将DNA分子Ⅰ替换为DNA分子Ⅴ，其它步骤均不变，得到质粒Y1644。
DNA分子Ⅴ的制备方法如下：由苏州吉玛基因股份有限公司合成引物Y1644-S：5’-CACCgTAATTTCTACTAAGTGTAGAT
Figure BDA0000982483720000074
g-3’(单下划线为LbcrRNA骨架序列，双下划线为靶序列Ⅰ，波浪线为终止序列)和引物Y1644-A：5’-aattc
Figure BDA0000982483720000075
ATCTACACTTAGTAGAAATTAc-3’(单下划线为Lb crRNA骨架序列，双下划线为靶序列Ⅰ，波浪线为终止序列)，用去离子水分别将引物Y1644-S和引物Y1644-A稀释至100μM，得到引物Y1644-S稀释液和引物Y1644-A稀释液；然后进行退火反应，形成DNA分子Ⅴ。
退火体系：引物Y1644-S稀释液5μL、引物Y1644-S稀释液5μL、去离子水35μL、10×退火buffer(含)5μL。
退火程序：99℃10min，85℃5min，80℃5min，75℃5min，70℃5min，16℃保存。
根据测序结果，对质粒Y1644进行结构描述如下：将质粒pU6gRNA的限制性内切酶BbsⅠ和EcoRⅠ识别序列间的片段(质粒pU6gRNA被限制性内切酶BbsⅠ和EcoRⅠ切成一个大片段和一个小片段，该DNA为该小片段)替换为DNA分子Ⅴ。
6、质粒Y1645的构建
按照步骤1的方法，仅将DNA分子Ⅰ替换为DNA分子Ⅵ，其它步骤均不变，得到质粒Y1645。
DNA分子Ⅵ的制备方法如下：由苏州吉玛基因股份有限公司合成引物Y1645-S：5’-CACCgTAATTTCTACTAAGTGTAGAT g-3’(单下划线为LbcrRNA骨架序列，双下划线为靶序列Ⅱ，波浪线为终止序列)和引物Y1645-A：5’-aattc
Figure BDA0000982483720000082
ATCTACACTTAGTAGAAATTAc-3’(单下划线为Lb crRNA骨架序列，双下划线为靶序列Ⅱ，波浪线为终止序列)，用去离子水分别将引物Y1645-S和引物Y1645-A稀释至100μM，得到引物Y1645-S稀释液和引物Y1645-A稀释液；然后进行退火反应，形成DNA分子Ⅵ。
退火体系：引物Y1645-S稀释液5μL、引物Y1645-S稀释液5μL、去离子水35μL、10×退火buffer(含)5μL。
退火程序：99℃10min，85℃5min，80℃5min，75℃5min，70℃5min，16℃保存。
根据测序结果，对质粒Y1645进行结构描述如下：将质粒pU6gRNA的限制性内切酶BbsⅠ和EcoRⅠ识别序列间的片段(质粒pU6gRNA被限制性内切酶BbsⅠ和EcoRⅠ切成一个大片段和一个小片段，该DNA为该小片段)替换为DNA分子Ⅵ。
7、质粒Y1646的构建
按照步骤1的方法，仅将DNA分子Ⅰ替换为DNA分子Ⅶ，其它步骤均不变，得到质粒Y1646。
DNA分子Ⅶ的制备方法如下：由苏州吉玛基因股份有限公司合成引物Y1646-S：5’-CACCgGAATTTCTACTATTGTAGAT
Figure BDA0000982483720000083
g-3’(单下划线为Lb2crRNA骨架序列，双下划线为靶序列Ⅰ，波浪线为终止序列)和引物Y1646-A：5’-aattc
Figure BDA0000982483720000084
ATCTACAATAGTAGAAATTCc-3’(单下划线为Lb2crRNA骨架序列，双下划线为靶序列Ⅰ，波浪线为终止序列)，用去离子水分别将引物Y1646-S和引物Y1646-A稀释至100μM，得到引物Y1646-S稀释液和引物Y1646-A稀释液；然后进行退火反应，形成DNA分子Ⅶ。
退火体系：引物Y1646-S稀释液5μL、引物Y1646-S稀释液5μL、去离子水35μL、10×退火buffer(含)5μL。
退火程序：99℃10min，85℃5min，80℃5min，75℃5min，70℃5min，16℃保存。
根据测序结果，对质粒Y1646进行结构描述如下：将质粒pU6gRNA的限制性内切酶BbsⅠ和EcoRⅠ识别序列间的片段(质粒pU6gRNA被限制性内切酶BbsⅠ和EcoRⅠ切成一个大片段和一个小片段，该DNA为该小片段)替换为DNA分子Ⅶ。
8、质粒Y1647的构建
按照步骤1的方法，仅将DNA分子Ⅰ替换为DNA分子Ⅷ，其它步骤均不变，得到质粒Y1647。
DNA分子Ⅷ的制备方法如下：由苏州吉玛基因股份有限公司合成引物Y1647-S：5’-CACCgGAATTTCTACTATTGTAGAT
Figure BDA0000982483720000085
g-3’(单下划线为Lb2crRNA骨架序列，双下划线为靶序列Ⅱ，波浪线为终止序列)和引物Y1647-A：5’-aattc
Figure BDA0000982483720000086
ATCTACAATAGTAGAAATTCc-3’(单下划线为Lb2crRNA骨架序列，双下划线为靶序列Ⅱ，波浪线为终止序列)，用去离子水分别将引物Y1647-S和引物Y1647-A稀释至100μM，得到引物Y1647-S稀释液和引物Y1647-A稀释液；然后进行退火反应，形成DNA分子Ⅷ。
退火体系：引物Y1647-S稀释液5μL、引物Y1647-S稀释液5μL、去离子水35μL、10×退火buffer(含)5μL。
退火程序：99℃10min，85℃5min，80℃5min，75℃5min，70℃5min，16℃保存。
根据测序结果，对质粒Y1647进行结构描述如下：将质粒pU6gRNA的限制性内切酶BbsⅠ和EcoRⅠ识别序列间的片段(质粒pU6gRNA被限制性内切酶BbsⅠ和EcoRⅠ切成一个大片段和一个小片段，该DNA为该小片段)替换为DNA分子Ⅷ。
二、检测AsCRISPR/Cpf1***、FnCRISPR/Cpf1***、LbCRISPR/Cpf1***和Lb2CRISPR/Cpf1***的基因编辑能力
1、共转染
(1)Y1681-Y1640-293T细胞组的获得
质粒Y1681和质粒Y1640共转染293T细胞的步骤如下：
①将293T细胞置于装有10％(体积比)FBS的DMEM培养基的培养皿(直径为10cm)，37℃、5％CO2培养箱中培养，待293T细胞培养至80～90％融合时，弃培养基，用3mL PBS洗涤两次。
②完成步骤①后，向所述培养皿中加入1mL Trypsin-EDTA Solution，混匀，然后吸出液相，37℃静置1～2min。
③完成步骤②后，向所述培养皿中加入2mL含10％(体积比)FBS的DMEM培养基，吹打形成单细胞悬液。
④完成步骤③后，将所述单细胞悬液接种于6孔板，每孔约接种2×105个293T细胞，37℃、5％CO2培养箱中培养24h。
⑤完成步骤④后，将所述6孔板中的培养基更换为OPTI-MEM培养基，然后加入4μg质粒Y1681和4μg质粒Y1640，进行共转染(共转染过程中，转染试剂为lipofectamine 2000，培养基为OPTI-MEM培养基，共转染的步骤参考Lipofectamin2000说明书)，然后37℃、5％CO2培养箱中孵育6h，然后更换为新的OPTI-MEM培养基，37℃、5％CO2培养箱中继续培养18h。
⑥重复步骤⑤一次。
⑦完成步骤⑥后48h，收集细胞，然后用1mL PBS洗涤一次。
⑧完成步骤⑦后，向所述培养皿中加入0.5mL Trypsin-EDTA Solution，混匀，然后吸出液相，37℃静置1～2min。
⑨完成步骤⑧后，向所述培养皿中加入1mL含10％(体积比)FBS的DMEM培养基，吹打形成单细胞悬液；将该单细胞悬液1000rpm离心3min，得到沉淀1。
⑩完成步骤⑨后，向所述沉淀中加入1mL PBS，1000rpm离心3min，得到沉淀2。
沉淀2即为质粒Y1681和质粒Y1640共转染后的293T细胞组，简称Y1681-Y1640-293T细胞组。
(2)Y1681-293T细胞组的获得
质粒Y1681转染293T细胞的步骤如下：
①同步骤(1)中①。
②同步骤(1)中②。
③同步骤(1)中③。
④同步骤(1)中④。
⑤完成步骤④后，将所述6孔板中的培养基更换为OPTI-MEM培养基，然后加入4μg质粒Y1681，进行转染(共转染过程中，转染试剂为lipofectamine 2000，培养基为OPTI-MEM培养基，共转染的步骤参考Lipofectamin2000说明书)，然后37℃、5％CO2培养箱中孵育6h，然后更换为新的OPTI-MEM培养基，37℃、5％CO2培养箱中继续培养18h。
⑥重复步骤⑤一次。
⑦同步骤(1)中⑦。
⑧同步骤(1)中⑧。
⑨同步骤(1)中⑨。
⑩同步骤(1)中⑩。
步骤⑩获得的沉淀即为质粒Y1681转染后的293T细胞组，简称Y1681-293T细胞组。
(3)Y1681-Y1641-293T细胞组的获得
按照上述步骤(1)的方法，将质粒Y1640替换为质粒Y1641，其它步骤均不变，得到Y1681-Y1641-293T细胞组。
(4)Y1681-Y1642-293T细胞组的获得
按照上述步骤(1)的方法，将质粒Y1640替换为质粒Y1642，其它步骤均不变，得到Y1681-Y1642-293T细胞组。
(5)Y1681-Y1643-293T细胞组的获得
按照上述步骤(1)的方法，将质粒Y1640替换为质粒Y1643，其它步骤均不变，得到Y1681-Y1643-293T细胞组。
(6)Y1681-Y1644-293T细胞组的获得
按照上述步骤(1)的方法，将质粒Y1640替换为质粒Y1644，其它步骤均不变，得到Y1681-Y1644-293T细胞组。
(7)Y1681-Y1645-293T细胞组的获得
按照上述步骤(1)的方法，将质粒Y1640替换为质粒Y1645，其它步骤均不变，得到Y1681-Y1645-293T细胞组。
(8)Y1681-Y1646-293T细胞组的获得
按照上述步骤(1)的方法，将质粒Y1640替换为质粒Y1646，其它步骤均不变，得到Y1681-Y1646-293T细胞组。
(9)Y1681-Y1647-293T细胞组的获得
按照上述步骤(1)的方法，将质粒Y1640替换为质粒Y1647，其它步骤均不变，得到Y1681-Y1647-293T细胞组。
(10)Y1682-Y1640-293T细胞组、Y1683-Y1640-293T细胞组和Y1684-Y1640-293T细胞组的获得
按照上述步骤(1)的方法，将质粒Y1681分别替换为质粒Y1682、质粒Y1683和质粒Y1684，其它步骤均不变，得到Y1682-Y1640-293T细胞组、Y1683-Y1640-293T细胞组和Y1684-Y1640-293T细胞组。
(11)Y1682-293T细胞组、Y1683-293T细胞组和Y1684-293T细胞组的获得
按照上述步骤(2)的方法，将质粒Y1681分别替换为质粒Y1682、质粒Y1683和质粒Y1684，其它步骤均不变，得到Y1682-293T细胞组、Y1683-293T细胞组和Y1684-293T细胞组。
(12)Y1682-Y1641-293T细胞组、Y1683-Y1641-293T细胞组和Y1684-Y1641-293T细胞组的获得
按照上述步骤(1)的方法，将质粒Y1640替换为质粒Y1641，将质粒Y1681分别替换为质粒Y1682、质粒Y1683和质粒Y1684，其它步骤均不变，得到Y1682-Y1641-293T细胞组、Y1683-Y1641-293T细胞组和Y1684-Y1641-293T细胞组。
(13)Y1682-Y1642-293T细胞组、Y1683-Y1642-293T细胞组和Y1684-Y1642-293T细胞组的获得
按照上述步骤(1)的方法，将质粒Y1640替换为质粒Y1642，将质粒Y1681分别替换为质粒Y1682、质粒Y1683和质粒Y1684，其它步骤均不变，得到Y1682-Y1642-293T细胞组、Y1683-Y1642-293T细胞组和Y1684-Y1642-293T细胞组。
(14)Y1682-Y1643-293T细胞组、Y1683-Y1643-293T细胞组和Y1684-Y1643-293T细胞组的获得
按照上述步骤(1)的方法，将质粒Y1640替换为质粒Y1643，将质粒Y1681分别替换为质粒Y1682、质粒Y1683和质粒Y1684，其它步骤均不变，得到Y1682-Y1643-293T细胞组、Y1683-Y1643-293T细胞组和Y1684-Y1643-293T细胞组。
(15)Y1682-Y1644-293T细胞组、Y1683-Y1644-293T细胞组和Y1684-Y1644-293T细胞组的获得
按照上述步骤(1)的方法，将质粒Y1640替换为质粒Y1644，将质粒Y1681分别替换为质粒Y1682、质粒Y1683和质粒Y1684，其它步骤均不变，得到Y1682-Y1644-293T细胞组、Y1683-Y1644-293T细胞组和Y1684-Y1644-293T细胞组。
(16)Y1682-Y1645-293T细胞组、Y1683-Y1645-293T细胞组和Y1684-Y1645-293T细胞组的获得
按照上述步骤(1)的方法，将质粒Y1640替换为质粒Y1645，将质粒Y1681分别替换为质粒Y1682、质粒Y1683和质粒Y1684，其它步骤均不变，得到Y1682-Y1645-293T细胞组、Y1683-Y1645-293T细胞组和Y1684-Y1645-293T细胞组。
(17)Y1682-Y1646-293T细胞组、Y1683-Y1646-293T细胞组和Y1684-Y1646-293T细胞组的获得
按照上述步骤(1)的方法，将质粒Y1640替换为质粒Y1646，将质粒Y1681分别替换为质粒Y1682、质粒Y1683和质粒Y1684，其它步骤均不变，得到Y1682-Y1646-293T细胞组、Y1683-Y1646-293T细胞组和Y1684-Y1646-293T细胞组。
(18)Y1682-Y1647-293T细胞组、Y1683-Y1647-293T细胞组和Y1684-Y1647-293T细胞组的获得
按照上述步骤(1)的方法，将质粒Y1640替换为质粒Y1647，将质粒Y1681分别替换为质粒Y1682、质粒Y1683和质粒Y1684，其它步骤均不变，得到Y1682-Y1647-293T细胞组、Y1683-Y1647-293T细胞组和Y1684-Y1647-293T细胞组。
2、各细胞的基因组DNA的提取和PCR扩增产物的回收
(1)用Genomic DNA Extraction kit分别提取步骤1获得的各细胞组的基因组DNA。
(2)完成步骤(1)后，以步骤(1)提取的Y1681-Y1640-293T细胞组、Y1682-Y1640-293T细胞组、Y1683-Y1640-293T细胞组和Y1684-Y1640-293T细胞组、Y1681-Y1642-293T细胞组、Y1682-Y1642-293T细胞组、Y1683-Y1642-293T细胞组、Y1684-Y1642-293T细胞组、Y1681-Y1644-293T细胞组、Y1682-Y1644-293T细胞组、Y1683-Y1644-293T细胞组、Y1684-Y1644-293T细胞组、Y1681-Y1646-293T细胞组、Y1682-Y1646-293T细胞组、Y1683-Y1646-293T细胞组或Y1684-Y1646-293T细胞组的基因组DNA为模板，以hAAV-F：5’-GGGTCACCTCTCACTCCTTTCAT-3’和hAAV-R：5’-ATCCTCTCTGGCTCCATCGTAAG-3’组成的引物，用Max酶进行PCR扩增，得到475bp的PCR扩增产物甲。
(3)完成步骤(1)后，以步骤(1)提取的Y1681-Y1641-293T细胞组、Y1682-Y1641-293T细胞组、Y1683-Y1641-293T细胞组和Y1684-Y1641-293T细胞组、Y1681-Y1643-293T细胞组、Y1682-Y1643-293T细胞组、Y1683-Y1643-293T细胞组、Y1684-Y1643-293T细胞组、Y1681-Y1645-293T细胞组、Y1682-Y1645-293T细胞组、Y1683-Y1645-293T细胞组、Y1684-Y1645-293T细胞组、Y1681-Y1647-293T细胞组、Y1682-Y1647-293T细胞组、Y1683-Y1647-293T细胞组或Y1684-Y1647-293T细胞组的基因组DNA为模板，以hRosa26-F：5’-AACCTCGACACCAACTCTAGTCC-3’和hRosa26-R：5’-TCTCACATGAGCGAAACCACTGC-3’组成的引物，用Max酶进行PCR扩增，得到670bp的PCR扩增产物乙。
3、T7E1突变检测
(1)样品的制备
①将PCR扩增产物甲进行胶回收，得到回收产物甲；将PCR扩增产物乙进行胶回收，得到回收产物乙。
②完成步骤①后，配制退火反应体系：退火反应体系包括回收产物甲或回收产物乙1～3μg、突变检测buffer 3μL，用ddH2O补至30μL。
③完成步骤②后，进行退火反应。反应条件为：首先98℃10min，然后缓慢降温(降温速度<1℃/10s)至25℃，最后25℃5min。
完成步骤③后的退火反应体系即为制备的样品。
(2)T7E1处理
取步骤(1)制备的样品20μL，加入0.5μL T7E1，得到处理体系；然后37℃条件下反应30min。
(3)电泳分析和结果判断
将完成步骤(2)的处理体系用浓度为1.8％的琼脂糖凝胶电泳分析，然后进行如下结果判断：
如果PCR扩增产物甲可被T7EⅠ酶切为两段且大小分别约为198bp和277bp、说明相应的CRISPR/Cpf1***造成hAAVS1基因的突变；如果PCR扩增产物甲被T7EⅠ酶切后的大小无明显变化，则相应的CRISPR/Cpf1***不造成hAAVS1基因的突变；
如果PCR扩增产物乙可被T7EⅠ酶切为两段且大小分别约为286bp和384bp、说明相应的CRISPR/Cpf1***造成THUMPD3-AS1基因的突变；如果PCR扩增产物乙被T7EⅠ酶切后的大小无明显变化，则相应的CRISPR/Cpf1***不造成THUMPD3-AS1基因的突变。
T7E1突变检测实验结果见图1(图1中A为hAAVS1基因的突变检测结果：左上为AsCRISPR/Cpf1***，其中M为DNA Marker，“-”为Y1681-293T细胞组，As为Y1681-Y1640-293T细胞组，Fn为Y1681-Y1642-293T细胞组，Lb为Y1681-Y1644-293T细胞组，Lb2为Y1681-Y1646-293T细胞组；右上为FnCRISPR/Cpf1***，其中M为DNA Marker，“-”为Y1682-293T细胞组，As为Y1682-Y1640-293T细胞组，Fn为Y1682-Y1642-293T细胞组，Lb为Y1682-Y1644-293T细胞组，Lb2为Y1682-Y1646-293T细胞组；左下为LbCRISPR/Cpf1***，其中M为DNAMarker，“-”为Y1683-293T细胞组，As为Y1683-Y1640-293T细胞组，Fn为Y1683-Y1642-293T细胞组，Lb为Y1683-Y1644-293T细胞组，Lb2为Y1683-Y1646-293T细胞组；右下为Lb2CRISPR/Cpf1***，其中M为DNA Marker，“-”为Y1684-293T细胞组，As为Y1684-Y1640-293T细胞组，Fn为Y1684-Y1642-293T细胞组，Lb为Y1684-Y1644-293T细胞组，Lb2为Y1684-Y1646-293T细胞组。图1中B为THUMPD3-AS1基因的突变检测结果：左上为AsCRISPR/Cpf1***，其中M为DNA Marker，“-”为Y1681-293T细胞组，As为Y1681-Y1641-293T细胞组，Fn为Y1681-Y1643-293T细胞组，Lb为Y1681-Y1645-293T细胞组，Lb2为Y1681-Y1647-293T细胞组；右上为FnCRISPR/Cpf1***，其中M为DNA Marker，“-”为Y1682-293T细胞组，As为Y1682-Y1641-293T细胞组，Fn为Y1682-Y1643-293T细胞组，Lb为Y1682-Y1645-293T细胞组，Lb2为Y1682-Y1647-293T细胞组；左下为LbCRISPR/Cpf1***，其中M为DNA Marker，“-”为Y1683-293T细胞组，As为Y1683-Y1641-293T细胞组，Fn为Y1683-Y1643-293T细胞组，Lb为Y1683-Y1645-293T细胞组，Lb2为Y1683-Y1647-293T细胞组；右下为Lb2CRISPR/Cpf1***，其中M为DNA Marker，“-”为Y1684-293T细胞组，As为Y1684-Y1641-293T细胞组，Fn为Y1684-Y1643-293T细胞组，Lb为Y1684-Y1645-293T细胞组，Lb2为Y1684-Y1647-293T细胞组)。结果表明，AsCRISPR/Cpf1***、FnCRISPR/Cpf1***、LbCRISPR/Cpf1***和Lb2CRISPR/Cpf1***均造成hAAVS1基因和THUMPD3-AS1基因的突变。因此，上述各CRISPR/Cpf1***均有一定的基因编辑能力。
4、PCR扩增产物甲和PCR扩增产物乙的测序
将步骤2中(2)得到的PCR扩增产物甲进行测序，引物为hAAV-ce：5’-cagctcccctaccccccttac-3’。将步骤2中(3)得到的PCR扩增产物乙进行测序，引物为hRosa26-ce：5’-cgcccagggaccaagttagc-3’。测序由苏州金唯智生物科技有限公司完成。
测序结果见图2(图2中A为AsCRISPR/Cpf1***对hAAVS1基因的编辑能力，其中(a)为Y1681-293T细胞组，(b)为Y1681-Y1640-293T细胞组，(c)为Y1681-Y1642-293T细胞组，(d)为Y1681-Y1644-293T细胞组，(e)为Y1681-Y1646-293T细胞组；图2中B为AsCRISPR/Cpf1***对THUMPD3-AS1基因的编辑能力，其中(a)为Y1681-293T细胞组，(b)为Y1681-Y1641-293T细胞组，(c)为Y1681-Y1643-293T细胞组，(d)为Y1681-Y1645-293T细胞组，(e)为Y1681-Y1647-293T细胞组；图2中C为FnCRISPR/Cpf1***对hAAVS1基因的编辑能力，其中(a)为Y1682-293T细胞组，(b)为Y1682-Y1640-293T细胞组，(c)为Y1682-Y1642-293T细胞组，(d)为Y1682-Y1644-293T细胞组，(e)为Y1682-Y1646-293T细胞组；图2中D为FnCRISPR/Cpf1***对THUMPD3-AS1基因的编辑能力，其中(a)为Y1682-293T细胞组，(b)为Y1682-Y1641-293T细胞组，(c)为Y1682-Y1643-293T细胞组，(d)为Y1682-Y1645-293T细胞组，(e)为Y1682-Y1647-293T细胞组；图2中E为LbCRISPR/Cpf1***对hAAVS1基因的编辑能力，其中(a)为Y1683-293T细胞组，(b)为Y1683-Y1640-293T细胞组，(c)为Y1683-Y1642-293T细胞组，(d)为Y1683-Y1644-293T细胞组，(e)为Y1683-Y1646-293T细胞组；图2中F为LbCRISPR/Cpf1***对THUMPD3-AS1基因的编辑能力，其中(a)为Y1683-293T细胞组，(b)为Y1683-Y1641-293T细胞组，(c)为Y1683-Y1643-293T细胞组，(d)为Y1683-Y1645-293T细胞组，(e)为Y1683-Y1647-293T细胞组；图2中G为Lb2CRISPR/Cpf1***对hAAVS1基因的编辑能力，其中(a)为Y1684-293T细胞组，(b)为Y1684-Y1640-293T细胞组，(c)为Y1684-Y1642-293T细胞组，(d)为Y1684-Y1644-293T细胞组，(e)为Y1684-Y1646-293T细胞组；图2中H为Lb2CRISPR/Cpf1***对THUMPD3-AS1基因的编辑能力，其中(a)为Y1684-293T细胞组，(b)为Y1684-Y1641-293T细胞组，(c)为Y1684-Y1643-293T细胞组，(d)为Y1684-Y1645-293T细胞组，(e)为Y1684-Y1647-293T细胞组)。测序结果表明，AsCRISPR/Cpf1***、FnCRISPR/Cpf1***、LbCRISPR/Cpf1***和Lb2CRISPR/Cpf1***均造成hAAVS1基因和THUMPD3-AS1基因的突变，且上述各CRISPR/Cpf1***的基因编辑能力依次为：AsCRISPR/Cpf1***＞FnCRISPR/Cpf1***＞LbCRISPR/Cpf1***＞Lb2CRISPR/Cpf1***。因此，AsCRISPR/Cpf1***、FnCRISPR/Cpf1***、LbCRISPR/Cpf1***和Lb2CRISPR/Cpf1***均可运用于基因编辑技术。
实施例2、化学合成的crRNA用于CRISPR/Cpf1***在基因编辑中的应用
一、化学合成的crRNA的制备
合成表1中所示的crRNA。表1中，单下划线为Lb crRNA骨架序列自5’末端起第2至21位，虚线为Lb2crRNA骨架序列自5’末端起第2至20位，双下划线为靶序列Ⅰ自5’末端起第1至19位，方框为靶序列Ⅰ自5’末端起第1至23位，单波浪线为靶序列Ⅱ自5’末端起第1至23位，双波浪线为靶序列Ⅱ自5’末端起第1至19位。
表1中所示的所有crRNA为均1OD(33μg)一管，每管中加入66μL DEPC水，得到RNA浓度均为0.5μg/μL的RNA溶液。
表1.化学合成的crRNA的基本信息
Figure BDA0000982483720000141
二、检测化学合成的crRNA用于CRISPR/Cpf1***中的基因编辑能力
1、共转染
(1)Y1683-A39-293T细胞组的获得
质粒Y1683和A39共转染293T细胞的步骤如下：
①同实施例1步骤二1(1)中①。
②同实施例1步骤二1(1)中②。
③同实施例1步骤二1(1)中③。
④同实施例1步骤二1(1)中④。
⑤完成步骤④后，将所述6孔板中的培养基更换为OPTI-MEM培养基，然后加入4μg质粒Y1683和2μg A39(即加入RNA溶液4μL)，进行共转染(共转染过程中，转染试剂为lipofectamine 2000，培养基为OPTI-MEM培养基，共转染的步骤参考Lipofectamin2000说明书)，然后37℃、5％CO2培养箱中孵育6h，然后更换为新的OPTI-MEM培养基，37℃、5％CO2培养箱中继续培养18h。
⑥重复步骤⑤一次。
⑦同实施例1步骤二1(1)中⑦。
⑧同实施例1步骤二1(1)中⑧。
⑨同实施例1步骤二1(1)中⑨。
⑩同实施例1步骤二1(1)中⑩。
步骤⑩中的沉淀即为质粒Y1683和A39共转染后的293T细胞组，简称Y1683-A39-293T细胞组。
(2)Y1683-R39-293T细胞组的获得
按照上述步骤(1)的方法，将质粒A39替换为R39，其它步骤均不变，得到Y1683-R39-293T细胞组。
(3)Y1683-293T细胞组的获得
按照实施例1步骤二1中(2)的方法，将质粒Y1681替换为质粒Y1683，其它步骤均不变，得到Y1683-293T细胞组。
(4)Y1683-Y1644-293T细胞组的获得
按照实施例1步骤二1中(1)的方法，将质粒Y1640替换为质粒Y1644，将质粒Y1681替换为质粒Y1683，其它步骤均不变，得到Y1683-Y1644-293T细胞组。
(5)Y1683-Y1645-293T细胞组的获得
按照实施例1步骤二1中(1)的方法，将质粒Y1640替换为质粒Y1645，将质粒Y1681替换为质粒Y1683，其它步骤均不变，得到Y1683-Y1645-293T细胞组。
(6)Y1684-A38-293T细胞组的获得
按照上述步骤(1)的方法，将质粒Y1683替换为质粒Y1684，将质粒A39替换为A38，其它步骤均不变，得到Y1684-A38-293T细胞组。
(7)Y1684-A42-293T细胞组的获得
按照上述步骤(1)的方法，将质粒Y1683替换为质粒Y1684，将质粒A39替换为A42，其它步骤均不变，得到Y1684-A42-293T细胞组。
(8)Y1684-R38-293T细胞组的获得
按照上述步骤(1)的方法，将质粒Y1683替换为质粒Y1684，将质粒A39替换为R38，其它步骤均不变，得到Y1684-R38-293T细胞组。
(9)Y1684-R42-293T细胞组的获得
按照上述步骤(1)的方法，将质粒Y1683替换为质粒Y1684，将质粒A39替换为R42，其它步骤均不变，得到Y1684-R42-293T细胞组。
(10)Y1684-293T细胞组的获得
按照实施例1步骤二1中(2)的方法，将质粒Y1681替换为质粒Y1684，其它步骤均不变，得到Y1684-293T细胞组。
(11)Y1684-Y1646-293T细胞组的获得
按照实施例1步骤二1中(1)的方法，将质粒Y1640替换为质粒Y1646，将质粒Y1681替换为质粒Y1684，其它步骤均不变，得到Y1684-Y1646-293T细胞组。
(12)Y1684-Y1647-293T细胞组的获得
按照实施例1步骤二1中(1)的方法，将质粒Y1640替换为质粒Y1647，将质粒Y1681替换为质粒Y1684，其它步骤均不变，得到Y1684-Y1647-293T细胞组。
2、各细胞的基因组DNA的提取和PCR扩增产物的回收
(1)用Genomic DNA Extraction kit分别提取步骤1获得的各细胞组的基因组DNA。
(2)完成步骤(1)后，以步骤(1)提取的Y1683-293T细胞组、Y1683-Y1644-293T细胞组、Y1684-Y1646-293T细胞组、Y1683-A39-293T细胞组、Y1684-A38-293T细胞组或Y1684-A42-293T细胞组的基因组DNA为模板，以hAAV-F：5’-GGGTCACCTCTCACTCCTTTCAT-3’和hAAV-R：5’-ATCCTCTCTGGCTCCATCGTAAG-3’组成的引物，用Max酶进行PCR扩增，得到475bp的PCR扩增产物甲。
(3)完成步骤(1)后，以步骤(1)提取的Y1684-293T细胞组、Y1683-Y1645-293T细胞组、Y1684-Y1647-293T细胞组、Y1683-R39-293T细胞组、Y1684-R38-293T细胞组或Y1684-R42-293T细胞组的基因组DNA为模板，以hRosa26-F：5’-AACCTCGACACCAACTCTAGTCC-3’和hRosa26-R：5’-TCTCACATGAGCGAAACCACTGC-3’组成的引物，用Max酶进行PCR扩增，得到670bp的PCR扩增产物乙。
3、PCR扩增产物的T7E1突变检测
同实施例1步骤二中3。
实验结果见图3(图3中A为化学合成的crRNA用于CRISPR/Cpf1***中hAAVS1基因的突变检测结果：其中M为DNA Marker，B为Y1683-293T细胞组，LbA为Y1683-Y1644-293T细胞组，Lb2A为Y1684-Y1646-293T细胞组，A39为Y1683-A39-293T细胞组，A38为Y1684-A38-293T细胞组，A42为Y1684-A42-293T细胞组；图3中B为化学合成的crRNA用于CRISPR/Cpf1***中THUMPD3-AS1基因的突变检测结果：其中M为Marker，B为Y1684-293T细胞组，LbR为Y1683-Y1645-293T细胞组，Lb2R为Y1684-Y1647-293T细胞组，R39为Y1683-R39-293T细胞组，R38为Y1684-R38-293T细胞组，R42为Y1684-R42-293T细胞组)。结果表明，化学合成的crRNA在LbCRISPR/Cpf1***和Lb2CRISPR/Cpf1***中均有一定的基因编辑能力。
4、PCR扩增产物的测序
同实施例1步骤二中4。测序结果见图4(图4中A为化学合成的crRNA用于CRISPR/Cpf1***中hAAVS1基因的编辑能力：其中LbCpf1为Y1683-293T细胞组，LbCpf1+LbA为Y1683-Y1644-293T细胞组，Lb2Cpf1+Lb2A为Y1684-Y1646-293T细胞组，LbCpf1+A39为Y1683-A39-293T细胞组，Lb2Cpf1+A38为Y1684-A38-293T细胞组，Lb2Cpf1+A42为Y1684-A42-293T细胞组。图4中B为化学合成的crRNA用于CRISPR/Cpf1***中THUMPD3-AS1基因的编辑能力：其中Lb2Cpf1为Y1684-293T细胞组，LbCpf1+LbR为Y1683-Y1645-293T细胞组，Lb2Cpf1+Lb2R为Y1684-Y1647-293T细胞组，LbCpf1+R39为Y1683-R39-293T细胞组，Lb2Cpf1+R38为Y1684-R38-293T细胞组，Lb2Cpf1+R42为Y1684-R42-293T细胞组)。测序结果表明，化学合成的crRNA能有效行使引导Cpf1剪切编辑特定靶位点的作用，且效率很高。因此，化学合成的crRNA在LbCRISPR/Cpf1***和Lb2CRISPR/Cpf1***中均有一定的基因编辑能力。
Figure IDA0000982483800000011
Figure IDA0000982483800000021
Figure IDA0000982483800000031
Figure IDA0000982483800000041
Figure IDA0000982483800000051
Figure IDA0000982483800000071
Figure IDA0000982483800000081
Figure IDA0000982483800000091
Figure IDA0000982483800000101
Figure IDA0000982483800000111
Figure IDA0000982483800000121
Figure IDA0000982483800000131
Figure IDA0000982483800000141

Claims (6)

1.CRISPR/Cpf1***在基因编辑中的应用；所述CRISPR/Cpf1***中包括a1）或a2）：
a1）化学合成的crRNA；
a2）表达化学合成的crRNA的载体；
所述化学合成的crRNA为e9）-e14）中的任一种：
e9）5’-AAUUUCUACUAAGUGUAGAUucuguccccuccaccccac-3’；
e10）5’-AAUUUCUACUAAGUGUAGAUgagaacaagcgccucccac-3’；
e11）5’-AAUUUCUACUAUUGUAGAUucuguccccuccaccccac-3’；
e12）5’-AAUUUCUACUAUUGUAGAUucuguccccuccaccccacagug-3’；
e13）5’-AAUUUCUACUAUUGUAGAUgagaacaagcgccucccac-3’；
e14）5’-AAUUUCUACUAUUGUAGAUgagaacaagcgccucccacccac-3’；
所述CRISPR/Cpf1***为c1）或c2）：
c1）LbCRISPR/Cpf1***；
c2）Lb2CRISPR/Cpf1***；
e9）、e11）和e12）的靶基因为hAAVS1基因；e10）、e13）和e14）的靶基因为THUMPD3-AS1基因；
所述应用为非疾病诊断和治疗应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述a2）中，所述表达crRNA的载体是将所述crRNA的编码DNA***骨架载体的多克隆位点得到的重组载体。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述骨架载体为克隆载体。
4.一种定向编辑基因组的方法，包括如下步骤：
（1）根据受体基因组中预期进行定向编辑的靶基因设计crRNA；
（2）化学合成所述crRNA；
（3）将所述化学合成的crRNA和编码Cpf1蛋白的基因导入所述受体，从而定向编辑所述受体基因组中的所述靶基因；
e9）、e11）和e12）的靶基因为hAAVS1基因；e10）、e13）和e14）的靶基因为THUMPD3-AS1基因；
所述化学合成的crRNA为e9）-e14）中的任一种：
e9）5’-AAUUUCUACUAAGUGUAGAUucuguccccuccaccccac-3’；
e10）5’-AAUUUCUACUAAGUGUAGAUgagaacaagcgccucccac-3’；
e11）5’-AAUUUCUACUAUUGUAGAUucuguccccuccaccccac-3’；
e12）5’-AAUUUCUACUAUUGUAGAUucuguccccuccaccccacagug-3’；
e13）5’-AAUUUCUACUAUUGUAGAUgagaacaagcgccucccac-3’；
e14）5’-AAUUUCUACUAUUGUAGAUgagaacaagcgccucccacccac-3’；
所述定向编辑为述CRISPR/Cpf1***，具体为c1）或c2）：
c1）LbCRISPR/Cpf1***；
c2）Lb2CRISPR/Cpf1***；
所述方法为非疾病诊断和治疗方法。
5.如权利要4所述的方法，其特征在于：所述编码Cpf1蛋白的基因是通过质粒的形式导入所述受体的。
6.一种定向编辑基因组的CRISPR/Cpf1***，其特征在于：所述CRISPR/Cpf1***中包括a1）或a2）：
a1）化学合成的crRNA；
a2）表达化学合成的crRNA的载体；
e9）、e11）和e12）的靶基因为hAAVS1基因；e10）、e13）和e14）的靶基因为THUMPD3-AS1基因；
所述CRISPR/Cpf1***为c1）或c2）：
c1）LbCRISPR/Cpf1***；
c2）Lb2CRISPR/Cpf1***；
所述化学合成的crRNA为e9）-e14）中的任一种：
e9）5’-AAUUUCUACUAAGUGUAGAUucuguccccuccaccccac-3’；
e10）5’-AAUUUCUACUAAGUGUAGAUgagaacaagcgccucccac-3’；
e11）5’-AAUUUCUACUAUUGUAGAUucuguccccuccaccccac-3’；
e12）5’-AAUUUCUACUAUUGUAGAUucuguccccuccaccccacagug-3’；
e13）5’-AAUUUCUACUAUUGUAGAUgagaacaagcgccucccac-3’；
e14）5’-AAUUUCUACUAUUGUAGAUgagaacaagcgccucccacccac-3’；
所述e9）、e11）或e12）的靶基因为hAAVS1基因；所述e10）、e13）或e14）的靶基因为THUMPD3-AS1基因；
所述hAAVS1基因的Gene ID为54776；所述THUMPD3-AS1基因的Gene ID为440944。
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