JP7084656B2 - トランス脂肪酸含有油脂を分解する新規リパーゼ - Google Patents
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Description
(項目1)
(a)配列番号4、11、16または18に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(b)(a)のアミノ酸配列において、1アミノ酸以上の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を含み、生物学的活性を有するポリペプチド;
(c)(a)または(b)に示すアミノ酸配列と少なくとも70%以上の配列同一性を有し、生物学的活性を有するポリペプチド;
(d)配列番号1、7、15または17に示す核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(e)(d)に示す核酸配列において、1ヌクレオチド以上の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含む核酸配列によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド;
(f)(d)または(e)に示す核酸配列と少なくとも70%以上の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド;
(g)(d)~(f)のいずれか1つに示す核酸配列またはその相補的配列を含むポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされ、かつ生物学的活性を有するポリペプチド;
(h)(d)~(g)のいずれか1つの核酸配列の対立遺伝子変異体によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド;または
(i)(a)~(h)に示すアミノ酸配列の断片を含む、ポリペプチド、
である、ポリペプチド。
(項目2)
前記生物学的活性は、トランス脂肪酸含有油脂の資化に関連する能力、またはトランス脂肪酸含有油脂を分解する能力である、項目1に記載のポリペプチド。
(項目3)
45~70℃が油脂を分解する能力の至適温度である、項目1または2に記載のポリペプチド。
(項目4)
35~55℃が油脂を分解する能力の至適温度である、項目1~3のいずれか一項に記載のポリペプチド。
(項目5)
65℃以上で、好ましくは85℃以下において熱安定性を有する、項目1~4のいずれか一項に記載のポリペプチド。
(項目6)
75℃以上で、好ましくは80℃以下において熱安定性を有する、項目1~5のいずれか一項に記載のポリペプチド。
(項目7)
15℃において油脂を分解する能力を有する、項目1~6のいずれか一項に記載のポリペプチド。
(項目8)
ブルクホルデリア アルボリス(Burkholderia arboris)に由来するポリペプチドである、項目1~7のいずれか一項に記載のポリペプチド。
(項目9)
(A)配列番号1、7、15または17に示す核酸配列を含むポリヌクレオチド;
(B)(A)に示す核酸配列において、1ヌクレオチド以上の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含む核酸配列を含むポリヌクレオチド;
(C)(A)または(B)に示す核酸配列と少なくとも70%以上の配列同一性を有する核酸配列を含み、生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド;
(D)(A)~(C)のいずれか1つに示す核酸配列またはその相補的配列を含むポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列を含み、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド;
(E)(A)~(D)のいずれか1つの核酸配列の対立遺伝子変異体であって、生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド;または
(F)配列番号4、11、16または18に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド;
(G)(F)のアミノ酸配列において、1アミノ酸以上の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を含み、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(H)(F)または(G)に示すアミノ酸配列と少なくとも70%以上の配列同一性を有し、生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド;または
(I)(F)~(H)に示す核酸配列の断片を含む、ポリヌクレオチド、
である、ポリヌクレオチド。
(項目10)
前記生物学的活性は、トランス脂肪酸含有油脂の資化に関連する能力、またはトランス脂肪酸含有油脂を分解する能力である、項目9に記載のポリヌクレオチド。
(項目11)
45~70℃が油脂を分解する能力の至適温度であるポリペプチドをコードする、項目9または10に記載のポリヌクレオチド。
(項目12)
35~55℃が油脂を分解する能力の至適温度であるポリペプチドをコードする、項目9~11のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
(項目13)
65℃以上で、好ましくは85℃以下において熱安定性を有するポリペプチドをコードする、項目9~12のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
(項目14)
75℃以上で、好ましくは80℃以下において熱安定性を有するポリペプチドをコードする、項目9~13のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
(項目15)
前記ポリヌクレオチドは、15℃において油脂を分解する能力を有するポリペプチドをコードする、項目9~14のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
(項目16)
ブルクホルデリア アルボリス(Burkholderia arboris)に由来するポリヌクレオチドである、項目9~15のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
(項目17)
項目9~16のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む細胞または無細胞発現系。
(項目18)
項目1~8のいずれか一項に記載のポリペプチド、項目9~16のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む細胞もしくは無細胞発現系、または項目17に記載の細胞もしくは無細胞発現系を含む油分解剤。
(項目19)
さらなる油処理成分を含む、項目18に記載の油分解剤。
(項目20)
項目1~8のいずれか一項に記載のポリペプチド、または項目9~16のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む細胞または無細胞発現系、項目17に記載の細胞もしくは無細胞発現系、または項目18に記載の油分解剤と、さらなる油処理成分とを備える、油分解のためのキット。
(項目21)
項目1~8のいずれか一項に記載のポリペプチド、または項目9~16のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む細胞または無細胞発現系、項目17に記載の細胞または無細胞発現系または項目18もしくは19に記載の油分解剤を処理対象に作用させることを包含する、油分解除去方法。
(項目22)
前記処理対象はトランス脂肪酸またはトランス脂肪酸含有油脂を含む、項目21に記載の方法。
(項目23)
項目1~8のいずれか一項に記載のポリペプチド、項目9~16のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む細胞もしくは無細胞発現系、または項目17に記載の細胞もしくは無細胞発現系を含む洗剤。
(項目24)
脂肪改変・油脂生産技術(エステル交換等)における、項目1~8のいずれか一項に記載のポリペプチド、または項目9~16のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む細胞または無細胞発現系、項目17に記載の細胞または無細胞発現系または項目18もしくは19に記載の油分解剤の使用。
本明細書において「リパーゼ」とは、エステラーゼの一種であり、中性脂肪(グリセロールエステル)を加水分解して,脂肪酸とグリセロールに分解する反応を可逆的に触媒する酵素をいう。本開示のリパーゼは、酵素番号(EC番号)でEC3.1.1.3に分類される、トリグリセロールリパーゼに分類される。
本開示で提供される油分解剤は液体又は固体ないし乾燥体の状態で提供される。液体形状としては、細菌の培養液(必要に応じて濃縮又は希釈してもよい)、培養上清、培養液由来の酵素成分を支持体に吸着させたもの、培養液から酵素を分離精製して溶媒に懸濁させたものなどを例示できる。また、固体については、グリセロールなどの保護剤を含む溶媒に懸濁し凍結させたもの、担体に固定化させたもの(担体に共有結合、静電相互作用・疎水性相互作用などにより吸着させたもの、担体に分子架橋させたものなど)、遠心分離やプレス圧縮等により脱水したもの、さらには乾燥した乾燥体などを例示できる。好ましい実施形態では、油分解剤は、代表的には、液体形状、粉末、顆粒の形状で提供され、洗剤としてまたは洗剤の成分として他の成分とともに含有されて提供され得る。
以下に本開示の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本開示のよりよい理解のために提供されるものであり、本開示の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本開示の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。また、本開示の以下の実施形態は単独でも使用されあるいはそれらを組み合わせて使用することができることが理解される。
本開示は、新規のポリペプチドを提供する。
本開示は、代表的に、ブルクホルデリア アルボリス(Burkholderia arboris)種KH-1株またはその誘導株から得られる第1のリパーゼの代表的配列および第2のリパーゼの代表的配列ならびにそれらの誘導体を提供する。
1つの局面において、本開示のポリペプチドは、
(a)配列番号4、11、16または18に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(b)(a)のアミノ酸配列において、1アミノ酸以上の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を含み、生物学的活性を有するポリペプチド;
(c)(a)または(b)に示すアミノ酸配列と少なくとも70%以上の配列同一性を有し、生物学的活性を有するポリペプチド;
(d)配列番号1、7、15または17に示す核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(e)(d)に示す核酸配列において、1ヌクレオチド以上の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含む核酸配列によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド;
(f)(d)または(e)に示す核酸配列と少なくとも70%以上の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド;
(g)(d)~(f)のいずれか1つに示す核酸配列またはその相補的配列を含むポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされ、かつ生物学的活性を有するポリペプチド;
(h)(d)~(g)のいずれか1つの核酸配列の対立遺伝子変異体によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド;または
(i)(a)~(h)に示すアミノ酸配列の断片を含む、ポリペプチド、
である、ポリペプチドであり得る。
別の局面では、本開示は、新規のポリペプチドをコードする核酸配列を提供する。本開示のポリヌクレオチドは、
(A)配列番号1、7、15または17に示す核酸配列を含むポリヌクレオチド;
(B)(A)に示す核酸配列において、1ヌクレオチド以上の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含む核酸配列を含むポリヌクレオチド;
(C)(A)または(B)に示す核酸配列と少なくとも70%以上の配列同一性を有する核酸配列を含み、生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド;
(D)(A)~(C)のいずれか1つに示す核酸配列またはその相補的配列を含むポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列を含み、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド;
(E)(A)~(D)のいずれか1つの核酸配列の対立遺伝子変異体であって、生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド;または
(F)配列番号4、11、16または18に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド;
(G)(F)のアミノ酸配列において、1アミノ酸以上の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を含み、生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド;
(H)(F)または(G)に示すアミノ酸配列と少なくとも70%以上の配列同一性を有し、生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド;または
(I)(F)~(H)に示す核酸配列の断片を含む、ポリヌクレオチド、
である、ポリヌクレオチドであり得る。
本開示のポリペプチドが有する生物学的活性は、本開示の第1または第2のリパーゼが有する任意の特性の少なくとも1つであり得るが、例えば、トランス脂肪酸含有油脂の資化に関連する能力、またはトランス脂肪酸含有油脂を分解する能力またはその両方を包含し得る。
したがって、1つの実施形態では、本開示のポリペプチドまたはポリヌクレオチドがコードするポリペプチドは、トランス脂肪酸含有油脂の資化に関連する能力、またはトランス脂肪酸含有油脂を分解する能力またはその両方を有し得る。
1つの好ましい実施形態では、本開示のポリペプチドまたはポリヌクレオチドがコードするポリペプチドは、15℃、あるいは10℃において油脂を分解する能力を有する。
別の好ましい実施形態では、本開示の第1のリパーゼである、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドがコードするポリペプチドは、45~75℃、50~70℃、好ましくは55~65℃、58~63℃、あるいは60℃が油脂を分解する能力の至適温度である。本開示の第2のリパーゼである、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドがコードするポリペプチドは、35~55℃、40~55℃、好ましくは45~55℃、45~50℃、あるいは50℃が油脂を分解する能力の至適温度である。
1つの実施形態では、本開示の第1のリパーゼである、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドがコードするポリペプチドは、50℃以上、55℃以上、60℃以上、65℃以上、70℃以上、あるいは75℃以上で熱安定性を有し得、この熱安定性は、50℃以下、55℃以下、60℃以下、65℃以下、70℃以下、75℃以下、80℃以下、85℃以下、あるいは88℃以下まで保持され得る。本開示の第1のリパーゼである、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドがコードするポリペプチドは、好ましくは、65℃以上で熱安定性を有し得、この熱安定性は、85℃以下まで保持され得る。本開示の第2のリパーゼである、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドがコードするポリペプチドは、40℃以上、45℃以上、55℃以上、60℃以上、65℃以上、70℃以上、あるいは75℃以上で熱安定性を有し得、この熱安定性は、40℃以下、45℃以下、50℃以下、55℃以下、60℃以下、65℃以下、70℃以下、75℃以下、80℃以下、あるいは85℃以下において保持され得る。本開示の第2のリパーゼである、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドがコードするポリペプチドは、好ましくは、50℃以上で熱安定性を有し、この熱安定性は80℃以下において保持され得る。
1つの具体的な実施形態では、本開示のポリペプチドまたはポリヌクレオチドがコードするポリペプチドは、ブルクホルデリア アルボリス(Burkholderia arboris)種に由来するものであってもよいが、これに限定されない。好ましい実施形態では、Burkholderia arboris KH-1株またはその誘導株に由来する酵素であってもよいがこれに限定されない。
さらなる局面において、本開示は、上記のいずれかのポリペプチド、またはポリヌクレオチドを含む細胞または無細胞発現系を含む、油分解剤を提供する。
本開示の細胞は、本開示の第1または第2のリパーゼのポリペプチドを含むか、本開示の第1または第2のリパーゼのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが発現可能に組み込まれているものである。無細胞発現系は、本開示の第1または第2のリパーゼのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが発現可能に提供され、適宜の仕組みによりポリペプチドが発現し、油分解効果を発揮する。
1つの実施形態では、上記油分解剤は、さらなる油処理成分を含む。
別の局面では、本開示は、本開示のポリペプチド、または本開示の細胞もしくは無細胞発現系、または油分解剤と、さらなる油処理成分とを備える、油分解または油脂処理のためのキットを提供する。本開示のキットに含まれる油分解剤および油処理成分は、本明細書において他の箇所に説明される任意の種類のものを任意の組合せで用いることができることが理解される。
別の局面では、本開示は、本開示のポリペプチド、または本開示の細胞もしくは無細胞発現系、または本開示の油分解剤を処理対象に作用させることを包含する、油分解除去方法を提供する。本開示の油分解除去方法において、前記処理対象は、トランス脂肪酸含有油脂を含むことが好ましいが、これに限定されない。トランス脂肪酸含有油脂を含まない対象であっても、本開示のリパーゼを用いる場合、非常に効率よく油分解を行うことができることが本明細書において示されている。
別の局面では、本開示は、本開示のポリペプチド、本開示の細胞もしくは無細胞発現系、または本開示の油分解剤を含む、洗剤を提供する。
さらに別の局面では、本開示のポリペプチド、本開示の細胞もしくは無細胞発現系、または本開示の油分解剤を使用した、脂肪改変・油脂生産技術(エステル交換等)における応用を提供する。脂肪改変・油脂生産技術(エステル交換等)としては、エステル体、例えばメチルエステルやエチルエステルを生じる反応、油脂含有脂肪酸の置換反応、ジアシルグリセロールやモノアシルグリセロールの生産などが挙げられる。
上記アミノ酸配列または核酸配列において変異が導入され得る位置は、当業者であれば、ホモロジーサーチ、モチーフ検索、ドメイン解析、アラインメント、二次構造予測などといった手法によって容易に決定することができる。アミノ酸配列または核酸配列において変異が導入され得る位置は、その位置において変異を有する改変体が本開示のリパーゼの活性を保持する限り、いずれの位置であってもよく、複数の位置に変異が導入されてもよい。具体的には、本開示の第1のリパーゼの場合、配列番号6(全長のアミノ酸配列)のいずれの位置に変異を有していてもよく、1つの例としては、配列番号6の131位のS、308位のD、330位のHに対応する残基以外における変異が望ましいがこれに限定されない。
本開示の第1または第2のリパーゼは、一例として、ブルクホルデリア アルボリス(Burkholderia arboris)種KH-1株(受託番号 NITE BP-02731)またはその誘導株から精製することができる。具体的には、本開示の第1のリパーゼは、
(a)KH-1株またはその誘導株を1%キャノーラ油を含む培地中で28℃で24時間以上培養する工程、
(b)(a)の培養上清を、0.45μm孔のフィルターによって滅菌し、カラム体積の約10倍量の0.5M NaClおよび2mM CaCl2を含む20mM Tris-HCl(pH7.0)緩衝液(以後、Tris緩衝液と記載する)によりあらかじめ平衡化させたButyl-S Sepharose 6 Fast Flow(GEヘルスケア)にアプライし、約1時間静置して疎水性タンパク質をカラムに吸着させる工程、
(c)(b)のカラムをカラム体積の約10倍量のTris緩衝液で洗浄し、その後カラム体積の約1倍量のNaClを含まないTris緩衝液で5回洗浄し、カラム担体に弱く結合したタンパク質を溶出させる工程、および
(d)(c)のカラムを、カラム体積の約1倍量の0.5%のTritonX-100を含むTris緩衝液で4回洗浄し、カラムに強く結合したタンパク質を溶出させる工程
を含む方法によって精製することができる。
本開示の第2のリパーゼは、
(a)KH-1株またはその誘導株を1%キャノーラ油を含む培地中で15℃で48時間以上培養する工程、
(b)(a)の培養上清を、0.45μm孔のフィルターによって滅菌し、カラム体積の約10倍量の0.5M NaClおよび2mM CaCl2を含む20mM Tris-HCl(pH7.0)緩衝液(以後、Tris緩衝液と記載する)によりあらかじめ平衡化させたButyl-S Sepharose 6 Fast Flow(GEヘルスケア)にアプライし、約1時間静置して疎水性タンパク質をカラムに吸着させる工程、
(c)(b)のカラムをカラム体積の約10倍量のTris緩衝液で洗浄し、その後カラム体積の約1倍量のNaClを含まないTris緩衝液で5回洗浄し、カラム担体に弱く結合したタンパク質を溶出させる工程、および
(d)(c)のカラムを、カラム体積の約1倍量の0.5%のTritonX-100を含むTris緩衝液で4回洗浄し、カラムに強く結合したタンパク質を溶出させる工程
を含む方法によって精製することができる。
酵素の精製方法において、KH-1株またはその誘導株の培養条件、カラムクロマトグラフィーの条件等の詳細な条件は、当業者によって適宜調整される。
(a)本開示の第1または第2のリパーゼの成熟体をコードする核酸分子(例えば、配列番号1、7、15または17またはその改変配列)をpBIC1プラスミド(タカラバイオ社)内に遺伝子導入し、ブレビバチルス(Brevibacillus)細菌内で発現させる工程、および
(b)ブレビバチルス(Brevibacillus)細菌から分泌されたタンパク質をNi-Sepharoseにより精製する工程
を含む方法によって生産することができる。または、本開示のリパーゼ組換えタンパク質は、Corynebacterium glutamicumを使用するCORYNEX(登録商標)システム(味の素)、Pichia pastoris発現系(ThermoFisher)、昆虫細胞を使用するバキュロウイルス発現系(ThermoFisher)、麹菌を使用するタンパク質分泌発現系(大関)、pETシステムによる大腸菌のペリプラズム分泌生産系(メルク)などの発現系によって生産することができる。この微生物を使用するリパーゼの生産方法において、リパーゼを発現させる方法、リパーゼを発現させる宿主、宿主から分泌されたリパーゼの精製方法等の詳細な条件は、当業者によって適宜調整される。さらに、本開示のリパーゼは、微生物の分泌生産系以外にも、菌体内発現系、無細胞発現系等の種々の発現系を使用して発現させることもできる。
本開示のリパーゼは、油脂の処理に有用であり、油脂を含む排水や廃液などの処理に使用することができる。この実施形態では、本開示のリパーゼは、排水処理において使用される。本開示のリパーゼは、排水処理用に使用される場合、工場排水、厨房排水、住宅排水などの用途において使用され得る。
この他の例としては、本開示のリパーゼは、洗剤として使用される。本開示のリパーゼは、洗剤として使用される場合、洗濯用洗剤、台所用洗剤、掃除用洗剤、工業用洗剤などの用途において使用され得る。本開示のリパーゼを含む洗剤は、パイプクリーナーなどの排水溝洗剤に特に有用である。
他の実施形態では、本開示のリパーゼは、脂肪改変・油脂生産技術において使用される。本開示のリパーゼは、脂肪改変・油脂生産技術において使用される場合、食品用、工業用、燃料用などの用途において使用され得る。
他の実施形態では、本開示のリパーゼは、環境汚染対策として使用され得る。本開示のリパーゼは、環境汚染対策において使用される場合、油による土壌汚染、地下水汚染、海洋汚染などでの汚染物質の除去に使用され得る。
他の実施形態では、本開示のリパーゼは、廃棄物処理および堆肥化において使用される。本開示のリパーゼは、廃棄物処理および堆肥化において使用される場合、消滅型を含む生ごみ処理、コンポスト化、農産物・食品廃棄物の飼料化、加圧浮上分離装置やグリーストラップから出る油性汚泥の減容化などの用途において使用され得る。
他の実施形態では、本開示のリパーゼは、医薬品として使用される。本開示のリパーゼは、医薬品として使用される場合、消化剤、脂肪分解促進剤などの用途において使用され得る。
他の実施形態では、本開示のリパーゼは、化粧品として使用される。本開示のリパーゼは、化粧品として使用される場合、脂性肌を改善、予防または処置するための化粧品などの用途において使用され得る。
本開示のリパーゼが使用される場合、単離された酵素を含む成分として使用してもよく、細菌自体を含む成分として使用してもよい。
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Savli,H., Karadenizli,A., Kolayli,F., Gundes,S., Ozbek,U., Vahaboglu,H. 2003. Expression stability of six housekeeping genes:A proposal for resistance gene quantification studies of Pseudomonas aeruginosa by real-time quantitative RT-PCR. J.Med.Microbiol. 52:403-408.、Marie-Ange Teste, Manon Duquenne, Jean M Francois and Jean-Luc Parrou 2009. Validation of reference genes for quantitative expression analysis by real-time RT-PCR in Saccharomyces cerevisiae. BMC Molecular Biology 10:99、石井誠治、奥村弘、松原チヨ、二宮扶実、吉岡浩、2004年、「熱感応性ポリマーを用いた水中油分の簡易測定方法」Vol 46、No.12、「用水と排水」などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分(全部であり得る)が参考として援用される。
本明細書において「または」は、文章中に列挙されている事項の「少なくとも1つ以上」を採用できるときに使用される。「もしくは」も同様である。本明細書において「2つの値の範囲内」と明記した場合、その範囲には2つの値自体も含む。
本実施例では、KH-1株において見出された推定リパーゼ遺伝子の各温度での発現解析を示す。
KH-1株を、1%キャノーラオイルを含む無機塩培地(Na2HPO4 3.5g/L、KH2PO4 2.0g/L、(NH4)2SO4 4.0g/L、MgCl2・6H2O 0.34g/L、FeSO4・7H2O 2.8mg/L、MnSO4・5H2O 2.4mg/L、CoCl2・6H2O 2.4mg/L、CaCl2・2H2O 1.7mg/L、CuCl2・2H2O 0.2mg/L、ZnSO4・7H2O 0.3mg/L、およびNaMoO4 0.25mg/L)3Lに、HITACHI U-2810分光光度計(日立製作所、東京)を使用して、菌体光学密度による最終濃度がOD660=0.03となるように植菌し、5L容積ファーメンター(250rpm、200ml/minの空気還流下)中で、28℃または15℃で培養した。経時的にサンプリングした各培養物から、ハイピュアRNAアイソレーションキット(Roche)を使用して全RNAを抽出した。2μgの全RNAを鋳型とし、PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser Perfect Real Time(タカラバイオ社)を使用して、ゲノムDNAを除去し、cDNAを合成した。その後、キットに付属の希釈溶液を使用してcDNA原液を3倍に希釈した。本開示の第1のリパーゼおよび第2のリパーゼをコードする遺伝子に特異的な合成プライマーを使用して、Applied Biosystems StepOnePlusTM (Applied Biosystems)により、定量リアルタイムRT-PCRを行った。PCR反応は、PowerUpTM SYBR(登録商標)Green Master Mix(Thermo Fisher Scientific)(10μl)、各プライマー(終濃度0.5μM)、cDNA(1μl)を含む20μl溶液中で実施した。PCR反応はファストサイクリングモードを使用し、95℃で2分の変性を1サイクル行った後、95℃で3秒間、60℃で30秒間のサイクルを40回反復するプログラムで行った。発現レベルは、RNAポリメラーゼシグマファクター(rpoD)の発現レベルで正規化した。データは、溶融曲線が単一のピークを有することを確認した後、比較Ct法(ΔΔCt法)により解析した。LB培地で培養した場合に発現した各リパーゼ遺伝子を対照として1に設定したときの、相対的な発現レベルを示す。
油脂存在下でのKH-1株の培養によって、2種類のリパーゼ(第1のリパーゼの代表的配列のものおよび第2のリパーゼの代表的配列のもの)をコードする遺伝子の発現誘導が認められた。以下の表1に示すように、第1のリパーゼの代表的配列のものをコードする遺伝子は、28℃で培養した場合に約24時間で発現レベルのピークを示し、15℃で培養した場合には約60時間で発現レベルのピークを示した。第2のリパーゼの代表的配列のものをコードする遺伝子は、28℃で培養した場合に約24時間で発現レベルのピークを示し、15℃で培養した場合には約96時間で発現レベルのピークを示した。
本実施例では、本開示のリパーゼの変異体を使用した実験を示す。
本開示の第1のリパーゼの代表的配列のもののアミノ酸配列(配列番号4)ならびに第2のリパーゼの代表的配列のもののアミノ酸配列(配列番号11)に、リパーゼで活性部位として知られている部位以外のアミノ酸残基について、配列同一性が70~99%になるようにそれぞれ変異を導入したポリペプチドを作製する。この変異体ポリペプチドを使用してトランス脂肪酸含有油脂の分解活性を測定する。
本実施例では、トランス脂肪酸(エライジン酸)およびトランス脂肪酸含有油脂(トリエライジン)を添加した場合の本開示の第1および第2のリパーゼの代表的配列のものをコードする遺伝子の発現レベルを、シス脂肪酸(オレイン酸)およびシス脂肪酸含有脂肪酸(トリオレイン)と比較した。
KH-1株をトリオレインプレートで2日間培養した。その後KH-1株を綿棒で擦り取り、PBSに懸濁し、次いでPBSで2回洗浄を行った。油脂のストック溶液として、終濃度2%のオレイン酸、トリオレイン、エライジン酸またはトリエライジンを含む、終濃度5%のTritonX-100溶液を調製し、70℃で溶解を行った。20mlの無機塩培地に、各油脂のストック溶液を体積比で1/10となるように添加し、ここに洗浄したKH-1株を植菌した(終濃度は、0.2%の油脂、0.5%のTritonX-100であり、菌株は、OD660=0.1である)。28℃で6時間の培養を行った後、KH-1株を回収し、回収したKH-1株から全RNAを抽出した。2μgの全RNAを鋳型として使用して上記に従いcDNAを合成した後、3倍に希釈したcDNAを鋳型として定量RT-PCRを行った。発現レベルは、rpoD遺伝子の発現量で正規化し、オレイン酸培養またはトリオレインでの発現レベルを1としたときの相対値で比較を行った。
第1のリパーゼの代表的配列のものをコードする遺伝子の発現レベルが、トリエライジン処理後に100倍程度増大した(図1Aおよび1B上段)。この結果は、トランス脂肪酸またはトランス脂肪酸含有油脂が、第1のリパーゼの誘導剤となる可能性を示唆する。第2のリパーゼの代表的配列のものをコードする遺伝子の発現についても、トリエライジン処理後に10~20倍程度増大し(図1Aおよび1B下段)、この結果は、トランス脂肪酸またはトランス脂肪酸含有油脂が、第2のリパーゼに対しても誘導剤となる可能性を示唆する。
本実施例では、28℃でのKH-1株培養上清からの第1のリパーゼの代表的配列のものの精製を示す。
4mlのButyl-S Sepharose 6 Fast Flow(GEヘルスケア)を、0.5M NaClおよび2mM CaCl2を含む20mM Tris-HCl(pH7.0)緩衝液40mlで平衡化した。KH-1株を28℃で培養した後の培養上清を、0.45μmのフィルターにより滅菌し、カラムにアプライした。1時間放置して疎水性タンパク質を吸着させた後、40mlの前出の緩衝液で洗浄した。その後、NaClを含まない4mlの前出の緩衝液で5回洗浄し、カラム担体に緩く結合するタンパク質を溶出させた。さらに0.5%のTritonX-100を含む4mlの前出の緩衝液で4回洗浄し、カラム担体に強く疎水性結合したタンパク質の溶出を行った。各溶出サンプルを0.45μmのフィルターでろ過し、そのうちの20μlに、4μlの5×SDS-PAGEサンプル緩衝液を添加した。100℃で5分間熱処理を行った後、遠心分離し、20μlの上清をポリアクリルアミドゲル(5-12%グラディエントゲル)にアプライし、20mAで90分間電気泳動を行った。次いでCBB染色を行うことによって、サンプルに含まれるタンパク質を分離解析した。
28℃の培養上清から精製されたタンパク質は、約30kDaの分子量を示した(図2)。そして、KH-1の28℃での培養上清から疎水性カラムクロマトグラフィーにより精製されたリパーゼは、ほぼ単一のバンドであり、ほとんど単一のタンパク質からなることが示された。
第1のリパーゼの代表的配列のものの成熟タンパク質のアミノ酸配列は、RASTの遺伝子情報から得られた遺伝子配列から推定された産物の45位からの配列と一致するものであり、1~44位のアミノ酸残基はプレ配列として細胞内からの分泌後に切断されることが示唆された。
本実施例では、15℃でのKH-1株培養上清からの第2のリパーゼの代表的配列のものの精製を示す。
実施例4と同様の手法によって、KH-1株を15℃で培養した後の培養上清から、リパーゼを精製した。精製した蛋白質画分をSDS-PAGEで分離後、目的のバンドをゲルから切り出し、脱色・洗浄後、トリプシンを含むトリス緩衝液(pH8.0)を加え、35℃で20時間、酵素消化に処した。回収したサンプル溶液を、脱塩・濃縮後にLC-MS/MS(Thermo Fisher Scientific Inc., USA)で解析した。
15℃の培養上清から精製されたタンパク質は、約40kDaの分子量を示した(図3)。そして、KH-1の15℃での培養上清から疎水性カラムクロマトグラフィーにより精製されたリパーゼは、ほぼ単一のバンドであり、ほとんど単一のタンパク質からなることが示された。
第2のリパーゼの代表的配列のものの成熟タンパク質のアミノ酸配列は、RASTの遺伝子情報から得られた遺伝子配列から推定された産物の49位または51位からの配列と一致するものであり、1~48または50位のアミノ酸残基はプレ配列として細胞内からの分泌後に切断されることが示唆された。
本実施例では、本開示の第1および第2のリパーゼの熱安定性、至適温度、至適pHおよびpH安定性を示す。
本開示の第1および第2のリパーゼの代表的配列のものを、それぞれ28℃または15℃で培養したKH-1株から疎水性カラムクロマトグラフィーによって精製し、5U/mlに調製した。各リパーゼ活性は、以下の(A)~(D)の条件でのp-ニトロフェニルパルミテートの加水分解を測定することによって定量した。(A)10~80℃の間の温度に調整した緩衝液と本開示の第1または第2のリパーゼの代表的配列のものとを混合し、直後に各温度でリパーゼ活性を測定した。(B)本開示の第1または第2のリパーゼを、30~95℃の間の温度で30分間インキュベートし、その後各リパーゼ活性を37℃で測定した。(C)酢酸緩衝液(pH3.0~5.0)、リン酸ナトリウム緩衝液(pH5.0~7.0)、Tris-HCl緩衝液(pH7.0~9.0)またはCAPS緩衝液(pH9.0~11.0)と本開示の第1または第2のリパーゼの代表的配列のものとを混合し、その後リパーゼ活性を測定した。pH9.0でのリパーゼ活性を100%とした場合の相対強度として示す。(D)(C)において使用した各緩衝液と本開示の第1または第2のリパーゼの代表的配列のものの溶液とを、1:1の体積比で混合し、28℃で24時間放置し、その後リパーゼ活性をpH7.0にて測定した。
本開示の第1のリパーゼの代表的配列のものの至適温度は60℃であり、30℃~85℃の間の広範な温度範囲で熱安定性を示した(図4)。本開示の第2のリパーゼの代表的配列のものの至適温度は50℃であり、15℃~80℃の間の広範な温度範囲で熱安定性を示した(図5)。本開示の第1のリパーゼの代表的配列のものの至適pHはpH9.0、安定なpHはpH9.0~9.5であった。本開示の第2のリパーゼの代表的配列のものの至適pHはpH9.0であり、安定なpHはpH7.5~10.5であった。
本開示の第1および第2のリパーゼの至適温度および熱安定性の結果から、本開示のリパーゼは、高温でも高い活性を保持するリパーゼであることが示された。
本実施例では、KH-1株培養上清と油用洗剤および一般洗剤との、換気扇汚れの分解活性を比較した。
KH-1株培養上清として、KH-1株を1%キャノーラ油を含む培地中で28℃で24時間培養したときの培養物の上清を使用した。油用洗剤および一般洗剤として、それぞれ天然酵素洗剤ニコエコ台所用(ニコエコ、長野、説明書に従って143倍に水で希釈)およびファミリー(登録商標)(花王、東京、説明書に従い、666倍に希釈)を使用した。油汚れが沈着した換気扇フィルターを2cm角に切りプレートに入れ、各プレートにKH-1株培養上清(KH-1)、油用洗剤または一般洗剤を5mlずつ添加し、30分間~4時間浸漬させた。
実施例7の結果を図6に示す。一般洗剤と油用洗剤は、4時間の浸漬洗浄でも油汚れを完全に落とすことはできなかったが、KH-1株培養上清は、1時間の浸漬洗浄によって、フィルターを新品と同程度になるまで洗浄することができた。
この培養条件により得られた培養上清中の主要なリパーゼは、本開示の酵素であると考えられるため、この油汚れの分解活性は、本開示の酵素によるものであると考えられる。
本実施例では、KH-1株由来の本開示の第1および第2のリパーゼの代表的配列のものとNovozym51032リパーゼ(Novozymes)との、換気扇汚れの分解活性を比較した。
KH-1株由来の本開示の第1のリパーゼの代表的配列のものおよび第2のリパーゼの代表的配列のものは、それぞれKH-1株の培養上清を、上記に従い疎水性カラムクロマトグラフィーによって精製することによって得た。Novozym51032リパーゼ(N-51032)は、Novozymes社から購入した。各リパーゼを、2mM CaCl2および0.25% TritonX-100を含む20mM Tris-HCl緩衝液(pH7.4)に、15U/mlの濃度となるように溶解した。油汚れが沈着した換気扇フィルターを2cm角に切りプレートに入れ、各プレートに各リパーゼの溶液を5mlずつ添加し、30分間浸漬させた。
リパーゼ溶液に浸漬させた後の換気扇フィルターおよび浸漬させた後のリパーゼ溶液を図7に示す。本開示の第1および第2のリパーゼの代表的配列のものに浸漬させた換気扇フィルターはいずれも、Novozym51032リパーゼに浸漬させた換気扇フィルターよりも油汚れが顕著に分解されていた。
本実施例では、本開示の第1のリパーゼの代表的配列のものによるラードおよびショートニングの分解活性を示す。
KH-1株の培養上清から本開示の第1のリパーゼの代表的配列のものを、2mM CaCl2および0.5% TritonX-100を含む20mM Tris-HCl(pH7.0)溶出緩衝液を使用して、疎水性カラムクロマトグラフィーによって精製した。2mlの本開示のリパーゼの溶液(50U/ml)をプレートに入れ、ここに0.7gのラード(A)または0.5gのショートニング(B)を添加した。適宜攪拌し溶液となじませながら、28℃で24時間放置した。前出の溶出緩衝液のみで処理したものを対照とした。
実施例9の結果を図8に示す。本実施例における実験結果から、緩衝液単独で処理したラードおよびショートニングは、処理後も固体の状態であったのに対し、第1のリパーゼの代表的配列のもので処理した油脂は溶解された(図8(A)および(B))。薄層クロマトグラフィーの結果からも、ラードおよびショートニング中のトリグリセリドが遊離脂肪酸に分解されたことが実証された(図8(C))。本開示の第1のリパーゼは、ラードおよびショートニングを加水分解し、可溶化する活性を有することが示された。
本実施例では、本開示の第2のリパーゼによるラードおよびショートニングの分解活性を示す。
15℃で96時間培養したKH-1株の培養上清から本開示の第2のリパーゼの代表的配列のものを、2mM CaCl2および0.5% TritonX-100を含む20mM Tris-HCl(pH7.0)溶出緩衝液を使用して、疎水性カラムクロマトグラフィーによって精製した。2mlの本開示のリパーゼの溶液(50U/ml)をプレートに入れ、ここに0.7gのラード(A)または0.5gのショートニング(B)を添加した。適宜攪拌し溶液となじませながら、28℃で24時間放置した。前出の溶出緩衝液のみで処理したものを対照とした。
実施例10の結果を図9に示す。本実施例における実験結果から、緩衝液単独で処理したラードおよびショートニングは、処理後も固体の状態であったのに対し、第2のリパーゼの代表的配列のもので処理した油脂は溶解された(図9(A)および(B))。薄層クロマトグラフィーの結果からも、ラードおよびショートニング中のトリグリセリドが遊離脂肪酸に分解されたことが実証された(図9(C))。本開示の第2のリパーゼの代表的配列のものは、ラードおよびショートニングを加水分解し、可溶化する活性を有することが示された。
本実施例では、KH-1株が含むリパーゼおよびBioRemove3200(BR3200、Novozymes)によるトランス脂肪酸含有排水の処理試験を示す。
(A)排水サンプルに、無機塩培地相当のN(窒素)およびP(リン)を添加した。KH-1株は、LB培地において培養し、培養後洗浄を行い、OD=0.1になるように接種しリパーゼを分泌する条件に供した。BR3200(BioRemove3200、Novozymes)は、通常使用される濃度の10倍の量になるように添加した。この排水サンプルを28℃で24時間または48時間培養した。その後サンプルを、クロロホルム、アセトンおよびメタノールを、体積比でそれぞれ96:4:1の比率で含む展開溶媒を使用し、シリカゲルコートプレート上に展開した。油脂の分解は、薄層クロマトグラフィーを使用して、モリブデン酸n水和物による発色によって検出した。
KH-1株が分泌するリパーゼは、24時間処理により排水サンプル中の油分を、BR3200の50%程度まで分解することができることが明らかになった(図10)。さらに、48時間処理では、KH-1株が分泌するリパーゼは、排水サンプル中の油分を、BR3200の1/7程度まで分解することができた。
本実施例では、本開示の第1のリパーゼの代表的配列のものによるトリオレインおよびトリエライジンの分解を示す。
本開示の第1のリパーゼの代表的配列のものは、KH-1株を1%のキャノーラ油を含む無機塩培地で、28℃で培養した培養上清から疎水性カラムクロマトグラフィーによって精製したものを使用した。トリオレインおよびトリエライジンを、終濃度が2%となるように5%のTritonX-100を含む蒸留水に溶解し、ストック溶液とした(10×ストック溶液)。本開示の第1のリパーゼの代表的配列のものの溶液(終濃度30U/mlの20mM Tris緩衝液(2mM CaCl2と0.5% TritonX-100を含む;pH7.0)中)またはリパーゼを含まない同緩衝液のそれぞれ100μlをチューブに分注し、上記の油脂10×ストック溶液を、体積比で1/10となるように添加した。各油脂の終濃度は0.2%、TritonX-100の終濃度は0.5%となる。これらの溶液を37℃で24時間インキュベートした。その後、クロロホルム、アセトンおよびメタノールを、体積比でそれぞれ96:4:1の比率で含む展開溶媒を使用し、シリカゲルコートプレート上に展開した。油脂の分解は、薄層クロマトグラフィーを使用して、モリブトン酸n水和物による発色によって検出した。
本開示の第1のリパーゼの代表的配列のものは、トリオレインおよびトリエライジンのいずれも加水分解する活性を有した(図11)
本開示の第1のリパーゼの代表的配列のものは、シス体のトリグリセリドであるトリオレインと、トランス体のトリグリセリドであるトリエライジンとの両方を加水分解する活性を有することが明らかとなった。
本実施例では、本開示の第2のリパーゼの代表的配列のものによるトリオレインおよびトリエライジンの分解を示す。
本開示の第2のリパーゼの代表的配列のものは、KH-1株を1%のキャノーラ油を含む無機塩培地で、15℃で培養した培養上清から疎水性カラムクロマトグラフィーによって精製したものを使用した。本開示の第2のリパーゼ溶液(終濃度0.3U/mlの20mM Tris緩衝液(2mM CaCl2と0.5% TritonX-100を含む;pH7.0)中)またはリパーゼを含まない同緩衝液のそれぞれ100μlをチューブに分注し、上述の油脂の10×ストック溶液を、体積比で1/10となるように添加した。各油脂の終濃度は0.2%、TritonX-100の終濃度は0.5%となる。これらの溶液を37℃で22時間インキュベートした。その後、クロロホルム、アセトンおよびメタノールを、体積比でそれぞれ96:4:1の比率で含む展開溶媒を使用し、シリカゲルコートプレート上に展開した。油脂の分解は、薄層クロマトグラフィーを使用して、モリブトン酸n水和物による発色によって検出した。
本開示の第2のリパーゼの代表的配列のものは、シス体のトリグリセリドであるトリオレインと、トランス体のトリグリセリドであるトリエライジンとの両方を加水分解する活性を有した(図12)。
本実施例では、15℃条件下での本開示の第1および第2のリパーゼの代表的配列のものによるトリオレインおよびトリエライジンの分解を示す。
第1のリパーゼの代表的配列のものとして、KH-1株を1%のキャノーラ油を含む無機塩培地で、28℃で培養した培養上清から疎水性カラムクロマトグラフィーによって精製したものを使用した。第2のリパーゼの代表的配列のものとして、KH-1株を15℃で同様に培養した培養上清から疎水性カラムクロマトグラフィーによって精製したものを使用した。トリオレインまたはトリエライジンは、終濃度が0.1%となるように、上記10×ストック溶液を1/20添加し、第1または第2のリパーゼ溶液と混合した。第1のリパーゼの代表的配列のものは4-NPPを基質として終濃度6U/ml、第2のリパーゼの代表的配列のものは4-NPPを基質として終濃度6U/mlとした。これらの溶液を15℃で72時間インキュベートした。その後、クロロホルム、アセトンおよびメタノールを、体積比でそれぞれ96:4:1の比率で含む展開溶媒を使用し、シリカゲルコートプレート上に展開した。油脂の分解は、薄層クロマトグラフィーを使用して、モリブトン酸n水和物による発色によって検出した。
シス体のトリグリセリドであるトリオレインは、第1および第2のリパーゼの代表的配列のもののいずれの処理によっても、オレイン酸に分解された。トランス体のトリグリセリドであるトリエライジンは、第1および第2のリパーゼのいずれの処理によっても、エライジン酸に分解された(図13)。この結果から、本開示の第1および第2のリパーゼの代表的配列のものは、低温(15℃)の条件下であっても、シス脂肪酸含有油脂およびトランス脂肪酸含有油脂のいずれも分解する活性を有することが実証された。
本実施例では、本発明の第1および第2のリパーゼの代表的配列のものによる、シス体の脂肪酸の脂肪改変を示す。
1%のキャノーラ油を含むBS培養液中でKH-1株を48時間ファーメンター培養し、その上清からButyl Sepharoseカラムを使用して第1および第2のリパーゼの代表的配列のものを精製した。第1および第2のリパーゼの溶液を、5U/mlに調整した。トリオレインは0.5%となるようにメタノールに溶解してストック溶液とした。そのストック溶液80μlと各酵素溶液20μlとの混合液をスクリューキャップ付きチューブに分注し、37℃のインキュベーターで96時間静置した。なお、リパーゼを含有しない緩衝液と混合したものを対照区とした。その後、各溶液に100μlの水および50μlのクロロホルムを添加し、ボルテックスミキサーでよく攪拌した後、12,000gで5分間遠心分離した。10μlの下層のクロロホルム層を、ヘキサン、ジエチルエーテルおよび酢酸を、体積比でそれぞれ80:20:1の比率で含む展開溶媒を使用してTLC解析に供した。
実施例15の結果を図14に示す。本発明の第1のリパーゼおよび第2のリパーゼのいずれも、シス体のトリグリセリドであるトリオレインのエステル交換反応を触媒し、オレイン酸メチルエステルを生成した。
本実施例では、本発明の第1および第2のリパーゼの代表的配列のものによる、トランス脂肪酸の脂肪改変を示す。
1%のキャノーラ油を含むBS培養液中でKH-1株を48時間ファーメンター培養し、その上清からButyl Sepharoseカラムを使用して第1および第2のリパーゼの代表的配列のものを精製した。第1および第2のリパーゼの溶液を、5U/mlに調整した。(A)パルミテライジン酸および(B)バクセン酸の各トランス脂肪酸モノマーは、各脂肪酸モノマーが0.5%となるようにメタノールに溶解してストック溶液とした。各トランス脂肪酸ストック溶液80μlと各酵素溶液20μlとの混合液を、スクリューキャップ付きチューブに分注し、37℃のインキュベーターで72時間静置した。なお、リパーゼを含有しない緩衝液と混合したものを対照区とした。その後、各溶液に100μlの水および50μlのクロロホルムを添加し、ボルテックスミキサーでよく攪拌した後、12,000gで5分間遠心分離した。5μlの下層のクロロホルム層を、ヘキサン、ジエチルエーテルおよび酢酸を、体積比でそれぞれ80:20:1の比率で含む展開溶媒を使用してTLC解析に供した。
実施例16の結果を図15に示す。本発明の第1のリパーゼおよび第2のリパーゼのいずれも、トランス脂肪酸であるパルミテライジン酸およびバクセン酸のエステル交換反応を触媒し、それぞれパルミテライジン酸メチルエステルおよびバクセン酸メチルエステルを生成した。これにより、これらの酵素は、エライジン酸以外のトランス脂肪酸の反応にも有用であることが明らかになった。
本実施例では、本発明の第1のリパーゼの改変体の油脂分解活性を解析した。
本発明の第1のリパーゼの代表的配列のもの(配列番号4)のアミノ酸配列において、1位、3位、6位、137位、220位、227位、243位、276位および316位に対応するアミノ酸が、それぞれセリン、アスパラギン酸、スレオニン、セリン、バリン、スレオニン、ロイシン、グルタミンおよびリジンに置換された改変体(配列番号16)の発現コンストラクトは、ブレビバチルス発現系を使用した発現システム(BIC system: TaKaRa)にしたがって構築した。菌体は、2SY培地に終濃度で50 μg/mlになるようネオマイシンを添加した培地で48時間30℃で培養した。培養した菌の上清50mlをButyl Sepharoseカラムにアプライし、0.25% TritonX-100を含む20 mM Tris-HCl,2 mM CaCl2に溶出した。なお、リコンビナントリパーゼは成熟型配列のN末端に、AD+6xHis+DDDK (Enterokinase認識配列)が付加されている。油脂として、トリオレイン(TOle)およびトリエライジン(TED)を使用して、以下の実験条件にしたがって、各油脂の分解活性をTLCにより解析した:
・油脂の種類:トリオレイン、トリエライジン
・反応液:20 mM Tris-HCl (pH7.0), 2mM CaCl2, 0.5% Triton X100
・油脂終濃度:0.2%
・処理方法:エッペンドルフチューブに100μlの酵素溶液を入れ、10x各油脂ストックを1/5量添加した。
・処理温度:37℃
・処理時間:48時間
・油分抽出:半量のクロロホルムで抽出し10μlをアプライしてTLCを行った。
・展開プレート:シリカゲルコートプレート
・展開溶剤:chlorofolm:acetone:methanol=96:4:2
・検出:モリブトリン酸n水和物による発色 (2.4 g/60 ml EtOH)
実施例17の結果を図16に示す。上記9か所の変異を有する改変体も、高い油脂分解活性を有していた。
本実施例では、本発明の第2のリパーゼの改変体の油脂分解活性を解析した。
本発明の第2のリパーゼの代表的配列のもの(配列番号11)のアミノ酸配列において、13位、26位、45位、75位、100位、138位、168位、171位、214位、230位、234位、248位、250位、331位および360位のアミノ酸が、それぞれロイシン、ロイシン、アルギニン、イソロイシン、バリン、セリン、グルタミン酸、アルギニン、グリシン、アスパラギン、セリン、アルギニン、グリシン、アスパラギンおよびアラニンに置換された改変体(配列番号18)の発現コンストラクトは、ブレビバチルス発現系を使用した発現システム(BIC system: TaKaRa)にしたがって構築した。菌体は、TM培地に終濃度20mMになるようMgCl2と終濃度50 μg/mlになるようネオマイシンを添加した培地で72時間30℃で培養した。培養した菌の上清50mlをButyl Sepharoseカラムにアプライし、0.25% TritonX-100を含む20 mM Tris-HCl,2 mM CaCl2に溶出した。なお、リコンビナントリパーゼは推定のシグナル配列が切断された配列のN末端に、AD+6xHis+DDDK (Enterokinase認識配列)が付加されている。油脂として、トリオレイン(TOle)およびトリエライジン(TED)を使用して、以下の実験条件にしたがって、各油脂の分解活性をTLCにより解析した:
・油脂の種類:トリオレイン、トリエライジン
・反応液:20 mM Tris-HCl (pH7.0), 2mM CaCl2, 0.5% Triton X100
・油脂終濃度:0.2%
・処理方法:エッペンドルフチューブに100μlの酵素溶液を入れ、10x各油脂ストックを1/5量添加した。
・処理温度:37℃
・処理時間:48時間
・油分抽出:等量のクロロホルムで抽出し10μlをアプライしてTLCを行った。
・展開プレート:シリカゲルコートプレート
・展開溶剤:chlorofolm:acetone:methanol=96:4:2
・検出:モリブトリン酸n水和物による発色 (2.4 g/60 ml EtOH)
実施例18の結果を図17に示す。上記15か所の変異を有する改変体も、高い油脂分解活性を有していた。
以上のように、本開示の好ましい実施形態を用いて本開示を例示してきたが、本開示は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願及び他の文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。本願は日本国特許庁に2018年7月6日に提出された特願2018-129504に対して優先権主張を伴うものであり、その内容はすべて本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
配列番号2 本開示の第1のリパーゼの代表的核酸配列においてプレ配列をコードするヌクレオチドを含む核酸配列
配列番号3 本開示の第1のリパーゼの代表的核酸配列の全長配列
配列番号4 本開示の第1のリパーゼの代表的アミノ酸配列の成熟配列
配列番号5 本開示の第1のリパーゼの代表的アミノ酸配列においてプレ配列を含むアミノ酸配列
配列番号6 本開示の第1のリパーゼの代表的アミノ酸配列の全長配列
配列番号7 本開示の第2のリパーゼの代表的核酸配列の成熟配列
配列番号8 本開示の第2のリパーゼの代表的核酸配列において短鎖プレ配列をコードするヌクレオチドを含む核酸配列
配列番号9 本開示の第2のリパーゼの代表的核酸配列において長鎖プレ配列をコードするヌクレオチドを含む核酸配列
配列番号10 本開示の第2のリパーゼの代表的核酸配列の全長配列
配列番号11 本開示の第2のリパーゼの代表的アミノ酸配列の成熟配列
配列番号12 本開示の第2のリパーゼの代表的アミノ酸配列において短鎖プレ配列を含むアミノ酸配列
配列番号13 本開示の第2のリパーゼの代表的アミノ酸配列において長鎖プレ配列を含むアミノ酸配列
配列番号14 本開示の第2のリパーゼの代表的アミノ酸配列の全長配列
配列番号15 本開示の第1のリパーゼの代表的核酸配列の成熟配列の改変配列
配列番号16 本開示の第1のリパーゼの代表的アミノ酸配列の成熟配列の改変配列
配列番号17 本開示の第2のリパーゼの代表的核酸配列の成熟配列の改変配列
配列番号18 本開示の第2のリパーゼの代表的アミノ酸配列の成熟配列の改変配列
Claims (34)
- (a)配列番号4、11、16または18に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(b)(a)のアミノ酸配列において、1アミノ酸以上30アミノ酸以下の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を含み、生物学的活性を有するポリペプチド;
(c)(a)に示すアミノ酸配列と少なくとも90%以上の配列同一性を有し、生物学的活性を有するポリペプチド;
(d)配列番号1、7、15または17に示す核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(e)(d)に示す核酸配列において、1ヌクレオチド以上90ヌクレオチド以下の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含む核酸配列によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド;
(f)(d)に示す核酸配列と少なくとも90%以上の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド;
(g)(d)に示す核酸配列またはその相補的配列を含むポリヌクレオチドと、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされ、かつ生物学的活性を有するポリペプチド;
(h)(d)~(g)のいずれか1つの核酸配列の対立遺伝子変異体によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド;または
(i)(a)~(h)に示すアミノ酸配列の断片を含み、生物学的活性を有するポリペプチド、
である、ポリペプチドであって、該生物学的活性は、トランス脂肪酸含有油脂の資化に関連する能力、トランス脂肪酸含有油脂を分解する能力、および(a)に記載のポリペプチドが有する油脂分解活性と少なくとも同じ度合いの活性の少なくとも1つを含む、ポリペプチドであって、
該ポリペプチドは、
(1)
MRSRVVAGAVACAMSVAPFAGTTAVMTLATTHAAMAATAPADDYATTRYPIVLVHGLTGTDKYAGVLEYWYGIQEDLQQHGATVYVANLSGFQSDDGPNGRGEQLLAYVKTVLAATGATKVNLVGHSQGGLTSRYVAAVAPDLVASVTTIGTPHRGSEFADFVQGVLAYDPTGLSSSVIAAFVNVFGILTSSSHNTNQDALASLKTLTTAQAATYNQNYPSAGLGAPGSCQTGAPTETVGGNTHLLYSWAGTAIQPTLSVFGVTGATDTSTIPLVDPANALDPSTLALFGTGTVMINRGSGQNDGLVSKCSALYGQVLSTSYKWNHIDEINQLLGVRGAFAEDPVAVIRTHANRLKLAGVからなるポリペプチド、
(2)
からなるポリペプチド、
(3)
からなるポリペプチド、
(4)
MSSRRFMTVAAAVCAALAIAAPPVNAAAPTVPDPFYTYTGTTPLASVPPGTVLKTRNVTYHVAGIPTAVTAQQLLYRTNNAQNQPVVNVTSVIRSQVSNGQAISYQSAYDSLNPYDEPSQVIAGDRDVTKIINIGTLLYSAESIPLSTLLLLGYNIIVPDTEGQTADFAAGPEYGMTTLDSIRAALNTPSTGLNPSSKVAMIGYSGGAIATNWAAQLAPSYAPEINKQLVGAAEGGVLVDPAHNLRYVDGSIVWGGVAAAALAGLSRGYNFDLTPYLSDTGVAVFKDIQNQSLAYILPKYTGLHWSTLFKPQYANDINSIPAYVTYANKVNAGLAASPTIPMFIGQGTAGALDGTFSSQVGDGVMLAYDVRALAQKFCASGTRVTYNEYPLEHAGAIVPWVAGMLPWLYDRFNGKAAPSNCWLTSLLPSNSLAPETLHからなるポリペプチド、
(5)
MSSRRFMIAAAAVSAALVIAAPPASAGAPTVPDPFYTYTGATPLASIPPGTVLKTRNVTYHVAGIPTALTAQQLLYRTNNAQNQPVVNVTSVIRSAVSNGQAISYQSAYDSLNPYDEPSQVIAGDRDVTKVINVGTLLYSAESIPLSTLLLLGYNIIVPDTEGQTADFAAGPEYGMTTLDSIRAALNTPSTGLNPSSKVAMIGYSGGAIATNWAAQLAPSYAPDINRQLVGAAEGGVLVDPAHNLRYVDGSIVWGGVAAAALAGLARGYNFDLTPYLSDTGVAVFKDIQNQSLAYILPKYTGLHWGTLFKPQYANDINSIPVYVTYANKVNAGLAASPTIPMYIGQGTAGALDGTFSSQVGDGVMMAYDVRALAQKFCASGTPVTYTEYPLEHAGAIVPWVAGMLPWLYDRFNGKAAPSNCWLTALLPSNSLAPETLHからなるポリペプチド、
(6)
MSSRRFMLAAAAVSAALAVAASPASAGAPAVSDPFYTYTGTTPLASIPPGTVLKTRNVTYHVAGIPTALTAQQLLYRTNNALNQPVVNVTSVIRSQVSNGRAISYQSAYDSLNPYDEPSQVIAGDRDVTKIINVGTLLYSAESIPLSTLLLLGYNVIVPDTEGQTADFAAGPEYGMTTLDSIRAALNTPSTGLSPSSKVAMIGYSGGAIATNWAAQLAPSYAPEINRQLVGAAEGGVLVDPAHNLRYVDGSIVWGGVAAAALAGLSRGYGFDLTPYLSDTGVAVFNDIQSQSLAYILPKYTGLHWGTLFKPQYANDINSIPAYVTYANKVNAGLAASPTIPMFIGQGTAGALDGTFSSQVGDGVMLAYDVRALAQKFCASGTPVTYTEYPLEHAGAIVPWVAGMLPWLYDRFNGKAAPSNCWLTSLLPSNSLAPETLHからなるポリペプチド、および
(7)
MSTRRFMLAAAAVSAALAVAAPPASAGAPAVSDPFYTYTGTTPLASIPPGTVLKTRNVTYHVAGIPTALTAQQLLYRTNNALNQPVVNVTSVIRSQVSNGQAISYQSAYDSLNPYDEPSQVIAGDRDVTKIINVGTLLYSAESIPLSTLLLLGYNVIVPDTEGQTADFAAGPEYGMTTLDSIRAALNTPSTGLSPSSKVAMIGYSGGAIATNWAAQLAPSYAPEINRQLVGAAEGGVLVDPAHNLRYVDGSIVWGGVAAAALAGLSRGYGFDLTPYLSDTGVAVFNDIQSQSLAYILPKYTGLHWGTLFKPQYANDINSIPAYVTYANKVNAGLAASPTIPMFIGQGTAGALDGTFSSQVGDGVMLAYDVRALAQKFCASGTPVTYTEYPLEHAGAIVPWVAGMLPWLYDRFNGKAAPSNCWLTSLLPSNSLAPETLHからなるポリペプチド
のいずれでもない、ポリペプチド。 - 45~70℃が油脂を分解する能力の至適温度である、請求項1に記載のポリペプチド。
- 35~55℃が油脂を分解する能力の至適温度である、請求項1に記載のポリペプチド。
- 65℃以上において熱安定性を有する、請求項1または2に記載のポリペプチド。
- 75℃以上において熱安定性を有する、請求項1または3に記載のポリペプチド。
- 15℃において油脂を分解する能力を有する、請求項1~5のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- ブルクホルデリア アルボリス(Burkholderia arboris)に由来するポリペプチドである、請求項1~6のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- (a)配列番号4、11、16または18に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド、または
(c)(a)に示すアミノ酸配列と少なくとも90%以上の配列同一性を有し、前記生物学的活性を有するポリペプチド
である、請求項1~7のいずれか一項に記載のポリペプチド。 - (a)配列番号4、11、16または18に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド;または
(b)(a)のアミノ酸配列において、1アミノ酸以上15アミノ酸以下の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を含み、前記生物学的活性を有するポリペプチド
である、請求項1~7のいずれか一項に記載のポリペプチド。 - (a)配列番号4、11、16または18に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド;または
(b)(a)のアミノ酸配列において、1アミノ酸以上3アミノ酸以下の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を含み、前記生物学的活性を有するポリペプチド
である、請求項1~7のいずれか一項に記載のポリペプチド。 - (A)配列番号1、7、15または17に示す核酸配列を含むポリヌクレオチド;
(B)(A)に示す核酸配列において、1ヌクレオチド以上90ヌクレオチド以下の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含む核酸配列を含み、生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド;
(C)(A)に示す核酸配列と少なくとも90%以上の配列同一性を有する核酸配列を含み、生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド;
(D)(A)に示す核酸配列またはその相補的配列を含むポリヌクレオチドと、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列を含み、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド;
(E)(A)~(D)のいずれか1つの核酸配列の対立遺伝子変異体であって、生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド;または
(F)配列番号4、11、16または18に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド;
(G)(F)のアミノ酸配列において、1アミノ酸以上30アミノ酸以下の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を含み、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;または
(H)(F)に示すアミノ酸配列と少なくとも90%以上の配列同一性を有し、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(I)(F)~(H)に示す核酸配列の断片を含み、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
である、ポリヌクレオチドであって、該生物学的活性は、トランス脂肪酸含有油脂の資化に関連する能力、トランス脂肪酸含有油脂を分解する能力、および(A)に記載のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドが有する油脂分解活性と少なくとも同じ度合いの活性の少なくとも1つを含む、ポリヌクレオチドであって、
該ポリヌクレオチドは、
(1)
ATGCGTTCCAGGGTGGTGGCAGGGGCAGTGGCATGCGCGATGAGCGTCGCGCCGTTCGCGGGGACGACCGCGGTGATGACGCTCGCGACGACGCACGCGGCGATGGCGGCGACCGCGCCCGCCGACGATTACGCGACGACGCGTTATCCGATCGTCCTCGTGCACGGGCTCACGGGCACCGACAAGTACGCGGGCGTGCTCGAGTACTGGTACGGCATCCAGGAAGACCTGCAGCAGCATGGCGCGACCGTCTACGTCGCGAACCTGTCGGGCTTCCAGAGCGACGACGGCCCGAACGGGCGCGGCGAACAGTTGCTCGCGTACGTGAAGACGGTGCTTGCCGCGACGGGCGCGACCAAGGTCAATCTCGTCGGCCACAGCCAGGGCGGGCTCACGTCGCGTTACGTCGCGGCTGTCGCGCCGGATCTCGTCGCGTCGGTGACGACGATCGGCACGCCGCATCGCGGCTCCGAGTTCGCCGACTTCGTGCAGGGCGTGCTCGCATACGATCCGACCGGGCTTTCGTCATCGGTGATCGCGGCGTTCGTCAATGTGTTCGGAATCCTCACGAGCAGCAGCCACAACACGAACCAGGACGCGCTCGCGTCGCTGAAGACGCTGACGACCGCCCAGGCCGCCACGTACAACCAGAACTATCCGAGCGCGGGCCTTGGCGCGCCGGGCAGTTGCCAGACCGGCGCGCCGACGGAAACCGTCGGCGGCAACACGCATCTGCTGTATTCGTGGGCCGGCACGGCGATCCAGCCGACGCTTTCCGTGTTCGGTGTCACGGGCGCGACGGACACTAGCACGATTCCGCTCGTCGATCCGGCGAACGCGCTCGACCCGTCGACGCTTGCGCTGTTCGGCACGGGCACGGTGATGATCAACCGCGGCTCGGGCCAGAACGACGGGCTCGTGTCGAAATGCAGCGCGCTGTACGGCCAGGTGCTGAGCACGAGCTACAAGTGGAACCATATCGACGAGATCAACCAGTTGCTCGGCGTGCGCGGCGCGTTTGCGGAAGATCCGGTCGCGGTGATCCGCACGCATGCGAACCGTCTGAAGCTGGCGGGCGTGからなるポリヌクレオチド、
(2)
からなるポリヌクレオチド、
(3)
ATGGCCAGATCGATGCGTTCCAGGGTGGTGGCAGGGGCAGTGGCATGCGCGATGAGCGTCGCGCCGTTCGCGGGGACGACCGCAGTGATGACGCTTGCGACGACGCACGCAGCGATGGCGGCGACCGCGCCCGCCGACGACTACGCGACGACGCGTTATCCGATCATCCTCGTGCACGGGCTCACGGGCACCGACAAGTACGCGGGCGTGCTCGAGTACTGGTACGGCATCCAGGAAGACCTGCAGCAGCATGGCGCGACCGTCTACGTCGCGAACCTGTCGGGCTTCCAGAGCGATGACGGCCCGAACGGGCGCGGCGAACAGCTGCTCGCTTACGTGAAGACGGTGCTCGCCGCGACGGGCGCGACCAAGGTCAATCTCGTCGGTCACAGCCAGGGCGGGCTCACGTCGCGTTATGTCGCGGCCGTCGCGCCCGATCTCGTCGCGTCGGTGACGACGATCGGCACGCCGCATCGCGGCTCCGAGTTCGCCGACTTCGTGCAGAGCGTGCTCGCATACGATCCGACCGGGCTTTCGTCGTCGGTGATCGCCGCGTTCGTCAATGTGTTCGGAATCCTGACGAGCAGCAGTCACAACACGAACCAGGACGCGCTCGCGTCGCTGAAGACGCTGACGACCGCACAGGCCGCCACGTACAACCAGAACTATCCGAGCGCGGGCCTTGGCGCGCCGGGCAGTTGCCAGACCGGCGCACCGACGGAAACCGTCGGCGGCAACACGCATCTGCTGTATTCGTGGGCCGGCACGGCGATCCAGCCGACGCTCTCCGTGTTCGGTGTCACGGGTGCGACGGACACGAGCACCATTCCGCTCGTCGACCCGGCGAACGCGCTCGATCTGTCGACGCTCGCGCTGTTCGGCACGGGCACGGTGATGATCAACCGCGGTTCGGGCCAGAACGACGGGCTCGTGTCGAAGTGCAGCGCGCTGTACGGCCAGGTGCTGAGCACGAGCTACAAGTGGAACCATATCGACGAGATCAACCAGTTGCTTGGCGTGCGCGGCGCGTATGCGGAAGATCCGGTCGCGGTGATCCGCACGCATGCGAACCGGCTGAAACTGGCGGGCGTGTAATCGATGACGGCACGTGAAGGGCGCGCGCCGCGGGCGCGGCGCGCTGCGATCTACGGTGTCGCGGGGCTGGCGGCGATCGTCGGCGTCGCGATGTGGAGCGGTGCGGGATGGCATCGCGGTACGGGTAGCGCCGGCGAGTCGCCCGATGCTGCGGCGGTGGGCGGCGTGGCTGCGGCACCGCCGCGGGCCGCCGTGCCGGCGAGCGCGGGCCTGCCGTCGTCGCTGGCCGGTTCCAGCGCGCCGCGGCTGCCGCTCGATGCCGGCGGCCATCTCGCGAAGGTGCGCGCGGTACGCGATTTCTTCGATTACTGCCTGACCGCGCAGAGCGATCTCATTGCGGCCGCGCTCGATGCGCTCGTCGCGCGCGAGATTGCCGCGCAGCTCGACGGTACGGTTGCGCAGGCCGACGCGCTCGACGTGTGGCGCCGGTATCGCGCGTATCTCGACGCGCTCGCGAAACTGCGCGATGCCGGCGCGGTCGACAAGTCCGACCTGGGCGCGCTGCAGCTCGCGCTCGACCAGCGCGCGTCGATCGCGTATCGCACGCTCGGCGACTGGAGTCAGCCGTTCTTCGGCGCGGAGCAGTGGCGGCAGCGCTACGATCTCGCACGGCTGAAGATCGCGCAGGATCGCACGCTGACCGATGCGCAGAAGGCCGAACGGCTCGCGGCGCTCGAGCAGCAGATGCCGGCCGACGAACGCGCGGCGCAGCAGCGGGTCGACCGGCAGCGGGCCGCGATCGACCAGATCGCGCAGTTGCAGAAGAGCGGGGCGACGCCCGATGCGATGCGCGCGCAACTGACGCAGACGCTCGGGCCCGAGGCCGCCGCGCGCGTCGCGCAGATGCAGCAGGACGACGCATCGTGGCAGAGCCGCTACGCGGACTATGCGGCGCAGCGTGCGCAGATCGAGTCGGCCGGCCTGTCGCCGCCGGATCGCGACGCGCAGATCGCCGCCCTGCGGCAGCGCGTGTTCACGAAGCCCGGCGAAGCCGTGCGCGCGGCGTCGCTCGATCGCGGCGCGGGCAGCGCGCAGTAAからなるポリヌクレオチド、
(4)
ATGTCCTCCAGACGATTCATGACCGTCGCGGCCGCCGTGTGCGCTGCGCTGGCCATTGCCGCACCGCCGGTCAACGCCGCCGCGCCGACCGTGCCCGATCCGTTCTACACGTACACCGGCACCACGCCGCTGGCATCGGTTCCACCGGGCACGGTGCTGAAGACGCGCAACGTCACCTATCACGTGGCCGGCATTCCGACCGCCGTGACCGCGCAGCAGCTGCTGTACCGCACCAACAACGCGCAGAACCAGCCGGTTGTCAACGTGACGTCGGTGATCCGCAGCCAGGTCAGCAACGGCCAGGCCATCTCGTACCAGTCGGCCTACGATTCGCTGAACCCGTACGACGAGCCGTCGCAGGTGATCGCCGGCGACCGCGACGTGACCAAGATCATCAACATCGGCACGCTGCTCTACAGCGCGGAATCGATTCCGCTGTCGACGCTGCTGCTGCTCGGCTACAACATCATCGTGCCCGATACGGAAGGCCAGACGGCCGACTTCGCGGCCGGCCCCGAATACGGGATGACGACGCTCGATTCGATCCGCGCGGCGCTCAATACGCCGTCGACCGGCCTGAATCCGTCGAGCAAGGTCGCGATGATCGGCTACTCCGGCGGCGCGATCGCGACGAACTGGGCCGCGCAGCTCGCGCCGAGCTATGCGCCCGAGATCAACAAGCAGCTCGTTGGCGCGGCGGAGGGCGGCGTGCTGGTCGACCCGGCGCACAACCTGCGCTATGTCGACGGCAGCATCGTGTGGGGCGGCGTGGCCGCGGCCGCGCTGGCCGGGTTGTCGCGCGGCTACAACTTCGACCTGACGCCGTATCTCAGCGATACGGGCGTCGCCGTGTTCAAGGACATCCAGAACCAGTCGCTCGCGTACATCCTGCCGAAGTACACGGGTCTGCACTGGAGCACGCTGTTCAAGCCGCAATACGCGAACGACATCAACAGCATTCCGGCGTACGTGACGTATGCGAACAAGGTGAATGCGGGGCTGGCCGCGTCGCCGACGATCCCGATGTTCATCGGCCAGGGCACCGCGGGCGCGCTGGACGGCACCTTCAGCAGCCAGGTGGGCGACGGCGTGATGCTCGCGTACGACGTGCGCGCACTCGCGCAGAAGTTTTGCGCGAGCGGCACACGGGTCACGTACAACGAGTATCCGCTGGAACATGCAGGCGCGATCGTGCCGTGGGTGGCCGGGATGCTGCCCTGGCTCTACGACCGCTTCAACGGGAAAGCCGCGCCGAGCAATTGCTGGCTGACGTCGCTGCTGCCGAGCAACTCGCTGGCGCCGGAGACGCTGCACTAGからなるポリヌクレオチド、および
(5)
ATGTCCTCCAGACGTTTCATGATTGCCGCGGCCGCCGTGTCCGCCGCACTGGTCATCGCCGCACCGCCGGCCAGCGCCGGCGCGCCGACCGTGCCCGATCCGTTCTATACGTACACCGGCGCCACGCCGTTGGCATCGATTCCACCGGGCACGGTGCTGAAGACGCGCAACGTCACCTATCACGTGGCCGGCATTCCGACCGCGCTGACCGCGCAGCAGTTGCTGTACCGCACCAACAACGCGCAGAACCAGCCCGTCGTCAATGTGACGTCCGTGATCCGGAGCGCGGTCAGCAACGGACAGGCCATCTCGTACCAGTCGGCCTACGATTCGCTGAACCCGTACGACGAACCGTCGCAGGTGATCGCCGGCGACCGCGACGTCACGAAGGTCATCAACGTGGGCACGCTGCTCTACAGCGCGGAATCGATTCCGCTGTCGACACTGCTGCTGCTCGGCTACAACATCATCGTGCCCGATACGGAAGGCCAGACGGCGGACTTCGCCGCCGGCCCCGAATACGGGATGACGACGCTCGATTCGATTCGCGCGGCGCTCAACACGCCGTCGACCGGCCTGAATCCGTCGAGCAAGGTCGCGATGATCGGTTACTCCGGCGGTGCGATTGCGACGAACTGGGCCGCGCAACTCGCGCCGAGCTATGCGCCCGACATCAACAGGCAGCTCGTCGGCGCGGCGGAAGGCGGCGTGCTGGTCGATCCCGCGCACAATCTGCGCTATGTCGACGGCAGCATCGTGTGGGGCGGCGTCGCGGCAGCCGCGCTCGCCGGGCTGGCGCGCGGCTATAACTTCGACCTGACGCCCTATCTCAGCGACACCGGCGTCGCCGTGTTCAAGGACATCCAGAATCAGTCGCTCGCGTACATCCTGCCGAAGTACACGGGCCTGCATTGGGGGACGCTGTTCAAGCCGCAATACGCGAACGACATCAACAGTATTCCCGTGTATGTGACGTATGCGAACAAGGTGAATGCGGGGCTGGCCGCGTCGCCGACGATCCCGATGTATATCGGCCAGGGCACGGCGGGCGCGCTCGATGGCACCTTCAGCAGCCAGGTGGGCGACGGCGTGATGATGGCCTACGACGTGCGCGCGCTTGCGCAGAAGTTCTGCGCAAGCGGCACGCCGGTCACGTACACCGAGTATCCGCTCGAGCATGCGGGCGCGATCGTGCCCTGGGTGGCCGGCATGCTGCCGTGGCTCTACGACCGCTTCAACGGGAAAGCCGCGCCGAGCAATTGCTGGCTGACGGCGCTGCTGCCGAGCAATTCGCTGGCGCCCGAGACGCTGCACTAGからなるポリヌクレオチド
のいずれでもない、ポリヌクレオチド。 - 45~70℃が油脂を分解する能力の至適温度であるポリペプチドをコードする、請求項11に記載のポリヌクレオチド。
- 35~55℃が油脂を分解する能力の至適温度であるポリペプチドをコードする、請求項11に記載のポリヌクレオチド。
- 65℃以上において熱安定性を有するポリペプチドをコードする、請求項11または12に記載のポリヌクレオチド。
- 75℃以上において熱安定性を有するポリペプチドをコードする、請求項11または13に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドは、15℃において油脂を分解する能力を有するポリペプチドをコードする、請求項11~15のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
- ブルクホルデリア アルボリス(Burkholderia arboris)に由来するポリヌクレオチドである、請求項11~16のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項11~17のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む細胞または無細胞発現系。
- 請求項1~10のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項11~17のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む細胞もしくは無細胞発現系、または請求項18に記載の細胞もしくは無細胞発現系を含む油分解剤。
- さらなる油処理成分を含む、請求項19に記載の油分解剤。
- 前記ポリペプチドは、
(a)配列番号4、11、16または18に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド、または
(c)(a)に示すアミノ酸配列と少なくとも90%以上の配列同一性を有し、前記生物学的活性を有するポリペプチド
である、請求項19または20に記載の油分解剤。 - 前記ポリペプチドは、
(a)配列番号4、11、16または18に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド;または
(b)(a)のアミノ酸配列において、1アミノ酸以上15アミノ酸以下の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を含み、前記生物学的活性を有するポリペプチド
である、請求項19または20に記載の油分解剤。 - 前記ポリペプチドは、
(a)配列番号4、11、16または18に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド;または
(b)(a)のアミノ酸配列において、1アミノ酸以上3アミノ酸以下の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を含み、前記生物学的活性を有するポリペプチド
である、請求項19または20に記載の油分解剤。 - 請求項1~10のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項11~17のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む細胞もしくは無細胞発現系、請求項18に記載の細胞もしくは無細胞発現系、または請求項19に記載の油分解剤と、さらなる油処理成分とを備える、油分解のためのキット。
- 請求項1~10のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項11~17のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む細胞または無細胞発現系、請求項18に記載の細胞または無細胞発現系、または請求項19もしくは20に記載の油分解剤を処理対象に作用させることを包含する、油分解除去方法。
- (a)配列番号4、11、16または18に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(b)(a)のアミノ酸配列において、1アミノ酸以上30アミノ酸以下の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を含み、生物学的活性を有するポリペプチド;
(c)(a)に示すアミノ酸配列と少なくとも90%以上の配列同一性を有し、生物学的活性を有するポリペプチド;
(d)配列番号1、7、15または17に示す核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(e)(d)に示す核酸配列において、1ヌクレオチド以上90ヌクレオチド以下の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含む核酸配列によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド;
(f)(d)に示す核酸配列と少なくとも90%以上の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド;
(g)(d)に示す核酸配列またはその相補的配列を含むポリヌクレオチドと、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされ、かつ生物学的活性を有するポリペプチド;
(h)(d)~(g)のいずれか1つの核酸配列の対立遺伝子変異体によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド;または
(i)(a)~(h)に示すアミノ酸配列の断片を含み、生物学的活性を有するポリペプチド、
である、ポリペプチドであって、該生物学的活性は、トランス脂肪酸含有油脂の資化に関連する能力、トランス脂肪酸含有油脂を分解する能力、および(a)に記載のポリペプチドが有する油脂分解活性と少なくとも同じ度合いの活性の少なくとも1つを含む、ポリペプチド、または該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む細胞もしくは無細胞発現系を、処理対象に作用させることを包含する、油分解除去方法であって、該処理対象はトランス脂肪酸またはトランス脂肪酸含有油脂を含む、方法。 - 請求項1~10のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項11~17のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む細胞もしくは無細胞発現系、請求項18に記載の細胞もしくは無細胞発現系、または請求項19もしくは20に記載の油分解剤を含む洗剤。
- 脂肪改変・油脂生産技術における、請求項1~10のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項11~17のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む細胞または無細胞発現系、請求項18に記載の細胞または無細胞発現系、または請求項19もしくは20に記載の油分解剤の使用。
- 請求項1~10のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項11~17のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む細胞もしくは無細胞発現系、請求項18に記載の細胞もしくは無細胞発現系、または請求項19もしくは20に記載の油分解剤を含む化粧品。
- 請求項1~10のいずれか一項に記載のポリペプチド、または請求項11~17のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む細胞もしくは無細胞発現系、請求項18に記載の細胞もしくは無細胞発現系、または請求項19もしくは20に記載の油分解剤を含む医薬品。
- (a)配列番号4、11、16または18に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(b)(a)のアミノ酸配列において、1アミノ酸以上30アミノ酸以下の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を含み、生物学的活性を有するポリペプチド;
(c)(a)に示すアミノ酸配列と少なくとも90%以上の配列同一性を有し、生物学的活性を有するポリペプチド;
(d)配列番号1、7、15または17に示す核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(e)(d)に示す核酸配列において、1ヌクレオチド以上90ヌクレオチド以下の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含む核酸配列によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド;
(f)(d)に示す核酸配列と少なくとも90%以上の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド;
(g)(d)に示す核酸配列またはその相補的配列を含むポリヌクレオチドと、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされ、かつ生物学的活性を有するポリペプチド;
(h)(d)~(g)のいずれか1つの核酸配列の対立遺伝子変異体によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド;または
(i)(a)~(h)に示すアミノ酸配列の断片を含み、生物学的活性を有するポリペプチド、
であって、該生物学的活性は、トランス脂肪酸含有油脂の資化に関連する能力、トランス脂肪酸含有油脂を分解する能力、および(a)に記載のポリペプチドが有する油脂分解活性と少なくとも同じ度合いの活性の少なくとも1つを含む、ポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む細胞もしくは無細胞発現系を含む、トランス脂肪酸含有油脂を分解するための組成物。 - 前記ポリペプチドは、
(a)配列番号4、11、16または18に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド、または
(c)(a)に示すアミノ酸配列と少なくとも90%以上の配列同一性を有し、前記生物学的活性を有するポリペプチド
である、請求項31に記載の組成物。 - 前記ポリペプチドは、
(a)配列番号4、11、16または18に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド;または
(b)(a)のアミノ酸配列において、1アミノ酸以上15アミノ酸以下の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を含み、前記生物学的活性を有するポリペプチド
である、請求項31に記載の組成物。 - 前記ポリペプチドは、
(a)配列番号4、11、16または18に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド;または
(b)(a)のアミノ酸配列において、1アミノ酸以上3アミノ酸以下の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を含み、前記生物学的活性を有するポリペプチド
である、請求項31に記載の組成物。
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