JP7061078B2 - 耐熱性の逆転写酵素変異体 - Google Patents
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Description
(1)A54P、
(2)T287K、
(3)Q291K、
(4)T306K、
(5)D524A、
(6)D524N、
(7)H204R、M289L、T306KおよびF309N、ならびに
(8)D209P、およびI212A。
(1)A54P、
(2)T287K、
(3)Q291K、
(4)T306K、
(5)D524A、
(6)D524N、
(7)H204R、M289L、T306KおよびF309N、ならびに
(8)D209P、およびI212A。
本発明の第一の態様は、耐熱性逆転写酵素変異体、即ち耐熱性を獲得した(又は耐熱性が向上した)逆転写酵素の変異体に関するものである。該逆転写酵素変異体は、モロニーマウス白血病ウイルス由来の野生型逆転写酵素又はその変異体において、野生型逆転写酵素のループ構造部分であるアミノ酸配列の53位から56位にかけての立体構造をより安定な構造にするアミノ酸に変異させることを特徴とする。例えば、野生型アミノ酸配列の55位に相当する位置にあるスレオニンが、該逆転写酵素における本ループ構造の立体構造を安定化させるためのアミノ酸、例えば、非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸および極性の酸性官能基側鎖を有するアミノ酸からなる群から選択される他のアミノ酸に置換されていることを特徴とする。前記「非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸」とは、さらに言い換えれば、非極性で疎水性のアミノ酸であり、イソロイシン、ロイシン、バリン、グリシン、プロリン、およびアラニンが例示される。前記「極性の酸性官能基側鎖を有するアミノ酸」とは、カルボン酸基を有するアミノ酸であり、アスパラギン酸およびグルタミン酸が例示される。本発明の逆転写酵素変異体は、特に、前記アミノ酸変異が、スレオニンからグリシンまたはアスパラギン酸へのアミノ酸置換であることが好適である。
(1)A54P、
(2)T287K、
(3)Q291K、
(4)T306K、
(5)D524A、
(6)D524N、
(7)H204R、M289L、T306KおよびF309N、ならびに
(8)D209P、およびI212A。
本発明においては、耐熱性逆転写酵素変異体をコードする核酸を提供することができる。具体的には上記した本発明の逆転写酵素変異体をコードする核酸を提供する。
本発明の発現ベクターは、本発明の変異体逆転写酵素変異体をコードする核酸、および該核酸と作動可能に連結された発現調節配列を含むことが好ましい。
本発明の逆転写酵素変異体を発現するベクターで形質転換する細胞(宿主)としては、本分野において通常使用されている宿主であれば、特に限定は無い。例えば細菌(大腸菌、枯草菌等)、酵母、糸状菌、昆虫細胞、真核細胞、動物細胞(ヒト細胞を含む哺乳動物細胞等)が使用できる。
本発明の核酸の製造方法は、例えば、MMLV由来の逆転写酵素をコードする核酸において、MMLV由来の野生型逆転写酵素のアミノ酸配列の55位に相当する位置にあるスレオニンをコードするコドンを、立体構造を安定化させるアミノ酸、例えば非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸、極性の酸性官能基側鎖を有するアミノ酸、極性の塩基性官能基側鎖を有するアミノ酸、および極性の水酸基脂肪族側鎖を有するアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸をコードするコドンに置換する工程を含む。立体構造を安定化させるアミノ酸については、上記1.で説明したとおりである。特に限定はされないが、上記スレオニンに対応するコドンの置換は、非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸および極性の酸性官能基側鎖を有するアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸に対応するコドンへの置換が好適であり、グリシンまたはアスパラギン酸に対応するコドンへの置換がさらに好適である。
(1)A54P、
(2)T287K、
(3)Q291K、
(4)T306K、
(5)D524A、
(6)D524N、
(7)H204R、M289L、T306KおよびF309N、ならびに
(8)D209P、およびI212A。
本発明の逆転写酵素変異体の製造方法は、MMLV由来の野生型逆転写酵素のアミノ酸配列の55位に相当する位置にあるスレオニンを、立体構造を安定化させるアミノ酸、例えば、非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸、極性の酸性官能基側鎖を有するアミノ酸、極性の塩基性官能基側鎖を有するアミノ酸、および極性の水酸基脂肪族側鎖を有するアミノ酸からなる群から選択される他のアミノ酸に置換することを特徴とする。また、本発明の逆転写酵素の耐熱性の向上方法は、MMLV由来の野生型逆転写酵素のアミノ酸配列の55位に相当する位置にあるスレオニンを、立体構造を安定化させるアミノ酸、例えば、非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸、極性の酸性官能基側鎖を有するアミノ酸、極性の塩基性官能基側鎖を有するアミノ酸、および極性の水酸基脂肪族側鎖を有するアミノ酸からなる群から選択される他のアミノ酸に置換することを特徴とする。立体構造を安定化させるアミノ酸については、上記1.で説明したとおりである。好ましくは、上記55位のアミノ酸置換は、非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸および極性の酸性官能基側鎖を有するアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸への置換であり、さらに好ましくは、グリシンまたはアスパラギン酸への置換である。
(1)A54P、
(2)T287K、
(3)Q291K、
(4)T306K、
(5)D524A、
(6)D524N、
(7)H204R、M289L、T306KおよびF309N、ならびに
(8)D209P、およびI212A。
本発明の逆転写酵素変異体は、RNAに相補的なDNAを合成する工程を包含する、cDNAの合成に使用することができる。本発明の逆転写酵素変異体は、耐熱性を有するので、野生型MMLV逆転写酵素より高温で逆転写反応を行うことができる。さらに、本発明の逆転写酵素変異体は、従来の耐熱性逆転写酵素よりも向上した耐熱性を有するので、従来の耐熱性逆転写酵素と比較してさらに高温条件下で逆転写反応を行うことができる。従って、これまで既存の耐熱性逆転写酵素を用いて40℃、45℃、50℃、または55℃でcDNAを合成していたのに対し、本発明の逆転写酵素変異体を用いれば、40℃以上、45℃以上、50℃以上、55℃以上、60℃以上、または70℃以上という、これまでに想定されていなかった高温条件下にて逆転写反応を行うことが可能である。これにより、今までの温度条件ではなし得なかったmRNAの高次構造破壊を達成することができ、その結果としてmRNA全長のcDNA合成が容易となる。
本発明の組成物は、逆転写反応用組成物である。本発明の組成物は、本発明の逆転写酵素変異体に加え、逆転写反応に必要な成分、例えば、二価金属塩、dNTPs、緩衝成分、還元剤、滅菌水等を含有する。本発明の組成物は、プライマーをさらに含んでいてもよい。本発明のキットは、逆転写反応用キットである。本発明のキットとしては、本発明の逆転写酵素変異体、二価金属塩、dNTP、緩衝成分、還元剤などを含有し、使用時にこれらを混合して逆転写反応液を調製するためのキット、前記の本発明の組成物を含有し、使用時に鋳型DNAと水(滅菌水等)を添加するのみで使用可能なキット、さらに前記の本発明の組成物が乾燥状態で含有されたキット、等が例示される。特定のRNAの検出を目的とした、標的RNAに特異的なプライマーや陽性コントロール用のRNAを含有するキットも本発明に包含される。なお、上記二価金属塩、dNTPs、緩衝成分、および還元剤は、上記7.で説明したとおりである。
(1)逆転写酵素変異体の調製A
Molony Murine Leukemia Virus由来の野生型逆転写酵素をコードする遺伝子の塩基配列は、Genbank Acc. No. AF033811.1に開示されている。本明細書では、その塩基配列をもとに特定の部位に変異を導入した人工遺伝子を常法により調製した。得られた人工遺伝子は、In-Fusion(登録商標)HD Cloning Kit(タカラバイオUSA社製)を用いて、プラスミドpET6xHN-C(タカラバイオUSA社製)に導入した。得られたプラスミドは、C末端側にヒスチジンタグが付加された逆転写酵素変異体をコードする塩基配列を有している。
上記(1)で得られた逆転写酵素変異体について、以下の方法で耐熱性を試験した。即ち、当該逆転写酵素変異体溶液について、最終濃度が0.25%のウシ血清アルブミン(宝生物工程社製)を含む希釈Buffer(50mM Tris・HCl pH8.3、2mM DTT、0.1%NP-40及び10%グリセロール)で2倍希釈した。当該希釈液を未加熱処理、あるいは44℃又は50℃で15分間の加熱処理に供した。その後、未加熱処理、あるいは熱処理後の希釈液を前記希釈Bufferでさらに5倍希釈したのち、逆転写酵素活性を測定した。
(1)逆転写酵素変異体の調製B
菌体処理方法を超音波処理からリゾチームによる溶菌処理へ変更した点を除き、実験方法1(1)と同じ調製方法で、逆転写酵素変異体を調製した。
上記(1)で得られた逆転写酵素変異体について、耐熱性を試験した。なお、加熱処理温度を55℃、60℃、65℃、および70℃へ変更した点を除き、実験方法1(2)と同じ試験方法である。
(1)MMLV逆転写酵素変異体O1~O3およびP12、P13の調製(T55G、T55A、T55S、T55D、T55K)
実験方法1(1)にしたがって、MMLV逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、55位のスレオニンをグリシンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法1(1)にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該55位にスレオニンからグリシンへの置換変異を有する逆転写酵素変異体をO1と命名した。また、55位のスレオニンをアラニンに置き換えた逆転写酵素変異体、55位のスレオニンをセリンに置き換えた逆転写酵素変異体をそれぞれO2及びO3と命名した。さらに、55位のスレオニンをアスパラギン酸に置き換えた逆転写酵素変異体、55位のスレオニンをリシンに置き換えた逆転写酵素変異体をそれぞれP12及びP13と命名した。これらのタンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号21~26に示す。
実験方法1(1)にしたがって、MMLV逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、55位のスレオニンをグリシンに置き換え、同時に54位のアラニンをプロリンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法1(1)にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該54位と55位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をC3と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号4及び14に示す。
実験方法1(1)にしたがって、MMLV逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、287位のスレオニンをリシンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法1(1)にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該287位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をD1と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号27および33に示す。
実験方法1(1)にしたがって、MMLV逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、55位のスレオニンをグリシン及び287位のスレオニンをリシンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法1(1)にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該55位及び287位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をO1+D1と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号5および15に示す。
実験方法1(1)にしたがって、MMLV逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、55位のスレオニンをグリシン、54位のアラニンをプロリン及び287位のスレオニンをリシンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法1(1)にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該55位、54位及び287位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をC3+D1と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号39および45に示す。
実験方法1(1)にしたがって、MMLV逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、204位のヒスチジンをアルギニン、289位のメチオニンをロイシン、306位のスレオニンをリシン、さらに309位のフェニルアラニンをアスパラギンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法1(1)にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該204位、289位、306位及び309位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をLTと命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号32および38に示す。
実験方法1(1)にしたがって、MMLV逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、55位のスレオニンをグリシン、204位のヒスチジンをアルギニン、289位のメチオニンをロイシン、306位のスレオニンをリシン、さらに309位のフェニルアラニンをアスパラギンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法1(1)にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該55位、204位、289位、306位及び309位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をO1+LTと命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号10および20に示す。
実験方法1(1)にしたがって、MMLV逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、54位のアラニンをプロリン、55位のスレオニンをグリシン、204位のヒスチジンをアルギニン、289位のメチオニンをロイシン、306位のスレオニンをリシン、さらに309位のフェニルアラニンをアスパラギンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法1(1)にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該54位、55位、204位、289位、306位及び309位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をC3+LTと命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号44および50に示す。
MMLV逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、291位のグルタミンをリシンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法1(1)にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該291位に変異を有する逆転写酵素変異体をK1と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列表の配列番号28および34に示す。
実験方法1(1)にしたがって、MMLV逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、55位のスレオニンをグリシン及び291位のグルタミンをリシンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法1(1)にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該55位及び291位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をO1+K1と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号6および16に示す。
実験方法1(1)にしたがって、MMLV逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、54位のアラニンをプロリン、55位のスレオニンをグリシン及び291位のグルタミンをリシンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法1(1)にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該54位、55位及び291位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をC3+K1と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号40および46に示す。
実験方法1(1)にしたがって、MMLV逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、524位のアスパラギン酸をアスパラギンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法1(1)にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該524位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をK2と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号31および37に示す。
実験方法1(1)にしたがって、MMLV逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、55位のスレオニンをグリシン及び524位のアスパラギン酸をアスパラギンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法1(1)にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該55位及び524位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をO1+K2と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号9および19に示す。
実験方法1(1)にしたがって、MMLV逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、54位のアラニンをプロリン、55位のスレオニンをグリシン及び524位のアスパラギン酸をアスパラギンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法1(1)にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該54位、55位及び524位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をC3+K2と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号43および49に示す。
実験方法1(1)にしたがって、MMLV逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、524位のアスパラギン酸をアラニンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法1(1)にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該524位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をK3と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号30および36に示す。
実験方法1(1)にしたがって、MMLV逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、55位のスレオニンをグリシン及び524位のアスパラギン酸をアラニンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法1(1)にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該55位及び524位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をO1+K3と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号8および18に示す。
実験方法1(1)にしたがって、MMLV逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、54位のアラニンをプロリン、55位のスレオニンをグリシン及び524位のアスパラギン酸をアラニンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法1(1)にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該54位、55位及び524位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をC3+K3と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号42および48に示す。
実験方法1(1)にしたがって、MMLV逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、306位のスレオニンをリシンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法1(1)にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該306位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をK4と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号29および35に示す。
実験方法1(1)にしたがって、MMLV逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、55位のスレオニンをグリシン及び306位のスレオニンをリシンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法1(1)にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該55位及び306位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をO1+K4と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号7および17に示す。
実験方法1(1)にしたがって、MMLV逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、54位のアラニンをプロリン、55位のスレオニンをグリシン及び306位のスレオニンをリシンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法1(1)にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該54位、55位及び306位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をC3+K4と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号41および47に示す。
実験方法1(1)にしたがって、MMLV逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、209位のアスパラギン酸をプロリン及び212位のイソロイシンをアラニンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法1(1)にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該209位及び212位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をC5と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号51および53に示す。
実験方法1(1)にしたがって、MMLV逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、54位のアラニンをプロリン、55位のスレオニンをグリシン、209位のアスパラギン酸をプロリン及び212位のイソロイシンをアラニンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法1(1)にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該54位、55位、209位及び212位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をC3+C5と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号52および54に示す。
実施例1(1)で調製した逆転写酵素変異体及び野生型逆転写酵素について、実験方法1(2)にしたがって耐熱性評価試験を行った。その結果を表1に示す。
本発明のアミノ酸置換と耐熱性に関与していると報告されている既知の変異、あるいは本研究で初めて耐熱性への関与が確認できた変異との組み合わせについて検討した。即ち、実施例1(3)と(5)、(6)と(8)、(9)と(11)、(12)と(14)、(15)と(17)、(18)と(20)、(21)と(22)で調製した逆転写酵素変異体について、実験方法1(2)にしたがって耐熱性評価試験を行った。その結果を表2に示す。
本発明のアミノ酸置換と耐熱性に関与していると報告されている既知の変異、あるいは本研究で初めて耐熱性との関与が確認できた変異との組み合わせについてさらに検討した。即ち、実施例1(9)と(10)、(15)と(16)並びに(18)と(19)で調製した逆転写酵素変異体について、実験方法1(2)にしたがって耐熱性評価試験を行った。
(1)MMLV逆転写酵素変異体P12+D1の調製(T55D+T287K)
実験方法2(1)にしたがって、MMLV逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、55位のスレオニンをアスパラギン酸および287位のスレオニンをリシンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法2(1)にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該55位および287位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をP12+D1と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号55および63に示す。
実験方法2(1)にしたがって、MMLV逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、55位のスレオニンをアスパラギン酸、204位のヒスチジンをアルギニン、289位のメチオニンをロイシン、306位のスレオニンをリシン、さらに309位のフェニルアラニンをアスパラギンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法2(1)にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該55位、204位、289位、306位、および309位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をP12+LTと命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号56および64に示す。
実験方法2(1)にしたがって、MMLV逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、55位のスレオニンをアスパラギン酸および291位のグルタミンをリシンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法2(1)にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該55位および291位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をP12+K1と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号57および65に示す。
実験方法2(1)にしたがって、MMLV逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、55位のスレオニンをアスパラギン酸および524位のアスパラギン酸をアスパラギンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法2(1)にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該55位および524位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をP12+K2と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号58および66に示す。
実験方法2(1)にしたがって、MMLV逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、55位のスレオニンをアスパラギン酸および524位のアスパラギン酸をアラニンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法2(1)にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該55位および524位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をP12+K3と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号59および67に示す。
実験方法2(1)にしたがって、MMLV逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、55位のスレオニンをアスパラギン酸および306位のスレオニンをリシンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法2(1)にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該55位および306位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をP12+K4と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号60および68に示す。
実験方法2(1)にしたがって、MMLV逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、55位のスレオニンをグリシン、209位のアスパラギン酸をプロリンおよび212位のイソロイシンをアラニンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法2(1)にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該55位、209位および212位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をO1+C5と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号61および69に示す。
実験方法2(1)にしたがって、MMLV逆転写酵素の野生型アミノ酸配列において、55位のスレオニンをアスパラギン酸、209位のアスパラギン酸をプロリンおよび212位のイソロイシンをアラニンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子は、実験方法2(1)にしたがってタンパク発現ならびに精製を行った。本明細書において、当該55位、209位および212位の置換変異を有する逆転写酵素変異体をP12+C5と命名した。当該タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号62および70に示す。
本発明のアミノ酸置換と、耐熱性に関与していると報告されている既知の変異あるいは本研究で初めて耐熱性への関与が確認できた変異との組み合わせについて検討した。すなわち、実施例1(3)、実施例1(4)と実施例5(1);実施例1(6)、実施例1(7)と実施例5(2);実施例1(9)、実施例1(10)と実施例5(3);実施例1(12)、実施例1(13)と実施例5(4);実施例1(15)、実施例1(16)と実施例5(5);実施例1(18)、実施例1(19)と実施例5(6);実施例1(21)と実施例5(7)、実施例1(22)と実施例5(8)で調製した逆転写酵素変異体について、実験方法2(2)にしたがって耐熱性評価試験を行った。その結果を表3および表4に示す。
また、本願で初めて耐熱性に関与していることが確認できた変異K1と本発明のO1、P12アミノ酸置換を組み合わせについて検討したところ、前記変異の組み合わせでも55℃15分の加熱処理における残存活性が3.0~8.4倍と大幅に向上していることが確認できた。
以上のことから、本発明は、耐熱性の向上した逆転写酵素変異体の耐熱性をさらに向上させることができることを確認した。
以上のことから、本発明は、耐熱性の向上した逆転写酵素変異体の耐熱性をさらに向上させることができることを確認した。
本発明のアミノ酸置換と、耐熱性に関与していると報告されている既知の変異あるいは本研究で初めて耐熱性への関与が確認できた変異との組み合わせについて検討した。すなわち、実施例1(7)と実施例5(2)で調製した逆転写酵素変異体について、実験方法2(2)にしたがって耐熱性評価試験を行った。
以上のことから、本発明は、耐熱性の向上した逆転写酵素変異体の耐熱性をさらに向上させることができることを確認した。
SEQ ID NO: 2: Reverse transcriptase mutant O1(T55G) amino acid sequence
SEQ ID NO: 3: Reverse transcriptase mutant P12(T55D) amino acid sequence
SEQ ID NO: 4: Reverse transcriptase mutant C3(T55G+A54P) amino acid sequence
SEQ ID NO: 5: Reverse transcriptase mutant O1+D1(T55G+T287K) amino acid sequence
SEQ ID NO: 6: Reverse transcriptase mutant O1+K1(T55G+Q291K) amino acid sequence
SEQ ID NO: 7: Reverse transcriptase mutant O1+K4 (T55G+T306K) amino acid sequence
SEQ ID NO: 8: Reverse transcriptase mutant O1+K3 (T55G+D524A) amino acid sequence
SEQ ID NO: 9: Reverse transcriptase mutant O1+K2 (T55G+D524N) amino acid sequence
SEQ ID NO: 10: Reverse transcriptase mutant O1+LT (T55G+H204R +M289L+T306K+F309N) amino acid sequence
SEQ ID NO: 11: Molony Murine Leukemia Virus reverse transcriptase nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 12: Reverse transcriptase mutant O1(T55G) nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 13: Reverse transcriptase mutant P12(T55D) nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 14: Reverse transcriptase mutant C3(T55G+A54P) nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 15: Reverse transcriptase mutant O1+D1(T55G+T287K) nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 16: Reverse transcriptase mutant O1+K1(T55G+Q291K) nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 17: Reverse transcriptase mutant O1+K4 (T55G+T306K) nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 18: Reverse transcriptase mutant O1+K3 (T55G+D524A) nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 19: Reverse transcriptase mutant O1+K2 (T55G+D524N) nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 20: Reverse transcriptase mutant O1+LT (T55G+H204R+M289L+T306K+F309N) nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 21: Reverse transcriptase mutant O2(T55A) amino acid sequence
SEQ ID NO: 22: Reverse transcriptase mutant O3(T55S) amino acid sequence
SEQ ID NO: 23: Reverse transcriptase mutant P13(T55K) amino acid sequence
SEQ ID NO: 24: Reverse transcriptase mutant O2(T55A) nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 25: Reverse transcriptase mutant O3(T55S) nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 26: Reverse transcriptase mutant P13(T55K) nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 27: Reverse transcriptase mutant D1(T287K) amino acid sequence
SEQ ID NO: 28: Reverse transcriptase mutant K1(Q291K) amino acid sequence
SEQ ID NO: 29: Reverse transcriptase mutant K4(T306K) amino acid sequence
SEQ ID NO: 30: Reverse transcriptase mutant K3(D524A) amino acid sequence
SEQ ID NO: 31: Reverse transcriptase mutant K2(D524N) amino acid sequence
SEQ ID NO: 32: Reverse transcriptase mutant LT(H204R+M289L+T306K+F309N) amino acid sequence
SEQ ID NO: 33: Reverse transcriptase mutant D1(T287K) nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 34: Reverse transcriptase mutant K1(Q291K) nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 35: Reverse transcriptase mutant K4(T306K) nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 36: Reverse transcriptase mutant K3(D524A) nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 37: Reverse transcriptase mutant K2(D524N) nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 38: Reverse transcriptase mutant LT(H204R+M289L+T306K+F309N) nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 39: Reverse transcriptase mutant C3+D1 amino acid sequence
SEQ ID NO: 40: Reverse transcriptase mutant C3+K1 amino acid sequence
SEQ ID NO: 41: Reverse transcriptase mutant C3+K4 amino acid sequence
SEQ ID NO: 42: Reverse transcriptase mutant C3+K3 amino acid sequence
SEQ ID NO: 43: Reverse transcriptase mutant C3+K2 amino acid sequence
SEQ ID NO: 44: Reverse transcriptase mutant C3+LT amino acid sequence
SEQ ID NO: 45: Reverse transcriptase mutant C3+D1 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 46: Reverse transcriptase mutant C3+K1 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 47: Reverse transcriptase mutant C3+K4 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 48: Reverse transcriptase mutant C3+K3 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 49: Reverse transcriptase mutant C3+K2 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 50: Reverse transcriptase mutant C3+LT nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 51: Reverse transcriptase mutant C5(D209P+I212A) amino acid sequence
SEQ ID NO: 52: Reverse transcriptase mutant C3+C5 amino acid sequence
SEQ ID NO: 53: Reverse transcriptase mutant C5 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 54: Reverse transcriptase mutant C3+C5 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 55: Reverse transcriptase mutant P12+D1 amino acid sequence
SEQ ID NO: 56: Reverse transcriptase mutant P12+LT amino acid sequence
SEQ ID NO: 57: Reverse transcriptase mutant P12+K1 amino acid sequence
SEQ ID NO: 58: Reverse transcriptase mutant P12+K2 amino acid sequence
SEQ ID NO: 59: Reverse transcriptase mutant P12+K3 amino acid sequence
SEQ ID NO: 60: Reverse transcriptase mutant P12+K4 amino acid sequence
SEQ ID NO: 61: Reverse transcriptase mutant O1+C5 amino acid sequence
SEQ ID NO: 62: Reverse transcriptase mutant P12+C5 amino acid sequence
SEQ ID NO: 63: Reverse transcriptase mutant P12+D1 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 64: Reverse transcriptase mutant P12+LT nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 65: Reverse transcriptase mutant P12+K1 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 66: Reverse transcriptase mutant P12+K2 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 67: Reverse transcriptase mutant P12+K3 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 68: Reverse transcriptase mutant P12+K4 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 69: Reverse transcriptase mutant O1+C5 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 70: Reverse transcriptase mutant P12+C5 nucleic acid sequence
Claims (16)
- モロニーマウス白血病ウイルス(MMLV)由来の野生型逆転写酵素の配列番号1で示されるアミノ酸配列において、開始コドンによってコードされるメチオニンを数えない番号での55位に相当する位置にアミノ酸変異を含む逆転写酵素変異体であって、該アミノ酸変異がスレオニンから、グリシン、アスパラギン酸、リシン、およびセリンからなる群から選択されるアミノ酸への置換であり、配列番号1で示されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有し、前記野生型逆転写酵素と比較して耐熱性が向上した逆転写活性を有することを特徴とする、MMLV由来の逆転写酵素変異体。
- さらに下記(1)~(8)からなる群から選択される1以上のアミノ酸置換を含む、請求項1に記載の逆転写酵素変異体:
(1)A54P、
(2)T287K、
(3)Q291K、
(4)T306K、
(5)D524A、
(6)D524N、
(7)H204R、M289L、T306KおよびF309N、ならびに
(8)D209P、およびI212A。 - リボヌクレアーゼH活性を欠損している、請求項1又は2に記載の逆転写酵素変異体。
- 請求項1~3いずれか1項に記載の逆転写酵素変異体をコードする核酸。
- 請求項4記載の核酸および発現調節配列を含む発現ベクター。
- 請求項5記載の発現ベクターで形質転換された、逆転写酵素変異体を発現する細胞。
- MMLV由来の逆転写酵素をコードする配列番号11で示される核酸において、MMLV由来の野生型逆転写酵素の配列番号1で示されるアミノ酸配列における、開始コドンによってコードされるメチオニンを数えない番号での55位に相当する位置にあるスレオニンをコードするコドンを、グリシン、アスパラギン酸、リシン、およびセリンからなる群から選択されるアミノ酸をコードするコドンに置換する工程を包含する、MMLV由来の逆転写酵素変異体をコードする核酸の製造方法。
- MMLV由来の逆転写酵素をコードする核酸が、MMLV由来の野生型逆転写酵素又は該酵素の変異体タンパク質をコードする核酸である、請求項7記載の方法。
- MMLV由来の逆転写酵素をコードする核酸が、下記(1)~(8)からなる群から選択される1以上のアミノ酸置換を含む逆転写酵素変異体をコードする核酸である、請求項8に記載の方法:
(1)A54P、
(2)T287K、
(3)Q291K、
(4)T306K、
(5)D524A、
(6)D524N、
(7)H204R、M289L、T306KおよびF309N、ならびに
(8)D209P、およびI212A。 - MMLV由来の野生型逆転写酵素の配列番号1で示されるアミノ酸配列において、開始コドンによってコードされるメチオニンを数えない番号での55位に相当する位置にあるスレオニンを、グリシン、アスパラギン酸、リシン、およびセリンからなる群から選択されるアミノ酸に置換することを特徴とする、MMLV由来の耐熱性逆転写酵素変異体の製造方法。
- 請求項1~3いずれか1項に記載の逆転写酵素変異体を使用して、鋳型となるRNAに相補的なDNAを合成する工程を包含する、cDNAの合成方法。
- さらにcDNAを増幅する工程を包含する、請求項11記載の方法。
- cDNAの増幅が等温増幅反応またはPCRで実施される、請求項12記載の方法。
- 請求項1~3いずれか1項に記載の逆転写酵素変異体を含む組成物。
- 請求項1~3いずれか1項に記載の逆転写酵素変異体を含むキット。
- MMLV由来の逆転写酵素をコードする配列番号11で示される核酸において、MMLV由来の野生型逆転写酵素の配列番号1で示されるアミノ酸配列における、開始コドンによってコードされるメチオニンを数えない番号での55位に相当する位置にあるスレオニンをコードするコドンを、グリシン、アスパラギン酸、リシン、およびセリンからなる群から選択されるアミノ酸をコードするコドンに置換することを特徴とする、MMLV由来の逆転写酵素の耐熱性向上方法。
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