JP4808361B2 - 新規dna合成酵素 - Google Patents
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Description
本発明は、遺伝子操作用試薬として有用な新規なタンパク質、及び該タンパク質を製造する方法に関する。
背景技術
鋳型DNAの塩基配列に従って、その相補的な配列を有するDNA鎖を合成することができるDNAポリメラーゼは、PCR(ポリメラーゼ チェイン リアクション)、DNAの塩基配列決定、部位特異的変異導入法などをはじめとする遺伝子操作実験に必要不可欠の試薬として、日常的に利用されている。分子医学、分子生物学、生化学の発展のために果たしてきたこの酵素の貢献度は、計り知れないものがある。
DNAポリメラーゼと称されるこの酵素について詳細にみると、各酵素によって生化学的性質は異なり、現在までに多くの種類のDNAポリメラーゼが商品として市場に出回っている。それぞれの酵素は、熱安定性や、合成鎖伸長能、ミス合成の校正能、鋳型DNAの好みなどの性質が異なり、実験目的によって使い分けられている。
しかしながら、これらの酵素で、全ての実験目的が十分に満足に達成されることはなく、さらに各目的に、より優れた新規DNAポリメラーゼの開発が期待されている。また、DNAポリメラーゼの基本的な性質として、そのDNA鎖合成反応には、プライマーと呼ばれる短鎖のヌクレオチドが必要であるため、PCRには増幅する遺伝子領域に特異的な一組のプライマーが必須であり、実験毎にそれぞれ目的の遺伝子領域を増幅するためのプライマーを用意しておき、反応液に加える必要がある。
発明の開示
本発明の目的は、新規DNA合成酵素遺伝子を特定し、新たな生化学的性質を有する新規DNA合成酵素を遺伝子操作用試薬として提供することにある。
本発明は、DNAプライマーゼ活性及びDNAポリメラーゼ活性を有するタンパク質に関する。
本明細書において「DNAプライマーゼ活性」とは、鋳型となるDNA鎖と基質となりうるデオキシヌクレオチド3リン酸が存在する場合、それらの基質を用いて鋳型鎖に依存してDNA鎖を合成することができる能力を言う。また、「DNAポリメラーゼ活性」とは、鋳型となるDNA鎖に相補的なオリゴデオキシヌクレオチド(プライマー)が結合した鋳型−プライマーと基質となりうるデオキシヌクレオチド3リン酸が存在する場合、それらの基質を用いて鋳型鎖に依存してプライマーの3’末端からDNA鎖を合成することができる能力を言う。DNAプライマーゼ活性及びDNAポリメラーゼ活性の両方を有するタンパク質が初めて見出された。
このタンパク質は、哺乳動物を含む真核生物又は古細菌、真正細菌を含む原核生物に由来し得るが、好ましい態様において、該タンパク質は古細菌に由来し、耐熱性である。本明細書で「耐熱性」タンパク質とは50℃以上の温度において上記活性を保持するタンパク質を言う。
1態様において該タンパク質は配列番号1で示すアミノ酸配列を含む。1態様において該タンパク質は、配列番号1で示すアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するものでもよい。
本明細書でこれらのタンパク質を「タンパク質1」と呼ぶことがある。
本発明は、上記タンパク質と複合体を形成してそのDNAプライマーゼ活性及び/又はDNAポリメラーゼ活性を増強し得るタンパク質にも関する。このタンパク質は、哺乳動物を含む真核生物又は古細菌、真正細菌を含む原核生物に由来し得るが、好ましい態様において、該タンパク質は古細菌に由来し、耐熱性である。1態様においてこのタンパク質は配列番号2で示すアミノ酸配列を含む。このタンパク質は、配列番号2で示すアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有してもよい。
本明細書でこれらのタンパク質を「タンパク質2」と呼ぶことがある。
発明を実施するための最良の形態
本発明者らは、遺伝子工学用試薬として優れた性質を有するDNA合成酵素の単離を目指し、特に熱安定性を期待して、超好熱性古細菌をスクリーニングしてきた。超好熱性好気性古細菌として単離同定された、ピロコッカス フリオサス(Pyrococcus furiosus)のゲノム配列中には、真核生物にみられる、DNAプライマーゼに類似した配列をコードしうる遺伝子が存在する。また、この遺伝子の領域を調べてみると、そのすぐ隣にもう一つの遺伝子が存在し、オペロンを構成していると予想された。そこで本発明者らは、これらの遺伝子をクローニングし(配列番号3及び4)、コードされているタンパク質を製造、精製して、その生化学的性質を調べた。精製されたタンパク質をそれぞれ、p41(配列番号1)及びp46(配列番号2)と名付けた。
p41は試験管内反応において、DNAプライマー合成活性が検出された。さらに、予想に反して、p41タンパク質は、従来のDNAポリメラーゼに匹敵するような、強いプライマー伸長活性を有していた。これらの活性は極めて熱安定性に優れ、遺伝子増幅用酵素として利用されうるべく、大きな可能性を有している。特に特筆すべきことは、プライマーを必要としないDNA鎖合成活性を有している点である。則ち、現在のPCR技術では、目的の遺伝子領域を増幅するために、各々の領域に特異的なプライマーを調製して、反応液に加える必要があるが、本発明の酵素にはプライマーを必要としないDNA合成活性が存在するため、新規な遺伝子増幅技術を提供できる。このようなDNAプライマーゼ活性及びDNAポリメラーゼを有するタンパク質については、ピロコッカス フリオサス以外に同じく超高熱性古細菌アエロピルム ペルニクス(Aeropyrum pernix)由来のタンパク質も同様の性質を有することを本発明者は見出している。
次に、p46は単独ではDNA鎖合成活性が認められなかった。しかしp41と安定な複合体を形成し、DNAに対する親和性の向上に貢献することがわかった。またp41−p46複合体は、p41単独に比べて、プライマー非依存的なDNA合成活性が遥かに強く、また非常に効率は低いものの、RNAプライマーをも合成できることがわかった。
従って、本発明は、デオキシヌクレオチド3リン酸の重合方法であって、
1)鋳型となるDNA鎖及び基質となるデオキシヌクレオチド3リン酸を供し、
2)タンパク質1を加えてデオキシヌクレオチド3リン酸を重合させる、
ことを含む方法にも関する。この重合方法において、タンパク質1の外にタンパク質2を加えてもよい。タンパク質2はタンパク質1のDNAプライマーゼ活性を増強し得る。
本発明はまた、デオキシヌクレオチド3リン酸の重合方法であって、
1)鋳型となるDNA鎖及び基質となるデオキシヌクレオチド3リン酸を供し、
2)鋳型となるDNA鎖に相補的なオリゴデオキシヌクレオチド(プライマー)を加えてDNA鎖と複合体を形成させ、
3)タンパク質1を加えてデオキシヌクレオチド3リン酸を重合させる、
ことを含む方法にも関する。この重合方法において、タンパク質1の外にタンパク質2を加えてもよい。タンパク質2はタンパク質1のDNAポリメラーゼ活性を増強し得る。
以上のように、これまでに知られていない、DNAプライマーゼ活性及びDNAポリメラーゼ活性を同時に有するタンパク質と該タンパク質の活性を増強するタンパク質を同定した。これらのタンパク質は、DNA合成反応を利用した新規な遺伝子工学的方法において利用できる。
本発明のタンパク質1又は2は、以下の組換えDNA法により製造することができる。
1)タンパク質1又は2をコードする塩基配列を調製し、
2)該塩基配列を発現ベクターに挿入し、
3)該ベクターで宿主細胞を形質転換し、
4)該形質転換体を培養し、
5)該培養物から所望のタンパク質を単離する。
タンパク質1をコードする塩基配列としては、例えば配列番号3に示すものを用いることができる。遺伝暗号の縮重により他の多くの塩基配列も用いることができることは周知である。
タンパク質2をコードする塩基配列としては、例えば配列番号4に示すものを用いることができる。遺伝暗号の縮重により他の多くの塩基配列も用いることができることは周知である。
発現されたタンパク質の精製を容易にする等の目的で、本発明のタンパク質を他のタンパク質又はペプチドとの融合タンパク質として発現させることもできる。その場合には、本発明のタンパク質をコードする塩基配列に当該他のタンパク質又はペプチドをコードする塩基配列を適当な方法で結合しておく。
本発明は、本発明のタンパク質をコードする塩基配列を有する、ベクター、特にプラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ、遺伝子操作で従来用いられる他のベクターにも関する。当業者に周知の方法を用いて様々なプラスミド及びベクターを構築することができる(例えばSambrook,Molecular Cloning A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(1989)及びAusbel,Current Protocols in Molecular Biology,Green Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y.(1994)に記載の技術を参照)。本発明に従い、好ましく用いられるプラスミド及びベクターには当業者に周知のものが含まれる。
好ましい態様では、ベクター中に存在する本発明のタンパク質をコードするDNA配列に、原核又は真核細胞中で遺伝子の発現をさせるのに必要なコントロール配列を作動可能に結合する。
「コントロール配列」という用語は、それらが結合するコード配列を発現させるのに必要な制御DNA配列を言う。そのようなコントロール配列の性質は、宿主生物により変わる。原核生物では、コントロール配列は一般にプロモーター、リボソーム結合部位及びターミネーターを含む。真核生物ではコントロール配列は一般にプロモーター、ターミネーター及びある場合にはトランスアクチベーター又は転写因子を含む。「コントロール配列」という用語は最小でもその存在が発現に必要であるすべての成分を含むことを意図し、更なる有用な成分をも含んでもよい。
「作動可能に結合した」という用語は、該成分がそれらの意図された方法で作用することを可能にする関係にある位置を言う。コード配列に「作動可能に結合した」コントロール配列は、コード配列の発現がコントロール配列と適合する条件下で達成されるような方法で結合される。コントロール配列がプロモーターである場合には、2本鎖核酸が好ましく用いられることは当業者に自明である。
従って本発明のベクターは発現ベクターである。「発現ベクター」は、選択した宿主細胞を形質転換し、選択した宿主細胞中でコード配列を発現させることができる構築物である。発現ベクターは例えばクローニングベクター、バイナリーベクター又はインテグレイティングベクターであり得る。発現は好ましくは翻訳可能なmRNAへの核酸分子の転写を含む。
原核及び/又は真核細胞中での発現を確実にする調節要素は当業者に周知である。真核細胞の場合、それらは通常転写の開始を確実にするプロモーター及び場合により、転写の終了及び転写物の安定化を保証するポリAシグナルを通常含む。一般的に用いられるプロモーターは、ポリュビキチンプロモーター、及びアクチンプロモーターである。更なる調節要素は転写及び翻訳エンハンサーを含みうる。原核宿主細胞で発現を可能にする可能な調節要素の例はE.coliにおけるPL、lac、trp又はtacプロモーターであり、真核宿主細胞で発現を可能にする調節要素の例は酵母におけるAOX1又はGAL1プロモーター。哺乳動物及び他の動物細胞におけるCMV−、SV40−,RSV−プロモーター(ラウス肉腫ウイルス)、CMVエンハンサー、SV40エンハンサー又はグロビンイントロンを含む。Okayama−Bergの発現ベクターpcDV1(Pharmacia)、pCDM8,pRc/CMV、pcDNA1,pcDNA3(In−vitorogen)、pSPORT1(GIBCO BRL)等の適当な発現ベクターが当業者に知られている。
有利には本発明の上記ベクターは選択可能なマーカーを含む。
本発明はさらに核酸配列が宿主細胞において外来である、上記のベクターを含む宿主細胞に関する。
「外来」とは核酸分子が宿主細胞に関して異種であるか(これは異なった遺伝的背景を有する細胞又は生物に由来することを意味する)、或いは宿主細胞に関してはホモロガスであるが、該核酸分子の天然に存在する対応物と異なる遺伝的環境にあることを意味する。これは、核酸分子が宿主細胞に関してホモロガスであるなら、それは該宿主細胞の遺伝子の天然の位置にはないこと、特に異なる遺伝子に取り囲まれていることを意味する。この場合、核酸分子はそれ自身のプロモーターの支配下にあるか、又はヘテロロガスなプロモーターの支配下にあってもよい。宿主細胞中に存在する本発明によるベクター又はプロモーターは宿主細胞のゲノムに組み込まれていてもよく、染色体外にある形で保持されていてもよい。
従って、本発明は本発明のベクター又は遺伝子を含む宿主細胞に関する。宿主細胞は真正細菌、古細菌、昆虫、菌類、植物、又は動物細胞等のいずれかの原核生物又は真核生物細胞でありうる。好ましい菌類細胞は、例えばSaccharomycess属の細胞、特にSaccharomycess cerevisiaeの細胞である。
「原核生物」と言う用語は、本発明のタンパク質の発現のためにDNA又はRNAで形質転換又はトランスフェクトされ得るすべての細菌を含むことを意図する。原核宿主は、例えばE.coli、S.typhimurium、Serratia marcescens、及びBacillus subtilis等のグラム陽性及びグラム陰性細菌、およびMethanococcus maripaludis,Haloferax volcanii等の古細菌を含み得る。「真核生物」と言う用語は、酵母、高等植物、昆虫、そして好ましくは哺乳動物細胞を含むことを意味する。組換え製造方法に用いる宿主によって、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質はグリコシル化されるかもしれないし、グリコシル化されないかもしれない。本発明のタンパク質は、最初のアミノ酸残基を有していても、有していなくてもよい。
当業者に一般的に知られたいずれかの技術を用いて本発明の遺伝子を形質転換又はトランスフェクトすることができる。更に、融合し、機能的に結合した遺伝子の調製方法及びそれらを例えば哺乳動物及び細菌中で発現させる方法は当業者に周知である(Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY,1989)。
本発明の新規タンパク質を産生させるための組換え大腸菌は、Eschericia coli BL21(DE3)RIL/pPFPR41,及び、Eschericia coli BL21(DE3)RIL/pPFPR46,と命名、表示され、独立行政法人産業技術総合研究所にそれぞれ受託番号FERM BP−7650及びFERM BP−7651として寄託されている。
以下、実施例をもって本発明を更に詳細に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
実施例
実施例1
ピロコッカス フリオサス ゲノムDNAの調製
P.furiosus DSM3638はDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zelkulturen GmbHより入手し、文献(Nucleic Acids Research,第21巻、第259ー265頁)に記載の方法に従って培養した。500mlの培養液から約1.2gの菌体を得た。これを緩衝液 L(10mM トリスー塩酸(pH8.0),1mM EDTA,100mM NaCl)10mlに懸濁し、10%SDSを1ml加えた。撹拌の後、プロテイナーゼK(20mg/ml)を50μl加えて、55℃で60分静置した。その後反応液を順次フェノール抽出、フェノール/クロロホルム抽出、クロロホルム抽出した後、エタノールを加えてDNAを不溶化した。回収したDNAを1mlのTE液(10mM トリスー塩酸,pH8.0,1mM EDTA)に溶解し、0.75mgのRNase Aを加えて37℃で60分反応させた。その後反応液をもう一度フェノール抽出、フェノール/クロロホルム抽出、クロロホルム抽出した後、エタノール沈殿によりDNAを回収した。0.75mgのDNAが得られた。
実施例2
ピロコッカス フリオサスp41及びp46をコードする遺伝子のクローニング
ピロコッカス フリオサス ゲノムDNAから、目的の遺伝子をクローニングするために、適当なプライマーを合成した。p41の遺伝子増幅として、
をそれぞれフォワード、リバースプライマーとして利用した。またp46遺伝子増幅のためには、
を用いた。PCRは通常の反応組成で、95℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 30秒を30サイクル回し、増幅したDNA鎖をpT7 blueベクター(Novagen社)に挿入して、組換えプラスミドを単離した。用いたプライマーにはそれぞれ、NdeI,XhoI(p41),NdeI,SalI(p46)認識配列が設けてあるので、それぞれの酵素で処理することによって、目的の遺伝子部分のみを切り出すことができる。切り出された遺伝子のNdeI配列中のATGを翻訳の開始コドンに合わせる形で、pET系の発現ベクターに組込むことができる。こうして、p41及びp46の遺伝子(それぞれ配列番号3及び4)を、それぞれpET28a’(本来のpET28aは選択マーカーとしてカナマイシン耐性遺伝子が含まれているが、便宜的にこれをアンピシリン耐性マーカーに入換えたもの)及びpET21aに挿入し、それぞれのプラスミドをpPFPR41,pPFPR46とした。これらのプラスミド構築により、p41にはN−末端にヒスチジンが6つ繋がったタグが付加される形で翻訳され、p46はそのまま本来の開始コドンATGから翻訳される形で産生される。
実施例3
p41タンパク質の産生及び精製
プラスミドpPFPR41を大腸菌BL21(DE3)RILに導入し、得られた形質転換体を培養して、目的のタンパク質を産生させた。
Eschrichia coli BL21(DE3)RIL/pPFPR41をアンピシリンが100μg/mlおよびクロラムフェニコールが20μg/mlの濃度で存在するLB培地(トリプトン10g/リットル、酵母エキス5g/リットル、NaCl 5g/リットル、pH7.2)500mlで培養した。培養液の濁度が0.4A600に達した時、誘導物質であるイソプロピル−β−D−チオガラクトシド(IPTG)を添加し、さらに5時間培養を行った。集菌後、菌体を40mlのバッファーA(50mM Tris−HCl,pH8.0,0.1mM EDTA,2mM β−メルカプトエタノール)に1mMフェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)を加えたものに懸濁し、超音波破砕機にかけた。16,000rpm、20分間の遠心分離により粗抽出液を上清として回収し、これを80℃、15分加熱して大腸菌由来の大部分のタンパク質を変性不溶化させた。遠心分離によって上清を回収し、メタルレジン(Co2+)キレーティングカラム(TALON,Clontech社製)に供した。カラムに結合しないタンパク質を、10mMイミダゾールを含むバッファーAで十分に洗浄除去した後、イミダゾール濃度を100mMに上げて、結合しているヒスチジンタグの付されたタンパク質を溶出させた。この画分を陽イオン交換カラム(HiTrap SP,ファルマシアバイオテク社)に供し、自動液体クロマトシステム(AKTA explorer,ファルマシア社製)を用いてクロマトグラフィーを行った。展開は0.1→0.8MのNaCl直線濃度勾配により行った。目的の活性は0.5−0.7M NaClのところで溶出された。活性のある画分10mlを集め、この画分を2リットルのバッファーAで透析した後、精製標品とした。1リッターの培養液から、約1mgの酵素が得られた。
実施例4
p46タンパク質の産生及び精製
プラスミドpPFPR46を大腸菌BL21(DE3)RILに導入し、得られた形質転換体を培養して、目的のタンパク質を産生させた。
Eseherichia coli BL21(DE3)RIL/pPFPR46を実施例3と同様の培養液で培養した。集菌後、実施例3と同様の方法により菌体破砕し、遠心分離により粗抽出液を得た。これを、同様に80℃15分で熱処理し、耐熱性のタンパク質のみ遠心分離の上清として回収した。この溶液にポリエチレンイミン(Polymin P)とNaClをそれぞれ0.2%(重量/容量)と0.3Mになるように加え、氷中で30分間撹拌した。不溶化した核酸を遠心分離により取り除いた後、80%飽和になるよう硫酸アンモニウムを加えて、タンパク質を沈澱させた。
沈澱をバッファーC(50mM Tris−Cl,pH8.0,0.3M NaCl,1mM β−メルカプトエタノール)で溶解し,同じバッファーで平衡化した陰イオン交換カラム(HiTrapQ,ファルマシアバイオテク社)に供した。展開は0.1→1MのNaCl直線濃度勾配により行った。目的の活性は0.15−0.25M NaClのところで溶出された。活性のある画分10mlを集め、ヘパリンアフィニティーカラム(HiTrap Heparin,ファルマシアバイオテク社)に供した。同じく0.05→0.8MのNaCl直線濃度勾配により展開し、0.3−0.5Mに目的のタンパク質が溶出された。1リッターの培養液から、約6.6mgの酵素が得られた。
実施例5
DNAプライマーゼ活性の検出
プライマーゼ活性を検出するために、M13ファージDNA(一本鎖DNA)を鋳型にしてDNA鎖が合成されるかどうかを、32P−標識のdATPを基質の中に加えることによって、放射活性で追跡した。反応は、50mM Tris−HCl,pH8.1,10mM MgCl2,1mM β−メルカプトエタノール反応液中、M13DNA0.05μg/μl,dCTP,dGTP,dTTPをそれぞれ100μM,[α32p]dATPを10μM,及びp41タンパク質0.7μM又はDNAポリメラーゼIを2.5単位の濃度でそれぞれ加え、20μlの反応溶液として、70℃で20分の後、8M尿素存在下の10%ポリアクリルアミドゲル電気泳動、または1%アルカリアガロースゲル電気泳動で分離し、オートラジオグラフィーを取った。第1図にアルカリアガロースゲル電気泳動の結果を示す。P41タンパク質は鋳型DNAがあるときに、0.4−0.6キロ塩基対のDNA鎖を合成している(レーン3)。DNAポリメラーゼIはこの条件下では、プライマーが無いため、DNA合成は起らない(レーン4)。p41にPolIを加えると合成鎖がより長くなる(レーン5)。
実施例6
DNAポリメラーゼ活性の検出
DNAポリメラーゼ活性を検出するために、M13ファージDNA(一本鎖DNA)を鋳型に用いて、32Pで5’−末端を標識した30鎖長のプライマーをアニーリングした後、dNTPを基質として酵素標品と反応させた。反応は、50mM Tris−HCl,pH8.1,10mM MgCl2,1mM β−メルカプトエタノール反応液(20μl)中、標識プライマーをアニールさせたM13DNA 0.5μg,dCTP,dGTP,dTTP,dATPをそれぞれ125μM,p41タンパク質を0.14μMの濃度で加えて70℃で行い、5分、10分、20分後、それぞれ反応液から5μl分を取り出し、反応停止液(95%ホルムアミド、0.05%ブロモフェノールブルー、0.05%キシレンシアノール)を3μl加えた。対照として、p41タンパク質の代わりにDNAポリメラーゼI,DNAポリメラーゼIIを各々2.5単位加えた反応を同時に調べた。反応液は8M尿素存在下の10%ポリアクリルアミドゲル電気泳動、または1%アルカリアガロースゲル電気泳動で分離し、オートラジオグラフィーを取った。ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果、p41は公知のDNAポリメラーゼI,IIと同じように、30鎖長のプライマーを伸長していたので(第2図)、さらに長鎖の領域が分析できるアルカリアガロースゲル電気泳動を行ってみた(第3図)。ここで行った条件下では、少なくとも、公知のDNAポリメラーゼに匹敵するプライマー伸長活性が認められた。
実施例7
p41−p46複合体の形成
生成した、p41とp46とが相互作用することを確認するため、それぞれ単独の場合と、両者を混合した場合について、陽イオン交換カラム(HiTrap SP)で分析した。P41タンパク質は実施例3で示したように、HiTrap SPカラムに吸着するが、p46は同じ条件下では吸着されずに通り抜ける。この両者を混合した後カラムに供すると、p46がp41と一緒に同じ吸着画分に溶出された(第4図)。このことから両者は非常に安定な複合体を形成しうると考えられる。
実施例8
p46によるDNA結合親和性の増進
酵素のDNAへの結合活性を調べるために、ゲルシフト法を用いた。49鎖長のオリゴデオキシヌクレオチド、5’−dAGCTACCATGCCTGCACGAATTAAGCAATTCGTAATCATGGTCATAGCT−3’の5’−末端を32Pで標識し、それをそのまま、または、相補的な配列を有する49鎖長および17鎖長のオリゴデオキシヌクレオチドとアニールした後、ゲルシフトアッセイに用いた。ゲルシフトアッセイバッファー(50mM Tris.Cl,pH8.0,10mM MgCl2,20mM KCl,及び1mM β−メルカプトエタノール)中で、上記3種類のDNAとタンパク質を種々の濃度で混合し、55℃で5分置いた後、1%アガロースゲル電気泳動により分離した。ゲルは0.1xTAEバッファー(4mM Tris−酢酸、pH8.0,0.1mM EDTA)で調製し、同じバッファーで泳動した。電気泳動後のオートラジオグラフィーを第5図に示す。p41−p46複合体はDNAの種類によらず結合し、複合体としてDNAバンドをシフトさせた。図には示していないが、この条件下ではp41,p46それぞれ単独では結合が見られなかった(シフトバンドが検出されなかった)。
実施例9
p46によるDNA合成反応効率の増進
実施例5に記載の方法により、p41−p46複合体によるDNA鎖合成反応の効率を、それぞれのタンパク質単独の時の場合と比較した。
反応条件は実施例5に記載した通りであるが、標識化合物として、[α32p]dATPの代わりに[α32p]dCTPを用いた。複合体の標品とし、実施例7に記載した陽イオン交換カラムクロマトグラフィーによる分離画分を用いたが、それと共にそれぞれ単独に精製したタンパク質を、反応液に同時に加える場合についても行った。第6図に、電気泳動による、反応生成物の分析結果を示す。p41単独(レーン1)、p41、p46の混合(レーン2)、精製した複合体(レーン3)による反応液から、同じ量を使って電気泳動すると、明らかにレーン2、3ではシグナルの強さが増大していることが分かる。p41単独の場合はシグナルが見難いが(レーン1)、4倍量の反応液を泳動すると、より見やすくなった(レーン4)。しかしそれでも複合体による生成物のシグナルに比べると、遥かに弱いことが分かる。また、図には示していないが、p46単独の反応からは、DNA合成活性が検出されなかった。
また、実施例6に記載した方法により、p41−P46複合体による、プライマー依存のDNA鎖合成反応の効率を、それぞれのタンパク質単独の場合と比較した。第7図に示すように、p41単独の場合に比べて、p41−P46複合体による反応では、伸長鎖の長さはより短いが、生産物の量が格段に増加していることがわかる。
以上のことからp46はp41と複合体を形成することにより、p41のプライマー非依存的及びプライマー依存的なDNA合成活性を増進することがわかる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
第1図はp41のDNAプライマーゼ活性を示す写真である。実施例5に記載の方法で反応した後、アルカリアガロースゲル電気泳動で分離したオートラジオグラフィー。鋳型DNAの存在する場合にp41は0.4−0.6キロ塩基対のDNA鎖を合成した。さらにDNAポリメラーゼIをいっしょに加えると、より長鎖の生成物が検出された。
第2図はp41のDNAポリメラーゼ活性を示す写真である。実施例6に記載の方法で反応した後、8M尿素を含む10%ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。放射標識された30鎖長のプライマーはp41によって、DNAポリメラーゼI,IIと同様に伸長された。合成鎖は時間とともに長くなっている。
第3図はp41のDNAポリメラーゼ活性を示す写真である。図2で示した反応生成物をさらに詳しく分析するため、同じ反応液を1%アルカリアガロースゲル電気泳動で分析した。
第4図はp41−p46複合体の検出を示す写真である。精製したp46は陽イオン交換カラムクロマトグラフィーで非吸着画分に溶出され(レーン3)、またp41は吸着し、約0.6M NaClで溶出された(レーン1)。両タンパク質を混合し、このカラムに供すると、両者が同じ塩濃度で溶出されるようになった(レーン2)。このことは両タンパク質が安定な複合体を形成し得ることを支持している。
第5図はDNAに対する親和性の測定結果を示す写真である。精製したp41−p46複合体を用いて3種類のDNA鎖に対する結合活性を調べた。DNAに対するタンパク質の量比はレーン1.4の順に0,1,3,5で加えている。3種のDNAともにタンパク質の量に依存してバンドシフトが見られる。
第6図はp46によるDNA鎖合成反応の増進を示す写真である。p41単独、またはp41−p46複合体を用いて、DNA鎖合成反応(DNAプライマーゼ アッセイ)を行い、アルカリアガロースゲル電気泳動で調べた。p41単独の反応では生成物が検出できない条件下(レーン1)でも複合体では非常に強い生成物のシグナルが検出できている(レーン2、3)。p41単独の反応液を4倍泳動すると、生成物が検出できた(レーン4)。
第7図はp46によるDNA鎖合成反応の増進を示す写真である。p41単独、またはp41−p46複合体を用いて、DNA鎖合成反応(DNAポリメラーゼ アッセイ)を行い、それぞれ5分、10分後の反応液をアルカリアガロースゲル電気泳動で調べた。p41単独の反応に比べて、複合体を用いた反応では、鎖長は短いものの、非常に強い生成物のシグナルが検出できている。
Claims (10)
- DNAプライマーゼ活性及び/又はDNAポリメラーゼ活性を有する、以下のタンパク質:
(a)配列番号1に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;または
(b)配列番号1に示すアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質。 - 古細菌由来である請求項1に記載のタンパク質。
- 耐熱性である請求項1に記載のタンパク質。
- 請求項1〜3のいずれかに記載のタンパク質と複合体を形成してそのDNAプライマーゼ活性及び/又はDNAポリメラーゼ活性を増強し得る、以下のタンパク質;
(c)配列番号2のアミノ酸配列を含むタンパク質;または
(d)配列番号2に示すアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質。 - 請求項1〜3のいずれかに記載のタンパク質を製造する方法であって、
1)配列番号1に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする塩基配列を調製し、
2)該塩基配列を発現ベクターに挿入し、
3)該ベクターで宿主細胞を形質転換し、
4)該形質転換体を培養し、
5)該培養物から請求項1〜3のいずれかに記載のタンパク質を単離する、
ことを含む方法。 - 請求項4に記載のタンパク質を製造する方法であって、
1)配列番号2に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする塩基配列を調製し、
2)該塩基配列を発現ベクターに挿入し、
3)該ベクターで宿主細胞を形質転換し、
4)該形質転換体を培養し、
5)該培養物から請求項4に記載のタンパク質を単離する、
ことを含む方法。 - デオキシヌクレオチド3リン酸の重合方法であって、
1)鋳型となるDNA鎖及び基質となるデオキシヌクレオチド3リン酸を供し、
2)請求項1〜3のいずれかに記載のタンパク質を加えてデオキシヌクレオチド3リン酸を重合させる、
ことを含む方法。 - 請求項4に記載のタンパク質を更に加える請求項7に記載の重合方法。
- デオキシヌクレオチド3リン酸の重合方法であって、
1)鋳型となるDNA鎖及び基質となるデオキシヌクレオチド3リン酸を供し、
2)鋳型となるDNA鎖に相補的なオリゴデオキシヌクレオチドを加えてDNA鎖と複合体を形成させ、
3)請求項1〜3のいずれかに記載のタンパク質を加えてデオキシヌクレオチド3リン酸を重合させる、
ことを含む方法。 - 請求項4に記載のタンパク質を更に加える請求項9に記載の重合方法。
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