JP7043051B2 - 表面プラズモン励起増強蛍光検出装置および検出方法 - Google Patents

Description

本発明は、検出装置および検出方法に関し、より詳細には、蛍光標識抗体と特異的に結合する抗原を、表面プラズモン励起増強蛍光法により検出する、検出装置および検出方法に関する。

患者が或る特定の病態にあるときに分泌が増加する特定のタンパク質が知られており、このようなタンパク質は病態マーカと呼ばれている。近年では、医療現場において病態マーカを測定するニーズが増加しており、病態マーカを測定する様々な装置が開発されている。

病態マーカを測定する方法の一つに、イムノアッセイがある。マイクロプレート上での典型的なイムノアッセイでは、まず、定量対象である抗原を認識する一次抗体を、抗原と結合させる。この一次抗体を蛍光標識しておく場合と、一次抗体を認識する二次抗体を、蛍光試薬を用いて蛍光標識し、蛍光標識した二次抗体を一次抗体に結合させる場合とがある。蛍光標識された抗体をマイクロプレートに固定化した状態で励起光を入射すると、蛍光標識された二次抗体から蛍光が放出される。この放出される蛍光の量を測定する（すなわち蛍光量を積算する）ことにより、抗原の濃度を定量することができる。

イムノアッセイの感度を向上させるための一つの方法として、プラズモニックチップを用いる方法がある。これは、プラズモニックチップにおける共鳴条件で励起光を入射することで入射光強度を高めて、蛍光分子から放出される蛍光の強度（蛍光量）を高める効果と蛍光分子から放出される蛍光がプラズモン共鳴によって再度増強される効果との２つの効果によって蛍光を増強する手法である。

プラズモニックチップは、基板の表面が、光の波長サイズの周期構造を有する金属薄膜で覆われたマイクロプレートであり、ある特定の角度で照射された光を透過させず、反射させず、基板表面に留めることができる。このような、金属の表面に光を留める現象は、表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance : SPR）と呼ばれている。イムノアッセイにプラズモニックチップを用いると、基板表面に固定化された抗原に結合された蛍光分子は、単なるガラス基板上に固定化される場合と比較して、非常に強い強度の光が照射されている状態となり、放出される蛍光の強度が増大する。このような、表面プラズモン共鳴により励起光の強度を増強させて、励起した蛍光分子から放出される蛍光の強度を増強させる手法は、表面プラズモン励起増強蛍光（Surface Plasmon Fluorescence）法と呼ばれている。

下記特許文献１には、表面プラズモン共鳴を利用して、検体に含まれる被検出物質の検出を行う表面プラズモン増強蛍光測定方法が開示されている。

特開２０１５－２１８８９号公報

患者の病態を早期に特定するためには、例えば約１０^－１２～約１０^－１５ｍｏｌ／Ｌ程度の低濃度の病態マーカを検出することが可能な高感度かつ高精度の測定装置が必要とされている。しかしながら、このニーズは十分に満たされておらず、対象となる病態マーカによってはさらなる高感度化のニーズがある。

高感度かつ高精度測定を達成するためには、蛍光強度が最大となる入射角および検出角の設定と、バックグラウンドノイズを減少させるための入射角に対する相対的な検出角の設定とが重要になる。プラズモニックチップに照射する光の入射角について、特許文献１を参照しても、蛍光物質からの蛍光の強度が最も強くなる角度が好ましい（段落［0031］）ことについて言及するだけである。特許文献１には、高感度測定を達成するための入射角および検出角の具体的な設定方法については何ら開示されていない。

本発明の目的は、被検出物質である抗原をより高感度かつ高精度に検出することができる光学系の設定を有する、表面プラズモン励起増強蛍光法による検出装置および検出方法を提供することにある。

本発明者は、上記目的を達成するために鋭意検討を進めていたところ、増強蛍光ピークがマイクロプレートの法線方向（後述する角度θｐｆが０°方向）で現われる条件のプラズモニックチップでは、法線方向から大きく離れた他の角度に増強蛍光ピークがある場合と比べて約２倍近い増強蛍光が得られることを見出した。このようなプラズモニックチップでは、検出器をチップの法線方向に設置し、検出角θｆを０°付近とすることで、蛍光分子から放出される増強蛍光ＦＬを効率的に検出することが可能となる。

さらに、本発明者は、入射光の偏光軸をプラズモニックチップの表面に投影したベクトル（投影ベクトル）が、マイクロプレート表面に形成された周期構造の配置パターンを示すベクトル（格子ベクトル）に対して方向付けられている場合に、光の結合効率が最大となる伝播型の表面プラズモン共鳴が生じることを見出した。

従来は、入射光がｐ偏光であるという前提の下で、検出装置の入射角および検出角を設定していた。しかしながら、本発明者によるこの知見によると、入射光の偏光軸がプラズモニックチップ表面に対してｐ偏光であるかまたはｓ偏光であるかにかかわらず、格子ベクトルと投影ベクトルとが平行なときに、最も結合効率が高い伝播型の表面プラズモン共鳴を生じさせることが可能となった。すなわち、本発明者によるこの知見によると、入射光がｐ偏光であるという制限をかけずに入射光の偏光軸の投影ベクトルとプラズモニックチップの格子ベクトルとを平行にして、光の結合効率が最大となる伝播型の表面プラズモン共鳴を生じさせ、さらに、 上記した知見として説明したように、θｐｆが０°になるプラズモニックチップを用い、蛍光検出器をチップの法線方向に設置することで、最大の増強蛍光FLを検出することが可能となった。そして、入射光を照射する光源と検出器との光学配置を最適化することで、蛍光の高精度な計測を実現することが可能となった。

すなわち、上記目的を達成するための本発明は、以下に示す態様を含む。

（項１）
抗原抗体反応により蛍光標識抗体と特異的に結合する抗原を、伝播型の表面プラズモン共鳴光によって増強される蛍光により検出する検出装置であって、
表面に周期構造を有するマイクロプレートに光を照射する光源と、
前記マイクロプレートの表面に搭載される試料中の抗原と特異的に結合する蛍光分子から放出される増強蛍光を検出する検出器と、
を備え、
前記検出器の検出方向と前記マイクロプレートの法線方向との角度が、０°以上１５°以下の範囲内である、検出装置。
（項２）
前記光源の照射方向と前記マイクロプレートの前記法線方向との角度が、２０°以上６５°以下の範囲内である、項１に記載の検出装置。
（項３）
前記光の偏光軸を前記マイクロプレートの表面に投影した投影ベクトルが、前記周期構造の配置パターンを示す格子ベクトルに対して方向付けられている、項１または２に記載の検出装置。
（項４）
前記投影ベクトルと前記格子ベクトルとが平行である、項３に記載の検出装置。
（項５）
前記光の偏光軸を前記光の進行方向の周りに回転させた角度と、前記マイクロプレートを前記マイクロプレートの前記法線方向の周りに回転させた角度とが対応付けられている、項３または４に記載の検出装置。
（項６）
表面プラズモン共鳴が格子結合型であり、前記周期構造の間隔が前記蛍光分子の蛍光波長に基づいて決定されている、項１から５のいずれかに記載の検出装置。
（項７）
前記検出器の検出方向と前記マイクロプレートの前記法線方向との角度が、０°以上１０°以下の範囲内である、項１に記載の検出装置。
（項８）
前記光源の照射方向と前記マイクロプレートの前記法線方向との角度が、３０°以上６０°以下の範囲内である、項２に記載の検出装置。
（項９）
前記周期構造が、前記マイクロプレートの平面内において回転対称な構造を有する、項１から８のいずれかに記載の検出装置。
（項１０）
前記周期構造が、二次元の周期構造であり、４回または６回の回転対称な構造である、項９に記載の検出装置。
（項１１）
前記二次元の周期構造は、穴部または突部が平面上に周期的に配置された構造であり、前記穴部および前記突部の立体形状が、円柱、多角柱、円錐、多角錐、円錐台、および多角錐台のいずれかの形状である、項１０に記載の検出装置。
（項１２）
前記光源の照射方向と前記マイクロプレートの前記法線方向との角度が、前記表面プラズモン共鳴により生じる低角側および高角側の２つの共鳴角のうち、高角側の共鳴角である、項１０または１１に記載の検出装置。
（項１３）
前記周期構造が、一次元の周期構造であり、２回の回転対称な構造である、項９に記載の検出装置。
（項１４）
前記一次元の周期構造は、一方向に連続する溝部または突部が筋状に周期的に配置された構造であり、前記溝部または前記突部の断面形状が、矩形、三角形、台形、および半円形のいずれかの形状である、項１３に記載の検出装置。
（項１５）
抗原抗体反応により蛍光標識抗体と特異的に結合する抗原を、伝播型の表面プラズモン共鳴光によって増強される蛍光により検出する方法であって、
表面に周期構造を有するマイクロプレートに光を照射するステップと、
前記マイクロプレートの表面に搭載される試料中の抗原と特異的に結合する蛍光分子から放出される増強蛍光を検出するステップと、
を含み、
前記増強蛍光を検出する方向と前記マイクロプレートの法線方向との角度が、０°以上１５°以下の範囲内である、方法。
（項１６）
前記光を照射する方向と前記マイクロプレートの前記法線方向との角度が、２０°以上６５°以下の範囲内である、項１５に記載の方法。
（項１７）
前記光の偏光軸を前記マイクロプレートの表面に投影した投影ベクトルを、前記周期構造の配置パターンを示す格子ベクトルに対して方向付ける、項１５または１６に記載の方法。
（項１８）
前記投影ベクトルと前記格子ベクトルとが平行である、項１７に記載の方法。
（項１９）
前記光の偏光軸を前記光の進行方向の周りに回転させた角度と、前記マイクロプレートを前記マイクロプレートの前記法線方向の周りに回転させた角度とを対応付ける、項１７または１８に記載の方法。

本発明によると、被検出物質である抗原をより高感度に検出することができる光学系の設定を有する、表面プラズモン励起増強蛍光法による検出装置および検出方法を提供することができる。

本発明の第１の実施形態に係る検出装置の構成を概略的に示す模式図である。 増強蛍光ＦＬの検出角θｆの説明を補足するための模式図である。 表面プラズモン励起増強蛍光法による従来の測定から提案される、検出装置の入射角および検出角の構成を概略的に示す模式図である。 入射光の偏光軸とマイクロプレート表面の周期構造とを所定の配置関係とすることにより伝播型の表面プラズモン共鳴を生じさせる本発明者による知見を説明するための模式図である。 格子結合型の表面プラズモン共鳴の共鳴条件を満たす波数ベクトルを説明するための模式図である。 第１の実施形態に係るマイクロプレートの概略的な構成を示す断面図である。 第１の実施形態に係るマイクロプレートの概略的な構成を示す平面図である。 第１の実施形態に係るマイクロプレートの表面に形成された周期構造のデューティ比を説明するための模式的な断面図である。 第２の実施形態に係るマイクロプレートの概略的な構成を示す平面図である。 第３の実施形態に係るマイクロプレートの概略的な構成を示す平面図である。 界面の平均屈折率を変化させたマイクロプレートを複数作製して増強蛍光の共鳴ピーク角θｐｆの測定を行った結果を示すグラフである。 （Ａ）は、入射光Ｌｉの偏光軸ｐｏｌの回転角Ψｉと一次元周期構造のマイクロプレートの回転角Ψｐとの関係を説明する概略的な模式図である。（Ｂ）は、（Ａ）に示す測定系について行った入射角θｉに依存する反射率計測の結果を示すグラフである。 入射光Ｌｉの偏光軸ｐｏｌの回転角Ψｉと一次元周期構造のマイクロプレートの回転角Ψｐとの関係を説明する概略的な模式図である。 図１３に示す測定系について行った入射角θｉに依存する反射率計測の結果を示すグラフである。 一次元周期構造のマイクロプレートの回転角をΨｐ＝０°～８０°まで回転させて行った反射率計測の結果を示すグラフである。 二次元周期構造のマイクロプレートの回転角をΨｐ＝＋８°～－８°まで回転させて行った反射率計測の結果を示すグラフである。 入射光Ｌｉの偏光軸ｐｏｌの回転角Ψｉとマイクロプレート２０，３０の回転角Ψｐとの関係を説明する概略的な模式図である。 入射光Ｌｉの偏光軸ｐｏｌの回転角Ψｉとマイクロプレート２０，３０の回転角Ψｐとの関係を説明する概略的な模式図である。 入射光Ｌｉの偏光軸ｐｏｌの回転角Ψｉとマイクロプレート２０，３０の回転角Ψｐとの関係を説明する概略的な模式図である。

以下、本発明の実施の形態を、添付の図面を参照して詳細に説明する。なお、以下の説明および図面において、同じ符号は同じまたは類似の構成要素を示すこととし、よって、同じまたは類似の構成要素に関する説明を省略する。

［第１の実施形態］
＜検出装置の構成＞
図１は、本発明の第１の実施形態に係る検出装置の構成を概略的に示す模式図である。

本発明の第１の実施形態に係る検出装置１０は、光源１と検出器２とを備え、表面プラズモン励起増強蛍光法に基づいて、抗原抗体反応により蛍光標識抗体と特異的に結合する抗原を、伝播型の表面プラズモン共鳴光によって増強される蛍光ＦＬにより検出する。

光源１は、表面に周期構造を有するマイクロプレート２０に、直線偏光した光Ｌｉを照射する。マイクロプレート２０表面の周期構造には、試料Ｓが搭載されている。検出器２は、試料Ｓ中の抗原と特異的に結合する蛍光分子から放出される増強蛍光ＦＬを検出する。光源１が照射する光Ｌｉは直線偏光しており、光Ｌｉの進行方向に垂直な面内において、進行方向周りに角度Ψ回転した偏光軸ｐｏｌを有する。本実施形態では、光源１は、例えば出力波長６３３ｎｍのＨｅ－Ｎｅレーザである。検出器２は、例えば光電子増倍管（Photomultiplier Tube: PMT）である。

マイクロプレート２０の法線方向をｎとする。本実施形態では、検出器２の検出方向とマイクロプレート２０の法線方向ｎとの角度θｆが、好ましくは０°以上１５°以下の範囲内であり、より好ましくは０°以上１０°以下の範囲内であるように、検出器２が配置される。また、本実施形態では、光源１が入射光Ｌｉを照射する方向とマイクロプレート２０の法線方向ｎとの角度θｉが、好ましくは２０°以上６５°以下の範囲内であり、より好ましくは３０°以上６０°以下の範囲内であるように、光源１が配置される。

図２は、増強蛍光ＦＬの検出角θｆの説明を補足するための模式図である。図２に示すように、検出角０°の定義がマイクロプレート２０の法線方向ｎであるので、入射面ＰＬｉと直交する平面ＰＬｐに対し、入射側の方位角側にふれている角度をマイナス側とし、入射面ＰＬｉの反射側の方位角側にふれている角度をプラス側とする。なお、本明細書において特に明示しない限り、検出角θｆはプラス側の角度およびマイナス側の角度の両方の意味として解釈することができるものとする。

蛍光の増強度を高めて増強蛍光ＦＬを高感度に検出するためには、入射光Ｌｉの入射角θｉの設定と増強蛍光ＦＬの検出角θｆの設定とが重要になる。すなわち、入射角θｉおよび検出角θｆをどちらもそれぞれ入射光の波長における共鳴角と蛍光の波長における共鳴角とに設定することが好ましい。

まず、本発明では、検出器２をマイクロプレート２０の法線方向ｎ（すなわち検出角θｆが０°方向）に配置することにより、蛍光分子から放出される増強蛍光ＦＬを効率的に検出する。増強蛍光ＦＬの蛍光ピーク角度θｐｆが０°付近に現われる条件のプラズモニックチップは、プラス側に現われる増強蛍光ピークと、マイナス側に現われる増強蛍光ピークがすべて重なり合い、強力な増強蛍光ＦＬの検出が期待されるからである。ここで、蛍光分子から発せられる増強蛍光ＦＬのピーク角は、後述する共鳴条件により決定されることから、以下の説明では、共鳴条件で決まる検出側の増強蛍光ＦＬの蛍光ピーク角をθｐｆと表現し、励起光の（入射側の）共鳴角をθｐｉと表現する。入射角θｉおよび検出角θｆはそれぞれ、図１に示すように、光源１および検出器２の光学的な配置を意味する角度である。

次に、本発明では、バックグラウンドノイズを抑えるために、入射光Ｌｉの入射角θｉと増強蛍光ＦＬの検出角θｆとを互いに干渉しない角度に設定する。一般的な知見として、イムノアッセイでよく用いられているAlexaやCyシリーズなどの蛍光分子の励起波長と蛍光分子が放出する蛍光波長とはそれほど離れておらず、波長差は概ね５０ｎｍ～１００ｎｍ程度である。すなわち、入射側の共鳴角θｐｉと検出側の共鳴角θｐｆとはそれほど離れた角度とならず、角度差は概ね５°～１０°程度である。

図３は、表面プラズモン励起増強蛍光法による一般的な知見から提案される、検出装置の入射角および検出角の構成を概略的に示す模式図である。

図３に示すように、検出器２をマイクロプレート２０の法線方向ｎ（すなわち検出角θｆが０°方向）に配置しようとすると、入射側の共鳴角θｐｉと検出側の共鳴角θｐｆとの角度差が概ね５°～１０°程度であることから、検出に最適な入射角θｉも概ね５°～１０°程度となる。しかしながら、一般的な知見に基づくこのような検出器２および光源１の配置では、検出器２に反射光または散乱光が入射してしまい、蛍光分子から放出される増強蛍光ＦＬを高感度に検出することができない。

本発明では、入射光の偏光軸とマイクロプレート表面の周期構造とを所定の配置関係とすることにより伝播型の表面プラズモン共鳴を生じさせ、共鳴角を高角側にシフトさせることにより、入射角θｉと検出角θｆとを分離させる。

図４は、入射光の偏光軸とマイクロプレート表面の周期構造とを所定の配置関係とすることにより伝播型の表面プラズモン共鳴を生じさせる本発明者による知見を説明するための模式図である。

光と表面プラズモンとを結合（カップリング）させるタイプには、プリズム結合（prism couple）型と、格子結合（grating couple）型との２つのタイプがある。本発明において使用するマイクロプレート２０には表面に周期構造が形成されており、格子結合型の表面プラズモン共鳴が実現される。したがって、本発明では、表面プラズモン共鳴の発生にプリズムは不要である。

いま、表面に周期構造を有するマイクロプレート２０に、偏光軸ｐｏｌを有する直線偏光した光Ｌｉを照射することを考える。図４に示す状態では、入射光Ｌｉはｐ偏光であり、入射光Ｌｉの偏光軸ｐｏｌをマイクロプレート２０の表面に投影したベクトル（以下、投影ベクトルと呼ぶ）Ｐｊは、マイクロプレート２０表面の周期構造の配置パターンを示すベクトル（以下、格子ベクトルと呼ぶ）ｋｇ１と平行になっている。図４に示す状態では、入射光Ｌｉの入射面ＰＬｉは格子ベクトルｋｇ１と平行であり、入射光Ｌｉはｐ偏光である。入射光Ｌｉの偏光状態と格子ベクトルｋｇ１との関係に関する従来の知見によると、図４に示す状態では、伝播型の表面プラズモン共鳴が生じている。

ここで、入射光Ｌｉの偏光軸ｐｏｌを入射光Ｌｉの進行方向周りに角度Ψ回転させ、さらに、偏光軸ｐｏｌを回転させた角度Ψと同じ角度Ψで、マイクロプレート２０を法線方向ｎのまわりに回転させることにより、光の結合効率が最大となる伝播型の表面プラズモン共鳴が生じることが、本発明者により見出された。すなわち、入射光Ｌｉの偏光状態がｐ偏光であることが必要なのではなく、その偏光軸と格子ベクトルとが平行であれば、結合効率が最大の伝播型の表面プラズモン共鳴場を発生させることができる。

入射光Ｌｉの偏光軸ｐｏｌの回転角Ψｉおよびマイクロプレート２０の法線方向まわりの回転角Ψｐについて補足する。入射光Ｌｉの偏光軸ｐｏｌの回転角Ψｉについて、例えば図４に示す状態では入射光Ｌｉはｐ偏光であり、このときの偏光軸ｐｏｌの回転角を回転角Ψｉの０°位置とする。マイクロプレート２０の回転角Ψｐについては、ピッチが最も小さい格子ベクトルの１本が入射面ＰＬｉと一致する方向を、回転角Ψｐの０°位置とする。例えば図４に示す状態では、一次元周期構造のマイクロプレート２０において、ピッチが最も小さい格子ベクトルｋｇ１は入射面ＰＬｉと一致しているので、回転角Ψｐ＝０°である。

図５は、格子結合型の表面プラズモン共鳴の共鳴条件を満たす波数ベクトルを説明するための模式図である。

格子結合型の表面プラズモン共鳴の共鳴条件は、次の式１および式２で与えられる。

ここで、ｋ_ｓｐｐは表面プラズモンの波数ベクトルであり、ｋ_ｐｈ、ｋ_ｐｈｘは入射光Ｌｉの波数ベクトルおよびそのｘ成分のベクトルであり、ｋ_ｇはマイクロプレート２０表面の周期構造の波数ベクトルである。ｍは０以上の整数値である。θは、入射光Ｌｉとマイクロプレート２０の法線ｎとがなす角度であり、表面プラズモン共鳴角に対応する角度である。ε_ｄは界面の誘電体の複素誘電率であり、ε_ｍはプレート表面の金属の複素誘電率である。

図５（Ａ）に示すように、入射光Ｌｉの入射面ＰＬｉがマイクロプレート２０の格子ベクトルに平行な場合、すなわち、入射光Ｌｉの偏光状態と格子ベクトルｋｇ１との関係が図４に示す状態の場合を、Ψｉ＝Ψｐ＝０°、共鳴角はθ（０°）とする。ここで、図５（Ｂ）に示すようにΨｐを回転すると、（式１）の関係から理解されるように、ｋ_ｐｈｓｉｎθが大きくなり、共鳴角もθ（０°）からθ（Ψｐ）に増大する。すなわち、マイクロプレート２０を法線方向ｎ（ｚ軸）のまわりに角度Ψｐ回転させることにより、表面プラズモン共鳴の共鳴角度を高角側にシフトさせ、入射角θｉと検出角θｆとを互いに干渉しない角度に設定することが可能となる。さらに、入射光Ｌｉの偏光軸ｐｏｌを入射光Ｌｉの進行方向周りに角度Ψｉ回転させることにより、光の結合効率が最大となる伝播型の表面プラズモン共鳴を生じさせることが可能となる。

＜一次元周期構造のマイクロプレートの構成＞
図６は、第１の実施形態に係るマイクロプレートの概略的な構成を示す断面図であり、図７は、第１の実施形態に係るマイクロプレートの概略的な構成を示す平面図である。図８は、第１の実施形態に係るマイクロプレートの表面に形成された周期構造のデューティ比を説明するための模式的な断面図である。

本発明の第１の実施形態に係るマイクロプレート２０は、表面に周期構造が形成されたベース基板２１と、ベース基板２１の表面に形成された金属層２２と、金属層２２の表面に形成された消光抑制層２３とを備える。消光抑制層２３は任意の構成である。なお、図では省略して記載しているが、隣接する２つの層の間には接着層を備えていることが好ましい。

マイクロプレート２０のベース基板２１には、一次元の周期構造である格子が表面に形成されている。ベース基板２１は、入射光Ｌｉに対して透明な材質、例えばガラスまたはプラスチック等で形成されている。一次元の周期構造は、例えば一方向に連続する溝部２０ａまたは突部２０ｂが筋状に周期的に配置された構造である。

図６および図７に示す一次元周期構造のマイクロプレート２０の場合、周期構造の配置パターンを示す格子ベクトルは、図示するｋｇ１の１本である。ここで、一次元周期構造のマイクロプレート２０を法線方向（紙面に垂直な方向）の周りに回転させることを考えると、一次元周期構造のマイクロプレート２０は、２回の回転対称構造を有する。ｎ回の回転対称とは、二次元で表される図形において、図形を中心の周りに［３６０／ｎ］°回転させると元の図形と重なる性質をいう。格子ベクトルｋｇ１は、回転軸である法線方向と垂直である。

溝部２０ａまたは突部２０ｂの断面形状は、例えば矩形、三角形、台形、および半円形等である。周期構造の周期、すなわち隣接する溝部２０ａ間の間隔は、照射する光Ｌｉの波長以下であり、例えば約１０～約１０００ｎｍであり、好ましくは約１００～約６００ｎｍである。周期構造の高さｄ（すなわち溝部２０ａの深さｄまたは突部２０ｂの高さｄ）は、約１０～約４０ｎｍであり、デューティ比は約０．３～約０．８である。周期構造に対する溝部２０ａの長さの割合をＭ％とし、突部２０ｂの長さの割合をＶ％とすると、デューティ比はＭ／（Ｍ＋Ｖ）で与えられる。好ましくは、溝部２０ａの長さの割合Ｍは、溝部２０ａの深さｄの略中央において規定され、突部２０ｂの長さの割合Ｖは、突部２０ｂの深さｄの略中央において規定される。

金属層２２は、表面プラズモン共鳴を発生することが可能な金属であればよく、金、銀、銅、プラチナ、ニッケル等の遷移金属であることが好ましい。金属層２２の膜厚は、約１０～約５００ｎｍが好ましく、より好ましくは約５０～約２００ｎｍである。

消光抑制層２３には、例えばポリカーボネートおよびポリメタクリル酸メチルのような有機高分子やシリカ（ＳｉＯ_２）など、入射光Ｌｉや放出される増強蛍光ＦＬの波長領域で吸収が無いまたは吸収が少ない透明な薄膜を用いる。表面プラズモン励起増強蛍光法の特徴である増強蛍光ＦＬは、蛍光分子と金属との距離が近いと、強い励起場で励起された蛍光も金属表面にエネルギー移動して消光されてしまう。したがって、試料Ｓを金属層２２から所定距離だけ離隔させて消光を抑制することが好ましい。また、表面プラズモン共鳴による励起場は近接場であるため、金属表面から離れるにしたがってその電場強度は減衰し、金属表面からおよそ１００ｎｍ以内に存在する蛍光分子のみが効率よく励起される。そのため、消光抑制層２３の膜厚は、約１０ｎｍ～約１００ｎｍの範囲で金属層２２の種類に応じて決定される。例えば、膜厚の最適値は、金属層２２が銀の場合約１０～約５０ｎｍであり、より好ましくは約２０～約５０ｎｍである。金属層２２が金の場合、膜厚の最適値は約１０～約７０ｎｍであり、より好ましくは約４０～約７０ｎｍである。

格子結合型の表面プラズモン共鳴の共鳴条件を、界面の誘電率を用いて表現すると、上記した式１および式２の通りである。

マイクロプレート表面の周期構造の間隔（ピッチ）Λを用いると、周期構造の波数ベクトルｋ_ｇは、ｋ_ｇ＝２π／Λで表される。すなわち、マイクロプレート表面の周期構造の間隔Λを変化させることによっても、波数ベクトルｋ_ｇが変化して入射角θが変化し、表面プラズモン共鳴の共鳴角θを変化させることができる。

なお、周期構造の間隔（ピッチ）Λは、法線方向（θｆ＝０°）で増強蛍光ピークが現われるように調整することができるが、それは蛍光波長λにおいて（式１）の共鳴条件が成り立つときである。

また、金属によってプラズモン増強効果が得られる波長は異なるが、（式２）より、ピッチΛのおおよその値は、金属層２２の材質毎に以下のように決めることができる。以下に示す蛍光波長λの範囲は、周期構造のピッチΛと蛍光波長λとの関係が線形性を示し、プラズモン増強が得られる波長範囲である。
Λ ＝ ０．８ ・λ－６０ ３８０＜λ＜８００ｎｍ 銀（Ａｇ）
Λ ＝ ０．８１・λ－８０ ５３０＜λ＜８００ｎｍ 金（Ａｕ）
Λ ＝ ０．７５・λ－１０ ３００＜λ＜８００ｎｍ アルミニウム（Ａｌ）

＜効果＞
本発明の第１の実施形態に係る検出装置１０によると、検出器２をマイクロプレート２０の法線方向ｎ（すなわち検出角度θｆが０°方向）に配置することにより、蛍光分子から放出される増強蛍光ＦＬを効率的に検出することが可能となる。

さらに、本発明の第１の実施形態に係る検出装置１０によると、マイクロプレート２０が法線方向ｎのまわりに角度Ψ回転されることにより、表面プラズモン共鳴の共鳴角度を高角側にシフトさせ、入射角と検出角とを互いに干渉しない角度に設定することが可能となる。さらに、入射光Ｌｉの偏光軸ｐｏｌが入射光Ｌｉの進行方向周りに角度Ψ回転されることにより、光の結合効率が最大となる伝播型の表面プラズモン共鳴を生じさせることが可能となる。

これにより、本発明の第１の実施形態に係る検出装置１０によると、入射角θｉと検出角θｆとが互いに干渉しない角度設定において、表面プラズモン励起増強蛍光法による測定を行うことが可能となる。さらに、入射角θｉおよび検出角θｆをどちらもそれぞれ共鳴角（θｐｉ，θｐｆ）近傍の角度に設定することにより、蛍光の増強度を高めて、増強蛍光ＦＬを高感度に検出することが可能となる。

［第２の実施形態］
本発明の第２の実施形態に係る検出装置は、第１の実施形態に係る検出装置１０と同じ構成を有する。第２の実施形態では、マイクロプレート３０の表面に形成されている周期構造が二次元の周期構造である。

＜二次元周期構造のマイクロプレートの構成＞
図９は、第２の実施形態に係るマイクロプレートの概略的な構成を示す平面図である。第２の実施形態に係るマイクロプレート３０は、表面に形成されている周期構造が二次元である以外は、第１の実施形態に係るマイクロプレート２０と同じである。

マイクロプレート３０のベース基板には、二次元の周期構造である格子が表面に形成されている。二次元の周期構造は、例えば穴部３０ａ（または台状部３０ｂ）が平面上に周期的に配置された構造である。

図９に示す二次元周期構造のマイクロプレート３０の場合、周期構造の配置パターンを示す格子ベクトルは、図示するｋｇ１およびｋｇ２の２本である。ここで、二次元周期構造のマイクロプレート３０を法線方向（紙面に垂直な方向）の周りに回転させることを考えると、二次元周期構造のマイクロプレート３０は、４回の回転対称構造を有する。

格子ベクトルｋｇ１，ｋｇ２はいずれも、回転軸である法線方向と垂直である。好ましくは、２本の格子ベクトルｋｇ１，ｋｇ２の関係は、格子ベクトルｋｇ１と格子ベクトルｋｇ２とが垂直であり、格子ベクトルｋｇ１の大きさが格子ベクトルｋｇ２の大きさと同じである。すなわち、好ましくは、ｋｇ１⊥ｋｇ２かつ｜ｋｇ１｜＝｜ｋｇ２｜である。

穴部３０ａの立体形状は、例えば円柱、多角柱、円錐、多角錐、円錐台、および多角錐台等である。周期構造の周期、すなわち隣接する穴部３０ａ間の間隔は、照射する光Ｌｉの波長以下であり、例えば約１０～約１０００ｎｍであり、好ましくは約１００～約６００ｎｍである。周期構造の高さ（すなわち穴部３０ａの深さ）は、約１０～約４０ｎｍであり、デューティ比は約０．３～約０．８である。

［第３の実施形態］
本発明の第３の実施形態に係る検出装置は、第１の実施形態に係る検出装置１０と同じ構成を有する。第３の実施形態では、マイクロプレート４０の表面に形成されている二次元の周期構造が、第２の実施形態のマイクロプレート３０と異なる。

図１０は、第３の実施形態に係るマイクロプレートの概略的な構成を示す平面図である。第２の実施形態では、二次元周期構造のマイクロプレート３０は、穴部３０ａが平面上に周期的に配置された構造である。しかしながら、第３の実施形態では、穴部３０ａの配置はこれに限定されず、図１０に示すような、例えば穴部４０ａ（または台状部４０ｂ）が平面上に周期的に配置された構造であってもよい。

図１０に示す二次元周期構造のマイクロプレート４０の場合、周期構造の配置パターンを示す格子ベクトルは、図示するｋｇ１，ｋｇ２およびｋｇ３の３本である。ここで、二次元周期構造のマイクロプレート４０を法線方向（紙面に垂直な方向）の周りに回転させることを考えると、二次元周期構造のマイクロプレート４０は、６回の回転対称構造を有する。

格子ベクトルｋｇ１，ｋｇ２およびｋｇ３はいずれも、回転軸である法線方向と垂直である。好ましくは、３本の格子ベクトルｋｇ１，ｋｇ２，ｋｇ３の関係は、ｋｇ１・ｋｇ２＝｜ｋｇ１｜｜ｋｇ２｜ｃｏｓ１２０°であり、ｋｇ２・ｋｇ３＝｜ｋｇ２｜｜ｋｇ３｜ｃｏｓ１２０°であり、｜ｋｇ１｜＝｜ｋｇ２｜＝｜ｋｇ３｜である。なお、記号「・」はベクトルの内積を意味する。

［付記事項］
以上、本発明を特定の実施の形態によって説明したが、本発明は上記した実施の形態に限定されるものではない。

上記第１～第３の実施形態では、光源１は直線偏光した光Ｌｉをマイクロプレート２０，３０へ照射しているが、光源１は直線偏光した光を照射する光源に限定されない。光源が直線偏光していない光を照射し、例えば直線偏光板等の追加の光学素子を介して光を直線偏光させて、マイクロプレート２０，３０，４０へ照射してもよい。

以下に、本発明の実施例を示し、本発明の特徴をより明確にする。

一次元周期構造のマイクロプレート２０について、界面の平均屈折率を変化させたマイクロプレートを複数作製して、増強蛍光ＦＬの共鳴ピーク角θｐｆの測定を行った。ピーク角θｐｆは、θｆ＝－１５°～１０°の範囲において測定した。増強蛍光ＦＬの強度計測の結果を図１１に示す。図１１中、実線で示された測定結果を波長分解したものが波線で示されており、増強蛍光ピーク角θｐｆを解析すると、図１１において、（Ａ）はθｐｆ＝０°という計測結果であり、（Ｂ）はθｐｆ＝４°という計測結果であり、（Ｃ）はθｐｆ＝７°という計測結果であった。

（Ａ）に示されるように、増強蛍光ピーク角θｐｆ＝０°において、蛍光強度のピーク値が最大（１秒間あたり約４．３×１０^７カウント）となり、θｐｆがプラス側のピークとマイナス側のピークとが重なり合って、より強い強度の増強蛍光を検出していると考えられる。また、（Ｂ）および（Ｃ）に示されるように、θｐｆが０°から離れるにしたがって、増強蛍光ピーク角θｐｆはプラス側のピークとマイナス側のピークとの重なり合いが弱まり、蛍光強度のピーク値も徐々に低下した。（Ｃ）に示されるように、増強蛍光ピーク角θｐｆ＝７°では、蛍光強度のピーク値は、１秒間あたり約３．３×１０^７カウントとなった。θｐｆ＝７°からさらにピークが０°から離れると、蛍光強度のピーク値も低下したことから、０°以上７°以下の範囲内にθｐｆが現われるようなプラズモニックチップが最適であることが示された。

一次元周期構造のマイクロプレート２０について、入射光Ｌｉの偏光軸ｐｏｌをマイクロプレート２０の表面に投影した投影ベクトルＰｊが、マイクロプレート表面に形成された周期構造の配置パターンを示す格子ベクトルｋｇ１，ｋ２に対して略平行に方向付けられている場合に、光の結合効率が向上した伝播型の表面プラズモン共鳴が生じることを確認した。

図１２の（Ａ）は、入射光Ｌｉの偏光軸ｐｏｌの回転角Ψｉと一次元周期構造のマイクロプレート２０の回転角Ψｐとの関係を説明する概略的な模式図である。（Ｂ）は、（Ａ）に示す測定系について行った入射角θｉに依存する反射率計測の結果を示すグラフである。

図１２の（Ａ）に示すように、マイクロプレート２０を角度Ψｐ＝９０°回転させた状態で、入射光Ｌｉがｐ偏光（Ψｉ＝０°）の場合と、ｓ偏光（Ψｉ＝９０°）の場合とのそれぞれについて、入射角θｉを変化させて反射率計測を行った。

入射光Ｌｉがｐ偏光の場合には、（Ｂ）に示されているように反射率が概ね９０％以上となり、表面プラズモン共鳴光の観測が困難であることが示された。（Ａ）に示すように、この場合の、投影ベクトルＰｊと格子ベクトルｋｇ１とは平行ではない。一方で、入射光Ｌｉがｓ偏光の場合には、入射角θｉ＝約２８°において反射率が極小となり、表面プラズモン共鳴光が生じていることが示された。この場合、投影ベクトルＰｊと格子ベクトルｋｇ１とは平行になっている。

従来の知見によると、光との結合効率を最大にできる伝播型の表面プラズモン共鳴を生じさせるためには、マイクロプレート表面に対してｐ偏光となる入射光が必要とされていた。しかしながら、ｐ偏光の状態（Ψｉ＝０°）からｓ偏光の状態（Ψｉ＝９０°）への偏光軸ｐｏｌの回転角９０°に対応させて、マイクロプレート２０を角度９０°回転させることによっても、光との結合効率を最大にできる伝播型の表面プラズモン共鳴場を生じさせることが可能であることが示された。

図１３の（Ａ）に示すように、入射光Ｌｉをｓ偏光（Ψｉ＝９０°）とした状態で、一次元周期構造のマイクロプレート２０の回転角を角度Ψｐ＝８０°～１００°回転させて反射率計測を行った。比較用に、（Ｂ）に示すように、一次元周期構造のマイクロプレート２０を回転させず（Ψｐ＝０°）入射光Ｌｉをｐ偏光（Ψｉ＝０°）とした状態でも、反射率計測を行った。（Ａ）および（Ｂ）どちらの状態でも表面プラズモン共鳴光は観測された。反射率計測の結果を図１４に示す。

入射光がｓ偏光（Ψｉ＝９０°）の場合には、マイクロプレート２０の回転角Ψｐ＝９０°において、投影ベクトルＰｊと格子ベクトルｋｇ１とは平行になっている。回転角Ψｐ＝９０°（実線●）から±１０°ずれた８０°（破線▲）または１００°（実線□）においても、表面プラズモン共鳴光は観測されていることが確認された。入射角θｉの共鳴角θｐｉは低角側にシフトしていることが確認された。

一次元周期構造のマイクロプレート２０の回転角Ψｐを、角度Ψｐとｐ偏光の状態からの偏光軸ｐｏｌの回転角Ψｉとを同期させて、Ψｐ＝０°～８０°まで回転させながら反射率計測を行った。すなわち、入射光Ｌｉの偏光軸ｐｏｌの回転角Ψｉとマイクロプレート２０の回転角Ψｐとは同じ値であり、例えば回転角Ψｐ＝３０°のときは、回転角Ψｉ＝３０°となるよう入射光Ｌｉの偏光軸ｐｏｌを回転させて反射率計測を行った。反射率計測の結果を図１５に示す。図１５に示されるように、マイクロプレート２０の回転角Ψｐが増加するにつれ、表面プラズモン共鳴光がピークとなる入射角θｉ（すなわち共鳴角θｐｉ）が高角側にシフトすることが示された。これは、図５を用いて説明した考察に対応する測定結果である。

二次元周期構造のマイクロプレート３０の回転角Ψｐを、角度Ψｐとｐ偏光の状態からの偏光軸ｐｏｌの回転角Ψｉとを同期させて、Ψｐ＝＋９°～－７°まで回転させて反射率計測を行った。反射率計測の結果を図１６に示す。図１６に示されるように、すべての回転角Ψｐについて、低角側（約６．５°）と高角側（約３６°～約５４°）との２つの共鳴角θｐｉが観測された。どのような回転角Ψｐについても、低角側の共鳴角（約６．５°）の角度はほぼ変化しなかった。

強力な増強蛍光ＦＬの検出を期待して、検出角θｆは０°方向に設定されている。したがって、低角側および高角側の２つの共鳴角θｐｉのうち、高角側の共鳴角（約３６°～約５４°）を光Ｌｉの入射角θｉに設定することにより、入射角θｉと検出角θｆとが互いに干渉しない角度設定の検出装置とすることができる。

［総括］
図１７～図１９は、入射光Ｌｉの偏光軸ｐｏｌの回転角Ψｉとマイクロプレート２０，３０の回転角Ψｐとの関係を説明する概略的な模式図である。

まず、蛍光強度の比較のために、マイクロプレート２０，３０を用いないガラス基板の表面に試料Ｓを載置して、蛍光強度の測定を行った。検出器２の露光時間は、１つの計測角度につき１秒とした。入射角θｉが約６．５°～約３６°の範囲内では、蛍光強度の計数値は１．２５万カウントであり、入射角θｉが約５０°では、蛍光強度の計数値は約１．７万カウントであった。

図１７の（Ａ）に示す、一次元周期構造のマイクロプレート２０に対するΨｐ＝９０°、Ψｉ＝９０°、共鳴角θｐｉ＝２８°の測定系で、蛍光強度の測定を行った。蛍光強度の計数値は約４２０万カウント（ガラス基板比で約３００倍以上）であり、標準偏差は約２０万であった。投影ベクトルＰｊは格子ベクトルｋｇ１と平行であった。

図１７の（Ｂ）に示す一次元周期構造のマイクロプレート２０に対するΨｐ＝０°、Ψｉ＝０°、共鳴角θｐｉ＝６．５°の測定系で、蛍光強度の測定を行った。蛍光強度の計数値は約７１０万カウント（ガラス基板比で約３００倍以上）であり、標準偏差は約４１０万であった。投影ベクトルＰｊは格子ベクトルｋｇ１と平行であった。

図１８の（Ｃ）に示す、二次元周期構造のマイクロプレート３０に対するΨｐ＝０°、Ψｉ＝９０°、共鳴角θｐｉ＝３６°の測定系で、蛍光強度の測定を行った。蛍光強度の計数値は約３５０万カウント（ガラス基板比で約２８０倍程度）であり、標準偏差は約３０万であった。投影ベクトルＰｊは格子ベクトルｋｇ１と平行であった。

図１８の（Ｄ）に示す、二次元周期構造のマイクロプレート３０に対するΨｐ＝０°、Ψｉ＝０°、低角側の共鳴角θｐｉ＝６．５°の測定系で、蛍光強度の測定を行った。蛍光強度の計数値は約４００万カウント（ガラス基板比で約３００倍以上）であり、標準偏差は約３８０万であった。投影ベクトルＰｊは格子ベクトルｋｇ２と平行であった。

図１８の（Ｅ）に示す、二次元周期構造のマイクロプレート３０に対するΨｐ＝０°、Ψｉ＝０°、高角側の共鳴角θｐｉ＝５１°の測定系で、蛍光強度の測定を行った。蛍光強度の計数値は約２４０万カウント（ガラス基板比で約２００倍程度）であり、標準偏差は約２４０万であった。投影ベクトルＰｊは格子ベクトルｋｇ２と平行であった。

図１９の（Ｆ）に示す、二次元周期構造のマイクロプレート３０に対するΨｐ＝４５°、Ψｉ＝４５°、共鳴角θｉ＝２６°の測定系で、蛍光強度の測定を行った。蛍光強度の計数値は約４１０万カウント（ガラス基板比で約３００倍以上）であった。投影ベクトルＰｊは格子ベクトルｋｇ２と平行であった。

図１９の（Ｇ）に示す、二次元周期構造のマイクロプレート３０に対するΨｐ＝０°、Ψｉ＝４５°、共鳴角θｉ＝３４°の測定系で、蛍光強度の測定を行った。蛍光強度の計数値は約３９０万カウント（ガラス基板比で約３００倍以上）であった。投影ベクトルＰｊは、周期構造の斜め４５°方向の配置パターンを示す格子ベクトルｋｇ４５と平行であった。二次元周期構造のマイクロプレート３０の場合、入射光Ｌｉの偏光軸ｐｏｌを４５°回転させると、図１９（Ｅ）に図示する斜め４５°方向の配置パターンを示す格子ベクトルｋｇ４５が、表面プラズモン共鳴光の発生に寄与していると考えられる。

図１７～１９の（Ａ）～（Ｇ）に示すいずれの測定系においても、投影ベクトルＰｊと、格子ベクトルｋｇ１およびｋｇ２のいずれかとは常に平行であった。（Ｆ）に示す測定系では、入射光Ｌｉの偏光軸ｐｏｌの回転角に対応して、マイクロプレート３０を同じ角度で回転させることにより、表面プラズモン共鳴光が生じていることが示された。（Ｇ）に示す測定系では、入射光Ｌｉの偏光軸ｐｏｌの回転角に対応して、マイクロプレート３０を同じ角度で回転させていない。しかしながら、二次元周期構造のマイクロプレート３０の場合は、図１９（Ｅ）に図示するように斜め４５°方向の配置パターンを示す格子ベクトルｋｇ４５が存在することから、格子ベクトルｋｇ４５が投影ベクトルＰｊと平行になり、結合効率のよい表面プラズモン共鳴光が生じていると考えられる。

測定系（Ｂ）および（Ｄ）の結果が示すように、一次元周期構造のマイクロプレート２０および二次元周期構造のマイクロプレート３０のどちらについても、入射面ＰＬｉと偏光軸ｐｏｌとを平行にして低角側の共鳴角を測定に用いると、蛍光強度は高くなる（約３００倍以上）ものの、ばらつきも大きくなることが示された。

測定系（Ｅ）の結果が示すように、二次元周期構造のマイクロプレート３０について、入射面ＰＬｉと偏光軸ｐｏｌとを平行にして高角側の共鳴角を測定に用いると、低角側の共鳴角を測定に用いる測定系（Ｄ）と比較して蛍光強度は少し低め（約２００倍程度）となり最適ではないものの、測定系（Ｄ）よりばらつきは小さくなり、表面プラズモン共鳴光が十分に高感度に計測可能であることが示された。このように、高角側の共鳴角を測定に用いる測定系（Ｅ）においても、高感度計測に十分な蛍光強度が得られた。二次元周期構造のマイクロプレート３０の場合には、図１９（Ｅ）に図示するように斜め４５°方向の配置パターンを示す格子ベクトルｋｇ４５が存在し、この格子ベクトルｋｇの投影ベクトルＰｊと平行な成分（図中、ｋｇ４５ｘ）が、表面プラズモン共鳴の結合効率の向上に寄与していると考えられる。

測定系（Ａ）および（Ｃ）の結果が示すように、一次元周期構造のマイクロプレート２０および二次元周期構造のマイクロプレート３０のどちらについても、入射面ＰＬｉと偏光軸ｐｏｌとを垂直にした測定系によると、蛍光強度が高く（約２８０倍～約３００倍程度の強度）、かつ、ばらつきも小さくなることが示された。すなわち、表面プラズモン共鳴光の高感度の計測に向いている測定系は、一次元周期構造のマイクロプレート２０の場合には、（Ａ）の測定系であり、二次元周期構造のマイクロプレート３０の場合には、（Ｃ）の測定系であることが示された。測定系（Ａ）および（Ｃ）ではいずれも、入射光Ｌｉはｓ偏光であり、ｐ偏光ではなかった。

測定系（Ｆ）および（Ｇ）の結果が示すように、二次元周期構造のマイクロプレート３０の場合には、４５°偏光であっても、格子ベクトルと投影ベクトルとが平行であれば、表面プラズモン共鳴光の高感度の計測が可能であることが示された。

１ 光源
２ 検出器
１０ 検出装置
２０ マイクロプレート
２０ａ 溝部
２０ｂ 突部
２１ ベース基板
２２ 金属層
２３ 消光抑制層
３０ マイクロプレート
３０ａ 穴部
４０ マイクロプレート
４０ａ 穴部
ＦＬ 蛍光
ｋｇ１，ｋｇ２，ｋｇ３ 格子ベクトル
Ｐｊ 投影ベクトル
Ｌｉ 入射光
ＰＬｉ 入射面
ｐｏｌ 偏光軸
Ｓ 試料
Λ ピッチ
λ 蛍光波長

Claims (13)

1. 抗原抗体反応により蛍光標識抗体と特異的に結合する抗原を、伝播型の表面プラズモン共鳴光によって増強される蛍光により検出する検出装置であって、
   表面に周期構造を有するマイクロプレートに光を照射する光源と、
   前記マイクロプレートの表面に搭載される試料中の抗原と特異的に結合する蛍光分子から放出される増強蛍光を検出する検出器と、
   を備え、
   前記検出器の検出方向と前記マイクロプレートの法線方向との角度が、０°以上１５°以下の範囲内であり、
   前記光源の照射方向と前記マイクロプレートの前記法線方向との角度が、２０°以上６５°以下の範囲内であり、
   前記光の偏光軸を前記マイクロプレートの表面に投影した投影ベクトルが、前記周期構造の配置パターンを示す格子ベクトルに対して方向付けられており、
   前記光の偏光軸を前記光の進行方向の周りに回転させた角度と、前記マイクロプレートを前記マイクロプレートの前記法線方向の周りに回転させた角度とが対応付けられている、検出装置。
2. 前記投影ベクトルと前記格子ベクトルとが平行である、請求項１に記載の検出装置。
3. 表面プラズモン共鳴が格子結合型であり、前記周期構造の間隔が前記蛍光分子の蛍光波長に基づいて決定されている、請求項１または２に記載の検出装置。
4. 前記検出器の検出方向と前記マイクロプレートの前記法線方向との角度が、０°以上１０°以下の範囲内である、請求項１に記載の検出装置。
5. 前記光源の照射方向と前記マイクロプレートの前記法線方向との角度が、３０°以上６０°以下の範囲内である、請求項１に記載の検出装置。
6. 前記周期構造が、前記マイクロプレートの平面内において回転対称な構造を有する、請求項１から５のいずれかに記載の検出装置。
7. 前記周期構造が、二次元の周期構造であり、４回または６回の回転対称な構造である、請求項６に記載の検出装置。
8. 前記二次元の周期構造は、穴部または突部が平面上に周期的に配置された構造であり、前記穴部および前記突部の立体形状が、円柱、多角柱、円錐、多角錐、円錐台、および多角錐台のいずれかの形状である、請求項７に記載の検出装置。
9. 前記光源の照射方向と前記マイクロプレートの前記法線方向との角度が、表面プラズモン共鳴により生じる低角側および高角側の２つの共鳴角のうち、高角側の共鳴角である、請求項７または８に記載の検出装置。
10. 前記周期構造が、一次元の周期構造であり、２回の回転対称な構造である、請求項６に記載の検出装置。
11. 前記一次元の周期構造は、一方向に連続する溝部または突部が筋状に周期的に配置された構造であり、前記溝部または前記突部の断面形状が、矩形、三角形、台形、および半円形のいずれかの形状である、請求項１０に記載の検出装置。
12. 抗原抗体反応により蛍光標識抗体と特異的に結合する抗原を、伝播型の表面プラズモン共鳴光によって増強される蛍光により検出する方法であって、
    表面に周期構造を有するマイクロプレートに光を照射するステップと、
    前記マイクロプレートの表面に搭載される試料中の抗原と特異的に結合する蛍光分子から放出される増強蛍光を検出するステップと、
    を含み、
    前記増強蛍光を検出する方向と前記マイクロプレートの法線方向との角度が、０°以上１５°以下の範囲内であり、
    前記光を照射する方向と前記マイクロプレートの前記法線方向との角度が、２０°以上６５°以下の範囲内であり、
    前記光の偏光軸を前記マイクロプレートの表面に投影した投影ベクトルが、前記周期構造の配置パターンを示す格子ベクトルに対して方向付けられており、
    前記光の偏光軸を前記光の進行方向の周りに回転させた角度と、前記マイクロプレートを前記マイクロプレートの前記法線方向の周りに回転させた角度とを対応付ける、方法。
13. 前記投影ベクトルと前記格子ベクトルとが平行である、請求項１２に記載の方法。

Images