JP7042305B2 - Crm197の高レベル発現のためにコドン最適化したポリヌクレオチド - Google Patents
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Description
本発明はまた、ポリペプチドCRM197の高生産のための方法であって、本発明のポリヌクレオチドを用いて適切な宿主を形質転換して対応するタンパク質を過剰発現させるための方法、および発現したポリペプチドを単離するための方法を提供する。
分泌するタンパク質外毒素である。ジフテリア菌の毒素産生株は、毒素遺伝子を保有するバクテリオファージ溶原菌(lysogen)を含む。成熟型のDTは535個のアミノ酸を含有
する単一ポリペプチドとして合成され、それは初期の536プロペプチドから誘導され、それが位置190、192および193においてタンパク質分解を受けて成熟毒素を形成する。このスプライシングまたはタンパク質分解の結果、ジスルフィド橋により互いに連結した2つのサブユニットAおよびBになる(Moskang et al Biol. Chem. 264: 15709-15713, 1989)。サブユニットAは、触媒活性をもつNAD依存性ADPリボシルトランスフェラーゼ部分である。それは伸長因子-2(Elongation Factor-2)(EF-2)を不活性
化するのに関与し、よって標的細胞においてタンパク質合成をダウンレギュレートする。
して知られる遺伝学的に解毒された形態のジフテリア毒素が導入された;それは本質的にDTの免疫学的交差反応特性を保持している。
トロソグアニジン変異形成、次いでそれを用いたジフテリア菌の感染により作製された(Uchida et al Nature New Biology (1971) 233; 8-11, Nucleic Acisd Res. 1984 May 25; 12(10): 4063-9)。
al., (J. Baeteriol. 189:5140-5151)によりCRM197を大腸菌(Escherichia coli)において発現させることによって対処されてきた:彼らはジフテリア毒素(toxシグナル配列を含む)を含む組換え融合タンパク質の発現を記載している;しかし、これにより分解したタンパク質が生成した。活性形態の収率が低いのは、毒素の個々の特性、たとえばサイズおよび二次構造に応じて、分解、不適正フォールディング、または両方にも関連する。したがって、大部分の生物医薬と同様に、CRM197の精製工程中に発現タンパク質の追加損失が生じ、それによりCRM197の生物活性形態の維持には困難が伴う。したがって、活性形態の細菌トキソイドCRM197の高レベル発現の達成に対するニーズがある。
方法であって、プロモーターおよび少なくとも1つの完全パリンドロームオペレーター(Palindrome Operator)配列に作動可能な状態で連結したCRM197をコードする遺伝子
を含むベクターを発現させることを含む方法が開示されている。
細胞から抽出する;その際、抽出プロセスは浸透圧ショックを含み、グラム陰性宿主細胞は大腸菌、シュードモナス属(Pseudomonas)およびモラクセラ属(Moraxella)からなる群から選択され、宿主細胞は工程b)に際して生存しており、この方法は10~5000リットルの培養物を収容する発酵槽内で実施される。
(Novartis Vaccines and Diagnostics)、すなわち髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)亜群A、C、Y、およびW-135により引き起こされる侵襲性髄膜炎菌疾患を防止するために適用されるワクチン;Menjugate(登録商標) (Novartis Vaccines)、すなわち髄膜炎菌C群コンジュゲートワクチン;ならびにPrevnar(登録商標) (Wyeth Pharmaceuticals,Inc.)、すなわち肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)の13の血清型を標的とする小児用肺炎ワクチン;ならびにHibTITER(登録商標) (Wyeth)、すなわちインフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)b型ワクチン。さらに、CRM197はジフテリア菌ワクチン接種のための追加免疫抗原としての使用の可能性をもち、他のワクチンに使用するためのキャリヤータンパク質として研究されている。
本発明のさらに他の目的は、CRM197が得られるようにポリペプチドの発現を制御するための調節可能な方法を提供することである。
NO.2)、ならびにその最適化したポリヌクレオチド配列SEQ ID NO.2に対して少なくとも70~88%相同であるそれのバリアント、たとえばSEQ ID NO.3、4、5、6、7、8、9および10を提供する。
a)本質的にSEQ ID NO.2からなる最適化したポリヌクレオチド配列またはSEQ ID NO.2に対して少なくとも70%相同であるそれのバリアントを選択し、
b)場合により工程(a)のポリヌクレオチド配列を適切なベクター内へライゲートさせ、
c)そのポリヌクレオチド配列を大腸菌宿主細胞に挿入または形質転換し、
d)形質転換した宿主細胞を、ポリペプチドの高レベル発現のための培地中で培養し、
e)誘導温度10~40℃を維持してポリペプチドを産生させ、
f)細菌ポリペプチドを宿主細胞から抽出し、次いで精製して、純粋なポリペプチドを高収率で得る。
が、それらに限定されない。これは、tRNA存在度(abundance)またはコグネイト(cognate)細胞tRNA頻度を反映し、それから同義コドン(synonymous codon)選択パターンを慎重に選ぶべきである。さらに他の要因には、二次構造形成のポテンシャル、mRNAレベルおよびRNA安定性、その後に実施を予定している操作、合成経路なども含まれる。これらのパターンの選択は目的とする個々のタンパク質の最適化および発現宿主に伴って異なるので、これらの構造の発生を慎重に調節すべきである。
他の態様において、本発明は、CRM197のポリペプチドの高レベル発現に有用な最適化したポリヌクレオチド配列(SEQ ID NO.2)、ならびに70%以上の類似性をもつそれの構造バリアントであってSEQ ID NO.3、4、5、6、7、8、9および10から選択されるもの(それらに限定されない)を提供する。
発現の誘導は、生成物が加速された速度で得られるようにポリヌクレオチドからの発現を誘導するために実施される工程を表わし、これは適切な誘導剤、たとえばIPTG、アラビノース、マルトースなどの添加を伴うことができる。
うことができる。タグの存在は、細胞質において、またタンパク質の後続精製について、タンパク質の安定性および溶解性を高めることも知られている。
ed., (1989))。これには、適切なプロモーター、複製起点、リボソーム結合部位、転写
終止配列、選択マーカー、および多重クローニング部位が含まれるが、これらに限定されない。特に、効率的かつ特異的な構築体を含むプラスミドが好ましい;たとえば、ファージT7のRNAポリメラーゼ酵素に対して特異的なT7プロモーターを含むもの。そのような方法は、限定ではないが、U.S. Patent Application NO. 2012/0128727; U.S. Pat. NO. 5,055,294; U.S.Pat. NO. 5,128,130; U.S.Pat. NO. 5,281,532; U.S.Pat. NO. 4,695,455; U.S.Pat. NO. 4,861,595; U.S.Pat. NO. 4,755,465およびU.S. Pat. NO. 5,169,760に開示されたものを参照できる。ジフテリア菌においてCRM197タンパク質を産生させるためのプラスミド系は、U.S. Pat. NO. 5,614,382にも記載されている。
グ法により確認する。得られた構築体を用いて、いずれか既知の化学的または物理的方法により宿主細胞を形質転換する。たとえば、宿主細胞を6.5kV.cm-1~25kV.cm-1の範囲の電界でエレクトロポレートする;本発明において宿主細胞を形質転換するために用いる好ましい化学的方法。これらの細胞を25~40℃で30分~120分間、LBまたはSOC培地のような適切な培地において増殖させ、次いで選択培地ペトリ皿へ移して25~40℃に10~36時間おくと、本発明のポリヌクレオチドを含有する陽性コロニーが選択される。
ルリア-ベルタニ))、TB(Terrific Broth(テリフィックブロス))、SOB(Super Optimal Broth(超最適ブロス))、SOC(Super Optimal broth with catabolic repressor(異化抑制因子を含む超最適ブロス))、YTブロス(Yeast Extract and Tryptone(酵母エキスおよびトリプトン))、スーパーブロス(Super broth)、富栄養培地(rich media)、最少培地、無機培地などから選択できるが、これらに限定されない。培地の成分には下記のものが含まれるが、それらに限定されない:炭素源、たとえばグルコース、スクロースまたはグリセロール;有機窒素源、たとえばペプトン、トリプトン、アミノ酸、または酵母エキス;無機窒素源が用いられ、これは特にたとえばアンモニウム塩、アンモニア水、およびアンモニアガスから選択できる;補足成分、たとえば低レベルのアミノ酸、ビタミン、ペプトン類または他の成分を補足するもの。培地は当技術分野で既知の方法を用いて調製できる。
、CRM197は調節可能な誘導温度で誘導され、その際、誘導温度を10~20℃に維持した場合、発現CRM197のうち80%より多くが可溶性画分中に存在する。他の態様において、誘導温度を25~40℃に維持した場合、得られた発現CRM197のうち80%より多くが細胞質封入体(inclusion body)として不溶性画分中にあり、そこから可溶化工程後に、プールした細胞質画分から精製される。
よって、本発明は1より多い後続精製工程を伴い、イオン交換クロマトグラフィー工程ではCRM197のpI値も利用し、それにより他の混在タンパク質からそれを分離する。最後に、CRM197の量をBCA/ブラッドフォード/ローリー(BCA/Bradford/Lowry)アッセイにより定量し、10~12%アクリルアミドゲル(SDS-PAGE)で視覚化する。ポリペプチドの同定をウェスタンブロットおよび類似のイムノアッセイにより行なう。精製ポリペプチドの純度および統合性をSDS-PAGEおよびHPLC法により測定する。こうして発現したタンパク質の収量は500~1000mg/L(培地)であり、培養の添加物および条件ならびに精製工程の調節によりその後変動する可能性がある。本発明の方法は、誘導時間を調節し、その後クロマトグラフィー工程のpHおよび温度を調節する、工業的に適用できる方法をも提供し、簡単で低価格かつ労力を要しない方法を提供する。それは緩衝液またはそれのキットもしくは作業溶液の調製を伴う多大な工程の必要性を排除する。タグの除去に際して追加の緩衝液または塩類または酵素または装置を用意する必要がない。特定の態様において、精製CRM197ポリペプチドは既に第1メチオニンアミノ酸を欠如している;それの存在は最終CRM197タンパク質に望まれず、それの除去は追加の精製工程の必要性を伴う。こうして得られたポリペプチドは活性かつ自然形態である:それは第1アミノ酸としての望ましくないメチオニンを既に欠如しており、追加工程の必要性がない。CRM197アミノ酸配列をインシリコ/バイオインフォーマティクスツールにより分析し、そのタンパク質において約38.4%の疎水性を示した。CRM197の等電点は約5.81であることが認められた。CRM197タンパク質は4個のシステインアミノ酸残基および21個のプロリン残基を含んでいた。ポリペプチドのリフォールディングは、DNAに対するエンドヌクレアーゼ活性を測定することによる機能アッセイにより確認される。生物物理学的/二次構造確認を、ポリペプチドの円偏光二色性(Circular Dichroism)(CD)分析(図8)および示差走査蛍光測定(Differential Scanning Fluorimetry)(DSF)(図9)により行ない、市販のポリペプチド(Sigma Aldrich)と比較した。
酸配列をエドマン分解シーケンシングにより確認した(図7)。
a)ポリペプチドCRM197をコードする、遺伝子SEQ ID NO.2またはそのバリアントを選択し、
b)遺伝子SEQ ID NO.2を発現ベクター内へサブクローニングし、
c)工程bの発現ベクターで宿主大腸菌細胞を形質転換し、
d)形質転換した宿主細胞を、毒素タンパク質の発現に適した培地中で培養し、
e)誘導物質としてIPTGを添加して30~40℃の範囲の温度で融合タンパク質の発現を誘導し、
f)不溶性形態の細菌トキソイドを宿主細胞から抽出し、
g)純粋な形態のCRM197を0.5mg/lより多い収量で精製する。
めに使用する。
工程(i):新規CRM197遺伝子の合成:
全長CRM197遺伝子を大腸菌コドン利用に応じて最適化した。CRM197遺伝子最適化のために下記のパラメーターを用いた:コドン利用バイアス(Codon Usage Bias)、GC含量、mRNA二次構造、カスタム所望パターン(Custom Desired Pattern)、カスタム非所望パターン(Custom Undesired Pattern)、反復配列(直列反復(direct repeat)、
逆方向反復(inverted repeat)、2組反復(dyad repeat))、制限酵素認識部位(欠失または挿入)。
pUC57_CRM197を保有する大腸菌DH5αを50mlの体積のLB+カナマイシン中で一夜増殖させた。細菌を遠心し、ペレットをプラスミドの単離に用いた。プラスミドの単離は、Qiagenプラスミド微量調製キット(Qiagen plasmid mini-prep kit)により製造業者の指示を用いて行われた。単離したプラスミドをノノ-ドロップにより定量した。
kit)により製造業者の指示を用いて精製した。その後、5μgの発現プラスミドpTW
IN1を同様にBamHIおよびSapIで消化して、それにCRM197遺伝子と適合する制限部位を作製した。消化したpTWIN1を同様にQiagenゲル抽出キットにより製造業者の指示に従ってゲルから精製した。
殖しているこれら5クローンを選択し、10mlのルリアブロス+アンピシリン培地中、37℃、200rpmで一夜、増殖させた。培養物を遠心し、Qiagenプラスミド抽
出キットによりプラスミドを細胞ペレットから抽出した。
-80度で保存したBL21クローンをルリアブロス+アンピシリンプレートに画線した。プレートを37度で一夜インキュベートした。単一コロニーを採取し、150mlフラスコ内の50mlのルリアブロス+アンピシリン培地に接種した。フラスコを37度、200RPMで、OD600=1までインキュベートした。ODが目標点に達すると、5mlの培養物を取り出し、それを非誘導培養として用いた。非誘導培養を使用時まで氷上で維持した。CRM197遺伝子の発現を誘導するために、0.5mMのIPTGを残り45mlの培養物に添加し、さらにフラスコを30度および200rpmの旋回でさらに4時間インキュベートした。4時間後に誘導培養物を収穫し、CRM197の発現をSDS-PAGE(図1)およびウェスタンブロット(図2)により調べた。
1mlバイアルのBL21大腸菌細胞を50mlのLB+アンピシリン培地に接種し、37度、200rpmで一夜増殖させた。発酵を20L規模で行なった。大腸菌細胞を発酵槽に接種し、30℃で培養した。培養物を0.5mMのIPTGによりOD600=20で誘導した。誘導の12時間後、発酵培養物を収穫し、遠心により細胞ペレットを調製した。細胞ペレットをホモジナイザー内で機械的に細胞溶解した。封入体(目的タンパク質CRM197を内封している)を細胞溶解物の遠心により単離した。上清を廃棄し、封入体(IB)を含むペレットを保存した。8M尿素にペレットを再懸濁することによりIBをホモジナイズし、イオン交換クロマトグラフィーによりタンパク質を精製した。発酵レベルのCRM197の量を測定した。全細胞溶解物を基準としての既知量のBSAと一緒にSDS-PAGE上で泳動させた。SDS-PAGEにおいて約58KDバンドとして現われたCRM197(図3)の量をデンシトメトリー分析により定量した。BSAを定量のための基準として用いた。タンパク質の総量は1.4グラムのCRM197/リットル(BL21大腸菌細胞)であることが認められた。
前記で作製したCRM197の一次アミノ酸配列はペプチド質量フィンガープリント(質量分析)により判定され、基準CRM197配列との100%配列類似性を備えていた(図6);
A.BE rCRMの消化物(peptic digest)をLC-MSにより分析したもの;
B.トリプシン、Glu-CおよびAsp-N消化したCRM197における配列カバレージ(SEQ ID NO.1と同一、すなわち100%の相同性を示す)。
本発明の態様は、下記の態様も含まれる。
態様1
SEQ ID NO.2を含む最適化したポリヌクレオチド配列、およびその最適化したポリヌクレオチド配列SEQ ID NO.2に対して少なくとも70%相同であるそれのバリアント。
態様2
SEQ ID NO.2を含む最適化したポリヌクレオチド配列、およびその最適化したポリヌクレオチド配列SEQ ID NO.2に対して少なくとも70~88%相同であるそれのバリアント。
態様3
SEQ ID NO.3、4、5、6、7、8、9、10から選択される、態様1および2に記載のSEQ ID NO.2のバリアント。
態様4
a)本質的にSEQ ID NO.2からなる最適化したポリヌクレオチド配列またはSEQ ID NO.2に対して少なくとも70%相同であるそれのバリアントを選択し、
b)場合により工程(a)のポリヌクレオチド配列を適切なベクター内へライゲートさせ、
c)そのポリヌクレオチド配列を大腸菌(Escherichia coli)宿主細胞に挿入または形質転換し、
d)形質転換した宿主細胞を、ポリペプチドの高レベル発現のための培地中で培養し、
e)誘導温度10~40℃を維持してポリペプチドを産生させ、
f)細菌ポリペプチドを宿主細胞から抽出し、次いで精製して、純粋なポリペプチドを高収率で得る
工程を含む、ポリペプチドの製造方法。
態様5
適切なベクターが、pET9a、pET3a、pET3b、pET3c、pET5a、pET5b、pET5c、pET9b、pET9c、pET12a、pTWIN1、pTWIN2、pET12b、pET12c、pET17bから選択されるプラスミドベクターである、態様4に記載の方法。
態様6
大腸菌株が、BL21(DE3)、BL21 A1、HMS174(DE3)、DH5α、W3110、B834、origami、Rosetta、NovaBlue(DE3)、Lemo21(DE3)、T7、ER2566およびC43(DE3)から選択される、態様4に記載の方法。
態様7
CRM 197 の収量が、約0.1g/l、0.25g/L、0.5g/L、約1g/L、約1.5g/L、約2g/L、約2.5g/L、約3g/L、約3.5g/L、約4g/L、約4.5g/L、約4.5g/L、約5g/Lである、態様4に記載の方法。
態様8
ペリプラズム間隙内へ指向する輸送のためのヘテロロガス配列なしに、ポリヌクレオチドの発現に適した誘導温度を付与することによりペリプラズム発現が引き起こされる、態様4に記載の方法。
態様9
誘導温度が10℃から40℃までの範囲である、態様8に記載の方法。
態様10
ポリペプチドがキャリヤータンパク質である、態様4に記載の方法。
態様11
キャリヤータンパク質がジフテリア毒素変異体CRM 197 である、態様10に記載のキャリヤータンパク質。
態様12
CRM 197 を、腸チフス菌(Salmonella typhi)、パラチフス菌(Salmonella paratyphi)、肺炎球菌(Pneumococcus)、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)、髄膜炎菌(Meningococcus)、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)および他の病原性細菌から単
離された多糖分子とコンジュゲートさせた、前記態様のいずれかに記載のCRM 197 。
態様13
CRM 197 を、ワクチン、例えば、腸チフス菌(Salmonella typhi)、パラチフス菌(Salmonella paratyphi)、肺炎球菌(Pneumococcus)、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)、髄膜炎菌(Meningococcus)、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)および他
の病原性細菌に対するワクチンのためのコンジュゲートしたキャリヤーとして使用する、前記態様のいずれかに記載のCRM 197 。
Claims (11)
- SEQ ID NO.2に記載されている配列を有する交差反応性物質197(CRM197)をコードするコドン最適化ポリヌクレオチド。
- a)SEQ ID NO.2に記載されている配列を有する最適化ポリヌクレオチドを選択し、
b)工程(a)のポリヌクレオチドを適切なベクター内へライゲートさせ、
c)その最適化ポリヌクレオチドを大腸菌(Escherichia coli)宿主細胞に挿入または形質転換し、
d)形質転換した宿主細胞を、CRM197の高レベル発現のための培地中で培養し、
e)誘導温度10~40℃を維持してCRM197を産生させ、
f)CRM197を宿主細胞から抽出し、次いで精製して、純粋なCRM197を高収率で得る
工程を含む、CRM197の製造方法。 - 適切なベクターが、pET9a、pET3a、pET3b、pET3c、pET5a、pET5b、pET5c、pET9b、pET9c、pET12a、pTWIN1、pTWIN2、pET12b、pET12c、pET17bから選択されるプラスミドベクターである、請求項2に記載の方法。
- 大腸菌株が、BL21(DE3)、BL21 A1、HMS174(DE3)、DH5α、W3110、B834、origami、Rosetta、NovaBlue(DE3)、Lemo21(DE3)、T7、ER2566およびC43(DE3)から選択される、請求項2に記載の方法。
- CRM197の収量が、0.1g/Lである、請求項2に記載の方法。
- CRM197の収量が、0.25g/Lである、請求項2に記載の方法。
- CRM197の収量が、0.5g/Lである、請求項2に記載の方法。
- CRM197の収量が、1g/Lである、請求項2に記載の方法。
- CRM197の収量が、1.5g/Lである、請求項2に記載の方法。
- ペリプラズム間隙内へ指向する輸送のためのヘテロロガス配列なしに、ポリヌクレオチドの発現に適した誘導温度を付与することによりペリプラズム発現が引き起こされる、請求項2に記載の方法。
- 誘導温度が10℃から40℃までの範囲である、請求項10に記載の方法。
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