JP7021762B2 - Kallikrein-related peptidase production promoter, LEKTI production promoter, SLPI production promoter, keratinization normalizer, corneodesmosome degradation normalizer - Google Patents
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Description
本発明は、カリクレイン関連ペプチターゼ、ＬＥＫＴＩ、ＳＬＰＩの産生を促進し、コルネオデスモソーム分解を正常化し、ひいては角化を正常化する製剤に関する。 The present invention relates to a pharmaceutical product that promotes the production of kallikrein-related peptidases, LEKTI, SLPI, normalizes corneodesmosome degradation, and thus normalizes keratinization.
表皮は、基底層の細胞***からはじまり、 有棘層、顆粒層を経て角質層に達する。
角質細胞は、セラミド等の角質細胞間脂質よる水分保持機能も重要な要因であるが、斑状に分布するコルネオデスモソームによってお互いに接着することにより層状構造が維持され、角層としての統合性が保たれている。
そして、新しい細胞よって、徐々に角層表層に押し出され、角層上層へ移動するとに従ってステロイドスルファターゼやリパーゼにより角層細胞間脂質が分解され、ついでコルネオデスモソームがプロテアーゼの働きによって徐々に分解され、細胞間接着が弱くなり、最終的には角質は剥離、脱落する。
しかしながら、乾燥、紫外線、化学物質等の外的要因及び酸化ストレスや加齢などの内的要因により、表皮のバリア機能が低下することが知られており、これらの要因により表皮のターンオーバーが低下することも知られている。
その１つにコルネオデスモソームの分解が遅延し、細胞間接着が弱くならずに、角質の剥離、脱落が正常に行われない場合がある。(角層肥厚)
The epidermis begins with cell division in the basal layer, passes through the stratum spinosum and the stratum granulosum, and reaches the stratum corneum.
The water retention function of corneocytes by intercorneocyte lipids such as ceramide is also an important factor, but the layered structure is maintained by adhering to each other by the corneodesmosomes distributed in a patch pattern, and the integrity as a stratum corneum is maintained. It's dripping.
Then, it is gradually pushed out to the surface layer of the stratum corneum by new cells, and as it moves to the upper layer of the stratum corneum, the intercellular lipids in the stratum corneum are decomposed by steroid sulfatase and lipase, and then the corneodesmosome is gradually decomposed by the action of protease, and the cells are gradually decomposed. The inter-adhesion weakens, and eventually the keratin peels off and falls off.
However, it is known that the barrier function of the epidermis is reduced by external factors such as dryness, ultraviolet rays, chemical substances, and internal factors such as oxidative stress and aging, and these factors reduce the turnover of the epidermis. It is also known to do.
One of them is that the degradation of Corneodesmosome is delayed, the cell-cell adhesion is not weakened, and the exfoliation and shedding of keratin may not be performed normally. (Thickening of the stratum corneum)
コルネオデスモソームを分解するプロテアーゼにカリクレイン関連ペプチターゼ５（ＫＬＫ５）、カリクレイン関連ペプチターゼ７（ＫＬＫ７）があり、これらのセリンプロテアーゼがデスモグレイン１、コルネオデスモシンおよびデスモコリン１等を分解する。
すなわち、カリクレイン関連ペプチターゼ５、カリクレイン関連ペプチターゼ７の産生が低下すると角質の剥離、脱落がうまくいかない。
このため、カリクレイン関連ペプチターゼ５、カリクレイン関連ペプチターゼ７の産生を促進することは皮膚のターンオーバーを促進するための重要な因子である。
しかし、カリクレイン関連ペプチターゼ５、カリクレイン関連ペプチターゼ７が過剰に産生すると異常な落屑が発生するおそれがある。さらには、カリクレイン関連ペプチターゼ７が２種の脂質プロセシング酵素であるβ－グルコセレブロシダーゼおよび酸性スフィンゴミエリナーゼを分解することがわかった。
また、カリクレイン関連ペプチターゼ５、カリクレイン関連ペプチターゼ７は、ＬＥＫＴＩ（Lympho-epithelial Kazal-type-related inhibitor）、ＳＬＰＩ（Secretory Leukocyte-Protease Inhibitor）によって、活性化が制限されバランスをとっている。
以上のように、加齢等で産生が低下したカリクレイン関連ペプチターゼ５、カリクレイン関連ペプチターゼ７の産生を促進するとともに、これを阻害するＬＥＫＴＩ、ＳＬＰＩの産生も同時に上昇させることが、コルネオデスモソームの分解を正常化し、ひいては角化も正常化する。（特許文献１、非特許文献１）
皮膚角化以外では、ＳＬＰＩ産生促進剤は、気道閉塞症の改善剤、間質性肺炎の治療剤、レトロウイルス感染を予防または治療、熱傷後瘢痕、肥厚性瘢痕及びケロイドを治療等に応用されている。（特許文献２～５）
ＬＥＫＴＩ産生促進剤は、抗炎症性、ネザートン症候群、魚鱗癬等に有効であることが知られている。
Proteases that degrade corneodesmosomes include kallikrein-related peptidase 5 (KLK5) and kallikrein-related peptidase 7 (KLK7), and these serine proteases degrade desmoglein 1, corneodesmocollin, desmocollin 1, and the like.
That is, when the production of kallikrein-
Therefore, promoting the production of kallikrein-
However, excessive production of kallikrein-
Further, the activation of kallikrein-
As described above, promoting the production of kallikrein-
Other than skin keratinization, SLPI production promoters are applied to improve airway obstruction, treat interstitial pneumonia, prevent or treat retroviral infections, treat post-burn scars, hypertrophic scars and keloids, etc. ing. (Patent Documents 2 to 5)
The LEKTI production promoter is known to be effective for anti-inflammatory, Netherton syndrome, ichthyosis and the like.
エイジツ（営実）は、ノイバラ(Rosa multiflora)の果実で、古くより漢方薬として知られ、瀉下薬、利尿薬にとして利用されてきた。
さらに毛髪化粧料、くすみ防止用皮膚外用剤、エラスターゼ阻害剤、セラミド産生促進剤としても知られている。（特許文献６～９）。
Agetsu is a fruit of Rosa multiflora, which has been known as a Chinese herbal medicine for a long time and has been used as a laxative and a diuretic.
It is also known as a hair cosmetic, an external skin agent for preventing dullness, an elastase inhibitor, and a ceramide production promoter. (Patent Documents 6 to 9).
ヨモギは（学名：Artemisia indica 又はArtemisia princeps ）、ニガヨモギ（Artemisia absinthium）、モウコヨモギ（Artemisia mongolia)の葉または全草を乾燥したもので、止血、鎮痛、下痢止め等に効く生薬（艾葉と称される）として用いられてきた。さらに保湿性、吸湿性、クローディン産生促進剤、オクルディン産生促進等に効果のある化粧料の原料として、さらに抗かゆみ外用、血液粘性低下剤、グリケーション阻害剤としても用いられている。（特許文献１０～１４） Mugwort (scientific name: Artemisia indica or Artemisia princeps), wormwood (Artemisia absinthium), wormwood (Artemisia mongolia) leaves or whole plants are dried, and are called wormwood, which is effective for stopping blood, pain relief, and diarrhea. ) Has been used. Further, it is used as a raw material for cosmetics effective in moisturizing, hygroscopicity, claudin production promoting agent, occludin production promoting, etc., and also as an anti-itch external use, blood viscosity reducing agent, and glycation inhibitor. (Patent Documents 10 to 14)
紅茶は、茶（Camellia sinensis）の葉を原料とし、摘み取った茶葉を発酵させたものである。
勿論飲用が主な用途であるが、プラーク形成阻害剤、メラニン生成抑制剤、アレルゲン不活性化剤、ＯＰＨ活性増強剤等の用途も知られている。（特許文献１５～１８参照）
Black tea is made from tea (Camellia sinensis) leaves and fermented picked tea leaves.
Of course, it is mainly used for drinking, but it is also known to be used as a plaque formation inhibitor, a melanin production inhibitor, an allergen inactivating agent, an OPH activity enhancer and the like. (See Patent Documents 15-18)
本発明の目的はカリクレイン関連ペプチターゼ、ＬＥＫＴＩ、ＳＬＰＩの産生を促進し、コルネオデスモソーム分解を正常化し、角層肥厚やターンオーバーの遅延の抑制等の角化を正常化する製剤を得ることにある。 An object of the present invention is to obtain a preparation that promotes the production of kallikrein-related peptidases, LEKTI, SLPI, normalizes the degradation of corneodesmosomes, and normalizes keratinization such as suppression of stratum corneum thickening and delay of turnover.
本発明者らが鋭意検討した結果、エイジツの抽出物、ヨモギの抽出物、紅茶の抽出物が上記目的を達することがわかった。
桂皮物、牛蒡、芍薬は、必要に応じて乾燥した後、抽出効率を考えると、細切、粉砕等の処理を行った後に抽出する。
乾燥は天日で行ってもよいし、通常使用される乾燥機を用いて行ってもよい。
前記抽出に用いる溶媒としては、水若しくは親水性有機溶媒又はこれらの混合液を用いる。
前記抽出溶媒として使用し得る水としては、例えば、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等の他、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、ろ過、イオン交換、浸透圧の調整、緩衝化等が含まれる。従って、本発明において抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。
前記親水性有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１～５の低級アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３－ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２～５の多価アルコールなどが挙げられ、これら親水性有機溶媒と水との混合溶媒などを用いることができる。
なお、前記水と親水性有機溶媒との混合溶媒を使用する場合には、低級アルコールの場合は水１０質量部に対して１～２０質量部、低級脂肪族ケトンの場合は水１０質量部に対して１～１５質量部添加することが好ましい。多価アルコールの場合は水１０質量部に対して１～２０質量部添加することが好ましい。
As a result of diligent studies by the present inventors, it was found that the extract of agetsu, the extract of mugwort, and the extract of black tea achieve the above-mentioned object.
Cinnamon bark, burdock root, and peony are extracted after being dried as necessary and then subjected to treatments such as shredding and crushing in consideration of extraction efficiency.
Drying may be carried out in the sun or by using a commonly used dryer.
As the solvent used for the extraction, water, a hydrophilic organic solvent, or a mixed solution thereof is used.
The water that can be used as the extraction solvent includes, for example, pure water, tap water, well water, mineral spring water, mineral water, hot spring water, spring water, fresh water, and the like, as well as those subjected to various treatments. Treatments applied to water include, for example, purification, heating, sterilization, filtration, ion exchange, osmotic pressure adjustment, buffering and the like. Therefore, the water that can be used as the extraction solvent in the present invention includes purified water, hot water, ion-exchanged water, physiological saline, phosphate buffer, phosphate buffered saline and the like.
Examples of the hydrophilic organic solvent include lower alcohols having 1 to 5 carbon atoms such as methanol, ethanol, propyl alcohol and isopropyl alcohol; lower aliphatic ketones such as acetone and methyl ethyl ketone; 1,3-butylene glycol and propylene glycol. Examples thereof include polyhydric alcohols having 2 to 5 carbon atoms such as glycerin, and a mixed solvent of these hydrophilic organic solvents and water can be used.
When a mixed solvent of the water and a hydrophilic organic solvent is used, the amount of lower alcohol is 1 to 20 parts by mass with respect to 10 parts by mass of water, and the amount of lower aliphatic ketone is 10 parts by mass of water. On the other hand, it is preferable to add 1 to 15 parts by mass. In the case of polyhydric alcohol, it is preferable to add 1 to 20 parts by mass with respect to 10 parts by mass of water.
抽出に使用する有機溶媒の量は、原料となる植物に対して望ましくは５～１００倍量程度、さらに望ましくは１０～５０倍量程度が良い。さらに抽出効率を上げるため、抽出溶媒中で撹拌やホモジナイズしてもよい。抽出温度としては、５℃程度から抽出溶媒の沸点以下の温度とするのが適切である。抽出時間は抽出溶媒の種類や抽出温度によっても異なるが、１時間～１４日間程度とするのが適切である。
尚、抽出操作は１回のみの操作に限定されるものではない。抽出後の残渣に再度新鮮な溶媒を添加し、抽出操作を施すこともできるし、抽出溶媒を複数回抽出原料に接触させることも可能である。
本発明者らが検討した結果、本発明の効果を発揮する物質は、水にも、８０％のエタノール抽出されるので、ある程度精製する場合は、水で抽出したのち、不溶物を取り除き、等量～５倍量のエタノールを加えてさらに抽出するとよいこともわかった。
必要ならば、その効果に影響のない範囲で更に脱臭、脱色等の精製処理を加えても良く、エバポレーターのような減圧濃縮装置や加熱による溶媒除去などにより、濃縮することができる。
また、この抽出物を合成吸着剤（ダイアイオンＨＰ２０やセファビースＳＰ８２５、アンバーライトＸＡＤ４、ＭＣＩｇｅｌＣＨＰ２０Ｐ等）やデキストラン樹脂（セファデックスＬＨ－２０など）、限外濾過等を用いてさらに精製することも可能である。
The amount of the organic solvent used for extraction is preferably about 5 to 100 times, more preferably about 10 to 50 times the amount of the plant as a raw material. In order to further increase the extraction efficiency, stirring or homogenization may be performed in the extraction solvent. It is appropriate that the extraction temperature is from about 5 ° C. to a temperature equal to or lower than the boiling point of the extraction solvent. The extraction time varies depending on the type of extraction solvent and the extraction temperature, but it is appropriate to set it to about 1 hour to 14 days.
The extraction operation is not limited to a one-time operation. A fresh solvent can be added again to the residue after extraction to perform an extraction operation, or the extraction solvent can be brought into contact with the extraction raw material multiple times.
As a result of the examination by the present inventors, 80% ethanol is extracted from water as a substance exhibiting the effect of the present invention. Therefore, when purifying to some extent, after extracting with water, the insoluble matter should be removed, etc. It was also found that further extraction should be performed by adding 5 times the amount of ethanol.
If necessary, further purification treatment such as deodorization and decolorization may be added within a range that does not affect the effect, and the concentration can be achieved by a vacuum concentrator such as an evaporator or solvent removal by heating.
Further, this extract can be further purified using a synthetic adsorbent (Diaion HP20, Sephadex SP825, Amberlite XAD4, MCIgelCHP20P, etc.), dextran resin (Sephadex LH-20, etc.), ultrafiltration, etc. be.
本発明の製剤は、経口、注射、外用のいずれでも薬効を発現するが、皮膚外用剤として用いるのが好ましい。皮膚外用剤には、皮膚化粧料、外用医薬部外品、医療用皮膚外用剤が含まれる。
これらの抽出物の製剤への配合量は固形分として、０．０００００１～１０．０重量％、好ましくは０．００００１～３．０重量％、さらに好ましくは０．００００５～１．０重量％である。
Although the pharmaceutical product of the present invention exerts a medicinal effect by oral, injectable or external use, it is preferably used as a skin external preparation. External skin preparations include skin cosmetics, quasi-drugs for external use, and external external preparations for medical use.
The amount of these extracts to be added to the formulation is 0.000001 to 10.0% by weight, preferably 0.00001 to 3.0% by weight, more preferably 0.00005 to 1.0% by weight as a solid content. be.
また、本発明の製剤には、上記成分の他に医薬品や化粧品の各種製剤において使用されている界面活性剤、油性成分、保湿剤、高分子化合物、紫外線吸収剤、抗炎症剤、殺菌剤、酸化防止剤、金属イオン封鎖剤、防腐剤、ビタミン類、色素、香料、水等を配合することができる。 In addition to the above-mentioned ingredients, the formulations of the present invention include surfactants, oily ingredients, moisturizers, polymer compounds, ultraviolet absorbers, anti-inflammatory agents, and bactericidal agents used in various pharmaceutical and cosmetic formulations. Antioxidants, metal ion blockers, preservatives, vitamins, pigments, fragrances, water and the like can be blended.
上記界面活性剤としては、アニオン性、カチオン性、非イオン性、天然、合成のいずれの界面活性剤も使用できるが、皮膚に対する刺激性を考慮すると非イオン性のものを使用することが好ましい。非イオン性界面活性剤としては、例えばグリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、アルキルグリコシド等が挙げられる。 As the above-mentioned surfactant, any of anionic, cationic, nonionic, natural and synthetic surfactants can be used, but it is preferable to use nonionic surfactants in consideration of skin irritation. Examples of the nonionic surfactant include glycerin fatty acid ester, propylene glycol fatty acid ester, sorbitan fatty acid ester, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, polyoxyethylene sorbit fatty acid ester, polyoxyethylene alkyl ether, and polyoxyethylene polyoxypropylene glycol. , Polyoxyethylene polyoxypropylene alkyl ether, polyethylene glycol fatty acid ester, polyoxyethylene castor oil, polyoxyethylene hydrogenated castor oil, alkyl glycoside and the like.
油性成分としては、油脂類、ロウ類、炭化水素類、高級脂肪酸類、高級アルコール類、エステル類、精油類、シリコーン油類などを挙げることができる。油脂類としては、例えば大豆油、ヌカ油、ホホバ油、アボガド油、アーモンド油、オリーブ油、カカオ油、ゴマ油、パーシック油、ヒマシ油、ヤシ油、ミンク油、牛脂、豚脂等の天然油脂、これらの天然油脂を水素添加して得られる硬化油及びミリスチン酸グリセリド、２－エチルヘキサン酸トリグリセリド等の合成トリグリセリド等が；ロウ類としては、例えばカルナバロウ、鯨ロウ、ミツロウ、ラノリン等が；炭化水素類としては、例えば流動パラフィン、ワセリン、パラフィンマイクロクリスタリンワックス、セレシン、スクワラン、ブリスタン等が；高級脂肪酸類としては、例えばラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘニン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ラノリン酸、イソステアリン酸等が；高級アルコール類としては、例えばラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール、ラノリンアルコール、コレステロール、２－ヘキシルデカノール等が；エステル類としては、例えばオクタン酸セチル、オクタン酸トリグリセライド、乳酸ミリスチル、乳酸セチル、ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸ミリスチル、ミリスチン酸オクチルドデシル、パルミチン酸イソプロピル、アジピン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、オレイン酸デシル、イソステアリン酸コレステロール、ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル等が；精油類としては、例えばハッカ油、ジャスミン油、ショウ脳油、ヒノキ油、トウヒ油、リュウ油、テレピン油、ケイ皮油、ベルガモット油、ミカン油、ショウブ油、パイン油、ラベンダー油、ベイ油、クローブ油、ヒバ油、バラ油、ユーカリ油、レモン油、タイム油、ペパーミント油、ローズ油、セージ油、メントール、シネオール、オイゲノール、シトラール、シトロネラール、ボルネオール、リナロール、ゲラニオール、カンファー、チモール、スピラントール、ピネン、リモネン、テルペン系化合物等が；シリコーン油類としては、例えばジメチルポリシロキサン等が挙げられる。これら上述の油性成分は一種又は二種以上を組み合わせて使用することができる。本発明においては、このうち特にミリスチン酸グリセリド、２－エチルヘキサン酸トリグリセリド、ラノリン、流動パラフィン、ワセリン、パラフィンマイクロクリスタリンワックス、スクワラン、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸、イソステアリン酸、セチルアルコール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール、コレステロール、オクタン酸セチル、オクタン酸トリグリセライド、ミリスチレン酸イソプロピル、ミリスチン酸オクチルドデシル、イソステアリン酸コレステロール、ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル、ハッカ油、トウヒ油、ケイ皮油、ローズ油、メントール、シネオール、オイゲノール、シトラール、シトロネラール、ゲラニオール、ピネン、リモネン、ジメチルポリシロキサンを使用することが好ましい。 Examples of the oily component include fats and oils, waxes, hydrocarbons, higher fatty acids, higher alcohols, esters, essential oils, silicone oils and the like. Examples of oils and fats include soybean oil, nuka oil, jojoba oil, avocado oil, almond oil, olive oil, cacao oil, sesame oil, persic oil, castor oil, palm oil, minced oil, beef oil, pork oil and other natural oils and fats. Hardened oil obtained by hydrogenating natural fats and oils from Japan and synthetic triglycerides such as myristic acid glyceride and 2-ethylhexanoic acid triglyceride; Examples of waxes include carnauba wax, whale wax, beeswax, lanolin and the like; hydrocarbons. Examples include liquid paraffin, vaseline, paraffin microcrystalin wax, selecin, squalane, bristan, etc .; and higher fatty acids include, for example, lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, behenic acid, oleic acid, linoleic acid, etc. Linolenic acid, lanolinic acid, isostearic acid and the like; higher alcohols include, for example, lauryl alcohol, cetyl alcohol, stearyl alcohol, oleyl alcohol, lanolin alcohol, cholesterol, 2-hexyldecanol and the like; esters include, for example, cetyl octanate. , Octanoic acid triglyceride, myristyl lactate, cetyl lactate, isopropyl myristate, myristyl myristate, octyldodecyl myristate, isopropyl palmitate, isopropyl adipate, butyl stearate, decyl oleate, cholesterol isostearate, POE sorbit fatty acid ester, etc. The essential oils include, for example, peppermint oil, jasmine oil, show brain oil, hinoki oil, peppermint oil, ryu oil, terepine oil, calyx skin oil, bergamot oil, orange oil, shove oil, pine oil, lavender oil, and bay oil. , Clove oil, hiba oil, rose oil, eucalyptus oil, lemon oil, thyme oil, peppermint oil, rose oil, sage oil, menthol, cineole, eugenol, citral, citroneral, borneol, linalol, geraniol, camphor, timole, spirantol, Pinen, limonene, terpene-based compounds and the like; Examples of silicone oils include dimethylpolysiloxane and the like. These above-mentioned oily components can be used alone or in combination of two or more. In the present invention, among these, myristic acid glyceride, 2-ethylhexanoic acid triglyceride, lanolin, liquid paraffin, vaseline, paraffin microcrystalin wax, squalane, lauric acid, myristic acid, palmitic acid, linolenic acid, linolenic acid, isostearic acid. , Cetyl alcohol, stearyl alcohol, oleyl alcohol, cholesterol, cetyl octanate, triglyceride octanate, isopropyl myristyrene, octyldodecyl myristate, cholesterol isostearate, POE sorbit fatty acid ester, peppermint oil, peppermint oil, coconut skin oil, rose It is preferable to use oil, menthol, cineole, eugenol, citral, citronellal, geraniol, pinen, linolenic acid, dimethylpolysiloxane.
本発明の製剤には、さらに下記のような成分を配合することができるが、その成分もこれらに限定されるものではない。
色素類；黄色４号、青色１号、黄色２０２号等の厚生省令に定められたタール色素別表Ｉ及びIIの色素、クロロフィル、リボフラビン、クロシン、紅花、アントラキノン等の食品添加物として認められている天然色素等。
ビタミン類；ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ等。
その他；殺菌剤、防腐剤、その他製剤上必要な成分等。
The following components can be further added to the pharmaceutical product of the present invention, but the components are not limited thereto.
Pigments; Tar dyes specified in the Ordinance of the Ministry of Health and Welfare such as Yellow No. 4, Blue No. 1, Yellow No. 202, etc. Approved as food additives such as pigments in Appendix I and II, chlorophyll, riboflavin, crocin, safflower, anthraquinone, etc. Natural pigments, etc.
Vitamins; Vitamin A, Vitamin C, Vitamin D, Vitamin E, etc.
Others; bactericides, preservatives, other ingredients necessary for formulation, etc.
本発明の製剤は、前記必須成分に必要に応じて前記任意成分を加え、常法に従って製造することができる。 The pharmaceutical product of the present invention can be produced according to a conventional method by adding the optional ingredient to the essential ingredient as needed.
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。 Next, the present invention will be described in detail with reference to examples.
実施例１
エイジツ（乾燥物、細断品）を３０ｇに５０％（Ｖ/Ｖ）エタノール水溶液２リッターを加え、ときどき撹拌しながら、２４時間抽出後、濾過（Ｎｏ５Ｃ）し、これをエバポレートした後、凍結乾燥した。
Example 1
Add 2 liters of 50% (V / V) ethanol aqueous solution to 30 g of Agetsu (dried product, shredded product), extract for 24 hours with occasional stirring, filter (No5C), evaporate this, and then freeze-dry. did.
実施例２
ヨモギの葉（乾燥物、細断品）を３０ｇに５０％（Ｖ/Ｖ）エタノール水溶液２リッターを加え、ときどき撹拌しながら、２４時間抽出後、濾過（Ｎｏ５Ｃ）し、これをエバポレートした後、凍結乾燥した。
Example 2
Add 2 liters of 50% (V / V) ethanol aqueous solution to 30 g of mugwort leaves (dried product, shredded product), extract for 24 hours with occasional stirring, filter (No5C), and evaporate this. Freeze-dried.
実施例３
紅茶（乾燥物、細断品）を３０ｇに３０％（Ｖ/Ｖ）エタノール水溶液２リッターを加え、ときどき撹拌しながら、２４時間抽出後、濾過（Ｎｏ５Ｃ）し、エバポレートしたのち、これを凍結乾燥した。
Example 3
Add 2 liters of 30% (V / V) ethanol aqueous solution to 30 g of black tea (dried product, shredded product), extract for 24 hours with occasional stirring, filter (No5C), evaporate, and then freeze-dry. did.
確認試験
２継代目のヒト***由来表皮細胞（クラボウ）を５０－７０％コンフルエントとなるようＨｕＭｅｄｉａ－ＫＧ２培地（フェノールレッド不含）で培養後、前日にカルシウム濃度を１．８ｍＭに変更したＨｕＭｅｄｉａ－ＫＧ２培地に、実施例を添加し、３７℃、５％ＣＯ2インキュベータ中で２日間培養した。
Confirmation test After culturing the second-stage human capsule-derived epidermal cells (Kurabou) in HuMedia-KG2 medium (without phenol red) so as to be 50-70% confluent, the calcium concentration was changed to 1.8 mM the day before. Examples were added to KG2 medium and cultured at 37 ° C. in a 5% CO2 incubator for 2 days.
＜ＲＮＡの抽出＞
細胞からの Ｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出は、トリプシン／ＥＤＴＡで剥離後、illustra RNA Mini RNA Isolation Kit（GE Healthcare社）を用い、GE Healthcare社の添付マニュアルに従い調製した。ＲＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ１０００（Ｔｈｅｒｍｏ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を用い算出した。
<RNA extraction>
Extraction of Total RNA from cells was prepared according to the attached manual of GE Healthcare using the illustra RNA Mini RNA Isolation Kit (GE Healthcare) after exfoliation with trypsin / EDTA. RNA concentration was calculated using NanoDrop1000 (Thermo SCIENTIFIC).
＜ＲＴ反応およびリアルタイムＰＣＲ＞
２．５μｇのＴｏｔａｌ ＲＮＡを使い、ＭＭＬＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＲＮａｓｅＨ－（東洋紡社）を用い、東洋紡社推奨プロトコール（ＴＯＹＯＢＯ ＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬＳ ＦＯＲ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥ ２００８／２００９のページ１－４２）に従いＲＴ反応を行なった。
リアルタイムＰＣＲはＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ リアルタイムＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを用い、以下のように実施した。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ法を用い（ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ，東洋紡社）、７５００ リアルタイムＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍの操作マニュアル（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ＣＴ（△△ＣＴ）法（ｎ＝３）により遺伝子発現比較を実施した。内部標準としてＧＡＰＤＨを使用した。
なお、対象遺伝子はカリクレイン関連ペプチターゼ５（ＫＬＫ５）、カリクレイン関連ペプチターゼ７（ＫＬＫ７）、ＬＥＫＴＩ、ＳＬＰＩである。
<RT reaction and real-time PCR>
An RT reaction was performed using 2.5 μg of Total RNA, using MMLV Reverse Transcriptase RNase H- (Toyobo), and according to the Toyobo recommended protocol (TOYOBO BIOCHEMICALS FOR LIFE SCIENCE, page 1-42).
Real-time PCR was performed using Applied Biosystems 7500 real-time PCR System as follows. Genes expressed by the Comparative CT (△△ CT) method (n = 3) using the SYBR Green method (THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix, Toyobo) and the 7500 real-time PCR system operating manual (Applied Biosystems). GAPDH was used as the internal standard.
The target genes are kallikrein-related peptidase 5 (KLK5), kallikrein-related peptidase 7 (KLK7), LEKTI, and SLPI.
確認試験の結果を図１に示す。
実施例１、実施例２及び実施例３いずれもカリクレイン関連ペプチターゼ５、カリクレイン関連ペプチターゼ７、ＬＥＫＴＩ、ＳＬＰＩの遺伝子発現量をコントロールに比較して大幅に促進した。
The results of the confirmation test are shown in FIG.
In each of Example 1, Example 2 and Example 3, the gene expression levels of kallikrein-related
また、実施例を配合した外用剤を作成し、実際に使用してみた結果、角層肥厚やターンオーバーの促進に効果があった。
In addition, as a result of preparing an external preparation containing the examples and actually using it, it was effective in promoting thickening of the stratum corneum and turnover.
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