JP2018002703A - Psoriasin production promoter - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ソラヤシンの産生を促進する製剤に関する。 The present invention relates to a preparation that promotes the production of solayacin.
皮膚は体の最も外側に存在しており、細菌などの外界からの刺激に対するバリアとなっている。皮膚は、角質細胞が基底細胞から有棘細胞、顆粒細胞、さらには角層細胞へと約４週間かけて変化（角化）し、これらの細胞中で細胞間脂質やＮＭＦ、さらにはコーニファイドエンベローブを形成することによってバリア機能を成し遂げている。しかし老化等によってこの角化の速度が低下すると、皮膚のくすみや肌荒れなどを引き起こすことが知られている。そのため皮膚の角化を促進する角化促進剤が開発されてきた。例えば、皮膚の角化とともにコーニファイドエンベローブの成分として生成されるタンパク質であるソラヤシン（＝Ｓ１００Ａ７）の発現量を指標として、このソラヤシン発現が増強される物質を研究した結果、酪酸またはその誘導体、およびカルシウムイオン供給化合物を含有する皮膚角化促進剤が知られている（特許文献１〜２）。
ソラヤシン（Ｓ１００Ａ７）は、乾癬の皮膚に過剰発現している分泌タンパク質として最初に同定されたタンパク質であり多くの炎症性疾患においても、過剰発現が確認されている。またソラヤシン（Ｓ１００Ａ７）は、体の表面でバクテリアを殺す働きがある。従って抗菌タンパク質であることが明らかとなっている。
The skin exists on the outermost side of the body and is a barrier against external stimuli such as bacteria. In the skin, keratinocytes changed from basal cells to spinous cells, granule cells, and horny cells over about 4 weeks (keratinization), and intercellular lipids, NMF, and cornified in these cells. The barrier function is achieved by forming an envelope. However, it is known that when the rate of keratinization decreases due to aging or the like, skin dullness or rough skin is caused. Therefore, keratinization promoters that promote skin keratinization have been developed. For example, as a result of studying a substance that enhances the expression of soyaracin (= S100A7), which is a protein generated as a component of a cornified envelope with skin keratinization, as an index, butyric acid or a derivative thereof, and Skin keratinization promoters containing calcium ion supply compounds are known (Patent Documents 1 and 2).
Sorayacin (S100A7) is the first protein identified as a secreted protein that is overexpressed in psoriatic skin, and overexpression has been confirmed in many inflammatory diseases. Sorayacin (S100A7) has a function of killing bacteria on the surface of the body. Therefore, it is clear that it is an antibacterial protein.
エイジツ（営実）は、ノイバラ(Rosa multiflora)の果実で、古くより漢方薬として知られ、瀉下薬、利尿薬にとして利用されてきた。
さらに毛髪化粧料、くすみ防止用皮膚外用剤、エラスターゼ阻害剤、セラミド産生促進剤としても知られている。（特許文献３〜６）
オタネニンジン(Panax ginseng）はチョウセンニンジン（朝鮮人参）、コウライニンジン（高麗人参）、また単に人参とも呼ばれる。
『神皇本草経』にも記載がある古くより利用されてきた生薬で強壮,強心,健胃、補精、鎮痛等に利用されている。
さらにセラミド産生促進剤、育毛料、グルタチオン産生促進剤、抗炎症剤、抗老化剤、抗肥満剤、エラスチン産生促進剤等の用途が知られている。（特許文献７〜１１）
Ages (fruits) is a fruit of the rose multiflora, which has long been known as a herbal medicine and has been used as a laxative and diuretic.
Furthermore, it is also known as a hair cosmetic, a skin external preparation for dullness prevention, an elastase inhibitor, and a ceramide production promoter. (Patent Documents 3 to 6)
Panax ginseng is also called ginseng, ginseng, ginseng, or simply ginseng.
It is a herbal medicine that has been used for a long time as described in “Shingon Honkaku” and is used for tonicity, intensification, stomach upset, prosthesis, analgesia, etc.
Furthermore, uses such as ceramide production promoters, hair restorers, glutathione production promoters, anti-inflammatory agents, anti-aging agents, anti-obesity agents, and elastin production promoters are known. (Patent Documents 7 to 11)
紅茶は、茶（Camellia sinensis）の葉を原料とし、摘み取った茶葉を発酵させたものである。
勿論飲用が主な用途であるが、プラーク形成阻害剤、メラニン生成抑制剤、アレルゲン不活性化剤、ＯＰＨ活性増強剤等の用途も知られている。（特許文献１２〜１５参照）
Black tea is made from the leaves of tea (Camellia sinensis) and fermented tea leaves.
Of course, drinking is the main use, but uses such as plaque formation inhibitors, melanin production inhibitors, allergen inactivators, and OPH activity enhancers are also known. (See Patent Documents 12 to 15)
オトギリソウ属(Hypericum)の植物はオトギリソウ(Hypericum erectum)、セイヨウオトギリソウ(Hypericum perforatum)がよく利用さ、止血、収斂、うがい薬等の用途が知られている。
さらに養毛・育毛料、メラニン生成抑制剤及び美白剤、抗プラスミン剤等の用途も知られている。（特許文献１６〜１８参照）
Hypericum plants are often used for Hypericum erectum and Hypericum perforatum, and their uses such as hemostasis, astringency, and mouthwash are known.
Furthermore, uses such as hair nourishing / hair growth agents, melanin production inhibitors, whitening agents, antiplasmin agents and the like are also known. (See Patent Documents 16 to 18)
本発明の目的はソラヤシンの産生を促進し、皮膚の角化を促進し、さらに炎症性疾患や抗菌性の向上する有効な皮膚外用剤を得ることにある。 An object of the present invention is to obtain an effective topical skin preparation that promotes the production of solayacin, promotes keratinization of the skin, and further improves inflammatory diseases and antibacterial properties.
本発明者らが鋭意検討した結果、エイジツの抽出物、オタネニンジンの抽出物、紅茶の抽出物、オトギリソウの抽出物が上記目的を達することがわかった。
エイジツ、オタネニンジン、紅茶、オトギリソウは必要に応じて乾燥した後、抽出効率を考えると、細切、粉砕等の処理を行った後に抽出する。
乾燥は天日で行ってもよいし、通常使用される乾燥機を用いて行ってもよい。
前記抽出に用いる溶媒としては、水若しくは親水性有機溶媒又はこれらの混合液を用いる。
前記抽出溶媒として使用し得る水としては、例えば、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等の他、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、ろ過、イオン交換、浸透圧の調整、緩衝化等が含まれる。従って、本発明において抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。
前記親水性有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコールなどが挙げられ、これら親水性有機溶媒と水との混合溶媒などを用いることができる。
なお、前記水と親水性有機溶媒との混合溶媒を使用する場合には、低級アルコールの場合は水１０質量部に対して１〜２０質量部、低級脂肪族ケトンの場合は水１０質量部に対して１〜１５質量部添加することが好ましい。多価アルコールの場合は水１０質量部に対して１〜２０質量部添加することが好ましい。
As a result of intensive studies by the present inventors, it has been found that an extract of ages, an extract of ginseng, an extract of black tea, and an extract of hypericum can achieve the above object.
Ages, ginseng, black tea, and hypericum are dried as necessary, and then extracted after processing such as shredding and pulverization in consideration of extraction efficiency.
Drying may be performed in the sun or using a commonly used dryer.
As the solvent used for the extraction, water, a hydrophilic organic solvent, or a mixture thereof is used.
Examples of water that can be used as the extraction solvent include pure water, tap water, well water, mineral spring water, mineral water, hot spring water, spring water, fresh water, and the like, as well as water that has been subjected to various treatments. Examples of the treatment applied to water include purification, heating, sterilization, filtration, ion exchange, adjustment of osmotic pressure, buffering, and the like. Therefore, the water that can be used as the extraction solvent in the present invention includes purified water, hot water, ion-exchanged water, physiological saline, phosphate buffer, phosphate buffered saline, and the like.
Examples of the hydrophilic organic solvent include lower alcohols having 1 to 5 carbon atoms such as methanol, ethanol, propyl alcohol, and isopropyl alcohol; lower aliphatic ketones such as acetone and methyl ethyl ketone; 1,3-butylene glycol, propylene glycol, Examples thereof include polyhydric alcohols having 2 to 5 carbon atoms such as glycerin, and a mixed solvent of these hydrophilic organic solvents and water can be used.
In addition, when using the mixed solvent of the said water and a hydrophilic organic solvent, in the case of a lower alcohol, it is 1-20 mass parts with respect to 10 mass parts of water, and in the case of a lower aliphatic ketone, it is 10 mass parts of water. It is preferable to add 1-15 mass parts with respect to it. In the case of a polyhydric alcohol, it is preferable to add 1 to 20 parts by mass with respect to 10 parts by mass of water.
抽出に使用する有機溶媒の量は、原料となる植物に対して望ましくは５〜１００倍量程度、さらに望ましくは１０〜５０倍量程度が良い。さらに抽出効率を上げるため、抽出溶媒中で撹拌やホモジナイズしてもよい。抽出温度としては、５℃程度から抽出溶媒の沸点以下の温度とするのが適切である。抽出時間は抽出溶媒の種類や抽出温度によっても異なるが、１時間〜１４日間程度とするのが適切である。
尚、抽出操作は１回のみの操作に限定されるものではない。抽出後の残渣に再度新鮮な溶媒を添加し、抽出操作を施すこともできるし、抽出溶媒を複数回抽出原料に接触させることも可能である。
本発明者らが検討した結果、本発明の効果を発揮する物質は、水にも、８０％のエタノール抽出されるので、ある程度精製する場合は、水で抽出したのち、不溶物を取り除き、等量〜５倍量のエタノールを加えてさらに抽出するとよいこともわかった。
必要ならば、その効果に影響のない範囲で更に脱臭、脱色等の精製処理を加えても良く、エバポレーターのような減圧濃縮装置や加熱による溶媒除去などにより、濃縮することができる。
また、この抽出物を合成吸着剤（ダイアイオンＨＰ２０やセファビースＳＰ８２５、アンバーライトＸＡＤ４、ＭＣＩｇｅｌＣＨＰ２０Ｐ等）やデキストラン樹脂（セファデックスＬＨ−２０など）、限外濾過等を用いてさらに精製することも可能である。
The amount of the organic solvent used for extraction is preferably about 5 to 100 times, more preferably about 10 to 50 times the amount of the plant as a raw material. Furthermore, in order to raise extraction efficiency, you may stir or homogenize in an extraction solvent. The extraction temperature is suitably about 5 ° C. to the boiling point of the extraction solvent. The extraction time varies depending on the type of extraction solvent and the extraction temperature, but it is appropriate to set it to about 1 hour to 14 days.
The extraction operation is not limited to a single operation. A fresh solvent can be added again to the residue after extraction to perform an extraction operation, or the extraction solvent can be brought into contact with the extraction raw material a plurality of times.
As a result of investigations by the present inventors, a substance that exerts the effect of the present invention is also extracted into water by 80% ethanol. Therefore, when purifying to some extent, after extracting with water, insoluble matters are removed, etc. It has also been found that further extraction may be performed by adding an amount to 5 times the amount of ethanol.
If necessary, purification treatment such as deodorization and decolorization may be further added within a range that does not affect the effect, and concentration can be performed by a vacuum concentrator such as an evaporator or solvent removal by heating.
Further, this extract can be further purified using a synthetic adsorbent (Diaion HP20, Sephabies SP825, Amberlite XAD4, MCIgelCHP20P, etc.), dextran resin (Sephadex LH-20, etc.), ultrafiltration, etc. is there.
本発明の製剤は、経口、注射、外用のいずれでも薬効を発現するが、皮膚外用剤として用いるのが好ましい。皮膚外用剤には、皮膚化粧料、外用医薬部外品、医療用皮膚外用剤が含まれる。
これらの抽出物の製剤への配合量は固形分として、０．０００００１〜１０．０重量％、好ましくは０．００００１〜３．０重量％、さらに好ましくは０．００００５〜１．０重量％である。
The preparation of the present invention exhibits drug efficacy for oral, injection, and external use, but is preferably used as a skin external preparation. Skin external preparations include skin cosmetics, external quasi-drugs, and medical skin external preparations.
The amount of these extracts in the preparation is 0.000001 to 10.0% by weight, preferably 0.00001 to 3.0% by weight, more preferably 0.00005 to 1.0% by weight, as a solid content. is there.
また、本発明の製剤には、上記成分の他に医薬品や化粧品の各種製剤において使用されている界面活性剤、油性成分、保湿剤、高分子化合物、紫外線吸収剤、抗炎症剤、殺菌剤、酸化防止剤、金属イオン封鎖剤、防腐剤、ビタミン類、色素、香料、水等を配合することができる。 In addition to the above ingredients, the preparations of the present invention include surfactants, oily ingredients, moisturizers, polymer compounds, ultraviolet absorbers, anti-inflammatory agents, bactericides, Antioxidants, sequestering agents, preservatives, vitamins, pigments, fragrances, water and the like can be blended.
上記界面活性剤としては、アニオン性、カチオン性、非イオン性、天然、合成のいずれの界面活性剤も使用できるが、皮膚に対する刺激性を考慮すると非イオン性のものを使用することが好ましい。非イオン性界面活性剤としては、例えばグリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、アルキルグリコシド等が挙げられる。 As the surfactant, any of anionic, cationic, nonionic, natural, and synthetic surfactants can be used, but it is preferable to use a nonionic surfactant in consideration of irritation to the skin. Examples of the nonionic surfactant include glycerin fatty acid ester, propylene glycol fatty acid ester, sorbitan fatty acid ester, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, polyoxyethylene sorbite fatty acid ester, polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene polyoxypropylene glycol. , Polyoxyethylene polyoxypropylene alkyl ether, polyethylene glycol fatty acid ester, polyoxyethylene castor oil, polyoxyethylene hydrogenated castor oil, alkylglycoside and the like.
油性成分としては、油脂類、ロウ類、炭化水素類、高級脂肪酸類、高級アルコール類、エステル類、精油類、シリコーン油類などを挙げることができる。油脂類としては、例えば大豆油、ヌカ油、ホホバ油、アボガド油、アーモンド油、オリーブ油、カカオ油、ゴマ油、パーシック油、ヒマシ油、ヤシ油、ミンク油、牛脂、豚脂等の天然油脂、これらの天然油脂を水素添加して得られる硬化油及びミリスチン酸グリセリド、２−エチルヘキサン酸トリグリセリド等の合成トリグリセリド等が；ロウ類としては、例えばカルナバロウ、鯨ロウ、ミツロウ、ラノリン等が；炭化水素類としては、例えば流動パラフィン、ワセリン、パラフィンマイクロクリスタリンワックス、セレシン、スクワラン、ブリスタン等が；高級脂肪酸類としては、例えばラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘニン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ラノリン酸、イソステアリン酸等が；高級アルコール類としては、例えばラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール、ラノリンアルコール、コレステロール、２−ヘキシルデカノール等が；エステル類としては、例えばオクタン酸セチル、オクタン酸トリグリセライド、乳酸ミリスチル、乳酸セチル、ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸ミリスチル、ミリスチン酸オクチルドデシル、パルミチン酸イソプロピル、アジピン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、オレイン酸デシル、イソステアリン酸コレステロール、ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル等が；精油類としては、例えばハッカ油、ジャスミン油、ショウ脳油、ヒノキ油、トウヒ油、リュウ油、テレピン油、ケイ皮油、ベルガモット油、ミカン油、ショウブ油、パイン油、ラベンダー油、ベイ油、クローブ油、ヒバ油、バラ油、ユーカリ油、レモン油、タイム油、ペパーミント油、ローズ油、セージ油、メントール、シネオール、オイゲノール、シトラール、シトロネラール、ボルネオール、リナロール、ゲラニオール、カンファー、チモール、スピラントール、ピネン、リモネン、テルペン系化合物等が；シリコーン油類としては、例えばジメチルポリシロキサン等が挙げられる。これら上述の油性成分は一種又は二種以上を組み合わせて使用することができる。本発明においては、このうち特にミリスチン酸グリセリド、２−エチルヘキサン酸トリグリセリド、ラノリン、流動パラフィン、ワセリン、パラフィンマイクロクリスタリンワックス、スクワラン、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸、イソステアリン酸、セチルアルコール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール、コレステロール、オクタン酸セチル、オクタン酸トリグリセライド、ミリスチレン酸イソプロピル、ミリスチン酸オクチルドデシル、イソステアリン酸コレステロール、ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル、ハッカ油、トウヒ油、ケイ皮油、ローズ油、メントール、シネオール、オイゲノール、シトラール、シトロネラール、ゲラニオール、ピネン、リモネン、ジメチルポリシロキサンを使用することが好ましい。 Examples of the oil component include fats and oils, waxes, hydrocarbons, higher fatty acids, higher alcohols, esters, essential oils, silicone oils, and the like. Examples of the fats and oils include soybean oil, nutka oil, jojoba oil, avocado oil, almond oil, olive oil, cacao oil, sesame oil, persic oil, castor oil, coconut oil, mink oil, beef fat, pork fat and the like, and these Hardened oil obtained by hydrogenation of natural fats and oils and synthetic triglycerides such as myristic acid glyceride and 2-ethylhexanoic acid triglyceride; waxes include, for example, carnauba wax, whale wax, beeswax, lanolin and the like; hydrocarbons For example, liquid paraffin, petrolatum, paraffin microcrystalline wax, ceresin, squalane, bristan etc .; higher fatty acids include, for example, lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, behenic acid, oleic acid, linoleic acid, Linolenic acid, lanolinic acid, isostearic acid, etc .; Examples of the class alcohols include lauryl alcohol, cetyl alcohol, stearyl alcohol, oleyl alcohol, lanolin alcohol, cholesterol, 2-hexyldecanol, etc .; examples of the esters include cetyl octanoate, triglyceride octanoate, myristyl lactate, cetyl lactate, Examples of essential oils include mint oil and jasmine. Oil, pepper brain oil, cypress oil, spruce oil, ryu oil, turpentine oil, cinnamon oil, bergamot oil, mandarin oil, ginger oil, pine , Lavender oil, bay oil, clove oil, hiba oil, rose oil, eucalyptus oil, lemon oil, thyme oil, peppermint oil, rose oil, sage oil, menthol, cineole, eugenol, citral, citronellal, borneol, linalool, geraniol, Camphor, thymol, spirantol, pinene, limonene, terpene compounds, etc .; examples of silicone oils include dimethylpolysiloxane. These oily components described above can be used alone or in combination of two or more. In the present invention, among these, myristic acid glyceride, 2-ethylhexanoic acid triglyceride, lanolin, liquid paraffin, petrolatum, paraffin microcrystalline wax, squalane, lauric acid, myristic acid, palmitic acid, linoleic acid, linolenic acid, isostearic acid , Cetyl alcohol, stearyl alcohol, oleyl alcohol, cholesterol, cetyl octanoate, triglyceride octanoate, isopropyl myristate, octyldodecyl myristate, cholesterol isostearate, POE sorbite fatty acid ester, peppermint oil, spruce oil, cinnamon oil, rose Oil, menthol, cineol, eugenol, citral, citronellal, geraniol, pinene, limonene, dimethylpolysiloxane It is preferable to use.
本発明の製剤には、さらに下記のような成分を配合することができるが、その成分もこれらに限定されるものではない。
色素類；黄色４号、青色１号、黄色２０２号等の厚生省令に定められたタール色素別表Ｉ及びIIの色素、クロロフィル、リボフラビン、クロシン、紅花、アントラキノン等の食品添加物として認められている天然色素等。
ビタミン類；ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ等。
その他；殺菌剤、防腐剤、その他製剤上必要な成分等。
The following components can be further added to the preparation of the present invention, but the components are not limited thereto.
Colors: Yellow color No. 4, Blue No. 1 and Yellow No. 202 are recognized as food additives such as tar color dyes I and II, chlorophyll, riboflavin, crocin, safflower, anthraquinone, etc. Natural pigments.
Vitamins; vitamin A, vitamin C, vitamin D, vitamin E, etc.
Others: bactericides, preservatives, other ingredients necessary for formulation.
本発明の製剤は、前記必須成分に必要に応じて前記任意成分を加え、常法に従って製造することができる。 The preparation of the present invention can be produced according to a conventional method by adding the optional components to the essential components as necessary.
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。 EXAMPLES Next, an Example is given and this invention is demonstrated in detail.
実施例１
エイジツ（乾燥物、細断品）を３０ｇに５０％（Ｖ/Ｖ）エタノール水溶液２リッターを加え、ときどき撹拌しながら、２４時間抽出後、濾過（Ｎｏ５Ｃ）し、これをエバポレートした後、凍結乾燥した。
Example 1
Add 2 liters of 50% (V / V) aqueous ethanol solution to 30 g of Ages (dried product, shredded product), extract with stirring for 24 hours, filter (No5C), evaporate it, and freeze-dry did.
実施例２
オタネニンジン（根、乾燥物、細断品）を５０ｇに２０％（Ｖ/Ｖ）エタノール水溶液２リッターを加え、ときどき撹拌しながら、２４時間抽出後、濾過（Ｎｏ５Ｃ）し、これをエバポレートした後、凍結乾燥した。
Example 2
Add 2 liters of 20% (V / V) ethanol aqueous solution to 50 g of ginseng (root, dried product, shredded product), extract it for 24 hours with occasional stirring, filter (No5C), and evaporate it. Lyophilized.
実施例３
紅茶（乾燥物、細断品）を３０ｇに３０％（Ｖ/Ｖ）エタノール水溶液２リッターを加え、ときどき撹拌しながら、２４時間抽出後、濾過（Ｎｏ５Ｃ）し、エバポレートしたのち、これを凍結乾燥した。
Example 3
Add 30 liters of 30% (V / V) ethanol aqueous solution to 30 g of black tea (dried product, shredded product), extract for 24 hours with occasional stirring, filter (No5C), evaporate, and freeze-dry this did.
実施例４
オトギリソウの地上部(Hypericum erectum)（乾燥物、細断品）を３０ｇに５０％（Ｖ/Ｖ）エタノール水溶液２リッターを加え、ときどき撹拌しながら、２４時間抽出後、濾過（Ｎｏ５Ｃ）し、エバポレートしたのち、これを凍結乾燥した。
Example 4
Hypericum erectum (dry matter, shredded product) of Hypericum perforatum is added to 30 g of 2 liters of 50% (V / V) aqueous ethanol solution, extracted with stirring for 24 hours, filtered (No5C), and evaporated. After that, this was freeze-dried.
実施例５
セイヨウオトギリソウの地上部(Hypericum perforatum)（乾燥物、細断品）を３０ｇに５０％（Ｖ/Ｖ）エタノール水溶液２リッターを加え、ときどき撹拌しながら、２４時間抽出後、濾過（Ｎｏ５Ｃ）し、エバポレートしたのち、これを凍結乾燥した。
Example 5
Hypericum perforatum (dried product, shredded product) of Hypericum perforatum is added to 30 g of 2% liter of 50% (V / V) ethanol aqueous solution, extracted with stirring for 24 hours, filtered (No5C), After evaporation, it was lyophilized.
確認試験
２継代目のヒト***由来表皮細胞（クラボウ）を５０−７０％コンフルエントとなるようＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地（フェノールレッド不含）で培養後、前日にカルシウム濃度を１．８ｍＭに変更したＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地に、実施例を添加し、３７℃、５％ＣＯ2インキュベータ中で２日間培養した。
Confirmation test HuMedia- cultivated human foreskin-derived epidermis cells (Kurabo) in the 2nd passage in HuMedia-KG2 medium (without phenol red) so as to be 50-70% confluent, and the calcium concentration was changed to 1.8 mM the day before. Examples were added to KG2 medium and cultured in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator for 2 days.
＜ＲＮＡの抽出＞
細胞からの Ｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出は、トリプシン／ＥＤＴＡで剥離後、illustra RNA Mini RNA Isolation Kit（GE Healthcare社）を用い、GE Healthcare社の添付マニュアルに従い調製した。ＲＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ１０００（Ｔｈｅｒｍｏ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を用い算出した。
<Extraction of RNA>
Total RNA was extracted from the cells after exfoliation with trypsin / EDTA and then using illustra RNA Mini RNA Isolation Kit (GE Healthcare) according to the attached manual of GE Healthcare. The RNA concentration was calculated using NanoDrop1000 (Thermo SCIENTIFIC).
＜ＲＴ反応およびリアルタイムＰＣＲ＞
２．５μｇのＴｏｔａｌ ＲＮＡを使い、ＭＭＬＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＲＮａｓｅＨ−（東洋紡社）を用い、東洋紡社推奨プロトコール（ＴＯＹＯＢＯ ＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬＳ ＦＯＲ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥ ２００８／２００９のページ１−４２）に従いＲＴ反応を行なった。
リアルタイムＰＣＲはＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ リアルタイムＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを用い、以下のように実施した。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ法を用い（ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ，東洋紡社）、７５００ リアルタイムＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍの操作マニュアル（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ＣＴ（△△ＣＴ）法（ｎ＝３）により遺伝子発現比較を実施した。内部標準としてＧＡＰＤＨを使用した。
確認試験の結果を図１に示す。
<RT reaction and real-time PCR>
Using 2.5 μg of total RNA, RT reaction was performed according to Toyobo recommended protocol (TOYOBO BIOCHEMICALS FOR LIFE SCIENCE 2008/2009, page 1-42) using MMLV Reverse Transcriptase RNase H- (Toyobo).
Real-time PCR was performed as follows using Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System. Using the SYBR Green method (THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix, Toyobo Co., Ltd.) and the 7500 Real-Time PCR System operation manual (Applied Biosystems), gene expression comparison was performed by the Comparative CT (ΔΔCT) method (n = 3). GAPDH was used as an internal standard.
The result of the confirmation test is shown in FIG.
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