JP7020910B2 - 改変アミノアシルtRNA合成酵素およびその用途 - Google Patents
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Description
このことからN-メチルアミノ酸を複数含む多様なペプチドのライブラリーから医薬品の候補物質を選択する創薬方法が考えられ、なかでも無細胞翻訳系を利用したN-メチルアミノ酸含有ペプチドのmRNAディスプレイライブラリーなどは、その多様性、スクリーニングの簡便性の点から期待が集まっている (非特許文献9,10、特許文献1)。まず膨大な種類のRNAもしくはDNA(遺伝型)などとそれがコードするペプチド(表現型)がそれぞれ1対1対応を形成している分子の集まりであるディスプレイライブラリーを構築し、続いて標的タンパクなどに結合反応させた後に、洗浄にて非結合分子を除去してライブラリーに含まれる極まれな微量の所望の分子を選択した後にそのRNA(DNA)の配列を解読することによって結合するペプチドの配列情報を簡便に得ることが出来る。特に無細胞翻訳系を利用するmRNAディスプレイライブラリーやribosomeディスプレイライブラリーは1012-14の多様な種類の分子を含むライブラリーを簡便に扱うことが出来る(非特許文献11)。また最近再構成無細胞翻訳系を利用することで非タンパク性アミノ酸を含むペプチドを調製できる方法が開発され、ディスプレイ技術と組み合わせることでN-メチルアミノ酸含有ペプチドディスプレイライブラリーの構築が可能となってきた(非特許文献10)。
本発明は、N-メチルアミノ酸に対する反応性を有するARSを提供する。具体的には、本発明は、天然型アミノアシルtRNA合成酵素(aminoacyl-tRNA synthetase;ARS)よりも、N-メチルアミノ酸、特にN-メチル-フェニルアラニン、N-メチル-バリン、N-メチル-セリン、N-メチル-スレオニン、N-メチルトリプトファン、N-メチルロイシンの6つのN-メチル置換アミノ酸をより効率良く取り込むことができるアミノ酸配列が改変されたそれぞれのARSおよびその用途に関する。本発明のアミノ酸配列が改変されたARSにより、これらのN-メチルアミノ酸から、任意のN-メチルアミノ酸を選択的に、かつ位置選択的に含有するペプチドを高い効率で製造することができる。
〔1〕改変アミノアシルtRNA合成酵素(ARS)を含むポリペプチドであって、当該ARSはN-メチルアミノ酸を元の天然のARSより効率よく取り込む反応をすることができるポリペプチド。
〔2〕N-メチルアミノ酸によるアミノアシル化反応が増強するように改変された、アミノアシルtRNA合成酵素(ARS)活性を有するポリペプチドであって、該改変が、分子量が10以上減少するアミノ酸への置換を少なくも1つ含む、ポリペプチド。
〔3〕前記N-メチルアミノ酸が、バリン、セリン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファンおよびロイシンからなる群より選択される〔1〕または〔2〕に記載のポリペプチド。
〔4〕前記ARSが、ValRS、SerRS、PheRSのαサブユニット、ThrRS、TrpRSおよびLeuRSからなる群より選択される〔1〕~〔3〕のいずれかに記載のポリペプチド。
〔5〕前記ValRSが、大腸菌由来のValRSの43位アスパラギンおよび/または45位スレオニンおよび/または279位スレオニンに相当する位置で改変された、〔1〕~〔4〕のいずれかに記載のポリペプチド。
〔6〕前記SerRSが、大腸菌由来のSerRSの239位グルタミン酸および/または237位スレオニンに相当する位置で改変された、〔1〕~〔4〕のいずれかに記載のポリペプチド。
〔7〕前記PheRSαサブユニットが、大腸菌由来のPheRSαサブユニットの169位グルタミンに相当する位置で改変された、〔1〕~〔4〕のいずれかに記載のポリペプチド。
〔8〕前記ThrRSが、大腸菌由来のThrRSの332位メチオニンおよび/または511位ヒスチジンに相当する位置で改変された、〔1〕~〔4〕のいずれかに記載のポリペプチド。
〔9〕前記TrpRSが、大腸菌由来のTrpRSの132位メチオニンおよび/または150位グルタミンおよび/または153位ヒスチジンに相当する位置で改変された、〔1〕~〔4〕のいずれかに記載のポリペプチド。
〔10〕前記LeuRSが、大腸菌由来のLeuRSの43位チロシンに相当する位置で改変された、〔1〕~〔4〕のいずれかに記載のポリペプチド。
〔11〕前記ValRSが、大腸菌由来のValRSの(a)43位アスパラギンに相当する位置がグリシンまたはアラニン、および/または(b)45位スレオニンに相当する位置がセリン、および/または(c)279位スレオニンに相当する位置がグリシンまたはアラニンである、〔1〕~〔4〕のいずれかに記載のポリペプチド。
〔12〕前記SerRSが、大腸菌由来のSerRSの(a)239位グルタミン酸に相当する位置がグリシンまたはアラニン、および/または(b)237位スレオニンに相当する位置がセリンである、〔1〕~〔4〕のいずれかに記載のポリペプチド。
〔13〕前記PheRSαサブユニットが、大腸菌由来のPheRSαサブユニットの169位グルタミンに相当する位置がグリシンまたはアラニンである、〔1〕~〔4〕のいずれかに記載のポリペプチド。
〔14〕前記ThrRSが、大腸菌由来のThrRSの332位メチオニンおよび/または511位ヒスチジンに相当する位置がそれぞれグリシンである、〔1〕~〔4〕のいずれかに記載のポリペプチド。
〔15〕前記TrpRSが、大腸菌由来のTrpRSの(a)132位メチオニンに相当する位置がアラニンまたはバリン、および/または(b)150位グルタミンに相当する位置がアラニン、および/または(c)153位ヒスチジンに相当する位置がアラニンである、〔1〕~〔4〕のいずれかに記載のポリペプチド。
〔16〕前記LeuRSが、大腸菌由来のLeuRSの43位チロシンに相当する位置がグリシンである、〔1〕~〔4〕のいずれかに記載のポリペプチド。
〔17〕前記ARSが、細菌由来のものである〔1〕~〔16〕のいずれかに記載のポリペプチド。
〔18〕前記細菌が、大腸菌である〔17〕に記載のポリペプチド。
〔19〕下記(a)および(b)で構成される群から選択される、〔1〕~〔18〕のいずれかに記載のポリペプチド。
(a) 配列番号:1乃至11および182乃至187からなる群から選択されたアミノ酸を含むポリペプチド
(b) 配列番号:1乃至11および182乃至187からなる群から選択されたアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド
〔20〕配列番号:1乃至11および182乃至187からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
〔21〕〔1〕~〔20〕のいずれかに記載のポリペプチドと他のポリペプチドとの融合ポリペプチド。
〔22〕〔1〕~〔21〕のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
〔23〕〔22〕に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
〔24〕〔22〕に記載のポリヌクレオチドまたは〔23〕に記載のベクターを含む宿主細胞。
〔25〕〔24〕に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、〔1〕~〔21〕のいずれかに記載のポリペプチドを製造する方法。
〔26〕N-メチルアミノ酸でアシル化されたtRNAの製造方法であって、〔1〕~〔20〕のいずれかに記載のポリペプチドの存在下、N-メチルアミノ酸およびtRNAを接触させる工程を含む方法。
〔27〕前記接触させる工程が、無細胞翻訳系で行われる〔26〕に記載の方法。
〔28〕N-メチルアミノ酸を含むポリペプチドを製造する方法であって、〔1〕~〔20〕のいずれかに記載のポリペプチドおよびN-メチルアミノ酸の存在下、翻訳を行う工程を含む方法。
〔29〕前記翻訳を行う工程が、無細胞翻訳系で行われる〔28〕に記載の方法。
例えば、大腸菌ValRSの43位および45位に相当する部位は、他生物のValRSに存在するPPP(N/Y/T)X(T/S)Gモチーフ(配列番号180;「N/Y/T」は好ましくはN;Xは任意のアミノ酸であり、好ましくはV、IまたはP、より好ましくはV;「T/S」は好ましくはT)のそれぞれ「N/Y/T」および「T/S」のアミノ酸部位であってよい。より好ましくは、大腸菌ValRSの43位および45位に相当する部位は、他生物のValRSに存在するPPPNXTGモチーフ(配列番号181;Xは任意のアミノ酸であり、好ましくはV、IまたはP、より好ましくはV)のそれぞれNおよびTのアミノ酸であってよい。例えば大腸菌ValRSの43位アスパラギンに相当する位置はHuman(Uniprot P26640)では345位のアスパラギンであり、Saccharomyces cervisiae(Uniprot P07806)では191位のアスパラギンである。
(a) 配列番号3~5,182および183(ValRS04、ValRS13、ValRS13-11、ValRS66およびValRS67)のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチド。
(b) 配列番号3~5,182および183のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有し、かつ以下の(i)~(iii)に記載の少なくとも1つのアミノ酸を含むN-メチルValに対する反応性を有するポリペプチド;
(i) 配列番号3~5,182および183の43位に相当する位置のアミノ酸がGlyまたはAlaである、
(ii) 配列番号3~5,182および183の45位に相当する位置のアミノ酸がSerである、及び、
(iii) 配列番号3~5,182および183の279位に相当する位置のアミノ酸がGlyまたはAlaである。
なお当該反応性は、(i) 43位に相当する位置のアミノ酸がAsnである、および/または (ii) 45位に相当する位置のアミノ酸がThrである、および/または (iii) 279位に相当する位置のアミノ酸がThrである場合よりも高いことが好ましい。例えば本発明のValRSは、当該ValRSの43位に相当する位置のアミノ酸がAsnであり、45位に相当する位置のアミノ酸がThrであり、かつ、279位に相当する位置のアミノ酸がThrであるValRSよりもN-メチルValに対する反応性が高いことが好ましい。
(a) 配列番号6~9(SerRS03、SerRS05、SerRS35、およびSerRS37)のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチド。
(b) 配列番号6~9のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有し、かつ以下の(i)及び(ii)に記載の少なくとも1つのアミノ酸を含むN-メチルSerに対する反応性を有するポリペプチド;
(i) 配列番号6~9の 237位に相当する位置のアミノ酸がSerである、及び、
(ii) 配列番号6~9の239位に相当する位置のアミノ酸がGlyまたはAlaである。
なお当該反応性は、(i) 237位に相当する位置のアミノ酸がThrである、および/または (ii) 239位に相当する位置のアミノ酸がGluである場合よりも高いことが好ましい。例えば本発明のSerRSは、当該SerRSの237位に相当する位置のアミノ酸がThrであり、かつ239位に相当する位置のアミノ酸がGluであるSerRSよりもN-メチルSerに対する反応性が高いことが好ましい。
(a) 配列番号1~2(PheRS05およびPheRS04)のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチド。
(b) 配列番号1~2のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有し、かつ配列番号1~2のいずれかの169位に相当する位置のアミノ酸がGlyまたはAlaであるアミノ酸配列を含むN-メチルPheに対する反応性を有するポリペプチド。なお当該反応性は、当該位置のアミノ酸がGlnである場合よりも高いことが好ましい。なお上記のポリペプチドはARSのαサブユニットであるので、βサブユニットと共に複合体を形成させることで機能的なARSを取得することができる。βサブユニットとしては特に制限はなく、例えば所望の野生型サブユニットを用いることはできるが、一例を挙げればNCBI Reference Sequence WP_000672380(例えばWP_000672380.1)のアミノ酸配列(塩基配列はGenBank CP009685 (例えばCP009685.1) の1897337 - 1899721)を含むサブユニットを用いることができる。
(a) 配列番号10~11(ThrRS03およびThrRS14)のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチド。
(b) 配列番号10~11のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有し、かつ以下の(i)および(ii)に記載の少なくとも1つのアミノ酸を含むN-メチルThrに対する反応性を有するポリペプチド;
(i) 配列番号10~11の332位に相当する位置のアミノ酸がGlyである、および、
(ii) 配列番号10~11の511位に相当する位置のアミノ酸がGlyである。
なお当該反応性は、(i) 332位に相当する位置のアミノ酸がMetである、および/または (ii) 511位に相当する位置のアミノ酸がHisである場合よりも高いことが好ましい。例えば本発明のThrRSは、当該ThrRSの332位に相当する位置のアミノ酸Metであり、かつ511位に相当する位置のアミノ酸がHisであるThrRSよりもN-メチルThrに対する反応性が高いことが好ましい。
(a) 配列番号184-186(TrpRS04,TrpRS05およびTrpRS18)のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチド。
(b) 配列番号184-186のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有し、かつ以下の(i)~(iii)のいずれかに記載の少なくとも1つのアミノ酸を含むN-メチルTrpに対する反応性を有するポリペプチド;
(i) 配列番号184-186の132位に相当する位置のアミノ酸がValまたはAlaである、
(ii) 配列番号184-186の150位に相当する位置のアミノ酸がAlaである、
(iii) 配列番号184-186の153位に相当する位置のアミノ酸がAlaである。
なお当該反応性は、(i) 132位に相当する位置のアミノ酸がMetである、および/または (ii) 150位に相当する位置のアミノ酸がGlnである、および/または (iii) 153位に相当する位置のアミノ酸がHisである場合よりも高いことが好ましい。例えば本発明のTrpRSは、当該TrpRSの132位に相当する位置のアミノ酸Metであり、150位に相当する位置のアミノ酸Glnであり、かつ153位に相当する位置のアミノ酸がHisであるTrpRSよりもN-メチルTrpに対する反応性が高いことが好ましい。
(a) 配列番号187(LeuRS02)のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
(b) 配列番号187のアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有し、かつ配列番号187の43位に相当する位置のアミノ酸がGlyであるアミノ酸配列を含み、N-メチルLeuに対する反応性を有するポリペプチド。
なお当該反応性は、(i) 43位に相当する位置のアミノ酸がTyrである場合よりも高いことが好ましい。
また、本発明の特定の位置のアミノ酸が他のアミノ酸で改変されたN-メチルアミノアシルtRNA合成酵素の変異体の製造方法としては、前記した方法に限定されるものではなく、公知のポイントミューテーション技術や遺伝子合成技術、制限酵素により改変断片を導入する方法など、各種の遺伝子操作技術を使用することができ、発現も大腸菌に限定されず、動物細胞や無細胞翻訳系も使用することができる。
(a) 配列番号3~5,182および183(ValRS04、ValRS13、ValRS13-11、ValRS66およびValRS67)のいずれかに記載のアミノ酸配列と高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
(b) 配列番号3~5,182および183のいずれかに記載のアミノ酸配列において1または複数のアミノ酸を置換、欠失、挿入および/または付加したアミノ酸配列を含むポリペプチド、
(c) 配列番号14~16,190および191(ValRS04、ValRS13、ValRS13-11、ValRS66およびValRS67のDNA)のいずれかに記載の塩基配列と高い同一性を有する塩基配列によりコードされるポリペプチド、または
(d) 配列番号14~16,190および191のいずれかに記載の塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAによりコードされるポリペプチド。
当該ポリペプチドは、好ましくは、(i) 43位に相当するアミノ酸がGlyまたはAla、および/または (ii) 45位に相当するアミノ酸がSer、および/または (iii) 279位に相当するアミノ酸がGlyまたはAlaであるポリペプチドである。このようなポリペプチドには天然のポリペプチドおよび人工的に改変したポリペプチドが含まれるが、好ましくは、(i) 43位に相当するアミノ酸がGlyまたはAla、および/または (ii) 45位に相当するアミノ酸がSer、および/または (iii) 279位に相当するアミノ酸がGlyまたはAlaに改変されているポリペプチドである。
(a) 配列番号6~9(SerRS03、SerRS05、SerRS35、およびSerRS37)のいずれかに記載のアミノ酸配列と高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
(b) 配列番号6~9のいずれかに記載のアミノ酸配列において1または複数のアミノ酸を置換、欠失、挿入および/または付加したアミノ酸配列を含むポリペプチド、
(c) 配列番号17~20(SerRS03、SerRS05、SerRS35、およびSerRS37のDNA)のいずれかに記載の塩基配列と高い同一性を有する塩基配列によりコードされるポリペプチド、または
(d) 配列番号17~20のいずれかに記載の塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAによりコードされるポリペプチド。
当該ポリペプチドは、好ましくは、(i) 237位に相当するアミノ酸がSer、および/または (ii) 239位に相当するアミノ酸がGlyもしくはAlaであるポリペプチドである。このようなポリペプチドには天然のポリペプチドおよび人工的に改変したポリペプチドが含まれるが、好ましくは、(i) 237位に相当するアミノ酸がSer、および/または (ii) 239位に相当するアミノ酸がGlyもしくはAlaに改変されているポリペプチドである。
(a) 配列番号1~2(PheRS05およびPheRS04)のいずれかに記載のアミノ酸配列と高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
(b) 配列番号1~2のいずれかに記載のアミノ酸配列において1または複数のアミノ酸を置換、欠失、挿入および/または付加したアミノ酸配列を含むポリペプチド、
(c) 配列番号12~13(PheRS05およびPheRS04のDNA)のいずれかに記載の塩基配列と高い同一性を有する塩基配列によりコードされるポリペプチド、または
(d) 配列番号12~13のいずれかに記載の塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAによりコードされるポリペプチド。
当該ポリペプチドは、好ましくは、169位に相当するアミノ酸がGlyまたはAlaであるポリペプチドである。このようなポリペプチドには天然のポリペプチドおよび人工的に改変したポリペプチドが含まれるが、好ましくは、169位に相当するアミノ酸がGlyまたはAlaに改変されているポリペプチドである。
(a) 配列番号10~11(ThrRS03およびThrRS14)のいずれかに記載のアミノ酸配列と高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
(b) 配列番号10~11のいずれかに記載のアミノ酸配列において1または複数のアミノ酸を置換、欠失、挿入および/または付加したアミノ酸配列を含むポリペプチド、
(c) 配列番号21~22(ThrRS03およびThrRS14のDNA)のいずれかに記載の塩基配列と高い同一性を有する塩基配列によりコードされるポリペプチド、または
(d) 配列番号21~22のいずれかに記載の塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAによりコードされるポリペプチド。
当該ポリペプチドは、好ましくは、(i) 332位に相当するアミノ酸がGly、および/または (ii) 511位に相当するアミノ酸がGlyであるポリペプチドである。このようなポリペプチドには天然のポリペプチドおよび人工的に改変したポリペプチドが含まれるが、好ましくは332位に相当するアミノ酸がGly、および/または511位に相当するアミノ酸がGlyに改変されているポリペプチドである。
(a) 配列番号184-186(TrpRS04、TrpRS05およびTrpRS18)のいずれかに記載のアミノ酸配列と高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
(b) 配列番号184-186のいずれかに記載のアミノ酸配列において1または複数のアミノ酸を置換、欠失、挿入および/または付加したアミノ酸配列を含むポリペプチド、
(c) 配列番号192-194(TrpRS04、TrpRS05およびTrpRS18のDNA)のいずれかに記載の塩基配列と高い同一性を有する塩基配列によりコードされるポリペプチド、または
(d) 配列番号192-194のいずれかに記載の塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAによりコードされるポリペプチド。
当該ポリペプチドは、好ましくは、(i) 132位に相当するアミノ酸がValまたはAla、および/または (ii) 150位に相当するアミノ酸がAlaであるおよび/または (iii) 153位に相当するアミノ酸がAlaであるポリペプチドである。このようなポリペプチドには天然のポリペプチドおよび人工的に改変したポリペプチドが含まれるが、好ましくは、(i) 132位に相当するアミノ酸がValまたはAla、および/または (ii) 150位に相当するアミノ酸がAla、および/または (iii) 153位に相当するアミノ酸がAlaに改変されているポリペプチドである。
(a) 配列番号187(LeuRS02)に記載のアミノ酸配列と高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
(b) 配列番号187のいずれかに記載のアミノ酸配列において1または複数のアミノ酸を置換、欠失、挿入および/または付加したアミノ酸配列を含むポリペプチド、
(c) 配列番号195(LeuRS02のDNA)に記載の塩基配列と高い同一性を有する塩基配列によりコードされるポリペプチド、または
(d) 配列番号195に記載の塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAによりコードされるポリペプチド。
当該ポリペプチドは、好ましくは、43位に相当するアミノ酸がGlyであるポリペプチドである。このようなポリペプチドには天然のポリペプチドおよび人工的に改変したポリペプチドが含まれるが、好ましくは、43位に相当するアミノ酸がGlyに改変されているポリペプチドである。
また、該ポリヌクレオチドは、同一のアミノ酸をコードするコドンであればどのようなコドンから構成される縮重ポリヌクレオチドをも含む。また、本発明のポリヌクレオチドは、所望の生物由来のポリヌクレオチドであってよい。
宿主がバチルス属菌の場合は、SL01プロモーター、SP02プロモーター、penPプロモーターなどが挙げられる。
本発明のポリペプチドは、上述のような組み換え細胞、特に動物細胞を培養し、培養上清中に分泌させること等により製造することができる。
単離、精製方法としては、例えば塩析、溶媒沈澱法等の溶解度を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動など分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーやヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーなどの荷電を利用する方法、アフィニティ・クロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差を利用する方法などが挙げられる。
また、本発明のアミノ酸配列が改変されたARSは細胞内における使用のみならず、インビトロ(セルフリー系)における使用も包含している。
いずれの場合においても、pdCpA法などの化学合成法を用いる先行技術とは異なり翻訳反応中に繰り返しtRNAをアシル化することが可能なため、NメチルアミノアシルtRNAの持続的な供給ができることと、翻訳を阻害するtRNAの大量添加を回避することが可能となる。
したがって、本発明は、非天然アミノ酸を効率よく、選択的に、特に位置選択的に、かつ大量に製造する方法を提供するものである。
本発明の改変ARSは、上述の通り公知の遺伝子組み換え技術を用いて作製することができるが、一般的に次のように調製することができる。まず、天然型ARS遺伝子を含むプラスミドを鋳型とし、そのプライマーを用いたPCRによって特定の位置及び特定のアミノ酸に部位特異的変異を導入し、制限酵素にて鋳型プラスミドを消化した後大腸菌等に形質転換し、目的の変異導入プラスミドをクローニングする。
また、得られた改変体について、例えば以下の3種のいずれかのアッセイ方法を用いて基質特異性を確認することができる。
本発明の改変ARSを用いれば、tRNAのアシル化においてN-メチルアミノ酸を基質とすることが可能となる。本発明の改変ARSは、N-メチルアミノ酸を用いてtRNAをアシル化し、N-メチルアミノ酸含有ペプチドを翻訳することを可能とする。
tRNAのアシル化を触媒する改変ARSであって、
(a)tRNA結合部位
(b)N-メチルアミノ酸基質結合部位、及び
(c)N-メチルアミノ酸基質からtRNAの3’末端へのアシル基転移反応を触媒する活性を有する触媒活性部位、
を含み、
tRNAおよびN-メチルアミノ酸を、翻訳反応混合物の中でも正確に認識してアシル化し、さらにアシル基転移反応後の解放されたtRNAを再利用して再びアシル化反応を繰り返すことができることを特徴とする、前記改変ARS。
本発明の改変ARSを用いて、所望のN-メチルアミノ酸基質でアシル化されたtRNAを合成できる。
(a)1つ以上の本発明の改変ARSを提供する工程;(b)tRNAを提供する工程;
(c)N-メチルアミノ酸を提供する工程;及び(d)前記改変ARSと、前記tRNA及びN-メチルアミノ酸とを接触させて、tRNAをアシル化する工程。
N-メチルアミノ酸結合tRNAを用いて、N-メチルアミノ酸が所望の部位に導入されたポリペプチドを製造することができる。当該方法は、目的のポリペプチドをコードする核酸を、本発明の改変ARSの存在下で翻訳させる工程を含む。
大腸菌野生型PheRSαサブユニット遺伝子のORF配列(配列番号:27、28)を含むプラスミド(pQE-32(2)2_wtPheRS)を出発物質とし、PCR法を用いた部位特異的変異を導入により表1に記載した変異PheRSプラスミド(N末端にHis-tag(6xHis)を有する)を構築した。具体的には、10ng/μLの鋳型 2μL、2x KOD Fx buffer (TOYOBO社 KFX-101)、10μL、10μM Fowardプライマー 0.6μL、10μM Reverseプライマー 0.6μL、2 mM dNTP 4μL、 KOD FX(TOYOBO社 KFX-101) 0.4μL、H2O 2.4μLを混合し、続いてその反応液を94℃ 2分加熱した後、98℃10秒、68℃7分の加熱からなるサイクルに10サイクル晒し、変異遺伝子を増幅した。なお、用いた鋳型プラスミド及びFowardプライマー、Reverseプライマーの組み合わせを表2に示す。各プライマーの配列は、「F.F02」から「F.F05」までは順に配列番号:30から33、「R.F02」から「R.F05」までは順に配列番号:34から37である。その後、PCR反応液に10U/μLのDpnI 0.5μLを添加し、さらに37℃ 1.5時間のインキュベートにより鋳型DNAを消化させ、得られた変異DNAを精製した。続いて、得られた遺伝子変異DNAとlacI遺伝子をコードするpREP4(Invitrogen、V004-50)を同時に大腸菌株XL-1 Blue(STRATAGENE、200236)に形質転換し、その形質転換株をアンピシリンとカナマイシンを含む寒天培地に撒くことで得られたクローンから目的プラスミドを精製し、変異が導入されていることを確認した。
続いて、得られた変異遺伝子とPheRSβサブユニットをコードした遺伝子を含むプラスミドを大腸菌に導入し、変異タンパク質ヘテロダイマーの発現を行った。まず、変異プラスミドとpREP4(Invitrogen、V004-50)を形質転換した大腸菌BL21株をカナマイシン、アンピシリンと0.5%のグルコースを含むLB培地4mLにて37℃で培養した。その後、600 nmでのOD値が0.4~0.8に達してから0.5mM終濃度のIPTGを添加し、さらに4時間37℃で培養した後、遠心分離機により菌体を集めた。
次に、得られた菌体を破砕し、その上清から目的の変異タンパク質を精製した。具体的には、上記菌体を600μLのCHAPS溶液(0.5 % CHAPS (DOJINDO: 349-04722)、50 % TBS (TaKaRa、T903))に懸濁し、6μLの30U/μl rLysozyme(Novagen, 71110-3)、2μLの2.5U/μLのbenzonase nuclease(Novagen, 70746-3)を混合した後、室温にて30分インキュベートし、その後終濃度15mMのイミダゾールを添加した後、遠心分離により不溶性画分を分離した。続いて、得られた上清に対し、キアゲン社のNi-NTA spin column kit(Qiagen、 31314)を用いてプロダクトマニュアルに従って変異タンパク質を精製した。最後に、脱塩カラムPD miniTrap G-25(GEヘルスケア 28-9180-07)を用い、プロダクトマニュアルに従って過剰なイミダゾールを除去した。
活性が確認された変異タンパク質については大量調製を行った。具体的には、αサブユニットの変異遺伝子とβサブユニットの野生型遺伝子を含むプラスミド、及びpREP4(Invitrogen、V004-50)を形質転換した大腸菌BL21株をカナマイシン、アンピシリンと0.5%のグルコースを含むLB培地3Lにて37℃で培養した。その後、600 nmでのOD値が0.4に達してから0.5mM終濃度のIPTGを添加し、さらに4時間37℃で培養した後、遠心分離機により菌体を集めた。上記菌体を1LのCHAPS溶液(0.5 % CHAPS (DOJINDO: 349-04722)、50 % TBS (TaKaRa、T903))に懸濁し、10μLの30KU/μl rLysozyme(Novagen, 71110-3)を混合し、室温で10分間攪拌した。続いて、2mLの1M MgCl2、320μLのBenzonase Nuclease(Novagen, 70746-3)を添加し、室温にて20分攪拌した。その後終濃度20mMのイミダゾールを添加した後、遠心分離により不溶性画分を分離した。続いて、得られた上清をNi Sepharose High Performance (GEヘルスケア社)15mLを充填したカラムとAKTA10S(GEヘルスケア社)を利用し、イミダゾール濃度のグラジェント(初期濃度20mM,最終濃度500mM)により変異タンパク質を精製した。最後に、透析カセット(MWCO10,000、Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes 70mL、Thermo Scientific Pierce社)を用い、3LのStock溶液(50 mM Hepes-KOH, 100 mM KCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, pH7.6)を用いて3回(2時間2回、一夜1回)透析を実施し、変異タンパク質を得た。
[In vitro転写反応による大腸菌tRNAPheの合成]
鋳型DNA(D-tRNAPhe (配列番号38))から、7.5 mM GMP存在下、RiboMAX Large Scale RNA production System T7(Promega社,P1300)を用いたin vitro 転写反応により大腸菌tRNA(R-tRNAPhe (配列番号39))を合成し、RNeasy Mini kit(Qiagen社)により精製した。
tRNAPhe DNA配列:
GGCGTAATACGACTCACTATAGCCCGGATAGCTCAGTCGGTAGAGCAGGGGATTGAAAATCCCCGTGTCCTTGGTTCGATTCCGAGTCCGGGCACCA
tRNAPhe RNA配列:
GCCCGGAUAGCUCAGUCGGUAGAGCAGGGGAUUGAAAAUCCCCGUGUCCUUGGUUCGAUUCCGAGUCCGGGCACCA
アミノアシル化反応を行うために、40μM 転写tRNAPhe、10 mM HEPES-K(pH7.6)、10 mM KCl溶液を95℃で2分間加熱し、その後室温に5分以上静置させることでtRNAのリフォールディングを行った。このtRNA溶液を最終濃度10μMになるように、アシル化バッファー(最終濃度50 mM HEPES-K[pH7.6], 2 mM ATP, 100 mM 酢酸カリウム、10 mM 酢酸マグネシウム、1 mM DTT、2 mM spermidine、0.1 mg/mL Bovine Serum Albumin)を添加後、 PheRS野生型もしくは変異体(最終濃度0.5μM)およびフェニルアラニン(最終濃度0.25 mM、渡辺化学工業、G00029)もしくはN-メチルフェニルアラニン(最終濃度1 mM、渡辺化学工業、J00040)と混合し、37℃で10分間インキュベートした。反応溶液に4倍量のローディングバッファー(90 mM 酢酸ナトリウム[pH5.2]、10 mM EDTA、95%(w/w)ホルムアミド、0.001%(w/v)キシレンシアノール)を添加し、6M尿素を含む酸性PAGE (12% (w/v) polyacrylamide gel, pH5.2)で分析し、未反応tRNAとアミノアシル化tRNAを分離することでアミノアシル化活性を確認した。RNAの染色は、SYBR Gold (Life Technologies)を用い、検出にはLAS4000(GEヘルスケア)を用いた。
[In vitro転写反応による鋳型DNA-Fの合成]
DNA配列:
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAACAAGGAGAAAAACATGCGTTTCCGTGACTACAAGGACGACGACGACAAGTAAGCTTCG
RNA配列:
GGGUUAACUUUAACAAGGAGAAAAACAUGCGUUUCCGUGACUACAAGGACGACGACGACAAGUAAGCUUCG
N-メチルフェニルアラニンの翻訳導入を確かめるため、N-メチルアミノ酸とPheRSを無細胞翻訳系に加えることで、所望のN-メチルフェニルアラニンを含有するポリペプチドの翻訳合成を行った。翻訳系は、大腸菌由来の再構成無細胞タンパク質合成系であるPURE systemを用いた。具体的には、基本的な無細胞翻訳液(1mM GTP,1mM ATP,20mMクレアチンリン酸,50mM HEPES-KOH pH7.6,100mM 酢酸カリウム,9mM 酢酸マグネシウム,2mMスペルミジン,1mM ジチオスレイトール,0.5mg/ml E.coli MRE600(RNaseネガティブ)由来tRNA(Roche社),4μg/ml クレアチンキナーゼ,3μg/ml ミオキナーゼ,2unit/ml 無機ピロフォスファターゼ,1.1μg/ml ヌクレオシド二リン酸キナーゼ,0.6μM メチオニルtRNAトランスフォルミラーゼ,0.26μM EF-G,0.24μM RF2,0.17μM RF3,0.5μM RRF,2.7μM IF1,0.4μM IF2,1.5μM IF3,40μM EF-Tu,44μM EF-Ts,1.2μM リボソーム,0.03μM ArgRS,0.13μM AspRS,0.11μM LysRS,0.03μM MetRS,0.02μM TyrRS(自家調製タンパクは基本的にHisタグ付加タンパクとして調製した))に、1μM 鋳型mRNA、アルギニン、アスパラギン酸、リシン、メチオニン、チロシンをそれぞれ250μMずつ加えた溶液に対して、PheRS野生型もしくは変異体とフェニルアラニンもしくはN-メチルフェニルアラニンを添加し、37℃で1時間静置することでペプチドの翻訳合成を行った。
N-メチルフェニルアラニンが翻訳導入されたペプチドを検出するためにラジオアイソトープでラベルしたアスパラギン酸を利用してペプチド翻訳実験を行った。具体的には、上述の無細胞翻訳系に1μM 鋳型mRNA(R-F (配列番号41))とアルギニン、リシン、メチオニン、チロシン(各々最終濃度250μM)、14C-アスパラギン酸(最終濃度37μM、Moravek Biochemicals社、MC139)を加えた溶液を調製し、PheRS野生型もしくは変異体05(最終濃度0.1μM)とフェニルアラニン(最終濃度250μM)もしくはN-メチルフェニルアラニン(最終濃度1mMもしくは250μM)を添加し、37℃で60分間保温した。得られた翻訳反応溶液に対して等量の2Xサンプルバッファー(TEFCO社、catNo.06-323)を加え、95℃で3分間加熱後、電気泳動(16% Peptide-PAGE mini、TEFCO社、TB-162)を実施した。泳動後のゲルは、Clear Dry Quick Dry Starter KIT(TEFCO社、03-278)を用いて乾燥させ、イメージングプレート(GEヘルスケア社、28-9564-75)に約16時間露光させ、バイオアナライザーシステム(Typhoon FLA 7000、GEヘルスケア社)で検出し、ImageQuantTL(GEヘルスケア社)で解析した。
0.1μM PheRS野生型の存在下で、0.25 mMおよび1 mM N-メチルフェニルアラニン添加時には、翻訳合成されたペプチドのバンドはほとんど観測されなかった(図2)。一方、0.1μM PheRS変異体05の存在下では、0.25 mM N-メチルフェニルアラニン添加時においても、ペプチドのバンドが観測された。これにより、PheRS変異体05のN-メチルフェニルアラニンに対するアミノアシル化活性が向上していること及びN-メチルフェニルアラニンを含むペプチド翻訳合成が高収率に進行したことを確認した。
N-メチルフェニルアラニンが翻訳導入されたペプチドを検出するために、MALDI-TOF MSを用いた質量分析を実施した。具体的には、上述の無細胞翻訳系に1μM 鋳型mRNA(R-F (配列番号41))と各アミノ酸、アルギニン、リシン、メチオニン、チロシン、アスパラギン酸(各々最終濃度250μM)を加えた溶液を調製し、PheRS(最終濃度0.1μM)とフェニルアラニン(最終濃度250μM)もしくはN-メチルフェニルアラニン(最終濃度1mMもしくは250μM)を添加し、37℃で60分間保温した。得られた翻訳反応物を、SPE C-TIP(日京テクノス社)で精製し、MALDI-TOF MSで分析した。翻訳産物はマトリックスとしてα-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸を用いた。
次にPheRS変異体05に対して、0.25 mMまたは1 mMのN-メチルフェニルアラニンを添加して翻訳合成を実施したところ、N-メチルフェニルアラニンのピークが顕著に検出され、フェニルアラニンとのピーク強度比は0.25 mM では12.4、1 mMでは16.0であった(図3 (e), (f))。これらの結果より、PheRS野生型と比較して、PheRS変異体05はN-メチルフェニルアラニンのアミノアシル化活性が高く、その結果、N-メチルフェニルアラニンを含むペプチドの翻訳合成を促進することを確認した。
formylMetArgPheArgAspTyrLysAspAspAspAspLys
formylMetArg[MePhe]ArgAspTyrLysAspAspAspAspLys
Calc. m/z: [H+M]+ = 1631.7(配列P-F1に対応するペプチド。)
Calc. m/z: [H+M]+ = 1645.7(配列P-MeF1に対応するペプチド。)
N-メチルフェニルアラニンの取り込み効率をpdCpA法と比較した。フェニルアラニンを1個、2連続、または3連続含む配列を用いて無細胞翻訳系による翻訳を行い、電気泳動で合成されたペプチドのバンドを検出した。本発明のPheRS変異体(PhrRS05(配列番号2))を用いた場合とpdCpA法を用いた場合で比較したところ、いずれの場合もpdCpA法に比べ本発明のPheRS変異体を用いた方が高い量の合成ペプチドが検出され、翻訳効率が高いことが確認された。特にN-メチルフェニルアラニンを2連続、および3連続含む配列を翻訳させた場合のペプチド生成量は、本発明のPheRS変異体(PhrRS05)を用いた場合が、pdCpA法を用いた場合よりも4~8倍高いことが判明した。
大腸菌野生型ValRS遺伝子を含むORF配列(配列番号23、24)をコードしたプラスミド(PQE-32(2)2_wtVALRS)を出発物質とし、PCR法を用いた部位特異的変異を導入により表3に記載した変異を持つValRSプラスミド(N末端にHis-tag(6xHis)を有する)を構築した。具体的には、10ng/μLの鋳型 2μL、2x KOD Fx buffer (TOYOBO社 KFX-101) 10μL、10μM Fowardプライマー 0.6μL、10μM Reverseプライマー 0.6μL、2 mM dNTP 4μL、 KOD FX(TOYOBO社 KFX-101) 0.4μL、H2O 2.4μLを混合し、続いてその反応液を94℃ 2分加熱した後、98℃10秒、68℃7分の加熱からなるサイクルに10サイクル晒し、変異遺伝子を増幅した。なお、用いた鋳型プラスミド及びFowardプライマー、Reverseプライマーの組み合わせを表4に示す。各プライマーの配列は、「F.V2」から「F.V19」、「F.V46」から「F.V48」、および「F.V13-01」から「F.V13-16」までは順に配列番号:43から79、「R.V2」から「R.V19」、「R.V46」から「R.V48」、および「R.V13-01」から「R.V13-16」までは順に配列番号:80から116である。その後、PCR反応液に10U/μLのDpnI 0.5μLを添加し、さらに37℃ 1.5時間のインキュベートにより鋳型DNAを消化させ、得られた変異DNAを精製した。続いて、得られた遺伝子変異DNAとlacI遺伝子をコードするpREP4(Invitrogen、V004-50)を同時に大腸菌株XL-1 Blue(STRATAGENE、200236)に形質転換し、その形質転換株をアンピシリンとカナマイシンを含む寒天培地に撒くことで得られたクローンから目的プラスミドを精製し、変異が導入されていることを確認した。
また、多段階の変異導入が必要なプラスミド構築には、上記操作を繰り返すことで目的の変異導入プラスミドを得た。その場合のプライマー及び鋳型の組み合わせを表4に示す。
続いて、得られた変異プラスミドを大腸菌に導入し、変異タンパク質の発現を行った。まず、変異プラスミドとpREP4(Invitrogen、V004-50)を形質転換した大腸菌BL21株をカナマイシン、アンピシリンを含むLB培地4mLにて得られた形質転換株を37℃にて培養した。その後、600 nmでのOD値が0.4~0.8に達してから0.5mM終濃度のIPTGを添加し、さらに4時間37℃で培養した後、遠心分離機により菌体を集めた。
次に、得られた菌体を破砕し、その上清から目的の変異タンパク質を精製した。具体的には、上記菌体を600μLのCHAPS溶液(0.5 % CHAPS (DOJINDO: 349-04722)、50 % TBS (TaKaRa、T903))に懸濁し、6μLの30U/μl rLysozyme(Novagen, 71110-3)を混合した後、室温にて10分インキュベートし、さらに2μLの2.5U/μLのbenzonase nuclease(Novagen, 70746-3)を混合した後、室温にて20分インキュベートし、遠心分離により不溶性画分を分離した。続いて、得られた上清に対し、キアゲン社のNi-NTA spin column kit(Qiagen、 31314)を用いてプロダクトマニュアルに従って変異タンパク質を精製した。最後に、脱塩カラムPD miniTrap G-25(GEヘルスケア 28-9180-07)を用い、プロダクトマニュアルに従って過剰なイミダゾールを除去した。
[In vitro転写反応による大腸菌tRNAValの合成]
鋳型DNA(D-tRNAVal2A (配列番号117))から、7.5 mM GMP存在下、RiboMAX Large Scale RNA production System T7(Promega社,P1300)を用いたin vitro 転写反応により大腸菌tRNA(R-tRNAVal2A (配列番号118))を合成し、RNeasy Mini kit(Qiagen社)により精製した。
tRNAVal2A DNA配列:
GGCGTAATACGACTCACTATAGCGTCCGTAGCTCAGTTGGTTAGAGCACCACCTTGACATGGTGGGGGTCGGTGGTTCGAGTCCACTCGGACGCACCA
tRNAVal2A RNA配列:
GCGUCCGUAGCUCAGUUGGUUAGAGCACCACCUUGACAUGGUGGGGGUCGGUGGUUCGAGUCCACUCGGACGCACCA
アミノアシル化反応を行うために、40μM 転写tRNA、10 mM HEPES-K(pH7.6)、10 mM KCl溶液を95℃で2分間加熱し、その後室温に5分以上静置させることでtRNAのリフォールディングを行った。このtRNA溶液を最終濃度10μMになるように、アシル化バッファー(最終濃度50 mM HEPES-K[pH7.6], 2 mM ATP, 100 mM 酢酸カリウム、10 mM 酢酸マグネシウム、1 mM DTT、2 mM spermidine、0.1 mg/mL Bovine Serum Albumin)を添加後、 ValRS野生型もしくは変異体(最終濃度0.2-1μM)およびN-メチルバリン (最終濃度5 mM)と混合し、37℃で10分間インキュベートした。反応溶液に4倍量のローディングバッファー(90 mM 酢酸ナトリウム[pH5.2]、10 mM EDTA、95%(w/w)ホルムアミド、0.001%(w/v)キシレンシアノール)を添加し、6M尿素を含む酸性PAGE で分析し、未反応tRNAとアミノアシルtRNAを分離することでアミノアシル化活性を確認した。RNAの染色は、SYBR Gold (Life Technologies)を用い、検出にはLAS4000(GEヘルスケア)を用いた(図4)。
この結果、変異体13にてN-メチルバリンでアシル化されたtRNAが観測され、野生型ValRSよりもNメチルバリンに対するアミノアシル化活性が高いことが示された(図4、レーン2 vs10)。
鋳型DNA(D-V,D-V2, D-V3 (それぞれ配列番号119、121、123))から、RiboMAX Large Scale RNA production System T7(Promega社,P1300)を用いたin vitro 転写反応により翻訳用鋳型mRNA(R-V, R-V2, R-V3 (それぞれ配列番号120、122、124))を合成し、RNeasy Mini kit(Qiagen社)により精製した。
DNA配列:
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAACAAGGAGAAAAACATGCGTGTCCGTGACTACAAGGACGACGACGACAAGTAAGCTTCG
RNA配列:
GGGUUAACUUUAACAAGGAGAAAAACAUGCGUGUCCGUGACUACAAGGACGACGACGACAAGUAAGCUUCG
DNA配列:
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAACAAGGAGAAAAACATGCGTGTCGTCCGTGACTACAAGGACGACGACGACAAGTAAGCTTCG
RNA配列:
GGGUUAACUUUAACAAGGAGAAAAACAUGCGUGUCGUCCGUGACUACAAGGACGACGACGACAAGUAAGCUUCG
DNA配列:
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAACAAGGAGAAAAACATGCGTGTCGTCGTCCGTGACTACAAGGACGACGACGACAAGTAAGCTTCG
RNA配列:
GGGUUAACUUUAACAAGGAGAAAAACAUGCGCGUGUCGUCGUCUGACUACAAGGACGACGACGACAAGUAAGCUUCG
N-メチルバリンの翻訳導入を確かめるため、N-メチルバリンとValRS変異体を無細胞翻訳系に加えることで、所望のN-メチルバリンを含有するポリペプチドの翻訳合成を行った。翻訳系は、大腸菌由来の再構成無細胞タンパク質合成系であるPURE systemを用いた。具体的には、基本的な無細胞翻訳液(1mM GTP,1mM ATP,20mMクレアチンリン酸,50mM HEPES-KOH pH7.6,100mM 酢酸カリウム,9mM 酢酸マグネシウム,2mMスペルミジン,1mM ジチオスレイトール,1.5mg/ml E.coli MRE600(RNaseネガティブ)由来tRNA(Roche社),0.1mM 10-HCO-H4folate、4μg/ml クレアチンキナーゼ,3μg/ml ミオキナーゼ,2unit/ml 無機ピロフォスファターゼ,1.1μg/ml ヌクレオシド二リン酸キナーゼ,0.6μM メチオニルtRNAトランスフォルミラーゼ,0.26μM EF-G,0.24μM RF2,0.17μM RF3,0.5μM RRF,2.7μM IF1,0.4μM IF2,1.5μM IF3,40μM EF-Tu,84μM EF-Ts,1.2μM リボソーム,0.03μM ArgRS,0.13μM AspRS,0.11μM LysRS,0.03μM MetRS,0.02μM TyrRS(自家調製タンパクは基本的にHisタグ付加タンパクとして調製した))に、1μM 鋳型mRNA、アルギニン、アスパラギン酸、リシン、メチオニン、チロシンをそれぞれ250μMずつ加えた溶液に対して、ValRS野生型もしくは変異体とN-メチルバリンを添加し、37℃で1時間静置することでペプチドの翻訳合成が達成された。
N-メチルバリンが翻訳導入されたペプチドを検出するために、MALDI-TOF MSを用いた質量分析を実施した。具体的には、上述の無細胞翻訳系に1μM 鋳型mRNA(R-V (配列番号120))とアルギニン、リシン、メチオニン、チロシン、アスパラギン酸(各々最終濃度250μM)を加えた溶液を調製し、ValRS(最終濃度0.1-1μM)とN-メチルバリン (最終濃度5mM)を添加し、37℃で60分間保温した。得られた翻訳反応物を、SPE C-TIP(日京テクノス社)で精製し、MALDI-TOF MSで分析した。翻訳産物はマトリックスとしてα-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸を用いてMALDI-TOF MSスペクトルを測定して同定した。
野生型ValRS(配列番号24)を用いて翻訳した結果、無細胞翻訳系内に混入しているバリンが導入されたペプチド配列P-V1に相当するピーク ((図5(a), Peak V1、m/z: [H+M]+ = 1583.6)が主生成物として観測された。種々の変異ValRSを用いて同様の実験を行ったところ、ValRS04(配列番号3)、ValRS13(配列番号4)を用いた場合、N-メチルバリンが導入されたペプチド配列P-MeV1に相当するピーク ((図5(b), Peak MeV1、m/z: [H+M]+ = 1597.5、図5(c), Peak MeV2、m/z: [H+M]+ = 1597.5)が主生成物として観測された。このことから、ValRS04,ValRS13は野生型ValRSよりもN-メチルバリンに対する活性が向上していることが翻訳の観点からも示された。また、翻訳系に混入しているバリンが導入されたペプチドP-V1に相当するピーク(図5(b) Peak V2, (c)Peak V3)も同時に観測されたが、そのピーク強度はValRS13の方が小さいことから、ValRS13の方がN-メチルバリンに対する活性が高いことが示唆された(図5(b), (c))。
formylMetArgValArgAspTyrLysAspAspAspAspLys
formylMetArg[MeVal]ArgAspTyrLysAspAspAspAspLys
Calc. m/z: [H+M]+ = 1583.7(配列P-V1に対応するペプチド。)
Calc. m/z: [H+M]+ = 1597.7(配列P-MeV1に対応するペプチド。)
上述のValRS13に対してさらに変異を導入することで、N-メチルバリンに対する活性の向上を目指した。目的の変異を導入したプラスミドは上述のように調製し、大腸菌での発現・精製を実施することでValRS変異体を調製した(表3)。アミノアシル化反応および翻訳合成によるスクリーニングの結果、ValRS13と比較してValRS13-11(配列番号5)がN-メチルバリンに対して高い活性を示した。
formylMetArg[MeVal][MeVal]ArgAspTyrLysAspAspAspAspLys
formylMetArg[MeVal]ValArgAspTyrLysAspAspAspAspLys
もしくは
formylMetArgVal[MeVal]ArgAspTyrLysAspAspAspAspLys
formylMetArg[MeVal][MeVal][MeVal]ArgAspTyrLysAspAspAspAspLys
formylMetArg[MeVal][MeVal]ValArgAspTyrLysAspAspAspAspLys
もしくは
formylMetArg[MeVal]Val[MeVal]ArgAspTyrLysAspAspAspAspLys
もしくは
formylMetArgVal[MeVal][MeVal]ArgAspTyrLysAspAspAspAspLys
formylMetArg[MeVal]ValValArgAspTyrLysAspAspAspAspLys
もしくは
formylMetArgVal[MeVal]ValArgAspTyrLysAspAspAspAspLys
もしくは
formylMetArgValVal[MeVal]ArgAspTyrLysAspAspAspAspLys
Calc. m/z: [H+M]+ = 1710.8(配列P-MeV2に対応するペプチド。)
Calc. m/z: [H+M]+ = 1696.8(配列P-MeV4に対応するペプチド。)
Calc. m/z: [H+M]+ = 1823.9(配列P-MeV3に対応するペプチド。)
Calc. m/z: [H+M]+ = 1809.9(配列P-MeV5に対応するペプチド。)
Calc. m/z: [H+M]+ = 1795.9(配列P-MeV6に対応するペプチド。)
大腸菌野生型SerRS遺伝子(PQE-32(2)2_wtSERRS)を含むORF配列(配列番号25、26)をコードしたプラスミドを出発物質とし、PCR法を用いた部位特異的変異を導入により表5に記載した変異SerRSプラスミド(N末端にHis-tag(6xHis)を有する)を構築した。具体的には、10ng/μLの鋳型 2.5μL、 2x KOD Fx buffer (TOYOBO社 KFX-101)12.5μL、10μM Fowardプライマー 0.75μL、10μM Reverseプライマー 0.75μL、2 mM dNTP 5μL、 KOD FX(TOYOBO社 KFX-101) 0.5μL、H2O 3μLを混合し、続いてその反応液を94℃ 2分加熱した後、98℃10秒、68℃7分の加熱からなるサイクルに10サイクル晒し、変異遺伝子を増幅した。なお、用いた鋳型プラスミド及びFowardプライマー、Reverseプライマーの組み合わせを表6に示した。各プライマーの配列は、「F.S2」から「F.S8」、「F.S15」から「F.S23」、および「F.S33」から「F.S38」までは順に配列番号:128から149、「R.S2」から「R.S8」、「R.S15」から「R.S23」、および「R.S33」から「R.S38」までは順に配列番号:150から171である。その後、PCR反応液に10U/μLのDpnI 0.5μLを添加し、さらに37℃ 1.5時間のインキュベートにより鋳型DNAを消化させ、得られた変異DNAを精製した。続いて、得られた遺伝子変異DNAとlacI遺伝子をコードするpREP4(Invitrogen、V004-50)を同時に大腸菌株XL-1 Blue(STRATAGENE、200236)に形質転換し、その形質転換株をアンピシリンとカナマイシンを含む寒天培地に撒くことで得られたクローンから目的プラスミドを精製し、変異が導入されていることを確認した。
続いて、得られた変異プラスミドを大腸菌に導入し、変異タンパク質の発現を行った。まず、変異プラスミドとpREP4(Invitrogen、V004-50)を形質転換した大腸菌BL21株をカナマイシン、アンピシリンを含むLB培地4mLにて得られた形質転換株を37℃にて培養した。その後、600 nmでのOD値が0.4~0.8に達してから0.5mM終濃度のIPTGを添加し、さらに4時間37℃で培養した後、遠心分離機により菌体を集めた。
次に、得られた菌体を破砕し、その上清から目的の変異タンパク質を精製した。具体的には、上記菌体を600μLのCHAPS溶液(0.5 % CHAPS (DOJINDO: 349-04722)、50 % TBS (TaKaRa、T903))に懸濁し、6μLの30U/μl rLysozyme(Novagen, 71110-3)を混合した後、室温にて10分インキュベートし、さらに2μLの2.5U/μLのbenzonase nuclease(Novagen, 70746-3)を混合した後、室温にて20分インキュベートし、遠心分離により不溶性画分を分離した。続いて、得られた上清に対し、キアゲン社のNi-NTA spin column kit(Qiagen、 31314)を用いてプロダクトマニュアルに従って変異タンパク質を精製した。最後に、脱塩カラムPD miniTrap G-25(GEヘルスケア 28-9180-07)を用い、プロダクトマニュアルに従って過剰なイミダゾールを除去した。
[In vitro転写反応による大腸菌tRNASerの合成]
鋳型DNA(D-tRNASer3 (配列番号172))から、7.5 mM GMP存在下、RiboMAX Large Scale RNA production System T7(Promega社,P1300)を用いたin vitro 転写反応により大腸菌tRNA(R-tRNASer3 (配列番号173))を合成し、RNeasy Mini kit(Qiagen社)により精製した。
tRNASer3 DNA配列:
GGCGTAATACGACTCACTATAGGTGAGGTGGCCGAGAGGCTGAAGGCGCTCCCCTGCTAAGGGAGTATGCGGTCAAAAGCTGCATCCGGGGTTCGAATCCCCGCCTCACCGCCA
tRNASer3 RNA配列:
GGUGAGGUGGCCGAGAGGCUGAAGGCGCUCCCCUGCUAAGGGAGUAUGCGGUCAAAAGCUGCAUCCGGGGUUCGAAUCCCCGCCUCACCGCCA
アミノアシル化反応を行うために、40μM 転写tRNA、10 mM HEPES-K(pH7.6)、10 mM KCl溶液を95℃で2分間加熱し、その後室温に5分以上静置させることでtRNAのリフォールディングを行った。このtRNA溶液を最終濃度10μMになるように、アシル化バッファー(最終濃度50 mM HEPES-K[pH7.6], 2 mM ATP, 100 mM 酢酸カリウム、10 mM 酢酸マグネシウム、1 mM DTT、2 mM spermidine、0.1 mg/mL Bovine Serum Albumin)を添加後、 SerRS野生型もしくは変異体(最終濃度0.1-2μM)およびN-メチルセリン(最終濃度1 mM)と混合し、37℃で10分間インキュベートした。反応溶液に4倍量のローディングバッファー(90 mM 酢酸ナトリウム[pH5.2]、10 mM EDTA、95%(w/w)ホルムアミド、0.001%(w/v)キシレンシアノール)を添加し、6M尿素を含む酸性PAGE で分析し、未反応tRNAとアミノアシルtRNAを分離することでアミノアシル化活性を確認した。RNAの染色は、SYBR Gold (Life Technologies)を用い、検出にはLAS4000(GEヘルスケア)を用いた(図8)。
鋳型DNA(D-S (配列番号174))から、RiboMAX Large Scale RNA production System T7(Promega社,P1300)を用いたin vitro 転写反応により鋳型用mRNA(R-S (配列番号175))を合成し、RNeasy Mini kit(Qiagen社)により精製した。
DNA配列:
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAACAAGGAGAAAAACATGCGTTCCCGTGACTACAAGGACGACGACGACAAGTAAGCTTCG
RNA配列:
GGGUUAACUUUAACAAGGAGAAAAACAUGCGUUCCCGUGACUACAAGGACGACGACGACAAGUAAGCUUCG
N-メチルセリンの翻訳導入を確かめるため、N-メチルセリンとSerRSを無細胞翻訳系に加えることで、所望のN-メチルセリンを含有するポリペプチドの翻訳合成を行った。翻訳系は、大腸菌由来の再構成無細胞タンパク質合成系であるPURE systemを用いた。具体的には、基本的な無細胞翻訳液(1mM GTP,1mM ATP,20mMクレアチンリン酸,50mM HEPES-KOH pH7.6,100mM 酢酸カリウム,9mM 酢酸マグネシウム,2mMスペルミジン,1mM ジチオスレイトール,1.5mg/ml E.coli MRE600(RNaseネガティブ)由来tRNA(Roche社),0.1mM 10-HCO-H4folate、4μg/ml クレアチンキナーゼ,3μg/ml ミオキナーゼ,2unit/ml 無機ピロフォスファターゼ,1.1μg/ml ヌクレオシド二リン酸キナーゼ,0.6μM メチオニルtRNAトランスフォルミラーゼ,0.26μM EF-G,0.24μM RF2,0.17μM RF3,0.5μM RRF,2.7μM IF1,0.4μM IF2,1.5μM IF3,40μM EF-Tu,84μM EF-Ts,1.2μM リボソーム,0.03μM ArgRS,0.13μM AspRS,0.11μM LysRS,0.03μM MetRS,0.02μM TyrRS(自家調製タンパクは基本的にHisタグ付加タンパクとして調製した))に、1μM 鋳型mRNA、アルギニン、アスパラギン酸、リシン、メチオニン、チロシンをそれぞれ250μMずつ加えた溶液に対して、SerRS野生型もしくは変異体とN-メチルセリンを添加し、37℃で1時間静置することでペプチドの翻訳合成が達成された。
N-メチルセリンが翻訳導入されたペプチドを検出するために、MALDI-TOF MSを用いた質量分析を実施した。具体的には、上述の無細胞翻訳系に1μM 鋳型mRNA(R-S (配列番号175))とアルギニン、リシン、メチオニン、チロシン、アスパラギン酸(各々最終濃度250μM)を加えた溶液を調製し、SerRS(最終濃度0.1-2μM)とN-メチルセリン(最終濃度5mM)を添加し、37℃で60分間保温した。得られた翻訳反応物を、SPE C-TIP(日京テクノス社)で精製し、MALDI-TOF MSで分析した。翻訳産物はマトリックスとしてα-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸を用いてMALDI-TOF MSスペクトルを測定して同定した。
formylMetArgSerArgAspTyrLysAspAspAspAspLys
formylMetArg[MeSer]ArgAspTyrLysAspAspAspAspLys
Calc. m/z: [H+M]+ = 1571.7(配列P-CT21Serに対応するペプチド。)
Calc. m/z: [H+M]+ = 1585.7(配列P-CT21MeSerに対応するペプチド。)
N末端にポリヒスチジン配列を有し、表7に記載した変異を含んだ発現ベクターを構築した。続いて、このベクターを発現株へと形質転換し、細胞破砕後の上清からニッケルカラムを用いて目的の変異タンパク質を精製した。
鋳型DNA(D-T (配列番号177))から、RiboMAX Large Scale RNA production System T7(Promega社,P1300)を用いたin vitro 転写反応により鋳型用mRNA(R-T (配列番号178))を合成し、RNeasy Mini kit(Qiagen社)により精製した。
DNA配列:
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAAGGCTGGTCCGGGTTTTATGACTAAGAGTGGTAGTGGTAGTTAAGCTTCG
RNA配列:
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGAAGGCUGGUCCGGGUUUUAUGACUAAGAGUGGUAGUGGUAGUUAAGCUUCG
N-メチルスレオニンの翻訳導入を確かめるため、N-メチルスレオニンとThrRS変異体を無細胞翻訳系に加えることで、所望のN-メチルスレオニンを含有するポリペプチドの翻訳合成を行った。翻訳系は、大腸菌由来の再構成無細胞タンパク質合成系であるPURE systemを用いた。具体的には、基本的な無細胞翻訳液(1mM GTP,1mM ATP,20mMクレアチンリン酸,50mM HEPES-KOH pH7.6,100mM 酢酸カリウム,9mM 酢酸マグネシウム,2mMスペルミジン,1mM ジチオスレイトール,1.5mg/ml E.coli MRE600(RNaseネガティブ)由来tRNA(Roche社),0.1mM 10-HCO-H4folate、4μg/ml クレアチンキナーゼ,3μg/ml ミオキナーゼ,2unit/ml 無機ピロフォスファターゼ,1.1μg/ml ヌクレオシド二リン酸キナーゼ,0.6μM メチオニルtRNAトランスフォルミラーゼ,0.26μM EF-G,0.24μM RF2,0.17μM RF3,0.5μM RRF,2.7μM IF1,0.4μM IF2,1.5μM IF3,40μM EF-Tu,93μM EF-Ts,1.2μM リボソーム,2.73μM AlaRS,0.13μM AspRS,0.09μM GlyRS,0.11μM LysRS,0.03μM MetRS,0.68μM PheRS,0.16μM ProRS、0.25μM SerRS(自家調製タンパクは基本的にHisタグ付加タンパクとして調製した))に、1μM 鋳型mRNA、グリシン、プロリン、アラニン、フェニルアラニン、リシン、メチオニン、セリンをそれぞれ250μMずつ加えた溶液に対して、ThrRS野生型もしくは変異体とN-メチルスレオニンを添加し、37℃で1時間静置することでペプチドの翻訳合成が達成された。
N-メチルスレオニンが翻訳導入されたペプチドを検出するために、MALDI-TOF MSを用いた質量分析を実施した。具体的には、上述の無細胞翻訳系に1μM 鋳型mRNA(R-T (配列番号178))とグリシン、プロリン、アラニン、フェニルアラニン、リシン、メチオニン、セリン(各々最終濃度250μM)を加えた溶液を調製し、ThrRS (最終濃度2μM)とN-メチルスレオニン (最終濃度5mM)を添加し、37℃で60分間保温した。得られた翻訳反応物を、SPE C-TIP(日京テクノス社)で精製し、MALDI-TOF MSで分析した。翻訳産物はマトリックスとしてα-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸を用いてMALDI-TOF MSスペクトルを測定して同定した。
formylMetLysAlaGlyProGlyPheMetThrLysSerGlySerGlySer
formylMetLysAlaGlyProGlyPheMet[MeThr]LysSerGlySerGlySer
Calc. m/z: [H+M]+ = 1470.7, [K+M]+ = 1508.8(配列P-3lib15Thrに対応するペプチド。)
Calc. m/z: [H+M]+ = 1484.7, [K+M]+ = 1522.8(配列P-3lib15MeThrに対応するペプチド。)
<TrpRS野生型および変異体のタンパク質調製>
N末端にポリヒスチジン配列を有し、表8に記載した変異を含んだ発現ベクターを構築した。続いて、このベクターを発現株へと形質転換し、細胞破砕後の上清からニッケルカラムを用いて目的の変異タンパク質を精製した。
鋳型DNA(D-W (配列番号196)から、RiboMAX Large Scale RNA production System T7(Promega社,P1300)を用いたin vitro 転写反応により鋳型用mRNA(R-W (配列番号197))を合成し、RNeasy Mini kit(Qiagen社)により精製した。
DNA配列:
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAACAAGGAGAAAAACATGCGTTGGCGTGACTACAAGGACGACGACGACAAGTAAGCTTCG
RNA配列:
GGGUUAACUUUAACAAGGAGAAAAACAUGCGUUGGCGUGACUACAAGGACGACGACGACAAGUAAGCUUCG
N-メチルトリプトファンの翻訳導入を確かめるため、N-メチルトリプトファンとTrpRS変異体を無細胞翻訳系に加えることで、所望のN-メチルトリプトファンを含有するポリペプチドの翻訳合成を行った。翻訳系は、大腸菌由来の再構成無細胞タンパク質合成系であるPURE systemを用いた。具体的には、基本的な無細胞翻訳液(1mM GTP,1mM ATP,20mMクレアチンリン酸,50mM HEPES-KOH pH7.6,100mM 酢酸カリウム,9mM 酢酸マグネシウム,2mMスペルミジン,1mM ジチオスレイトール,1.5mg/ml E.coli MRE600(RNaseネガティブ)由来tRNA(Roche社),0.1mM 10-HCO-H4folate、4μg/ml クレアチンキナーゼ,3μg/ml ミオキナーゼ,2unit/ml 無機ピロフォスファターゼ,1.1μg/ml ヌクレオシド二リン酸キナーゼ,0.6μM メチオニルtRNAトランスフォルミラーゼ,0.26μM EF-G,0.24μM RF2,0.17μM RF3,0.5μM RRF,2.7μM IF1,0.4μM IF2,1.5μM IF3,40μM EF-Tu,84μM EF-Ts,1.2μM リボソーム,0.03μM ArgRS,0.13μM AspRS,0.11μM LysRS,0.03μM MetRS,0.02μM TyrRS(自家調製タンパクは基本的にHisタグ付加タンパクとして調製した))に、1μM 鋳型mRNA、アルギニン、アスパラギン酸、リシン、メチオニン、チロシンをそれぞれ250μMずつ加えた溶液に対して、TrpRS野生型もしくは変異体とN-メチルトリプトファンを添加し、37℃で1時間静置することでペプチドの翻訳合成が達成された。
N-メチルトリプトファンが翻訳導入されたペプチドを検出するために、MALDI-TOF MSを用いた質量分析を実施した。具体的には、上述の無細胞翻訳系に1μM 鋳型mRNA(R-W (配列番号197))とアルギニン、リシン、メチオニン、チロシン、アスパラギン酸(各々最終濃度250μM)を加えた溶液を調製し、TrpRS (最終濃度5μM)とN-メチルトリプトファン(最終濃度5mM)を添加し、37℃で60分間保温した。得られた翻訳反応物を、SPE C-TIP(日京テクノス社)で精製し、MALDI-TOF MSで分析した。翻訳産物はマトリックスとしてα-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸を用いてMALDI-TOF MSスペクトルを測定して同定した。
formylMetArgTrpArgAspTyrLysAspAspAspAspLys
formylMetArg[MeTrp]ArgAspTyrLysAspAspAspAspLys
Calc. m/z: [H+M]+ = 1670.7(配列P-CT29Trpに対応するペプチド。)
Calc. m/z: [H+M]+ = 1684.7(配列P-CT29MeTrpに対応するペプチド。)
<LeuRS野生型および変異体のタンパク質調製>
N末端にポリヒスチジン配列を有し、表9に記載した変異を含んだ発現ベクターを構築した。続いて、このベクターを発現株へと形質転換し、細胞破砕後の上清からニッケルカラムを用いて目的の変異タンパク質を精製した。
鋳型DNA(D-L (配列番号200)から、RiboMAX Large Scale RNA production System T7(Promega社,P1300)を用いたin vitro 転写反応により鋳型用mRNA(R-L (配列番号201))を合成し、RNeasy Mini kit(Qiagen社)により精製した。
DNA配列:
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAACAAGGAGAAAAACATGCGTCTCCGTGACTACAAGGACGACGACGACAAGTAAGCTTCG
RNA配列:
GGGUUAACUUUAACAAGGAGAAAAACAUGCGUCUCCGUGACUACAAGGACGACGACGACAAGUAAGCUUCG
N-メチルロイシンの翻訳導入を確かめるため、N-メチルロイシンとLeuRS変異体を無細胞翻訳系に加えることで、所望のN-メチルロイシンを含有するポリペプチドの翻訳合成を行った。翻訳系は、大腸菌由来の再構成無細胞タンパク質合成系であるPURE systemを用いた。具体的には、基本的な無細胞翻訳液(1mM GTP,1mM ATP,20mMクレアチンリン酸,50mM HEPES-KOH pH7.6,100mM 酢酸カリウム,9mM 酢酸マグネシウム,2mMスペルミジン,1mM ジチオスレイトール,1.5mg/ml E.coli MRE600(RNaseネガティブ)由来tRNA(Roche社),0.1mM 10-HCO-H4folate、4μg/ml クレアチンキナーゼ,3μg/ml ミオキナーゼ,2unit/ml 無機ピロフォスファターゼ,1.1μg/ml ヌクレオシド二リン酸キナーゼ,0.6μM メチオニルtRNAトランスフォルミラーゼ,0.26μM EF-G,0.24μM RF2,0.17μM RF3,0.5μM RRF,2.7μM IF1,0.4μM IF2,1.5μM IF3,40μM EF-Tu,84μM EF-Ts,1.2μM リボソーム,0.03μM ArgRS,0.13μM AspRS,0.11μM LysRS,0.03μM MetRS,0.02μM TyrRS(自家調製タンパクは基本的にHisタグ付加タンパクとして調製した))に、1μM 鋳型mRNA、アルギニン、アスパラギン酸、リシン、メチオニン、チロシンをそれぞれ250μMずつ加えた溶液に対して、LeuRS野生型もしくは変異体とN-メチルロイシンを添加し、37℃で1時間静置することでペプチドの翻訳合成が達成された。
N-メチルロイシンが翻訳導入されたペプチドを検出するために、MALDI-TOF MSを用いた質量分析を実施した。具体的には、上述の無細胞翻訳系に1μM 鋳型mRNA(R-L (配列番号201))とアルギニン、リシン、メチオニン、チロシン、アスパラギン酸(各々最終濃度250μM)を加えた溶液を調製し、LeuRS (最終濃度0.4-2μM)とN-メチルロイシン (最終濃度5mM)を添加し、37℃で60分間保温した。得られた翻訳反応物を、SPE C-TIP(日京テクノス社)で精製し、MALDI-TOF MSで分析した。翻訳産物はマトリックスとしてα-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸を用いてMALDI-TOF MSスペクトルを測定して同定した。
formylMetArgLeuArgAspTyrLysAspAspAspAspLys
formylMetArg[MeLeu]ArgAspTyrLysAspAspAspAspLys
Calc. m/z: [H+M]+ = 1597.7(配列P-CT23Leuに対応するペプチド。)
Calc. m/z: [H+M]+ = 1611.7(配列P-CT23MeLeuに対応するペプチド。)
<ValRS野生型および変異体のタンパク質調製>
N末端にポリヒスチジン配列を有し、N-メチルバリンへの活性を向上させる触媒ドメインの変異(N44G,T45S)及び校正ドメインの変異T279A(G)を含んだ改変ValRSの発現ベクターを構築した(表10)。続いて、このベクターを発現株へと形質転換し、細胞破砕後の上清からニッケルカラムを用いて目的の変異タンパク質を精製した。
[In vitro転写反応による大腸菌tRNAValの合成]
鋳型DNA(D-tRNAVal1(配列番号204))から、7.5 mM GMP存在下、RiboMAX Large Scale RNA production System T7(Promega社,P1300)を用いたin vitro 転写反応により大腸菌tRNA(R-tRNAVal1 (配列番号205))を合成し、RNeasy Mini kit(Qiagen社)により精製した。
tRNAVal1 DNA配列:
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTGATTAGCTCAGCTGGGAGAGCACCTCCCTTACAAGGAGGGGGTCGGCGGTTCGATCCCGTCATCACCCACCA
tRNAVal1 RNA配列:
GGGUGAUUAGCUCAGCUGGGAGAGCACCUCCCUUACAAGGAGGGGGUCGGCGGUUCGAUCCCGUCAUCACCCACCA
アミノアシル化反応を行うために、50μM 転写tRNA、10 mM HEPES-K(pH7.6)、10 mM KCl溶液を95℃で2分間加熱し、その後室温に5分以上静置させることでtRNAのリフォールディングを行った。このtRNA溶液を最終濃度10μMになるように、アシル化バッファー(最終濃度50 mM HEPES-K[pH7.6], 2 mM ATP, 100 mM 酢酸カリウム、10 mM 酢酸マグネシウム、1 mM DTT、2 mM spermidine、0.1 mg/mL Bovine Serum Albumin)を添加後、 ValRS変異体(最終濃度2μM)およびN-メチルバリン (最終濃度0.08-5 mM)またはバリン(最終濃度0.031-0.25mM)と混合し、37℃で10分間インキュベートした。反応溶液に4倍量のローディングバッファー(90 mM 酢酸ナトリウム[pH5.2]、10 mM EDTA、95%(w/w)ホルムアミド、0.1%(w/v)キシレンシアノール)を添加し、6M尿素を含む酸性PAGE で分析し、未反応tRNAとアミノアシルtRNAを分離することでアミノアシル化活性を確認した。RNAの染色は、SYBR Gold (Life Technologies)を用い、検出にはLAS4000(GEヘルスケア)を用いた。
Claims (10)
- 大腸菌由来の野生型ValRSの(a)43位アスパラギンに相当する部位に位置するアミノ酸がグリシンまたはアラニン、および/または(b)45位スレオニンに相当する部位に位置するアミノ酸がセリンであるValRSのアミノ酸配列を含み、N-メチルバリンによりtRNAをアシル化する活性を有するポリペプチド(ただし、ValRSのアミノ酸配列において大腸菌由来の野生型ValRSの43位アスパラギンに相当する部位に位置するアミノ酸がアラニンであり、かつ41位プロリンに相当する部位に位置するアミノ酸がグリシンであるアミノ酸配列を含むポリペプチドを除く)。
- 下記(a)および(b)で構成される群から選択される、請求項1に記載のポリペプチド。
(a) 配列番号:3、4、5、182および183からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド
(b) 配列番号:3、4、5、182および183からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド - 配列番号:3、4、5、182および183からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
- 請求項1~3のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項4に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項4に記載のポリヌクレオチドまたは請求項5に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項6に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、請求項1~3のいずれかに記載のポリペプチドを製造する方法。
- N-メチルバリンでアシル化されたtRNAの製造方法であって、請求項1~3のいずれかに記載のポリペプチドの存在下、N-メチルバリンおよびtRNAを接触させる工程を含む方法。
- N-メチルバリンを含むポリペプチドを製造する方法であって、請求項1~3のいずれかに記載のポリペプチドおよびN-メチルバリンの存在下、翻訳を行う工程を含む方法。
- 前記翻訳を行う工程が、無細胞翻訳系で行われる請求項9に記載の方法。
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