JP7017310B2 - スポットに分析方法を実行するための対照マーカー - Google Patents
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Description
分析される試料は、好ましくは生物学的試料である。
試料中で検出される分析物は、試料中で検出および/または定量することを望む任意の種類の天然または合成の化合物であってよい。
- ウイルス、HIV(ヒト免疫不全ウイルス)、特に、HIV-1もしくはHIV-2、HBV(B型肝炎ウイルス)、HCV(C型肝炎ウイルス)、HPV(ヒトパピローマウイルス)、HTLV(ヒトTリンパ球向性ウイルス)、特に、HTLV-IもしくはHTLV-IIなど、
- 寄生生物、ヒトもしくは非ヒト動物においてトキソプラズマ症(特に、トキソプラズマ原虫(Toxoplasma gondii)、マラリア(特に、プラスモジウム属(Plasmodium genus)の寄生生物、例えば熱帯マラリア原虫(Plasmodium falciparum)、三日熱マラリア原虫(Plasmodium vivax)、卵形マラリア原虫(Plasmodium ovale)、四日熱マラリア原虫(Plasmodium malariae)もしくは二日熱マラリア原虫(Plasmodium knowlesi)またはシャーガス病(特に、トリパノゾーマ・クルージ(Trypanosoma cruzi))を生じ得る寄生生物など、または
- 細菌、ヒトもしくは非ヒト動物において梅毒症(梅毒トレポネーマ(Treponema pallidum)またはライム病(特に、ボレリア属(Borrelia genus)からの細菌)を生じ得る細菌など
の1つもしくはいくつかの抗原および/細菌または1つもしくはいくつかの抗体および/または1つもしくはいくつかの特異的核酸を含んでよい。
捕捉リガンドは目的の化合物の特異的分子である。
検出リガンドは、目的の化合物の特異的分子である。それは、特に捕捉リガンドに固定された目的の化合物を検出できるようにする。
検出リガンドにカップリングされた検出マーカーは、直接マーカーまたは間接マーカーであってよい。
本発明は、固体支持体の表面に存在するスポット(複数可)の質、特に固体支持体の表面に存在するスポット(複数可)の存在、位置および/または完全性を対照できるようにする1つまたはいくつかの耐性対照マーカー(例えば耐性対照マーカーの混合物)の使用に基づいており、この対照は(またはこれらの対照のうちの1つ)は実行された分析方法の終了時に行われてよい。
a)前記化合物を固体支持体の表面に沈着させて、少なくとも1個のスポットを形成させるステップ、
b)好ましくは、固体支持体の表面を飽和させるステップ、
c)好ましくは、固体支持体の表面を乾燥させるステップ、
d)任意選択で、1回または複数回の洗浄ステップを実行するステップ、
e)任意選択で、スポットを検出リガンドの存在下に置くステップ、
f)任意選択で、1回または複数回の洗浄ステップを実行するステップ、
g)任意選択で、スポット(複数可)を少なくとも1つのレポーターまたは少なくとも1つの酵素、例えばレポーターにカップリングされていてもされていなくてもよいペルオキシダーゼ酵素の存在下に置くステップ、
h)任意選択で、1回または複数回の洗浄ステップを実行するステップ、
i)スポット(複数可)を少なくとも1つの基質(前記基質は、好ましくは、前記耐性対照マーカーを実施したい分析方法において使用されるものである)、好ましくはペルオキシダーゼ酵素の基質、例えばルミノールの存在下に置くステップ、
j)前記化合物によってスポット(複数可)で生成されるシグナルを測定するステップ、ならびに
k)ステップj)において測定されたシグナルが検出可能なシグナルである場合、前記化合物が耐性対照マーカーであると結論付けるステップ
を含む方法を実行できる。
本発明による1つの好ましい耐性対照マーカーはフルオロフォアである。この場合、耐性対照フルオロフォアと呼ばれる。
- 本発明による耐性対照マーカー(複数可)、特に耐性対照フルオロフォア(複数可)と
- 検出リガンドの検出マーカー(複数可)および/または分析方法において使用される検出リガンドの検出マーカー(複数可)に対応するシグナルを生成する化合物(複数可)との間
特に本発明による耐性対照マーカー(複数可)(特に耐性対照フルオロフォア(複数可))と、ルミノール、その類似物のうちの1つ、例えばイソルミノール、および/またはそれらの誘導体のうちの1つとペルオキシダーゼ酵素との反応によって得られるルミネッセンス化合物との間
に共鳴によるエネルギー移動はない。
- 吸収極大波長(エタノール中):635nm、
- 最大発光波長(エタノール中):658nm、および
- 吸収極大波長でのモル吸収係数:200,000M-1cm-1
を有する。
- 吸収極大波長(エタノール中):636nm、
- 最大発光波長(エタノール中):657nm、および
- 吸収極大波長でのモル吸収係数:200,000M-1cm-1
を有する。
本発明による耐性対照マーカーの別の例は、酵素の基質との反応によってルミネッセンス化合物を生成する前記酵素である。
検出リガンドの検出マーカー(複数可)によって生成されるまたは耐性対照マーカー(複数可)によって生成されるシグナルは、直接的または間接的に検出される。
本発明による分析方法を実行するために使用される支持体(複数可)は、固体支持体である。
本発明は、少なくとも1つの試料中の少なくとも1つの分析物を検出するための固体支持体を調製する方法であって、
a)固体支持体の少なくとも1つのコンパートメント、好ましくは少なくとも2つのコンパートメントの表面に、少なくとも1つの耐性対照マーカーおよび少なくとも1つの捕捉リガンドを含む混合物を沈着させて、スポットを得るステップ、
b)ステップa)をn-1回(nは1以上の整数である)繰り返して、前記コンパートメント(複数可)の表面の分析物を検出する目的でn個のスポットを得るステップ、
c)任意選択で、前記コンパートメント(複数可)の表面を飽和させるステップ、ならびに
d)任意選択で、前記コンパートメント(複数可)の表面を乾燥させるステップ
を含む方法にも関する。
- 少なくとも2種の溶液を固体支持体の表面に沈着させるステップであって、各溶液が前記耐性対照マーカーおよび捕捉リガンドを含み、耐性対照マーカーの濃度が一方の溶液から他方に増加し、耐性対照マーカーの最低濃度が予め決定した最少濃度以上であるステップ、
- 任意選択で、固体支持体の表面を飽和させるステップ、すなわち固体支持体への非特異的結合を回避できるようにする薬剤の存在下に固体支持体の表面を置くステップ、
- 任意選択で、固体支持体の表面を乾燥させるステップ、
- スポットの存在下に特異的捕捉リガンドを有する分析物を含む試料を置くステップ、
- スポットの存在下に前記分析物の特異的検出リガンドを置くステップであって、前記検出リガンドが直接または間接検出マーカーにカップリングされている、ステップ、
- 前記検出リガンドが間接検出マーカーにカップリングされている場合、前記間接検出マーカーのレポーター(第1のレポーターとも呼ばれる)を添加するステップ、および前記(第1の)レポーターが間接検出マーカーにカップリングされている場合、検出リガンドの間接検出方法の前記(第1の)のレポーターにカップリングされている間接検出マーカーの第2のレポーターを添加するステップ、
- 耐性対照マーカーによって生成されるシグナルを検出するステップ、
- 検出リガンドの検出マーカーによって生成されるシグナルを検出するステップ、ならびに
- 耐性対照マーカーによって生成されるシグナルおよび検出リガンドの検出マーカーによって生成されるシグナルの両方を検出できるようにする耐性対照マーカーの濃度を選択するステップ、
を含む方法を使用して例えば決定され得る。
- 少なくとも2種の溶液を固体支持体の表面に沈着させるステップであって、各溶液が耐性対照マーカーを含み、捕捉リガンドを含まず、耐性対照マーカーの濃度が少なくとも2個のスポットを形成するために一方の溶液から他方に増加しているステップ、
- 任意選択で、固体支持体の表面を飽和させるステップ、すなわち固体支持体への非特異的結合を回避できるようにする薬剤の存在下に固体支持体の表面を置くステップ、
- 任意選択で、固体支持体の表面を乾燥させるステップ、
- 任意選択で、
(i)1回または複数回の洗浄ステップを実行するステップ、
(ii)スポット(複数可)を検出リガンドの存在下に置くステップ、
(iii)スポット(複数可)をレポーターの存在下に置くステップ、
(iv)スポット(複数可)を基質の存在下に置くステップ、
うちの少なくとも1つを実行するステップ
- 耐性対照マーカーによって生成されるシグナルを検出するステップ、ならびに
- シグナルを検出できるようにする耐性対照マーカーの最少濃度を選択するステップ
を使用して例えば決定され得る。
本発明は、試料中の少なくとも1つの分析物を検出するためのデバイスであって、
- 固体支持体で生成される第1のシグナルおよび第2のシグナルを検出するための手段、ならびに
- 前記第1のシグナルの位置からリーディンググリッドを定義するため、および前記第2のシグナルを前記リーディンググリッドで読み取るための手段
を含むデバイスを提供することも目的とする。
- 照明システム、
- テレセントリック対物レンズ、
- フィルターホイール(前記テレセントリック対物レンズは、好ましくは、その出力レンズで前記フィルターホイールにカップリングされている)、および
- カメラ
を含むまたはからできていてよい。
- 可視ドメイン(位置調整画像とも呼ばれる)での画像、例えば照明システムからの照明を使用するが、特異的フィルターを使用しないことによる、
- 蛍光画像(検出画像とも呼ばれる)、照明システムからの照明および探索される蛍光に対する特異的フィルターを使用することによる、
- 照明および特異的フィルターを伴わない画像(分析画像とも呼ばれる)、例えば化学ルミネッセンスシグナルを明らかにするため
などの、異なる照明、フィルタリングおよび/または画像取得パラメーターで同じ支持体の系列画像を取ることができるようにする。
1.固体支持体の固体支持体およびコンパートメント(複数可)を探索および位置調整するステップ、特に位置調整画像による;この処理の目的は、固体支持体のいかなる機械的位置調整誤差も低減し、高度で精密な位置調整を有さない機構を使用できるようにすることである;
2.ステップ1において決定したコンパートメント(複数可)の位置から、各コンパートメントにおいて、各スポットの理論的位置を表す理論的グリッドを位置調整する;この位置調整は、例えば分析系において記載される基準グリッドから行われてよく、前記基準グリッドはコンパートメントの基準ポイントと比較した各スポットの座標を示す;コンパートメントの基準ポイントは、例えばコンパートメントの中央である;
3.固体支持体のコンパートメント(複数可)に存在するすべての蛍光事象について照明および蛍光フィルターを用いて行われた検出画像を使用して探索するステップ、ならびに任意選択で、完全に予測規格外であるものを除外するためにそれらのサイズおよび形状による事象の選択を使用して特定の事象を排除するステップ;
4.○ 既に検出され、有効であると見なされた事象の位置、
○ ステップ2において定義された予測されるスポットの理論的位置;
の間の比較、
5.欠損しているスポットを検出できるようにする「理論的スポット」/「蛍光事象」対を形成するために、予測されるスポットそれぞれについて、最も近い検出された事象と理論的スポット面との交差の関連付け。各理論的スポットについて、異なる独自の蛍光事象が存在するはずである;
6.検出されたスポットの完全性を保証できるようにする直径、形状、理論的位置からの距離の基準を使用する検出されたスポットそれぞれの特徴付け;
7.検出されたスポットそれぞれについてリーディンググリッドと呼ばれる、目的の対応する領域の定義、特に検出されたスポットの面および座標による定義;ならびに
8.ステップ7において定義されたリーディンググリッド上で第2のシグナルの読み取り、特に目的のこの領域、すなわちリーディンググリッドでの分析画像上の第2のシグナルの定量
を含む。
本発明による分析方法は、少なくとも1つの試料中の少なくとも1つの分析物の検出を可能にする。
a)分析される試料を固体支持体のコンパートメントのスポット(複数可)の存在下に置くステップであって、前記スポットまたは複数の前記スポットのうちの少なくとも1つが、少なくとも1つの耐性対照マーカーおよび分析物の少なくとも1つの捕捉リガンドを含む、ステップ、
b)分析物の少なくとも1つの検出リガンドを前記コンパートメントのスポット(複数可)の存在下に置くステップであって、分析物の前記検出リガンドが直接または間接検出マーカーにカップリングされている、ステップ、
c)分析物の少なくとも1つの検出リガンドが間接検出マーカーにカップリングされている場合、前記間接検出マーカーのレポーターを前記コンパートメントのスポット(複数可)の存在下に置くステップ、
d)ステップc)において使用されるレポーターが間接検出マーカーにカップリングされている場合、ステップc)において使用される前記レポーターにカップリングされている間接検出マーカーのレポーターを前記コンパートメントのスポット(複数可)の存在下に置くステップ、
e)前記コンパートメント中の少なくとも1つの耐性対照マーカーによって生成されるシグナルを検出するステップ、
f)ステップe)において検出されたシグナルの位置からリーディンググリッドを定義するステップ、
g)任意選択で、分析物の検出リガンドの少なくとも1つの検出マーカーによって生成されるシグナルを検出するステップ、ならびに
h)任意選択で、ステップf)において定義されたリーディンググリッドでステップg)において検出されたシグナルを読み取るステップ
を含む方法に関する。
a)分析される試料を固体支持体のコンパートメントのスポット(複数可)の存在下に置くステップであって、前記スポットまたは複数の前記スポットのうちの少なくとも1つが、少なくとも1つの耐性対照マーカーおよび分析物の少なくとも1つの捕捉リガンドを含む、ステップ、
b)分析物の少なくとも1つの検出リガンドを前記コンパートメントのスポット(複数可)の存在下に置くステップであって、分析物の前記検出リガンドが直接または間接検出マーカーにカップリングされている、ステップ、
c)分析物の少なくとも1つの検出リガンドが間接検出マーカーにカップリングされている場合、前記間接検出マーカーのレポーターを前記コンパートメントのスポット(複数可)の存在下に置くステップ、
d)ステップc)において使用されるレポーターが間接検出マーカーにカップリングされている場合、ステップc)において使用される前記レポーターにカップリングされている間接検出マーカーのレポーターを前記コンパートメントのスポット(複数可)の存在下に置くステップ、
e)前記コンパートメント中の少なくとも1つの耐性対照マーカーによって生成されるシグナルを検出するステップ、
f)ステップe)において検出されたシグナルの位置からリーディンググリッドを定義するステップ
g)任意選択で、分析物の検出リガンドの少なくとも1つの検出マーカーによって生成されるシグナルを検出するステップ、ならびに
h)任意選択で、ステップf)において定義されたリーディンググリッドでステップg)において検出されたシグナルを読み取るステップ
を含み、
前記耐性対照マーカー(複数可)は、少なくとも1つの分析物を検出するための前記方法の実施の際に固体支持体の表面のスポットに、ステップe)の際に検出可能なシグナルを生成するように少なくとも部分的に固定されたままであるマーカーである、方法に関する。
a)分析される試料を固体支持体のコンパートメントのスポット(複数可)の存在下に置くステップであって、前記スポットまたは複数の前記スポットのうちの少なくとも1個が、少なくとも1つの耐性対照マーカーおよび分析物の少なくとも1つの捕捉リガンドを含む、ステップ、
b)分析物の少なくとも1つの検出リガンドを前記コンパートメントのスポット(複数可)の存在下に置くステップであって、分析物の前記検出リガンドが間接検出マーカーにカップリングされているステップ、
c)前記間接検出マーカーのレポーターを前記コンパートメントのスポット(複数可)の存在下に置くステップ、
d)ステップc)において使用されるレポーターが間接検出マーカーにカップリングされている場合、ステップc)において使用される前記レポーターにカップリングされている間接検出マーカーのレポーターを前記コンパートメントのスポット(複数可)の存在下に置くステップ、
e)前記コンパートメント中の少なくとも1つの耐性対照マーカーによって生成されるシグナルを検出するステップ、
f)ステップe)において検出されたシグナルの位置からリーディンググリッドを定義するステップ、
g)任意選択で、分析物の検出リガンドの少なくとも1つの検出マーカーによって生成されるシグナルを検出するステップ、ならびに
h)任意選択で、ステップf)において定義されたリーディンググリッドでステップg)において検出されたシグナルを読み取るステップ
を含む。
- 分析物の検出リガンドの少なくとも1つの検出マーカーによって生成される前記シグナルがペルオキシダーゼと、ルミノール、ルミノールの類似物および/またはルミノールもしくはルミノールの類似物の誘導体との反応によって得られた化学ルミネッセンス化合物によって放出される光であり、
- そのまたは前記耐性対照マーカー(複数可)によって生成されるシグナルが波長375から550nmまで、375から580nmまでまたは350から580nm(両端を含む)まで以外で放出される光である
ことを特徴とする上に定義の方法に関する。
本発明は、耐性対照マーカーを選択するための方法であって、
a)検査されるマーカーを固体支持体の表面に沈着させて、少なくとも1個のスポットを形成させるステップ、
b)任意選択で、固体支持体の表面を飽和させるステップ、
c)任意選択で、固体支持体の表面を乾燥させるステップ、
d)
(i)1回または複数回の洗浄ステップを実施するステップ、
(ii)スポット(複数可)を検出リガンドの存在下に置くステップ、
(iii)スポット(複数可)をレポーターの存在下に置くステップ、
(iv)スポット(複数可)を基質の存在下に置くステップ
のうちの少なくとも1つを実行するステップ、
e)ステップd)の終了時にシグナルを生成するマーカーを選択するステップ
を含む方法にも関する。
(i)1回または複数回の洗浄ステップを実施するステップ、
(ii)スポット(複数可)を少なくとも1つの検出リガンドの存在下に置くステップ、
(iii)スポット(複数可)を少なくとも1つのレポーターの存在下に置くステップ、および/または
(iv)スポット(複数可)を少なくとも1つの基質の存在下に置くステップ
のうちの少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、より好ましくは少なくとも3つを実行することを含むまたはからなる。
で含む。
で含む。
- 任意選択で、第1に、
○ ステップa)において形成されたスポット(複数可)が捕捉リガンドを含まない、上記ステップa)からc)、
○ 任意選択で、ステップc)の終了時に検出可能なシグナルを生成するマーカーを選択することを含む第1の予備選択ステップ、
○ 任意選択で、同じ支持体上のステップd)からe)、好ましくは第1の予備選択ステップで選択された前記マーカーでだけ実行される前記ステップの後、ステップc)の終了時に検出可能なシグナルを生成するマーカーを選択することを含む第2の予備選択ステップ、
- 第2に、ステップa)において形成されたスポット(複数可)が捕捉リガンドを含む上記ステップa)からe)(ステップd)からe)は、好ましくは、前記第1の予備選択ステップで選択された、および/または前記第2の予備選択ステップで選択されたマーカーでだけ行われる)
も含んでよい。
本発明は、試料または少なくとも1つの試料中の少なくとも1つの分析物を検出するための方法を確実にするために分析物を検出することを目的とする少なくとも1個のスポット中の少なくとも1つの耐性対照マーカーの使用にも関する。
- 試料および検出される分析物の少なくとも1つの検出リガンドの存在下に置かれた後に、特に分析方法の終了時に、前記スポットの質をチェックすること、ならびに/または
- 前記耐性対照マーカー(複数可)によって生成されるシグナルの位置から定義されるリーディンググリッド上で検出される分析物の検出リガンドの少なくとも1つの検出マーカーによって生成される前記シグナルの読み取り
を含むことを特徴とする使用に関する。
- 前記スポットが、試料および、間接検出マーカーにカップリングされた検出される分析物の少なくとも1つの検出リガンド、前記間接検出マーカーのレポーター(第1のレポーターとも呼ばれる)、任意選択で前記第1のレポーターにカップリングされた間接検出マーカーの第2のレポーターの存在下に置かれた後に前記スポットの質をチェックすること、ならびに/または
- 前記耐性対照マーカー(複数可)によって生成されるシグナルの位置から定義されたリーディンググリッド上で検出される分析物の検出リガンドの少なくとも1つの検出マーカーによって生成されるシグナルの読み取り
を含むことを特徴とする使用に関する。
耐性対照マーカーを選択するための方法例
材料および方法
ポリスチレンマイクロプレート(Greiner、ドイツ)の各ウエル内に、抗原または抗体のスポッティングのために伝統的に使用される緩衝液中のフルオロフォア溶液500nl滴をウエルごとに沈着させる。次のフルオロフォアを本実施例において使用する:Atto633-カルボン酸(すなわちAtto633-COOHまたはAtto633)(供給者:ATTO-TEC;ドイツ)、Atto633-アミン(すなわちAtto633由来アミン誘導体)(供給者:ATTO-TEC;ドイツ)、Dye634-カルボン酸(すなわちDye634-COOHまたはDye634)(供給者:Dyomics、ドイツ)、Dye634-アミン(すなわちDye634由来アミン誘導体)(供給者:Dyomics、ドイツ)、Dye630-アミン(すなわちDye630由来アミン誘導体)(供給者:Dyomics、ドイツ)、APC(アロフィコシアニン)(供給者Febico;台湾)、B-フィコエリトリン(Febico;台湾)。これらのマイクロプレートの各ウエルの底は、当業者によってそれ自体が公知の分子吸着能力を有する。したがって得られた各ウエルの表面は、当業者によってそれ自体が公知の飽和溶液で飽和させる;ウエルは飽和溶液を満たし、飽和溶液を除去し、ウエルを次いで乾燥させ;これらのウエルの再水和ステップ後、次いでルミノール(ELISTAR ETA C Ultra ELISA(Cyanagen、イタリア)(実施例2参照)を含有する基質溶液を50μL/ウエルの割合で添加する。蛍光画像は、フルオロフォアに対する適切なフィルターを有するChemidoc(商標)MP System(Bio-Rad)を使用して、上に記載のプロトコール(すなわち、滴を沈着させる、飽和、乾燥、再水和のステップの後、およびルミノールを含有する基質溶液を添加した後)のさまざまなステップで行う。
図1は、さまざまなフルオロフォアの使用および上に記載のプロトコールのさまざまなステップにおいて生じた画像を記載している。
目的の分析物の検出での耐性対照フルオロフォアの存在の影響の欠如
材料および方法
(i)マイクロプレートの調製
ポリスチレンマイクロプレート(Greiner、ドイツ)の各ウエル内で、スポッターロボットを捕捉リガンド(複数可)および出願書に記載の方法を使用して選択したフルオロフォアを含有する溶液の50nL滴を行で(rows)沈着させるために使用する。
- 抗体検出検査の一部として1つもしくは複数の合成ペプチドを伴う組換えタンパク質からできていてよい抗原もしくは抗原の混合物のいずれか、
- または抗原検出検査の場合は探索マーカーに対する抗体もしくは抗体の混合物
であってよい。
分析方法の実施の際に使用した種々の要素の記載:
レポーター
ストレプトアビジンPOD(S-POD)レポーターは、当業者にそれ自体が公知のNakane and Kawaoi [J Histochem Cytochem (1974) Vol. 22, No. 12. pp. 1084-1091]によって記載された方法によりペルオキシダーゼ(Roche ドイツ)とカップリングさせたストレプトアビジン(Roche、ドイツ)である。
洗浄溶液
10mM Tris緩衝溶液pH7.4は、218mM NaCl、0.1%Tween20(商標)(Sigma社の商標)、0.002%Proclin 300(商標)(Supelco社の商標)を含有する。
発色基質
ELISTAR ETA C Ultra ELISA発色基質(Cyanagen、イタリア)は2種の溶液:XLSE024Lルミノールエンハンサー溶液(A)およびXLSE024P過酸化物溶液(B)から作られている。
検査プロトコールは次のステップを含む。
ステップ1:
1.マイクロプレート(スポットを含む)の各ウエルに以下のものを分配する。
- 試料40μl:試料は例えば血清または対照試料であってよい。
- 希釈剤40μl
2.混合物を40分間、37℃で撹拌しながらインキュベートする。
3.少なくとも300μlの洗浄溶液での3回連続洗浄を行う。
4.次にインキュベーションステップを検出リガンドの存在下で行い、次いでポイント3と同条件で洗浄する。
5.次いでレポーターのインキュベーションステップを行い、次いで洗浄する。
6.最後に、発色基質溶液BおよびAそれぞれ25μlの添加を含む最終発色ステップを行う。
7.混合物を1分間、37℃で撹拌しながらインキュベートする。
8.読み取りを蛍光を測定するためにChemidoc(商標)リーダーで、化学ルミネッセンスを測定するためにQview(商標)リーダーで行う。読み取りの結果を画像分析系によって直接的に処理し、相対光単位(RLU)に記録する;相対蛍光強度(RFI)も同様。
各データは3回反復の平均に対応する;蛍光値はバックグラウンドノイズを引いた後の蛍光シグナルレベルに対応する。
表3に示す結果は、フルオロフォア用量6μg/ml以下について分析物の検出へのAtto 634-BSAの存在の影響の欠如を示しており、この用量は、分析の終了時での蛍光の検出および本出願に記載のデータ処理方法の実施と共用できる。
表4に示す結果は、フルオロフォア用量0.1μg/ml以下について分析物の検出へのAtto633-アミンフルオロフォアの存在の影響の欠如を示している。捕捉リガンド(表5参照)の存在は蛍光を改変するが、シグナルは非常に顕著で、分析の終了時に完全に検出可能であり、本出願に記載のデータ処理方法を実行するために使用可能なままである。
試料中の少なくとも1つの分析物を検出するための方法を確実にする耐性対照マーカーの使用
材料および方法
(i)マイクロプレートの調製
ポリスチレンマイクロプレート(Greiner、ドイツ)の各ウエル内で、スポッターロボットを捕捉リガンド(複数可)および出願書に記載の方法を使用して選択したフルオロフォアを含有する溶液の50nL滴を行で沈着させるために使用する。
捕捉リガンド溶液は、
- 抗体検出検査の一部として1つもしくは複数の合成ペプチドを伴う組換えタンパク質からできていてよい抗原もしくは抗原の混合物のいずれか、
- または抗原検出検査の場合は探索マーカーに対する抗体もしくは抗体の混合物
であってよい。
分析方法の実施の際に使用される種々の要素の記載:
ストレプトアビジン-POD(S-POD)レポーターは、当業者によりそれ自体が公知のP. Nakane and A. Kawaoi [J Histochem Cytochem (1974) Vol. 22, No. 12. pp. 1084-1091]によって記載された方法によりペルオキシダーゼ(Roche ドイツ)とカップリングされたストレプトアビジン(Roche、ドイツ)である。
a)希釈ステップ1
50mM Tris緩衝溶液、pH7.5:150mM NaCl、20mM EDTA、500μg/mLマウスIgG(Meridian)、15%ウシの乳汁(100%スキム)、10%ヒツジ血清、0.095%NaN3を含有。
b)コンジュゲート1の希釈
50mM Tris緩衝溶液、pH7.5:150mM NaCl 20mM EDTA、0.1%Chaps、10%グリセロール、0.095%NaN3を含有。
c)コンジュゲート2の希釈
50mMクエン酸緩衝溶液、pH6.7:150mM NaCl、5.6mM EDTA、2%Triton、10%ヒツジ血清、500μg/mLマウスIgG、0.5%Proclin300(商標)(Supelco社の商標)、15%ウシの乳汁(100%スキム)、10%グリセロール、0.095%NaN3を含有。
d)ストレプトアビジン-PODレポーターの希釈
50mMクエン酸緩衝溶液、pH6.7:2053mM NaCl、0.5%Tween20(商標)(Sigma社の商標)、0.5%Proclin300(商標)(Supelco社の商標)、7%ウシの乳汁(100%スキム)、20%グリセロールを含有。
e)洗浄溶液
10mM Tris緩衝溶液、pH7.4:218mM NaCl、0.1%Tween20(商標)(Sigma社の商標)、0.002%Proclin300(商標)(Supelco社の商標)を含有。
f)発色基質
ELISTAR ETA C Ultra ELISA発色基質(Cyanagen、イタリア)は2種の溶液:XLSE024Lルミノールエンハンサー溶液(A)およびXLSE024P過酸化物溶液(B)から作られている。
免疫学的反応は1ウエル当たり最大容積392μLを有しポリスチレンで作られている96ウエルマイクロプレート(Greiner、ドイツ)で行う。
使用した陰性試料(血清または血漿)は、リールのフランス血液局に由来する。
使用した光学ベンチは、次の要素:
- 波長620nmを軸とした赤色光を発し、マイクロプレートの下面を均一に照らすように組み立てられた照明システム、
- マイクロプレートの表面全体を画像化できるように生成されたテレセントリック対物レンズ、
- テレセントリック対物レンズの出力レンズ(output lens)とカメラとの間に挿入されたフィルターホイール、
- 0.001秒間から250秒間の間に含まれる露出時間で画像を撮る能力を有するカメラ、
- マイクロプレートを含むすべての要素を支持し、位置付ける支持シャーシ
から作られている。光学ベンチは、マイクロプレートの下面から画像を取るように研究され、組み立てられている。対物レンズの開発は、マイクロプレートウエルの内面が明らかであるように開発されている。
フィルターホイールは2枚の異なるフィルター:
- フルオロフォアによって放出される光に対応するシグナルだけが通過できるようにする波長680nmを軸とするフィルター、
- 400nmから700nmまでのすべての波長が通過できるようにするフィルター
を有することができる。
検査プロトコールは以下のステップを含む。
ステップ1:
1.マイクロプレート(スポットを含む)の各ウエルに以下のものを連続的に分配する。
+ ステップ1の希釈物20μl
+ 第1のステップ由来のアッセイされる分析物の検出リガンドを含むコンジュゲート1の希釈物20μl
+ 試料40μl
2.混合物を40分間、37℃で撹拌しながらインキュベートする。
3.連続3回の洗浄を少なくとも400μlの洗浄液で行う。
ステップ2:
4.各反応ウエル中に分配されるのは第2のステップ由来のアッセイされる分析物の検出リガンドを含有するコンジュゲート2の希釈物50μlである。
5.混合物を15分間、37℃で撹拌しながらインキュベートする。
6.洗浄ステップ(ポイント3と同じ)を実行する。
ステップ3:
7.S-PODレポーター50μLを各反応ウエルに分配する。
8.混合物を15分間、37℃で撹拌しながらインキュベートする。
ステップ4:
9.発色溶液「B」25μLを各反応ウエルに分配する。
10.発色溶液「A」25μLを各反応ウエルに分配する。
10.混合物を1分間、37℃で撹拌しながらインキュベートする。
11.蛍光シグナルの取得を10秒間行う。
12.ルミネッセンスシグナルの取得を180秒間行う。
A)分析方法後の耐性対照マーカーの持続性
12ウエル中に存在する9個のスポットそれぞれの耐性対照マーカーの蛍光シグナルは、はっきりと同定可能であり、図2において分析方法の終了時に完全に測定可能である。
この画像は、耐性対照マーカーを通じて検出された実際のスポットの位置を常に標的化できるようにし、分析物の検出リガンドの検出マーカーによって放出されるシグナルの読み取りに誤差を生じない、方法の妥当性を実証している。
実際のスポット(点線)の位置を耐性対照マーカーによって生成されるシグナルに基づいて得て、本明細書で示す化学ルミネッセンスによる分析物のリガンドの検出マーカーのシグナルの取得画像に適用する(図5参照)。スポットの理論的位置調整は実線で示される。
(1) 少なくとも1つの試料中の少なくとも1つの分析物を検出するための方法であって、
a)分析される試料を固体支持体のコンパートメントのスポットの存在下に置くステップであって、前記スポットまたは複数の前記スポットのうちの少なくとも1個が、少なくとも1つの耐性対照マーカーおよび分析物の少なくとも1つの捕捉リガンドを含むステップ、
b)分析物の少なくとも1つの検出リガンドを前記コンパートメントのスポットの存在下に置くステップであって、分析物の前記検出リガンドが直接または間接検出マーカーにカップリングされている、ステップ、
c)分析物の少なくとも1つの検出リガンドが間接検出マーカーにカップリングされている場合、前記間接検出マーカーのレポーターを前記コンパートメントのスポット(の存在下に置くステップ、
d)ステップc)において使用される前記レポーターが間接検出マーカーにカップリングされている場合、ステップc)において使用される前記レポーターにカップリングされている前記間接検出マーカーのレポーターを前記コンパートメントのスポットの存在下に置くステップ、
e)前記コンパートメント中の少なくとも1つの耐性対照マーカーによって生成される少なくとも1つのシグナルを検出するステップ、
f)ステップe)において検出された少なくとも1つのシグナルの位置から少なくとも1つのリーディンググリッドを定義するステップ、
g)任意選択で、分析物の検出リガンドの少なくとも1つの検出マーカーによって生成されるシグナルを検出するステップ、ならびに
h)任意選択で、ステップf)において定義されたリーディンググリッドでステップg)において検出されたシグナルを読み取るステップ
を含む方法。
(2) 分析物の検出リガンドの少なくとも1つの検出マーカーによって生成される前記シグナルがルミネッセントシグナルであることを特徴とする、上記(1)に記載の方法。
(3) 前記耐性対照マーカーまたは複数の前記耐性対照マーカーのうちの1つがフルオロフォアであることを特徴とする、上記(1)または(2)に記載の方法。
(4) 前記耐性対照マーカーまたは複数の前記耐性対照マーカーのうちの1つがフルオロフォアであり、その励起スペクトルが、分析物の前記検出リガンドの検出マーカーによって放出されるまたはそれに対応する前記シグナルの発光スペクトルに重複せず、その発光スペクトルが、分析物の前記検出リガンドの前記検出マーカーのまたはそれに対応する前記発光スペクトルに重複しないまたは部分的に重複することを特徴とする、上記(3)に記載の方法。
(5) - 分析物の検出リガンドの少なくとも1つの検出マーカーによって生成される前記シグナルが、ペルオキシダーゼと、ルミノール、ルミノールの類似物および/またはルミノールもしくはルミノールの類似物の誘導体との反応によって得られた化学ルミネッセンス化合物によって放出される光であり、
- 耐性対照マーカーによって生成された前記シグナルが波長375から550nmまで以外で放出される光である
ことを特徴とする、上記(1)から(4)の一項に記載の方法。
(6) 耐性対照マーカーを選択するための方法であって、
a)検査されるマーカーを固体支持体の表面に沈着させて、少なくとも1個のスポットを形成させるステップ、
b)任意選択で、前記固体支持体の表面を飽和させるステップ、
c)任意選択で、前記固体支持体の表面を乾燥させるステップ、
d)
(i)1回または複数回の洗浄ステップを実施するステップ、
(ii)前記スポットを少なくとも1つの検出リガンドの存在下に置くステップ、
(iii)前記スポットを少なくとも1つのレポーターの存在下に置くステップ、
(iv)前記スポットを少なくとも1つの基質の存在下に置くステップ
のうちの少なくとも1つを実行するステップ、
e)ステップd)の終了時にシグナルを生成するマーカーを選択するステップ
を含む方法。
(7) 試料中の少なくとも1つの分析物を検出するための固体支持体であって、前記固体支持体が、少なくとも1個のスポットを含む少なくとも1つのコンパートメントを含み、前記スポットが、少なくとも1つの耐性対照マーカーおよび少なくとも1つの捕捉リガンドを含み、前記耐性対照マーカーが、検出方法の終了時に検出可能なシグナルを生成するように、少なくとも1つの分析物を検出するための方法の実行の際に固体支持体の表面の前記スポットに少なくとも部分的に固定されたままであるマーカーであることを特徴とする固体支持体。
(8) 前記耐性対照マーカーまたは複数の前記耐性対照マーカーのうちの1つが、請求項6に記載のおよび/または請求項3から5の一項に記載の方法を介して選択される耐性対照マーカーであることを特徴とする、請求項7に記載の支持体。
(9) 試料中の少なくとも1つの分析物を検出するための固体支持体を調製するための方法であって、
a)固体支持体の少なくとも1つのコンパートメントの表面に、少なくとも1つの耐性対照マーカーおよび少なくとも1つの捕捉リガンドを含む混合物を沈着させて、スポットを得るステップであって、前記耐性対照マーカーが検出方法の終了時に検出可能シグナルを生成するように、少なくとも1つの分析物を検出するための方法の実行の際に固体支持体の表面の前記スポットに少なくとも部分的に固定されたままであるマーカーである、ステップ、
b)ステップa)をn-1回(nは1以上の整数である)繰り返して、前記コンパートメントの表面の分析物を検出する目的でn個のスポットを得るステップ、
c)任意選択で、前記コンパートメントの表面を飽和させるステップ、ならびに
d)任意選択で、前記コンパートメントの表面を乾燥させるステップ
を含む方法。
(10) 前記捕捉リガンドが、抗体、抗原、核酸およびそれらの組合せからなる群から選択されることを特徴とする、上記(9)に記載の方法。
(11) 前記耐性対照マーカーがフルオロフォアであることを特徴とする、上記(9)または(10)に記載の方法。
(12) 試料中の少なくとも1つの分析物を検出するためのデバイスであって、
- 固体支持体で少なくとも1つの耐性対照マーカーによって生成されるシグナルおよび分析物の検出リガンドの少なくとも1つの検出マーカーによって生成されるシグナルを検出するための手段であって、照明システム、テレセントリック対物レンズ、フィルターホイールおよびカメラを含む手段、ならびに
- 少なくとも1つの耐性対照マーカーによって生成されるシグナルの位置からリーディンググリッドを定義するため、および分析物の検出リガンドの少なくとも1つの検出マーカーによって生成される前記シグナルを前記リーディンググリッドで読み取るための手段
を含むデバイス。
(13) 試料中の少なくとも1つの分析物を検出するための方法を確実にするために分析物を検出することを目的とする少なくとも1個のスポット中の少なくとも1つの耐性対照マーカーの使用であって、
- 試料および検出される分析物の少なくとも1つの検出リガンドの存在下に置かれた後に、前記スポットの質をチェックすること、ならびに/または
- 前記耐性対照マーカーによって生成されるシグナルの位置から定義されるリーディンググリッド上で検出され、分析方法の終了時に検出される分析物の検出リガンドの少なくとも1つの検出マーカーによって生成される前記シグナルの読み取り
を含むことを特徴とする使用。
Claims (9)
- 少なくとも1つの試料中の少なくとも1つの分析物を検出するための方法であって、
a)分析される試料を固体支持体のコンパートメントのスポットの存在下に置くステップであって、前記スポットまたは複数の前記スポットのうちの少なくとも1個が、少なくとも1つの耐性対照マーカーおよび分析物の少なくとも1つの捕捉リガンドを含むステップであり、
前記耐性対照マーカーは、Atto633―アミン、Dye634-アミン、Dye630-アミンおよびB-フィコエリトリンからなる群から選択されるフルオロフォアマーカーであり、
前記耐性対照マーカーは、検出方法の終了時に検出可能シグナルを生成するものであり、かつ、前記耐性対照マーカーは、少なくとも1つの分析物を検出するための方法の実行の際に固体支持体の表面の前記スポットに少なくとも部分的に固定されたままである、ステップ、
b)分析物の少なくとも1つの検出リガンドを前記コンパートメントのスポットの存在下に置くステップであって、分析物の前記検出リガンドが直接または間接検出マーカーにカップリングされている、ステップ、
c)分析物の少なくとも1つの検出リガンドが間接検出マーカーにカップリングされている場合、前記間接検出マーカーのレポーターを前記コンパートメントのスポットの存在下に置くステップ、
d)ステップc)において使用される前記レポーターが間接検出マーカーにカップリングされている場合、ステップc)において使用される前記レポーターにカップリングされている前記間接検出マーカーのレポーターを前記コンパートメントのスポットの存在下に置くステップ、
e)前記コンパートメント中の少なくとも1つの耐性対照マーカーによって生成される少なくとも1つのシグナルを検出するステップ、
f)ステップe)において検出された少なくとも1つのシグナルの位置から少なくとも1つのリーディンググリッドを定義するステップ、
を含み、
前記ステップa)からd)はステップe)からf)より前に行われ、
前記耐性対照マーカーの励起スペクトルが、分析物の前記検出リガンドの検出マーカーによって放出されるまたはそれに対応する生成シグナルの発光スペクトルに重複せず、その発光スペクトルが、分析物の前記検出リガンドの前記検出マーカーのまたはそれに対応する前記発光スペクトルに重複しないまたは部分的に重複することを特徴とする、方法。 - さらに以下の1または両方のステップを含む請求項1に記載の方法
g) 分析物の検出リガンドの少なくとも1つの検出マーカーによって生成されるシグナルを検出するステップ、ならびに
h) ステップf)において定義されたリーディンググリッドでステップg)において検出されたシグナルを読み取るステップ。 - 分析物の検出リガンドの少なくとも1つの検出マーカーによって生成される前記シグナルがルミネッセントシグナルであることを特徴とする、
請求項2に記載の方法。 - - 分析物の検出リガンドの少なくとも1つの検出マーカーによって生成される前記シグナルが、ペルオキシダーゼと、ルミノール、ルミノールの類似物および/またはルミノールもしくはルミノールの類似物の誘導体との反応によって得られた化学ルミネッセンス化合物によって放出される光であり、
- 耐性対照マーカーによって生成された前記シグナルが波長375から550nmまで以外で放出される光であることを特徴とする、請求項2または3に記載の方法。 - 耐性対照マーカーを選択するための方法であって、
a)検査されるマーカーを固体支持体の表面に沈着させて、少なくとも1個のスポットを形成させるステップ、
b)少なくとも以下を実行するステップ、
(i)1回または複数回の洗浄ステップを実施するステップ、
(ii)前記スポットを少なくとも1つの検出リガンドの存在下に置くステップ、
(iii)前記スポットを少なくとも1つのレポーターの存在下に置くステップ、
(iv)前記スポットを少なくとも1つの基質の存在下に置くステップ
c)ステップb)の終了時にシグナルを生成するマーカーを選択するステップ
を含む方法。 - 前記固体支持体のコンパートメントの表面が、
前記固体支持体のコンパートメントの表面に、前記少なくとも1つの耐性対照マーカーおよび前記少なくとも1つの捕捉リガンドを含む混合物が沈着されたステップの後、
a-1)前記コンパートメントの表面を飽和させるステップ、ならびに
a-2)前記コンパートメントの表面を乾燥させるステップ
のステップの1つまたは両方により調製されている、請求項1に記載の方法。 - 前記捕捉リガンドが、抗体、抗原、核酸およびそれらの組合せからなる群から選択されることを特徴とする、請求項6に記載の方法。
- 試料中の少なくとも1つの分析物を検出するためのデバイスであって、
- 固体支持体で少なくとも1つの耐性対照マーカーによって生成されるシグナルおよび分析物の検出リガンドの少なくとも1つの検出マーカーによって生成されるシグナルを検出するための手段であって、照明システム、テレセントリック対物レンズ、フィルターホイールおよびカメラを含む手段、ならびに
- 少なくとも1つの耐性対照マーカーによって生成されるシグナルの位置からリーディンググリッドを定義するため、および分析物の検出リガンドの少なくとも1つの検出マーカーによって生成される前記シグナルを前記リーディンググリッドで読み取るための画像化システムを含む手段を含み、
前記耐性対照マーカーは、Atto633-アミン、Dye634-アミン、Dye630-アミンおよびB-フィコエリトリンからなる群から選択されるフルオロフォアマーカーであり、
前記耐性対照マーカーは、検出方法の終了時に検出可能シグナルを生成するものであり、かつ、前記耐性対照マーカーは少なくとも1つの分析物を検出するための方法の実行の際に固体支持体の表面の前記スポットに少なくとも部分的に固定されたままであり、
前記耐性対照マーカーの励起スペクトルが、分析物の前記検出リガンドの検出マーカーによって放出されるまたはそれに対応する前記シグナルの発光スペクトルに重複せず、その発光スペクトルが、分析物の前記検出リガンドの前記検出マーカーのまたはそれに対応する前記発光スペクトルに重複しないまたは部分的に重複することを特徴とする、デバイス。 - 試料中の少なくとも1つの分析物を検出するための方法を確実にするために分析物を検出することを目的とする少なくとも1個のスポット中の少なくとも1つの耐性対照マーカーの使用であって、
- 試料および検出される分析物の少なくとも1つの検出リガンドの存在下に置かれた後に、前記スポットの質を、耐性対照マーカーによって生成されるシグナルに基づきチェックすること、ならびに/または
- 前記耐性対照マーカーによって生成されるシグナルの位置から定義されるリーディンググリッド上で検出され、分析方法の終了時に検出される分析物の検出リガンドの少なくとも1つの検出マーカーによって生成されるシグナルの読み取り
を含むことを特徴とし、前記耐性対照マーカーは、Atto633-アミン、Dye634-アミン、Dye630-アミンおよびB-フィコエリトリンからなる群から選択されるフルオロフォアマーカーであり、
前記耐性対照マーカーは、検出方法の終了時に検出可能シグナルを生成するものであり、かつ、前記耐性対照マーカーは少なくとも1つの分析物を検出するための方法の実行の際に固体支持体の表面の前記スポットに少なくとも部分的に固定されたままであり、
前記耐性対照マーカーの励起スペクトルが、分析物の前記検出リガンドの検出マーカーによって放出されるまたはそれに対応する前記シグナルの発光スペクトルに重複せず、その発光スペクトルが、分析物の前記検出リガンドの前記検出マーカーのまたはそれに対応する前記発光スペクトルに重複しないまたは部分的に重複することを特徴とする、使用。
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