JP2017508993A - 生物学的検体を分析するための方法およびデバイス - Google Patents
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Abstract
Description
(a)少なくとも1種類の機能化された粒子または少なくとも1種類の機能化された磁性粒子を測定チャンバに導入するステップであって、前記測定チャンバは、前記測定チャンバの底部を通じて光が到達する検出領域と光が到達しない分離除去領域とを有するものとするステップ;
(b)少なくとも1種類の生物学的検体を含有するサンプルを前記測定チャンバに導入するステップ;
(c)少なくとも1種類の蛍光マーカーを前記測定チャンバに導入するステップ;
(c’)前記導入された粒子、サンプルおよび蛍光マーカーを前記測定チャンバ内で混合するステップ;
(c’’)未結合の蛍光マーカーと結合した蛍光マーカーとを(好ましくは沈降または遠心分離により)分離することによって、前記結合した蛍光マーカーが前記分離除去領域内に存在するステップ;
(d)前記未結合の蛍光マーカーの蛍光放射を前記検出領域内で測定するステップ;および
(e)前記1つ以上の生物学的検体の量および/または濃度を分析するステップ。
2×3(6ウェル)、4×3(12ウェル)、4×6(24ウェル)、6×8(48ウェル)、8×12(96ウェル)、16×24(384ウェル)、32×48(1536ウェル)。市販のマイクロタイタープレートのカップ内の底部は、様々に形成されていてよい。市販されているのは、以下の底部である:F底(平底)、C底(最小限の丸みのついた角を有する平底)、V底(先が円錐形状の底部)およびU底(U字形の凹部)。本発明により適しているのは、特にF底、C底またはU底を有するマイクロタイタープレートであり、この中にデバイスが導入される。
(x)マイクロタイタープレートの底部を、構造要素を有する基部に置き換えるステップであって、ここで、前記基部は、好ましくは前記マイクロタイタープレートウェル中に存在するのと同数の構造要素を有するものとするステップ;
(y)前記基部を前記マイクロタイタープレートと接続させるステップ;および
(z)前記基部の下面に非透光性の層を施与し、その際、前記構造要素の底面を空所にするステップ。
(a)少なくとも1種類の機能化された表面をデバイスに導入するステップ;
(b)少なくとも1種類の生物学的検体を含有するサンプルを前記デバイスに導入するステップ;
(c)少なくとも1種類の発光マーカーを前記デバイスに導入するステップ;
(d)未結合の発光マーカーの発光放射を測定するステップ;および
(e)前記生物学的検体の量および/または濃度を分析するステップ。
(i)少なくとも1種類の機能化された粒子もしくは機能化された磁性粒子、および少なくとも1種類の蛍光マーカー、または
(ii)少なくとも1種類の機能化された粒子もしくは機能化された磁性粒子、または
(iii)少なくとも1種類の蛍光マーカー
がそれぞれ乾燥状態にある本発明による測定チャンバおよびマイクロタイタープレート、ならびに本発明による方法におけるその使用にも関する。
図1aに、構造要素(103)を有する一体型のデバイス(102)からなる測定チャンバ(101)を示し、該構造要素(103)は測定窓(104)を有し、該測定窓(104)を通じて励起光(105)が検出領域(106)に到達し、かつ該測定窓(104)を通じて発光の放射(107)が適切な検出器(該検出器は同時に励起光をももたらす)または検出ユニットを用いて測定される。一体型のデバイス(102)は、液体を透過しないように側壁(108)と接続されている。デバイスの基部の下面上には非透光性の層(109)(例えば塗料またはシート)が存在し、その際、構造要素の底面(110)は空所になっている。
図1bに、マイクロタイタープレートの窪み/凹部に導入されている複数のデバイス(102)を示し、その際、側壁(108)はマイクロタイタープレートからのものであり、該デバイスはシート(111)であり、該シート(111)に構造要素(103)がエンボス加工されている。
図1cに、透光性の基部(112)からなる上方に向かって開放されている測定チャンバ(101)を示し、その際、該基部(112)の下方には、空所(114)を有する非透光性の磁性要素(ここでは、非透光性の磁性の層またはシート)(113)が存在し、その際、該空所(114)が測定窓(104)を形成している。測定窓(104)を通じて励起光(105)が下方から(すなわち、デバイスの基部から)測定チャンバに到達し、その結果、未結合の発光マーカーの発光の放射(107)が生じ、その後、該放射はデバイスの下方の測定窓(104)を通じて検出ユニット(115)により検出される。好ましくは、そして図示されているように、検出ユニット(例えば蛍光読取り装置)は、励起光の放射および発光の検出を行うことができる。基部(112)と、側壁(108)および磁性要素(113)とは、取り外しできるように接続されていてもよいし、取り外しできないように接続されていてもよい。基部と側壁とは、同一の材料からなってもよいし異なる材料からなってもよい。
図1dに、複数の測定チャンバ(101)と、透光性の基部(112)と、測定窓(104)として利用される空所(114)を有する非透光性の磁性の層またはシート(113)とを示す。本発明による方法における励起および検出は、測定窓を通じて下方から、すなわち複数の測定チャンバまたはマイクロタイタープレートの基部の下方から、行われる。
図2aに、以下の試験成分を含む、測定溶液(201)が充填された図1aからの測定チャンバを示す:生物学的検体(204)、機能化された粒子(203)および発光マーカー(202)。これらは充填の直後に均一に分配され、混合による接触前に未結合の状態にある。機能化された粒子は磁性であってもよい(ここでは図示せず)。
図2bに、結合させ、かつ結合した発光マーカーと未結合の発光マーカーとを分離したの後の、試験成分(202)、(203)、(204)を含む、測定溶液(201)が充填された図2aからの測定チャンバを示す。未結合の発光マーカー(202u)は測定チャンバ内に均一に分配されて存在し、一方で、結合した試験成分(202、203、204)は分離除去領域(205)内に存在する。
図2cに、以下の試験成分を含む、測定溶液(201)が充填された図1cからの測定チャンバを示す:生物学的検体(204)、機能化された磁性粒子(203−M)および蛍光マーカー(202−F)。これらは充填の直後に均一に分配され、混合による接触前に未結合の状態にある。
図2dに、結合させ、かつ結合した蛍光マーカーと未結合の蛍光マーカーとを分離したの後の、試験成分(202−F)、(203−M)、(204)を含む、測定溶液(201)が充填された図2cからの測定チャンバを示す。未結合の蛍光マーカー(202u−F)は測定チャンバ内に均一に分配されて存在し、一方で、結合した試験成分(202−F、203−M、204)は分離除去領域(205)内に存在する。
図3aに、図2bからの測定チャンバの上面図を示す。結合した試験成分(301)は、デバイス/測定チャンバの基部に存在する。デバイスの基部には非透光性の層(302)が備えられており、その際、構造要素の底面(303)は空所になっている。この空所は、同時に測定窓(305)でもある。デバイスの基部とは反対側の端部(304)も図示されており、該端部(304)は測定窓(305)と光学的に接続されている。ここでは、構造要素は、円形の横断面を有しかつ上方に向かって先細状の突出部である。
図3bに、図2dからの測定チャンバの上面図を示す。結合した試験成分(301)は、測定チャンバの基部に存在する。測定チャンバの基部には、空所(307)を有する非透光性でかつ磁性の層またはシート(306)が備えられている。この空所は、同時に測定窓(305)でもある。
図5a:実施例Aからの検量線
図5b:実施例Bからの検量線
図5c:実施例Cからの検量線
図5a、図5bおよび図5cにおいて、x軸上には検体濃度がμg/mLで示されており、y軸上には蛍光強度が示されている。(菱形の)測定値により関数が描画されている(破線)。
図5dにおいて、x軸上には検体濃度がμg/mLで示されており、y軸上には同一の検体の異なるエピトープに結合する2つの蛍光マーカーに関する蛍光強度が示されている。蛍光マーカーは2つの異なる波長(535nmまたは580nm)で放射する。(それぞれ菱形の)測定値により、相応する関数が描画されている(破線)。
図5eにおいて、x軸上には検体濃度がμg/mLで示されており、y軸上には蛍光強度が示されている。(菱形の)測定値により、関数が描画されている(破線)。本実施例では蛍光顕微鏡を用いて測定したため、y軸のスケーリングは前出の実施例のものとは異なる。
図6aに、粒子(602)または磁性粒子(602−M)(該粒子上には複数のスカベンジャー分子(603)が存在する)からなる、機能化された粒子(601)または機能化された磁性粒子(601−M)を示す。生物学的検体(604)と、スカベンジャー分子(603)および発光マーカー(607)または蛍光マーカー(607−F)とが結合する。さらに、未結合の発光マーカー(607u)または未結合の蛍光マーカー(607u−F)が存在する。発光マーカーまたは蛍光マーカーは、結合部位(606)と、発光色素(605)または蛍光色素(605−F)とを有する。
図6bに、粒子(602)または磁性粒子(602−M)(該粒子上には複数のスカベンジャー分子(603)が存在する)からなる、機能化された粒子(601)または機能化された磁性粒子(601−M)を示す。スカベンジャー分子(603)は、生物学的検体(604)か、または発光マーカー(607)もしくは蛍光マーカー(607−F)か、のいずれかと結合し、その際、該生物学的検体(604)は、結合した発光マーカーまたは結合した蛍光マーカーをスカベンジャーから排除することができる。
図6cに、粒子(602)または磁性粒子(602−M)(該粒子上には複数のスカベンジャー分子(603)が存在する)からなる、機能化された粒子(601)または機能化された磁性粒子(601−M)を示す。生物学的検体(604)は、スカベンジャー分子(603)と結合し、さらに発光マーカー(607)または蛍光マーカー(607−F)とも結合する。さらに、未結合の発光マーカー(607u)または未結合の蛍光マーカー(607u−F)が存在する。発光マーカーは、結合部位(606)と、発光色素(605)または蛍光色素(605−F)とを有する。
図6dに、粒子(602)または磁性粒子(602−M)(該粒子上には複数のスカベンジャー分子(603)が存在する)からなる、機能化された粒子(601)または機能化された磁性粒子(601−M)を示し、その際、該スカベンジャー分子(603)は、結合部位(606)と蛍光色素(605−F)とからなる蛍光マーカー(607−F)に結合しうる。生物学的検体(604)は蛍光マーカー(607−F)に結合し、それによりスカベンジャー(603)への蛍光マーカーの結合が妨害(阻害)される。このタイプの結合の場合、複合体(608、608−F)、すなわち生物学的検体(604)に結合した発光マーカー(607)または蛍光マーカー(607−F)が検出される。
双方の図に、それぞれ粒子(702)または磁性粒子(702−M)(該粒子上には複数のスカベンジャー分子(703)が結合している)からなる、機能化された粒子(701)または機能化された磁性粒子(701−M)を示す。スカベンジャー分子は、適切なタンパク質(705)から、例えばビオチン化抗体から形成され、該タンパク質はリンカー(704)(例えばストレプトアビジン)を介して粒子(702)または磁性粒子(702−M)に結合する。タンパク質(705)は、生物学的検体(709)に結合する。さらに、結合した発光マーカー(706)または結合した蛍光マーカー(706−F)、および未結合の発光マーカー(706u)または未結合の蛍光マーカー(706u−F)が図示されている。発光マーカー(706)または蛍光マーカー(706−F)は、結合部位(707)と、発光色素(708)または蛍光色素(708−F)とを有する。
測定チャンバ(101)に、生物学的検体(204)と、機能化された粒子(203)と、未結合の発光マーカー(202)とを含有する測定溶液(201)を導入する(図2a参照)。均質な混合物が生じる。(インキュベーションおよび振とうにより)相応する結合を形成させた後に、結合した試験成分が分離除去領域(205)内で沈降し、そこに蓄積する(図2bおよび図3a参照)。この時点で、検出領域(106)内で未結合の発光マーカー(202u)を測定することができる。分離除去領域内に存在する結合した発光マーカーが励起光により励起されて放射しうることのないようにし、また該結合した発光マーカーの放射光が測定窓を通じて測定チャンバから検出ユニット/検出器に到達することのないようにするために、非透光性の層(109)を使用する。
測定チャンバ(101)に、生物学的検体(204)と、機能化された磁性粒子(203−M)と、未結合の蛍光マーカー(202−F)とを含有する測定溶液(201)を導入する(図2c参照)。均質な混合物が生じる。(インキュベーションおよび振とうにより)相応する結合を形成させた後に、結合した試験成分が磁性要素の磁場により配向性をもって分離除去領域(205)内で沈降し、そこに蓄積する(図2dおよび図3b参照)。この時点で、検出領域内で未結合の蛍光マーカー(202u−F)を測定することができる。分離除去領域内に存在する結合した蛍光マーカー(202−F)が励起光により励起されて放射しうることのないようにし、また該結合した蛍光マーカー(202−F)の放射光が測定窓(104)を通じて測定チャンバから検出装置(115)に到達することのないようにするために、非透光性の磁性の層またはシート(113)を使用する。
測定のために、以下の本発明によるマイクロタイタープレートを使用する:384個のウェル(測定チャンバ)を有する黒色のマイクロタイタープレート(Greiner BioONE社、品番781000−06)であって、該ウェル内にはそれぞれ高さ1.6mmのポリプロピレンからなる円錐形の構造要素が存在し、該構造要素は上方に向かって先細状であってかつ円形の横断面を有し、該横断面は、基部とは反対側の面で1mmの直径を有する。測定チャンバにはその下面に非透光性の塗料層が設けられており、その際、該層は構造要素の基部面には施与されず、その結果、該基部には約2mmの直径を有する測定窓が生じている。
測定のために、以下の本発明によるマイクロタイタープレートを使用する:384個のウェル(測定チャンバ)を有する黒色のマイクロタイタープレート(Greiner BioONE社、品番781000−06)であって、該ウェル内にはそれぞれ高さ1.6mmのポリプロピレンからなる円錐形の構造要素が存在し、該構造要素は上方に向かって先細状であってかつ円形の横断面を有し、該横断面は、基部とは反対側の面で1mmの直径を有する。測定チャンバにはその下面に非透光性の塗料層が設けられており、その際、該層は構造要素の基部面には施与されず、その結果、該基部には約2mmの直径を有する測定窓が生じている。
測定のために、以下の本発明によるマイクロタイタープレートを使用する:384個のウェルを有する透明な底部を有する黒色のマイクロタイタープレート(Greiner BioONE社、品番781091)であって、該ウェルの下方に、384個の空所を有する磁性シートを、該空所の各々が該マイクロタイタープレートのウェルの下方で中心が合った状態となるように貼り付ける。この永久磁性シート(Permaflex 518、Rheinmagnet社)は1mmの厚さを有し、かつこれらの空所は2.5mmの直径を有する。
測定のために、以下の本発明によるマイクロタイタープレートを使用する:384個のウェル(測定チャンバ)と、熱成形により製造された構造要素を含む一体型の底部とを備えた、黒色のマイクロタイタープレート(Greiner BioONE社、品番781000−06)。この構造要素は、正方形の土台上の四面体の角錐の形態を有する。測定チャンバにはその下面に非透光性の塗料層が設けられており、その際、該層は構造要素の正方形の基部面には施与されず、その結果、該基部には約2.5mmの直径を有する測定窓が生じている。
この測定のために、実施例Dに記載した構造要素を有するマイクロタイタープレートを使用するが、但し、非透光性の塗料層なしで行う。
Claims (23)
- 1つ以上の機能化された表面の存在下に水溶液中で生物学的検体の定量分析を行うための方法であって、前記水溶液は少なくとも1種類の生物学的検体および少なくとも1種類の蛍光マーカーを含有する前記方法において、前記1つ以上の生物学的検体の量および/または濃度を分析するために未結合の蛍光マーカーの蛍光放射を測定することを特徴とする前記方法。
- 機能化された表面として、ポリマーまたはポリマー混合物からの機能化された粒子であって該粒子の表面上にスカベンジャー分子が存在している粒子を使用し、前記スカベンジャー分子が1つ以上の生物学的検体および/または1つ以上の蛍光マーカーと結合することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 以下:
(a)少なくとも1種類の機能化された粒子を測定チャンバ(101)に導入するステップであって、前記測定チャンバは、前記測定チャンバの底部を通じて光が到達する検出領域(106)と光が到達しない分離除去領域(205)とを有するものとするステップ;
(b)少なくとも1種類の生物学的検体を含有するサンプルを前記測定チャンバに導入するステップ;
(c)少なくとも1種類の蛍光マーカーを前記測定チャンバに導入するステップ;
(c’)前記機能化された粒子、サンプルおよび蛍光マーカーを前記測定チャンバ内で混合するステップ;
(c’’)未結合の蛍光マーカーと結合した蛍光マーカーとを分離することによって、前記結合した蛍光マーカーが前記分離除去領域(205)内に存在するステップ;
(d)前記未結合の蛍光マーカーの蛍光放射を前記検出領域(106)内で測定するステップ;および
(e)前記1つ以上の生物学的検体の量および/または濃度を分析するステップ
を含む、請求項1または2に記載の方法。 - 前記ステップ(a)、(b)および(c)を逐次的に行うか、または前記ステップの少なくとも2つを同時に行うことを特徴とする、請求項3に記載の方法。
- ステップ(a)および/またはステップ(c)を、その他のステップの前に、かつ前記その他のステップと時間的間隔を大きくあけて行うことを特徴とする、請求項3に記載の方法。
- 請求項1から5までのいずれか1項に記載の方法であって、該方法が、直接イムノアッセイ、サンドイッチイムノアッセイ、置換イムノアッセイまたはディスプレイスメントイムノアッセイ、競合イムノアッセイおよび二次イムノアッセイである、前記方法。
- 機能化された磁性粒子を使用することを特徴とする、請求項1から6までのいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(c’’)を、沈降により、および一時的または永続的な磁場の印加により行ことを特徴とする、請求項7に記載の方法。
- デバイス(102)と前記デバイスを包囲する少なくとも1つの側壁(108)とを含む測定チャンバ(101)の、請求項1から7までのいずれか1項に記載の方法を実施するための使用において、前記デバイスの基部は前記測定チャンバの基部を形成することができ、前記デバイスは少なくとも部分的に透光性である構造要素(103)を有し、かつ前記デバイスの基部は前記構造要素の底面(110、303)を除いて非透光性である、前記使用。
- 構造要素(103)が上方に向かって先細状の突出部として構成されており、前記突出部の横断面は任意の形状を有することができ、基部とは反対側の構造要素端部(304)は該端部に試験成分が堆積しない状態にあることを特徴とする、請求項9に記載の測定チャンバ(101)の使用。
- デバイスの基部が測定チャンバの基部を形成するか、または、デバイスの基部は測定チャンバの基部ではなくもう1つの基部が存在する、請求項9または10に記載の測定チャンバ(101)の使用。
- 請求項1から7までのいずれか1項に記載の方法を実施するためのマイクロタイタープレート(401)の使用において、前記マイクロタイタープレート(401)が、請求項9から11までのいずれか1項に定義される少なくとも1つの測定チャンバ(101)を有する、前記使用。
- 請求項6から8までのいずれか1項に記載の方法を実施するための測定チャンバ(101)の使用において、前記測定チャンバの基部に、固定されているかまたは取り外し可能な非透光性の磁性の層が存在し、前記層が透光性の測定窓(104)を有する、前記使用。
- 請求項1から7までのいずれか1項に記載の方法を実施するためのマイクロタイタープレート(401)の使用において、前記マイクロタイタープレート(401)が、請求項10に記載の少なくとも1つの測定チャンバ(101)を有する、前記使用。
- 請求項1から7までのいずれか1項に記載の方法を実施するためのマイクロタイタープレートであって、前記マイクロタイタープレートの少なくとも1つの凹部内にデバイス(102)が導入されており、前記デバイスは少なくとも部分的に透光性である構造要素(103)を有し、前記構造要素は上方に向かって先細状の突出部として構成されており、かつ前記突出部の横断面は任意の形状を有することができ、基部とは反対側の構造要素端部(304)は該端部に実質的に試験成分が堆積しない状態にあり、かつ前記デバイスの基部は前記構造要素の底面(110、303)を除いて非透光性であり、かつ前記凹部の縁部が測定チャンバの側壁を形成することを特徴とする、前記マイクロタイタープレート。
- 請求項15に記載のマイクロタイタープレートにおいて、前記マイクロタイタープレートの元の底部が、構造要素を有する一体型の基部に置き換えられており、前記マイクロタイタープレートのすべての凹部の中に1つの構造要素が存在し、前記基部は、前記構造要素の底面を除いて非透光性となるように被覆されていることを特徴とする、前記マイクロタイタープレート。
- 請求項1から8までのいずれか1項に記載の方法を実施するためのマイクロタイタープレート(101)であって、前記マイクロタイタープレートの少なくとも1つの凹部が測定チャンバである前記マイクロタイタープレートにおいて、前記マイクロタイタープレートの基部に、固定されているかまたは取り外し可能な非透光性の磁性の層が施与されており、前記層が少なくとも1つの測定窓を有することを特徴とする、前記マイクロタイタープレート。
- 請求項15から17までのいずれか1項に記載のマイクロタイタープレートにおいて、少なくとも1つの測定チャンバ内に、機能化された表面または機能化された粒子および/または蛍光マーカーが乾燥された形態で存在することを特徴とする、前記マイクロタイタープレート。
- 請求項1から8までのいずれか1項に記載の方法を実施するためのキットであって、請求項15から17までのいずれか1項に記載のマイクロタイタープレートと、少なくとも1種類の機能化された表面または少なくとも1種類の機能化された粒子と、少なくとも1種類の蛍光マーカーと、反応緩衝液とを含む、前記キット。
- 請求項1から8までのいずれか1項に記載の方法を実施するためのキットであって、請求項18に記載のマイクロタイタープレートと反応緩衝液とを含む、前記キット。
- 請求項1から8までのいずれか1項に記載の方法を実施するためのマイクロタイタープレートの使用であって、前記マイクロタイタープレートの少なくとも1つの凹部内にデバイス(102)が導入されており、前記デバイスは透光性の構造要素(103)を有し、前記構造要素は上方に向かって先細状の突出部として構成されており、前記突出部の横断面は任意の形状を有することができ、基部とは反対側の構造要素端部(304)は該端部に試験成分が堆積しない状態にあり、かつ前記凹部の縁部が測定チャンバの側壁を形成し、未結合の蛍光マーカーの蛍光放射を検出領域において蛍光読取り装置を用いて行い、前記蛍光読取り装置の光学的配置は、前記検出領域内の蛍光放射のみが測定されうるように構成されている、前記使用。
- 請求項21に定義されるマイクロタイタープレート(101)の使用であって、前記マイクロタイタープレートの元の底部が、構造要素を含む一体型の基部に置き換えられている、前記使用。
- 請求項21または22に記載の使用において、蛍光読取り装置が蛍光顕微鏡であることを特徴とする、前記使用。
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