JP7001585B2 - 細胞および細胞培養の方法 - Google Patents
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Description
(i)細胞増殖および/または産生性インヒビターである1種または複数の細胞代謝産物を同定するステップと、
(ii)細胞増殖および/または産生性インヒビターの合成をもたらす1つまたは複数の細胞代謝経路を同定するステップと、
(iii)細胞増殖および/もしくは産生性インヒビター、またはその代謝中間体の合成を触媒する酵素をコードする1つまたは複数の細胞代謝経路における1つもしくは複数の遺伝子、ならびに/またはそれから分岐する、もしくは直接的に分岐する代謝経路における酵素をコードする1つもしくは複数の遺伝子を同定するステップと、
(iv)細胞増殖および/または産生性インヒビターの合成のレベルを低減するように1つまたは複数の遺伝子の発現を改変するステップと
を含む、方法に関する。
第1の態様では、本発明は、細胞培養の方法であって、(i)細胞培養培地中に細胞を提供して細胞培養プロセスを開始するステップを含み、細胞が細胞による増殖および/または産生性インヒビターの合成のレベルを低減するように改変される。
(i)Auh、
(ii)Bcat1、
(iii)Bcat2
(iv)Mccc1、Mccc2、およびIvdの1つまたは複数、
(v)Bcat1および/またはBcat2および/またはAuh、ならびに1つまたは複数のMccc1、Mccc2、およびIvd、
(vi)Pah、
(vii)PCBD1、
(viii)PCBD1および/またはQDPR
(ix)HpdおよびHgdの1つまたは複数、
(x)Pahおよび/またはPCBD1、ならびに1つまたは複数のHpdおよびHgd
(xi)PahおよびPCBD1、ならびに任意選択によりQDPR
(xii)Pah、PCBD1、Hpd、およびHgd、ならびに任意選択によりQDPR
(xiii)Bcat1および/またはBcat2、Auh、Mccc1、Mccc2、ならびにIvd、または
(ix)Bcat1および/またはBcat2、Auh、Mccc1、Mccc2、Ivd、Pah、PCBD1、Hpd、Hgd、ならびに任意選択によりQDPR。
(i)PCBD1遺伝子を含む発現可能核酸またはベクターコンストラクト、
(ii)Pah遺伝子を含む発現可能核酸またはベクターコンストラクト、
(iii)Pah遺伝子およびPCBD1遺伝子を含む発現可能核酸またはベクターコンストラクト、
(iv)PCBD1遺伝子もしくはPah遺伝子またはPah遺伝子およびPCBD1遺伝子、ならびにさらにQDPR遺伝子を含む発現可能核酸またはベクターコンストラクト、
(v)Hpd遺伝子および/もしくはHgd遺伝子をさらに含む(i)~(iv)の発現可能核酸またはベクターコンストラクト
を含む。
(ii)細胞培養培地中で濃度C1未満の3-(4-ヒドロキシフェニル)ラクテート、4-ヒドロキシフェニルピルベート、フェニルラクテート、インドールラクテート(インドール-3-ラクテート)、インドールカルボン酸(インドール-3-カルボキシレート)、ホモシステイン、2-ヒドロキシ酪酸、イソバレレート、2-メチルブチレート、イソブチレート、およびホルメートから選択される少なくとも1種の代謝産物を維持するステップであって、C1が3mMである、ステップ
をさらに含む。
一部の実施形態では、細胞培養の方法は、
(iii)フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、セリン、トレオニン、およびグリシンから選択される少なくとも1種のアミノ酸を、細胞培養培地中で濃度C2未満に維持するステップであって、C2が2mMである、ステップ
をさらに含む。
一部の実施形態では、ステップ(iii)は、前記少なくとも1種のアミノ酸の濃度を測定するステップを含む。アミノ酸の濃度は、オフラインおよびオンライン測定法を含めた当業者に公知の任意の方法によって測定することができる。
一部の実施形態では、ステップ(iii)では、フェニルアラニンの濃度は、細胞培養培地中で2mM未満に維持される。好適な実施形態では、フェニルアラニンの濃度は、細胞培養培地中で、0.1から2mMの間で維持される。好適な実施形態では、フェニルアラニンの濃度は、細胞培養培地中で、0.1から1mMの間で維持される。好適な実施形態では、フェニルアラニンの濃度は、細胞培養培地中で、0.2から1mMの間で維持される。好適な実施形態では、フェニルアラニンの濃度は、細胞培養培地中で、0.5から1mMの間で維持される。
細胞の増殖を阻害する他の代謝産物の一部の実施形態では、例えば、ラクテートおよびアンモニアも細胞培養培地中で低レベルに維持されるなどである。低レベルでラクテートおよびアンモニアを保つ方法も、当業者に公知である。
用語「培養」および「細胞培養」は、本明細書では、細胞集団の生存および/または増殖に適した条件下で培地中に供給される細胞集団を指す。当業者に明らかとなるように、一部の実施形態では、これらの用語は、本明細書では、細胞集団および集団が懸濁される培地を含む組合せを指す。一部の実施形態では、細胞培養液の細胞は、哺乳動物細胞を含む。
(i)細胞増殖および/または産生性インヒビターである1種または複数の細胞代謝産物を同定するステップと、
(ii)細胞増殖および/または産生性インヒビターの合成をもたらす1つまたは複数の細胞代謝経路を同定するステップと、
(iii)細胞増殖および/もしくは産生性インヒビター、またはその代謝中間体の合成を触媒する酵素をコードする1つまたは複数の細胞代謝経路における1つもしくは複数の遺伝子、またはそれから分岐する、もしくは直接分岐する代謝経路における酵素をコードする1つもしくは複数の遺伝子を同定するステップと、ならびに/あるいは
(iv)細胞増殖および/もしくは産生性インヒビター、または細胞増殖および/もしくは産生性インヒビターの代謝産物、または細胞増殖および/もしくは産生性インヒビターの代謝中間体、または代謝中間体の代謝産物、もしくは1つまたは複数の細胞代謝経路もしくはBH4(テトラヒドロビオプテリン)におけるコファクター、またはBH4-4a(カルビノールアミン)、またはq-BH2の合成を触媒する酵素をコードする1つまたは複数の細胞代謝経路における1つまたは複数の遺伝子を同定するステップと、
(v)細胞増殖および/または産生性インヒビターの合成のレベルを低減するように1つまたは複数の遺伝子の発現を改変するステップと
を含む、方法を提供する。
(i)最大生存細胞密度まで細胞培養中に産生される測定可能な細胞代謝産物の濃度/レベルを測定することと、
(ii)高度に発現される代謝産物もしくは高レベル/濃度まで蓄積する代謝産物であり、かつ/または他の代謝産物と比べた細胞培養中の代謝産物産生の速度の増大もしくは代謝産物産生のレベル/濃度の増大を実証する細胞代謝産物を同定することと
を含む。
(i)最大生存細胞密度で高度に発現される代謝産物産生/濃度を定量化することと、
(ii)(i)において高度に発現される代謝産物の量の存在を伴った、および伴わない細胞を培養することと、
(iii)(ii)における各細胞集団の細胞培養中の最大生存細胞密度もしくは産生性ならびに/または最大生存細胞密度および/もしくは産生性を比較し、培養細胞増殖および/もしくは産生性に対する高度に発現される代謝産物の効果を判定することと
をさらに含む。
(i)1つもしくは複数の細胞代謝経路中の相対的な遺伝子発現レベルを判定し、増大もしくは低下したレベルで発現される遺伝子を同定すること、および/または
(ii)突然変異を含む1つまたは複数の細胞代謝経路中の遺伝子を同定すること
をさらに含む。
(a)増大もしくは低下したレベルで発現される同定された遺伝子もしくは突然変異を含む同定された遺伝子に適用される遺伝子欠損、破壊、置換、点突然変異、多重点突然変異、挿入突然変異、もしくはフレームシフト突然変異のうちのいずれか1つもしくは複数、または
(b)任意選択により発現可能核酸もしくはベクターコンストラクトとして細胞内への遺伝子を含む1種もしくは複数の核酸の導入、
(c)CRISPR/CAS9もしくはCRISPR干渉もしくは干渉RNA、干渉mRNAもしくは干渉アプタマー、またはsiRNAもしくはsiRNA干渉または亜鉛フィンガー転写因子または亜鉛フィンガーヌクレアーゼまたは転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)の使用による遺伝子発現の抑制もしくは活性化
を含む。
細胞培養に感受性の任意の細胞を本発明により利用することができる。一部の実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。本発明によって使用され得る哺乳動物細胞の非限定的な例としては、BALB/cマウス骨髄腫株(NSO/l、ECACC番号:85110503);ヒト網膜芽細胞(PER.C6、CruCell、Leiden、オランダ);SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株(COS-7、ATCC CRL 1651);ヒト胚腎臓株(懸濁培養で増殖させるためにサブクローニングされた293または293細胞、Grahamら、J.Gen Virol.、36:59、1977);仔ハムスター腎細胞(BHK、ATCC CCL10);チャイニーズハムスター卵巣細胞+/-DHFR(CHO、UrlaubおよびChasin、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、77:4216、1980);マウスセルトリ細胞(TM4、Mather、Biol.Reprod.、23:243~251、1980);サル腎細胞(CV1 ATCC CCL 70);アフリカミドリザル腎細胞(ベロ-76、ATCC CRL-1 587);ヒト子宮頸癌細胞(HeLa、ATCC CCL 2);イヌ腎細胞(MDCK、ATCC CCL 34);バッファローラット肝細胞(BRL 3A、ATCC CRL 1442);ヒト肺細胞(W138、ATCC CCL 75);ヒト肝細胞(Hep G2、HB 8065);マウス乳腺腫瘍(MMT 060562、ATCC CCL51);トリ細胞(Matherら、Annals N.Y.Acad.Sci.、383:44~68、1982);MRC 5細胞;FS4細胞;およびヒト肝細胞癌株(Hep G2)がある。一部の好適な実施形態では、細胞は、CHO細胞である。一部の好適な実施形態では、細胞は、GS細胞である。
代謝産物を同定することができ、かつ/または代謝産物の濃度を、オフラインおよびオンライン測定法を含めた当業者に公知の任意の方法によって測定することができ、このような測定もメタボローム解析またはメタボローム測定を構成する。細胞培養培地または細胞の試料、例えば、細胞ペレットに適用される。
上述した方法の一部の実施形態では、細胞増殖および/または産生性は、対照培養と比較して増大し、前記対照培養は、ステップ(ii)および/もしくは(iii)を含まず、かつ/または細胞を産生する方法によって産生される改変細胞または細胞を含まない、すなわち細胞が非改変であることを除いて同一である。
IVCCt+1=IVCCt+(VCDt+VCDt+1)*(Δt)/2
式中、Δtは、t時点とt+1時点との間の時差であり、IVCCt=0は無視できると仮定することができる。VCDtおよびVCDt+1は、tおよびt+1時点での生存細胞密度である。
用語「培地」、「細胞培養培地」、および「培養培地」は、本明細書では、増殖中の哺乳動物細胞に栄養を与えるコンポーネントまたは栄養分を含有する溶液を指す。典型的には、栄養分としては、最小限の増殖および/または生存のために細胞が要求する必須および非必須アミノ酸、ビタミン、エネルギー源、脂質、ならびに微量元素がある。このような溶液は、それだけに限らないが、ホルモンおよび/または他の増殖因子、特定イオン(ナトリウム、塩化物、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸など)、緩衝液、ビタミン、ヌクレオシド、もしくはヌクレオチド、微量元素(非常に低い最終濃度で通常存在する無機化合物)、高最終濃度で存在する無機化合物(例えば、鉄)、アミノ酸、脂質、および/もしくはグルコース、または他のエネルギー源を含めた最小限の割合を超える増殖および/または生存を増強するさらなる栄養分または追加のコンポーネントも含有する。一部の実施形態では、培地は、細胞生存および増殖に最適なpHおよび塩濃度に有利には配合される。一部の実施形態では、培地は、細胞培養が始まった後に添加されるフィード培地である。
上述したように、多くの事例において、細胞は、高レベルの所望産物(例えば、組換えタンパク質または抗体)を産生するように選択または操作されることになる。多くの場合、細胞は、例えば、目的のタンパク質をコードする遺伝子の導入および/またはその遺伝子(内因性であっても導入されたものであっても)の発現を調節する遺伝子制御エレメントの導入によって高レベルの組換えタンパク質を産生するように人の手によってマニピュレートされることになる。
医薬剤または他の商業的作用物質として現在使用中または調査下にある多数の抗体を考慮すると、抗体の産生は、本発明によれば特に目的とするものである。抗体は、特定抗原を特異的に結合させる能力を有するタンパク質である。宿主細胞内で発現され得る任意の抗体を、本発明によって産生することができ、本発明の方法によって、または本発明の細胞によって産生することができる。一部の実施形態では、発現される抗体は、モノクローナル抗体である。
一般に、本発明によって発現されることが望まれるタンパク質をコードする細胞内に導入される核酸分子は、本発明の方法によって、または本発明の細胞内にかつ本発明の細胞によって導入および発現され得る。代替として、核酸分子は、細胞による所望のタンパク質の発現を誘導する遺伝子産物をコードすることができる。例えば、導入される遺伝物質は、内因性または異種タンパク質の転写を活性化する転写因子をコードし得る。代替としてまたは追加的に、導入される核酸分子は、細胞によって発現されるタンパク質の翻訳または安定性を増大させることができる。
一般に、本発明によって発現されるタンパク質を単離および/または精製することが典型的には望ましいことになる。ある特定の実施形態では、発現タンパク質は、培地中に分泌され、よって細胞および他の固体を、例えば、精製法における第1のステップとして遠心分離または濾過によって除去することができる。
本発明のある特定の好適な実施形態では、産生されるポリペプチドまたはタンパク質は、薬理的活性を有することになり、医薬品の調製において有用となる。上述した発明組成物は、対象に投与することができ、またはそれだけに限らないが、非経口(例えば、静脈内)、皮内、皮下、経口、経鼻、気管支、眼、経皮(局部的な)、経粘膜、直腸、および膣経路を含めた任意の利用可能な経路によって送達するために最初に製剤化することができる。本発明の医薬組成物は、典型的には、薬学的に許容できる担体と組み合わせて、哺乳動物細胞株から発現される精製されたポリペプチドまたはタンパク質、送達剤(すなわち、上述したカチオン性ポリマー、ペプチド分子トランスポーター、界面活性剤など)を含む。本明細書では、言い回し「薬学的に許容できる担体」は、薬剤投与に適合する溶媒、分散媒質、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。追加の活性化合物も組成物中に組み込んでもよい。
培養において哺乳動物細胞の増殖に阻害作用を有するフェドバッチ培養中に蓄積する代謝副生物の同定
目標:
この実験は、包括的な代謝産物プロファイリング手法を使用した哺乳動物細胞のグルコース制限および従来のフェドバッチ培養において蓄積する主要な増殖インヒビター(代謝副生物)を同定するのに実行された。
細胞および培地
CHOはグルタミン合成酵素発現系(Lonzaから市販されている)(以下GS-CHO、細胞株A)を含み、組換え抗体を発現する本実験で使用した。2つのタイプの培地を本実験で使用した。第1の培地は、「培地A」であり、これは、培養の0日の実験の接種のために使用される。第2の培地は、培養用の従来の、およびHIPDOGフェドバッチプロセスのフィード培地として使用される強化栄養培地である「培地B」である(次セクションに記載されている)。
従来のフェドバッチプロセスおよびグルコース制限フェドバッチプロセスを含む2つの条件を使用した。グルコース制限フェドバッチプロセス(以下HIPDOG培養)では、グルコースは、HIPDOG技術を使用して制限された(Gagnonら、2011)。HIPDOG対照が使用可能であった間に使用したpH不感帯は、7.025+/-0.025であった。
質量分析を伴った液体/ガスクロマトグラフィー
試料調製を、メタノール抽出を使用して行ってタンパク質画分を除去した一方、低分子の最大回収を可能にした。結果として生じる抽出物を真空下で乾燥させ、適切な計測器、LC/MSまたはGC/MSのための試料調製に引き続いて使用した。
各試料1000μLをNanosep 3K Omega微量遠心フィルターチューブを使用して60分間濾過し、濾過した試料630μLをNMR分析に使用した。これらのフィルターは、グリセロールで保存したので、何らかの微量のグリセロールが分析に現れ得る。内部標準溶液を各試料溶液に添加し、得られた混合物を30秒間ボルテックスした。遠心分離した溶液700μLをNMRチューブに移し、データを取得した。
最初に細胞は、従来およびHIPDOG培養の両方において指数関数的に増殖し、それぞれ6日目および7日目にピーク細胞密度を達成し、HIPDOG培養でははるかにより高い細胞密度でピークとなった(図1)。HIPDOGプロセス/培養におけるラクテートレベルは、HIPDOG対照の適用(2日目~5日目の間)に起因して低いままであったが、一方、ラクテートレベルは、従来フェドバッチ培養の場合では非常に高レベルまで蓄積した。アンモニアも、グルタミン合成酵素発現系を含む細胞の使用によって従来およびHIPDOG培養中に低レベルで維持された。力価(細胞培養培地1リットル当たりの目的のタンパク質の量)を培養の最後(12日目)に測定した。HIPDOG培養は、従来プロセスと比較してより高い力価を達成した。細胞密度および力価値の差異は、2つの培養間で観察されたラクテート蓄積の差異の成果と考えられる。
実施例2:HIPDOGフェドバッチ培養の後期に蓄積する推定上のインヒビターの濃度の判定
目標:
この実験は、GS-CHO細胞のHIPDOGフェドバッチ培養における異なる時点で新しく同定された推定上の増殖インヒビター(代謝副生物)の濃度を査定するのに実行した。
実験セットアップは、実施例1で定義したものと同じである。定量化は、表3の最初の2つの群中の代謝産物についてLC/MSおよびGC/MS法によって実施し、NMR技術を群4および5中の代謝産物の定量化について使用した。表3の代謝産物列に列挙した代謝産物の最初の2つの群について、精製化合物を商業的に得、既知の濃度のこれらの化合物の溶液をベース溶媒として培地Aを使用して調製した。インヒビター同定および相対定量化(実施例1を参照)に使用したのと同様のLC/MSおよびGC/MS包括的代謝産物プロファイリング手法を使用して、4種の代謝産物について独立した較正曲線を調製した。これらの較正曲線は、LC/MSおよびGS/MS技法で使用した代謝産物の実際量のこの技法によって生成された強度値との数学的相関である。相関を実施例1で生成した強度値とともに引き続いて使用して、培養における異なる時点での代謝産物の濃度を算出した。
表3の最初の2つの群からの新しく同定した代謝産物の濃度を、描いた較正曲線を使用して判定し、群4および5に列挙した代謝産物の濃度を、実施例1の材料および方法セクションで論じたNMR技術によって判定した。HIPDOGフェドバッチ培養の7日目の6種の推定上のインヒビター(フェニルラクテート、3-(4-ヒドロキシフェニル)ラクテート、4-ヒドロキシフェニルピルベート、インドールラクテート、イソバレレート、およびホルメート)の濃度を表4に列挙する。
HIPDOGフェドバッチ培養の7日目に検出された濃度の同定された推定上のインヒビターの増殖抑制効果を確立するための実験
目標:
この実験は、培養におけるGS-CHO細胞の増殖に対するHiPDOG培養の7日目に判定した濃度で新しく同定された推定上のインヒビターの効果を査定するのに実行した。細胞の増殖に対する9種の代謝産物(フェニルラクテート、3-(4-ヒドロキシフェニル)ラクテート、4-ヒドロキシフェニルピルベート、インドールラクテート、インドールカルボン酸、ホモシステイン、2-ヒドロキシ酪酸、イソバレレート、およびホルメート)の独立した効果を最初に試験した。引き続いて、細胞増殖に対する4種の代謝産物(フェニルラクテート、3-(4-ヒドロキシフェニル)ラクテート、4-ヒドロキシフェニルピルベート、およびインドールラクテート)の相乗効果を試験した。
組換え抗体を産生するGS-CHO細胞を、5ml容積、6-ウェルプレート培養において様々な条件下で低生存細胞密度(0.1E6細胞/mL)で接種した。これらの条件は、新鮮培地A、または実施例1のHIPDOG培養の7日目に検出された濃度で4種の推定上のインヒビター(0.2mMのフェニルラクテート、0.38mMの3-(4-ヒドロキシフェニル)ラクテート、0.08mMの4-ヒドロキシフェニルピルベート、0.26mMのインドールラクテート)でスパイクインした新鮮培地Aを含む。別個の実験において、組換え抗体を産生するGS-CHO細胞に、1条件当たり1回に1種のインヒビターで、異なる濃度の9種のインヒビター(インドールカルボン酸、ホモシステイン、2-ヒドロキシ酪酸、フェニルラクテート、3-(4-ヒドロキシフェニル)ラクテート、4-ヒドロキシフェニルピルベート、インドールラクテート、イソバレレート、およびホルメート)でスパイクインした新鮮培地A中で低生存細胞密度で接種した。9種の代謝産物のいずれか1つ、または9種の代謝産物の任意の組合せでスパイクインした培地AのpHを7に調整した後、細胞に接種した(0日目)。試験した濃度は、
- インドールカルボン酸:0、0.5、および1mM
- ホモシステイン:0、0.5、および1mM
- 2-ヒドロキシ酪酸:0、1、および5mM
- フェニルラクテート:0、1、および5mM
- 3-(4-ヒドロキシフェニル)ラクテート:0、0.1、0.3、0.5、1、および5mM
- 4-ヒドロキシフェニルピルベート:0、0.05、0.1、および0.25mM
- インドールラクテート:0、1、および3mM
- イソバレレート:0、1、2.5、および5mM
- ホルメート:0、2、4、および6mM
インドールラクテートについて、原液(500mM)をDMSO中に調製した。したがって、純粋なDMSOスパイクイン条件(「DMSO cont」またはDMSO対照)を、細胞の増殖に対してDMSOの効果について制御するために、試験したあらゆる濃度のインドールラクテートを含めた。すべての条件を2通りにまたは3通りに行った。上述した条件における細胞の増殖を5または6日間モニターした。
GS-CHO細胞の増殖に対する9種すべてのインヒビターの独立した効果を調査した(図2、図3、図4、および図5)。インドールカルボン酸および4-ヒドロキシフェニルピルベートを、1mMまたはより低い濃度で細胞の増殖に対する強力な負の効果を有することを観察した。GS-CHO細胞が、0.5mMまたは1mMより高い濃度でホモシステイン、2-ヒドロキシ酪酸、または3-(4-ヒドロキシフェニル)ラクテートに曝露したとき、増殖の中程度の阻害が観察された。L-フェニルラクテートは、1mMの濃度で細胞の増殖に対する軽度の効果を有した。インドールラクテートは、3mMまたはそれ未満の濃度で細胞の増殖に対する効果をほとんどまたはまったく効果を示さなかった。ホルメートは、2mMおよびそれを超える濃度で増殖に対する負の効果を有した。イソバレレートは、1mM超の濃度で細胞の増殖に対する有意な負の効果を有した。
フェドバッチ培養における栄養分制限ストラテジーによる新しく同定されたインヒビターの増殖抑制効果の低減
目標:
この実験は、これらの生合成を担う炭素供給源の供給を制限することによって新しく同定されたインヒビターの形成を低減するために実施した。この実験の目標は、インヒビター形成をこのように低減すると、培養の後期において増殖抑制が緩和され、フェドバッチ培養において最大生存細胞密度の増大をもたらすか否かを査定することであった。
細胞およびバイオリアクターセットアップ
組換え抗体(細胞株A)を発現するGS-CHO細胞を本実験で使用した。2つの条件をこの実験の一部として試験した:A)低レベルの4種のアミノ酸((チロシン、メチオニン、フェニルアラニン、およびトリプトファン)を含むHIPDOGフェドバッチ培養(低AA条件))、B)通常のアミノ酸濃度を有するHIPDOGフェドバッチ培養(対照HIPDOG条件/培養)。シード培養からの指数関数的増殖細胞を各産生バイオリアクター中に1×106細胞/mLで接種した。両条件について、HIPDOGストラテジーを培養の2日目から7日目の間に運用した。低アミノ酸条件では、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニン、およびメチオニンの濃度を、培養の最初の7日間、0.5mMから1mMの間で維持し、その後、これらを対照HIPDOG条件におけるこれらのそれぞれのアミノ酸のレベルに調整した。7日目後、両条件を同様に処置した。生存細胞密度、ラクテート、アンモニア、およびアミノ酸の濃度を毎日測定した(アミノ酸は、最初の7日間のみ測定した)。両条件について、標的にした接種生存細胞密度(1×106細胞/mL)、および培養容積(1L)、ならびに温度(36.5℃)、pH(6.9~7.2)、および撹拌速度(267rpm)を含むプロセスパラメータは同一であった。対照HIPDOG条件で使用した基本培地は、培地Aであり、低AA条件で使用したものは、低濃度の4種のアミノ酸(およそ0.6mMのチロシン、トリプトファン、フェニルアラニン、およびメチオニン)を含む培地Aの改良版であった。対照HIPDOG培養に使用したフィード培地は、培地Bであった。低AA条件について、元の培地Bまたはより高濃度の4種のアミノ酸(チロシン、トリプトファン、メチオニン、およびフェニルアラニン)を含む培地Bの改良版をフィード培地(元のフィード培地Bと比較してメチオニンについて60%高い、チロシン、トリプトファン、およびフェニルアラニンについて約100%高いレベル)として配合および使用した。培地Bの改良版における4種のアミノ酸のレベルを、培養のHIPDOGプロセスにおける細胞株Aについての4種のアミノ酸の細胞特異的消費率および予め決定したフィーディングスケジュールに基づいて構成した。アミノ酸濃度をUPLCアミノ酸法(UPLC based amino acid method)を使用して、毎日測定した。この方法を以下でより詳細に記載する。所与のサンプリングポイントでのアミノ酸のレベルおよびフィーディングスケジュールに基づいて、2タイプの培地Bの一方(元の、またはより高い濃度)を4種のアミノ酸の濃度が次サンプリング時点で0.5~1mMの間であるように次サンプリングポイントまでフィード培地として選択した。
標準アミノ酸ミックス溶液または使用済み培地試料(10倍希釈試料)10μLをAccQ・Tag Ultraホウ酸塩緩衝液(Waters UPLC AAA H-クラス Applications Kit[176002983])70μLと混合し、AccQ・Tag Ultra試薬希釈剤1.0mL中に以前に溶解させたAccQ・Tag試薬20μLを添加した。反応を55℃で10分間進行させた。液体クロマトグラフィー分析は、バイナリソルベントマネージャー、オートサンプラー、カラムヒーター、およびPDA検出器を備えたWaters Acquity UPLCシステムで実施した。分離カラムは、Waters AccQ・Tag Ultraカラム(2.1mm i.d.×100mm、1.7μm粒子)であった。カラムヒーターは、55℃に設定し、移動相流量は、0.7mL/分で維持した。溶離液Aは、10% AccQ・Tag Ultra濃縮溶媒Aであり、溶離液Bは、100% AccQ・Tag Ultra溶媒Bであった。非線形分離勾配は、0~0.54分(99.9% A)、5.74分 (90.0% A)、7.74分(78.8% A)、8.04~8.64分(40.4% A)、8.73~10分(99.9% A)であった。試料1マイクロリットルを分析のために注入した。PDA検出器は、260nmに設定した。アミノ酸について以前に決定した溶出時間を使用して各試料のクロマトグラム上の特定のアミノ酸ピークを同定した。アミノ酸濃度を、ピーク下面積および標準液(Amino Acids Standard H、Thermo Scientific、PI-20088)を使用して作成した較正曲線を使用して推定した。
アミノ酸の濃度を、低AA条件中で0.5mM~1mMの間で順調に維持した(図8および図9)。対照HIPDOGプロセス中のアミノ酸濃度は、培養の過程にわたって高いままであった。図7に示した通り、低AA条件における細胞密度は、7日目に35×106細胞/ml付近でピークとなった一方、対照HIPDOG条件における細胞密度は、32×106細胞/mL付近でピークとなった。低AA条件(5.3g/L)における回収力価レベルは、対照条件(4.5g/L)より18%高かった。明らかに、アミノ酸供給を制限すると、培養の後期に細胞密度(それによって力価)が増大した。
フェドバッチ培養における(i)アミノ酸の制限による新しく同定されたインヒビターの蓄積の低減、および(ii)GS-CHO細胞(細胞株A)の増殖に対する阻害性代謝産物のこのような制限のプラス効果の再現性の実証
目標:
本実施例の主目標は、フェドバッチ培養における新しく同定されたインヒビターの蓄積の、これらの生合成を担う炭素供給源(アミノ酸)の供給を制限することによる低減を実証することであった。本実施例では、2つの実験が、4種のアミノ酸または8種のアミノ酸の制限による新しく同定されたインヒビターのレベルのこのような低減が、最大生存細胞密度の増大をもたらすフェドバッチ培養の後期における増殖抑制を緩和することを実証するのに含められた。
細胞およびバイオリアクターセットアップ
細胞株Aを本実施例の一部として実施した2つの実験で使用した。
A)低レベルのチロシン、メチオニン、フェニルアラニン、およびトリプトファン(培養の低4AA+HIPDOG条件)を用いたHIPDOGフェドバッチ培養、
B)低レベルのチロシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、ロイシン、セリン、トレオニン、およびグリシン(低8AA+HIPDOG条件)を用いたHIPDOGフェドバッチ培養、および
C)通常のアミノ酸濃度を用いた2つのHIPDOGフェドバッチ培養(HIPDOG1およびHIPDOG2)。
A)低レベルのチロシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、ロイシン、セリン、トレオニン、およびグリシンを用いたHIPDOGフェドバッチ培養(低8AA+HIPDOG条件)、および
B)低レベルのチロシン、メチオニン、フェニルアラニン、およびトリプトファンを用いたHIPDOGフェドバッチ培養(低4AA+HIPDOG条件)。
第1の実験では、アミノ酸の濃度を、フェドバッチ培養の7日目まで低4AAおよび低8条件の両方において0.5mM~1mMの間で順調に維持した(図11~14)。2つの条件におけるアミノ酸レベルのこのような制限は、新しく同定された代謝産物のより低いレベルの蓄積をもたらした(図15および図16)。イソバレレート、ホルメート、3-(4-ヒドロキシフェニル)ラクテート、およびインドール-3-ラクテートを具体的にプロファイリングした。イソバレレートおよびホルメートは、ロイシン、セリン、グリシン、およびトレオニンの副生物であり、これらは、低8AA条件においてのみ低レベルで制御される。これらのアミノ酸は、低4AA条件では低レベルで制御されない。対応して、有意により低い濃度のイソバレレートは、低8AA条件においてのみ見られる。イソバレレートのレベルは、対照HIPDOG条件および低4AA条件においてより高かった(図15B)。ホルメートレベルは、培養の7日目ですべての条件にわたって同様であったが、細胞1個当たりに基づくと、産生されるホルメートの量は、HIPDOG条件と比較して低8AA条件においてより低い。プロファイリングした他の2種のインヒビター、3-(4-ヒドロキシフェニル)ラクテートおよびインドール-3-ラクテートは、アミノ酸フェニルアラニンおよびトリプトファンの副生物であり、これらは、低8AAおよび低4AA条件の両方においてより低いレベルで制御される。これらの2種のインヒビターの有意により低い濃度が7日目にHIDPOG条件と比較して低8AAおよび低4AA条件の両方において観察された(図15Aおよび16)。
(i)アミノ酸の制限による新しく同定されたインヒビターの蓄積の低減、および(ii)フェドバッチ培養における異なるGS-CHO細胞株(細胞株B)の増殖に対する阻害性代謝産物のこのような制限のプラス効果の実証。
目標:
この実験は、細胞の増殖に対するある特定のアミノ酸のレベルを制限することの増殖に有益な効果は、1つの細胞株(細胞株A)に特異的でなかったが、より一般的であり、他の細胞株に適用できることを実証するために実施した。2つの栄養分制限実験を、異なる組換え抗体を産生する異なるCHO細胞株(細胞株B)を使用して本実施例の一部として実施した。これらの実験の目標は、フェドバッチ培養では、より低いレベルでアミノ酸を制御すると、インヒビター蓄積が低減され、インヒビターのこのような低い蓄積は、低アミノ酸フェドバッチ培養において見られた生存細胞密度およびタンパク質力価の増大を説明することができることを示すためであった。
細胞およびバイオリアクターセットアップ
異なる組換え抗体を発現する新しいGS-CHO細胞株(細胞株B)を本実施例で使用した。4種または8種のアミノ酸を同時に制限することの効果を理解するために2つの実験を実施した。第1の実験では、2つの条件を試験した:A)チロシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、ロイシン、セリン、グリシン、およびトレオニンを含む低レベルの8種のアミノ酸を用いたHIPDOGフェドバッチ培養(低8AA+HIPDOG条件)、およびB)通常のアミノ酸濃度を用いたHIPDOGフェドバッチ培養(HIPDOG条件)。第2の実験では、2つの条件を試験した:A)チロシン、メチオニン、フェニルアラニン、およびトリプトファンを含む低レベルの4種のアミノ酸を用いたHIPDOGフェドバッチ培養(低4AA+HIPDOG条件)、およびB)通常のアミノ酸濃度を用いたHIPDOGフェドバッチ培養(HIPDOG条件)。第1の実験は、12日間行った一方、第2の実験は、培養の8日目までのみ行った。
第1の実験では、8種のアミノ酸の濃度を、フェドバッチ培養の7日目まで低8AA条件中で0.5mM~1mMの間で順調に維持した。アミノ酸培養プロファイルは、本実験について示されていないが、本実験で消耗されなかったチロシンを除いて実施例5の実験1における同様の条件について観察されたものと同様である(図11~14)。低8AA条件におけるアミノ酸レベルのこのような制限は、新しく同定された代謝産物のより低いレベルの生合成および蓄積の低減をもたらした。表3に列挙した9種のインヒビターのうちの4種をプロファイリングした(図19および図20)。低8AA条件では、イソバレレート、3-(4-ヒドロキシフェニル)ラクテート、およびインドール-3-ラクテートの有意により低い蓄積が対照HIPDOG条件と比較して観察された。ホルメートレベルは、培養の10日目で低8AA条件においてより高いと観察されたが、細胞1個当たりに基づくと、産生されるホルメートの量は、HIPDOG条件と比較して低8AA条件において同様であった。低8AA条件における細胞は、9日目に40×106細胞/mLの細胞密度でピークとなった対照条件(HIPDOG)より良好に増殖した一方、対照HIPDOG条件における細胞密度は、32×106細胞/mL付近でピークとなった(図18A)。さらに、低8AA条件において観察される増殖の増大は、対照HIPDOG条件と比較してより高い力価レベルとなる(図18B)。低アミノ酸条件で観察された細胞増殖および産生性のこのような増大は、インヒビター生合成および蓄積の低減の成果として説明することができる(図19および20)。
4種(フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、およびメチオニン)、または8種のアミノ酸(フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、ロイシン、セリン、グリシン、およびトレオニン)、ならびに新しく同定されたインヒビターをオンラインで測定するためのラマン分光法の使用
ラマン分光法は分子による単色光(光子)の非弾性散乱に基づく。本技術は、光子が分子によって吸収および再放出されるときの光子のエネルギーの変化に起因する光の周波数シフトを使用して分子の特性を判定する。本技術は、微生物および哺乳動物細胞培養バイオリアクターにおいて順調に使用されており、様々なプロセスパラメータのレベルを測定することに成功している。ラマン分光法は、CHO細胞培養液中のグルコース、ラクテート、アンモニア、グルタミン、およびグルタミン酸の濃度を判定するのにも使用されている。
インヒビター濃度のオンライン測定を使用することによってフェドバッチ培養において低レベルでアミノ酸を制御することによるインヒビター形成の抑制
フェドバッチプロセスは、4種(フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、およびメチオニン)または8種のアミノ酸(フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、ロイシン、セリン、グリシン、およびトレオニン)を細胞培養培地中で低レベル、例えば、0.2~1mMの間に制御することによってインヒビターの形成を低減するように設計されている。インヒビター産生のこのような制御は、インヒビター自体のオンライン測定に基づいてフィードバックループとして運用するフィーディングストラテジーによって達成される。このようなオンライン測定は、ラマン分光法の形態であり、またはプログラムされた様式で反応器から試料を引き出し、装置にこれを移すオートサンプラーを伴ったHPLCまたはUPLCに基づく技術を使用するものである。インヒビターの濃度は指定レベル(例:0.2mM)より上に上昇するので、かつ上昇したとき、細胞にフィードされるフェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、ロイシン、セリン、グリシン、およびトレオニンの量は、インヒビターの濃度が既定レベル(例えば、0.1mM)未満に降下するまで低下する。
オンラインまたはオフライン測定によるインヒビター形成の抑制およびフェドバッチ培養における低レベルでのアミノ酸の制御
フェドバッチプロセスは、4種(フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、およびメチオニン)または8種のアミノ酸(フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、ロイシン、セリン、グリシン、およびトレオニン)を低レベル(0.2~1mM)で制御することによってインヒビターの形成を低減するように設計されている。インヒビター形成のこのような制御は、アミノ酸のオンライン測定に基づいてフィードバックループとして運用するフィーディングストラテジーによって達成される。このようなオンライン測定は、ラマン分光法の形態であり、またはプログラムされた様式で反応器から試料を引き出し、装置にこれを移すオートサンプラーを伴ったHPLCまたはUPLCに基づく技術を使用するものである。アミノ酸の濃度は指定レベル(例:0.5mM未満)に降下するので、かつ降下したとき、推定量のフィード培地(培地Bと同様の)が4種または8種のアミノ酸の濃度を維持するために培養液中に添加される。
フェドバッチ培養において低レベルでアミノ酸を保つためのプログラムフィーディングによるインヒビター形成の抑制
培養液中の新しく同定されたインヒビターの形成は、4種(フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、およびメチオニン)または8種のアミノ酸(フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、ロイシン、セリン、グリシン、およびトレオニン)の濃度を培養液中で低レベル(0.2~1mM)で維持することによって低く保たれる。これは、アミノ酸の濃度が培養中の任意の所与の時点で所望の範囲(0.2mM~1mM)内に常にあるようにプログラムフィーディングストラテジー(改変培地Bを使用して)を設計することによって達成される。このようなフィーディングストラテジーは、培養に沿って異なる時点でアミノ酸の特定の消費率を査定し、上記に定義されたフィーディングストラテジー/スケジュールを用いて、十分な量のアミノ酸が培養液に提供されて所望の範囲(0.2~1mM)内にアミノ酸濃度が維持されるようにフィード培地(培地B)中の濃度を改変することによって工夫されている。
フェニルアラニン/チロシン経路に関連したインヒビターの生合成を抑制するための代謝操作の遺伝子標的を判定する実験
目標:
本実験は、フェニルラクテート、4-ヒドロキシフェニルピルベート、および3-(4-ヒドロキシフェニル)ラクテートを含めたインヒビター分子の産生の原因を判定するのに実施された。フェニルアラニン/チロシン経路におけるすべての酵素の遺伝子発現をリアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)アッセイを使用してプローブした。フェニルアラニン/チロシン異化経路の遺伝子発現および生化学に基づいて、上述したインヒビターの生合成を抑制するCHO細胞株Aを代謝操作するための遺伝子標的を同定した。
遺伝子発現分析
RT-qPCRアッセイを使用してロイシンおよびフェニルアラニン/チロシン代謝経路における酵素の相対的遺伝子発現レベルを査定した。RT qPCRは、検出試薬(すなわち、SYBR Green)と組み合わせてPCRを使用して標的cDNA配列を増幅することによって転写量、したがって遺伝子発現を測定する。SYBR greenは、二本鎖DNAに結合されているとき蛍光を発する分子であり、蛍光は、RT qPCRアッセイ中にリアルタイムで測定することができる。蛍光の量は、反応における二本鎖PCR産物(アンプリコンとも呼ばれる)の量に正比例する。相対的遺伝子発現レベルは、バックグラウンド蛍光を上回るのにSYBR green蛍光に必要とされるPCRサイクルの数を測定することによって判定され、対数的に増大する。このサイクル数は一般に、CT(閾値サイクル)と呼ばれる。高存在量での転写物は、より低いCT値を有するはずであり、その理由は、蛍光がバックグラウンド蛍光を上回るためにより少ないPCRサイクルを必要とするためであり、反対に、より低い存在量での転写物は、より高いCT値を有するはずであり、その理由は、蛍光がバックグラウンドレベルを上回るためにより多くのPCRサイクルを必要とするはずであるためである。
フェニルアラニン/チロシン経路における遺伝子のCTおよびΔCT値を図24に示す。フェニルアラニン/チロシン経路からの遺伝子発現データは、CHO細胞株Aは、PAH、HPD、およびHGD遺伝子の発現が低いことを示す。発現タンパク質(または酵素)レベルは、転写量に相関するので、低レベルのPAH酵素は、ともにCHO細胞株A内で高レベルで発現されるGOT1/GOT2およびMIF酵素の触媒作用によってフェニルピルベートに、引き続いてフェニルラクテートに変換されるフェニルアラニンをもたらし得る。同様に、CHO細胞株内のHPDおよびHGD酵素が低レベルであることに起因して、チロシンは、GOT1/GOT2およびMIF酵素の触媒作用によって4-ヒドロキシフェニルピルベートおよび3-(4-ヒドロキシフェニル)ラクテートの産生にチャネリングされる。インヒビター産生に向けたフェニルアラニンおよびチロシンフラックスのチャネリングの低減は、GOT1/GOT2およびMIF遺伝子の発現の下方調節を必要とする。しかし、GOT1/GOT2およびMIFは、他の生理学的に重要な代謝機能に極めて重要である。したがって、2種の酵素の下方調節は、生存細胞株を潜在的に生じないはずである。インヒビター生合成を低減する代替のやり方は、PAH、HPD、およびHGD遺伝子の過剰発現によるものであり、次いでそれは、インヒビター産生から離してクレブス回路代謝産物(これらは、ミトコンドリア内のエネルギー合成に使用される)の産生に向けてフラックスをチャネリングする。したがって、フェニルアラニン/チロシン経路の代謝標的は、PAH、HPD、およびHGD遺伝子である。
ロイシン経路に関連したインヒビターの生合成を抑制するための代謝操作の遺伝子標的を判定する実験
目標:
本実験は、ロイシン代謝の副生物であり、CHO細胞のフェドバッチ培養において非常に高レベルに蓄積するイソ吉草酸の生合成および蓄積の原因を判定するのに実施した。ロイシン経路内のすべての酵素の遺伝子発現を、リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)アッセイを使用してプローブした。さらに、イソ吉草酸血症などのヒトの病状におけるイソ吉草酸の産生は、イソバレリル-CoA、ロイシン異化作用経路の中間体の下流の酵素における「機能喪失」突然変異に起因すると報告された。これらの酵素としては、Ivd、Mccc1、およびMccc2があり、これらは、活性喪失突然変異を宿し得るが高レベルで発現される。したがって、CHO細胞株A内のこれらの酵素の突然変異状態を調査した。ロイシン異化作用経路における上述した酵素の遺伝子発現分析および突然変異分析に基づいて、イソ吉草酸の生合成を抑制することになるCHO細胞株Aの代謝操作の遺伝子標的を同定した。
突然変異分析
Ivd、Mccc1、およびMccc2の翻訳領域にフランクする(5’および3’末端で)ゲノムDNA配列を同定し、Primer3アルゴリズム(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/)を使用してPCRプライマー設計の鋳型として使用した。RNAは、Qiagen RNeasyキット(Qiagen)を使用してCHO細胞株Aから調製し、それをひいては、RT-PCR用SuperScript III First-Strand Synthesisシステム(Life Technologies)を使用してオリゴdTプライミングcDNA合成の鋳型として使用した。伸長温度およびマグネシウム濃度が最適化されたPCR反応を、Pfu Turbo HotStart 2X Master Mix(Agilent)を使用して実施した。試料を、QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen)を使用して精製し、Wyzerbio(Cambridge、MA)での配列分析に送った。
ロイシン経路内の遺伝子のCTおよびΔCT値を図25に示す。フェニルアラニン/チロシン経路からの遺伝子発現データは、CHO細胞株AのAUH酵素のレベルが経路内の他の酵素と相対的に低いことを示す。しかし、このデータは、より早期の実験において報告された高レベルのイソ吉草酸産生を強く説明せず、その理由は、酵素がイソ吉草酸産生に向けて分岐するノードのさらに下流にあるためである(図25)。したがって、IVD、MCCC1、および/またはMCCC2の機能(酵素活性)の喪失は、イソ吉草酸産生のより良好な原理を与えることができる。DNAシーケンシング結果は、突然変異状態およびコードされる酵素の機能のもっともらしいレベルを明らかにする。IVD、MCCC1、およびMCCC2遺伝子中の突然変異を変更する酵素活性が見つかった場合、対応する野生型(非突然変異)遺伝子の過剰発現を伴う代謝操作手法が行われることになり、この場合、遺伝子起源は、CHO細胞株由来であるはずであるが、野生型遺伝子の他の起源、例えば、ヒト、ラット、マウスなども利用可能であり、使用することができる。これに加えて、AUH遺伝子も、同じCHO細胞株A内で過剰発現されることになる。
HPD、HGD、PAH、AUH、および突然変異分析によって実施例12で判定した任意の他の遺伝子標的の野生型形態のマウス遺伝子をCHO細胞株A内で異所性に発現させる実験
目標:
RT qPCRアッセイによって判定されるベータアクチンと相対的低遺伝子発現レベルに基づいて4つの標的をCHO細胞内の過剰発現について選択した:Auh(ロイシン代謝経路)ならびにHPD、HGD、およびPAH(フェニルアラニン/チロシン代謝経路)。さらに、IVD、MCCC1、およびMCCC2の活性喪失突然変異状態に基づいて、突然変異酵素の野生型遺伝子をCHO細胞内の過剰発現について選択するであろう。一般に、遺伝子が突然変異され、または不活性であると見いだされる場合、ストラテジーは、野生型遺伝子を過剰発現させることである。目標は、これらの遺伝子のマウスmRNA配列を市販の哺乳動物発現ベクター中にクローニングし、CHO細胞株Aにこれらの発現ベクターをトランスフェクトすることである。得られる細胞株は、マウスAUH、HPD、HGD、またはPAH遺伝子の発現が高レベルであり、ひいてはより高いレベルのAUH、HPD、HGD、またはPAH酵素活性を有する。これらの重要な酵素の活性が増大すると、おそらく代謝フラックスが改善され、ある特定の公知の阻害性物質の細胞濃度が低減されることになる。
過剰発現カセットを、AUH、HPD、HGD、および/またはPAH遺伝子のMGCコレクション(http://genecollections.nci.nih.gov/MGC/)からマウスcDNA配列を使用して構築した。配列は、標的遺伝子のcDNAを含むシャトルベクターを含有する大腸菌(E.coli)グリセロールストック(GE Dharmacon)として提供した。PCRプライマーを、Primer3アルゴリズム(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/)を使用して設計して、Pfu Turbo HotStart 2X Master Mix(Agilent)と呼ばれる校正ポリメラーゼを用いて反応におけるcDNAのコード領域を増幅した。PCR産物は、pcDNA Gateway Direction TOPO発現ベクター(Invitrogen)中に指向的にクローニングした。ベクターは、ウイルスプロモーター配列(ヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーター)、指向性TOPOクローニング部位、抗V5抗体を使用して検出するためのエピトープタグ(V5)、ポリアデニル化配列(単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ)、および抗生物質耐性遺伝子(ブラストサイジン)を含有する。ベクターは、WyzerBioによって確認され、GenePulser XCellエレクトロポレーター(BioRad)を使用して過剰発現のためにCHO細胞株A内にトランスフェクトされ、選択圧についてブラストサイジンの存在下で回収される配列である。操作されたCHO細胞を、RT qPCR、ウェスタンハイブリダイゼーション、および酵素アッセイによって導入遺伝子の発現について査定する。ブラストサイジンを含有する培地で選択した後、細胞をバイオリアクターで後に実験するために凍結保存する。
実施例11および12で判定された標的遺伝子を発現する遺伝子操作された細胞株内でのインヒビター形成の抑制をプローブする実験
目標:
本実験の一部として、標的遺伝子を過剰発現するクローン(およびプール)の表現型を調査した。表現型判定は主に、HIPDOGフェドバッチ培養におけるこれらのクローンのピーク細胞密度および産生性ならびに/または培養液中のインヒビター分子蓄積のレベルを主に伴う。
細胞およびバイオリアクターセットアップ
実験で使用したCHO細胞は、PAH、HPD、HGD、AUH、および突然変異分析によって実施例11および12で判定した任意の他の遺伝子標的の野生型形態の過剰発現から得られるCHO細胞株Aの操作された形態である。2つの条件を本実験の一部として試験する:A)すべての標的遺伝子を発現するCHO細胞を使用するHIPDOGフェドバッチ培養B)GFPタンパク質を発現するCHO細胞を用いたHIPDOGフェドバッチ培養。HIPDOG技術の使用についての詳細は、実施例1の材料および方法セクションに記載されている。シード培養からの指数関数的増殖細胞を1×106細胞/mLでHiPDOGプロセスを使用する産生バイオリアクター内に接種した。両条件について、HiPDOG対照を培養の2日目と7日目との間で運用する。生存細胞密度、ラクテート、アンモニア、およびアミノ酸濃度を12日目まで毎日測定する(アミノ酸は、最初の7日のみ測定する)。両条件について、標的にした接種生存細胞密度(1×106細胞/mL)、および培養容積(1L)、ならびに温度(36.5℃)、pH(6.9~7.2)、および撹拌速度(267rpm)を含むプロセスパラメータは同一であった。両条件について、使用される基本培地は培地Aとなり、フィード培地は培地Bである。両実験にわたる様々な条件からの上清試料を、実施例1の材料および方法セクションに記載のNMR技術を使用して新しく同定されたインヒビターのレベルについて分析する。アミノ酸濃度を以下で詳細に記載するUPLCアミノ酸法を使用して試料について測定する。
標準アミノ酸ミックス溶液または使用済み培地試料(10倍希釈試料)10μLをAccQ・Tag Ultraホウ酸塩緩衝液(Waters UPLC AAA H-クラス Applications Kit[176002983])70μLと混合し、AccQ・Tag Ultra試薬希釈剤1.0mL中に以前に溶解させたAccQ・Tag試薬20μLを添加した。反応を55℃で10分間進行させる。液体クロマトグラフィー分析を、バイナリソルベントマネージャー、オートサンプラー、カラムヒーター、およびPDA検出器を備えたWaters Acquity UPLCシステムで実施した。分離カラムは、Waters AccQ・Tag Ultraカラム(2.1mm i.d.×100mm、1.7μm粒子)である。カラムヒーターを55℃に設定する。移動相流量を0.7mL/分で維持した。溶離液Aは、10% AccQ・Tag Ultra濃縮溶媒Aであり、溶離液Bは、100% AccQ・Tag Ultra溶媒Bである。非線形分離勾配は、0~0.54分(99.9% A)、5.74分(90.0% A)、7.74分(78.8% A)、8.04~8.64分(40.4% A)、8.73~10分(99.9% A)である。試料1マイクロリットルを分析のために注入する。PDA検出器を260nmに設定する。アミノ酸について以前に決定した溶出時間を使用して各試料のクロマトグラム上の特定のアミノ酸ピークを同定する。アミノ酸濃度を、ピーク下面積および標準液(Amino Acids Standard H、Thermo Scientific、PI-20088)を使用して作成した較正曲線を使用して推定する。
標的遺伝子を発現する細胞は、より少ない炭素(フェニルアラニン、チロシン、およびロイシン)をインヒビターの生合成に向けてチャネリングし、培養培地中の化合物の蓄積がより低くなる。しかし、GFP分子(陰性対照)を発現する細胞は、より多くの炭素をインヒビター産生に向けてチャネリングし、培養培地中の化合物のより高い蓄積をもたらす。インヒビター産生および蓄積のレベルのこのような差異は、GFPを発現する細胞と比較して標的遺伝子セットを発現する細胞内のより高いピーク細胞密度に至る増殖差異をもたらせる。全細胞のこのような増加も、細胞によって産生される組換えタンパク質のより高い過剰収量に至る。
フェニルアラニン/チロシン経路に関連したインヒビターの生合成を抑制するための代謝操作の遺伝子標的を判定する実験
目標
本実験は、フェニルラクテート、4-ヒドロキシフェニルピルベート、および3-(4-ヒドロキシフェニル)ラクテートを含めたインヒビター分子の産生の原因を判定するのに実施された。フェニルアラニン/チロシン経路におけるすべての酵素の遺伝子発現をリアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)アッセイを使用してプローブした。フェニルアラニン/チロシン異化経路の遺伝子発現および生化学に基づいて、上述したインヒビターの生合成を抑制するCHO細胞(CHO細胞株A、CHO細胞株B、および親細胞株)の代謝操作の遺伝子標的を同定した。
遺伝子発現分析
RT-qPCRアッセイを使用してフェニルアラニン/チロシン代謝経路における酵素の相対的遺伝子発現レベルを査定した。RT qPCRは、検出試薬(すなわち、SYBR Green)と組み合わせてPCRを使用して標的cDNA配列を増幅することによって転写量、したがって遺伝子発現を測定する。SYBR greenは、二本鎖DNAに結合されているとき蛍光を発する分子であり、蛍光は、RT qPCRアッセイ中にリアルタイムで測定することができる。蛍光の量は、反応における二本鎖PCR産物(アンプリコンとも呼ばれる)の量に正比例する。相対的遺伝子発現レベルは、バックグラウンド蛍光を上回るのにSYBR green蛍光に必要とされるPCRサイクルの数を測定することによって判定され、対数的に増大する。このサイクル数は一般に、CT(閾値サイクル)と呼ばれる。高存在量での転写物は、より低いCT値を有するはずであり、その理由は、蛍光がバックグラウンド蛍光を上回るためにより少ないPCRサイクルを必要とするためであり、反対に、より低い存在量での転写物は、より高いCT値を有するはずであり、その理由は、蛍光がバックグラウンドレベルを上回るためにより多くのPCRサイクルを必要とするはずであるためである。
CHO細胞株Aおよび親細胞株のフェニルアラニン/チロシン経路中の遺伝子についてのCTおよびΔCT値を図26に示す。CHO細胞株Bは、CHO細胞株Aと同様のレベルの遺伝子発現を有する(データを示さず)。フェニルアラニン/チロシン経路からの遺伝子発現データは、CHO細胞株Aおよび親細胞株は、PAH、HPD、およびHGD遺伝子の発現が低いことを示す。タンパク質(または酵素)レベルは、転写量に相関し、低レベルのPAH酵素は、ともにCHO細胞株Aおよび親細胞株内で高レベルで発現されるGOT1/GOT2およびMIF酵素の触媒作用(または非特異的酵素反応)によってフェニルピルベートに、引き続いてフェニルラクテートに変換されるフェニルアラニンをもたらし得る。同様に、CHO細胞株Aおよび親細胞株内のHPDおよびHGD酵素が低レベルであることに起因して、チロシンは、GOT1/GOT2およびMIF酵素の触媒作用(または非特異的酵素反応)によって4-ヒドロキシフェニルピルベートおよび3-(4-ヒドロキシフェニル)ラクテートの産生にチャネリングされる。フェニルアラニンおよびチロシンフラックスのインヒビター産生に向けたチャネリングを低減する一つのやり方は、GOT1/GOT2およびMIF遺伝子の発現を下方調節することであるはずである。しかし、GOT1/GOT2およびMIFは、他の生理学的に重要な代謝機能に極めて重要である。したがって、これらの2つの酵素の下方調節またはノックアウトは、生存細胞株を潜在的に生じないはずである。インヒビター生合成を低減する代替のやり方は、PAH、HPD、およびHGD遺伝子の過剰発現によるものであり、次いでそれは、インヒビター産生から離してクレブス回路代謝産物(これらは、ミトコンドリア内のエネルギー合成に使用される)の産生に向けてフラックスをチャネリングする。したがって、フェニルアラニン/チロシン経路のために選択された代謝標的は、PAH、HPD、およびHGD遺伝子である。
CHO細胞株内でPAH、HPD、HGD、およびPCBD1を過剰発現させる実験
目標
RT qPCRアッセイによって判定した場合にB-アクチンと相対的低遺伝子発現レベルに基づいて、4つの標的をCHO細胞の過剰発現について選択した:HPD、HGD、PAH、およびPCBD1。本実験の主目標は、市販の哺乳動物発現ベクター内にこれらの遺伝子のmRNA配列をクローニングし、CHO親細胞株、CHO細胞株A、およびCHO細胞株Bに発現ベクターをトランスフェクトすることであった。得られる細胞株は、HPD、HGD、PAH、およびPCBD1遺伝子の発現が高レベルであり、ひいてはより高いレベルのHPD、HGD、PAH、およびPCBD1酵素活性を有する。これらの重要な酵素の活性が増大すると、代謝フラックスが改善され、同定された阻害性物質の細胞濃度が低減された。
HPD、HGD、PAH、およびPCBD1遺伝子の発現ベクターを、MGCコレクション(http://genecollections.nci.nih.gov/MGC/)からマウスcDNA配列を使用して構築した(図28)。配列は、標的遺伝子のcDNAを含むシャトルベクターを含有する大腸菌(E.coli)グリセロールストックとしてGE Dharmaconによって提供した。PCRプライマーを、Primer3アルゴリズム(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/)を使用して設計して、Pfu Turbo HotStart 2X Master Mix(Agilent)と呼ばれる校正ポリメラーゼを用いて反応におけるcDNAのコード領域を増幅した。PCR産物は、異なる抗生物質耐性遺伝子を含む市販の構成的発現ベクター内にクローニングして表6に示した発現プラスミドの個々の選択を可能にした。さらに、対照ベクターも、陰性対照(トランスフェクション対照)として機能を果たすために供給業者によって提供された。ベクターは、WyzerBiosciences(Cambridge、MA)が確認した配列であった。発現および対照プラスミドを、GenePulser XCellエレクトロポレーター(BioRad)を使用してCHO親細胞、CHO細胞株A、およびCHO細胞株B内にトランスフェクトし、選択圧について抗生物質の存在下で回収した。段階的手法を採用し、それにより細胞にPAH発現ベクターを最初にトランスフェクトし、回収した。次いでPAH発現細胞プールにHPDおよびHGDを一緒にトランスフェクトし、得られる細胞プールに、最終産物、4倍トランスフェクト細胞株が実現されるまでPCBD1をトランスフェクトした。抗生物質を含有する培地で選択した後、細胞プールをバイオリアクターで後に実験するために凍結保存した。図28は、発現されたマウス遺伝子、Pfizerの研究所で創製された発現ベクター、および抗生物質選択遺伝子を示す。CHO細胞株Aは、PAHをトランスフェクトしただけであり、後続のセットのトランスフェクションは行わなかった。表6は、使用した市販の発現ベクター、選択圧として使用した抗生物質、および発現ベクターの供給業者を含む、発現された各遺伝子に使用したプラスミドの概要を示す。陰性トランスフェクション対照細胞株を生成するのに使用したヌルベクターも列挙されている。
細胞プールを、付随する陰性対照ベクター(空ベクターまたはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)を含有するベクター)(4x-対照-tfxn細胞プールと呼ぶ)とともにPAH、HPD、HGD、およびPCBD1発現ベクター(4x-tfxn細胞プールと呼ぶ)をトランスフェクトした後生成した。トランスフェクションから得た4x-tfxn細胞プールは、高レベルでマウスPAH、HPD、HGD、およびPCBD1遺伝子を発現し、増大したPAH、HPD、HGD、およびPCBD1酵素活性を有するように設計した。RT qPCRおよびウェスタンハイブリダイゼーション(データを示さず)による分析を使用して、新しく創製されたトランスジェニック細胞プール内でのPAH、HPD、HGD、およびPCBD1遺伝子発現(ともに内因性かつトランスジェニック)の変化を判定した(実施例17を参照)。
4倍トランスフェクションから生成された細胞プール内のマウス導入遺伝子(PAH、HPD、HGD、およびPCBD1)の発現をプローブする実験
目標
RT qPCRアッセイを実施して親細胞株またはCHO細胞株Bに由来する4x-tfxn細胞プール内のマウス導入遺伝子PAH、HPD、HGD、およびPCBD1の相対的遺伝子発現レベルを査定した。
RT qPCRアッセイは、Applied Biosystems 7500リアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems)およびPowerUP SYBR Green Master Mix試薬(Life Technologies)を使用して実施した。PCRプライマーは、GE Dharmaconによって提供されたMGCコレクション(http://genecollections.nci.nih.gov/MGC/)からのマウスcDNA配列に基づいてPrimer3アルゴリズム(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/)を使用して設計した。RNAは、Qiagen RNeasyキット(Qiagen)を使用してCHO細胞株Aまたは親細胞株の4x-tfxn細胞プールおよび4x-対照-tfxn細胞プールから調製し、それをひいては、RT-PCR用SuperScript III First-Strand Synthesisシステム(Life Technologies)を使用してオリゴdTプライミングcDNA合成の鋳型として使用した。マウスPAH、HPD、HGD、およびPCBD1遺伝子のCT値を表にし、十分特徴付けられたハウスキーピング遺伝子、B-アクチンのCT値と比較した。標的遺伝子のCTとB-アクチンのCTとのデルタをΔCTとして報告した。4x-tfxn細胞プール内でのマウス導入遺伝子PAH、HPD、HGD、およびPCBD1遺伝子の順調な発現を、マウスPAH、HPD、HGD、およびPCBD1発現を欠く陰性対照(4x-対照-tfxn)細胞プール内の導入遺伝子のΔCT値と比較したときのΔCT値の低減(したがって遺伝子発現レベルの増大)によって同定した。
4x-tfxn細胞プールおよび対応する陰性対照プール(4x-対照-tfxn)内のマウスPAH、HPD、HGD、およびPCBD1遺伝子のCT値を表7に示す。対応する陰性対照細胞プール(4x-対照-tfxn)と比較して、より低いΔCT値が、CHO細胞株Bおよび親細胞株の4x-tfxn細胞プール内のマウス導入遺伝子について観察された。これは、標的の遺伝子発現が、4x-tfxnプールにおいてより高かったので、アミノ酸フラックスをフェニルラクテート、3-(4-ヒドロキシフェニル)ラクテート、および4-ヒドロキシフェニルラクテートインヒビター生合成経路から離すチャネリングを促進することを示す(実施例19を参照)。4x-対照-tfxn細胞プール内でのマウスPAH、HPD、HGD、およびPCBD1の発現の明らかな存在は、トランスジェニック(マウス)PAH、HPD、HGD、およびPCBD1遺伝子と内因性(ハムスター)PAH、HPD、HGD、およびPCBD1遺伝子との間の高レベルの配列相同性に部分的に起因する。これは、データがトランスジェニックおよび内在性遺伝子の両方を含めたPAH、HPD、HGD、およびPCBD1遺伝子発現の総レベルを正確に反映することを示唆する。
チロシンフリー培地中でPAH、HPD、HGD、およびPCBD1を含む4種のトランスフェクションマウス遺伝子を発現して増殖する細胞プール(4x-tfxn)の能力のプローブ
目標
PAHおよびPCBD1酵素活性の発現は、細胞に、フェニルアラニンからのチロシンの合成を触媒し、したがってアミノ酸フラックスをフェニルラクテート、3-(4-ヒドロキシフェニル)ラクテート、および4-ヒドロキシフェニルラクテートインヒビター生合成経路から離すチャネリングを促進する能力を付与した(実施例19を参照)。本実験の目標は、CHO細胞株Bまたは親宿主細胞株に由来するPAH、HPD、HGD、およびPCBD1を含む4種のマウス遺伝子を発現する4x-tfxn細胞プールがチロシンフリー培地条件下で増殖する能力を有するか否かを試験することであった。
細胞、培地、および実験セットアップ
CHO細胞株Bまたは親細胞株の4x-tfxn細胞プールまたは4x-対照-tfxn細胞プールをスピンダウンし、細胞ペレットを培地D(チロシンを含まないが追加量(2mM)のフェニルアラニンが補充された培地C)に接種した。培地Cは、培地A中のレベルの様々なアミノ酸の濃度のおよそ3分の1である。培地Aは、炭酸水素ナトリウムおよび塩化カリウムの濃度にわずかな差異があり、ポリビニルアルコールの代わりにPluronic F68を含有する、US7294484、表14に開示のインスリンフリー培地9の強化版である。これは、10%グルタミンフリー培地5(US7294484、表7)を添加し、8種のアミノ酸(Glu、Tyr、Gly、Phe、Pro、Thr、Trp、およびVal)の濃度をさらに上昇させることによって強化した。アミノ酸の濃度を以下で表8に列挙する。
初代において、3日間の過程にわたって、4x-tfxn細胞プールに由来する細胞株Bおよび親細胞株はともに、チロシンフリー培地条件下で十分増殖した一方、4x-対照-tfxn細胞プールは、いずれの増殖も示さなかった(図29)。第2の継代において、第1のラウンドと同様に、4x-tfxn細胞プールは、十分増殖した一方、4x-対照-tfxn細胞プールは、いずれの増殖も示さなかった。このデータは、4x-tfxn細胞プールが、フェニルアラニンからチロシン合成を合成し、したがってアミノ酸フラックスをフェニルラクテート、3-(4-ヒドロキシフェニル)ラクテート、および4-ヒドロキシフェニルラクテートインヒビター生合成経路から離すチャネリングを促進することができることを示唆した(実施例19を参照)。
(i)チロシン補充培養における4x-対照-tfxn細胞プールと比較したときのチロシンフリーフェドバッチ培養における4x-tfxn細胞プールの同様のまたはより良好な増殖/産生性、および(ii)4x-tfxn培養における3-(4-ヒドロキシフェニル)ラクテート、チロシン経路の副生物の蓄積の低減の実証
目標
本実験の目標は、4x-tfxn細胞プールが、典型的な(チロシン補充)HiPDOG培養における4x-対照-tfxn細胞プールと比較したとき、同様のまたはより高い増殖速度でチロシンフリーHiPDOG培養下で増殖し、同様のまたはより高いピーク細胞密度に到達し、同様のまたはより高い力価を生じさせることができることを実証することであった。別の目標は、チロシンフリー培地中での培養を用いたPAH、HPD、HGD、およびPCBD1発現の組合せが、チロシン経路の代謝産物副生物、3-(4-ヒドロキシフェニル)ラクテートの産生を抑制することを確立することであった。
細胞およびバイオリアクターセットアップ
組換え抗体を発現するCHO細胞株Bに由来する4x-tfxn細胞および4x-対照-tfxn細胞プールを本実施例で使用した。4x-tfxn細胞プールは、4種のマウス酵素(PAH、HPD、HGD、およびPCBD1)を発現した一方、4x-対照-tfxn細胞プールは、選択圧の耐性マーカーのみを発現した対照細胞である。
各試料1000μLをNanosep 3K Omega微量遠心フィルターチューブを使用して60分間濾過し、濾過した試料630μLをNMR分析に使用した。これらのフィルターは、グリセロールで保存したので、何らかの微量のグリセロールが分析に現れ得る。内部標準溶液を各試料溶液に添加し、得られた混合物を30秒間ボルテックスした。遠心分離した溶液700μLをNMRチューブに移し、データを取得した。
標準アミノ酸ミックス溶液または使用済み培地試料(10倍希釈試料)10μLをAccQ・Tag Ultraホウ酸塩緩衝液(Waters UPLC AAA H-クラス Applications Kit[176002983])70μLと混合し、AccQ・Tag Ultra試薬希釈剤1.0mL中に以前に溶解させたAccQ・Tag試薬20μLを添加した。反応を55℃で10分間進行させた。液体クロマトグラフィー分析は、バイナリソルベントマネージャー、オートサンプラー、カラムヒーター、およびPDA検出器を備えたWaters Acquity UPLCシステムで実施した。分離カラムは、Waters AccQ・Tag Ultraカラム(2.1mm i.d.×100mm、1.7μm粒子)であった。カラムヒーターは、55℃に設定し、移動相流量は、0.7mL/分で維持した。溶離液Aは、10% AccQ・Tag Ultra濃縮溶媒Aであり、溶離液Bは、100% AccQ・Tag Ultra溶媒Bであった。非線形分離勾配は、0~0.54分(99.9% A)、5.74分 (90.0% A)、7.74分(78.8% A)、8.04~8.64分(40.4% A)、8.73~10分(99.9% A)であった。試料1マイクロリットルを分析のために注入した。PDA検出器は、260nmに設定した。アミノ酸について以前に決定した溶出時間を使用して各試料のクロマトグラム上の特定のアミノ酸ピークを同定した。アミノ酸濃度を、ピーク下面積および標準液(Amino Acids Standard H、Thermo Scientific、PI-20088)を使用して作成した較正曲線を使用して推定した。
両培養における細胞プールは、指数関数的様式で増殖し、わずかにより良好な増殖が4x-対照-tfxn培養と比較して4x-tfxn細胞チロシンフリーフェドバッチ培養において観察された(図30A)。両培養は、培養の7日目と9日目との間で35E6細胞/mLのピーク細胞密度を達成した。両培養において、細胞生存能は、培養の12日目を通じて97%超であった(図30B)。両培養の力価プロファイルは、非常に同様であり、11日目の力価は2.5g/Lであった(図30C)。さらに、4x-tfxn細胞は、4x-対照-tfxn細胞より速い速度でフェニルアラニンを消費することが観察された(データを示さず)。チロシン蓄積が4x-tfxn培養で観察された(データを示さず)。これは、4x-tfxn細胞がフェニルアラニンをチロシンに変換してこの細胞の生理的必要性(バイオマスおよびタンパク質合成)のためにそれを供給することを示唆した。過剰のチロシンが培養液中に分泌された。4x-対照-tfxn培養液に、接種およびフィード培地で外因性チロシンを補充した。チロシンのレベルは、4x-対照-tfxn培養の過程にわたって低下し、これらの細胞によるチロシンの消費を示した(データを示さず)。さらに、チロシン代謝の副生物、3-(4-ヒドロキシフェニル)ラクテートのレベルは、4x-対照-tfxn培養と比較して4x-tfxn培養において著しく低く、フェニルアラニンおよび/またはチロシンの副生物合成に向けたチャネリングがより低いことを示した(図30D)。
CHO細胞の増殖に対する2-メチルブチレートおよびイソブチレートの効果のプローブ
目標:
2-メチルブチレートおよびイソブチレートは、イソロイシンおよびバリン経路の副生物であり、これらは、CHO細胞株AのHiPDOGフェドバッチ培養において蓄積することが観察された。7日目の蓄積のレベルは、2-メチルブチレートで約9mMであり、イソブチレートで2mMであった(データを示さず;CHO細胞株Cの蓄積は、同じ順序である(実施例21を参照))。本実験は、HiPDOGフェドバッチ培養において観察された濃度範囲内でCHO細胞株Aの増殖に対するこれらの2種の化合物の効果を個別にプローブするために設定した。
組換え抗体を産生するCHO細胞株Aを、6-ウェルプレート培養液中に3通りで様々な条件下で低細胞密度(0.1E6細胞/mL)で接種した。0日目の各ウェル作業容量は、4mLであった。試験した条件は、新鮮培地Aまたは様々な濃度で2-メチルブチレートもしくはイソブチレートを個別に補充した新鮮培地Aを含む。2-メチルブチレートについて試験した濃度は、[0、5、10、および20mM]であり、イソブチレートについて試験した濃度は、[0、1、2、および4mM]である。6-ウェルプレートを、36.5℃および5%二酸化炭素下にて振盪プラットフォームでインキュベートした。すべての条件下の細胞増殖を5日間モニターした。
図31は、CHO細胞株Aの増殖に対する2-メチルブチレートまたはイソブチレートの独立した効果を示す。新鮮培地中で培養した細胞は、非常によく増殖した。細胞増殖は、細胞をそれぞれ5mMまたは1mM超の濃度で2-メチルブチレート(図31A)またはイソブチレート(図31B)を補充した新鮮培地中で培養したとき抑制された。これは、2-メチルブチレートおよびイソブチレートが細胞増殖を阻害することを実証する。2-メチルブチレートは、イソロイシン代謝の代謝副生物であり、イソブチレートは、バリン代謝の代謝副生物である。
CHO細胞(CHO細胞株C)のフェドバッチ培養における、それぞれイソロイシンまたはバリンの制限による2-メチルブチレートまたはイソブチレートの蓄積の低減の実証。
目標
本実施例の主目標は、それぞれイソロイシンまたはバリンの供給を制限することによるCHO細胞のフェドバッチ培養における2-メチルブチレートまたはイソブチレートの蓄積の低減を実証することであった。
細胞およびバイオリアクターセットアップ
組換え抗体を発現するGS-CHO細胞株(細胞株C)を本実施例で使用した。2つの条件は、本実施例の一部として試験した:A)低レベルのイソロイシンおよびバリン(低AA)を有するフェドバッチ培養、B)通常のアミノ酸濃度を有するフェドバッチ培養(対照)。実験は、12日間実行した。
アミノ酸、イソロイシン、およびバリンの濃度は、低AA条件下で0.5mM~1mMの間で順調に維持された(図32Aおよび32C)。低AA条件下でアミノ酸レベルをこのように制限すると、2-メチルブチレート(図32B)およびイソブチレート(図32D)のより低い蓄積がもたらされた。
分岐鎖アミノ酸経路から産生されるインヒビター(イソバレレート、2-メチルブチレート、およびイソブチレート)の生合成を抑制するための代謝操作の遺伝子標的を判定する実験
目標
本実験は、CHO細胞のフェドバッチ培養において非常に高レベルに蓄積した分岐鎖アミノ酸代謝の副生物であるイソバレレート、2-メチルブチレート、およびイソブチレートの生合成の原因を判定するために実施した。分岐鎖アミノ酸経路(BCAA)中のすべての酵素の遺伝子発現をプローブした。BCAA異化作用経路における遺伝子発現分析に基づいて、イソバレレート、イソブチレート、および2-メチルブチレートの生合成を抑制するCHO細胞(CHO細胞株Bおよび親細胞株)の代謝操作の遺伝子標的を同定した。
RT qPCR分析をロイシン異化経路遺伝子について実施した。ロイシン経路中の遺伝子の対数発現値を図33Aに示す。ロイシン経路からの遺伝子発現データは、経路中のすべての酵素が同様のレベルで発現されたことを示す。イソロイシンおよびバリン経路中の酵素の遺伝子発現も、親細胞株内で相対的に高いことが観察された(データを示さず)。データは、イソバレレート、イソブチレート、および2-メチルブチレート生合成および分泌の高い速度を説明し得るBCAA経路中の明らかの標的の方向を指さなかった。しかし、イソバレレート、イソブチレート、または2-メチルブチレートノードの下流の酵素は、イソバレレート、イソブチレート、または2-メチルブチレートに向けたフラックスのチャネリングを説明することができる機能損失突然変異を宿し得る。BCAT1(またはBCAT2)およびBCKDHA/BCKDHB酵素は、3つすべての分岐鎖アミノ酸経路における最初の2つのステップを触媒するので、任意の上述した酵素の活性のノックダウンもしくはノックアウトまたは阻害を、イソバレレート、イソブチレート、および2-メチルブチレートの生合成を低減する目的で行った(図33B)。
BCAA経路インヒビター(イソバレレート、2-メチルブチレート、およびイソブチレート)生合成の産生量を抑制する一過性BCAT1ノックダウンCHO細胞プールの生成
目標
本実験は、それぞれの細胞培養においてイソバレレート、イソブチレート、および2-メチルブチレートの産生量を制限するために、CHO細胞株BおよびCHO親細胞株内のBCAT1遺伝子発現をノックダウンするように設定した。
miRNAノックダウンは、標的遺伝子配列(例えば、BCAT1)に相補的である低分子RNA配列(およそ20~25塩基)を発現させることによって働く。miRNAは、標的遺伝子のメッセンジャーRNA(mRNA)に結合し、二本鎖RNAの領域を形成する。この二本鎖RNAは、細胞による切断および分解を標的にされ、翻訳されるmRNA、およびしたがって産生されるタンパク質の正味の低下をもたらす。BCAT1のマイクロRNAノックダウンは、EmGFPを含むBLOCK-iT Inducible Pol II miR RNAi Expression Vector Kit(Invitrogen)を使用して実施した。5つのmiRNAオリゴヌクレオチド対(BCAT1の相補的トップおよびボトム鎖)を、Block-iT RNAiデザイナーと呼ばれるオンラインツール(https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/)を使用して設計し、DNAオリゴヌクレオチドは、Integrated DNA技術(www.idtdna.com)によって調製した。オリゴヌクレオチド対をアニールし、pcDNA(商標)6.2-GW/EmGFP-miRベクター中にライゲーションした。ベクター(これらのうちの5種)は、WyzerBiosciences(Cambridge、MA)が確認した配列であった。5種のmiRNAベクターまたはpcDNA(商標)6.2-GW/EmGFP-miR-negという名称の陰性対照ベクター(キットとともにInvitrogenにより提供された)を、GenePulser XCellエレクトロポレーター(BioRad)を使用してCHO親細胞株またはCHO細胞株B内にトランスフェクトし、2日間放置して回収した。2日後、細胞を、安定な細胞プールを生成させるために抗生物質(プラストサイジン、10μg/mL)による選択圧に付し(実施例24を参照)、またはトランスフェクト細胞(もしくは非トランスフェクト細胞)由来の細胞ライセートを、cOmplete、Mini、EDTA不含プロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche)を補充したM-PERタンパク質抽出試薬(Thermo Fisher)で調製した。試料を、Novex NuPageシステム(Thermo Fisher)を使用してウェスタンブロットによって分析した。システムは、ポリアクリルアミドゲル、試料ローディング緩衝液、試料還元剤、ゲルランニング緩衝液、タンパク質質量標準物質、ニトロセルロース膜、および化学発光検出試薬を提供する。ブロットは、ウサギポリクローナル抗BCAT1抗体(AbCam、カタログ番号ab110761)またはB-アクチン抗体(AbCam、カタログ番号ab8227)を用いてプローブした。ウェスタンブロットを、BioRad ChemiDocシステムを使用して画像化し、B-アクチンおよびBCAT1のレベルについて分析した。
miRNA seq1.1a:TGGGAGAAGCCTCACATTAAA
miRNA seq2.1a:TCTGCTGTGAGGACCACTTTG
miRNA seq3.1a:AGTGGGCACGATGAATCTGTT
miRNA seq4.1a:CACGATGAATCTGTTCCTCTA
miRNA seq5.1a:CTTGGGCAAACTGACTGATAT
図34は、一過性トランスフェクト細胞内のBCAT1およびB-アクチンタンパク質レベルのウェスタンブロットを示す。B-アクチンは、ハウスキーピング遺伝子(またはタンパク質)として含まれ、タンパク質発現の内部コンパレーターとして使用した。B-アクチンのレベルは、5つすべてのmiRNA(一過性)トランスフェクション、陰性miRNA対照トランスフェショントおよび非トランスフェクト細胞(CHO細胞株Bおよび親細胞株の両方について)にわたって同様であった。これは、すべての条件にわたるタンパク質ローディングさえ示した(図34Aおよび34C)。CHO親細胞株一過性トランスフェクションでは、より低いレベルのBCAT1タンパク質が、miRNA Seq 2.1a、miRNA Seq 3.1a、miRNA Seq 4.1a、およびmiRNA Seq 5.1aを使用したノックダウンの場合において観察された。親細胞株一過性トランスフェクションでは、より低いレベルのBCAT1タンパク質が、試験した5つすべてのノックダウン条件下で観察された。非トランスフェクト対照および陰性対照は、より強いバンディングパターンを示し、より高いレベルのBCAT1タンパク質を示した。
BCAA経路インヒビター(イソバレレート、2-メチルブチレート、およびイソブチレート)生合成の産生量を抑制する安定なBCAT1ノックダウンCHO細胞プールの生成
目標
本実験の主目標は、BCAT1のレベルが低減された安定なCHO細胞プールを開発することであった。目的は、これらの安定プールは、BCAA経路インヒビター代謝産物(イソバレレート、2-メチルブチレート、およびイソブチレート)を産生する能力が低減されており、その低減がより良好な増殖および産生性をもたらしたことをさらに実証することであった。
5つのBCAT1 miRNAノックダウンベクターをトランスフェクトした親およびCHO細胞株B細胞を、安定な細胞プールについて選択した。次いで安定なプールをBCAT1のタンパク質レベルについてプローブした。親細胞株のすべての安定なプールは、5種のmiRNAでのトランスフェクションから生成され、陰性miRN配列対照でのトランスフェクションから生成された安定なプールと比較したとき、様々な程度にBCAT1のタンパク質レベルを低減した(図35Aおよび35B)。これは、BCAT1がノックダウンされた安定な細胞プールの順調な生成を示した。BCAT1のタンパク質レベルがより低いプールを、フェドバッチ培養(HiPDOGストラテジーを使用した、または使用しない)におけるイソバレレート、2-メチルブチレート、およびイソブチレートを含むインヒビターの産生量について選択および試験した。より低いレベルのこれらの阻害性代謝産物を産生する培養物は、より高い細胞密度に増殖し、より高い力価を生じた。イソ酵素BCAT2の等価なノックダウンも実施して、イソバレレート、2-メチルブチレート、およびイソブチレートを含むインヒビターの産生の低減について試験するために、BCAT2産生量のレベルの低減を実証した。BCAT2は、BCAT1のイソ酵素形態であり、これは、BCAT1と触媒的および機能的に等価であり、図33Bに表したロイシン、イソロイシン、およびバリン経路中の同じ機能を遂行する。
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Claims (38)
- 細胞培養の方法であって、(i)細胞培養培地中に細胞を提供して細胞培養プロセスを開始するステップを含み、細胞は、細胞による増殖および/または産生性インヒビターの合成のレベルを低減するように改変されており、細胞がフェニルアラニン/チロシン経路における1つまたは複数の遺伝子の発現を改変するように改変され、改変された1つまたは複数の遺伝子が3-(4-ヒドロキシフェニル)ラクテート(HPLA)、4-ヒドロキシフェニルピルベート、フェニルラクテート(PLA)、フェニルピルベート、BH4(テトラヒドロビオプテリン)、BH4-4a(カルビノールアミン)、またはq-BH2の合成を触媒する酵素をコードする、方法。
- 改変された1つまたは複数の遺伝子が、Pah、PCBD1、QDPR、Mif、Got1、Got2、Nup62-il4i1、Hpd、Hgd、Gstz1、Fahから選択される、請求項1に記載の方法。
- 改変された1つまたは複数の遺伝子が、(i)PCBD1、(ii)Pah、(iii)QDPR、(iv)PCBD1およびQDPR、(v)PCBD1およびPah、(vi)PahおよびQDPR、(vii)PCBD1およびPah、およびQDPR、(viii)(i)~(vii)のいずれか、ならびにHpdおよび/またはHgdから選択される、請求項2に記載の方法。
- 1つまたは複数の遺伝子が、遺伝子発現を増大または低下させるように改変されている、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 1つまたは複数の遺伝子が、遺伝子発現を増大させるように改変されている、請求項4に記載の方法。
- (ii)3-(4-ヒドロキシフェニル)ラクテート、4-ヒドロキシフェニルピルベート、フェニルラクテート(PLA)、またはフェニルピルベートから選択される少なくとも1種の代謝産物を細胞培養培地中で濃度C1未満に維持することをさらに含み、C1が3mMである、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- C1が2mM、1mM、または0.5mMである、請求項6に記載の方法。
- ステップ(ii)が、前記少なくとも1種の代謝産物の濃度を測定するステップを含み、測定濃度が既定値より上であるとき、細胞培養培地中の前記少なくとも1種の代謝産物の前駆体の濃度が、細胞に提供される前駆体の量を低減することによって低下する、請求項6または7に記載の方法。
- 前記少なくとも1種の代謝産物の前記濃度が、NMR、HPLC、またはUPLCを使用して測定される、請求項8に記載の方法。
- (a)3-(4-ヒドロキシフェニル)ラクテート、4-ヒドロキシフェニルピルベート、および/またはフェニルラクテートの測定濃度が前記既定値より上であるとき、フェニルアラニンの濃度が細胞培養培地中で低下し、かつ/または
(b)3-(4-ヒドロキシフェニル)ラクテートおよび/もしくは4-ヒドロキシフェニルピルベートの測定濃度が、前記既定値より上であるとき、チロシンの濃度が細胞培養培地中で低下する、
請求項8または9に記載の方法。 - ステップ(ii)が、3-(4-ヒドロキシフェニル)ラクテート、4-ヒドロキシフェニルピルベート、およびフェニルラクテートのうちの2、または3種を、細胞培養培地中でC1未満に維持することを含む、請求項6から9のいずれか一項に記載の方法。
- (iii)フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、セリン、トレオニン、およびグリシンから選択される少なくとも1種のアミノ酸を、細胞培養培地中で濃度C2未満に維持するステップであって、C2が2mMである、ステップをさらに含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の細胞培養の方法。
- ステップiii)が、前記少なくとも1種のアミノ酸の濃度を測定するステップを含み、測定濃度が既定値より上であるとき、細胞培養培地中の前記少なくとも1種のアミノ酸の濃度が、細胞に提供されるアミノ酸の量を低減することによって低下する、請求項12に記載の方法。
- 前記既定値が、C2、もしくはC2の50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、もしくは95%であり、または2mM、1mM、もしくは0.5mM以下である、請求項13に記載の方法。
- フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、セリン、トレオニン、およびグリシンのそれぞれの濃度が、細胞培養培地中で2mM未満に維持される、請求項12から14のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞培養培地が、0.5mM、1mM、1.5mM、2mM、3mM、または5mMより上の濃度でプロリン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、およびアスパラギンのうちの1、2、3、4、5、6、または7種を含む、請求項6から15のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞培養培地がチロシンを含まない、またはチロシンを含まないHiPDOG培養もしくはプロセスが使用される、請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。
- 改変された1つまたは複数の遺伝子が、(i)PCBD1、(ii)Pah、(iii)QDPR、(iv)PCBD1およびQDPR、(v)PCBD1およびPah、(vi)PahおよびQDPR、(vii)PCBD1およびPah、ならびにQDPR、(viii)(i)~(vii)のいずれか、ならびにHpdおよび/またはHgdから選択される、請求項17に記載の方法。
- 細胞が、
(i)PCBD1遺伝子を含む発現可能核酸またはベクターコンストラクト、
(ii)Pah遺伝子を含む発現可能核酸またはベクターコンストラクト、
(iii)Pah遺伝子およびPCBD1遺伝子を含む発現可能核酸またはベクターコンストラクト、
(iv)PCBD1遺伝子もしくはPah遺伝子、またはPah遺伝子およびPCBD1遺伝子、ならびにさらにQDPR遺伝子を含む、発現可能核酸またはベクターコンストラクト、
(v)Hpd遺伝子および/またはHgd遺伝子をさらに含む(i)~(iv)の発現可能核酸またはベクターコンストラクト
を含む、請求項17または18に記載の方法。 - pHセンサーが、細胞培養液のpHをモニターするのに使用され、所定のpH値より上への上昇に応答して、グルコースが細胞培養液にフィードされる、請求項1から19のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞培養がフェドバッチ培養である、請求項1から20のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞培養法が、増殖期および産生期を含み、ステップ(ii)および/またはステップ(iii)が増殖期中に適用される、請求項1から21のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞による増殖および/または産生性インヒビターの合成のレベルを低減する1種または複数の改変遺伝子を含む細胞であって、改変された1種または複数の遺伝子がフェニルアラニン/チロシン経路における、3-(4-ヒドロキシフェニル)ラクテート(HPLA)、4-ヒドロキシフェニルピルベート、フェニルラクテート(PLA)、フェニルピルベート、BH4(テトラヒドロビオプテリン)、BH4-4a(カルビノールアミン)、またはq-BH2の合成を触媒する酵素をコードする、細胞。
- 改変により遺伝子発現が増大または低下するPah、PCBD1、QDPR、Mif、Got1、Got2、Nup62-il4i1、Hpd、Hgd、Gstz1およびFahから選択される1種または複数の改変遺伝子を含む、請求項23に記載の細胞。
- Hpd、Hgd、PCBD1、QDPR、およびPahから選択される1種または複数の改変遺伝子を含み、改変により、Hpd、Hgd、PCBD1、QDPR、およびPahの1つもしくは複数の遺伝子発現が増大し、かつ/または細胞による増殖および/または産生性インヒビターの合成のレベルが低減する、請求項23または24に記載の細胞。
- 1種または複数の改変遺伝子が、
(i)Pahであり、
(ii)PCBD1であり、
(iii)PCBD1および/もしくはQDPRであり、
(iv)HpdおよびHgdの1種もしくは複数であり、
(v)Pahおよび/もしくはPCBD1、ならびにHpdおよびHgdの1種もしくは複数であり、
(vi)PahおよびPCBD1、またはPah、PCBD1、およびQDPRであり、
(vii)Pah、PCBD1、Hpd、およびHgd、またはPah、PCBD1、Hpd、Hgd、およびQDPRである、
請求項23から25のいずれか一項に記載の細胞。 - 細胞が、
(i)PCBD1遺伝子を含む発現可能核酸またはベクターコンストラクト、
(ii)Pah遺伝子を含む発現可能核酸またはベクターコンストラクト、
(iii)Pah遺伝子およびPCBD1遺伝子を含む発現可能核酸またはベクターコンストラクト、
(iv)PCBD1遺伝子もしくはPah遺伝子、またはPah遺伝子およびPCBD1遺伝子、ならびにQDPR遺伝子を含む発現可能核酸またはベクターコンストラクト、または
(v)HPD遺伝子および/またはHGD遺伝子をさらに含む(i)~(iv)の発現可能核酸またはベクターコンストラクト
を含む、請求項23から26のいずれか一項に記載の細胞。 - 細胞がCHO細胞である、請求項1から22のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞がCHO細胞である、請求項23から27のいずれか一項に記載の細胞。
- 細胞が、組換えタンパク質または異種組換えタンパク質を発現する、請求項1から22および28のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞が、組換えタンパク質または異種組換えタンパク質を発現する、請求項23から27および29のいずれか一項に記載の細胞。
- 細胞によって産生される組換えタンパク質を得るステップおよび精製するステップをさらに含む、請求項30に記載の方法。
- 細胞増殖および/または産生性が、対照培養と比較して増大し、前記対照培養が、非改変細胞を含むことを除いて同一である、請求項1から22、28、30および32のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞増殖および/または産生性が、対照培養と比較して増大し、前記対照培養が、非改変細胞を含むことを除いて同一である、請求項23から27、29および31のいずれか一項に記載の細胞。
- 細胞増殖が、最大生存細胞密度によって判定され、対照培養と比較して少なくとも5%増大する、請求項33に記載の方法。
- 産生性が、発現される組換えタンパク質の力価によって判定され、対照培養と比較して少なくとも5%増大する、請求項33に記載の方法。
- 細胞培養の最大生存細胞密度が、1×106細胞/mL、5×106細胞/mL、1×107細胞/mL、5×107細胞/mL、1×108細胞/mL、または5×108細胞/mL超である、請求項1から22、28、30、32、33、35および36のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞培養の最大生存細胞密度が、1×10 6 細胞/mL、5×10 6 細胞/mL、1×10 7 細胞/mL、5×10 7 細胞/mL、1×10 8 細胞/mL、または5×10 8 細胞/mL超である、請求項23から27、29、31および34のいずれか一項に記載の細胞。
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