BR112016013443B1

BR112016013443B1 - Métodos para produzir de forma recombinante um produto de interesse, para produção de uma célula hospedeira eucariótica para produzir de forma recombinante um produto de interesse, e para analisar as células eucarióticas quanto à sua adequabilidade como células hospedeiras para expressão recombinante de um produto de interesse

Info

Publication number: BR112016013443B1
Application number: BR112016013443-5A
Authority: BR
Inventors: Thomas Jostock; Holger Laux; Anett RITTER
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 2013-12-20
Filing date: 2014-12-18
Publication date: 2022-11-29
Also published as: EP3604331A1; US20220298228A1; DK3083676T3; CA2934411A1; MX371025B; KR20160101981A; RU2016129285A; RU2720525C2; SG11201604215XA; US20170002059A1; CN106029692A; JP2017500868A; IL245854B; KR102288857B1; LT3083676T; MX2016008249A; BR112016013443A2; AU2014369175B2; US11203631B2; AU2014369175A1

Abstract

CÉLULAS HOSPEDEIRAS EUCARIÓTICAS, METODO DE SELEÇÃO, PRODUÇÃO, E ANÁLISE DAS MESMAS, E MÉTODO DE GERAÇÃO DE UM PRODUTO DE INTERESSE. A presente invenção refere-se a célula eucariótica adequada para produção recombinante de um produto de interesse, onde o efeito do produto de expressão de um gene endógeno C12orf35 é prejudicado na dita célula, desta maneira aumentando sua produtividade quando recombinantemente expressando um polipeptídeo de interesse. Ainda, a presente invenção provê tecnologias associadas onde tais células hospedeiro são usadas em tecnologias de produção recombinante.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção se refere ao campo de tecnologias de expressão recombinante. Ela provê inter alia células eucarióticas alteradas que são capazes de produção aumentada de um produto de interesse bem como seu uso em métodos de expressão recombinante. Ainda, são providas ferramentas que permitem no início do processo de seleção a identificação de células eucarióticas que expressam um produto recombinante com alto rendimento e estabilidade aperfeiçoada com base no perfil de expressão da célula eucariótica. A célula eucariótica é preferivelmente uma célula de mamífero.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] O mercado para biofarmacêuticos continua a crescer em uma taxa alta uma vez que os biofarmacêuticos se tornam mais e mais importantes para a medicina de hoje. Atualmente, um número grande de biofarmacêuticos é produzido em células eucarióticas tal como em particular células de mamífero. Produção bem sucedida e de alto rendimento de biofarmacêuticos em células de mamífero é então crucial. O tempo para gerar tal linhagem de célula produzindo uma proteína terapêutica de interesse é uma parte essencial do tempo necessário para trazer qualquer biofarmacêuticos para a clínica. Ainda, também considerando os custos de produção para biofarmacêuticos é importante ter linhagens de célula eucariótica de expressão alta e estável, em particular linhagens de célula de mamífero.

[003] Para eficiência de produção de biofarmacêuticos em particular em escala industrial, um grande empenho está sendo posto no processo de seleção de clone, com o objetivo de identificar clones de produção alta com boas características de estabilidade e crescimento em uma pequena quantidade de tempo. A geração de clones de célula recombinante para produção de proteínas terapêuticas geralmente compreende avaliação excessiva de clones individuais para detectar e isolar clones de expressão alta. No entanto, mesmo se clones de expressão alta forem identificados no curso do processo de avaliação, estes clones inicialmente de expressão alta frequentemente perdem suas características de expressão vantajosas e o rendimento de expressão diminui com o tempo. Esta perda gradual de expressão de proteína recombinante em clones de célula durante subcultura prolongada é uma questão comum com muitas linhagens de célula tais como as linhagens de célula CHO e é referida como instabilidade. Esta instabilidade afeta seriamente o processo de produção industrial de polipeptídeos recombinantemente produzidos. Desta maneira, deve-se ter cuidado a fim de identificar dentro da população de células de expressão bem sucedida e até mesmo dentre clones de célula que expressam a proteína de interesse incialmente com um bom rendimento aquelas células, respectivamente clones de célula, que também têm uma estabilidade de produção alta durante cultivo prolongado e, então, não propensas a uma perda gradual de expressão de proteína recombinante. Tais clones são também chamados clones "estáveis". Durante períodos de cultura prolongados, clones estáveis não devem perder mais do que 30%, preferivelmente 25%, de sua produtividade inicial dentro de um período de 8-12 semanas. Produtividade é definida como produtividade volumétrica, que é a quantidade expressa de proteína por volume (por exemplo, g/L) em um certo ponto de tempo de cultivo, respectivamente como produtividade específica de célula, que é a quantidade específica de proteína expressa por célula por dia (por exemplo, pg/célula/dia). A fim de evitar que um clone de célula seja selecionado para produção em grande escala subsequente que é propenso à instabilidade e então perderá título durante cultura prolongada, geralmente análises de estabilidade extensivas são realizadas por várias semanas até vários meses a fim de eliminar aqueles clones de célula que se tornam instáveis durante este período de tempo e identificar os clones estáveis. Desta maneira, a geração de clones de célula recombinante para produção de proteínas terapêuticas e outros polipeptídeos recombinantes que são produzidos em grande escala geralmente compreende avaliação excessiva e demorada de clones individuais a fim de identificar os clones de célula de expressão alta que também mostram a estabilidade de expressão necessária para produção em grande escala. Esta prática prolonga o desenvolvimento de biotecnológicos tais como processos de produção de biofarmacêuticos. Mesmo quando usando sistemas de seleção altamente adstringentes que favorecem a sobrevivência de células de expressão alta sob as condições de seleção usadas, encontrar um clone de produção adequado dentro da população sobrevivente que combine uma taxa de expressão alta com características de crescimento e estabilidade boas é difícil.

[004] É um objetivo da invenção aperfeiçoar produção recombinante de um produto de interesse em células eucarióticas tal como em particular células de mamífero. Em particular, é um objetivo da presente invenção prover uma linhagem de célula eucariótica que, quando da transfecção com um polinucleotídeo codificando um produto de interesse, expressa o produto de interesse com rendimento aperfeiçoado. Ainda, é um objetivo prover um método de seleção que permita identificação de células transfectadas com sucesso com características de expressão aperfeiçoadas. Ainda, é um objetivo prover um método aperfeiçoado para produzir recombinantemente um produto de interesse. Ainda, é um objetivo prover ferramentas de análise que permitam discriminação entre clones de célula recombinante de produção alta e baixa e/ou entre clones de célula estáveis e não estáveis em um estágio inicial do processo de desenvolvimento.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[005] A presente invenção é inter alia baseada na inesperada constatação que prejuízo do efeito do produto de expressão de gene C12orf 35 em uma célula eucariótica, por exemplo, através da redução ou eliminação da expressão funcional de gene C12orf35 na dita célula, permite significantemente aumentar a expressão de um produto recombinante de interesse na dita célula. Desta maneira, um gene- chave foi identificado, o qual influencia expressão recombinante. Prejuízo do efeito do produto de expressão de gene C12orf35 nas células conforme descrito aqui permite aperfeiçoar significantemente a produção recombinante de um produto de interesse através do aumento do rendimento de expressão. Desta maneira, a presente invenção faz uma contribuição importante para a técnica anterior.

[006] De acordo com um primeiro aspecto, a presente invenção provê uma célula eucariótica isolada, onde o efeito do produto de expressão de gene C12orf35 é prejudicado na dita célula. Prejuízo pode ser obtido, por exemplo, através da redução ou eliminação de expressão funcional de gene endógeno C12orf35 na dita célula, por exemplo, através de silenciamento de gene, deleção de gene ou através da mutação do gene de maneira que uma proteína não- ou menos funcional é expressa. Como é mostrado pelos exemplos, quando da transfecção transiente ou estável células eucarióticas respectivamente alteradas são surpreendentemente capazes de produzir um produto recombinante de interesse com rendimento maior.Desta maneira, estas células eucarióticas são particularmente adequadas como células hospedeiro para tecnologias de produção recombinante e podem ser usadas para produção recombinante de um produto de interesse.

[007] De acordo com um segundo aspecto, é provido um método para seleção de uma célula hospedeiro que expressa recombinantemente um produto de interesse, compreendendo

[008] (a) provisão de células eucarióticas de acordo com um primeiro aspecto como células hospedeiro, onde as ditas células hospedeiro compreendem pelo menos um polinucleotídeo heterólogo codificando o produto de interesse; e

[009] (b) seleção de uma ou mais células hospedeiro expressando o produto de interesse.

[0010] De acordo com um terceiro aspecto, é provido um método para produzir recombinantemente um produto de interesse, compreendendo uso de uma célula eucariótica de acordo com o primeiro aspecto como célula hospedeiro para expressão recombinante do produto de interesse. Como descrito acima, devido à sua capacidade de produção aumentada, estas células eucarióticas são particularmente adequadas como células hospedeiro para produção recombinante.

[0011] De acordo com um quarto aspecto, é provido um método para produção de uma célula eucariótica adequada para produção recombinante de um produto de interesse, compreendendo prejuízo do efeito do produto de expressão de um gene endógeno C12orf35 na célula eucariótica. Isto pode ser conseguido, por exemplo, através da redução ou eliminação de expressão funcional de gene C12orf35 na dita célula.

[0012] De acordo com um quinto aspecto, é provido um método para análise de células eucarióticas quanto à sua adequabilidade como células hospedeiro para expressão recombinante de um produto de interesse, compreendendo analisar diretamente ou indiretamente se o efeito do produto de expressão de gene C12orf35 é prejudicado nas ditas células. Este método pode ser vantajosamente usado, por exemplo, em combinação com o método de acordo com o quarto aspecto a fim de identificar, por exemplo, se uma célula eucariótica foi obtida, onde o efeito do produto de expressão de gene C12orf35 é prejudicado. Ainda, este método pode ser usado como ferramenta analítica a fim de discriminar entre clones de expressão alta e baixa e em modalidades entre clones estáveis e instáveis que expressam o produto de interesse.

[0013] De acordo com um sexto aspecto, a presente invenção se refere ao uso de uma célula eucariótica isolada para expressar recombinantemente um produto de interesse, onde o efeito do produto de expressão de gene C12orf35 é prejudicado na dita célula.

[0014] Outros objetivos, características, vantagens e aspectos do presente pedido se tornarão aparentes àqueles versados na técnica a partir da descrição que segue e reivindicações apensas. Deve ser compreendido, no entanto, que a descrição que segue, reivindicações apensas e exemplos específicos, embora indicando modalidades preferidas do pedido, são dados a título de ilustração apenas. Várias mudanças e modificações dentro do espírito e escopo da presente invenção se tornarão aparentes àqueles versados na técnica a partir da leitura do que segue.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0015] A Figura 1 provê uma visão geral esquemática da região telomérica de cromossomo 8 de células de ovário de hamster Chinês (CHO) e genes localizados na dita região telomérica. A região genômica mostrada na Figura é o resultado de bases fundidas números 6 e 25 no cromossomo 8. Uma visão geral de genes e genes putativos no cromossomo 8 de células CHO pode ser encontrada usando o arquivo de anotação de banco de gene associado com a montagem de Brinkrolf e outros (Nature Biotechnology Volume 31, 694-695 (2013); vide banco de gene: APMK00000000, versão APMK01000000 como é descrito na dita publicação). Ainda, o Beijing Genomics Institute também proveu uma anotação desta região (Xu e outros, Nature Biotechnology, Volume 29, número 8, 735-741 (2011); vide banco de gene: AFTD00000000, versão AFTD01000000). Anotações que são marcadas com um * na Figura 1 são do arquivo de banco de gene AFTD01000000.

[0016] Uma visão geral correspondente da região telomérica de cromossomo 6 de camundongo pode ser encontrada, por exemplo, no banco de dados Ensembl. O cromossomo 6 de camundongo tem uma estrutura que corresponde ao cromossomo 8 de hamster Chinês. A ligação subsequente do banco de dados Ensemble mostra a região telomérica de cromossomo 6 de camundongo que contém o gene C12orf35 (aqui chamado 2810474O19Rik):http://www.ensembl.org/Mus_musculus/Location/View?db=core;g=ENS MUSG00000032712;r=6:149309414-149335658

[0017] A Tabela 1 subsequente provê uma visão geral de abreviações e nomes alternativos (aliases) de genes e produtos codificados mostrados na Figura 1 e indica a anotação correspondente em camundongo e hamster Chinês (de acordo com Brinkrolf e outros, 2013 e/ou Xu e outros, 2011) onde possível. A Tabela 1 também lista nomes alternativos usados, por exemplo, em espécies diferentes. Onde a presente invenção se refere a um nome de proteína ou gene específico, este também se refere a e compreende quaisquer nomes alternativos da dita proteína ou gene, por exemplo, usados para caracterizar o gene ou proteína correspondente em uma espécie diferente. Em particular, homólogos e ortólogos tendo a mesma função são compreendidos então.Tabela 1: Abreviações e nomes alternativos (aliases) de produtos codificados por genes localizados no cromossomo 8 de hamster Chinês ou cromossomo 6 de camundongo

[0018] A Figura 2 mostra os níveis de expressão relativos de genes localizados na região telomérica de cromossomo 8 em uma linhagem de célula CHO, a saber TMTC1 (1), RPS4Y2 (2), IPO8 (3), CAPRIN2 (4), FAM60A (5), Dennd5b (6), METTL 20 (7), AMN1 (8), C12orf35 (9), Bicd1 (10).

[0019] As Figuras 3A a L mostram perfis de FACS obtidos após redução da expressão de genes alvo diferentes localizados na região telomérica de cromossomo 8 de células de hamster Chinês (CHO) usando siRNAs. As células que foram estavelmente transfectadas com um vetor de expressão e expressaram o anticorpo codificado como produto de interesse foram fluorescentemente tingidas para detectar a quantidade de anticorpo recombinantemente expresso. Quanto maior a intensidade no perfil de FACS, mais o anticorpo é expresso pela célula tingida. O pico da esquerda mostrado no perfil de FACS corresponde à linhagem de célula parental (não transfectada e então não expressando o anticorpo) que foi incluída para propósitos comparativos. As duas outras curvas representam resultados obtidos para um clone de célula que foi estavelmente transfectado com o vetor de expressão e que expressa recombinantemente o anticorpo. Este clone de célula foi transfectado ou com um controle negativo de siRNA (curva escura; nenhum efeito sobre a expressão de nenhum gene) ou com um siRNA que reduz a expressão de um gene alvo (curva cinza claro). Se silenciamento do gene alvo não tiver um efeito sobre expressão recombinante de anticorpo, as curvas fluorescentes para o siRNA controle e o siRNA alvo se sobrepõem e permanecem iguais. Se silenciamento do gene alvo aumentar a taxa de expressão do anticorpo recombinantemente expresso, a intensidade do perfil de FACS correspondente aumenta e muda para a direita: A: gene Mettl20_1, 125 pmol, 24,9%; B: gene C12orf35_1, 125 pmol, 30,6%; C: gene C12orf35_2, 150 pmol, 31,7%; D: gene Caprin2_6, 100 pmol, 53,3%; E: FAM60A_3, 150 pmol, 48%; F: Ipo8_1, 125 pmol, 20,3%; G: Ipo8_2, 150 pmol, 57,5%; H: Ipo8_3, 150 pmol, 21,5%; I: Dennd5b_2, 100 pmol, 36,9%; J: Amn1_4, 125 pmol, 30,8%; K: TMTC1_1, 150 pmol, 60,6%; L: TMTC1_2, 150 pmol, 53,4% (valores de porcentagem correspondem à expressão de mRNA do gene alvo entre siRNA de referência versus siRNA ctrl). As Figuras 3B e C mostram que a sub- regulagem do gene C12orf35 aumenta significantemente a expressão do anticorpo recombinante e então resulta em uma produtividade maior como é indicado pela mudança clara do perfil de FACS para a direita (vide curva cinza claro à direta, também marcada com uma seta).

[0020] As Figuras 4 e 5 mostram os níveis de expressão de mRNA das cadeias leve e pesada de anticorpo de dois polipeptídeos de interesse de modelo diferentes (anticorpos 1 e 2) em clones e grupos diferentes em cada caso após redução da expressão do gene C12orf35 em células CHO por RNAi. Os níveis de mRNA das cadeias de anticorpo são suprarregulados, se expressão do gene C12orf35 for reduzida pelo silenciamento de gene. Desta maneira, redução da expressão de C12orf35 leva surpreendentemente a níveis de mRNA mais altos de HC e LC.

[0021] A Figura 6 mostra que quando do silenciamento de gene C12orf35 usando siRNA, títulos volumétricos significantemente maiores foram obtidos.

[0022] A Figura 7 também demonstra que silenciamento do gene C12orf35 leva a produtividades específicas maiores (calculadas a partir dos dias 3, 4, 5 e 5 de cultivo). siRNA-1 teve um efeito de silenciamento mais pronunciado do que siRNA-2 e desta maneira levou a taxas de expressão mais altas.

[0023] A Figura 8 mostra que os 46 clones de produção mais alta (pretos) derivados de uma linhagem de célula CHO onde a região telomérica compreendendo o gene C12orf35 no cromossomo 8 (braço q) é deletada (C8DEL) têm títulos maiores comparado com os 45 clones de produção mais alta obtidos da linhagem de célula parental que foram testadas ser positivas para IPO8 (cinza).

[0024] A Figura 9 mostra perfis de FACS de grupos de célula C8DEL estavelmente transfectadas após seleção usando um sistema de receptor de folato/DHFR. A concentração de MTX foi aumentada de A para E (A: nenhum MTX; B: MTX 1nM; C: MTX 5 nM; D: MTX 10 nM; E: MTX 50 nM). Expressão de anticorpo recombinante foi detectada com base em fluorescência. Em MTX 50 nM, células de produção predominantemente alta foram compreendidas no grupo obtido como é demonstrado através de análise FACS. O perfil de grupo obtido lembrava notadamente de um clone de célula. Isto apoia o impacto extraordinário que tecnologia descrita aqui tem sobre o rendimento de expressão.

[0025] A Figura 10 mostra os resultados de testes de estabilidade realizados por 7/8 semanas com três clones de célula diferentes (tipo selvagem CHO e dois clones de inativação de FAM60A s16 e s23 derivados do dito tipo selvagem) seguindo transfecção estável com um vetor de expressão codificando um anticorpo como produto de interesse. (1) mostra os resultados de estabilidade obtidos com as células do tipo selvagem parentais (derivadas de CHO-K1); (2) mostra os resultados de estabilidade com o clone inativado em FAM60A s16; (3) mostra os resultados de estabilidade com o clone inativado em FAM60A s23. Como pode ser visto, a estabilidade de expressão foi significantemente aumentada nos clones de célula que derivaram das células inativadas em FAM60A (vide (2) e (3)). O número de clones estáveis foi significantemente aumentado quando usando as células inativadas em FAM60A para expressão recombinante. Desta maneira, prejuízo do efeito de FAM60 na célula hospedeiro, aqui por inativação de gene, aperfeiçoou significantemente a estabilidade de expressão. Desta maneira, de acordo com uma modalidade, o efeito da proteína FAM60A é ainda prejudicado na célula eucariótica, preferivelmente através da redução ou eliminação de expressão funcional, para aumentar a estabilidade de expressão quando da transfecção estável.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0026] A presente invenção é inter alia baseada na surpreendente constatação que células eucarióticas, onde o efeito do produto de expressão de gene C12orf35 é prejudicado, por exemplo, através da redução ou eliminação da expressão funcional do gene endógeno C12orf35, através da deleção do dito gene ou através da introdução de mutações, são capazes de expressar um produto recombinante de interesse com rendimento significantemente aperfeiçoado. Com base nesta surpreendente constatação que o gene C12orf35 tem um impacto forte sobre a expressão de um produto recombinante de interesse, a presente invenção também provê novos métodos de seleção e produção e tecnologias associadas que permitem produção recombinante aperfeiçoada de um produto de interesse. Desta maneira, a presente invenção faz uma importante contribuição para a técnica anterior.

[0027] Os aspectos individuais e modalidades adequadas e preferidas dos mesmos serão agora descritos em detalhes.

A. Células eucarióticas modificadas

[0028] De acordo com um primeiro aspecto, a presente invenção provê uma célula eucariótica isolada, onde o efeito do produto de expressão de gene C12orf35 é prejudicado na dita célula. Como é mostrado pelos exemplos para células de mamífero, células eucarióticas respectivamente modificadas mostram uma produtividade significantemente maior seguindo transfecção estável bem como seguindo transiente com um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo codificando um produto de interesse como é demonstrado pelos exemplos. Ainda, a abundância de células de expressão alta na população de células transfectadas é aperfeiçoada quando usando células eucarióticas respectivamente alteradas. Em modalidades, foi constatado também que estabilidade de clone é aperfeiçoada. A estabilidade de expressão aperfeiçoada permite encurtar ou até mesmo pular estudos de estabilidade demorados de clones de célula de expressão alta. Vantagens adicionais também são descritas abaixo e são também aparentes a partir dos exemplos. Desta maneira, uso destas linhagens de célula eucariótica vantajosas para produção recombinante de um produto de interesse reduz esforços de avaliação para identificação de células ou clones de célula de expressão alta e em particular reduz o tempo necessário para obtenção de clones de célula de expressão alta adequados para produção do produto de interesse em larga escala. Desta maneira, estas linhagens de célula eucariótica têm vantagens importantes quando sendo usadas como células hospedeiro para tecnologias de produção recombinante.

[0029] O gene C12orf35 é endogenamente expresso em células eucarióticas tais como, por exemplo, espécies de mamífero tais como humano, camundongo e hamster. O produto de expressão do gene C12orf35 é uma proteína bem grande. A listagem de sequência mostra sequências de aminoácido exemplares ou sequências de aminoácido putativas da proteína codificada pelo gene C12orf35 endógeno de espécies de mamífero diferentes tais como hamster (SEQ ID NO: 1 e 2), humano (SEQ ID NO: 3 e 4), camundongo (SEQ ID NO: 5), gado (SEQ ID NO: 6) e javali selvagem (SEQ ID NO: 7). As CDS (Sequência de Codificação de DNA) de C12orf35 de hamster Chinês são mostradas como SEQ ID NO: 8. Ainda, uma seção da 5’UTR (vide SEQ ID NO: 9) e da 3’UTR (vide SEQ ID NO: 10) do mRNA de C12orf35 de hamster Chinês foi sequenciada. O gene C12orf35 é também referido como tipo C12orf35 ou homólogo de C12orf35 em hamster ou 2810474O19Rik em camundongo. Informação sobre o gene, a sequência de codificação e a proteína C12orf35 prevista é também revelada para Cricetulus griseus no NCBI: XM_003512865, aqui incorporado a título de referência. Em humano, ele é também referido como KIAA1551. Nomes diferentes podem ser dados em espécies diferentes para a proteína ou o gene e nomes alternativos não limitantes (aliases) são também listados acima na Tabela 1. O termo "gene C12orf35" conforme aqui usado também compreende quaisquer homólogos e ortólogos de C12orf35 que têm a mesma função que C12orf35. Desta maneira, o termo "gene C12orf35" conforme aqui usado compreende em particular qualquer gene endógeno que codifica uma proteína que compartilha pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de homologia ou identidade com uma ou mais das sequências de aminoácido mostradas em SEQ ID NO: 1 a 7 ou a proteína codificada pela SEQ ID NO: 8. A proteína codificada por tal gene tem preferivelmente a mesma função que a proteína tendo uma sequência de aminoácido como é mostrado na SEQ ID NO: 1 ou uma ou mais de SEQ ID NO: 2 a 7 ou a proteína codificada por SEQ ID NO: 8. O dito gene pode ser modificado como descrito aqui a fim de prejudicar a função do produto de expressão que é expresso pela célula não modificada. A proteína expressa pelo gene C12orf35 não foi descrita em detalhes na literatura. Os termos "proteína C12orf35" ou "produto de expressão de gene C12orf35 endógeno" e expressões similares conforme aqui usado compreendem homólogos e ortólogos de C12orf35 e compreendem em particular qualquer proteína que compartilhe pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de homologia ou identidade com uma ou mais das sequências de aminoácido mostradas na SEQ ID NO: 1 a 7 ou a proteína codificada por SEQ ID NO: 8. Tal proteína C12orf35 tem preferivelmente a mesma função que a proteína tendo uma sequência de aminoácido como é mostrado na SEQ IDNO: 1 ou como é mostrado em uma ou mais de SEQ ID NO: 2 a 7 ou a proteína codificada por SEQ ID NO: 8. Homologia, respectivamente identidade podem ser calculadas no comprimento total da proteína de referência.

[0030] A presente invenção inter alia se refere a células eucarióticas modificadas, tais como preferivelmente células de mamífero, onde o efeito do produto de expressão do gene C12orf35, que geralmente é endogenamente expresso por uma célula eucariótica não modificada correspondente, é prejudicado na dita célula. Como é demonstrado pelos exemplos, esta modificação da célula que pode ser transiente ou permanente permite aumentar a expressão de um produto recombinante de interesse.

[0031] Há várias possibilidades para modificar uma célula eucariótica para prejudicar o efeito do produto de expressão de gene C12orf35 na dita célula. O efeito do produto de expressão do gene C12orf35 e desta maneira da proteína C12orf35 pode ser prejudicado, por exemplo, no nível de gene ou no nível de proteína. O efeito de C12orf35 pode ser prejudicado, por exemplo, através da modificação da estrutura/sequência da proteína C12orf35, a transcrição e/ou tradução. Opções não limitantes são descritas abaixo.

[0032] De acordo com uma modalidade, o efeito do produto de expressão de gene C12orf35 é prejudicado na célula eucariótica porque expressão funcional de gene C12orf35 é reduzida ou eliminada na dita célula. Como é mostrado pelos exemplos, alteração da expressão de gene C12orf35, por exemplo, através de silenciamento de gene ou através de deleção do dito gene, é uma medição muito eficiente para prover células eucarióticas capazes de expressar um produto recombinante de interesse com alto rendimento. Quando o nível de expressão de gene C12orf35 é reduzido ou eliminado em uma célula eucariótica e então menos ou nenhuma proteína C12orf35 funcional é produzida pela respectiva célula alterada, o rendimento de expressão de um produto recombinante de interesse é significantemente aumentado. Esta correlação entre expressão de C12orf35 funcional e rendimento de expressão de proteína recombinante é uma constatação inesperada.

[0033] Redução ou eliminação de expressão funcional de gene C12orf35 pode ser obtida através de vários meios. Expressão funcional pode ser reduzida, por exemplo, reduzindo o nível de expressão de gene C12orf35 ou rompendo o funcionamento de C12orf35 ou através de uma combinação de tais metodologias. De acordo com uma modalidade, a célula é alterada de maneira que expressão funcional de gene C12orf35 é reduzida ou eliminada por inativação de gene, mutação de gene, deleção de gene, silenciamento de gene ou uma combinação de qualquer um dos acima. De acordo com uma modalidade, expressão funcional de gene C12orf35 é reduzida ou eliminada na célula por inativação de gene. Uma inativação de gene é uma técnica genética através da qual um gene é tornado inoperante através da interrupção de seu funcionamento. Por exemplo, um ácido nucleico pode ser inserido na sequência de codificação, desta maneira interrompendo o funcionamento do gene. Ainda, o gene C12orf35 completo ou uma porção do mesmo pode ser deletado, de maneira que nenhuma ou nenhuma proteína funcional é expressa pela respectiva célula alterada. Uma outra opção é introduzir uma ou mais mutações de inativação na sequência de codificação, que fornece um produto de expressão não ou menos funcional. Por exemplo, uma ou mais mutações de mudança de estrutura podem ser introduzidas, as quais resultam em uma proteína não ou menos funcional. Alternativamente ou adicionalmente, um ou mais códons de parada podem ser introduzidos na sequência de codificação de maneira que uma proteína não ou menos funcional, truncada, é obtida. Desta maneira, de acordo com uma modalidade, o gene C12orf35 compreende uma ou mais mutações que proveem um produto de expressão não ou menos funcional. Outras opções incluem, mas não estão limitadas a, uma ou mais mutações no promotor, na UTR 5’ e/ou 3’ ou outros elementos reguladores. De acordo com uma modalidade, a função de promotor do gene C12orf35 é interrompida, por exemplo, através da introdução de uma deleção de promotor ou através da introdução de um construto entre o promotor e o início de transcrição. Métodos para obter uma inativação de gene para suprimir ou eliminar expressão do gene alvo são também bem conhecidos do versado e, então, não necessitam nenhuma descrição detalhada aqui. Alguns exemplos não limitantes são, não obstante, descritos aqui.

[0034] De acordo com uma modalidade, o gene C12orf35 é funcionalmente inativado através de engenharia genética. Exemplos incluem, mas não estão limitados a, edição de gene, tal como edição de genoma com nucleases engenheiradas (GEEN). Este é um tipo de engenharia genética onde DNA é inserido, substituído ou removido de um genoma usando nucleases artificialmente engenheiradas ou "tesouras moleculares". As nucleases criam interrupções de filamento duplo específicas (DSBs) nos locais desejados no genoma, e fazem uso dos mecanismos endógenos da célula para reparar a ruptura induzida por processos naturais da recombinação homóloga (HR) e união de extremidade não homóloga (NHEJ). Há pelo menos quatro famílias de nucleases engenheiradas que podem ser usadas: nucleases dedo-de-zinco (ZFNs), Nucleases Efetoras Tipo Ativador de Transcrição (TALENs), CRISPR e endonucleases homing reengenheiradas por meganuclease engenheirada.

[0035] De acordo com uma modalidade, uma ou mais cópias de gene C12orf35 presentes no genoma da célula eucariótica são alteradas, por exemplo, inativadas ou deletadas, para reduzir ou eliminar e então prejudicar o efeito do produto de expressão de gene C12orf35 na célula eucariótica. Desta maneira, de acordo com uma modalidade, pelo menos uma cópia de gene C12orf35 é deletada ou funcionalmente inativada no genoma da célula eucariótica. Por exemplo, uma ou mais mutações podem ser inseridas na cópia ou cópias do gene C12orf35 (se mais de uma cópia estiver presente) para prover um produto de expressão não ou menos funcional ou eliminar ou reduzir expressão em toto e, desta maneira, prejudicar o efeito de C12orf35 na célula de mamífero. Desta maneira, o gene C12orf35 é basicamente inativado no genoma. De acordo com uma modalidade, no caso de mais de uma cópia estar presente, todas as cópias de gene C12orf35 são respectivamente alteradas na célula eucariótica, que é preferivelmente uma célula de mamífero.

[0036] De acordo com uma modalidade, a célula eucariótica é uma célula de metazoário, uma célula de vertebrado ou preferivelmente uma célula de mamífero. De acordo com uma modalidade, uma porção de um cromossomo é deletada na dita célula, onde a porção deletada compreende gene C12orf35. De acordo com uma modalidade, uma porção cromossomal compreendendo gene C12orf35 é deletada em todos os cromossomos que compreendem uma cópia de gene C12orf35. Desta maneira, todas as cópias de gene C12orf35 são deletadas do genoma.

[0037] De acordo com uma modalidade, uma porção da região telomérica de um cromossomo é deletada, onde a porção deletada compreende gene C12orf35. De acordo com uma modalidade preferida, a célula alterada é uma célula de roedor. De acordo com uma modalidade, a célula é uma célula de hamster tal como, por exemplo, célula CHO e pelo menos uma porção da região telomérica de cromossomo 8 é deletada no genoma, onde a dita porção deletada compreende gene C12orf35. O significado do termo "C12orf35" é explicado acima e nomes alternativos não limitantes de homólogos e ortólogos que são também compreendidos pelo escopo do dito termo são também indicados na Tabela 1. De acordo com uma modalidade, tal deleção ocorre no braço q do cromossomo 8 de uma célula de hamster, em particular uma célula de hamster Chinês, que compreende o gene FAM60A. Como é mostrado pelos exemplos, uma célula CHO compreendendo uma respectiva deleção na região telomérica do cromossomo 8 é particularmente adequada como célula hospedeiro para expressão recombinante. Após transfecção estável e transiente com um vetor de expressão, estas células mostram uma produtividade significantemente maior comparado com células onde a dita porção na região telomérica de cromossomo 8 não é perdida. Ainda, a abundância e então a quantidade, respectivamente proporção de células de expressão alta na população de célula transfectada é significantemente aumentada. No caso de transfecção estável, a estabilidade de expressão recombinante é significantemente aumentada, por exemplo, em tais células de hamster que perderam a dita porção da região telomérica no cromossomo 8. Vantagens importantes adicionais são descritas em detalhes nos exemplos onde células CHO onde uma porção respectiva da região telomérica do cromossomo 8 é deletada devido à ruptura do cromossomo são caracterizadas. As propriedades vantajosas tornam essas células de hamster particularmente adequadas como linhagens de célula de produção industrial. Alternativamente, a célula de roedor alterada pode ser uma célula de camundongo onde pelo menos uma porção da região telomérica do cromossomo 6 é deletada no genoma, onde a dita porção deletada compreende gene C12orf35. A região telomérica do cromossomo 6 é muito similar à região telomérica do cromossomo 8 de hamster.

[0038] De acordo com uma modalidade, pelo menos uma porção da região telomérica é deletada ou não está presente em ambos os cromossomos do par de cromossomo 8 de hamster (ou par de cromossomo 6 no caso de células de camundongo), onde a porção deletada compreende o gene C12orf35.

[0039] De acordo com uma modalidade, pelo menos uma porção da região telomérica é deletada em um cromossomo do par de cromossomo 8 de hamster (ou par de cromossomo 6 no caso de camundongo), onde a dita porção deletada compreende o gene C12orf35 e a expressão do gene C12orf35 no outro cromossomo é reduzida ou eliminada. Meios adequados para reduzir ou eliminar a expressão de um gene são conhecidos do versado na técnica e exemplos não limitantes são também descritos aqui. De acordo com uma modalidade, tal deleção ocorre no braço q do cromossomo 8 de hamster, em particular hamster Chinês.

[0040] De acordo com uma modalidade, a região cromossomal deletada compreende o gene C12orf35 e adicionalmente um ou mais ou todos os genes selecionados do grupo consistindo em Bicd1, Amn1, proteína 20 tipo metiltransferase, Dennd5b, FAM60A, Caprin2 e Ipo8. De acordo com uma modalidade, todos os genes mencionados acima são deletados. De acordo com uma modalidade a região cromossomal deletada compreende ainda pelo menos uma porção do ou o gene inteiro Tmtc1. Em células de hamster tais como células CHO, estes genes estão também localizados na região telomérica do cromossomo 8. De acordo com uma modalidade, a região cromossomal deletada compreende ainda gene RPS4Y2 se presente. Uma visão geral da região telomérica do cromossomo 8 do genoma de hamster Chinês onde a localização dos genes mencionados acima é mostrada é provida como Figura 1. Como é mostrado pelos exemplos, células CHO compreendendo uma respectiva deleção na região telomérica do cromossomo 8 (braço q) têm propriedades vantajosas particulares com relação ao rendimento de expressão e estabilidade de expressão. Em células de camundongo os genes mencionados acima estão localizados na região telomérica do cromossomo 6. Nomes alternativos não limitantes dos genes individuais e/ou proteínas codificadas incluindo homólogos e ortólogos mencionados acima são também indicados na Tabela 1 acima e os respectivos genes são compreendidos pelo escopo dos termos usados acima para os genes individuais.

[0041] De acordo com uma modalidade, a deleção do gene C12orf35 é devido a uma ruptura no cromossomo. Uma ruptura no cromossomo pode ser induzida, por exemplo, através do tratamento das células eucarióticas com um agente tóxico que promove rupturas de cromossomo, tais como, por exemplo, MTX, afidicolina e higromicina. Outras opções para indução de quebras de cromossomo incluem, mas não estão limitadas a, radiação, irradiação, mutagenos, substâncias cancerígenas e bleomicina. Rupturas de cromossomo podem também ocorrer espontaneamente durante transfecção, por exemplo, eletroporação. Métodos para indução de ruptura de cromossomo são também conhecidos daqueles versados na técnica e, então, não necessitam nenhuma descrição detalhada aqui. Após indução de ruptura de cromossomo, células eucarióticas tendo o ponto de ruptura desejado (que resulta em uma deleção de gene C12orf35) podem ser identificadas, por exemplo, através da análise do DNA ou usando o método de acordo com o quinto aspecto da presente invenção. Por exemplo, o perfil de expressão das células tratadas pode ser analisado para determinar se o gene C12orf35 ou genes localizados centroméricos do gene C12orf35 são expressos, se a expressão for reduzida ou se os genes não são expressos. Por exemplo, em caso de células de camundongo ou hamster pode ser analisado se o gene C12orf35 é expresso e alternativamente ou em adição a isto, pode ser analisado se um ou mais genes selecionados do grupo consistindo em proteína 20 tipo metiltransferase, Dennd5b, FAM60A, Caprin2, Ipo8, Tmtc1 ou genes que estão localizados teloméricos dos genes mencionados acima (onde telomérico com relação a isso significa na direção da extremidade telomérica) são expressos pela célula e/ou se a expressão é reduzida ou eliminada. Se o ponto de ruptura induzido estiver localizado centromérico do(s) respectivo(s) gene(s) (onde centromérico com relação a isso significa ainda mais para dentro do cromossomo e desta maneira mais distante da extremidade telomérica), a extremidade telomérica compreendendo os ditos genes é deletada, o que elimina ou reduz (se outras cópias do gene existirem em um outro local que são expressos) sua expressão. Como é evidente a partir da Figura 1, o gene C12orf35 está localizado telomérico dos genes mencionados acima, isto é, ele está localizado ainda mais para a direção da extremidade telomérica. Desta maneira, se os genes mencionados acima forem deletados por uma ruptura do cromossomo, a região deletada inclui também gene C12orf35. Desta maneira, os genes acima podem ser usados validamente como marcadores a fim de basicamente indiretamente determinar se a ruptura de cromossomo induzida resultou em uma deleção de uma porção de cromossomo que inclui gene C12orf35. Ainda, foi constatado que embora localizado telomérico do gene C12orf35, também o gene Bicd1 pode ser usado como marcador para determinar se uma ruptura de cromossomo foi induzida, a qual resultou em uma deleção de gene C12orf35. Foi constatado em células CHO que se o gene Bicd1 for deletado por causa de uma ruptura de cromossomo, a deleção geralmente também inclui gene C12orf35. Foi confirmado através de análise das características de expressão de várias centenas de clones que os genes mencionados acima podem ser validamente usados como marcadores a fim de discriminar clones de célula com características de expressão alta e estável de clones de célula tendo características de expressão baixa e instável. A expressão relativa dos genes mencionados acima em células CHO é mostrada na Figura 2. Como pode ser visto a partir da Figura 2, gene Ipo8 (3), FAM60A (5) e C12orf35 (9) são relativamente altamente expressos em comparação com outros genes que estão localizados na região telomérica do cromossomo 8 em células CHO normais tais como células CHO-K1, que não compreendem uma deleção na região telomérica do cromossomo 8. Desta maneira, é vantajoso incluir um ou mais dos genes mencionados acima na análise, uma vez que isso simplifica a detecção que sua expressão é eliminada ou reduzida. Nomes alternativos não limitantes dos genes individuais e proteínas codificadas mencionados acima, incluindo homólogos e ortólogos, são também indicados na Tabela 1 acima e os respectivos genes são compreendidos pelo escopo dos termos usados acima para os genes individuais.

[0042] De acordo com uma modalidade, o ponto de ruptura no cromossomo 8 está localizado centromérico do gene da proteína 20 tipo metiltransferase, centromérico do gene Dennd5b, centromérico do gene FAM60A, centromérico do gene Caprin2, centromérico do gene Ipo8 ou centromérico do gene RPS4Y2. Foi constatado que o ponto de ruptura no cromossomo 8 do genoma de hamster está frequentemente localizado centromérico do gene Ipo8. De acordo com uma modalidade, o ponto de ruptura no cromossomo 8 está localizado dentro do gene Tmtc1 e o dito gene não é expresso ou sua expressão é baixa. De acordo com uma modalidade, o gene Ergic2, que está localizado centromérico do gene Tmtc1, não é deletado no cromossomo 8. Desta maneira, de acordo com a presente modalidade, o ponto de ruptura é telomérico do gene Ergic2 (onde telomérico com relação a isso significa a jusante para a direção da extremidade telomérica) e o gene Ergic2 está presente.

[0043] De acordo com uma modalidade, expressão funcional de gene C12orf35 é reduzida ou eliminada na célula eucariótica que preferivelmente, é uma célula de mamífero. Expressão funcional do gene C12orf35 pode ser influenciada por vários meios, por exemplo, alterando o promotor e/ou potencializador de gene C12orf35 de maneira que menos ou nenhum transcrito é produzido, ou através de tecnologias de silenciamento de gene tal como silenciamento de gene transcripcional ou pós-transcripcional. De acordo com uma modalidade, a célula eucariótica isolada compreende uma ou mais mutações na região de promotor do gene C12orf35. Por exemplo, a região de promotor pode ser alterada para prover um promotor menos funcional ou não funcional, o promotor pode ser também completamente eliminado. Alternativamente ou em adição, é possível adicionar uma sequência de polinucleotídeo codificando um polipeptídeo incluindo um códon de parada entre o promotor e o códon de início do gene C12orf35 que leva à expressão do outro polipeptídeo ao invés de C12orf35. Respectivos métodos são bem conhecidos do versado na técnica e, desta maneira, não necessitam nenhuma descrição detalhada aqui.

[0044] Redução de expressão de gene funcional pode atingir um nível onde expressão é ainda mais eliminada. Silenciamento de gene pós-transcripcional pode ser obtido, por exemplo, através de moléculas de antissentido ou moléculas que fazem a mediação de interferência de RNA. Exemplos não limitantes serão descritos rapidamente abaixo.

[0045] Polinucleotídeos de antissentido podem ser projetados para especificamente se ligarem a RNA, resultando na formação de híbridos de RNA-DNA ou RNA-RNA, com uma parada de transcrição reversa ou tradução de RNA mensageiro. Muitas formas de antissentido foram desenvolvidas e podem ser categorizadas de modo amplo em antissentido dependente de enzima ou antissentido de bloqueio estérico. Antissentido dependente de enzima inclui formas dependentes de atividade de RNase H para degradar mRNA alvo, incluindo antissentido de DNA de filamento único, RNA e fosforotioato. Polinucleotídeos de antissentido são tipicamente gerados dentro da célula através da expressão a partir de construtos de antissentido que contêm o filamento de antissentido como o filamento transcrito. RNAs catalíticos de clivagem trans- (ribozimas) são moléculas de RNA que possuem atividade de endorribonuclease. Ribozimas podem ser especificamente projetadas para um alvo particular e podem ser engenheiradas para clivar qualquer espécie de RNA especificamente em sítio na base de RNA celular. O evento de clivagem torna o mRNA instável e previne expressão de proteína. O genoma da célula eucariótica pode ser alterado de maneira que uma respectiva molécula de antissentido é, por exemplo, permanentemente expressa.

[0046] Uma outra opção adequada para redução de expressão funcional de gene C12orf35 em um nível pós-transcripcional é baseada na interferência de RNA (RNAi). Como é mostrado pelos exemplos, redução da expressão do gene C12orf35 por RNAi é eficaz a fim de aumentar a produtividade da célula hospedeiro. Produto significantemente mais recombinante é produzido quando do silenciamento do gene C12orf35 por RNAi. Ainda, como é demonstrado pelos exemplos, os níveis de expressão de mRNA do produto de interesse são aumentados quando do silenciamento do gene C12orf35. Métodos para silenciamento de genes através de RNAi são bem conhecidos do versado na técnica e desta maneira, não necessitam nenhuma descrição detalhada aqui. Exemplos de compostos de indução de RNAi que podem ser usados para silenciar a expresso do gene C12orf35 incluem, mas não estão limitados a, ácidos nucleicos de interferência curtos (sina), RNA de interferência curto (siRNA), microRNA (miRNA), RNAs grampos-de-cabelo curtos (shRNA) bem como precursores dos mesmos que são processados na célula para o composto de indução de RNAi real. De acordo com uma modalidade, um siRNA é usado para silenciamento. O siRNA pode ser provido como molécula de filamento duplo tendo sobreposições 3’ em cada filamento. Moléculas de extremidade embotada podem também ser usadas. O dito siRNA pode compreender desóxi- bem como ribonucleotídeos e, ainda, pode compreender nucleotídeos modificados. Várias modalidades e variações de compostos de siRNA são conhecidas na técnica anterior e podem ser usadas para reduzir expressão de gene C12orf35. siRNAs adequados se direcionando às sequências alvo escolhidas/identificadas dos genes alvo no nível de RNA podem ser identificados usando métodos computacionais apropriados, aplicando certos algoritmos de projeto. A fim de obter um siRNA contra o transcrito alvo, a molécula de filamento duplo pode ser transfectada diretamente na célula. Como é mostrado pelos exemplos, tais métodos transientes para redução da expressão do gene C12orf35 são eficazes para aumentar a expressão recombinante de um produto de interesse. Alternativamente, o siRNA pode resultar do processamento por dicer, uma enzima que converte ou dsRNAs longos ou RNAs grampo-de-cabelo pequenos (shRNAs) em siRNAs. Estes precursores ou as moléculas de siRNA finais podem ser produzidos exogenamente (artificialmente) e podem ser então introduzidos nas células eucarióticas através de vários métodos de transfecção. De acordo com uma modalidade adicional, o composto de indução de RNAi é expresso por um vetor que é transfectado na célula eucariótica. Para siRNA, isto pode ser feito, por exemplo, através da introdução de uma alça entre os dois filamentos, desta maneira produzindo um transcrito único, que pode então ser processado em um siRNA funcional na célula eucariótica. Tais cassetes de transcrição usam tipicamente um promotor de polimerase de RNA 3 (por exemplo U6 ou H1) que geralmente direciona a transcrição de RNAs nucleares pequenos (shRNAs). É suposto que o transcrito de shRNA resultante a partir do vetor seja então processado por dicer, desta maneira produzindo as moléculas de siRNA de filamento duplo, preferivelmente tendo as sobreposições 3’ características. De acordo com uma modalidade, tal vetor provendo shRNA é estavelmente integrado ao genoma da célula eucariótica. Esta modalidade é vantajosa, uma vez que a sub-regulagem do gene C12orf35 é devido ao siRNA constantemente produzido bastante de estável e não transiente. Células compreendendo um respectivo vetor provendo shRNA podem então ser transfectadas com um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo codificando o produto de interesse. Alternativamente, estratégias de co-transfecção podem ser usadas, onde o vetor gerando o shRNA é co-transfectado com o vetor de expressão compreendendo o polinucleotídeo codificando o produto de interesse.

[0047] Silenciamento de gene transcripcional pode, por exemplo, incluir modificações epigenéticas. De acordo com uma modalidade, expressão do gene C12orf35 é reduzida por silenciamento epigenético. Células de mamífero foram identificadas onde a expressão do gene C12orf35 é significantemente reduzida através de silenciamento epigenético, presumivelmente metilação de DNA, e a produtividade recombinante das ditas células é extraordinariamente alta. Ainda, a sequência do gene pode ser mudada para reduzir a meia-vida do mRNA. Isto também consegue uma redução no efeito da proteína C12orf35 na respectiva célula alterada.

[0048] De acordo com uma modalidade, expressão funcional do gene C12orf35 é reduzida ou eliminada através de direcionamento a um elemento regulador envolvido na regulagem de expressão de gene C12orf35. Por exemplo, um fator de transcrição, promotor (vide também acima), potencializador, UTRs ou outros elementos reguladores podem ser direcionados, por exemplo, através de inativação, deleção, sub-regulagem ou qualquer outra inativação que inative ou reduza a atividade do dito elemento regulador, desta maneira prevenindo ou reduzindo expressão funcional de gene C12orf35 e desta maneira prejudicando o efeito do produto de expressão endógena.

[0049] De acordo com uma modalidade, o genoma da célula eucariótica é alterado para prejudicar o efeito de C12orf35 através da expressão heteróloga de um C12orf35 mutante que é não ou menos funcional do que a proteína C12orf35 endogenamente expressa. Nesta modalidade, a célula eucariótica isolada compreende em adição ao polinucleotídeo heterólogo codificando o polipeptídeo de interesse um polinucleotídeo heterólogo adicional codificando o C12orf35 mutante. Através da superexpressão de uma respectiva forma mutante não ou menos funcional de C12orf35, um fenótipo negativo dominante pode ser criado. Uma opção adicional para prejudicar e então reduzir o efeito de C12orf35 na célula é a expressão heteróloga de uma proteína tal como um anticorpo que neutraliza C12orf35 e desta maneira prejudica o efeito de C12orf35 na célula. De acordo com uma modalidade, o efeito de C12orf35 é prejudicado na célula através da redução ou eliminação de expressão funcional de moléculas que interagem funcionalmente com C12orf35.

[0050] De acordo com uma outra modalidade, um composto de peso molecular baixo é usado, o qual inibe expressão do gene C12orf35 ao inibir especificamente ligação de um fator de transcrição a uma região reguladora no promotor, ou inibindo um ativador de transcrição requerido para transcrição do gene alvo.

[0051] De acordo com uma modalidade, expressão do gene C12orf35 é reduzida em pelo menos 3 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 30 vezes, pelo menos 40 vezes, pelo menos 50 vezes, pelo menos 60 vezes, pelo menos 70 vezes, pelo menos 75 vezes, pelo menos 80 vezes, pelo menos 90 vezes, pelo menos 100 vezes, pelo menos 125 vezes, pelo menos 250 vezes, pelo menos 500 vezes, pelo menos 750 vezes, pelo menos 1000 vezes, pelo menos 1250 vezes, pelo menos 1500 vezes, pelo menos 1750 vezes ou pelo menos 2000 vezes. Isto pode ser determinado, por exemplo, usando RT-PCR em tempo real ou outros métodos de detecção de RNA sensíveis. Tal redução pode ser conseguida, por exemplo, em comparação com a célula de referência não modificada onde a expressão do gene C12orf35 não é reduzida. De acordo com uma modalidade, expressão do gene C12orf35 é 0,05% ou menos, 0,0475% ou menos, 0,045% ou menos, 0,0425% ou menos, 0,04% ou menos, 0,0375% ou menos, 0,035% ou menos, 0,0325% ou menos, 0,03% ou menos, 0,0275% ou menos, 0,025% ou menos, 0,0225% ou menos, 0,02% ou menos, 0,0175% ou menos, 0,015% ou menos comparado com a expressão do RNA 18S (ajustado em 100%) na mesma célula. De acordo com uma modalidade, expressão do gene C12orf35 é ainda menor tal como 0,001% ou menos, 0,0001% ou menos ou até mesmo 0,00001 ou menos comparado com a expressão do RNA 18S (ajustado em 100%) na mesma célula. A expressão funcional de gene C12orf35 é reduzida de maneira que ela resulta em um aumento na expressão de um produto recombinante de interesse se a dita célula eucariótica modificada for transfectada com um vetor de expressão codificando o produto de interesse comparado om uma célula correspondente onde a expressão funcional do gene C12orf35 não é reduzida ou eliminada. De acordo com uma modalidade, expressão do produto recombinante ou interesse é pelo menos 1,5 vez maior, pelo menos 1,75 vez maior, pelo menos 2 vezes maior, pelo menos 2,5 vezes maior, pelo menos 3 vezes maior, pelo menos 4 vezes maior ou pelo menos 5 vezes maior do que a expressão de uma célula correspondente onde a expressão funcional do gene C12orf35 é não reduzida ou eliminada. De acordo com modalidades, taxas de expressão são obtidas, as quais são pelo menos 8 vezes maiores, pelo menos 10 vezes maiores ou pelo menos 15 vezes maiores do que a expressão de uma célula correspondente onde a expressão do gene C12orf35 não é reduzida ou eliminada. Por exemplo, as taxas de expressão foram determinadas após seleção com G418 que eram até 35 vezes maiores do que as taxas de uma célula correspondente onde a expressão do gene C12orf35 é não reduzida ou eliminada. A taxa de expressão do produto recombinante pode ser testada usando, por exemplo, os ensaios descritos nos exemplos.

[0052] De acordo com uma modalidade adicional, o efeito do produto de expressão do gene C12orf35 é reduzido ou eliminado usando um composto que combate ou inibe o efeito do produto de expressão do gene C12orf35. Respectivos compostos inibidores podem ser de qualquer natureza e incluem, mas não estão limitados a, compostos químicos tais como em particular moléculas pequenas, proteínas e peptídeos. Uma outra possibilidade é usar compostos tais como compostos de peso molecular baixo estimulando a degradação do produto de proteína, por exemplo, estimulando ubiquitinação da proteína.

[0053] De acordo com uma modalidade, adicionalmente, o efeito do produto de expressão de um ou mais genes selecionados do grupo consistindo em Bicd1, Amn1, proteína 20 tipo metiltransferase, Dennd5b, FAM60A, Caprin2, Ipo8, RPS4Y2 e Tmtc1 ou um ou mais genes localizados telomérico dos genes mencionados acima é prejudicado. Nomes alternativos não limitantes dos genes individuais e/ou das proteínas codificadas mencionados acima, incluindo homólogos e ortólogos, estão também indicados na Tabela 1 acima e os respectivos genes codificando as respectivas proteínas são compreendidos pelo escopo dos termos usados acima para os genes individuais. Prejuízo do efeito pode da mesma maneira ser conseguido, por exemplo, reduzindo ou eliminando a expressão funcional dos respectivos genes. Tecnologias e modalidades adequadas são descritas acima em conjunto com o gene C12orf35 e da mesma maneira se aplicam a qualquer outro gene alvo. Conforme descrito acima, os ditos genes estão localizados na região telomérica do cromossomo 8 de hamster Chinês e cromossomo 6 de camundongos. Se uma porção da dita região telomérica for deletada, por exemplo, através da indução de uma ruptura de cromossomo conforme acima descrito, a região deletada geralmente compreende um ou mais dos genes mencionados acima.

[0054] De acordo com uma modalidade preferida, na dita célula onde o efeito de C12orf35 é prejudicado, adicionalmente o efeito de proteína FAM60A é prejudicado, preferivelmente através de redução ou eliminação de expressão funcional do gene FMA60A. Uma constatação inesperada adicional foi que prejudicando o efeito de FAM60A em uma célula eucariótica, por exemplo, através da redução ou eliminação da expressão funcional do gene FAM60A, resultados sobre transfecção estável com um polinucleotídeo codificando um produto de interesse é um aumento significante na abundância de clones de célula obtidos que expressam o produto recombinante com características de estabilidade aperfeiçoada. Desta maneira, com o gene FAM60A, um gene-chave foi identificado, o qual influencia a estabilidade de expressão recombinante. Ainda, prejuízo do efeito de FAM60A nas células permite melhorar significantemente a produção recombinante de um produto de interesse através do aumento da estabilidade de expressão. Como é mostrado nos exemplos, prejuízo do efeito de FAM60A, por exemplo, através de inativação de gene, melhora significantemente as características de estabilidade. Perdas acentuadas em estabilidade de expressão durante cultura prolongada são mais raras com relação a células hospedeiro e, desta maneira, se ocorrerem, resultam em uma diminuição menos drástica na produtividade comparado com células onde o genoma não é alterado para prejudicar o efeito de proteína FAM60A na célula. A abundância de clones estáveis é aumentada quando da transfecção estável. Desta maneira, análises de estabilidade para identificação de células hospedeiro que não são ou são menos propensas à instabilidade durante cultivo prolongado podem ser encurtadas ou até mesmo puladas. Esta é uma vantagem importante uma vez que encurta o tempo que é requerido para obtenção de clones de célula de expressão estável que expressam o produto recombinante de interesse com bom rendimento durante um período de tempo prolongado e que, desta maneira, são adequados para propósitos de produção em grande escala. Isto reduz significantemente o esforço de avaliação. Desta maneira, prejuízo do efeito de FAM60A e C12orf35 na mesma célula é particularmente vantajoso, porque células hospedeiro eucarióticas são providas, as quais mostram características aperfeiçoadas com relação à estabilidade e rendimento de expressão. Desta maneira, células hospedeiro eucarióticas tendo propriedades particularmente vantajosas para a produção de um produto recombinante de interesse são providas. Conforme aqui descrito, a célula eucariótica é preferivelmente uma célula de mamífero.

[0055] FAM60A é uma subunidade do complexo de SIN3-histona desacetilase (HDAC) (complexo SIN3/HDAC) que funciona em repressão transcripcional (Munoz e outros, 2012, THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 287, NO. 39, pp. 32346-32353; Smith e outros, 2012, Mol Cell Proteomics 11 (12): 1815-1828).Histona desacetilase (HDAC) catalisa a remoção de grupos acetila de histonas. Acetilação de histonas em lisinas é um mecanismo principal para modulação de conformação de cromatina. Acetilação de histona promove um estado de cromatina transcripcionalmente ativa, relaxada, enquanto desacetilação catalisada por histona desacetilase (HDACs) favorece um estado inativo, silencioso. Análise de banco de dados revelou a presença de pelo menos um ortólogo de FAM60A na maioria dos metazoários, mas não em nematoides. O gene FAM60A é conservado em metazoários e pode ser encontrado em genomas de todos os vertebrados e na maioria dos invertebrados que foram completamente sequenciados. Por exemplo, uma identidade de sequência de 100% de proteína FAM60A pode ser encontrada entre humano, rato, camundongo e vaca. Pesquisa de similaridade de sequência de homólogos de FMA60A indica que predominantemente, há apenas um único membro representativo desta família no genoma. Há apenas algumas exceções. De acordo com Smith e outros, 2012, a proteína FAM60A tem uma única sequência sem quaisquer domínios de proteína conhecidos. Além disso, foi descrito por Smith e outros, 2012, que ela não exibe nenhuma homologia de sequência com outras proteínas conhecidas no proteoma humano. Comparação de sequência entre proteínas FAM60A de espécies diferentes mostrou que a proteína FAM60A compreende geralmente três regiões: (1) um terminal N compreendendo segmentos altamente conservados em todos os metazoários; (2) uma região média que é altamente conservada em todos os vertebrados enquanto em invertebrados ela consiste em um espaçador não conservado de um comprimento variável; (3) um terminal C compreendendo segmentos altamente conservados em todos os metazoários. Desta maneira, conservação mais alta foi observada nas regiões N- e C-terminais de FAM60A. Conforme acima descrito, pesquisa indica que FAM60A se associa com complexos SIN3/HDAC em vários tipos de célula eucariótica tal como em particular células de mamífero. No entanto, até agora, informação sobre FAM60A é muito restrita. Estudos funcionais recentes (vide Smith e outros, 2012) indicam que FAM60A pode reprimir expressão de gene e regula um subconjunto específico de genes. Smith e outros, 2012, relatam um papel de FAM60A na regulagem do curso de sinalização de TGF-beta, que desempenha um papel pivotal em processos tais como progressão de câncer, metástase, migração de célula e vigilância imunológica. Há constatações indicando que FAM60A age como um repressor transcripcional de componentes do curso de sinalização de TGF-beta enquanto esta função de FAM60A parece ser permitida através de seu papel no complexo SIN3-HDAC. Depleção de FAM60A em linhagens de célula de câncer diferentes usando siRNA contra FMA60A resultou em uma mudança de morfologia de célula de câncer normal. Ainda, foi constatado que níveis de proteína FAM60A realmente mudam periodicamente dentro do curso do ciclo celular em células U2OS (Munoz e outros, 2012). Experimentos de inativação de FAM60A usando siRNA de FAM60A em células de osteossarcoma de osso humano U2OS revelaram que FAM60A restringe expressão de gene ciclina D1. Contra esta base científica, foi muito surpreendente constatar que prejuízo do efeito de proteína FAM60A em uma célula eucariótica tal como preferivelmente uma célula de mamífero aumenta significantemente a estabilidade de expressão de gene heterólogo na dita célula sem afetar negativamente outras características da célula que são importantes para expressão recombinante. Esta correlação entre os efeitos de proteína FAM60A e a estabilidade de expressão durante cultura prolongada das células foi inesperada.

[0056] Como descrito, o gene FAM60A é endogenamente expresso em metazoário e desta maneira em espécies de mamífero tais como humano, camundongo, rato e hamster e a sequência de aminoácido de FAM60A é altamente conservada em espécies de mamífero bem como em vertebrados. A célula eucariótica alterada onde o efeito de FAM60A é prejudicado é derivada de uma célula eucariótica que expressa endogenamente FAM60A. Por questão de simplicidade, a proteína FAM60A bem como o gene FAM60A codificando a proteína FAM60A são escritos aqui em letras maiúsculas embora em algumas espécies uma escrita diferente seja usada para o gene e/ou a proteína. A listagem de sequência mostra sequências de aminoácido exemplares de proteínas FAM60A conhecidas e/ou previstas de espécies de vertebrado diferentes, a saber Homo sapiens (SEQ ID NO: 11), Rattus norvegicus (SEQ ID NO: 12), Mus musculus (SEQ ID NO: 13), Cricetulus griseus (SEQ ID NO: 14), Gallus gallus (SEQ ID NO: 15), Pan troglodytes (SEQ ID NO: 16), Pongo abelii (SEQ ID NO: 17) e Bos taurus (SEQ ID NO: 18). O cDNA de FAM60A previsto de Cricetulus griseus é mostrado na SEQ ID NO: 19 (sequência de codificação de 14-679; vide também NCBI Reference Sequence: XM_003505482.1). Nomes diferentes pode ser atribuídos à proteína FAM60A ou ao gene FAM60A em espécies diferentes e nomes alternativos não limitantes (aliases) são também listados acima na Tabela 1. O termo "FAM60A" conforme aqui usado também compreende quaisquer homólogos e ortólogos de FAM60A que têm a mesma função que FAM60A. De acordo com uma modalidade, o termo "FAM60A" conforme aqui usado em se refere particular a uma proteína que compartilha pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de homologia com uma ou mais das sequências de aminoácido mostradas nas SEQ ID NOs: 11 a 18. De acordo com uma modalidade, os valores percentuais acima se referem à identidade de polipeptídeo ao invés de homologia. Homologia, respectivamente identidade, pode ser calculada em todo o comprimento da proteína de referência. Uma respectiva proteína tem preferivelmente a mesma função que a proteína tendo uma sequência de aminoácido que é mostrada na SEQ ID NO: 11 ou uma ou mais de SEQ ID NO: 12 a 18, preferivelmente SEQ ID NO: 14. A proteína FAM60A não foi descrita em detalhes na literatura. Desta maneira, foi muito surpreendente que a estabilidade de expressão de uma célula hospedeiro recombinante pudesse ser aperfeiçoada, se o genoma da célula hospedeiro for alterado de maneira que o efeito de proteína endógena FAM60A é prejudicado na célula, como pode ser, por exemplo, obtido através da redução ou eliminação da expressão funcional do gene FAM60A na dita célula. Foi inesperado que FAM60A influencie a estabilidade de expressão de um produto recombinante de interesse. De acordo com uma modalidade, o gene FAM60A codificando a proteína FAM60A é alterada a fim de prejudicar o efeito de FMA60A na célula. Isto pode ser obtido, por exemplo, através de tecnologias de engenharia genética tais como tecnologias de inativação de gene como são, por exemplo, descritas aqui. A sequência de gene genômica de espécies de mamífero diferentes é conhecida e é, por exemplo, descrita em Homo sapiens (NCBI Gene- ID: 58516); Rattus norvegicus (NCBI Gene-ID: 686611); Mus musculus (NCBI Gene-ID: 56306); Bos Taurus (NCBI Gene-ID: 538649) e outras. Variantes de transcrito podem existir de uma maneira dependente da espécie e em número diferente. Por exemplo, o gene FAM60A humano expressa 3 isoformas de transcrito putativas que diferem nas UTRs, mas codificam a mesma proteína.

[0057] De acordo com uma modalidade, expressão de gene FAM60A é reduzida em pelo menos 3 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 30 vezes, pelo menos 40 vezes, pelo menos 50 vezes, pelo menos 60 vezes, pelo menos 70 vezes, pelo menos 75 vezes, pelo menos 80 vezes, pelo menos 90 vezes, pelo menos 100 vezes ou pelo menos 125 vezes, pelo menos 250 vezes, pelo menos 500 vezes, pelo menos 750 vezes, pelo menos 1000 vezes, pelo menos 1250 vezes, pelo menos 1500 vezes, pelo menos 1750 vezes, pelo menos 2000 vezes, pelo menos 2500 vezes, pelo menos 3000 vezes ou pelo menos 3500 vezes. Expressão pode ser determinada, por exemplo, usando RT-PCR em tempo real ou outros métodos de detecção e RNA sensíveis. Tal redução pode ser obtida, por exemplo, em comparação com a célula de referência não modificada onde a expressão de gene endógeno FAM60A não é reduzida. De acordo com uma modalidade, expressão de gene FAM60A é 0,05% ou menos, 0,04% ou menos, 0,03% ou menos, 0,02% ou menos, 0,01% ou menos, 0,005% ou menos ou 0,0025% ou menos comparado com a expressão do RNA 18S (ajustado em 100%) na mesma célula. De acordo com uma modalidade, expressão de gene FAM60A é ainda menor, tal como 0,001% ou menos, 0,0005% ou menos ou até mesmo 0,0002 ou menos comparado com a expressão do RNA 18S (ajustada e 100%) na mesma célula.

[0058] De acordo com uma modalidade, a célula eucariótica isolada se origina de uma população de células eucarióticas que são alteradas de maneira que adicionalmente o efeito da proteína FAM60A é prejudicado nas células e onde as ditas células compreendem estavelmente integrado ao seu genoma um polinucleotídeo heterólogo codificando um produto de interesse, onde em média pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85% ou pelo menos 90% das células se originando da dita população não perdem mais de 30%, preferivelmente não mais do que 25%, de seu produto de título de expressão de interesse durante um período de tempo de pelo menos 8 semanas, preferivelmente 10 semanas, mais preferivelmente durante um período de tempo de 12 semana. Como é mostrado nos exemplos, após transfecção e identificação de células estavelmente transfectadas, a quantidade de células que não mostram uma perda gradual em produtividade durante cultura prolongada é aumentada quando usando as células alteradas descritas aqui, isto é, mais clones de célula estável são obtidos de uma população de célula selecionada. A propriedade de estabilidade pode ser testada através do cultivo de células individuais a partir da dita população como clones de célula e determinação do título durante o período de tempo indicado. A estabilidade pode ser testada usando, por exemplo, os ensaios descritos nos exemplos. As taxas de estabilidade podem variar de projeto para projeto dependendo da proteína expressa e se ela é, por exemplo, otimizada no códon. No entanto, com as células eucarióticas alteradas de acordo com a presente invenção, em todos os projetos analisados, um aumento significante em clones expressando estavelmente foi observado comparado com as células do tipo selvagem onde o efeito de FAM60A não é prejudicado. A abundância de células com características de expressão estável foi significantemente aumentada na população de células hospedeiro transfectadas com sucesso. Desta maneira, o risco de que um clone instável que gradualmente perde produtividade durante cultura prolongada seja escolhido para produção em larga escala é significantemente reduzido com esta modalidade onde os efeitos de FAM60A e C12orf35 prejudicados na célula. Esta vantagem importante permite reduzir significantemente ou até mesmo pular completamente análises de estabilidade longas que são geralmente realizadas a fim de eliminar clones instáveis.

[0059] A célula eucariótica é derivada de uma espécie que expressa endogenamente o gene C12orf35. Ainda, a célula eucariótica é derivada de um tipo de célula que é geralmente expresso no dito gene. Exemplos são descritos abaixo. O termo "isolado" é usado para deixar claro que a célula eucariótica não está contida em um organismo vivo tal como um animal ou humano. Conforme aqui descrito, a célula pode ser provida como cultura de célula, linhagem de célula, clone de célula e similar. Exemplos são também descritos abaixo. Como é descrito acima, a dita célula eucariótica é modificada para prejudicar o efeito do produto de expressão de gene C12orf35 na dita célula comparado com uma célula eucariótica não modificada correspondente que expressa endogenamente C12orf35. Prejuízo é preferivelmente conseguido através da redução ou eliminação de expressão funcional de gene C12orf35. Modalidades são descritas acima. A fim de prover linhagens de célula de produção com características uniformes e então previsíveis, é preferido alterar o genoma da célula eucariótica para obter prejuízo. Modalidades exemplares são descritas acima. A respectiva célula alterada pode então ser transfectada com um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo codificando um produto de interesse. A célula eucariótica pode ser uma célula de metazoário tal como uma célula de vertebrado, preferivelmente uma célula de mamífero. Desta maneira, todas as modalidades descritas aqui para células eucarióticas em geral se aplicam à modalidade preferida onde células de mamífero são usadas. A célula eucariótica pode ser, por exemplo, selecionada do grupo consistindo em células de roedor, células humanas e células de macaco. Células eucarióticas preferidas são células de roedor tais como, por exemplo, células derivadas de hamster ou camundongo. Elas podem ser selecionadas do grupo consistindo em uma célula de hamster Chinês tal como uma célula CHO, uma célula BHK, uma célula NS0, uma célula C127, uma célula de fibroblasto 3T3 de camundongo e uma célula SP2/0. Particularmente preferida é uma célula CHO. Exemplos para célula CHO são CHO-K1, CHO-S, CHO- K1SV, CHO-SSF3, CHO-DG44, CHO-DUXB11 ou uma linhagem de célula derivada das mesmas. Como é mostrado nos exemplos, redução ou eliminação da expressão de gene C12orf35 em uma célula CHO provê células CHO que são capazes de produzir um produto recombinante com rendimento aumentado significante. O gene C12orf35 é também expresso em células humanas. Desta maneira, de acordo com uma modalidade, a célula eucariótica é derivada de uma célula humana, que pode ser, por exemplo, selecionada do grupo consistindo em uma célula HEK293, uma célula MCF-7, uma célula PerC6, uma célula CAP, células hematopoiéticas e uma célula HeLa. Uma outra alternativa são células de macaco, que, por exemplo, podem ser selecionadas do grupo consistindo em células COS, COS- 1, uma célula COS-7 e uma célula Vero. De acordo com uma modalidade, a célula eucariótica, que é preferivelmente uma célula de mamífero, é provida como clone de célula ou linhagem de célula.

[0060] De acordo com uma modalidade, a célula eucariótica não compreende um polinucleotídeo heterólogo codificando um produto de interesse, um polinucleotídeo heterólogo codificando um marcador selecionável e/ou um polinucleotídeo heterólogo codificando um polipeptídeo repórter que é/são expressos, em particular secretados, da dita célula. Uma respectiva célula eucariótica "vazia" pode ser usada, por exemplo, como linhagem de célula de clonagem para tecnologias de produção recombinante. Uma respectiva célula pode ser transfectada com um polinucleotídeo heterólogo codificando um produto de interesse, por exemplo, usando um vetor de expressão apropriado. Tais células eucarióticas "vazias" onde o efeito do produto de expressão de gene C12orf35 é prejudicado e que não expressam ainda e em particular não secretam um produto recombinante podem ser então transfectadas com vetores de expressão diferentes, dependendo do produto de interesse desejado que é suposto ser recombinantemente produzido. Desta maneira, tal linhagem de célula eucariótica pode ser usada para projetos diferentes, isto é, para a produção de produtos de interesse diferentes, em particular polipeptídeos de interesse secretados. Transfecção pode ser transiente ou estável e é conforme demonstrado pelos exemplos, rendimento de expressão aperfeiçoados são observados em ambas as modalidades.

[0061] De acordo com uma modalidade, a célula eucariótica compreende um polinucleotídeo heterólogo codificando um produto de interesse. O produto de interesse é o produto recombinante que é suposto ser expresso pela célula eucariótica em quantidade grande. Preferivelmente, o produto de interesse é um polipeptídeo. Ainda, a célula eucariótica pode compreender ainda um polinucleotídeo heterólogo codificando um marcador selecionável e/ou um polinucleotídeo heterólogo codificando um repórter. Isto simplifica a seleção de células hospedeiro que são transfectadas com sucesso e então expressam o produto de interesse. Ainda, a célula eucariótica pode compreender vários polinucleotídeos codificando marcadores selecionáveis e/ou polipeptídeos repórteres diferentes. De acordo com uma modalidade, o polinucleotídeo heterólogo codificando o produto de interesse é estavelmente integrado ao genoma da célula eucariótica de acordo com o primeiro aspecto.

[0062] Um "polinucleotídeo heterólogo" ou "ácido nucleico heterólogo" e expressões similares usadas aqui se referem em particular a uma sequência de polinucleotídeo que foi introduzida na célula eucariótica, por exemplo, através do uso de técnicas recombinantes tal como transfecção. Um "polinucleotídeo" se refere em particular a um polímero de nucleotídeos que são geralmente ligados de uma desoxirribose ou ribose para uma outra e se refere a DNA bem como RNA, dependendo contexto. O termo "polinucleotídeo" não compreende quaisquer restrições de tamanho.

[0063] Um vetor de expressão pode ser usado para introduzir polinucleotídeos heterólogos. Os polinucleotídeos podem ser compreendidos em um cassete de expressão. O(s) polinucleotídeo(s) codificando o produto de interesse e o(s) polinucleotídeo(s) codificando um marcador selecionável ou polipeptídeo repórter pode(m) estar localizado(s) nos mesmos vetores de expressão ou em diferentes. Introdução na célula eucariótica pode ser conseguida, por exemplo, através de transfecção de um vetor de expressão adequado compreendendo os polinucleotídeos codificando o produto de interesse nas células hospedeiro. O vetor de expressão integra preferivelmente no genoma da célula hospedeiro (transfecção estável). No caso do ácido nucleico heterólogo não ser inserido no genoma, o ácido nucleico heterólogo pode ser perdido no estágio posterior, por exemplo, quando as células sofrem mitose (transfecção transiente). Como é mostrado pelos exemplos, as células eucarióticas descritas aqui são vantajosas para ambas as modalidades, isto é, transfecção transiente bem como estável. Transfecção estável é preferida para geração de clones de célula de expressão alta para produção de um produto de interesse tal como um polipeptídeo de interesse em escala industrial. Isto é particularmente importante para polipeptídeos terapêuticos ou de diagnóstico de interesse. Vários métodos apropriados são conhecidos na técnica anterior para introdução de um ácido nucleico heterólogo tal como um vetor de expressão em eucarióticos tais como células hospedeiro de mamífero e, desta maneira, não necessitam nenhuma descrição detalhada aqui. Respectivos métodos incluem, mas não estão limitados a, transfecção com fosfato de cálcio, eletroporação, lipofecção, transferência de genes mediada por biolística e polímero e similar. Além de métodos baseados em integração aleatória tradicionais também abordagens mediadas por recombinação podem ser usadas para transferir o polinucleotídeo heterólogo para o genoma da célula hospedeiro. Como respectivos métodos são bem conhecidos na técnica anterior, eles não necessitam nenhuma descrição detalhada aqui. Modalidades não limitantes de projeto de vetor adequados são também descritas subsequentemente e é referida a respectiva descrição.

[0064] Vetores de expressão usados para obter expressão de um produto recombinante de interesse geralmente contêm elementos de controle transcripcional adequados para direcionar transcrição tais como, por exemplo, promotores, potencializadores, sinais de poliadenilação, sinais de pausa ou terminação de transcrição geralmente como elemento de um cassete de expressão. Se o produto desejado for um polipeptídeo, elementos de controle de tradução adequados são preferivelmente incluídos no vetor, tais como, por exemplo, regiões não traduzidas 5’ levando a estruturas cap 5’ adequadas para recrutamento de ribossomos e códons de parada para terminar o processo de tradução. Os transcritos resultantes carregam elementos de tradução funcionais que facilitam expressão de proteína (isto é, tradução) e terminação de tradução apropriada. Uma unidade de expressão funcional, capaz de apropriadamente dirigir a expressão de um polinucleotídeo incorporado, é também referida como um "cassete de expressão". É bem conhecido de um versado na técnica como um cassete de expressão deve ser projetado a fim de permitir a expressão em uma célula eucariótica, tal como preferivelmente em uma célula de mamífero.

[0065] O(s) polinucleotídeo(s) codificando o produto de interesse e os polinucleotídeos codificando o(s) marcador(s) selecionável(eis) e/ou polipeptídeo(s) repórter(es) conforme aqui descrito são preferivelmente compreendidos em cassetes de expressão. Várias modalidades são adequadas. Por exemplo, cada um do(s) dito(s) polinucleotídeo(s) pode ser compreendido em um cassete de expressão separado. Isto é também referido como ajuste monocistrônico. Também está dentro do escopo da presente invenção que pelo menos dois dos respectivos polinucleotídeos são compreendidos em um cassete de expressão. De acordo com uma modalidade, pelo menos um elemento de sítio de entrada ribossomal interno (IRES) está funcionalmente localizado entre os polinucleotídeos que são expressos a partir do mesmo cassete de expressão. Desta maneira, é assegurado que produtos de tradução separados são obtidos do dito transcrito. Respectivas tecnologias de expressão baseadas em IRES e outros sistemas bi- e policistrônico são bem conhecidas e então não necessitam de descrição adicional aqui.

[0066] Conforme descrito, o vetor de expressão pode compreender pelo menos um elemento promotor e/ou promotor/potencializador como elemento de um cassete de expressão. Promotores podem ser divididos em duas classes, aqueles que funcionam constitutivamente e aqueles que são regulados por indução ou desrepressão. Ambos são adequados. Promotores constitutivos fortes que direcionam expressão em muitos tipos de célula incluem, mas não estão limitados a, o promotor tardio principal de adenovírus, o promotor precoce imediato de citomegalovírus humano, o promotor do vírus SV40 e Sarcoma Rous e promotor de 3-fosfoglicerato cinase de murino, EF1a. De acordo com uma modalidade, o promotor e/ou potencializador é ou obtido de CMV e/ou SV40. Os promotores de transcrição podem ser selecionados do grupo consistindo em um promotor de SV40, um promotor de CMV, um promotor de EF1alfa, um promotor de RSV, um promotor de BORAD3, um promotor de rosa 26 de murino, um promotor de pCEFL e um promotor de β-actina. Também outros promotores podem ser usados se eles resultarem em expressão do produto de interesse na célula eucariótica que é preferivelmente uma célula de mamífero.

[0067] Ainda, um cassete de expressão pode compreender pelo menos um íntron. Geralmente, íntrons são postos na extremidade 5’ da estrutura de leitura aberta, mas também podem ser postos na extremidade 3’. O dito íntron pode estar localizado entre o(s) elemento(s) promotor(es)/potencializador(es) e a extremidade 5’ da estrutura de leitura aberta do polinucleotídeo codificando o produto de interesse a ser expresso. Vários íntrons adequados são conhecidos no estado da técnica que podem ser usados em conjunto com a presente invenção.

[0068] O produto de interesse pode ser qualquer produto biológico capaz de ser produzido através de transcrição, tradução ou qualquer outro evento de expressão da informação genética codificada pelo polinucleotídeo codificando o produto de interesse. O produto de interesse pode ser selecionado do grupo consistindo em polipeptídeos e ácidos nucleicos, em particular RNA. O produto pode ser um composto farmaceuticamente ou terapeuticamente ativo ou uma ferramenta de pesquisa a ser utilizada em ensaios e similar. Preferivelmente, o produto de interesse é um polipeptídeo. Qualquer polipeptídeo de interesse pode ser expresso com o método da presente invenção. O termo "polipeptídeo" se refere a uma molécula compreendendo um polímero de aminoácidos interligados por uma ligação(ões) peptídica(s). Polipeptídeos incluem polipeptídeos de qualquer comprimento, incluindo proteínas (por exemplo, tendo mais de 50 aminoácidos) e peptídeos (por exemplo, 2-49 aminoácidos). Polipeptídeos incluem proteínas e e/ou peptídeos de qualquer atividade, função ou tamanho, e podem incluir, por exemplo, enzimas (por exemplo, proteases, cinases, fosfatases), receptores, transportadores, proteínas bactericidas e/ou de ligação à endotoxina, polipeptídeos estruturais, polipeptídeos ligados à membrana, glicoproteínas, proteínas globulares, imunopolipeptídeos, toxinas, antibióticos, hormônios, fatores de crescimento, fatores sanguíneos, vacinas ou similar. O polipeptídeo pode ser selecionado do grupo consistindo em hormônios de peptídeo, interleucinas, ativadores de plasminogênio de tecido, citocinas, imunoglobulinas, em particular anticorpos ou fragmentos de anticorpo funcionais ou variantes dos mesmos e proteínas de fusão Fc. Os polipeptídeos de interesse que são expressos de acordo com os ensinamentos descritos aqui podem ser também uma subunidade ou domínio de um polipeptídeo tal como, por exemplo, uma cadeia pesada ou uma cadeia leve de um anticorpo ou um fragmento funcional ou derivado do mesmo. Os termos "produto de interesse" ou "polipeptídeo de interesse" podem se referir a tal subunidade ou domínio individual ou à proteína final que é composta das respectivas subunidades ou domínios, dependendo do contexto. Em uma modalidade preferida o polipeptídeo de interesse é uma molécula de imunoglobulina, mais preferivelmente um anticorpo, ou uma subunidade ou domínio do mesmo tal como, por exemplo, a cadeia pesada ou cadeia leve de um anticorpo. O termo "anticorpo" conforme aqui usado se refere particularmente a uma proteína compreendendo pelo menos duas cadeias pesadas e duas cadeias leves conectadas por ligações dissulfeto. O termo "anticorpo" inclui anticorpos de ocorrência natural bem como todas as formas recombinantes de anticorpos, por exemplo, anticorpos humanizados, anticorpos integralmente humanos e anticorpos quiméricos. Cada cadeia pesada é geralmente compreendida de uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região constante de cadeia pesada (CH). Cada cadeia leve é geralmente compreendida de uma região variável de cadeia leve (VL) e uma re-gião constante de cadeia leve (CL). O termo "anticorpo", no entanto, também inclui outros tipos de anticorpos tais como anticorpos de domínio único, anticorpos de cadeia pesada, isto é, anticorpos apenas compostos de um ou mais, em particular duas cadeias pesadas, e nanocorpos, isto é, anticorpos compostos apenas de um domínio variável monomérico único. Conforme acima discutido, o polinucleotídeo codificando o polipeptídeo de interesse pode também codificar uma ou mais subunidades ou domínios de um anticorpo, por exemplo, uma cadeia pesada ou uma cadeia leve ou um fragmento funcional ou derivado do mesmo, como polipeptídeo de interesse. As ditas subunidades ou domínios podem ser expressos ou a partir dos mesmos cassetes de expressão ou diferentes. Um "fragmento ou derivado funcional" de um anticorpo se refere em particular a um polipeptídeo que é derivado de um anticorpo e é capaz de se ligar ao mesmo antígeno, em particular ao mesmo epítopo que o anticorpo. Foi mostrado que a função de ligação a antígeno de um anticorpo pode ser executada por fragmentos de um anticorpo de comprimento integral ou derivados do mesmo. Exemplos de fragmentos ou derivados de um anticorpo incluem (i) fragmentos Fac, fragmentos monovalentes consistindo na região variável e no primeiro domínio constante de cada cadeia pesada e leve; (ii) fragmentos F(ab)2, fragmentos bivalentes compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfeto na região de dobra; (iii) fragmentos Fd consistindo na região variável e no primeiro domínio constante CH1 da cadeia pesada; (iv) fragmentos Fv consistindo na região variável de cadeia pesada e cadeia leve de um braço único de um anticorpo; (v) fragmentos scFv, fragmentos Fv consistindo em uma cadeia de polipeptídeo única; (vi) fragmentos (Fv)2 consistindo em dois fragmentos Fv covalentemente interligados; (vii) um domínio variável de cadeia pesada; e (viii) multicorpos consistindo em uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve covalentemente interligadas de tal maneira que associação das regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve podem apenas ocorrer intermolecular, mas não intramolecular. De acordo com uma modalidade, a célula eucariótica secreta o polipeptídeo recombinante de interesse no meio de cultura de célula. De acordo com uma modalidade, o polipeptídeo de interesse não é ou não compreende uma proteína C12orf35.

[0069] A célula eucariótica pode ou não compreender um polinucleotídeo endógeno correspondendo a, respectivamente sendo idêntico ao polinucleotídeo codificando o produto de interesse. De acordo com uma modalidade, a célula eucariótica não compreende um gene endógeno correspondendo ao produto de interesse.

[0070] Como descrito, em modalidades preferidas, a célula eucariótica compreende pelo menos um polinucleotídeo heterólogo codificando um marcador selecionável e/ou um polinucleotídeo heterólogo codificando um polipeptídeo repórter em adição ao polinucleotídeo heterólogo codificando o produto de interesse.

[0071] Um "marcador selecionável" permite sob condições de cultura seletiva apropriadas a seleção de células hospedeiro expressando o dito marcador selecionável. Um marcador selecionável provê o carreador do dito marcador sob condições seletivas com uma vantagem de sobrevivência e/ou crescimento. Desta maneira, células hospedeiro transfectadas com sucesso com o vetor de expressão podem ser selecionadas sob condições de seleção apropriadas. Tipicamente, um gene marcador selecionável conferirá resistência a um agente de seleção tal como um fármaco, por exemplo, um antibiótico ou outro agente tóxico, ou compensará um defeito metabólico ou catabólico na célula hospedeiro. Ele pode ser um marcador de seleção positivo ou negativo. Para seleção de células hospedeiro transfectadas com sucesso um meio de cultura pode ser usado para cultura das células hospedeiro compreendendo um agente de seleção que permite seleção do marcador selecionável usado. Em outras modalidades, o marcador de seleção permite que a célula hospedeiro sobreviva e prolifere na ausência ou redução de um composto que é essencial para sobrevivência e/ou proliferação das células hospedeiro sem o marcador de seleção. Através do cultivo das células hospedeiro em um meio que não compreende o composto essencial em uma concentração alta o suficiente para sobrevivência e/ou proliferação da célula hospedeiro ou com-preende uma quantidade reduzida de dito composto essencial, apenas células hospedeiro expressando o marcador de seleção podem sobreviver e/ou proliferar. De acordo com uma modalidade, o marcador selecionável é um marcador de resistência a fármaco codificando uma proteína que confere resistência a condições de seleção envolvendo o dito fármaco. Uma variedade de genes marcadores selecionáveis foi descrita (vide, por exemplo, WO 92/08796, WO 94/28143, WO2004/081167, WO2009/080759, WO2010/097240). Por exemplo, pelo menos um marcador selecionável pode ser usado, o qual confere resistência contra a um ou mais agentes antibióticos. O marcador selecionável pode de acordo com uma modalidade ser um marcador selecionável amplificável. Um marcador selecionável amplificável permite a seleção de vetor contendo células hospedeiro e pode prover amplificação de gene do dito vetor nas células hospedeiro. Genes marcadores selecionáveis comumente usados com células eucarióticas tais como em particular células de mamífero incluem os genes para aminoglicosídeos fosfotransferase (APH), higromicina fosfotransferase (hyg), di-hidrofolato redutase (DHFR), timidina cinase (tk), glutamina sintetase, asparagina sintetase e genes codificando resistência à neomicina (G418), puromicina, higromicina, zeocina, ouabaína, blasticidina, histidinol D, bleomicina, fleomicina e ácido micofenólico. De acordo com uma modalidade, um receptor de folato é usado como marcador selecionável em conjunto com as células eucarióticas descritas aqui (vide, por exemplo, WO2009/080759), que são preferivelmente células de mamífero. De acordo com uma modalidade, a célula eucariótica compreende um polinucleotídeo heterólogo codificando um receptor de folato como marcador selecionável e/ou compreende um polinucleotídeo heterólogo codificando uma di-hidrofolato redutase (DHFR) como marcador selecionável. Esta modalidade será também descrita em detalhes abaixo em conjunto com o método de seleção de acordo com o segundo aspecto. A célula eucariótica pode expressar endogenamente DHFR e um receptor de folato.

[0072] Um "polipeptídeo repórter" permite a identificação de uma célula expressando o dito polipeptídeo repórter com base nas características de descrição (por exemplo, fluorescência). Genes repórteres geralmente não proveem as células hospedeiro com uma vantagem de sobrevivência. No entanto, a expressão do polipeptídeo repórter pode ser usada para diferenciar entre células expressando o polipeptídeo repórter e aquelas células que não. Desta maneira, também um gene repórter permite a seleção de células hospedeiro transfectadas com sucesso. Polipeptídeos repórteres adequados incluem, mas não estão limitados a, por exemplo, proteína verde fluorescente (GFP), YFP, CFP e luciferase. De acordo com uma modalidade, o polipeptídeo repórter tem características que permitem a seleção através de citometria de fluxo.

[0073] Conforme descrito, o vetor de expressão compreendendo o polinucleotídeo codificando o produto de interesse pode também compreender mais de um gene marcador e/ou repórter selecionável. Ainda, o um ou mais polinucleotídeos codificando marcador(es) selecionável(eis) e/ou o um ou mais polinucleotídeos codificando o(s) polipeptídeo(s) repórter(s) podem também ser providos em um ou mais vetores de expressão diferentes que são co-transfectados com o vetor de expressão que compreende o polinucleotídeo codificando o produto de interesse. Tais estratégias de co-transfecção da mesma maneira permitem seleção como é bem conhecido na técnica anterior.

[0074] O vetor de expressão ou a combinação de pelo menos dois vetores de expressão compreendidos na célula eucariótica pode compreender ainda elementos de vetor adicionais. Por exemplo, pelo menos um polinucleotídeo adicional codificando um produto de interesse adicional pode ser compreendido. Como explicado acima, e como se torna aparente a partir dos exemplos descritos acima de polipeptídeos que podem ser expressos de acordo com os presentes ensinamentos, o polipeptídeo final que deve ser produzido e preferivelmente secretado pela célula hospedeiro pode também ser uma proteína que é composta de várias subunidades ou domínios individuais. Um exemplo preferido de uma respectiva proteína é uma molécula de imunoglobulina, em particular um anticorpo que compreende, por exemplo, cadeias pesadas e leves. Há várias opções para produção de uma respectiva proteína que é composta de subunidades ou domínios individuais diferentes e projetos de vetor apropriados são conhecidos na técnica. De acordo com uma modalidade, duas ou mais subunidades ou domínios da dita proteína são expressos a partir de um cassete de expressão. Nesta modalidade, um transcrito longo é obtido a partir do respectivo cassete de expressão que compreende as regiões de codificação das subunidades ou domínios individuais da proteína. De acordo com uma modalidade, pelo menos um elemento IRES (sítio de entrada ribossomal interno) está funcionalmente localizado entre as regiões de codificação das subunidades ou domínios individuais e cada região de codificação é precedida por uma sequência líder secretora. Desta maneira, é assegurado que produtos de tradução separados sejam obtidos a partir do dito transcrito e que a proteína final possa ser corretamente montada e secretada. Respectivas tecnologias são conhecidas na técnica anterior e, desta maneira, não necessitam nenhuma descrição detalhada aqui.

[0075] Para algumas modalidades, tal como a expressão de anticorpos, é ainda preferido expressar as subunidades ou domínios individuais a partir de cassetes de expressão diferentes. De acordo com uma modalidade, o cassete de expressão usado para expressão do produto de interesse é um cassete de expressão monocistrônico. Todos os cassetes de expressão compreendidos no vetor de expressão ou combinação de vetores de expressão podem ser monocistrônicos. De acordo com uma modalidade, desta maneira, cada cassete de expressão projetado para expressão de um produto de interesse compreende um polinucleotídeo codificando uma subunidade ou domínio da proteína a ser expressa como polipeptídeo de interesse. Por exemplo, em caso de anticorpos, um cassete de expressão pode codificar a cadeia leve de um anticorpo e um outro cassete de expressão pode codificar a cadeia pesada do anticorpo. Após expressão das subunidades ou domínios individuais a partir dos cassetes de expressão individuais, a proteína final tal como um anticorpo é montada a partir das ditas subunidades ou domínios e secretada pela célula hospedeiro. Esta modalidade é particularmente adequada para expressão de moléculas de imunoglobulina tais como anticorpos. Neste caso, um primeiro polinucleotídeo heterólogo codificando um produto de interesse codifica, por exemplo, a cadeia pesada ou a cadeia leve de uma molécula de imunoglobulina e um segundo polinucleotídeo heterólogo codificando um produto de interesse codifica a outra cadeia da molécula de imunoglobulina. De acordo com uma modalidade, o vetor de expressão ou combinação de pelo menos dois vetores de expressão usados para transfecção a célula hospedeiro de mamífero compreende pelo menos um cassete de expressão compreendendo um polinucleotídeo codificando a cadeia pesada de uma molécula de imunoglobulina ou um fragmento funcional da mesma e pelo menos um cassete de expressão compreendendo um polinucleotídeo codificando a cadeia leve de uma molécula da imunoglobulina ou um fragmento funcional da mesma. Os ditos polinucleotídeos podem estar localizados nos mesmos vetores de expressão ou em diferentes em caso de uma combinação de pelo menos dois vetores de expressão ser usada. Quando da expressão dos ditos polinucleotídeos na célula hospedeiro transfectada, uma molécula de imunoglobulina funcional é obtida e preferivelmente é secretada a partir da célula hospedeiro. Como é mostrado pelos exemplos, uso das células e linhagens de célula descritas aqui onde o efeito do produto de expressão de gene C12orf35 é prejudicado, preferivelmente através da redução ou eliminação da expressão funcional do dito gene, é particularmente adequado para expressão de proteínas, em particular proteínas que são compostas de várias subunidades ou domínios tais como anticorpos. Como é mostrado pelos exemplos, a quantidade geral de anticorpo que é expressa pelas ditas células eucarióticas é aumentada. Ainda, em modalidades, em particular onde o efeito de FAM60A é adicionalmente prejudicado na célula, também a estabilidade de expressão foi aperfeiçoada. Desta maneira, nas linhagens de célula eucariótica descritas aqui têm vantagens particulares quando sendo usadas para expressão recombinante de polipeptídeos, incluindo proteínas que são compostas de várias subunidades de domínios tais como, por exemplo, anticorpos. Vantagens adicionais são também descritas em conjunto com os exemplos.

B. Método de seleção

[0076] De acordo com um segundo aspecto, um método para seleção de uma célula hospedeiro que expressa recombinantemente um produto de interesse é provido, compreendendo

[0077] (a) provisão de células eucarióticas de acordo com o primeiro aspecto como células hospedeiro, onde as ditas células hospedeiro compreendem pelo menos um polinucleotídeo heterólogo codificando o produto de interesse; e

[0078] (b) seleção de uma ou mais células hospedeiro expressando o produto de interesse.

[0079] As células eucarióticas de acordo com o primeiro aspecto, incluindo modalidades adequadas e preferidas, bem como suas vantagens, são descritas em detalhes acima e é referida a respectiva descrição que também se aplica aqui. Como descrito, células de vertebrado, em particular células de mamífero, são preferivelmente usadas como células hospedeiro. As propriedades vantajosas das ditas células eucarióticas simplificam, por exemplo, a seleção e então identificação de clones de produção estável adequados. Ainda, como a proporção de células de produção alta na população de célula transfectada é significantemente aumentada quando usando as células eucarióticas descritas aqui, menos clones precisam ser analisados e avaliados quanto às suas características de produção a fim de identificar clones de produção adequados. Isto economiza tempo e, ainda, permite manejo de mais projetos em paralelo. Ainda, como é demonstrado pelos exemplos, o número de respectivamente proporção de células de expressão alta é aumentado após etapas de transfecção e seleção quando usando as ditas células eucarióticas.Tais células de expressão, também chamadas grupos de célula, produzem quantidades significantes do produto de interesse. Desta maneira, tais grupos de célula compreendendo células de expressão alta podem ser, por exemplo, usados para produzir um polipeptídeo de interesse dentro de um prazo curto. Desta maneira, o produto de interesse pode ser produzido rapidamente nas respectivas células.

[0080] De acordo com uma modalidade, o estágio (a) do método de seleção de acordo com o segundo aspecto compreende transfecção de células eucarióticas de acordo com o primeiro aspecto, que preferivelmente não compreende ainda um polinucleotídeo heterólogo codificando o produto de interesse, com um polinucleotídeo heterólogo codificando o produto de interesse, desta maneira provendo células eucarióticas que compreendem um polinucleotídeo heterólogo codificando o produto de interesse. Como descrito, células de mamífero são preferivelmente usadas como células hospedeiro eucarióticas. Os polinucleotídeos codificando o produto de interesse podem ser compreendidos em um vetor de expressão que é então transfectado na célula eucariótica.

[0081] Estágio de seleção (b) pode ser um processo de seleção de multietapa compreendendo várias etapas de seleção a fim de selecionar e então identificar células hospedeiro que expressam um produto de interesse alto rendimento. Por exemplo, o estágio (b) pode incluir uma ou mais etapas de seleção para identificar células que foram transfectadas com sucesso bem como uma ou mais etapas de seleção subsequentes para selecionar células de expressão alta do grupo de células transfectadas com sucesso. A estratégia de seleção apropriada depende do projeto do vetor de expressão que é usado para introdução do polinucleotídeo codificando o produto de interesse e em particular depende do(s) marcador(es) e/ou repórter(es) de seleção usado(s). Modalidades não limitantes serão descritas a seguir.

[0082] Como descrito acima, as células hospedeiro eucarióticas podem compreender pelo menos um polinucleotídeo heterólogo codificando um marcador selecionável. O polinucleotídeo codificando o marcador selecionável pode ser introduzido na célula hospedeiro junto com o polinucleotídeo codificando o produto de interesse usando ou o mesmo ou um vetor de expressão co-transfectado diferente. O estágio (b) então compreende cultura da dita pluralidade de células hospedeiro sob condições provendo uma pressão de seleção para as células hospedeiro para identificar células hospedeiro transfectadas com sucesso, por exemplo, usando um meio de seleção apropriado. Conforme aqui usado, um "meio de seleção" se refere em particular a um meio de cultura de célula útil para a seleção de células hospedeiro que expressam o marcador selecionável. Ele pode incluir, por exemplo, um agente de seleção tal como um fármaco tóxico que permite identificar células hospedeiro transfectadas com sucesso. Alternativamente, um composto essencial pode estar ausente ou sua concentração pode ser reduzida no meio de seleção. De acordo com uma modalidade, células hospedeiro que não foram transfectadas com sucesso e, então, não expressam o(s) marcador(s) de seleção ou onde expressão é baixa não podem proliferar ou morrem sob as condições de cultivo seletivas. Em contraste, células hospedeiro que foram transfectadas com sucesso com o(s) vetor(es) de expressão e que expressam o(s) marcador(es) de seleção (e desta maneira o produto co-introduzido de interesse) com rendimento suficiente são resistentes a ou são menos afetadas pela pressão de seleção e, desta maneira, podem proliferar, desta maneira superando as células hospedeiro que não foram transfectadas com sucesso ou onde o sítio de integração no genoma da célula não é favorável. De acordo com uma modalidade, o marcador selecionável é selecionado do grupo consistindo em marcadores de resistência a antibiótico, marcadores de resistência a fármaco e marcadores metabólicos. Exemplos adequados de marcadores selecionáveis e princípios de seleção são descritos acima em conjunto com o primeiro aspecto e condições de seleção apropriadas para os marcadores selecionáveis individuais são também bem conhecidas do versado na técnica. Modalidades não limitantes, mas vantajosas, serão descritas rapidamente subsequentemente.

[0083] Como é mostrado pelos exemplos, uma vantagem das células eucarióticas descritas aqui, tal como em particular uma linhagem de célula CHO compreendendo uma deleção na região telomérica do cromossomo 8 que inclui gene C12orf35, é que já após uma etapa de seleção padrão, tal como, por exemplo, uma seleção G418/neo, a porcentagem de células de produção alta é significantemente aumentada. Por exemplo, quando transfectando linhagens de célula CHO normais, onde a expressão de gene C12orf35 não é reduzida ou eliminada, frequentemente 60% ou até mesmo 80% das células sobrevivendo seleção G418/neo são não produtoras. O número de não ou pouco produtoras é significantemente reduzido quando usando as linhagens de célula eucariótica de acordo com a presente descrição. Isto permite realizar eficientemente a seleção no estágio (b) ao usar apenas um marcador selecionável e então apenas uma etapa de seleção, tal como, por exemplo, uma seleção G418/neo, se desejado. Isto aumenta a velocidade de seleção e, desta maneira, reduz o tempo requerido para obtenção de células transfectadas que expressam o produto de interesse. Ainda, devido ao número de produtoras de taxa alta ser aumentado, foi constatado que mesmo na ausência de uma seleção específica para células de produção de taxa alta populações de célula podem ser geradas com desempenho do tipo clone e, desta maneira, dentro de tempo muito curto. Desta maneira, o produto de interesse pode ser ainda fabricado a partir de tais grupos. Desta maneira, para aplicações onde, por exemplo, apenas certas quantidades de proteína são necessárias rapidamente, por exemplo, para propósitos de pesquisa ou teste, tal sistema de seleção rápida que rapidamente apresenta células produtoras ou grupos de célula produtoras boas é muito vantajoso.

[0084] No entanto, se for desejado aumentar mais a produtividade, uma seleção de multietapa no estágio (b) é preferida. Este é particularmente o caso quando pretendendo estabelecer uma linhagem de célula clonal para produção do produto de interesse em larga escala, em particular escala industrial.

[0085] Como descrito acima, o vetor de expressão ou vetores de expressão introduzidos nas células eucarióticas podem compreender dois ou mais genes marcadores selecionáveis e seleção para os marcadores selecionáveis diferentes pode ser feita simultaneamente ou sequencialmente para seleção de células hospedeiro que foram transfectadas com sucesso com o(s) vetor(es) de expressão e expressam o produto de interesse com alto rendimento. O meio de seleção usado para cultivo pode compreender agentes de seleção para todos os marcadores selecionáveis usados. Em uma outra modalidade, cultivo pode ser realizado primeiro com um meio de seleção apenas compreendendo o(s) agente(s) de seleção de um ou um subconjunto dos genes marcadores selecionáveis usados, seguido pela adição de um ou mais dos agentes de seleção para os genes marcadores selecionáveis restantes. Em uma outra modalidade, as células hospedeiro são cultivadas com um primeiro meio de seleção apenas compreendendo o(s) agente(s) de seleção de um ou um subconjunto dos genes marcadores selecionáveis do(s) vetor(es), seguido por cultivo com um segundo meio de seleção compreendendo o(s) agente(s) de seleção de um ou mais dos agentes de seleção dos genes marcadores selecionáveis restantes. De acordo com uma modalidade, o segundo meio de seleção não compreende o(s) agente(s) de seleção usado(s) no primeiro meio de seleção.

[0086] De acordo com uma modalidade, as células eucarióticas providas no estágio (a) compreendem um polinucleotídeo heterólogo codificando uma di-hidrofolato redutase (DHFR) como marcador selecionável e estágio (b) compreende realização da etapa de seleção para DHFR. Uma respectiva etapa de seleção geralmente envolve um meio de seleção compreendendo um inibidor de DHFR. Várias enzimas DHFR adequadas e consequentemente genes DHFR são conhecidos na técnica anterior e podem ser usados como marcador selecionável. O termo DHFR se refere a DHFR do tipo selvagem bem como enzimas DHFR tendo uma ou mais trocas de sequência de aminoácido (por exemplo, deleções, substituições ou adições) com relação à sequência de aminoácido da enzima DHFR do tipo selvagem correspondente, proteínas de fusão compreendendo uma enzima DHFR e enzimas DHFR que foram modificadas para prover uma estrutura e/ou função adicional, bem como fragmentos funcionais do acima, que ainda têm pelo menos uma função de uma enzima DHFR. Tais modalidades são bem conhecidas na técnica anterior e, desta maneira, não necessitam ser descritas em detalhes. Por exemplo, uma enzima DHFR pode ser usada como marcador selecionável que é mais ou menos sensível a antifolato tal como MTX do que a enzima DHFR do tipo selvagem e/ou a enzima DHFR endogenamente expressa pela célula hospedeiro se expressa. Respectivas enzimas DHFR são bem conhecidas na técnica anterior e, por exemplo, são descritas na EP 0 246 049 e outros documentos. A enzima DHFR pode ser derivada de qualquer espécie contanto que ela seja funcional dentro da presente invenção, isto é, compatível com a célula hospedeiro de mamífero utilizada. Por exemplo, uma DHFR de camundongo mutante com uma resistência grande a MTX tem sido extensivamente usada como um marcador selecionável dominante em células eucarióticas. Uma enzima DHFR pode ser usada como marcador selecionável que é menos suscetível a um inibidor de DHFR tal como MTX do que a enzima DHFR endogenamente expressa em uma célula hospedeiro DHFR + (plus) e então uma célula hospedeiro que compreende um gene DHFR endógeno funcional. De acordo com uma modalidade, um íntron ou um fragmento do mesmo é posto na extremidade 3’ da estrutura de leitura aberta do gene DHFR. O íntron usado no cassete de expressão de DHFR está levando a uma variante não funcional, menor, do gene DHFR (Grillari e outros, 2001, J. Biotechnol. 87, 59-65). Desta maneira, o nível de expressão do gene DHFR é diminuído, o que aumenta mais a adstringência de seleção. Métodos alternativos que fazem uso de um íntron para reduzir o nível de expressão do gene DHFR são descritos na EP0 724 639 e poderiam ser também usados.

[0087] Um "inibidor de DHFR" se refere em particular a um composto que inibe a atividade de di-hidrofolato redutase (DHFR). Um respectivo inibidor pode, por exemplo, competir com o substrato de DHFR para ligação a DHFR. Inibidores de DHFR adequados são, por exemplo, antifolatos tais como metotrexato (MTX). Desta maneira, de acordo com uma modalidade, o estágio (b) compreende realização de uma etapa de seleção para DHFR através do cultivo da dita pluralidade de células hospedeiro em um meio de cultura seletivo que compreende pelo menos um inibidor de DHFR, tal como preferivelmente uma antifolato. Respectivas condições de seleção são conhecidas do versado na técnica. De acordo com uma modalidade, um meio de cultura seletivo é usado no estágio (b) que compreende um antifolato em uma concentração de 1500 nM ou menos, 1250 nM ou menos, 1000 nM ou menos, 750 nM ou menos, 500 nM ou menos, 250 nM ou menos, 200 nM ou menos, 150 nM ou menos, 125 nM ou menos, 100 nM ou menos ou 75 nM ou menos. A concentração usada de dito inibidor no meio de cultura seletivo (que pode também ser aumentado gradualmente) determina a adstringência das condições de seleção. Faixas de concentração preferidas para o antifolato podem ser selecionadas de 500nM - 0,1nM, 350nM - 1nM, 200nM - 2,5nM, 150nM - 5nM, 100nM - 7,5nM e 75nM - 10 nM. De acordo com uma modalidade, o meio de cultura seletivo compreende MTX como antifolato. Como é mostrado pelos exemplos, concentrações de MTX baixas podem ser usadas em conjunto com as células eucarióticas descritas aqui para realização de uma seleção de HDFR, em particular se seleção for realizada em combinação com uma concentração limitante de folato.

[0088] De acordo com uma modalidade, as células hospedeiro de acordo com a presente invenção providas no estágio (a) compreendem um polinucleotídeo heterólogo codificando um transportador de folato como marcador selecionável. Um sistema de seleção baseado em transportador de folato tem várias vantagens quando sendo usado em conjunto com células eucarióticas que são dependentes de absorção de folato tais como células de mamífero. Um transportador de folato permite importar pelo menos um folato do meio de cultura para a célula hospedeiro que preferivelmente é uma célula de mamífero. De acordo com uma modalidade, o transportador de folato é ou compreende o carreador de folato reduzido (RFC). RFC é uma glicoproteína de membrana ubiquamente expressa que serve como o transportador principal para a absorção de folatos reduzidos tal como 5-metil-THF e 5-formil-THF na célula. No entanto, RFC exibe uma afinidade muito pobre com o folato oxidado, ácido fólico. Desta maneira, as células que não têm a expressão de RFC ou foram deletadas do locus de RFC genômico podem servir como recipientes para a transfecção do RFC de gene marcador selecionável sob condições onde folatos reduzidos tais como 5-formil-THF são gradualmente privados do meio de crescimento, desta maneira permitindo identificar células que expressam níveis aumentados deste transportador de folato e consequentemente o produto de interesse. Condições de seleção adequadas quando usando RFC como marcador selecionável são conhecidas do versado na técnica e são, por exemplo, descritas no WO2006/059323.

[0089] De acordo com uma modalidade que é também descrita em detalhes abaixo e na seção de exemplos, o transportador de folato usado como marcador selecionável é um receptor de folato. Um sistema de seleção baseado em receptor de folato tem várias vantagens. Por exemplo, para seleção, quaisquer substâncias tóxicas são necessárias (embora elas possam ser usadas) e, ainda, o receptor de folato endógeno da célula hospedeiro não precisa ser inativado. Ainda, este sistema de expressão funciona particularmente bem em conjunto com a linhagem de célula eucariótica descrita aqui, onde o efeito do produto de expressão de gene C12orf35 é reduzido ou eliminado, preferivelmente através da redução ou eliminação da expressão do gene C12orf35. Uma explicação é que genes introduzidos, tal como o polipeptídeo de interesse, mas também genes marcadores selecionáveis, são expressos em uma taxa maior que simplifica a seleção.

[0090] Um "receptor de folato" conforme aqui usado se refere a um receptor de folato que é funcional e então capaz de importação ou absorção de um folato ou derivado do mesmo para a célula eucariótica. Preferivelmente, o receptor é capaz de importação ou absorção unidirecional de folato ou um derivado de folato para a célula eucariótica. Ainda, o receptor de folato conforme usado aqui é ligado à membrana. Desta maneira, os receptores de folato descritos aqui são receptores de folato ligados à membrana funcionais. Ancoragem à membrana pode ser obtida, por exemplo, através de uma âncora de transmembrana ou através de uma âncora de GPI. Uma âncora de GPI é preferida uma vez que ela corresponde ao ambiente natural de receptor de folato ligado à membrana. Receptores de folato (FRs) são glicoproteínas de ligação a folato de alta afinidade. Eles são codificados por três genes distintos FR alfa, FR beta e FR gama. FR alfa e FR beta são glicoproteínas de superfície celular, ancoradas em glicosilfosfatidinilinositol (GPI), enquanto FR gama é destituída de uma âncora de GPI e é uma proteína secretada. No entanto, ele pode ser geneticamente alterado para incluir uma âncora de transmembrana ou uma âncora de GPI. Tal forma alterada de um FR gama que inclui uma âncora de membrana é também considerada um receptor de folato ligado à membrana se ele for capaz de importação ou absorção de um folato ou derivado do mesmo para uma célula eucariótica. O termo "receptor de folato" também inclui mutantes ligados à membrana de receptores de folato do tipo selvagem que são capazes de absorção de folato e proteínas de fusão compreendendo um respectivo receptor de folato.

[0091] O receptor de folato utilizado pode ser derivado de um receptor de folato de qualquer espécie contanto que ele seja funcional dentro da presente invenção, isto é, ele seja compatível com a célula hospedeiro que é utilizada e quando sendo expresso na célula hospedeiro transfectada, incorpora folato, em particular ácido fólico, a partir do meio de cultura para a célula hospedeiro que é dependente da absorção de folato. Em geral, o receptor de folato que é introduzido na célula hospedeiro como marcador selecionável pode ser homólogo ou heterólogo para um receptor de folato endógeno da célula hospedeiro (se um receptor de folato endógeno estiver presente o que é preferido). Se ele for homólogo, ele será derivado da mesma espécie que a célula hospedeiro. Se ele for heterólogo, ele será derivado de outras espécies que não a célula hospedeiro. Por exemplo, um receptor de folato humano pode ser usado como um marcador selecionável para uma célula hospedeiro de roedor, por exemplo, uma célula de hamster tal como uma célula CHO. Preferivelmente, um receptor de folato derivado de uma espécie de mamífero é usado, por exemplo, derivado de um roedor, tal como camundongo, rato ou hamster ou, mais preferido, derivado de um humano. O receptor de folato ligado à membrana usado como marcador selecionável pode ser selecionado do grupo consistindo em um receptor de folato alfa, um receptor de folato beta e um receptor de folato gama. De acordo com uma modalidade, um receptor de folato alfa humana é usado como marcador selecionável.

[0092] O uso de um receptor de folato ligado à membrana como transportador de folato é vantajoso porque células podem ser usadas, que expressam endogenamente seus próprios receptores de folato e ácido fólico pode ser processado pelo receptor de folato. Receptores de folato ligados à membrana adequados que podem ser usados como marcadores selecionáveis para células eucarióticas que são dependentes de absorção de folato tais como células de mamífero e condicoes de seleção adequadas são também descritos no WO2009/080759, aqui incorporado a título de referência. De acordo com uma modalidade, o receptor de folato alfa humano do tipo selvagem maduro é usado, o qual compreende a sequência de aminoácido que segue mostrada na SEQ ID NO: 20 (código de 1 letra, mostrada na direção do terminal N para o terminal C).

[0093] Receptor de folato alfa está naturalmente ancorado à membrana celular por uma âncora de GPI. A sequência de sinal para uma âncora de GPI não é mostrada na SEQ ID NO: 20. De acordo com uma modalidade, o receptor de folato alfa que é derivado de ou compreende SEQ ID NO: 20 compreende um sinal de âncora de GPI no terminal C. Qualquer sinal de âncora de GPI adequado pode ser usado. A sequência de sinal de âncora de GPI natural de receptor de folato alfa humano é mostrada na SEQ ID NO: 21 (código de 1 letra, mostrada na direção do terminal N para o terminal C).

[0094] Ancoragem à membrana pode ser alternativamente obtida usando uma âncora de membrana, por exemplo, uma âncora de transmembrana. Nesta modalidade, o receptor de folato compreende uma âncora de membrana em seu terminal C. Âncoras adequadas são conhecidas na técnica anterior. O receptor de folato alfa que é derivado de ou compreende SEQ ID NO: 20 pode compreender uma sequência líder no terminal N. Qualquer sequência líder adequada pode ser usada, que assegure expressão funcional do receptor de folato.

[0095] A sequência de aminoácido integral incluindo a sequência líder natural (no terminal N) e a sequência de sinal de âncora de GPI natural (no terminal C) do receptor de folato alfa humano do tipo selvagem é mostrada na SEQ ID NO: 22 (código de 1 letra, mostrado na direção do terminal N para o terminal C).

[0096] De acordo com uma modalidade, o receptor de folato ligado à membrana tem ou compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 20 ou 22 ou é uma variante funcional do acima que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de homologia ou identidade com SEQ ID NO: 20 ou 22, e é ligado à membrana e é capaz de absorção de ácido fólico na célula.

[0097] Quando usando uma célula eucariótica que é dependente de absorção de folato tal como uma célula hospedeiro de mamífero, que compreende um polinucleotídeo heterólogo codificando um transportador de folato, preferivelmente um receptor de folato, o estágio (b) compreende uma etapa de seleção onde a dita pluralidade de células hospedeiro é culturada em um meio de cultura seletivo compreendendo folato em uma concentração limitante. Uma "concentração limitante de folato" conforme aqui usado se refere em particular a uma concentração de folato(s) no meio de cultura seletivo que provê uma pressão seletiva sobre a célula hospedeiro. Sob tais condições de seleção, apenas células hospedeiro que incorporaram o vetor de expressão crescem e proliferam e, desta maneira, expressam o transportador de folato como marcador selecionável. Desta maneira, folatos não são compreendidos no meio de cultura seletivo em abundância, e esta limitação de folato(s) no meio de cultura provê uma pressão de seleção sobre as células hospedeiro. O folato compreendido no meio de cultura seletivo em uma concentração limitante é capaz de ser absorvido na e ser processado pela célula hospedeiro, em particular por células hospedeiro que incorporaram o transportador de folato que é usado como marcador selecionável. Folatos e em particular derivados de folato que não seriam ou não podem ser processados pela célula hospedeiro não contribuem para a pressão de seleção que é exercida nas células hospedeiro que incorporaram o transportador de folato como marcador selecionável e desta maneira não contribuem para a concentração limitante de folato. No entanto, respectivos folatos, tais como, por exemplo, antifolato, podem estar presentes e ainda preferivelmente estão presentes, se uma seleção combinada com DHFR for realizada como será subsequentemente descrito. O folato presente no meio de cultura seletivo em uma concentração limitante pode ser, por exemplo, um folato oxidado ou um folato reduzido ou um derivado do mesmo. Folatos oxidados, tal como ácido fólico, bem como derivados reduzidos de ácido fólico, conhecidos como folatos reduzidos ou tetraidrofolatos (THF), são um grupo de vitaminas B-9 que são co- fatores e/ou co-enzimas essenciais para a biossíntese de purinas, timidilato e certos aminoácidos em células eucarióticas que são dependentes de absorção de folato tais como células de mamífero. Co-fatores de THF são particularmente cruciais para replicação de DNA e desta maneira proliferação celular. Preferivelmente, o folato que é compreendido em uma concentração limitante no meio de cultura seletivo é ácido fólico. Faixas de concentração adequadas para provisão de uma concentração limitante de folato são descritas abaixo.

[0098] O sistema de seleção baseado em transportador de folato ébaseado na disponibilidade limitada de folato, preferivelmente ácido fólico, no meio de cultura de célula. Células hospedeiro que não incorporaram com sucesso o(s) vetor(es) de expressão e desta maneira não expressam quantidades suficientes do transportador de folato, que preferivelmente é um receptor de folato, morrem ou são prejudicados em crescimento sob as condições de cultura seletivas comparado com as células hospedeiro que incorporaram com sucesso o(s) vetor(es) de expressão. Como é mostrado pelos exemplos, uso de uma seleção baseada em receptor de folato em combinação com as células eucarióticas descritas aqui permite seleção, avaliação e estabelecimento acelerados de clones de célula eucariótica que superexpressam níveis altos de produtos recombinantes de interesse tais como polipeptídeos.

[0099] O meio de cultura seletivo que é usado no estágio (b), respectivamente usado em uma subetapa da estágio (b), para seleção contra um receptor de folato como marcador selecionável pode compreender folato e em particular ácido fólico em uma concentração selecionada de: (a) cerca de 5000nM - 0,1nM; (b) cerca de 2500nM - 0,1nM; (c) cerca de 1500nM - 0,1nM; (d) cerca de 1000nM- 0,1nM; (e) cerca de 750nM - 0,1nM; (f) cerca de 500nM - 0,1nM; (g) cerca de 250nM - 0,2nM; preferivelmente cerca de 250nM - 1nM ou cerca de 250nM - 2,5nM; (h) cerca de 150nM - 0,3nM; preferivelmente cerca de 150nM - 1nM ou cerca de 150nM - 2,5nM; (i) cerca de 100nM - 0,5nM; preferivelmente cerca de 100nM - 1nM ou cerca de 100nM - 2,5nM; (j) cerca de 75nM - 0,6nM, preferivelmente cerca de 75nM - 1nM ou cerca de 75nM - 2,5nM; (k) cerca de 50nM - 1nM; preferivelmente cerca de 50nM - 2,5nM ou cerca de 50nM - 5nM; (l) cerca de 35nM - 0,75nM; e (m) cerca de 25nM - 1nM ou cerca de 25nM - 2,5nM, cerca de 20nM - 3nM cerca de 15nM - 4nM ou 10nM - 5nM.

[00100] As concentrações e faixas de concentração conforme acima descrito são particularmente adequadas para crescimento rápido de células de mamífero em suspensão, tais como células CHO, que é uma modalidade preferida para linhagens de célula de produção comercial. No entanto, linhagens de célula diferentes podem ter propriedades de consumo de ácido fólico diferentes. Concentrações adequadas, no entanto, podem ser facilmente determinadas experimentalmente pelo versado na técnica. O folato compreendido no meio de cultura seletivo é preferivelmente ácido fólico e de acordo com uma modalidade, ácido fólico é o único folato compreendido no meio de cultura seletivo que contribui para a concentração limitante de folato.

[00101] De acordo com uma modalidade, as células hospedeiro providas no estágio (a) compreendem um polinucleotídeo heterólogo codificando um transportador de folato como primeiro marcador sele- cionável e um polinucleotídeo heterólogo codificando um segundo marcador selecionável que possui um substrato que é um folato, um derivado de um folato e/ou um produto que pode ser obtido através do processamento de folato. Por exemplo, o segundo marcador selecionável pode ser uma di-hidrofolato redutase (DHFR) ou uma enzima operando a jusante ou em conjunto com DHFR tal como timidilato sintase (TS) e serina hidroximetiltransferase (SHMT). Preferivelmente, um receptor de folato ligado à membrana é usado como primeiro marcador selecionável e o segundo marcador selecionável é uma di-hidrofolato redutase (DHFR). De acordo com esta modalidade, o estágio (b) compreende cultura das células hospedeiro em um meio de cultura seletivo que compreende folato, preferivelmente ácido fólico, em uma concentração limitante e compreende pelo menos um inibidor de DHFR tal como, por exemplo, MTX. Como é mostrado pelos exemplos, quando usando as linhagens de célula eucariótica descritas aqui como células hospedeiro para expressão recombinante em combinação com tal seleção baseada em receptor de folato/DHFR, resultados de expressão altos e homogêneos são obtidos já no nível de grupo de célula. Como é mostrado na seção de exemplo, uma expressão 7 ou 8 vezes maior em nível de grupo poderia ser obtida já com concentrações de inibidor de DHFR baixas. O aumento significante em título de grupo é vantajoso, por exemplo, quando pretendendo produzir quantidades menores de um polipeptídeo de interesse rapidamente uma vez que podem ser usados grupos de célula selecionados para produção, o que economiza tempo para estabelecimento de uma linhagem de célula clonal. Ainda, como o número de células de expressão alta no grupo é significantemente aumentado, obtenção de clones de célula de produção alta a partir do dito grupo de célula é simplificado. Menos clone de célula precisam ser feitos, o que reduz o esforço de avaliação. Modalidades adequadas do receptor de folato e DHFR bem como condições de seleção e concentrações adequadas são descritas acima e é referida a descrição acima que também se aplica aqui. As concentrações descritas e faixas de concentração para folato e antifolato descritas acima podem ser combinadas umas com as outras. Em uma modalidade, uma concentração de folato de cerca de 0,1nM - 150nM, 1nM - 125nM, 5nM - 100nM ou 7,5nM a 75nM é usada em combinação com uma concentração de antifolato de 0,1nM - 150nM, 1nM a 125nM, 2,5nM a 100nM, 5nM a 75nM ou 7,5nM a 50nM no meio de cultura seletivo. Como descrito, ácido fólico é preferivelmente usado como folato e MTX como antifolato.

[00102] Uso de uma respectiva combinação de um receptor de folato e DHFR como marcador selecionável e aplicação no estágio (b) das condições de seleção para ambos os marcadores simultaneamente usando um meio de cultura seletivo apropriado resulta em um sistema de seleção muito adstringente que permite o enriquecimento eficiente de células de produção alta a partir da população de célula hospedeiro transfectada. A viabilidade da célula hospedeiro é consideravelmente aumentada sob condições seletivas, se ambos os marcadores selecionáveis forem fortemente expressos. Desta maneira, células eucarióticas dependentes de absorção de folato tais como células de mamífero podem ser selecionadas, as quais mostram uma taxa de expressão aumentada do produto de interesse. Este conceito de uso de um receptor de folato como marcador selecionável em combinação com um marcador selecionável adicional envolvido no metabolismo de folato tal como preferivelmente um DHFR é revelado no WO 2010/097240, aqui incorporado a título de referência. Como é mostrado pelos exemplos, a alta adstringência do sistema de seleção de acordo com esta modalidade pode ser combinada vantajosamente com as células eucarióticas descritas aqui onde o efeito do produto de expressão do gene C12orf35 é prejudicado, preferivelmente através de redução ou eliminação da expressão do dito gene. Esta combinação diminui mais o número de produtores baixos e uma população mais homogênea de células de produção alta pode ser obtida após seleção. Isto inter alia simplifica clonagem de célula única de células de produção alta. Ainda, esta combinação permite reduzir significantemente a concentração de MTX necessária para seleção de DHFR.

[00103] De acordo com uma modalidade, duas ou mais etapas de seleção são realizadas no estágio (b), onde as duas ou mais etapas de seleção são baseadas no mesmo princípio de seleção ou um diferente. Por exemplo, se um marcador selecionável adicional for usado em adição ao receptor de folato e/ou DHFR, as condições seletivas para o dito marcador selecionável adicional podem ser aplicadas antes da (por exemplo, em uma etapa de pré-seleção) ou simultaneamente com aplicação das condições seletivas para o receptor de folato e/ou DHFR. Por exemplo, no caso do gene de neomicina fosfotransferase (neo) ser usado como marcador selecionável adicional, o estágio (b) pode compreender primeiro cultivo das células em um meio, por exemplo, contendo G418 a fim de selecionar células que incorporaram o vetor de expressão ou a combinação de pelo menos dois vetores de expressão e então realização de uma etapa de seleção usando um meio de cultura seletivo compreendendo uma concentração limitante de folato e um inibidor do segundo marcador selecionável, tal como, por exemplo, MTX quando usando DHFR como segundo marcador selecionável.

[00104] De acordo com uma modalidade, uma seleção baseada em citometria de fluxo é realizada no estágio (b). Uma etapa de seleção empregando citometria de fluxo, em particular classificação de célula ativada por fluorescência (FACS), tem a vantagem que números grandes de célula podem ser avaliados rapidamente quanto ao rendimento de expressão característico desejado.

[00105] De acordo com uma modalidade, a dita seleção baseada em citometria de fluxo é realizada em adição a, preferivelmente após, uma ou mais etapas de seleção contra um ou mais gene(s) marcador(es) selecionável(eis) terem sido realizadas. Desta maneira, clones de célula de expressão alta podem ser identificados na população de células transfectadas com sucesso e separados.

[00106] De acordo com uma modalidade, células de expressão alta são identificadas através da detecção da expressão de um polipeptídeo repórter co-expresso tal como, por exemplo, proteína verde fluorescente (GFP), CFP, YFP, luciferase ou outro polipeptídeo repórter comum que pode ser detectado através de citometria de fluxo. De acordo com esta modalidade, o estágio (a) compreende provisão de uma pluralidade de células hospedeiro compreendendo pelo menos um polinucleotídeo heterólogo codificando um repórter e o estágio (b) compreende identificação de células hospedeiro expressando o repórter baseado em pelo menos uma característica do dito polipeptídeo repórter usando citometria de fluxo. Em tal seleção baseada em repórter, a expressão do gene repórter se relaciona com a expressão do produto de interesse. O polipeptídeo repórter pode estar intracelularmente localizado, desta maneira marcando a célula de expressão. De acordo com uma modalidade, a expressão do polipeptídeo repórter é firmemente ligada à expressão do produto de interesse que é um polipeptídeo. Por exemplo, o polipeptídeo repórter e o polipeptídeo de interesse podem ser expressos como polipeptídeos separados, mas a partir do mesmo cassete de expressão, no entanto, separados por um elemento IRES (sítio de entrada ribossomal interno). Ainda, o polipeptídeo repórter e o polipeptídeo de interesse podem ser expressos como proteína de fusão. De acordo com uma modalidade, no cassete de expressão para expressão do polipeptídeo de interesse, o polinucleotídeo codificando o polipeptídeo de interesse é separado por pelo menos um códon de parada do polinucleotídeo codificando o repórter. Uma proteína de fusão compreendendo o polipeptídeo repórter é apenas expressa se tradução ler o códon de parada. Como a leitura do códon de parada ocorre apenas até certo ponto, o que pode ser influenciado pelo número e projeto do códon de parada e pelas condições de cultura, uma certa proporção do polipeptídeo de interesse é produzida como proteína de fusão compreendendo o polipeptídeo repórter que pode ser detectado através de citometria de fluxo. Uso de uma respectiva estratégia permite ligar firmemente a expressão do polipeptídeo repórter à expressão do polipeptídeo de interesse. O princípio de obtenção de proteínas de fusão através de leitura do códon de parada será também explicado subsequentemente em conjunto com uma modalidade onde uma proteína de fusão (não necessariamente compreendendo um repórter) é exibida na superfície celular e, por exemplo, é tingida usando um composto de detecção. Para expressão de um polipeptídeo secretado de interesse pode ser ainda incluído um polinucleotídeo codificando uma âncora de membrana ou entre o códon de parada e o polinucleotídeo codificando o repórter ou a jusante do polinucleotídeo codificando o repórter. A âncora de membrana assegura que o polipeptídeo repórter permaneça associado com a célula de expressão. Desta maneira, o polipeptídeo repórter compreendido na proteína de fusão provê as células de expressão com uma característica que é selecionável através de citometria de fluxo. O polipeptídeo de interesse é expresso no meio de cultura. Quando maior, por exemplo, a fluorescência do polipeptídeo repórter, mais a proteína de fusão é produzida e, consequentemente, maior é a taxa de expressão do polipeptídeo de interesse. Um respectivo método é, por exemplo, revelado no WO 03/014361 que é referido.

[00107] De acordo com uma modalidade, o estágio (b) compreende:

[00108] (i) realização de pelo menos uma seleção sob condições seletivas para um ou mais marcadores selecionáveis expressos pelas células hospedeiro transfectadas; e

[00109] (ii) realização de uma seleção baseada em citometria de fluxo.

[00110] Opcionalmente, uma ou mais etapas de seleção adicionais podem ser realizadas antes da ou após a etapa (i) e/ou etapa (ii).

[00111] De acordo com uma modalidade, a seleção baseada em citometria de fluxo compreende seleção de uma pluralidade de células hospedeiro expressando o polipeptídeo de interesse com um rendimento desejado com base na presença ou quantidade do polipeptídeo de interesse. Preferivelmente, o polipeptídeo de interesse é um polipeptídeo secretado. De acordo com uma modalidade, o polipeptídeo de interesse é detectado na superfície celular usando um composto de detecção que se liga ao polipeptídeo de interesse. De acordo com uma modalidade, o polipeptídeo de interesse secretado é detectado enquanto ele passa pela membrana celular e deste modo é transientemente associado com a membrana plasmática durante secreção de polipeptídeo. Um respectivo sistema de seleção baseado em citometria de fluxo é, por exemplo, revelado no WO03/099996 que é referido.

[00112] De acordo com uma modalidade, uma porção do polipeptídeo de interesse é expressa fundida a uma âncora de membrana e então é expressa como polipeptídeo de fusão ligado à membrana. Desta maneira, uma porção do polipeptídeo é exibida como polipeptídeo de fusão sobre a superfície celular e pode ser tingida usando um composto de detecção. Nenhum polipeptídeo repórter é requerido para este tipo de seleção embora ele possa ser adicionalmente usado. Devido à presença da âncora de membrana, o polipeptídeo de interesse é firmemente ancorado à célula de expressão. Como a quantidade de polipeptídeo de fusão produzido se relaciona com a taxa de expressão total da célula de expressão, células hospedeiro podem ser selecionadas através de citometria de fluxo com base na quantidade de polipeptídeo de fusão exibido através da âncora da membrana na superfície celular. Isto permite uma seleção rápida de células hospedeiro de produção alta. Para permitir seleção eficiente usando citometria de fluxo, preferivelmente usando FACS, é vantajoso usar projetos de cassete de expressão especiais para expressão do polipeptídeo de interesse. Desta maneira, de acordo com uma modalidade, o polinucleotídeo codificando o polipeptídeo de interesse é compreendido em um cassete de expressão que é projetado de maneira que uma porção do polipeptídeo de interesse expresso compreende uma âncora de membrana. O polipeptídeo de interesse que é fundido a uma âncora de membrana é também referido como um polipeptídeo de fusão ou proteína de fusão. Várias opções existem para obter este resultado.

[00113] De acordo com uma modalidade, as células hospedeiro providas no estágio (a) compreendem

[00114] (i) um cassete de expressão heterólogo compreendendo

[00115] aa) o polinucleotídeo codificando um polipeptídeo de interesse,

[00116] bb) pelo menos um códon de parada a jusante do polinucleotídeo codificando o polipeptídeo de interesse, e

[00117] cc) um polinucleotídeo adicional a jusante do códon de parada codificando uma âncora de membrana e/ou um sinal para uma âncora de membrana; e

[00118] (ii) pelo menos um cassete de expressão heterólogo compreendendo um polinucleotídeo codificando um marcador selecionável;

[00119] e seleção no estágio (b) compreende

[00120] (i) cultura das ditas células hospedeiro sob condições seletivas para o pelo menos um marcador selecionável e permitir expressão do polipeptídeo de interesse onde pelo menos uma porção do polipeptídeo de interesse é expressa como polipeptídeo de fusão compreendendo uma âncora de membrana, onde o dito polipeptídeo de fusão é exibido na superfície da dita célula hospedeiro;

[00121] (ii) realização de uma seleção baseada em citometria de fluxo, compreendendo seleção de uma pluralidade de células hospedeiro expressando o polipeptídeo de interesse com um rendimento desejado com base na presença ou quantidade do polipeptídeo de fusão exibido na superfície celular usando citometria de fluxo.

[00122] Transcrição do polinucleotídeo codificando o polipeptídeo de interesse compreendido no cassete de expressão descrito acima resulta em um transcrito compreendendo em ordem consecutiva pelo menos

[00123] aa) um polinucleotídeo, onde tradução do dito polinucleotídeo resulta no polipeptídeo de interesse;

[00124] bb) pelo menos um códon de parada a jusante do dito polinucleotídeo;

[00125] cc) um polinucleotídeo a jusante do dito códon de parada, codificando uma âncora de membrana e/ou um sinal para uma âncora de membrana.

[00126] Pelo menos uma porção do transcrito é traduzida em um polipeptídeo de fusão compreendendo o polipeptídeo de interesse e a âncora de membrana através da leitura traducional do pelo menos um códon de parada. Este projeto do cassete de expressão que é usado nesta modalidade tem o efeito que através de processos de leitura traducionais (o códon de parada é "leaky") uma porção definida do polipeptídeo de interesse é produzida como um polipeptídeo de fusão compreendendo uma âncora de membrana. Desta maneira, pelo menos uma porção do transcrito é traduzida em um polipeptídeo de fusão compreendendo o polipeptídeo de interesse e a âncora de membrana através de leitura traducional do pelo menos um códon de parada. Leitura traducional pode ocorrer naturalmente devido à escolha do códon de parada/projeto do sinal de terminação traducional ou pode ser induzida através da adaptação das condições de cultura, por exemplo, usando um agente de supressão de terminação. Este nível de leitura resulta em uma certa proporção de polipeptídeos de fusão. Estes polipeptídeos de fusão compreendem uma âncora de membrana, que âncora firmemente os polipeptídeos de fusão à superfície celular. Como resultado, o polipeptídeo de fusão está sendo exibido sobre a superfície celular e células exibindo níveis altos de polipeptídeo de fusão ancorado à membrana podem ser selecionadas através de citometria de fluxo, preferivelmente através de FACS. Desta maneira, células hospedeiro são selecionadas, as quais expressam o polipeptídeo de interesse com alto rendimento. Detalhes e modalidades preferidas desta tecnologia baseada em leitura de códon de parada são descritos no WO2005/073375 e WO 2010/022961 e é referido a esta descrição para detalhes.

[00127] De acordo com uma modalidade, o cassete de expressão compreende ainda iv) um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo repórter, tal como GFP. O dito polinucleotídeo codificando o polipeptídeo repórter está localizado a jusante do códon de parada. Quando da leitura do códon de parada um polipeptídeo de fusão é obtido, o qual compreende o repórter, desta maneira permitindo seleção através de citometria de fluxo com base nas características do polipeptídeo repórter tal como, por exemplo, fluorescência. Detalhes da dita modalidade já estão descritos acima e é referida a descrição acima. Preferivelmente, o polinucleotídeo codificando o polipeptídeo repórter está localizado a jusante do polipeptídeo codificando uma âncora de membrana.

[00128] De acordo com uma modalidade alternativa, uma porção do polipeptídeo de interesse é expressa como polipeptídeo de fusão exibido na superfície celular usando tecnologia descrita no WO2007/131774. Aqui, através de transcrição e processamento de transcrito pelo menos dois mRNAs maduros diferentes (mRNA- polipeptídeo de interesse) e (mRNA-polipeptídeo de interesse-âncora) são obtidos a partir do cassete de expressão codificando o polipeptídeo de interesse. Tradução do mRNA-polipeptídeo de interesse resulta no polipeptídeo de interesse. Tradução do mRNA- polipeptídeo de interesse-âncora resulta em um polipeptídeo de fusão compreendendo o polipeptídeo de interesse e uma âncora de membrana. Como resultado, este polipeptídeo de fusão é novamente exibido na superfície celular e células exibindo níveis altos de polipeptídeo de fusão ancorado à membrana podem ser selecionadas através de citometria de fluxo, preferivelmente FACS. Desta maneira, novamente células hospedeiro podem ser selecionadas, as quais têm uma taxa de expressão alta. De acordo com uma modalidade, o cassete de expressão compreende ainda um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo repórter, tal como, por exemplo, GFP. O dito polinucleotídeo codificando o polipeptídeo repórter está localizado a jusante do íntron. Desta maneira, um polipeptídeo de fusão é obtido, o qual compreende o polipeptídeo repórter, desta maneira permitindo seleção através de citometria de fluxo com base nas características do polipeptídeo repórter tal como, por exemplo, sua fluorescência. Preferivelmente, o polinucleotídeo codificando o polipeptídeo repórter está localizado a jusante do polinucleotídeo codificando uma âncora de membrana. Desta maneira, o repórter está localizado dentro da célula hospedeiro.

[00129] Ambas as modalidades exemplares descritas acima resultam em que uma porção do polipeptídeo de interesse é expressa como polipeptídeo de fusão que é exibido na superfície das células hospedeiro, e células exibindo níveis altos de polipeptídeos de fusão ancorados à membrana (indicando um nível alto de polipeptídeo secretado) podem ser selecionadas, por exemplo, através de citometria de fluxo, em particular através de classificação de célula ativada por fluorescência (FACS). Aqui, modalidades diferentes estão disponíveis. Por exemplo, se um polipeptídeo repórter estiver compreendido no polipeptídeo de fusão, células hospedeiro de expressão alta podem ser selecionadas com base em uma característica do polipeptídeo repórter, por exemplo, sua fluorescência. Ainda, compostos de detecção apropriadamente marcados podem ser usados como será descrito rapidamente abaixo.

[00130] De acordo com uma modalidade, o estágio b) compreende seleção de uma pluralidade de células hospedeiro eucarióticas expressando o polipeptídeo de interesse com um rendimento desejado com base na presença ou quantidade do polipeptídeo de fusão exibido sobre a superfície celular usando citometria de fluxo através de contato das células hospedeiro com um composto de detecção ligando o polipeptídeo de fusão exibido na superfície celular e seleção de uma pluralidade de células hospedeiro expressando o polipeptídeo de interesse com um rendimento desejado com base na presença ou quantidade do composto de detecção ligado usando citometria de fluxo. Desta maneira, células podem ser contatadas com um composto de detecção apropriadamente marcado que se liga à proteína de fusão, por exemplo, a porção correspondendo ao polipeptídeo de interesse. O composto de detecção usado para ligação ao polipeptídeo de fusão pode ter pelo menos uma das características que seguem: o dito composto pode ser marcado, em particular fluorescentemente marcado, ele pode ser um antígeno, ele pode ser uma molécula de imunoglobulina ou um fragmento de ligação da mesma ou ele pode ser uma proteína-A, -G ou -L. O composto de detecção usado para ligação do polipeptídeo de fusão na superfície celular pode ser, por exemplo, uma molécula de imunoglobulina ou um fragmento da mesma tal como um anticorpo ou fragmento de anticorpo, reconhecendo o polipeptídeo de fusão. Basicamente todas as porções acessíveis do polipeptídeo de fusão podem ser detectadas, a esse título também a porção correspondendo ao polipeptídeo de interesse que é secretada em paralelo ao polipeptídeo de fusão em forma solúvel. A fim de permitir detecção e seleção, o dito composto de detecção usado para ligação ao polipeptídeo de fusão pode ser marcado. O composto de detecção marcado que se liga ao polipeptídeo de fusão exibido na superfície celular então marca, respectivamente tinge, a superfície celular. Quanto maior a quantidade de polipeptídeo de fusão que é expresso pela célula hospedeiro, mais composto de detecção marcado é ligado e mais intenso é o tingimento. Isto tem a vantagem que seleção baseada em citometria de fluxo das células hospedeiro pode ser facilmente realizada uma vez que não apenas a presença, mas também a quantidade, do composto de detecção ligado pode ser determinada. Para selecionar células hospedeiro de produção alta, estas células hospedeiro podem ser selecionadas da população de célula hospedeiro que são mais efetivamente, respectivamente intensivamente marcadas pelo composto de detecção. O marcador é adequado para seleção baseada em citometria de fluxo, em particular seleção FACS. Um marcador fluorescente é preferido uma vez que isto permite detecção fácil através de citometria de fluxo.

[00131] De acordo com uma modalidade, o cassete de expressão é construído de maneira que aproximadamente < 50%, < 25%, < 15%, < 10%, < 5%, < 2,5%, < 1,5%, < 1% ou menos de < 0,5% de polipeptídeo de fusão são obtidos. A porção restante é produzida como a forma de polipeptídeo secretado não compreendendo a âncora de membrana.

[00132] A âncora de membrana pode ser de qualquer tipo contanto que ela permita ancoragem do polipeptídeo de interesse à membrana celular e então permita a exibição do polipeptídeo de fusão sobre a superfície celular. Modalidades adequadas incluem, mas não estão limitadas a, uma âncora de GPI ou uma âncora de transmembrana. Uma âncora de transmembrana é preferida para assegurar ligação firme do polipeptídeo de fusão à superfície celular e evitar perda da proteína de fusão. Particularmente preferido, em particular quando expressando anticorpos como polipeptídeo de interesse, é o uso de uma âncora de transmembrana de imunoglobulina. Outras âncoras de membrana e modalidades preferidas de uma âncora de transmembrana de imunoglobulina são descritas nos WO2007/131774, WO2005/073375 e WO 2010/022961.

[00133] De acordo com uma modalidade, as células hospedeiro expressam uma molécula de imunoglobulina tal como um anticorpo como polipeptídeo de interesse. O polinucleotídeo codificando a cadeia pesada de uma molécula de imunoglobulina e o polinucleotídeo codificando a cadeia leve de uma molécula de imunoglobulina podem estar compreendidos no mesmo cassete de expressão ou, preferivelmente, estão compreendidos em cassetes de expressão separados como é descrito acima em conjunto com o primeiro aspecto. Quando usando um projeto de cassete de expressão conforme acima descrito, onde uma porção do polipeptídeo de interesse é produzida como polipeptídeo de fusão ancorado à membrana através de leitura de tradução ou união alternativa, tal projeto é usado para expressão da cadeia pesada de anticorpo.

[00134] De acordo com uma modalidade, dois ou mais ciclos de seleção baseados em citometria de fluxo podem ser realizados no estágio (b) para selecionar e enriquecer células hospedeiro de expressão alta.

[00135] Em uma modalidade, células hospedeiro expressando uma quantidade alta de polipeptídeo de interesse que consequentemente mostram um sinal alto são classificadas usando classificação de célula ativada por fluorescência (FACS). Classificação FACS é vantajosa, uma vez que ela permite avaliação rápida de números grandes de células hospedeiro para identificar e enriquecer aquelas células que expressam o polipeptídeo de interesse com um rendimento alto. Esta modalidade é particularmente adequada se as células forem selecionadas com base na expressão de uma proteína de fusão como descrito acima. Estas células, mostrando a taxa de fluorescência mais alta, podem ser identificadas e isoladas através de FACS. Uma correlação positiva e estatisticamente significante entre fluorescência, conforme determinado através de FACS, e a quantidade de polipeptídeo produzido é encontrada. Desta maneira, classificação FACS pode ser usada não apenas para uma análise qualitativa para identificar células expressando um polipeptídeo de interesse em geral, mas pode ser na verdade usada quantitativamente para identificar aquelas células hospedeiro que expressam níveis altos do polipeptídeo de interesse. Desta maneira as melhores células produtoras podem ser selecionadas/enriquecidas no estágio (b).

[00136] De acordo com uma modalidade, células que expressam o polipeptídeo de interesse com o rendimento desejado, por exemplo, acima de um certo limiar e/ou as 15% melhores, 10% melhores, 5% melhores ou as 2% melhores das células hospedeiro, são selecionadas como grupo. Por exemplo, várias células de expressão alta, por exemplo, pelo menos 10, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 50, pelo menos 100, pelo menos 200, pelo menos 300, pelo menos 500, pelo menos 1000 ou pelo menos 5000 células de expressão alta podem ser selecionadas no estágio (b) e classificadas em um grupo de célula. Este grupo de célula compreendendo uma pluralidade de células de expressão alta diferentes é também referido como grupo de célula de expressão alta. O dito grupo de célula compreendendo células de expressão alta individuais diferentes pode então ser usado a fim de obter clones de célula individuais para produção em grande escala do polipeptídeo de interesse. Como é mostrado pelos exemplos, uso das células hospedeiro de mamífero da invenção onde a expressão do gene C12orf35 é reduzida ou eliminada provê após seleção contra um ou mais marcadores selecionáveis e seleção FACS um grupo de célula com características vantajosas. Por exemplo, os perfis de FACS determinados mostram que tais grupos de célula de expressão alta frequentemente têm um perfil FACS que lembra muito aquele de células que foram obtida de um clone de célula. A redução ou eliminação de expressão de gene C12orf35 provê após transfecção e seleção conforme descrito células hospedeiro que expressam muito uniformemente o produto de interesse com alto rendimento. Isto leva a uma redução significante de clones de produção baixa ou não produção na população de célula selecionada. Ainda, estes grupos de célula podem também ser diretamente usados para produção do polipeptídeo de interesse, por exemplo, para propósitos analíticos ou se quantidades menores forem necessárias, uma vez que títulos de grupo significantemente maiores são obtidos quando usando as células eucarióticas de acordo com a invenção. No entanto, foi constatado que mesmo sem seleção FACS para enriquecimento de grupos de célula de expressão alta, populações de célula com desempenho tipo clone poderiam ser geradas em um tempo muito curto quando usando as linhagens de célula da presente invenção. Esta é uma vantagem importante, por exemplo, se um polipeptídeo de interesse precisar ser rapidamente produzido. Os grupos obtidos foram adequados para propósitos de produção. Uma outra vantagem é que os tempos de seleção são também reduzidos.

[00137] De acordo com uma modalidade, as células eucarióticas providas no estágio (a) são células de mamífero, preferivelmente células de roedor, mais preferivelmente células de hamster, tais como células CHO. Modalidades adequadas e preferidas são descritas acima em conjunto com o primeiro aspecto e é referida a descrição acima. Conforme acima descrito, de acordo com uma modalidade, as ditas células CHO perderam uma porção da região telomérica do cromossomo 8 onde a dita porção perdida compreende o gene C12orf35. Modalidades alternativas são também descritas acima. Vantagem particular é a modalidade onde a dita porção perdida compreende ainda o gene FAM60A. Estas células têm características particularmente favoráveis com relação ao rendimento e estabilidade. De acordo com uma modalidade, o método de acordo com o segundo aspecto compreende como etapa de análise se expressão de gene C12orf35 é reduzida ou eliminada. Tal análise pode ser realizada após seleção, em particular seleção de DHFR. Detalhes de tal método analítico já são descritos acima em conjunto com o primeiro aspecto da presente descrição e são também descritos abaixo em conjunto com o método de acordo com o quinto aspecto e é referido à presente descrição.

[00138] Modalidades preferidas adicionais em particular com relação às células eucarióticas de acordo com o primeiro aspecto que são preferivelmente células de mamífero, o vetor de expressão ou combinação de vetores de expressão são descritas em detalhes acima. É referida a descrição acima.

[00139] Células obtidas como um resultado do método de seleção de acordo com o segundo aspecto podem ser isoladas e culturadas como células individuais. É, no entanto, também possível usar uma população enriquecida de células hospedeiro diferentes, isto é, um grupo de célula, no processo a jusante. As células hospedeiro obtidas podem ser também submetidas à análise qualitativa ou quantitativa adicional ou podem ser usadas, por exemplo, no desenvolvimento de uma linhagem de célula clonal para produção de proteína. Uma linhagem de célula clonal pode ser estabelecida a partir de uma célula hospedeiro selecionada que expressa estavelmente o produto de interesse com rendimento alto.

[00140] Desta maneira, de acordo com uma modalidade, células selecionadas são cultivadas para prover clones de célula, em particular na forma de culturas de célula clonal. Uma cultura de célula clonal é uma cultura de célula derivada de uma célula ancestral única. Em uma cultura de célula clonal, todas as células são clones umas das outras. Preferivelmente, todas as células em uma cultura de célula contêm a mesma ou substancialmente a mesma informação genética. Em certas modalidades, a quantidade ou concentração do polipeptídeo de interesse na cultura de célula é determinada para determinar a produtividade. Por exemplo, o título pode ser medido através da análise do sobrenadante de cultura. De acordo com uma modalidade, após determinação do desempenho de produtividade de cada clone individual, uma classificação de título é feita para selecionar os melhores clones de produção como clones de produção. Ainda, um estudo de estabilidade pode ser realizado com os clones de célula obtidos. No entanto, como é mostrado nos exemplos, uso das células eucarióticas descritas aqui como células hospedeiro e em particular células CHO que perderam uma porção da região telomérica do cromossomo 8 que compreende o gene C12orf35 e o gene FAM60A provê após seleção clones de célula recombinante mostrando uma estabilidade significantemente aperfeiçoada. Desta maneira, perdas em estabilidade de expressão são mais raras com relação a células hospedeiro e ainda, se ocorrerem, frequentemente resultam apenas em uma diminuição menos drástica na produtividade comparado com quando usando células onde expressão funcional de gene C12orf35 e FAM60A não é reduzida ou eliminada. Desta maneira, em modalidades, em particular aquelas onde o efeito de C12orf35 e FAM60A são prejudicados, por exemplo, porque pelo menos uma porção da região telomérica que compreende o gene C12orf35 e o gene FAM60A é perdida, análises de estabilidade podem ser encurtadas ou até mesmo puladas, o que é uma vantagem importante uma vez que encurta o tempo que é requerido para obtenção de clones de célula de expressão estável que podem ser usados para produção em grande escala do produto de interesse.

C. Método para produção de um produto de interesse

[00141] De acordo com um terceiro aspecto, é provido um método para produção de um produto recombinante de interesse compreendendo uso de uma célula eucariótica de acordo com o primeiro aspecto como célula hospedeiro para expressão recombinante de um produto de interesse.

[00142] Como descrito acima, as células eucarióticas providas aqui são particularmente adequadas como células hospedeiro de produção para produzir recombinantemente um produto de interesse tal como um polipeptídeo de interesse. Exemplos adequados e preferidos de dita célula eucariótica, onde o efeito do produto de expressão de gene C12orf35 na dita célula é prejudicado, preferivelmente através da redução ou eliminação da expressão funcional do gene C12orf35, bem como exemplos adequados e preferidos do produto de interesse são descritos em detalhes acima e é referida a descrição acima que também se aplica aqui. Como descrito acima, a célula eucariótica é preferivelmente uma célula de vertebrado, mais preferivelmente uma célula de mamífero. Particularmente vantajosa é a modalidade onde em adição a C12orf35, o efeito de FAM60A é prejudicado na dita célula, por exemplo, através da redução ou eliminação de expressão funcional do gene FAM60A uma vez que foi constatado que desta maneira, a estabilidade de expressão pode ser significantemente aperfeiçoada. A abundância de clones de expressão estável aumenta. Ao prejudicar o efeito de proteína FAM60A bem como de proteína C12orf25, células hospedeiro eucarióticas, preferivelmente células hospedeiro de mamífero, podem ser providas, as quais mostram características aperfeiçoadas com relação a ambas as características, estabilidade a longo prazo bem como rendimento de produção, e então características-chave importantes para a produção em larga escala de um produto de interesse, em particular um polipeptídeo de interesse.

[00143] De acordo com uma modalidade, o método compreende introdução na dita célula eucariótica de um polinucleotídeo codificando um produto de interesse e seleção de uma célula hospedeiro que expressa o produto de interesse. Introdução pode ser conseguida através de transfecção conforme acima descrito. Seleção pode ocorrer usando o método de acordo com o segundo aspecto. Preferivelmente, células hospedeiro são selecionadas onde o polinucleotídeo heterólogo codificando o produto de interesse é estavelmente integrado ao genoma da célula hospedeiro.

[00144] De acordo com uma modalidade, o método compreende

[00145] (a) cultura de células eucarióticas de acordo com o primeiro aspecto que compreendem um polinucleotídeo heterólogo codificando um produto de interesse e/ou uma célula hospedeiro selecionada de acordo com o método de acordo com o segundo aspecto sob condições que permitem a expressão do produto de interesse;

[00146] (b) isolamento do produto de interesse a partir do dito meio de cultura de célula e/ou a partir das ditas células hospedeiro;

[00147] (c) opcionalmente processamento do produto de interesse isolado.

[00148] De acordo com uma modalidade, as ditas células hospedeiro são culturadas sob condições livres de soro. O produto de interesse expresso pode ser obtido através de rompimento das células hospedeiro. Preferivelmente, o produto de interesse é um polipeptídeo. O polipeptídeo é preferivelmente expresso, por exemplo, secretado, no meio de cultura e pode ser obtido a partir do mesmo. Para este propósito, um peptídeo líder apropriado é provido no polipeptídeo de interesse. Sequências líderes e projetos de cassete de expressão para obter secreção são bem conhecidos na técnica anterior. Também uma combinação dos respectivos métodos é possível. Desta maneira, polipeptídeos tais como proteínas podem ser produzidos e obtidos/isolados eficientemente com alto rendimento.

[00149] O produto de interesse que é preferivelmente um polipeptídeo de interesse que é produzido pode ser recuperado, purificado mais, isolado, processado e/ou modificado através de métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser recuperado a partir do meio nutriente através de procedimentos convencionais incluindo, mas não limitado a, centrifugação, filtragem, ultrafiltragem, extração ou precipitação. Etapas de processamento adicionais tais como etapas de purificação podem ser realizadas através de uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica incluindo, mas não limitado a, cromatografia (por exemplo, troca de íon, afinidade, hidrofóbica, cromatofoco e exclusão de tamanho), procedimentos eletroforéticos (por exemplo, foco isoelétrico preparativo), solubilidade diferencial (por exemplo, precipitação de sulfato de amônio) ou extração. Ainda, o polipeptídeo de interesse isolado e purificado pode ser processado mais, tal como, por exemplo, formulado, em uma composição, por exemplo, uma composição farmacêutica.

D. Método para produção de uma linhagem de célula eucariótica

[00150] De acordo com um quarto aspecto, é provido um método para produção de uma célula eucariótica adequada para produção recombinante de um produto de interesse compreendendo prejuízo do efeito do produto de expressão do gene C12orf35 na dita célula. Modalidades adequadas e preferidas para obter este resultado são descritas acima em conjunto com as células eucarióticas de acordo com o primeiro aspecto e é referida a descrição acima que também se aplica aqui. Modalidades não limitantes são novamente descritas rapidamente abaixo.

[00151] De acordo com uma modalidade, o método compreende redução ou eliminação da expressão funcional de gene C12orf35 desta maneira prejudicando o efeito do produto de expressão do gene C12orf35 na dita célula. Meios adequados são descritos acima em conjunto com as células eucarióticas de acordo com o primeiro aspecto da presente descrição e é referida aqui. De acordo com uma modalidade, o genoma da célula eucariótica é alterado para reduzir ou eliminar a expressão funcional do gene C12orf35. Por exemplo, uma inativação de gene pode ser introduzida no gene C12orf35. De acordo com uma modalidade, tal inativação de gene é introduzida em todas as cópias do gene C12orf35. De acordo com uma modalidade, o gene C12orf35 é deletado. Todas as cópias do gene C12orf35 podem ser deletadas no genoma. De acordo com uma modalidade, o método compreende deleção de uma porção de um cromossomo, onde a porção deletada compreende gene C12orf35. A porção deletada pode corresponder a uma região telomérica. Tal deleção pode ser induzida, por exemplo, usando um agente que induz rupturas de cromossomo. Desta maneira, as células podem ser repetidamente tratadas com tal agente a fim de obter células onde a expressão funcional de gene C12orf35 é reduzida ou eliminada, por exemplo, porque todas as cópias do dito gene são deletadas devido às rupturas de cromossomo induzidas.

[00152] De acordo com uma modalidade, a célula eucariótica é uma célula de metazoário, preferivelmente uma célula de vertebrado, mais preferido uma célula de mamífero. De acordo com uma modalidade, a célula de mamífero é uma célula de roedor. Preferivelmente, a célula de roedor é uma célula de hamster tal como uma célula CHO, por exemplo, uma célula CHO derivada de CHO-K1. De acordo com uma modalidade, o método compreende deleção de pelo menos uma porção da região telomérica do cromossomo 8 em uma célula de hamster, onde a dita porção deletada compreende o gene C12orf35. Como é mostrado pelos exemplos, células CHO compreendendo uma respectiva deleção na região telomérica de cromossomo 8, aqui o braço q, têm características de expressão particularmente favoráveis e então são particularmente adequadas como células hospedeiro para produção recombinante. De acordo com uma modalidade, a região telomérica deletada compreende o gene C12orf35 e um ou mais ou todos os genes selecionados do grupo consistindo em Bicd1, Amn1, proteína 20 tipo metiltransferase, Dennd5b, FAM60A, Caprin2, Ipo8 e RPS4Y2. De acordo com uma modalidade, a região deletada compreende ainda pelo menos uma porção de ou todo o gene Tmtc1. De acordo com uma modalidade, o método compreende deleção de pelo menos uma respectiva porção da região telomérica em ambos os cromossomos do par de cromossomo 8. Nomes alternativos não limitantes dos genes individuais mencionados acima e proteínas codificadas são também indicados na Tabela 1 acima e são, bem como homólogos e ortólogos, compreendidos pelo escopo dos termos usados acima para os genes individuais e/ou proteínas codificadas.

[00153] Como descrito acima, a região telomérica do cromossomo 6 em camundongo corresponde à região telomérica do cromossomo 8 em hamster Chinês. Desta maneira, a descrição acima com relação à região telomérica do cromossomo 8 de hamster se aplica correspondentemente à região telomérica do cromossomo 6 em camundongo.

[00154] De acordo com uma modalidade, o método compreende causar uma ruptura de cromossomo na região telomérica do cromossomo 8 do genoma de hamster (ou cromossomo 6 do genoma de camundongo), onde o ponto de ruptura no cromossomo 8 (ou cromossomo 6 do genoma de camundongo) está localizado centromérico do gene da proteína 20 tipo metiltransferase (referido como 4833442J19Rik em camundongo), centromérico do gene Dennd5b, centromérico do gene FAM60A, centromérico do gene Caprin2, centromérico do gene Ipo8 ou centromérico do gene RPS4Y2. Desta maneira, todos os genes que estão presentes telomérico do mesmo, isto é, que se encontram mais para a direção da extremidade telomérica, são deletados. Nomes alternativos não limitantes dos genes individuais mencionados acima são também indicados na Tabela 1 acima e os respectivos genes e proteínas codificadas são compreendidos pelo escopo dos termos usados acima para os genes individuais. De acordo com uma modalidade, as células obtidas compreendendo uma ruptura de cromossomo na região telomérica têm uma ou mais das características que seguem: a) o ponto de ruptura está localizado centromérico do gene Ipo8; b) o ponto de ruptura está localizado dentro do gene Tmtc1.

[00155] Conforme acima discutido, todos os genes que estão localizados telomérico do ponto de ruptura, isto é, mais para a direção da extremidade telomérica, são compreendidos na região deletada. Isto inclui gene C12orf35. Métodos para identificação das respectivas células eucarióticas tendo tal ponto de ruptura que são descritos acima são também descritos abaixo em conjunto com o quinto aspecto da presente invenção. De acordo com uma modalidade, o gene Ergic2 não é deletado.

[00156] De acordo com uma modalidade, uma célula CHO, preferivelmente derivada da linhagem de célula K1, é usada a fim de produzir uma linhagem de célula eucariótica onde o efeito do produto de expressão do gene C12orf35 é prejudicado, preferivelmente através de redução ou eliminação da expressão funcional de gene C12orf35. De acordo com uma modalidade, uma região telomérica no braço q do cromossomo 8 compreendendo gene C12orf35 é deletada. Detalhes de como obter este resultado são conhecidos do versado e modalidades adequadas também são descritas aqui e é referida a respectiva descrição. Particularmente vantajosa é a modalidade onde ainda, o efeito de FAM60A é prejudicado na dita célula, por exemplo, através da redução ou eliminação da expressão funcional do gene FAM60A uma vez que foi constatado que desta maneira, a estabilidade da expressão pode ser significantemente aperfeiçoada. Detalhes são explicados acima e é referida a descrição acima. Células hospedeiro de mamífero que são alteradas de maneira que o efeito de ambos C12orf35 e FAM60A é prejudicado nas ditas células têm características de expressão particularmente favoráveis. Desta maneira, células hospedeiro de mamífero são providas, as quais mostram características aperfeiçoadas com relação a ambas as características, estabilidade a longo prazo bem como rendimento de produção, e então características-chave importantes para a produção em larga escala de um produto de interesse, em particular um polipeptídeo de interesse.

[00157] De acordo com uma modalidade, o método de acordo com o quarto aspecto compreende introdução na célula eucariótica onde a expressão do gene C12orf35 é reduzida ou eliminada de pelo menos um polinucleotídeo codificando um produto de interesse e preferivelmente pelo menos um polinucleotídeo codificando um marcador selecionável. De acordo com uma modalidade, o polinucleotídeo codificando um produto de interesse e o polinucleotídeo codificando um marcador selecionável estão localizados nos mesmos vetores de expressão ou separados. Os vetores de expressão podem ser introduzidos através de transfecção, transfecção estável é preferida. Modalidades adequadas e preferidas são também descritas acima e é referida a respectiva descrição que também se aplica aqui. Células hospedeiro que foram transfectadas com sucesso e expressam o produto de interesse podem ser selecionadas usando o método de acordo com o segundo aspecto. É referida da descrição acima.

E. Método para análise de células eucarióticas

[00158] De acordo com um quinto aspecto, é provido um método para análise de células eucarióticas quanto à sua adequabilidade como células hospedeiro para expressão recombinante de um produto de interesse, compreendendo analisar diretamente ou indiretamente se o efeito do produto de expressão do gene C12orf35 é prejudicado nas ditas células. Conforme acima descrito, a célula eucariótica é preferivelmente uma célula de mamífero.

[00159] Este método analítico pode ser vantajosamente usado, por exemplo, em combinação com o método de acordo com o quarto aspecto da presente descrição a fim de identificar se uma célula eucariótica foi produzida, onde o efeito do produto de expressão de gene C12orf35 é prejudicado na dita célula. Ainda, o dito método pode ser usado a fim de discriminar entre clones de produção alta e baixa. Ainda, em modalidades, este método pode ser adicionalmente usado para discriminar entre clones estáveis ou não estáveis durante o processo de seleção/avaliação. Ao usar este método analítico, clones podem ser identificados logo no início do processo de seleção, os quais têm características de expressão favoráveis. Isto aumenta a probabilidade de selecionar clones de produção alta e estável resultando em uma proporção maior de clones de produção alta e estável. Desta maneira, este método analítico tem aplicações importantes e provê um aperfeiçoamento adicional de tecnologias de expressão recombinante.

[00160] De acordo com uma modalidade preferida, o método compreende análise de se a expressão funcional do gene C12orf35 é reduzida ou eliminada nas ditas células. A análise de se expressão funcional de gene C12orf35 é reduzida ou eliminada pode ser realizada diretamente ou indiretamente. Modalidades não limitantes são descritas abaixo. Qual método analítico é adequado depende também de como as células são alteradas para obter a redução ou eliminação de expressão funcional de gene endógeno C12orf35.

[00161] Por exemplo, quando introduzindo uma inativação de gene no gene C12orf35 a fim de reduzir ou eliminar expressão de gene C12orf35, a seção de DNA correspondente pode ser amplificada e sequenciado o DNA amplificado a fim de confirmar que a inativação de gene foi introduzida no gene C12orf35. Se expressão funcional do gene C12orf35 for reduzida ou eliminada deletando completamente ou parcialmente o dito gene, a deleção no nível de DNA pode ser detectada, por exemplo, usando métodos de detecção baseados em amplificação adequados para detectar a deleção (tais métodos são conhecidos do versado na técnica).

[00162] De acordo com uma modalidade, o perfil de expressão das células eucarióticas é analisado para determinar se expressão funcional do gene C12orf35 é reduzida ou eliminada. Por exemplo, a análise pode compreender realização de uma RT (transcrição reversa) PCR qualitativa ou quantitativa a fim de detectar a presença, ausência, quantidade ou comprimento de mRNA de C12orf35. Isto seria um exemplo de uma análise direta, uma vez que a análise envolve diretamente o transcrito do gene C12orf35. Análises indiretas, onde o estado de expressão do gene C12orf35 é indiretamente determinado através da análise do perfil de expressão de genes diferentes do gene C12orf35 e onde, consequentemente, a análise não envolve diretamente a análise do gene C12orf35 ou seu transcrito são também adequadas e então compreendidas pelo termo "análise se a expressão funcional do gene C12orf35 é reduzida ou eliminada". Tais análises indiretas são, por exemplo, adequadas se uma porção cromossomal compreendendo o gene C12orf35 (e outros genes) é deletada por ruptura de cromossomo e serão descritas subsequentemente. Para uma análise quantitativa, uma comparação com uma referência (por exemplo, célula correspondente não alterada) pode ser realizada.

[00163] De acordo com uma modalidade, é ainda analisado diretamente ou indiretamente se o efeito da proteína FAM60A é prejudicado nas ditas células. Isto pode ser analisados através da determinação de se a expressão funcional do gene FAM60A endógeno é reduzida ou eliminada nas ditas células. Esta análise pode ser realizada mutatis mutandis como foi descrito para gene C12orf35. É referida a discussão acima.

[00164] De acordo com uma modalidade, antes da análise, as células são tratadas com um agente que induz quebras de cromossomo a fim de deletar uma porção do cromossomo que compreende o gene C12orf35. Conforme acima descrito, todas as cópias do gene C12orf35 poderiam então ser deletadas. A análise pode então compreender análise de se tratamento com o dito agente resultou em uma deleção de uma porção de um cromossomo que inclui gene C12orf35. As células são tratadas com um agente que induz ruptura de cromossomo em uma concentração apropriada de maneira que a ruptura de cromossomo ocorre. Aqui, várias rodadas de tratamento podem ser realizadas. Ruptura de cromossomo pode ser induzida durante o processo de seleção se seleção envolver o uso de um agente que induz quebras de cromossomo em uma concentração suficientemente alta. Um exemplo não limitante de um agente adequado é, por exemplo, MTX. Neste caso as células podem compreender um polinucleotídeo heterólogo codificando DHFR como marcador selecionável a fim de ser capaz de sobreviver a tratamento com MTX. No entanto, como acima discutido também outros agentes podem ser usados, tal como, por exemplo, higromicina e isto pode ser confirmado por exemplos.

[00165] Após tratamento das células para induzir quebras de cromossomo, as células obtidas podem ser analisadas usando o método de acordo com o quinto aspecto para determinar se tratamento com o dito agente resultou em uma deleção de uma porção de um cromossomo que inclui gene C12orf35. Modalidades diferentes são adequadas para este propósito. De acordo com uma modalidade, o perfil de expressão das células tratadas é analisado. Por exemplo, pode ser analisado se o gene C12orf35 ou um ou mais genes localizados centroméricos do gene C12orf35 (isto é, distante da extremidade telomérica para o cromossomo) são expressos. Por exemplo, no caso de células de camundongo ou hamster Chinês pode ser analisado se o gene C12orf35 é expresso e, desta maneira, se seu mRNA pode ser detectado (exemplo de uma análise direta) e alternativamente ou em adição a isto, pode ser analisado se um ou mais genes selecionados do grupo consistindo em proteína 20 do tipo metiltransferase (referida como 4833442J19Rik em camundongo), Dennd5b, FAM60A, Caprin2, Ipo8, Tmtc1 ou genes que estão localizados telomérico dos genes mencionados acima são expressos pela célula (exemplo de análise indireta). Nomes alternativos não limitantes dos genes individuais mencionados acima são também indicados na Tabela 1 acima e os respectivos genes são compreendidos pelo escopo dos termos usados acima para os genes individuais e produtos codificados. Se o ponto de ruptura induzido estiver localizado centromérico do(s) respectivo(s) gene(s), os ditos genes são deletados, o que elimina ou reduz (se outras cópias do gene existirem em outro local que não são expressos) sua expressão. Como é evidente a partir da Figura, 1, o gene C12orf35 está localizado telomérico dos genes mencionados acima. Desta maneira, se os genes mencionados acima forem deletados, a região deletada também inclui gene C12orf35. Desta maneira, os genes acima podem ser validamente usados como marcadores a fim de basicamente indiretamente determinar se a ruptura de cromossomo induzida resultou em uma deleção de gene C12orf35 e então resultou em uma redução ou eliminação de expressão de gene C12orf35. Desta maneira, a análise de se expressão do gene C12orf35 foi reduzida ou eliminada não tem necessariamente que ser baseada em uma análise direta do, por exemplo, mRNA de C12orf35 e tais métodos indiretos são também compreendidos pelo método do quinto aspecto. Ainda, foi constatado que embora localizado telomérico do gene C12orf35 (isto é, mais para baixo para a direção da extremidade telomérica), também gene Bicd1 pode ser usado como marcador para determinar se uma ruptura de cromossomo foi induzida que resultou em uma deleção de gene C12orf35. Foi constatado em conjunto com a análise de célula de hamster Chinês tais como células COH que se gene Bicd1 é deletado devido a uma ruptura de cromossomo, a região telomérica deletada geralmente inclui C12orf35. Foi confirmado através de análise das características de expressão de várias centenas de clones que os genes mencionados acima podem ser validamente usados como marcadores a fim de discriminar clones de célula com características de expressão alta e estável de clones de célula tendo características de expressão baixa e instável. A expressão relativa dos genes mencionados acima em células CHO é mostrada na Figura 2.

[00166] De acordo com uma modalidade, o método de acordo com o quinto aspecto é para análise de células de hamster, preferivelmente células CHO, e o método compreende análise de se expressão de gene C12orf35 é reduzida nas ditas células através da análise de se a expressão de um ou mais genes localizados na região telomérica do cromossomo 8 e sendo selecionado do grupo consistindo no gene Tmtc1 e genes localizados teloméricos do gene Tmtc1 é reduzida ou eliminada nas ditas células. Como descrito acima, respectivas células que após tratamento com o agente que introduz ruptura de cromossomo não expressam mais o gene Tmtc1 e/ou genes localizados teloméricos do gene Tmtc1 geralmente compreendem uma deleção na região telomérica do cromossomo 8 que compreende os ditos genes e em particular compreende o gene C12orf35. Material genético telomérico do ponto de ruptura é perdido.

[00167] De acordo com uma modalidade, as células hospedeiro selecionadas tendo as características descritas acima são transfectadas com um vetor de expressão compreendendo pelo menos um polinucleotídeo codificando um produto de interesse e preferivelmente compreendendo pelo menos um marcador selecionável. Modalidades adequadas são descritas acima em conjunto com os outros aspectos e é referida a descrição acima.

[00168] De acordo com uma modalidade, antes da realização da análise usando o método de acordo com o quinto aspecto, as células eucarióticas são transfectadas com pelo menos um polinucleotídeo heterólogo codificando um produto de interesse e pelo menos um polinucleotídeo heterólogo codificando um marcador selecionável, e antes da análise pelo menos uma etapa de seleção é realizada para identificar células hospedeiro transfectadas com sucesso. Modalidades adequadas são descritas em detalhes acima. De acordo com uma modalidade, seleção envolve o uso de um agente de seleção que induz quebras de cromossomo. Nesta modalidade, o marcador selecionável pode ser DHFR e o agente de seleção pode ser MTX. Alternativamente, o agente de seleção pode ser higromicina e o marcador selecionável pode ser um gene que confere resistência contra higromicina tal como, por exemplo, o gene hph. Em tais aplicações, onde o método é realizado durante ou após o processo de seleção, o método de acordo com o quinto aspecto pode ser usado como ferramenta analítica a fim de identificar dentro da população de célula selecionada tais células, onde a expressão do gene C12orf35 é reduzida ou eliminada. Como descrito, tal redução ou eliminação pode ser causada ou apoiada pelas condições de seleção, se, por exemplo, uma ruptura de cromossomo é induzida então que resulta em uma deleção do gene C12orf35 e o método de acordo com o quinto aspecto permite identificar tais células, por exemplo, com base em seu perfil de expressão. Isto permite a identificação de tais células ou clones de célula que devido ao seu perfil de expressão, em particular devido à expressão reduzida ou eliminada do gene C12orf35, são particularmente adequadas para estabelecimento de uma linhagem de célula de produção recombinante uma vez que pode ser esperado que a expressão alta do produto de interesse permaneça estável. Como descrito, no caso de células de hamster tais como células CHO onde o gene FAM60A está localizado na região telomérica do cromossomo 8 é preferido que as células tenham perdido a região telomérica do cromossomo 8, preferivelmente o braço q, desta maneira reduzindo ou eliminando expressão do gene C12orf35. O método analítico pode ser realizado após geração de clones de célula a partir de células compreendidas na população de células de expressão alta. De acordo com uma modalidade, uma pluralidade de clones de célula é analisada quanto à discriminação entre clones de célula estáveis e não estáveis e/ou produção alta e baixa.

[00169] De acordo com uma modalidade, o método de acordo com o quinto aspecto compreende seleção de pelo menos uma célula onde o efeito do produto de expressão do gene C12orf35 é prejudicado, preferivelmente através da redução ou eliminação de expressão funcional do gene C12orf35, para expressão recombinante de um produto de interesse, preferivelmente um polipeptídeo de interesse. Células tendo as respectivas características são particularmente adequadas para expressão recombinante como é mostrado pelos exemplos. Modalidades adicionais de respectivas células são também descritas em detalhes acima. Como descrito, preferivelmente células de vertebrado tais como sobretudo preferivelmente células de mamífero são usadas como células hospedeiro eucarióticas.

F. Uso de células eucarióticas alteradas para produção recombinante de um produto de interesse

[00170] De acordo com um sexto aspecto, a presente invenção se refere ao uso de uma célula eucariótica isolada para expressar recombinantemente um produto de interesse, onde o efeito do produto de expressão de gene C12orf35 é prejudicado na dita célula. Detalhes com relação às respectivas células hospedeiro eucarióticas e modalidades adequadas para obter prejuízo do efeito do produto de expressão do gene C12orf35 nas ditas células, preferivelmente através da redução ou eliminação de expressão funcional de gene C12orf35 foram descritos em detalhes acima e é referida a descrição acima que também se aplica aqui. Modalidades não limitantes são descritas rapidamente abaixo.

[00171] Preferivelmente, a célula hospedeiro eucariótica de acordo com o primeiro aspecto é usada como células hospedeiro eucarióticas. As ditas células são descritas em detalhes acima e é referida a descrição acima. A célula eucariótica pode ser selecionada de uma célula de metazoário, uma de vertebrado ou mamífero. Preferivelmente, a célula eucariótica é uma célula de mamífero tal como uma célula de roedor. Preferidas são células CHO. O genoma da célula eucariótica pode ser alterado conforme descrito em detalhes acima para obter prejuízo. De acordo com uma modalidade, ainda o efeito de proteína FAM60A é prejudicado na dita célula, preferivelmente através de redução ou eliminação de expressão funcional de gene endógeno FAM60A. Detalhes com relação a esta modalidade e as vantagens associadas foram descritos em detalhes acima e é referida a descrição acima.

[00172] De acordo com uma modalidade, o produto de interesse é um polipeptídeo. Preferivelmente, o polipeptídeo de interesse é quando da expressão na célula eucariótica secretado no meio de cultura celular. Detalhes com relação ao polipeptídeo de interesse são descritos acima e é referida a respectiva descrição. Para permitir expressão do produto de interesse, a célula hospedeiro eucariótica pode ser transientemente ou preferivelmente estavelmente transfectada com um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo codificando o polipeptídeo de interesse. Detalhes são descritos acima e é referida a descrição acima.

[00173] Faixas numéricas descritas aqui são inclusivas dos números definindo a faixa. Os cabeçalhos providos aqui não são limitações dos vários aspectos ou modalidades da presente invenção que podem ser lidos com referência à especificação como um todo. De acordo com uma modalidade, matéria-objetivo descrita aqui como compreendendo certos elementos também se refere à matéria-objeto consistindo nos respectivos elementos. Em particular, os polinucleotídeos descritos aqui como compreendendo certas sequências podem também consistir nas respectivas sequências. É preferido selecionar e combinar modalidades preferidas descritas aqui e a matéria-objeto específica tendo origem a partir de uma respectiva combinação de modalidades preferidas também pertence à presente invenção.

[00174] O presente pedido reivindica prioridade do pedido de patente provisório U.S. No. US 61/919313 depositado em 20 de dezembro de 2013, cuja descrição é aqui incorporada a título de referência.

EXEMPLO

[00175] Os exemplos que seguem servem para ilustrar a presente invenção sem de modo alguma limitar o seu escopo. Em particular, os exemplos se referem a modalidades preferidas da presente invenção.

Exemplo 1: Redução da expressão do gene C12orf35 através de interferência de RNA (RNAi) em células CHO aumenta o rendimento de expressão

[00176] A fim de demonstrar que redução da expressão do gene C12org35 resulta em um aumento em produtividade volumétrica ou específica, siRNAs foram projetados contra genes alvo diferentes localizados na região telomérica do cromossomo 8 do genoma de hamster Chinês analisado (CHO-K1). siRNAs foram projetados contra os genes alvo que seguem listados na Tabela 2:Tabela 2: siRNAs contra genes alvo diferentes

[00177] Os siRNAs usados foram validados usando RT-PCR em tempo real para confirmar que eles reduzem a expressão dos genes alvo através de silenciamento de gene. Expressão de gene foi normalizada para RNA 18S. A expressão de gene observada quando transfectando o controle negativo de siRNA foi ajustada para 100%. A redução relativa de expressão do gene alvo é mostrada na Tabela 3 subsequente para os dois siRNAs diferentes contra gene alvo C12orf35:Tabela 3

[00178] Ainda, foi confirmado que os siRNAs alvo usados neste experimento não inibem crescimento das células transfectadas. Ainda, análise BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) baseada nos dados de genoma de hamster Chinês disponíveis não indica quaisquer efeitos fora do alvo.

[00179] As linhagens de célula que seguem foram transfectadas: Uma linhagem de célula CHO derivada de CHO-K1 foi usada como linhagem de célula parental. A dita linhagem de célula expressa os genes acima como é mostrado na Figura 2. Esta linhagem de célula parental não foi transfectada com um vetor de expressão e serviu como controle. Células CHO (clones e grupos) derivadas da dita linhagem de célula parental que compreendia um vetor de expressão codificando um anticorpo como proteína de interesse integrado estavelmente ao genoma foram usadas para determinar o efeito dos siRNAs. O vetor de expressão compreendido no dito clone de célula compreendia genes marcadores selecionáveis e a cadeia pesada de anticorpo e a cadeia leve de anticorpo foram expressas a partir de cassetes de expressão diferentes. O cassete de expressão usado para a cadeia pesada foi projetado de maneira que uma porção da cadeia pesada foi expressa devido à leitura do códon de parada como polipeptídeo de fusão compreendendo uma âncora de membrana. A proteína de fusão foi exibida na superfície celular, desta maneira simplificando análise FACS (vide descrição). As ditas células CHO expressaram os genes alvo siRNA mencionados acima similar à linhagem de célula parental que foi determinada através de microdisposições para centenas de clones e grupos. Um clone de CHO que expressava recombinantemente o anticorpo foi usado a fim de determinar se uma sub-regulagem de um ou mais dos genes alvo acima resulta em um aumento da expressão do polipeptídeo de interesse. Se este foi o caso, um aumento da produtividade volumétrica de anticorpo do dito clone de célula seria visto, o que é detectável usando análise FACS.

[00180] O clone de CHO compreendendo o vetor de expressão estavelmente integrado ao genoma foi transfectado ou com um controle de siRNA (não tendo um efeito sobre expressão de gene) ou com um dos siRNAs mencionados acima contra os genes alvo. Após transfecção dos siRNAs foi analisado se a redução da expressão do gene alvo resulta em um aumento da expressão do anticorpo. Inter alia, as células transfectadas foram tingidas usando um composto de detecção fluorescente e analisadas através de FACS a fim de determinar a taxa de expressão do anticorpo. Quanto mais anticorpo é produzido, mais a proteína de fusão exibida pode ser tingida usando um composto marcado e, consequentemente, maior é o sinal de fluorescência detectado por FACS. Desta maneira, quanto maiores as intensidades nos perfis de FACS, mais anticorpo é expresso.

[00181] Os resultados são mostrados nas Figuras 3A a L para os siRNAs diferentes testados. O pico da esquerda nos perfis corresponde ao sinal obtido para a linhagem de célula parental, que não expressa o anticorpo. As duas curvas representam os resultados obtidos com o clone de célula expressando anticorpo que foi transfectado ou com controle negativo de siRNA (nenhum efeito sobre expressão) ou com o siRNA testado que reduz a expressão de seu gene alvo. Se o siRNA testado e, consequentemente, a sub-regulagem do gene alvo não tem um efeito sobre expressão do anticorpo (isto é, nenhuma suprarregulagem de produtividade volumétrica), a curva de fluorescência obtida para o controle negativo para siRNA e a curva de fluorescência obtida para o siRNA alvo se sobrepõem e então são basicamente idênticas. Este era em essência o caso para todos os genes alvo testados em nível de clone, exceto o gene C12orf35. Para FAM60A, no entanto, uma ligeira mudança foi vista em nível de grupo que é suposta ser atribuível à estabilidade de expressão aumentada (dados não mostrados).

[00182] Como pode ser visto a partir dos resultados obtidos com os siRNAs contra C12orf35 (vide Figuras 3B e C), os picos de fluorescência obtidos para o controle negativo de siRNA e o siRNA contra gene C12orf35 se separam claramente quando silenciamento do gene C12orf35 usando RNAi. O pico fluorescente obtido para o clone de célula transfectado com o siRNA contra gene C12orf35 muda claramente para a direita (marcado por setas), o que significa que a fluorescência é significantemente aumentada. Este aumento observado em fluorescência é atribuível a uma expressão maior do anticorpo uma vez que mais proteína de fusão está presente e então é tingida na superfície celular. Desta maneira, este experimento mostra claramente que uma sub-regulagem da expressão funcional do gene C12orf35 resulta diretamente em uma suprarregulagem significante da expressão recombinante do anticorpo (rendimento de anticorpo). A mesma mudança notavel nos perfis de FACS foi observada quando usando siRNAs contra C12orf35 em todas as três concentrações. Uma redução prolongada da expressão do gene C12orf35 através de interferência de RNA pode ser obtida se, por exemplo, estavelmente integrado em um vetor de expressão que expressa um transcrito de indução de RNAi, como é, por exemplo, descrito na descrição. Ainda, uma redução ou eliminação da expressão de gene C12orf35 pode ser obtida através de inativação de gene ou deleção/mutação de gene, de acordo com uma modalidade através da deleção de uma porção da região telomérica do cromossomo 8 no caso de células de hamster tais como células CHO, conforme descrito na descrição. Ainda, como é descrito nela, é também possível reduzir ou eliminar o efeito do produto de expressão, por exemplo, através da introdução de uma ou mais mutações que resultam em uma proteína não funcional ou menos funcional.

[00183] O aumento obtido na expressão do polipeptídeo recombinante de interesse foi também confirmado através de análise do nível de expressão de mRNA da cadeia pesada e da cadeia leve (que foram expressas a partir de cassetes de expressão separados, vide acima). Os resultados são mostrados para dois polipeptídeos de interesse diferentes (anticorpos 1 e 2) nas Figuras 4 e 5. Os dados mostrados são normalizados para o controle negativo de siRNA (125 pmol). Foi constatado que redução de expressão do gene C12orf35 leva a níveis de mRNA significantemente maiores da cadeia pesada e da cadeia leve do anticorpo expresso. Em comparação, redução de expressão de outros genes alvo testados não teve um impacto sobre o nível de expressão de mRNA da cadeia pesada e da cadeia leve. Desta maneira, redução da expressão do gene C12orf35 resulta em um aumento significante no nível de mRNA do polipeptídeo recombinante de interesse. Ainda, foi observado que também outros genes introduzidos tais como marcadores de seleção são suprarregulados se o gene C12orf35 for silenciado. Um experimento, onde o efeito de silenciamento de gene foi medido com o tempo começando no dia 3, mostrou que siRNA 1 (vide siRNA C12orf35_1 na Tabela 4) tinha um efeito mais longo comparado com siRNA2 (vide siRNA C12orf35_2 na Tabela 4). Ainda, números de célula e título foram determinados durante o período do experimento e revelaram que sub-regulagem de C12orf35 leva a produtividades específicas e volumétricas significantemente maiores (vide Figuras 6 e 7).

[00184] Ainda, expressão do gene C12orf35 com relação a RNA 18S foi analisada em um clone de expressão de anticorpo quando da repressão com siRNA 1 e 2 e comparada com controles diferentes. Os resultados são mostrados na Tabela 4 subsequente:Tabela 4

Exemplo 2: Geração de uma linhagem de célula CHO que compreende uma deleção na região telomérica do cromossomo 8

[00185] Uma linhagem de célula CHO (C8DEL) foi gerada, a qual compreende uma deleção na região telomérica do braço q do cromossomo 8. A deleção foi induzida por ruptura de cromossomo. A porção deletada compreendia o gene C12orf35 bem como dentre outros gene FAM60A (vide Figura 1). A dita linhagem de célula foi obtida de uma linhagem de célula parental derivada de CHO-K1. A dita linhagem de célula foi preparada como segue. As células CHO parentais foram divididas em 2E5 células/mL em meio de cultura compreendendo 0,5 μM, 1 μM ou 2 μM de MTX. Após seis dias as viabilidades celulares eram em torno de 30-40%. As células foram centrifugadas a 180xg por 5 min e cultivadas em meio de cultura sem MTX para permitir que as células se recuperassem até que as viabilidades fossem acima de 95% (após cerca de 21 dias). Este procedimento foi repetido mais duas vezes. Clones de célula únicos foram obtidos de grupos de célula. No geral 561 clones de célula foram cultivados e DNA foi isolado usando o "Extract-N-Amp Blood PCR Kit". Avaliação de PCR usando iniciadores detectando o gene Ipo8 foi realizada. Três dos 561 clones eram "IPO8 negativos" indicando a perda de região telomérica do cromossomo 8 que inclui o gene Ipo8. O gene Ipo8 está localizado centromérico do gene C12orf35 (vide Figura 1). Desta maneira, se o gene Ipo8 for deletado devido à ruptura de cromossomo, todos os genes localizados teloméricos do gene Ipo8 (e consequentemente também o gene C12orf35 e o gene C12orf35) são também deletados. Estes três clones foram expandidos e avaliados mais. Um destes clones é referido como linhagem de célula "C8DEL". Usando técnica de PCR o ponto de ruptura da região telomérica do cromossomo 8 da linhagem de célula C8DEL poderia ser determinado. O ponto de ruptura foi determinado entre duas PCRs, chamadas PCR20 e 28:PCR20: dir 5’-ACC AGT GAA TAA TCG TGT TT-3’ (SEQ ID NO: 47), rev 5’-CTA TGA GTC AAT GTC CCA AG-3’ (SEQ ID NO: 48);PCR28: dir 5’-CAC ACA CAA CCT CCT AAC AAC CC-3’ (SEQ ID NO: 49), rev 5’-TTC CGC ACC GAC TCA GTT CT-3’ (SEQ ID NO: 50)

[00186] O ponto de ruptura se encontra dentro do gene Tmtc1. Ainda, poderia ser demonstrado que o ponto de ruptura identificado de linhagem de célula C8DEL é estável durante várias semanas de cultivo (determinado através de PCR). Transfecção desta linhagem de célula eucariótica com um vetor de expressão codificando um produto de interesse resulta em títulos de produto volumétrico maiores em comparação com a linhagem de célula parental (não compreendendo a dita deleção na região telomérica) bem como uma probabilidade maior de seleção de clones de produção estável como é mostrado a seguir. Transfecção e tratamento com MTX de linhagem de célula C8DEL aparentemente não têm nenhum efeito sobre o ponto de ruptura (nenhum material genético adicional é perdido) conforme foi determinado com base na análise de clones transfectados.

Exemplo 3: Análise das características da linhagem de célula C8DEL

[00187] A linhagem de célula C8DEL foi analisada quanto ao seu desempenho quando expressando recombinantemente um polipeptídeo de interesse e comparada com a linhagem de célula parental a partir da qual a linhagem de célula C8DEL foi derivada.Como descrito acima, a dita linhagem de célula parental não compreende uma deleção correspondente na região telomérica do cromossomo 8.

3.1 Análise de produtividade

[00188] A produtividade volumétrica de C8DEL foi avaliada em comparação com a linhagem de célula parental a partir da qual ela foi derivada. Transfecções estáveis bem como transientes foram realizadas.

Transfecção estável

[00189] Cultivo, transfecção e avaliação de célula foram realizadas em frascos de agitação usando células CHO de crescimento em suspensão em um meio de cultura quimicamente definido. As células foram transfectadas através de eletroporação com vetores de expressão diferentes codificando uma variedade de anticorpos e proteínas terapêuticas. Vetores de expressão usados compreendiam um cassete de expressão compreendendo um polinucleotídeo codificando uma neomicina fosfotransferase como marcador selecionável e um cassete de expressão codificando um DHFR como marcador selecionável. Os vetores de expressão usados para expressão de anticorpos compreendiam ainda um cassete de expressão compreendendo um polinucleotídeo codificando a cadeia leve de um anticorpo e um cassete de expressão compreendendo um polinucleotídeo codificando a cadeia pesada de um anticorpo de maneira que um anticorpo completo foi expresso a partir do dito vetor de expressão. Os vetores de expressão usados para expressão de um polipeptídeo que não era um anticorpo compreendiam um cassete de expressão compreendendo um polinucleotídeo codificando o polipeptídeo em adição aos marcadores de seleção. Todo os cassetes de expressão nos vetores de expressão foram orientados na mesma direção. O vetor era adequado para seleção FACS e detalhes de tal vetor são descritos acima.

[00190] Dependendo da viabilidade celular, a primeira etapa de seleção foi iniciada 24-48 h após transfecção através da adição de meio seletivo G418 às células. Assim que as células se recuperaram para uma variabilidade de mais de 80%, uma segunda etapa de seleção foi aplicada passando as células para 500 nM MTX ou 1 μM MTX.

[00191] Produtividade volumétrica das populações de célula selecionadas foi analisada após etapas de seleção de G418 e MTX através de culturas de batelada de frasco de agitação de supercrescimento em meio com G418 ou MTX. A batelada de G418 foi feita em 30 mL (frasco de 125 mL) e a batelada de MTX em 100 mL (frasco de 500). Culturas de batelada de G418 foram semeadas em 1E5 vc/mL em frasco de agitação e cultivadas em uma cabine de agitação (não umidificada) a 150 rpm e CO2 10%. Bateladas dealimentação foram semeadas 4E5 vc/mL. Viabilidade de células tinha que ser >90% quando começando o ensaio. Determinação de título aconteceu no dia 14. Títulos de anticorpo no sobrenadante de cultura celular foram determinados por HPLC de proteína-A 14 dias após início da cultura.

[00192] Após a primeira etapa de seleção (seleção com G418) um aumento de título volumétrico massivo (12-35 vezes) pôde ser detectado para os grupos de C8DEL estavelmente transfectados em comparação com os grupos parentais estavelmente transfectados. Após a segunda etapa de seleção (seleção com MTX) os grupos de batelada alimentada de C8DEL estavam expressando 4-7 vezes mais polipeptídeo de interesse em comparação com as células parentais transfectadas, como exemplificado por 2 anticorpos (anticorpo 1 e anticorpo 2). Títulos de G418 e MTX volumétricos (batelada alimentada) de C8DEL em comparação com linhagem de célula CHO parental não compreendendo a deleção na região telomérica do cromossomo 8 são exemplarmente exibidos para dois projetos de anticorpo nas Tabelas 5.a e 5.b que seguem. As Tabelas 5.a e 5.b mostram o título de grupo de batelada alimentada de G418 e MTX volumétrico (anticorpo) produzido em C8DEL em comparação com os grupos parentais (médias de 4 grupos/condições são mostradas).Tabela 5.a: Títulos de grupo de anticorpo 1 exemplar

Tabela 5.b: Títulos de grupo de anticorpo 2 exemplar

[00193] Os resultados apoiam a conclusão que uma deleção na região telomérica do cromossomo 8 que inclui o gene C12orf35 está relacionada com produtividade volumétrica maior. Já com relação a título de grupo volumétrico, a linhagem de célula C8DEL tem melhor desempenho do que a linhagem de célula parental que não compreende uma respectiva deleção na região telomérica do cromossomo 8. Análise da frequência e distribuição dos sítios de integração dentro do cariótipo de grupos de C8DEL e grupos parentais foi analisada. Ambos os grupos mostram mais de 100 sítios de integração diferentes em 200 células analisadas destacando que uma enorme variabilidade em ambos os grupos existe sem nenhuma diferença entre as duas linhagens de célula. Isto indica que a produtividade volumétrica maior não é devido a quaisquer artefatos de integração.

Transfecção transiente

[00194] Células C8DEL e células de linhagem de célula parental cultivadas em meio de cultura foram transientemente transfectadas em triplicadas com plasmídeos de expressão codificando ou eGFP ou uma proteína de fusão Fc como proteína modelo de interesse. Polietilenoimina (PEI) foi usada como reagente de transfecção. O título da proteína modelo no sobrenadante do meio foi medido através de Protein A HPLC no dia 3 e no dia 6 após transfecção. A expressão da proteína modelo foi aproximadamente 3 vezes maior em C8DEL. A porcentagem de células expressando eGFP foi medida 48 h após transfecção através de citometria de fluxo com células não transfectadas agindo como controle negativo. Células exibindo um nível de fluorescência maior do que 99% das células controle negativas foram consideradas como "transfectadas". Células exibindo nível de fluorescência de mais de 1000 vezes a intensidade das células controle negativas foram consideradas "altamente fluorescentes". O número de células altamente fluorescentes foi 2-3 maior usando a linhagem de célula C8DEL comparado com a linhagem de célula parental da qual C8DEL foi derivada.

[00195] Este exemplo mostra que as vantagens de produtividade volumétrica aumentada são também obtidas quando realizando uma transfecção transiente com a linhagem de célula C8DEL onde uma porção da região telomérica do cromossomo 8 é perdida devido à ruptura de cromossomo.

3.2 Análise de estabilidade

[00196] As características de estabilidade de 46 clones derivados de C8DEL e 37 clones derivados da linhagem de célula parental (que foram testados ser positivos para Ipo8 e desta maneira não perderam a região telomérica do cromossomo 8) foram analisadas após trans- fecção estável. Todos os clones expressaram recombinantemente o mesmo anticorpo como produto de interesse e foram classificados como estáveis se eles não tivessem perdido mais de 25% de título de anticorpo (volumétrico) em 12 semanas. 76% dos clones analisados da linhagem de célula parental perderam mais de 25% de título (volumétrico) dentro de 12 semanas de cultivo. Apenas 24% dos clones analisados foram classificados como estáveis. Desta maneira, taxas de instabilidade eram altas. Em comparação, 67% dos clones de C8DEL puderam ser classificados como estáveis e apenas 33% eram instáveis como é mostrado na Tabela 6:Tabela 6: Resultados de estudos de estabilidade

[00197] Usando um teste x2 com uma correção Yates um valor p de 0,0002 pôde ser calculado, o que apoia que clones derivados de C8DEL têm uma tendência maior significante em ser produtores estáveis. Desta maneira, um número maior significante de clones de produção estável para linhagem de célula C8DEL foi encontrado. Isto apoia ainda mais em particular em conjunto com os experimentos de inativação do exemplo 5 que células de hamster tais como células CHO, onde uma porção da região telomérica do cromossomo 8 compreendendo também gene FAMP60A é deletada, mostra características de estabilidade superiores. Desta maneira, uso de tal linhagem de célula para expressão recombinante aumenta a chance que células recombinantes de produção alta e estável sejam identificadas. Ainda, a produtividade volumétrica dos ditos clones foi analisada (vide 3.3).

3.3 Análises adicionais das características de C8DEL

[00198] As características da linhagem de célula CHO compreendendo uma deleção na região telomérica do cromossomo 8 onde a dita deleção compreende gene C12orf35 foram analisadas em experimentos adicionais que demonstram vantagens adicionais da dita linhagem de célula.

Menos clonagem de célula única requerida para seleção de produtores de taxa alta

[00199] Uma característica vantajosa da linhagem de célula C8DEL é a maior proporção de clones de produção alta após clonagem de célula única. Foi constatado que os grupos de C8DEL contêm uma proporção maior de células de produção alta (resultando em um título de grupo volumétrico aumentado) comparado com a linhagem de célula parental derivada de CHO-K1. Após clonagem de célula única de grupos C8DEL usando tecnologia FACS, uma proporção significantemente maior de clones expressando quantidades grandes de anticorpo foi selecionada comparado com grupos derivados da linhagem de célula parental selvagem. A Tabela 7 mostra que a maioria dos clones derivados da linhagem de célula parental tinha um "título de 96 cavidades" volumétrico de 0-20 mg/L. Em contraste, a maioria dos clones derivados da linhagem de célula C8DEL tinha um título volumétrico médio de 80-100 mg/L o que é um aperfeiçoamento significante. Uma vantagem do uso de grupos de C8DEL é o número reduzido de clones que tem que ser gerado para obter uma quantidade comparável de clones de produção alta. Isto reduz significantemente o esforço de avaliação.Tabela 7

[00200] Uso da linhagem d e célula C8DEL como linhagem de célula de produção resulta não apenas em uma proporção maior de clones de produção alta, também o título volumétrico dos clones de C8DEL individuais é maior. A Figura 8 mostra o título volumétrico dos 45 clones de maior produção da linhagem de célula parental derivada de CHO-K1 (todas positivas para Ipo8) e C8DEL de um projeto de anticorpo (resultados da análise de estabilidade dos ditos clones são mostrados em 3.2). Como pode ser visto, o título volumétrico médio para clones derivados de C8DEL é maior comparado com a linhagem de célula parental e, ainda, também os clones produtores de taxa mais alta de anticorpo são originados da linhagem de célula C8DEL.

Adequabilidade do biorreator

[00201] Testes adicionais para avaliar linhagem de célula C8DEL em comparação com a linhagem de célula parental derivada de CHO- K1 foram realizados inter alia para determinar sua adequabilidade para aumento. Operações de biorreator mostraram que a linhagem de célula C8DEL é adequada para aumento. A linhagem de célula C8DEL cultivada em biorreatores tinha uma densidade de célula viável que é adequada para produção em grande escala. Ainda, foi constatado que a viabilidade era melhor do que aquela para a linhagem de célula parental. No geral, a linhagem de célula C8DEL é adequada para aumento e tem melhor desempenho do que a linhagem de célula parental da qual ela é derivada com relação à viabilidade. A viabilidade da linhagem de célula C8DEL fica mais tempo em um nível maior.

Cronogramas aperfeiçoados a partir da transfecção para produção de grupo estável

[00202] Uma outra vantagem da linhagem de célula C8DEL é a recuperação mais rápida da seleção de MTX. A recuperação de grupos após incubação em MTX foi realizada 7-8 dias mais rápido comparado com a linhagem de célula parental onde nenhuma porção da região telomérica do cromossomo 8 compreendendo gene C12orf35 é deletada. No geral, foi constatado que a crise celular é significantemente menor com as células onde expressão de gene C12orf35 é reduzida ou eliminada. Sem desejar ser limitado à teoria, é acreditado que isto seja bem possível devido ao fato que genes heterogêneos, isto é, exógenos, incluindo o marcador de seleção são expressos em uma taxa maior.

Exemplo 4: Seleção usando um receptor de folato como marcador selecionável

[00203] A linhagem de célula C8DEL foi usada em ambientes diferentes em conjunto com o receptor de ácido fólico como marcador selecionável e mostra vantagens particulares em conjunto com o dito sistema de seleção. Em particular, uma seleção combinada contra o receptor de folato e DHFR como marcadores selecionáveis é benéfica. Aqui, as células transfectadas compreendiam um receptor alfa de folato humano e DHFR como marcadores selecionáveis e expressaram um anticorpo. Enquanto seleção da linhagem de célula parental com quantidades muito baixas de ácido fólico (ácido fólico (FA) 50 nM/MTX 50 nM) encontrou dificuldades devido à adstringência da seleção (as células não se recuperaram sempre), a combinação de C8DEL e o receptor de folato como marcador selecionável é muito poderosa sob tais condições adstringentes e resultou em um aumento de título volumétrico significante. A Tabela 8 destaca as diferenças de título volumétrico entre a linhagem de célula parental e C8DEL bem como o aumento de título volumétrico adicional que é obtido usando o receptor de folato como um marcador de seleção em combinação com quantidades baixas de ácido fólico ao invés da etapa de seleção com MTX 500 nM. Desta maneira, o uso das células eucarióticas descritas aqui onde a expressão de gene C12orf35 e gene FAM60A é reduzida ou eliminada permite em combinação com o sistema de seleção de receptor de folato/DHFR usar condições de seleção muito adstringentes que não requerem o uso de quantidades grandes de agentes tóxicos.Tabela 8

[00204] Ainda, cé ulas C8DEL foram transfectadas (nucleofecção) com um vetor de expressão que compreendia um cassete de expressão compreendendo um polinucleotídeo codificando um receptor de folato alfa humano e um cassete de expressão compreendendo um polinucleotídeo codificando DHFR. Desta maneira, ambos os marcadores selecionáveis FRalfa e DHFR estavam no mesmo vetor de expressão. Ainda, o vetor de expressão compreendia um cassete de expressão compreendendo um polinucleotídeo codificando a cadeia leve de um anticorpo e um cassete de expressão compreendendo um polinucleotídeo codificando a cadeia pesada de um anticorpo. O cassete de expressão para a cadeia pesada do anticorpo foi projetado de maneira que uma porção da cadeia pesada era devido à leitura do códon de parada produzida como fusão ancorada à membrana, desta maneira facilitando seleção FACS (vide acima). Cinco condições de seleção diferentes usando ácido fólico (FA) 100 nM e concentrações diferentes de MTX foram testadas. Os meios de seleção foram sumarizados na Tabela 9 subsequente. Após seleção, os grupos de célula selecionados foram transferidos para meio completo e cultivados em culturas de batelada de frasco de agitação. No dia 13 de cultura, amostras do meio de cultura foram obtidas e analisadas quanto ao teor de anticorpo através de Protein-A HPLC. Estes resultados são também mostrados na Tabela 9.Tabela 9

[00205] Como pode ser visto, uma concentração de MTX já tão baixa quanto 5 nM proveu uma vantagem de seleção. Aumento da adstringência de seleção também aumenta o título de grupo volumétrico. Desta maneira, as produtividades volumétricas de anticorpo são significantemente aumentadas. Ainda, comparado com seleções de MTX padrão, concentrações significantemente menores de MTX podem ser usadas durante seleção. Esta é uma vantagem importante considerando que MTX é um agente tóxico. Ainda, foi analisado como a adstringência de seleção influencia os títulos de grupo volumétrico e o tempo para seleção. Foi constatado que aumento da adstringência de seleção através do aumento da concentração de MTX prolonga o tempo de recuperação. Desta maneira, a adstringência de seleção pode ser ajustada de acordo com as necessidades de aplicações diferentes (tempo versus título volumétrico). Para certas aplicações, onde quantidades totais menores de proteína de interesse são suficientes, condições de seleção menos adstringentes podem ser usadas, desta maneira ainda obtendo grupos com uma taxa de produção suficientemente alta para permitir a purificação da respectiva proteína em quantidades suficientes. Para estabelecimento de uma linhagem de célula clonal que pode ser usada para produção da proteína de interesse em escala industrial, é preferido aplicar uma adstringência de seleção maior, a fim de obter clones de célula única que têm uma taxa de expressão muito alta combinada com uma taxa de estabilidade boa.

[00206] Ainda, análise dos grupos obtidos após seleção com ácido fólico/MTX para expressão na superfície do anticorpo através de FACS mostra que uso deste sistema de seleção em combinação com a linhagem de célula aumenta significantemente a abundância de produtores de taxa alta no grupo de célula como é aparente a partir dos perfis de fluorescência obtidos mostrados como Figuras 9A a E. A concentração de MTX foi aumentada de A a E (A: sem MTX; B: MTX 1nM; C: MTX 5nM; D: MTX 10nM; E: MTX 50nM). Quando aumentando a concentração de MTX, o número de clones de célula de expressão alta no grupo de célula foi aumentado como pode ser derivado do aumento do tamanho do pico no lado direito (fluorescência maior se relacionando com uma taxa de expressão de anticorpo maior). Uso de ácido fólico 50 nM em combinação com MTX 10 nM (vide Figura 9D) já resultou em um grupo de célula compreendendo predominantemente clones de célula de produção alta (um pico dominante no lado direito). Ainda, quando aumentando a concentração de MTX para 50 nM (vide Figura 9E), basicamente exclusivamente células de produção alta foram compreendidas no grupo obtido. Estes resultados são notáveis, porque quando usando a linhagem de célula C8DEL em combinação com o sistema de seleção de receptor de folato/DHFR, é obtido um perfil de grupo após análise FACS que lembra muito mais aquele de um clone de célula (compreendendo células geneticamente idênticas) do que aquele de um grupo de célula (compreendendo células geneticamente diferentes). Parece que a deleção do gene C12orf35 compreendido na região telomérica perdida da linhagem de célula C8DEL resulta em um aumento significante da produtividade volumétrica, de maneira que a maioria das células nos grupos de célula obtidos após seleção com ácido fólico/MTX sob condições apropriadas eram produtoras em taxa alta de acordo com perfis de FACS.

[00207] Ainda, foi constatado que quando cultivando clones estavelmente transfectados obtidos da linhagem de célula C8DEL (gene FAM60A é perdido, vide acima) em meio seletivo (ácido fólico 50 nM, MTX 10 nM), taxas de estabilidade de até 80% e até no máximo 100% poderiam ser obtidas em projetos. Resultados de estabilidade alta significantes foram também obtidos em um meio semisseletivo, que compreendia apenas uma concentração limitada de ácido fólico (50 nM), no entanto, nenhum MTX. Aqui, taxas de estabilidade de até 87% foram obtidas com esta linhagem de célula. Em certos projetos, taxas de estabilidade de até no máximo 100% foram obtidas.

Exemplo 5: Inativação de FAM60A em células CHO usando tecnologia TALEN

[00208] Dois clones de célula com base em células CHO derivadas da linhagem de célula CHO-K1 foram feitos, os quais compreendem uma mutação de inativação no gene FAM60A. Para criação das células mutantes em FAM60A, tecnologia TALEN (Transcription Activator-Like Effector Nucleases) foi usada. Para a inativação de FAM60A, uma região de codificação (exon 1 presumido) do gene FAM60A foi direcionada. As células CHO-K1 usada como célula parental contêm apenas uma cópia de FAM60A. Desta maneira, uma única inativação por célula é suficiente para prejudicar o efeito de FAM60A na dita célula.

5.1. Projeto/produção e uso de TALENs que são específicas para FAM60A

[00209] A sequência de exon de DNA genômico que segue do gene FAM60A da linhagem de célula parental CHO foi direcionada: atgtttggttttcacaagccaaagatgtaccgaagtatagagggctgctgtatctgcagagcca agtcctccagctctcggttcacggacagtaaacgttatgaaaaggacttccagagctgttttgg (SEQ ID NO: 51)

[00210] Os nucleotídeos dos sítios de ligação de TALEN são marcados em negrito. Duas TAL Fok I se direcionando à sequência de codificação de FAM60 mostrada acima (SEQ ID NO: 51) foram projetadas. TALEN TAL-L se direciona a e se liga aos 25 nucleotídeos marcados no filamento de DNA 5’ (direto) e TALEN TAL-R se direciona a e se liga aos 25 nucleotídeos marcados no filamento de DNA 3’ (reverso) do gene FAM60A como é mostrado acima para SEQ ID NO: 51 (vide também Tabela 10, que mostra ainda sequências de iniciador que foram subsequentemente usadas para identificação de inativações). Os dois sítios de ligação são separados pelos dezesseis nucleotídeos no sítio de corte. Plasmídeos codificando as duas TALENS TAL-L e TAL-R foram obtidos.Tabela 10. TALEN direciona sequências para inativação de gene FAM60A e sequências de iniciador

[00211] Uma porção da sequência de DNA genômico do gene FAM60A que compreende a sequência de codificação direcionada mostrada na SEQ ID NO: 51 e que também se estende pelos sítios de ligação de iniciador para iniciadores 1, 2 e 4 que estão localizados em seções de íntron é mostrada como SEQ ID NO: 58.

5.2. Transfecção do plasmídeo de TALEN

[00212] Transfecção foi realizada usando um protocolo de transfecção padrão envolvendo eletroporação usando as células CHO parentais em fase de crescimento exponencial com viabilidade acima de 95% e 5 μg de cada um dos plasmídeos de TALEN.

5.3. Ensaio de Célula-I e classificação de célula

[00213] Ensaio de Célula-I foi realizado de acordo com o manual de SAFC Biosciences. O ensaio Cel-I é um ensaio padrão a fim de determinar a eficiência de corte. Em suma, após vários dias de cultivo, DNA genômico foi isolado das células e uma PCR foi realizada usando iniciadores 1 e 2 (vide Tabela 10). O produto de amplificação foi desnaturado e deixado renaturar. Então, nuclease S e potencializador de nuclease S foram adicionados e incubados. O produto digerido foi analisado. Se atividade de TALEN ocorreu, duas faixas menores estão presentes indicando atividade de TALEN dentro desta região do genoma e, desta maneira, apoiando que células onde o gene FAM60A é inativado estão presentes no grupo de célula analisado. A partir de grupos de célula positivas, células únicas foram classificadas em placas de 96 cavidades através de diluição limitante.

5.4. Estratégia de avaliação

[00214] DNA genômico (gDNA) foi extraído de cada clone em placas de 96 cavidades. O gDNA foi analisado através de procedimento padrão para identificar clones de inativação através de análise de PCR. Para este propósito, os iniciadores 3 e 4 (vide Tabela 10) foram usados. No caso de uma mutação na região de corte, o iniciador 3 não se ligará de maneira que nenhum produto de PCR é gerado. Os produtos de PCR resultantes de PCR com iniciadores 1 e 2 de gDNA (vide acima) de clones positivos foram sequenciados a fim de analisar a mutação introduzida.

[00215] Dois clones com uma mutação de inativação foram obtidos: FAM60A_ko_s16 (s16), com uma deleção de 14 nucleotídeos e FAM60A-ko_s23 (s23) com uma deleção de 5 nucleotídeos. As sequências mutadas dos clones de célula são mostradas na Tabela 11. Cada uma das deleções resulta em mudança de estrutura. Devido à mudança de estrutura dentro da sequência direcionada de FAM60A, códons de parada são providos dentro da estrutura de leitura (destacada na Tabela 11 por nucleotídeos em letras em itálico e sublinhado). Desta maneira, é esperado que um produto de expressão de FAM60A anormalmente curto e menos ou não funcional seja expresso pelos clones de inativação de FAM60A obtidos.

[00216] Tabela 11: Sequência de DNA de exon 1 presumido de FAM60A em tipo selvagem de CHO (WT - derivado de CHO-K1) e dois clones de célula de inativação (s16 e s23) derivados do dito WT. Nucleotídeos de sítios de ligação de TALEN são destacados em negrito e nucleotídeos de códons de parada prematuros em letras em itálico e sublinhado.

5.5. Análise de estabilidade

[00217] A linhagem de célula WT parental a partir da qual os clones de inativação de FAM60A foram obtidos e as células de inativação de FAM60A obtidas foram estavelmente transfectadas com um vetor de expressão codificando um anticorpo como polipeptídeo de interesse. O vetor de expressão transfectado compreendia um cassete de expressão compreendendo um polinucleotídeo codificando uma neomicina fosfotransferase como marcador selecionável, um cassete de expressão codificando DHFR como marcador selecionável, um cassete de expressão compreendendo um polinucleotídeo codificando a cadeia leve de um anticorpo e um cassete de expressão compreendendo um polinucleotídeo codificando a cadeia pesada de um anticorpo de maneira que um anticorpo completo foi expresso a partir do dito vetor de expressão. Todos os cassetes de expressão nos vetores de expressão foram orientados na mesma direção. O cassete de expressão usado para a cadeia pesada foi projetado de maneira que uma porção da cadeia pesada foi expressa devido à leitura do códon de parada como polipeptídeo de fusão compreendendo uma âncora de membrana. A proteína de fusão foi exibida na superfície celular, desta maneira simplificando análise FACS (vide descrição). As células transfectadas foram selecionadas quanto à expressão recombinante usando seleção de G418 e MTX (1 μM). A partir dos grupos selecionados de cada linhagem de célula estavelmente transfectada (WT CHO, s16 e s23), clones de célula que expressavam o produto de interesse com bons rendimentos foram obtidos e foram culturados por várias semanas (7 semanas para linhagem de célula parental CHO WT (45 clones) e 8 semanas para as células de inativação de FAM60A (13 clones para s16 e 18 clones para s23)) a fim de analisar sua estabilidade de expressão durante cultura prolongada. Para assegurar que produção de linhagens de célula possa ser aumentada para biorreatores de volume alto, estudos de estabilidade de 12 semanas, em particular análise adicional da estabilidade de expressão durante cultura de 12 semanas, foram também realizados. Clones foram classificados como instáveis se eles tivessem perdido mais de 25% de seu título de expressão volumétrico inicial durante o período de estabilidade analisado. Dentro do nível comum de variação alguns clones estão um pouco acima ou abaixo da linha limite de 25%. A proporção maior de clones instáveis na semana 7/8 comparado com a semana 12 para linhagem de célula parental pode ser explicada com a variação no ensaio de produtividade para clones que estão mais próximo do limiar de 25%.

[00218] A Tabela 12 compara os resultados de estabilidade que foram obtidos com as linhagens de célula. Como pode ser visto, a porcentagem de clones com título volumétrico estável é consideravelmente maior nos clones derivados de qualquer linhagem de célula inativada em FAM60A comparado com os clones que são derivados da linhagem de célula do tipo selvagem. Isto demonstra que prejuízo do efeito de FAM60A endógeno na célula, aqui através da introdução de uma inativação de gene, melhora significantemente os resultados de estabilidade durante cultura prolongada. A razão de clones estáveis versus instáveis é significantemente aumentada quando usando as células da invenção de maneira que clones mais estáveis são obtidos, os quais mantêm suas características de expressão de alta favoráveis durante cultura prolongada. O anticorpo que foi recombinantemente expresso neste exemplo não foi otimizado no códon e mostrou na linhagem de célula parental um grau muito alto de instabilidade. Devido a esta instabilidade significante, este projeto foi escolhido como exemplo para comparação porque ele demonstra os benefícios significantes que são obtidos com a presente invenção mesmo quando sendo confrontado com projetos difíceis onde taxas de instabilidade são altas com a linhagem de célula não modificada do tipo selvagem. No entanto, conforme discutido acima, com outros projetos, as taxas de instabilidade não são tão altas com a linhagem de célula do tipo selvagem CHO parental. No entanto, em todos os casos analisados, as células hospedeiro de acordo com a presente invenção, onde o efeito de FAM60A é prejudicado nas ditas células, obtêm em comparação com o tipo selvagem não modificado um aumento significante na quantidade de células estáveis. As taxas de estabilidade podem atingir até 60% ou mais, 70% ou mais, 80% ou mais, 85% ou mais ou até mesmo 90% ou mais, dependendo do projeto. Com as células de acordo com a presente invenção, que, por exemplo, compreendem uma inativação de gene no gene FAM60A ou onde uma porção da região telomérica compreendendo gene FAM60A é perdida devido à ruptura de cromossomo, clones instáveis apareceram sem importar o projeto analisado significantemente com menos frequência e mesmo se aparecendo, a perda em produtividade volumétrica foi menos pronunciada comparado com células correspondentes onde o efeito de FAM60A não é prejudicado na célula. Desta maneira, devido à porcentagem aumentada de clones estáveis que são obtidos após transfecção e seleção, as células de acordo com a presente invenção permitem encurtar significantemente ou até mesmo pular estudos de estabilidade de longo prazo. Os estudos de estabilidade dos clones de inativação de FAM60A confirmam os resultados benéficos que são obtidos com a tecnologia da presente invenção.Tabela 12. Resultados de estudos de estabilidade

[00219] Os resultados são também mostrados na Figura 10 e demonstram as vantagens importantes que são obtidos quando se prejudica o efeito de FAM60A nas células, aqui através de inativação de gene. Desta maneira, é vantajoso prejudicar mais o efeito da proteína FAM60A na célula eucariótica, por exemplo, através da redução ou eliminação de expressão funcional do gene FAM60A através da alteração do genoma da célula eucariótica, uma vez que desta maneira, a estabilidade de expressão pode ser aperfeiçoada.

Exemplo 6: Ferramenta de validação para identificar produtores de taxa alta e estáveis com base no perfil de expressão

[00220] Uma ferramenta analítica de PCR em tempo real foi desenvolvida para prever produtividade e estabilidade de clone em um estágio inicial de processo de pipeline de desenvolvimento. RT-PCR em tempo real foi implementado para quatro genes: C12orf35, Dennd5b, FAM60A e Ipo8 (todos localizados na região telomérica no braço q do cromossomo 8). Após seleção e geração de clone, várias centenas de clones expressando estavelmente um anticorpo como polipeptídeo de interesse foram analisados com relação à presença e nível de expressão desses quatro genes na região telomérica do cromossomo 8 e o rendimento de expressão. Uma correlação clara foi encontrada entre produtividade de anticorpo volumétrica e uma perda na região telomérica do cromossomo 8. Ainda, foi constatado que estas células mostram níveis mais altos de mRNA de cadeia pesada e cadeia leve. Desta maneira, clones de célula de expressão alta podem ser identificados usando o dito método analítico.

[00221] Ainda, foi conduzido um estudo para determinar se há uma correlação entre estabilidade e presença de região telomérica de cromossomo 8. Clones foram classificados como estáveis se eles não perdessem mais de 25% de título volumétrico em 12 semanas. Uma correlação significante entre perda de região telomérica de cromossomo 8 e estabilidade de clone é existente (valor p: 4.67E-06 com base em teste x2). Consequentemente, a perda de região telomérica no cromossomo 8 pode ser usada como uma ferramenta de previsão para estabilidade. Análise da presença de região telomérica do cromossomo 8 através de RT-PCR em tempo real aumenta a probabilidade de selecionar uma proporção maior de clones estáveis em projetos de pipeline.

[00222] Ainda, foi constatado através de análise de várias centenas de clones que perderam uma porção da região telomérica do cromossomo 8 que parece haver vários pontos de ruptura na região telomérica do cromossomo 8 existentes que podem ser induzidos. Na maioria dos casos analisados, o ponto de ruptura estava localizado centromérico do gene Ipo8. Pontos de ruptura foram também detectados entre os genes da proteína 20 tipo metiltransferase (referida como 4833442J19Rik em camundongo) e Dennd5b, entre Dennd5b e FMA60A, entre FAM60A e Ipo8. A região de deleção compreendia em todos os casos gene C12orf35 (que está localizado telomérico do gene de codificação de proteína 20 tipo metiltransferase). Todos os pontos de ruptura foram associados com produtividade volumétrica alta, desta maneira confirmando a relevância do gene C12orf35 para a produtividade volumétrica.

Exemplo 7: Redução das células de expressão de gene C12orf35 através de interferência de RNA (RNAi) em uma linhagem de célula derivada de HEK293 aumenta rendimento de expressão

[00223] A fim de demonstrar que redução que redução de expressão de gene C12orf35 resulta também em outras linhagens de célula de mamífero em um aumento em produtividade volumétrica, dois siRNAs foram projetados contra C12orf35 de Homo sapiens. Sequências de siRNAs são listadas na Tabela 13. Como controle negativo de RNAi (controle negativo de siRNA), o Silencer® Negative Controle No. 1 siRNA (AM4611) foi usado.Tabela 13. siRNAs contra C12orf35 e gene controle

[00224] Os siRNAs usados foram validados usando RT-PCR em tempo real para confirmar que eles reduzem a expressão dos genes alvo através de silenciamento de gene. Expressão de gene foi normalizada para RNA 18S. A expressão de gene observada quando transfectando o controle negativo de siRNA foi ajustada como 100%. A redução relativa de expressão do gene alvo é mostrada na Tabela 14 subsequente para os dois siRNAs diferentes contra o gene alvo C12orf35:Tabela 14

[00225] Ainda, análise BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) com base em dados genômicos de Homo sapiens não indica quaisquer efeitos fora do alvo.

[00226] As linhagens de célula que seguem foram transfectadas: Uma linhagem de célula derivada de HEK293 foi usada como linhagem de célula parental. A dita linhagem de célula expressa estavelmente C12orf35. Um grupo derivado da transfecção estável de uma linhagem de célula derivada de HE293 com um vetor de expressão codificando uma proteína terapêutica recombinante de interesse estavelmente integrada no genoma foi usado para determinar o efeito dos siRNAs. O vetor de expressão no dito grupo de célula compreendia genes marcadores selecionáveis e a proteína terapêutica recombinante. O grupo que expressava recombinantemente a proteína recombinante foi usado a fim de determinar se uma sub-regulagem de C12orf35 resulta em um aumento da expressão do polipeptídeo de interesse. Se este fosse o caso, um aumento da produtividade volumétrica da proteína alvo do dito clone de célula seria visto.

[00227] O grupo derivado de HEK compreendendo vetor de expressão estavelmente integrado ao genoma foi transfectado ou com um controle de siRNA (não tendo um efeito sobre expressão de gene) ou com um dos siRNAs mencionados acima contra C12orf35. Após transfecção dos siRNAs foi analisado se a redução da expressão de C12orf35 resulta em um aumento da expressão da proteína recombinante.

[00228] Os resultados são mostrados na Tabela 15 para os siRNAs diferentes testados. As células derivadas de HEK293 foram transfectadas em escala de 6 cavidades com os respectivos siRNAs usando Lipofectamin2000 como reagente de transfecção. Cinco dias após transfecção a concentração da proteína alvo recombinante no sobrenadante de cultura celular foi medida usando HPLC de afinidade. Para isso um marcador curto da proprietária foi usado na proteína recombinante de interesse foi usado. Um aumento da proteína de interesse pôde ser detectado independente de qual dos dois siRNAs avaliados foi usado. Uma redução prolongada da expressão de gene C12orf35 através de interferência de RNA pode ser obtida se, por exemplo, estavelmente integrado em um vetor de expressão que expressa um transcrito de indução de RNAi. Ainda, uma redução ou eliminação da expressão de gene C12orf35 pode ser obtida através de inativação de gene ou deleção/mutação de gene. Ainda, como descrito aqui, é também possível reduzir ou eliminar o efeito do produto de expressão, por exemplo, através da introdução de uma ou mais mutações que resultam em uma proteína não funcional ou menos funcional.Tabela 15: Título volumétrico aumenta após transfecção de siRNA contra C12orf35

[00229] Ainda, expressão do gene C12orf35 foi analisada quando da repressão com siRNA 3 e 5 no dia 3 e no dia 5. Os resultados são mostrados na Tabela 16 subsequente:Tabela 16

Exemplo 8: Geração de linhagens de célula CHO que compreendem inativação de gene C12orf35 através de mutações de mudança de estrutura dentro do gene C12orf35

[00230] Três clones de célula de inativação de C12orf35 ("KO") com base nas células derivadas de CHO-K1 foram gerados usando tecnologia TALEN (Transcription Activator-Like Effector Nucleases). Para inativação, C12orf35 foi direcionado na região 5-iniciador. Adição de mutações de mudança de estrutura na região 5-iniciador tem a vantagem que a proteína truncada será curta.

8.1. Projeto/produção e uso de TALENs

[00231] Duas nucleases TAL FokI truncadas se direcionando à região 5-prime foram projetadas. Cada TALEN está se direcionando e se ligando a 19 nucleotídeos no filamento de DNA 5’ (no direto) ou 3’ (no reverso), respectivamente. Os dois sítios de ligação são separados por dezesseis nucleotídeos do sítio de corte. Cada TAL projetada foi sintetizada e clonada em um vetor de entrada adequado e subclonada em um vetor de destinação pcDNA3.3_DEST_A343. Descrição e produto e métodos estão disponíveis da Life Technology/GeneArt.

8.2. Transfecção de plasmídeos de TALEN

[00232] Células CHO parentais em fase de crescimento exponencial com viabilidade acima de 95% foram usadas para transfecção. Eletroporação (nucleofecção) foi realizada usando a tecnologia Amaxa®, Nucleofector® de acordo com as instruções do fabricante (Lonza). As células transfectadas foram expandidas no dia 5 após transfecção e células únicas separadas no dia 8 em placas de 20 x 96 cavidades. Monoclonalidade e confluência foram controladas com o CloneSelect® Imager (Genetix).

8.3. Ensaio Cel-I e estratégia de avaliação

[00233] O ensaio Cel-I foi realizado de acordo com o manual da SAFC Biosciences. O ensaio Cel-I é um ensaio padrão a fim de determinar a eficiência de corte. Em suma, após 6 dias de cultivo, DNA genômico foi isolado das células e uma PCR foi realizada usando os iniciadores que seguem: Dir: GCATCCAGTGAACTTACTTATCCAGAT (SEQ ID NO: 65) Rev: GCTCTGCCACTGCTGTTGAAAG (SEQ ID NO: 66)

[00234] O produto de amplificação foi desnaturado e deixado renaturar. Então, nuclease S e potencializador de nuclease foram adicionados e incubados. O produto digerido foi analisado. Duas faixas menores estavam presentes indicando atividade de TALEN dentro desta região do genoma e, desta maneira, apoiando que células onde o gene C12orf35 é alterado por mutação estavam presentes nos grupos de célula analisados. A partir dos grupos de célula mais positivos (intensidade mais forte das duas faixas menores), células únicas foram classificadas em placas de 96 cavidades.

[00235] DNA genômico (gDNA) foi extraído de cada clone em placas de 96 cavidades usando os Extract-N-Amp® Blood PCR Kits (cat. XNAB2R, Sigma). Os extratos de gDNA foram usados para avaliar clones mutados, em um ensaio de PCR usando o Iniciador Direto (Dir) (SEQ ID NO 67: TGCTGGGATTAAAGGGGAAAGCTTT) em combinação com um iniciador ("Iniciador de Corte") ligando no sítio de corte que tinha a sequência que segue:Iniciador de Corte: TCTAGAAACAGACTGAGAATTTTGCAC (SEQ ID NO: 68)

[00236] Clones com mutações foram transferidos em frascos de agitação de 125 mL e sequenciados. Nos ditos ensaios de avaliação 10 clones foram identificados e três clones selecionados para análise adicional. Os genótipos dos três clones são mostrados na Tabela 17 destacando as sequências de C12orf35 5-iniciador se referindo ao tipo selvagem e às respectivas mutações. As respectivas sequências de aminoácido são mostradas na Tabela 18.

[00237] Tabela 17: Sequências de gene C12orf35 codificando a extremidade 5-prime de WT derivada de CHO-K1 e dos clones de KO diferentes. Δ indica uma deleção. O número atrás de Δ indica quantos nucleotídeos foram deletados. Em parênteses, os nucleotídeos deletados são mostrados e fornecidos com uma SEQ ID NO separada como indicado. Sítio de ligação de TALEN e sítio de corte são marcados em negrito. Sequências ao redor dos sítios de ligação e corte de TALEN foram confirmadas por sequenciamento Sanger em clones de KO e o resto da sequência é baseado na suposição de ser a mesma que a sequência do tipo selvagem.

[00238] Tabela 18: Sequências de aminoácido de C12orf35 parciais de WT CHO e clones de KO. Uma estrela * representa o primeiro códon de parada ocorrendo devido às respectivas mutações de mudança de estrutura. Devido à deleção de 8 pb respectivos 20 pb para clones "Δ8" respectivos "Δ20" apenas partes das traduções em estrutura dos sítios de ligação a TALEN estão ainda presentes e são marcados em negrito. O clone "Δ59 mais inserções de nucleotídeo "C" e "A"" não mostra mais nenhum sítio de ligação de TALEN devido à inserção do nucleotídeo C antes do sítio de ligação de TALEN e da mudança de estrutura resultante.

[00239] A fim de confirmar os resultados dos experimentos de siRNA, um candidato a anticorpo foi expresso em três clones de célula de inativação em C12orf35 em um cultivo de batelada e alimentação em batelada e os títulos de anticorpo volumétricos foram analisados e comparados com os resultados obtidos com uma linhagem de célula do tipo selvagem de CHO correspondente que expressa endogenamente C12orf35 intacto.

8.4. Transfecção do vetor de codificação de mAb

[00240] A linhagem de célula do tipo selvagem CHO, o C8DEL descrito acima e os clones de célula CHO de inativação de C12orf35 (vide Tabelas 17 e 18) foram transfectados com vetores de expressão compreendendo polinucleotídeos codificando anticorpos monoclonais (mAb) e dois genes marcadores selecionáveis, a saber neo e DHFR. Dois vetores codificando dois anticorpos exemplares diferentes (anticorpo 1 e anticorpo 2) foram avaliados. Para transfecção, as células foram cultivadas para fase exponencial e 5 x 106 células foram transfectadas com 3 μg de DNA de vetor. Três réplicas de transfecção foram realizadas. Seleção de células estavelmente transfectadas com os vetores codificando a proteína de interesse foi realizada com G418 (concentração de G418 0,8 mg/mL) seguido por seleção com MTX (500 nM). As condições de seleção foram idênticas para todos os grupos. Durante o processo de seleção, títulos volumétricos de mAB expresso no meio foram determinados. O título volumétrico no sobrenadante dos clones com inativação de C12orf35 foi comparado com o título volumétrico do tipo selvagem de CHO. As células foram cultivadas em agitadores contendo um meio químico definido. O cultivo em batelada foi realizado na temperatura de 37° C e sob condições de agitação. Durante o cultivo em batelada alimentada as células foram cultivadas em agitadores contendo um meio químico definido enriquecido em aminoácidos. O cultivo em batelada alimentada foi realizado na temperatura de 37° C e agitação e uma mudança de temperatura foi realizada no dia 5 para 33° C. Ainda, uma alimentação contendo glicose e aminoácidos foi regularmente adicionada ao longo do processo. Durante o processo de cultivo de batelada alimentada, amostras do material de cultura de batelada alimentada foram regularmente coletadas para determinar a densidade de célula viável (vcd) usando um analisados de viabilidade de célula Vi-Cell (Beckman Coulter) e determinar os títulos de proteína no meio de cultura celular. No final da batelada e batelada alimentada (dia 14), o processo de cultivo foi parado. Análise das culturas de batelada e batelada alimentada revelou que durante o período de 14 dias de cultivo, o título volumétrico de mAb expresso no meio de cultura dos grupos de C12orf35 foi similar ao título volumétrico de C8DEL e significantemente maior do que no meio de cultura de grupos de célula do tipo selvagem CHO.

[00241] Após a primeira etapa de seleção (seleção com G418) um aumento de título volumétrico massivo (4-10 vezes) pôde ser detectado para os grupos de KO de C12orf35 estavelmente transfectados em comparação com os grupos parentais estavelmente transfectados. Após a segunda etapa de seleção (seleção com MTX) os grupos de KO C12orf35 estavam expressando 4-7 vezes mais polipeptídeo de interesse em comparação com as células parentais transfectadas (batelada) e 2-6 vezes mais polipeptídeo (batelada alimentada). Títulos de G418 e MTX volumétricos (batelada alimentada) de grupos de KO C12orf35 em comparação com a linhagem de célula CHO parental são mostrados para os projetos de anticorpo exemplares 1 e 2 nas Tabelas 19 e 20 que seguem. As Tabelas 19 e 20 mostram o título de grupo volumétrico de batelada e batelada alimentada de G418 e MTX (anticorpo) produzido em grupos de KO C12orf35 em comparação com os grupos parentais (média de 3 grupos/condição são mostrados).Tabela 19: Títulos de grupo conforme exemplificado pelo anticorpo 1

Tabela 20: Títulos de grupos conforme exemplificado pelo anticorpo 2

[00242] Os resultados apoiam a conclusão que a perda de função de C12orf35 está relacionada com produtividade volumétrica maior.

[00243] Ainda, um tempo de seleção mais curto (etapas de G418 e MTX) pôde ser detectado para os grupos de KO C12orf35 estavelmente transfectados em comparação com os grupos parentais estavelmente transfectados. O tempo de seleção foi em média 7 dias mais curto para os grupos de KO C12orf35.

Claims

1. Método para produzir de forma recombinante um produto de interesse, caracterizado pelo fato de que compreende a utilização de uma célula hospedeira eucariótica como célula hospedeira para expressão recombinante do produto de interesse e o método compreendendo: (a) cultura das células hospedeiras sob condições que permitam a expressão do produto de interesse, em que na referida célula hospedeira o efeito do produto de expressão do gene C12orf35 é prejudicado porque a expressão funcional do gene C12orf35 é reduzida ou eliminada por nocaute do gene, mutação do gene, deleção do gene, silenciamento do gene ou uma combinação de qualquer um dos anteriores, em que o gene C12orf35 é um gene que codifica uma proteína que tem uma das sequências de aminoácidos mostradas nas SEQ ID NO: 1 a 7 ou a proteína codificada pela SEQ ID NO: 8, e em que a célula compreende pelo menos um polinucleotídeo heterólogo que codifica o produto de interesse compreendido em um cassete de expressão; (b) isolamento do produto de interesse a partir do meio da cultura celular e/ou a partir das ditas células hospedeiras; e (c) opcionalmente, processamento do produto de interesse isolado; em que o produto de interesse é um polipeptídeo.

2. Método para produção de uma célula hospedeira eucariótica para produzir de forma recombinante um produto de interesse, caracterizado pelo fato de que compreende prejudicar o efeito do produto de expressão de um gene C12orf35 na referida célula, em que o gene C12orf35 é um gene que codifica uma proteína que apresenta uma das sequências de aminoácido mostradas nas SEQ ID NOs: 1 a 7, ou a proteína codificada pela SEQ ID NO: 8.

3. Método para analisar as células eucarióticas quanto à sua adequabilidade como células hospedeiras para expressão recombinante de um produto de interesse, caracterizado pelo fato de que o método compreende: (1) analisar direta ou indiretamente se o efeito do produto de expressão do gene endógeno C12orf35 é prejudicado nas referidas células, em que o gene C12orf35 é um gene codificando uma proteína que apresenta uma das sequências de aminoácido mostradas nas SEQ ID NOs: 1 a 7, ou a proteína codificada pela SEQ ID NO: 8, em que o método compreende ainda (2) selecionar pelo menos uma célula onde a expressão funcional de C12orf35 é prejudicada porque a expressão funcional do gene C12orf35 é reduzida ou eliminada através do nocaute do gene, mutação do gene, deleção do gene, silenciamento do gene, ou uma combinação de qualquer um dos acima, para expressão recombinante do produto de interesse.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que compreende uma ou mais das tipificações que seguem: (a) o prejuízo do efeito do produto de expressão do gene C12orf35 aumenta a expressão do produto de interesse na referida célula; (b) as células são células de mamíferos, opcionalmente células de roedores.

5. Método, de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que as células eucarióticas são células de hamster e o método compreende analisar se a expressão de um ou mais genes localizados na região telomérica do cromossomo 8 e sendo selecionados do grupo que consiste no gene Tmtc1 e genes localizados no telomérico do gene Tmtc1, é eliminada ou reduzida, analisando assim se a expressão do gene C12orf35 é reduzida ou eliminada nas referidas células.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 5, caracterizado pelo fato de que o produto de interesse é um polipeptídeo.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira eucariótica apresenta uma ou mais das seguintes características: (a) o gene C12orf35 compreende como mutação do gene uma ou mais mutações no gene C12orf35 que fornecem um produto de expressão não ou menos funcional; (b) pelo menos uma ou todas as cópias do gene C12orf35 são deletadas ou funcionalmente inativadas no genoma da célula eucariótica; (c) uma porção de um cromossomo é deletada, em que a porção deletada compreende o gene C12orf35.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a célula eucariótica tem uma ou mais das seguintes características: (a) a célula eucariótica é uma célula de metazoário; (b) a célula eucariótica é uma célula de vertebrado; (c) a célula eucariótica é uma célula de mamífero; (d) a célula eucariótica é uma célula de roedor, (e) a célula eucariótica é uma célula de hamster; (f) a célula eucariótica é uma célula CHO; (g) a célula eucariótica é fornecida como clone celular ou linhagem celular; (h) a célula eucariótica expressa endogenamente DHFR e um receptor de folato.

9. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que na característica (c): (a) a célula eucariótica é uma célula de hamster e pelo menos uma porção da região telomérica do cromossomo 8 é deletada, em que a referida porção deletada compreende o gene C12orf35; ou (b) a célula eucariótica é uma célula de camundongo e pelo menos uma porção da região telomérica do cromossomo 6 é deletada, em que a referida porção deletada compreende o gene C12orf35.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a região telomérica deletada compreende o gene C12orf35 e compreende um ou mais genes selecionados dentre o grupo que consiste em Bicd1, Amn1, proteína tipo metiltransferase 20, Dennd5b, FAM60A, Caprin2, Ipo8 e RPS4Y2.

11. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a deleção é induzida pela quebra do cromossomo e o ponto de quebra está localizado no centro do gene Ipo8.

12. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a deleção é induzida pela quebra do cromossomo e o ponto de quebra está localizado no centro do gene Ipo8 dentro do gene Tmtc1.

13. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma porção da região telomérica é deletada em ambos os cromossomos do respectivo par de cromossomos, em que as porções deletadas compreendem o gene C12orf35.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 13, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira eucariótica isolada tem uma ou mais das seguintes características: (a) a deleção do gene é a deleção do gene completo C12orf35; (b) a mutação do gene é selecionada dentre uma ou mais mutações de deslocamento de quadro na sequência de codificação e ou um ou mais códons de parada introduzidos na sequência de codificação; e/ou (c) o silenciamento gênico é realizado por moléculas antissenso ou por moléculas que medeiam a interferência de RNA compreendida na célula.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 14, caracterizado pelo fato de que: (a) a expressão funcional do gene C12orf35 é reduzida ou eliminada na referida célula e em que a redução ou eliminação resulta em um aumento na produção volumétrica de um produto recombinante de interesse em comparação com uma célula correspondente em que a expressão funcional do gene C12orf35 não é reduzida ou eliminada; (b) o prejuízo do efeito do produto de expressão do gene C12orf35 aumenta a expressão do produto de interesse na referida célula; e/ou (c) o genoma da célula eucariótica é alterado para prejudicar o efeito do produto de expressão do gene C12orf35 na referida célula.

16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 15, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo heterólogo que codifica o produto de interesse está compreendido em um cassete de expressão que está integrado no genoma da célula eucariótica.

17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 16, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira eucariótica isolada tem uma ou mais das seguintes características: (a) a célula eucariótica compreende integrado em seu genoma pelo menos um polinucleotídeo heterólogo que codifica o produto de interesse e pelo menos um polinucleotídeo heterólogo que codifica um marcador selecionável ou polipeptídeo repórter e em que os referidos polinucleotídeos heterólogos estão localizados no mesmo ou em diferentes vetores de expressão; e/ou (b) a célula eucariótica compreende um polinucleotídeo heterólogo que codifica um receptor de folato como marcador selecionável e/ou compreende um polinucleotídeo heterólogo que codifica uma di-hidrofolato redutase (DHFR) como marcador selecionável.

18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 17, caracterizado pelo fato de que a célula eucariótica secreta o referido polipeptídeo de interesse para o meio de cultura celular.