JP6998892B2 - 細菌組成物の作製方法 - Google Patents
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Description
(a)有益な細菌と、バイオフィルム産生細菌とのインビトロ共培養を、有益な細菌と、非病原性細菌とを含むバイオフィルムを生じさせる条件のもと、成長基材において行うこと;および
(b)バイオフィルムを成長基材から単離し、それにより、細菌組成物を調製すること
を含む方法が提供される。
(a)有益な細菌と、バイオフィルム産生細菌とのインビトロ共培養を、有益な細菌と、非病原性細菌とを含むバイオフィルムを生じさせる条件のもと、成長基材において行うこと;および
(b)バイオフィルムを成長基材から単離し、それにより、細菌組成物を調製すること
を含む方法が提供される。
このプロセスを介して、アンモニウムおよび硝酸塩(天然水域における富栄養化の原因となっている2つの汚染物質)が除染される。
バイオフィルム形成
材料および方法
菌株および成長条件:本研究で使用されたプロバイオティック細菌株はラクトバシラス・プランタルムであった。この菌株は日常的には、MRS(Man、Rogosa&Sharpe)ブロス、または1.5%の寒天(Difco(商標))を使用して固化されるMRSブロスのどちらかにおいて成長させられる。バシラス・スブチリスの野生株NCIB3610およびその誘導体が典型的には、LB(1リットルあたり10gのトリプトン、5gの酵母エキス、5gのNaCl)ブロス、または1.5%の寒天により固化されるLBにおいて培養される。それらの使用に先立って、L.plantarumおよびB.subtilisを硬寒天平板において、ともに37℃で、48時間または一晩にわたってそれぞれ成長させた。それぞれの菌株のスターター培養物を、およそ1.5のOD600に達するまで、単一細菌コロニーを使用して調製した(L.plantarumを、撹拌を伴うことなく8時間にわたって5mLのMRSブロスに接種し、B.subtilisを、37℃、150rpmで5時間にわたってLB培地に接種した)。共培養実験については、B.subtilisによるバイオフィルム形成を促進させることにおいて効果的であり、かつ、B.subtilisおよびプロバイオティック乳酸菌(LAB)の共培養による培養のために好適であることが見出されたので、pH7でのMRS培地を使用した。B.subtilis細胞を等量のL.plantarum細胞と混合して、それぞれの菌株が108細胞/mLである最終濃度とし、その後、MRS(pH7)に1:100で希釈した。混合培養物における細胞を好気的に37℃において50rpmで7時間~8時間インキュベーションした。
共培養でのB.subtilisおよびL.plantarumの相互成長のためのシステム開発
バイオフィルムが、見かけ上は細胞外マトリックスの産生に起因すると思われるが、様々な好ましくない環境条件に対する増大した耐性を有することが以前に示された(Friedman、Kolter&Branda、2005)。したがって、本発明者らは、頑強なバイオフィルムの形成細菌のB.subtilisによって産生される細胞外マトリックスが他の細菌種(例えば、プロバイオティック細菌など)に対する増大した保護を共培養バイオフィルム系においてそれらの成長の期間中にもたらしているかもしれないと仮定した。この目的を達成するために、L.plantarumおよびB.subtilisが共培養で成長することができる特殊培地を開発した。MRSのpHをpH7に変更することによって、これらの細菌を共培養で成長させることが可能であることが見出された。図13に示されるように、共培養による培養は、L.plantarumおよびB.subtilisの成長に対する影響を(純粋培養におけるそれらの成長と比較して)何ら有しておらず、このことは、拮抗的相互作用が所与条件においてこれらの細菌の間にはないことを示していた。驚くべきことに、MRS培地の改変はB.subtilisによるバイオフィルム形成を強く促進することが見出された(図2)。B.subtilisは、酸性pHに対して感受性があるように思われるので、共培養による培養のために使用されるMRS培地のpHを、バシラス属の成長のために好適であるpH値を見出すために徐々に上昇させた。pHを6から8に上げることにより、コロニーバイオフィルムおよび菌膜バイオフィルムの両方のバイオフィルム表現型の堅固性における比例した増大がもたらされた(図2)。pHを6に調節したときには、固体MRS培地での弱い成長が見られ、液体培地では成長が見られなかった。6.5へのpH調節により、固体MRSおよび液体MRSの両方における細菌成長が認められただけでなく、驚くべきことに、固体培地でのバイオフィルム形成が始まることもまた認められた。pHを7および8に上げた後では、両方の成長設定における極めて頑強なバイオフィルム表現型が認められた。次に、MRS(pH7)およびLBにおけるB.subtilisの成長速度を比較した。図13において認められ得るように、わずかな遅れが、LBと比較した場合、MRSにおける微生物成長の開始時に見られた。しかしながら、より大きい速度の成長が、LBと比較した場合、MRSにおいて成長させられるB.subtilis細胞についてはその後に認められた。
バイオフィルム発達およびマトリックス遺伝子発現を促進させることにおけるMRS培地の可能性を評価するために、LB培地(これは通常、B.subtilisを培養するために使用される)を種々の量のMRSにより強化した(1:1、1:5、および5:1)。バイオフィルム表現型と、MRS濃度の増大との間における正比例的な相関が示された(図3)。tapAオペロンおよびepsオペロンを使用するB.subtilisにおけるマトリックス遺伝子発現に対する、MRS濃度を増大させることの影響もまた、それらの産物が細胞外マトリックスの主要な成分であるので調べた。tapAの発現がLBにおけるMRSの濃度に関して比例して増大することが見出された(図4)。epsの発現が、80%のMRSまではMRSの濃度に比例して増大し、その後、100%については発現の低下が検出された(図5)。
改変MRS培地を使用して、二重菌種バイオフィルムを、GFPを構成的に発現する蛍光標識されたB.subtilis細胞(YC161)をL.plantarum細胞と共培養することによって調べた。生じたバイオフィルムを、CLSMを使用して可視化した。図8A(上段パネル)において認められ得るように、生じたバイオフィルムは、蛍光性細胞および非蛍光性細胞の両方からなった。L.plantarum細胞が、バイオフィルム関連構造(束)を形成するために互いに付着するB.subtilis細胞によって取り囲まれていた。このことがさらに、LBGM培地におけるB.subtilisおよびL.plantarumの共培養されたバイオフィルムを例示する図8Bにおいて例示される。
共培養バイオフィルムにおいてB.subtilisによって産生されるマトリックスが、好ましくない環境条件からの防御をL.plantarumに提供し得るであろうかどうかを明らかにするために、L.plantarum細胞の生存を熱処理(工業的加工(例えば、低温殺菌など)を模擬する条件)の期間中に、同様にまた、冷凍(貯蔵条件を模擬する条件)の期間中に調べた。熱処理の低温殺菌については、共培養バイオフィルムで成長させられるL.plantarum細胞を63℃での1分間および3分間の加熱にさらした。低温処理については、共培養バイオフィルムで成長させられるL.plantarum細胞を4℃で21日間まで貯蔵した。単一種培養で成長させられるL.plantarum細胞をコントロールとして使用した。1分および3分の熱処理の後では、共培養バイオフィルムで成長させられるL.plantarum細胞は、コントロールと比較して、生L.plantarum細胞の数におけるおよそ1.25Log CFU/mLおよび1.06Log CFU/mLの増大をそれぞれもたらした(図10)。そのうえ、低温処理実験からの結果は、共培養バイオフィルムで成長させられるL.plantarum細胞が貯蔵条件の期間中を通してはるかにより多く保護されることを示し、その生存度におけるおよそ0.44~0.89Log CFU/mLの増大を明らかにした(図10)。
好ましくない環境条件に対するL.plantarumの増大した抵抗性が細胞外マトリックスによって促進されることをさらに証明するために、L.plantarumと、B.subtilis変異菌株(バイオフィルム形成欠損菌株(ΔepsΔtasA)またはバイオフィルムマトリックス過剰産生菌株(ΔabrB)のどちらか)との共培養物を生じさせた。共培養物を熱処理の低温殺菌に供した。単一種培養で成長させられるL.plantarum細胞、および、野生型B.subtilisとの共培養で成長させられるL.plantarum細胞をコントロールとして使用した。図11Aに示されるように、ΔepsΔtasA二重変異体の細胞とともに成長させられるL.plantarum細胞は、単一種培養で成長させられるL.plantarumと比較して、その生存レベルにおける有意差を示さなかった。しかしながら、野生型B.subtilisとの共培養で成長させられるL.plantarum細胞の生存における有意な増大が認められた。興味深いことに、単一培養で成長させられるL.plantarumの生存率と比較した場合、ΔabrB変異細胞の存在下で成長させられるL.plantarum細胞の生存率における約1.78Log CFU/mLの増大が認められた。
胃腸管における移行時のL.plantarumの生存能を調べるために、L.plantarumの生存率を、インビトロ消化モデルを使用して調べた(図12)。模擬の胃条件における2時間のインキュベーションの後において、およそ0.86Log CFU/mLの生細胞濃度における増大が、単一培養物のL.plantarum細胞と比較して、B.subtilisとの共培養バイオフィルムで成長させられるL.plantarum細胞について認められた。その後、細胞を模擬の腸条件のもとで2時間インキュベーションした。生細胞濃度におけるおよそ0.9Log CFU/mLの増大が、L.plantarumの自由生活細胞と比較して、バイオフィルムによって保護されるL.plantarum細胞について認められた。
アセトインはバイオフィルム形成を増強させる
食品製造物は多くの場合、製造物の感覚刺激特性および官能特性を改善し得る種々の食品添加物によって強化される。そのような添加物の中には、種々の食品製造物の風味を改善することができる重要な小分子(例えば、アセトインなど)が含まれる。アセトインは、自然界に広く存在する中性分子である。一部の微生物、高等植物、昆虫および高等動物が、アセトインを合成する能力を有する。そのような添加物は、ヒトの健康に関連する多くの細菌の生理学に影響を及ぼす可能性があり、また、バイオフィルムとして知られている細菌細胞の多細胞共同体の発達に影響を及ぼす可能性がある。バイオフィルム形成は、構成細胞を一緒に保持する細胞外マトリックスの合成に依存する。バシラス・スブチリス(プレバイオティック細菌)において、細胞外マトリックスは、2つの主要な成分(epsA-Oオペロンの産物によって合成される菌体外多糖、およびtapA-sipW-tasAオペロンによってコードされるアミロイド繊維)を有する。
図15A~図15Cに例示されるように、アセトインはバシラス・スブチリスにおけるバイオフィルム束形成を誘発する。アセトインの非存在下では、バイオフィルム形成が、LB培地において成長させられるときには認められない(図15A)。図16A~図16Bは、アセトインがコロニー型バイオフィルムの形成をバシラス・スブチリスにおいて誘発することを例示する。B.subtilisにおけるマトリックス産生に関わるtapAオペロンの転写が、アセトインによって非常にアップレギュレーションされることが示された(図17A~図17D)。
Claims (33)
- 細菌組成物を調製する方法であって、前記方法が、
(a)有益な細菌とバイオフィルム産生細菌とのインビトロ共培養を、前記有益な細菌と前記バイオフィルム産生細菌とを含むバイオフィルムを生じさせる条件のもと、成長基材上で行うこと;および
(b)前記バイオフィルムを前記成長基材から単離し、それにより、細菌組成物を調製すること
を含み、前記バイオフィルム産生細菌が、前記有益な細菌とは異なる属の細菌である、方法。 - 前記バイオフィルム産生細菌は非病原性細菌である、請求項1に記載の方法。
- 前記バイオフィルム産生細菌はバシラス属である、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記バイオフィルム産生細菌はB.subtilis種である、請求項3に記載の方法。
- 前記有益な細菌はプロバイオティック細菌である、請求項1に記載の方法。
- 前記有益な細菌は、治療用ポリペプチドを発現するように遺伝子改変される、請求項1に記載の方法。
- 前記プロバイオティック細菌はラクトバシラス目である、請求項5に記載の方法。
- 前記バイオフィルム産生細菌はB.subtilis種である、請求項5又は7に記載の方法。
- 前記プロバイオティック細菌はL.plantarum種である、請求項5又は7に記載の方法。
- 前記有益な細菌はバイオレメディエーションで使用される、請求項1に記載の方法。
- 前記バイオフィルム産生細菌はKinD-Spo0A経路の遺伝子を発現する、請求項1に記載の方法。
- 前記成長基材は成長培地を含む、請求項1~9のいずれかに記載の方法。
- 前記成長培地は、LB、LBGM、乳汁およびMRSからなる群から選択される、請求項12に記載の方法。
- 前記バイオフィルム産生細菌はバシラス属であり、前記有益な細菌はラクトバシラス目であり、前記成長基材は、LBGM、乳汁またはMRSである、請求項1に記載の方法。
- 前記成長基材はMRSである、請求項11又は14に記載の方法。
- 前記条件は、6.5~8のpHを含む、請求項14又は15に記載の方法。
- 前記条件は、6.8~7.5のpHを含む、請求項16に記載の方法。
- 前記成長基材はアセトインを含む、請求項1~17のいずれかに記載の方法。
- 前記バイオフィルムを前記単離後に脱水することをさらに含む、請求項1~18のいずれかに記載の方法。
- 前記有益な細菌は、最大でも50種の細菌種を含む、請求項1~19のいずれかに記載の方法。
- 前記バイオフィルム産生細菌は、1つだけの菌種のバイオフィルム産生細菌である、請求項1~20のいずれかに記載の方法。
- 単離されたバイオフィルムを含む細菌の食用組成物であって、前記バイオフィルムが、有益な細菌とバイオフィルム産生細菌とを含み、前記有益な細菌が、バイオフィルムに取り込まれていないコントロールの有益な細菌と比較して、前記バイオフィルム中でより耐熱性又は耐冷性であり、前記バイオフィルム産生細菌が、前記有益な細菌とは異なる属の細菌である、細菌の食用組成物。
- 組成物における細菌の少なくとも50%が成長可能である、請求項22に記載の細菌の食用組成物。
- 最大でも50種の細菌種の有益な細菌を含む、請求項22に記載の細菌の食用組成物。
- 1つだけの菌種の非病原性細菌を含む、請求項22又は24に記載の細菌の食用組成物。
- プロバイオティック細菌組成物である、請求項22に記載の細菌の食用組成物。
- 粉末、液状物または錠剤として配合される、請求項22に記載の細菌の食用組成物。
- 細菌組成物を調製するために好都合である作用因または培養条件を選択する方法であって、有益な細菌と、バイオフィルム産生細菌との共培養を、有益な細菌と、バイオフィルム産生細菌とを含むバイオフィルムを生じさせるように、前記作用因の存在下、または前記培養条件のもと、成長基材において行うことを含み、前記バイオフィルムの特性における変化により、前記作用因または培養条件が、細菌組成物を調製するために好都合であることが示される、方法。
- 前記バイオフィルム産生細菌はバシラス属である、請求項28に記載の方法。
- 前記バイオフィルム産生細菌はB.subtilis種である、請求項29に記載の方法。
- 前記有益な細菌はプロバイオティック細菌である、請求項30に記載の方法。
- 前記プロバイオティック細菌はラクトバシラス目である、請求項31に記載の方法。
- 作用因は系の培地のpHを変化させる、請求項28に記載の方法。
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