CN109475170A - 生成细菌组合物的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请公开一种制备细菌组合物的方法。该方法包括:(a)在产生生物膜的条件下,在生长基质中体外共培养有益细菌与产生物膜细菌,所述生物膜包含有益细菌和非致病细菌;和(b)将生物膜与生长基质分离。
Description
发明领域和背景
本发明,在其某些实施方案中,涉及生成细菌组合物的方法,更特别地但不排他地涉及益生素组合物、有益于环境的益生素组合物和用于工业的益生素组合物。
以足够的数量给予时赋予宿主有益的生理作用的活的微生物细胞被称为"益生素"。研究表明,益生菌在维持肠道健康和控制数种类型的胃肠道感染方面,对宿主可提供治疗作用。由于认识到益生菌的健康益处,在过去的几十年里,益生菌越来越多地被加入各种食物和饮料产品中。用作益生素的一些最常见类型的微生物是乳酸菌(LAB),其主要属于乳酸杆菌属(Lactobacillus)和双歧杆菌属(Bifidobacterium)。这两个菌属都是人类肠道的主要栖息菌,并有着悠久的安全使用历史,被认为是GRAS (通常认为是安全的)。为了确保它们在体内的有益作用,这些生物体必须在食物加工、贮存和通过上胃肠道(GIT)的过程中存活下来并活着到达它们的作用部位。然而,先前的研究已表明,益生菌在最终食品中的存活水平低,在胃的高酸性条件和小肠中高胆汁浓度的情况下,它们的存活力有相当大的损失。此外,益生素通常可以作为主要是通过冷冻干燥来制备的干燥细菌粉末而获得,而冷冻干燥已被确立为一种可能对细胞造成致命伤害的方法。因此,有必要开发新的技术,以改善在食品生产、以及通过贮存和摄入过程以保持益生素递送至人类的过程中促进健康的细菌的生存。
在大多数自然生态***中,细菌偏好在称为生物膜的多细胞的复杂群落中生长,而不是作为自由生活(浮游的)细胞生长。生物膜生长方式对于居住在肠道的细菌也是优选的。生物膜中的细胞被细胞外基质结合在一起,细胞外基质主要由多糖和其他大分子(如蛋白质、DNA、脂质和核酸)组成,这些大分子是由细胞自身产生的。嵌入生物膜中的物种与其环境之间的相互作用导致能够抵抗环境应激和接触抗微生物剂的复杂结构的形成。因此,生物膜形成代表了在不同环境中的不利条件下的持久性策略。
研究较多的生物膜形成菌之一是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),它是一种形成孢子的非致病细菌,其特征在于其产生健壮的生物膜的能力。芽孢杆菌(Bacillus)物种,主要是枯草芽孢杆菌(B. subtilis),作为益生素微生物近年来受到人们的关注,因为它们显示主要通过保持胃肠道微生物丛的有利平衡而积极影响宿主的健康状况。由于枯草芽孢杆菌孢子能够在极端的pH条件和低氧下生存,所以大量的休眠但存活的微生物可到达下肠道,其可通过活性物质的分泌而诱导一些有益的效果。而且,已发现枯草芽孢杆菌细胞可通过过氧化氢酶和枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)的产生来促进乳杆菌(lactobacillispp.)的生长和存活力(Hosoi, Ametani, Kiuchi, & Kaminogawa, 2000)。也有报道称,由枯草芽孢杆菌产生的作为细胞外基质的一部分的ϒ-聚谷氨酸可被用来改善冷冻干燥过程(A. R. Bhat等人, 2013)和贮存期间(A. R. Bhat等人, 2015)益生菌的存活。在模拟胃的酸性条件的模拟胃液中也是如此(A. R. Bhat等人, 2015)。
另外的背景技术包括美国申请号20100203581和Salas Jara等人,Microorganisms 2016, 4, 35; doi:10.3390。
发明概述
依据本发明的一个方面,提供一种制备细菌组合物的方法,包括:
(a) 在产生生物膜的条件下,在生长基质中体外共培养有益细菌与产生物膜细菌,所述生物膜包含有益细菌和非致病细菌;和
(b) 将生物膜与生长基质分离,从而制备细菌组合物。
依据本发明的一个方面,提供一种依据本文描述的方法获得的细菌组合物。
依据本发明的一个方面,提供一种食物/饲料产品,其包含本文描述的细菌组合物。
依据本发明的一个方面,提供一种改善或保持受试者健康的方法,包括给予受试者治疗有效量的本文描述的益生素组合物,从而改善或保持受试者的健康。
依据本发明的一个方面,提供一种选择有利于制备细菌组合物的试剂或培养条件的方法,该方法包括在所述试剂的存在下或在所述培养条件下,在生长基质中共培养有益细菌与产生物膜细菌,以生成包含有益细菌和产生物膜细菌的生物膜,其中生物膜性质的变化表明该试剂或培养条件有利于制备细菌组合物。
依据本发明的实施方案,所述产生物膜细菌是非致病细菌。
依据本发明的实施方案,所述产生物膜细菌属于芽孢杆菌属。
依据本发明的实施方案,所述产生物膜细菌属于枯草芽孢杆菌物种。
依据本发明的实施方案,所述有益细菌是益生菌。
依据本发明的实施方案,所述有益细菌经基因修饰以表达治疗性多肽。
依据本发明的实施方案,所述益生菌属于乳杆菌目。
依据本发明的实施方案,所述产生物膜细菌属于枯草芽孢杆菌物种。
依据本发明的实施方案,所述益生菌属于植物乳杆菌物种。
依据本发明的实施方案,所述有益细菌被用于生物修复。
依据本发明的实施方案,所述产生物膜细菌表达KinD-Spo0A途径的基因。
依据本发明的实施方案,所述生长基质包含生长培养基。
依据本发明的实施方案,所述生长培养基选自LB、LBGM、牛奶和MRS。
依据本发明的实施方案,所述产生物膜细菌属于芽孢杆菌属和有益细菌属于乳杆菌目,生长基质是LBGM、牛奶或MRS。
依据本发明的实施方案,所述生长基质是MRS。
依据本发明的实施方案,所述条件包括约6.5-8的pH。
依据本发明的实施方案,所述条件包括6.8-7.5的pH。
依据本发明的实施方案,所述生长基质包含乙偶姻。
依据本发明的实施方案,该方法还包括在分离后使生物膜脱水。
依据本发明的实施方案,所述有益细菌包含不超过50种细菌物种。
依据本发明的实施方案,所述产生物膜细菌是单一物种的产生物膜细菌。
依据本发明的实施方案,组合物中至少50 %的细菌存活。
依据本发明的实施方案,所述细菌组合物包含不超过50种细菌物种的有益细菌。
依据本发明的实施方案,所述细菌组合物包含单一物种的非致病细菌。
依据本发明的实施方案,所述细菌组合物是可食用的。
依据本发明的实施方案,所述细菌组合物是益生菌组合物。
依据本发明的实施方案,所述细菌组合物配制为散剂、液体剂或片剂。
依据本发明的实施方案,所述产生物膜细菌属于芽孢杆菌属。
依据本发明的实施方案,所述产生物膜细菌属于枯草芽孢杆菌物种。
依据本发明的实施方案,所述有益细菌是益生菌。
依据本发明的实施方案,所述益生菌属于乳杆菌目。
依据本发明的实施方案,所述试剂改变***的培养基的pH。
除非另外指明,本文所用的的全部技术和/或科学术语具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同意义。虽然与本文所述的那些方法和材料类似或等同的方法和材料可用于实施或测试本发明的实施方案,但是在下文描述示例性方法和/或材料。在冲突的情况下,以本专利说明书(包括定义)为准。此外,材料、方法和实施例仅仅是说明性的,而非旨在必然是限制性的。
附图说明
仅通过举例的方式,并参照附图,在此描述了本发明的一些实施方案。现在详细地具体参照附图,需要强调的是,示出的详情是通过举例的方式并用于本发明的实施方案的说明性讨论。在这方面,连同附图一起的描述使本领域技术人员明了可以如何实施本发明的实施方案。
在附图中:
图1A-B是比较共培养物中的枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌(L. plantarum)生长的图。共培养传代对植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌生长没有影响(与它们在纯培养物中的生长相比),表明这些细菌之间没有拮抗的相互作用。
图2是说明改良的MRS培养基引起枯草芽孢杆菌的生物膜形成的照片。使用立体显微镜分析MRS的pH改变对枯草芽孢杆菌NCIB3610生物膜形成的影响。
图3是说明LB与MRS培养基的组合引发枯草芽孢杆菌的生物膜发育的照片。富集不同浓度MRS (pH 7)的LB培养基对菌落(上排)和菌膜(下排)生物膜形成的影响。
图4A-B是说明LB与MRS培养基的组合引发枯草芽孢杆菌的细胞外基质产生的图。增加MRS浓度诱导tapA-sipW-tasA (A)和epsA-O (B)操纵子的转录。
图5A是说明MRS的生物膜刺激作用受先前在枯草芽孢杆菌中描述的基质合成和生物膜形成信号传导途径的调节的照片。比较了野生型(WT)和各种突变株在MRS (pH 7)上的菌落发育和菌膜形成。这里使用的菌株如下:野生型(NCIB3610)、ΔkinCD (RL4577)、Δ kinAB (RL4573)、Δspo0A (RL4620)、ΔepsΔtasA (RL4566)、ΔabrB (YC668)。
图5B是说明MRS在WT细胞中的作用与枯草芽孢杆菌中的过度产生基质的突变细胞(ΔabrB)相当的照片。
图6是说明MRS诱导不同芽孢杆菌物种的菌落生物膜形成的照片。MRS (pH 7)培养基强烈诱导副地衣芽孢杆菌MS303、地衣芽孢杆菌MS310、地衣芽孢杆菌S127、枯草芽孢杆菌MS1577和蜡样芽孢杆菌10987的菌落型生物膜形成。
图7是说明MRS诱导不同芽孢杆菌物种的菌膜形成的照片。MRS (pH 7)培养基强烈诱导副地衣芽孢杆菌MS303、地衣芽孢杆菌MS310、地衣芽孢杆菌S127、枯草芽孢杆菌MS1577和蜡样芽孢杆菌10987的菌膜形成。
图8A-B是说明枯草芽孢杆菌生产细胞外基质,同时与植物乳杆菌形成双物种生物膜的图。8A. 于37℃和50 rpm下,枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌在MRS (pH 7)中的共培养生物膜的CLSM图像。从左到右:使用荧光灯、Nomarski微分干涉相差(DIC)制备的图像和合并的图像。顶部小图显示荧光标记的枯草芽孢杆菌细胞的表达组成型地表达GFP。底部小图显示产生基质的枯草芽孢杆菌细胞的表达在tapA启动子的控制下表达CFP。在所有图像中,植物乳杆菌细胞未被染色。8B. 枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌在LBGM培养基中的共培养生物膜的CLSM图像。从左到右:使用荧光灯、Nomarski微分干涉相差(DIC)制备的图像和合并的图像。顶部小图显示荧光标记的枯草芽孢杆菌细胞的表达组成型地表达GFP。底部小图显示产生基质的枯草芽孢杆菌细胞的表达在tapA启动子的控制下表达CFP。在所有图像中,植物乳杆菌细胞未被染色。
图9A-C是(A) 枯草芽孢杆菌细胞、(B) 植物乳杆菌细胞和(C) 由枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌构成的双物种生物膜的SEM图像。
图10A-B是说明双物种生物膜有利于植物乳杆菌在暴露于不利条件下的存活的图。植物乳杆菌细胞在枯草芽孢杆菌生物膜的存在或不存在(对照)下的生存,在(A) 63℃热处理1-3 min、(B) 4℃贮存21天期间来测定。所给出的值是一式两份进行的至少三个独立实验的平均值。*p<0.05
图11A-B是说明枯草芽孢杆菌的细胞外基质有利于提高植物乳杆菌在热处理期间的存活的图。A. 测试了63℃热处理3 min对WT枯草芽孢杆菌及其衍生物(缺乏胞外基质的胞外多糖成分和蛋白成分的突变体(ΔepsΔtasA)和缺乏基质基因抑制子的突变体(ΔabrB;过度产生生物膜基质))的影响。所给出的结果是一式两份进行的至少三个独立实验的平均值。*p<0.05。B. 使样品于30℃、20 rpm下在牛奶中生长18 h。此后,它们于63℃经热处理1-3分钟。对照样品未经热处理。存活的植物乳杆菌细胞的数目使用CFU-方法测定。*p<0.05
图12是说明枯草芽孢杆菌生物膜的存在增加植物乳杆菌在体外(模型***)胃肠消化过程中的存活的图。在体外胃肠消化过程中测定植物乳杆菌细胞在枯草芽孢杆菌生物膜的存在或不存在(对照)下的存活。所给出的结果是一式两份进行的三个独立实验的平均值。*p<0.05。
图13是枯草芽孢杆菌3610NCIB在MRS (pH 7)和LB中的生长曲线的图。
图14是说明组氨酸激酶突变对在MRS (pH 7)中的菌落表面结构和菌膜形成的影响的照片。
图15A-C是荧光标记的枯草芽孢杆菌细胞(Pspank-gfp)在LB培养基中于乙偶姻的存在和不存在下孵育24h后的CLSM图像。
图16A-B是说明乙偶姻引发枯草芽孢杆菌的菌落型生物膜形成的照片。
图17A-D是说明负责枯草芽孢杆菌中基质生产的tapA操纵子的转录高度受乙偶姻上调的照片。携带PtapA–cfp转录融合的枯草芽孢杆菌细胞的CLSM图像,在LB培养基中培养24h后不促进生物膜形成。
发明的具体实施方案的描述
本发明,在其某些实施方案中,涉及生成细菌组合物的方法,更特别地但不排他地涉及益生素组合物、有益于环境的益生素组合物和用于工业的益生素组合物。
在详细解释本发明的至少一种实施方案之前,应当理解,本发明的应用不一定限于在以下描述中阐述的或通过实施例举例说明的细节。本发明能够具有其他实施方案或能够以不同方式实施或进行。
细菌在经济上是很重要的,因为这些微生物被人类用于多种用途。细菌的有益用途包括:生产传统食品,如酸奶、奶酪和醋;生物技术和基因工程,生产诸如药物和维生素的物质;农业;纤维脱胶(fibre retting);甲烷生产;生物修复和害虫生物防治。
为了达到它们的目的,细菌经常被暴露在恶劣的条件中,这种条件降低它们的存活力,并因此降低它们的有效性。
例如,为确保益生素对机体的有益作用,这些生物体必须在食物加工、贮存和通过上胃肠道(GIT)的过程中存活,并活着到达它们的作用部位。然而,先前的研究已表明,益生菌在最终食品中的存活水平低,在胃的高酸性条件和小肠中的高胆汁浓度的情况下,它们的存活力有相当的损失。此外,益生素通常可以作为主要是通过冻干来制备的干燥细菌粉末而获得,而冷冻干燥已被确立为一种可对细胞造成致命伤害的方法。
在对细菌生物膜进行研究时,本发明人注意到,在适当的条件下,产生物膜细菌可将非产生物膜细菌掺入其生物膜中,从而使其对极端温度更有抵抗力(冷和热;分别见图10和11A-B)。
具体地,本发明人共培养了枯草芽孢杆菌物种与益生菌植物乳杆菌一起的细菌。他们表明,在特定的条件下,枯草芽孢杆菌的细菌产生生物膜,其中植物乳杆菌细胞被掺入到其细胞外基质中(图9A)。生物膜掺入的植物乳杆菌显示与对照即非生物膜掺入的植物乳杆菌相比,不仅具有更强的耐热性和更强的抗寒性,而且具有更强的耐酸性。
总体看来,本发明人提出,产生物膜细菌可以用来包封非产生物膜细菌。因此,产生物膜细菌用作有益的非产生物膜细菌的保护性载体。
因此,依据本发明的第一个方面,提供一种制备细菌组合物的方法,包括:
(a) 在产生生物膜的条件下,在生长基质中体外共培养有益细菌与产生物膜细菌,所述生物膜包含有益细菌和非致病细菌;
(b) 将生物膜与生长基质分离,从而制备细菌组合物。
如本文所用的术语“细菌”指原核微生物,包括古细菌。细菌可为革兰氏阳性的或革兰氏阴性的。细菌也可为光合细菌(例如蓝细菌(cyanobacteria))。
如本文所用的术语“有益细菌”指对人类产生积极影响的任何细菌。
在一个实施方案中,在标准培养条件下,有益细菌在生长培养基中作为单一培养物繁殖时不产生生物膜。
在另一个实施方案中,有益细菌在对其繁殖为最佳的培养条件下,在生长培养基中作为单一培养物繁殖时不产生生物膜。
在又一个实施方案中,有益细菌利用KinD-Spo0A途径(例如表达基因组氨酸激酶kinD、spo0F、spo0B和/或spo0A) – 见例如Shemesh和Chai, 2013 Journal ofBacteriology, 2013, Vol 195, No.12 2747-2754页,其内容通过引用并入本文。
有益细菌可为典型的在Man、Rogosa和Sharpe培养基即MRS (使用琼脂固化或MRS肉汤)中培养的细菌。
有益细菌一般不应阻止(即拮抗)成生物膜菌(例如枯草芽孢杆菌)的生物膜形成能力。当一起培养时确定细菌是否对其他细菌有拮抗活性的方法在本领域是已知的(见例如图1A-B)。在一个实施方案中,有益细菌不是土壤细菌。
任何数量的有益细菌菌株都可以在本发明的这一方面的共培养物中培养。在一个实施方案中,不超过500个不同菌株的有益细菌在单一培养物中培养,不超过250个不同菌株的有益细菌在单一培养物中培养,不超过100个不同菌株的有益细菌在单一培养物中培养,不超过90个不同菌株的有益细菌在单一培养物中培养,不超过80个不同菌株的有益细菌在单一培养物中培养,不超过70个不同菌株的有益细菌在单一培养物中培养,不超过60个不同菌株的有益细菌在单一培养物中培养,不超过50个不同菌株的有益细菌在单一培养物中培养,不超过40个不同菌株的有益细菌在单一培养物中培养,不超过30个不同菌株的有益细菌在单一培养物中培养,不超过20个不同菌株的有益细菌在单一培养物中培养,不超过10个不同菌株的有益细菌在单一培养物中培养,不超过9个不同菌株的有益细菌在单一培养物中培养,不超过8个不同菌株的有益细菌在单一培养物中培养,不超过7个不同菌株的有益细菌在单一培养物中培养,不超过6个不同菌株的有益细菌在单一培养物中培养,不超过5个不同菌株的有益细菌在单一培养物中培养,不超过4个不同菌株的有益细菌在单一培养物中培养,不超过3个不同菌株的有益细菌在单一培养物中培养,不超过2个不同菌株的有益细菌在单一培养物中培养,每个单一培养物中只培养1株有益细菌。
本发明这个方面的单一培养物的有益细菌菌株可属于单一的物种,或可属于多个物种。优选地,培养物的有益细菌菌株属于单一物种的细菌。在其他实施方案中,多个物种的有益细菌在单一培养物中培养。优选不超过10个不同物种的有益细菌在单一培养物中培养,不超过9个不同物种的有益细菌在单一培养物中培养,不超过8个不同物种的有益细菌在单一培养物中培养,不超过7个不同物种的有益细菌在单一培养物中培养,不超过6个不同物种的有益细菌在单一培养物中培养,不超过5个不同物种的有益细菌在单一培养物中培养,不超过4个不同物种的有益细菌在单一培养物中培养,不超过3个不同物种的有益细菌在单一培养物中培养,不超过2个不同物种的有益细菌在单一培养物中培养,每个单一培养物只培养1个物种的有益细菌。
在一个实施方案中,有益细菌在摄入时促进人类的健康。在另一个实施方案中,有益细菌被用于工业以生产对人类有用的产品(例如甲烷、石油、杀虫剂等)。在另一个实施方案中,有益细菌被用于食品工业。在另一个实施方案中,有益细菌被用于青贮接种剂(silage inoculant)。在又一个实施方案中,有益细菌被用于农业以支持植物的生长。在又一个实施方案中,有益细菌被用于生物修复。
在一个实施方案中,有益细菌是益生菌。
如本文所用的术语"益生菌"指当以足够的数量给予时赋予宿主(例如人)健康益处的活细菌。
在益生素作用的主要机制中,可发现:通过乳酸、过氧化氢和细菌素的产生而抑制肠道病原体;通过阻断粘附位点、竞争营养物质和调节免疫***,包括减少炎症,而竞争性地排除肠道病原体。它们还为宿主提供益处,例如乳糖不耐受的缓解;通过同化、维持肠道正常菌群和改善生态失调来降低胆固醇,抑制肠内毒素产生、毒素受体的降解,保持正常的肠道pH,增加肠道运动,和帮助保持肠渗透性的完整性。
在一个实施方案中,有益细菌属于乳杆菌目(俗称乳酸菌(LAB))。这些细菌是革兰氏阳性、低-GC、耐酸、一般不形成孢子、不呼吸、棒状或者球状的细菌,具有共同的代谢和生理特性。这些细菌生产乳酸作为碳水化合物发酵的主要代谢终端产物。
优选地,乳杆菌目的有益细菌是在MRS琼脂(MRS)中生长(并通常被培养)的细菌。
预期的乳杆菌目的示例性菌属包括但不限于乳酸杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、片球菌属(Pediococcus)、乳酸球菌属(Lactococcus)、链球菌(Streptococcus)、气球菌属(Aerococcus)、肉食杆菌属(Carnobacterium)、肠球菌属(Enterococcus)、酒球菌属(Oenococcus)、芽孢乳酸杆菌属(Sporolactobacillus)、嗜盐四联球菌属(Tetragenococcus)、漫游球菌属(Vagococcus)和魏斯氏属(Weissella)。
依据优选的实施方案,本发明的这个方面的有益细菌属于乳酸杆菌属。本发明预期的乳酸杆菌属的示例性物种包括但不限于耐酸乳杆菌(L. acetotolerans)、酸面乳杆菌(L. acidifarinae)、酸鱼乳杆菌(L. acidipiscis)、嗜酸乳杆菌(L. acidophilus)、敏捷乳杆菌(L. agilis)、低温乳杆菌(L. algidus)、消化乳杆菌(L. alimentarius)、解淀粉乳杆菌(L. amylolyticus)、嗜淀粉乳杆菌(L. amylophilus)、发酵淀粉乳杆菌(L. amylotrophicus)、食淀粉乳杆菌(L. amylovorus)、动物乳杆菌(L. animalis)、胃窦乳杆菌(L. antri)、田鼠乳杆菌(L. apodemi)、鸟乳杆菌(L. aviarius)、双发酵乳杆菌(L. bifermentans)、短乳杆菌(L. brevis)、布氏乳杆菌(L. buchneri)、茶叶乳杆菌(L. camelliae)、干酪乳杆菌(L. casei)、链状乳杆菌(L. catenaformis)、鲸乳杆菌(L. ceti)、人***乳杆菌(L. coleohominis)、丘状菌落乳杆菌(L. collinoides)、堆肥乳杆菌(L. composti)、曲面乳杆菌(L. concavus)、棒状乳杆菌(L. coryniformis)、卷曲乳杆菌(L. crispatus)、面包乳杆菌(L. crustorum)、弯曲乳杆菌(L. curvatus)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(L. delbrueckii subsp. bulgaricus)、德氏乳杆菌德氏亚种(L. delbrueckii subsp. delbrueckii)、德氏乳杆菌乳亚种(L. delbrueckii subsp. lactis)、L. dextrinicus、食二酸乳杆菌(L. diolivorans)、马乳杆菌(L. equi)、驯马乳杆菌(L. equigenerosi)、谷糠乳杆菌(L. farraginis)、香肠乳杆菌(L. farciminis)、发酵乳杆菌(L. fermentum)、近茎轴乳杆菌(L. fornicalis)、食果糖乳杆菌(L. fructivorans)、谷物乳杆菌(L. frumenti)、府中乳杆菌(L. fuchuensis)、母鸡乳杆菌(L. gallinarum)、加氏乳杆菌(L. gasseri)、胃乳杆菌(L. gastricus)、加纳乳杆菌(L. ghanensis)、稀氏乳杆菌(L. hilgardii)、同型腐酒乳杆菌(L. homohiochii)、懒惰乳杆菌(L. iners)、果囊乳杆菌(L. ingluviei)、肠乳杆菌(L. intestinalis)、詹氏乳杆菌(L. jensenii)、约氏乳杆菌(L. johnsonii)、卡利克斯镇乳杆菌(L. kalixensis)、产马乳酒乳杆菌(L. kefiranofaciens)、高加索酸奶乳杆菌(L. kefiri)、韩泡菜乳杆菌(L. kimchii)、北里氏乳杆菌(L. kitasatonis)、昆仑乳杆菌(L. kunkeei)、莱希曼氏乳杆菌(L. leichmannii)、林氏乳杆菌(L.lindneri)、坏发酵乳杆菌(L. malefermentans)、苹果乳杆菌(L. mali)、食木薯乳杆菌(L. manihotivorans)、明登乳杆菌(L. mindensis)、粘膜乳杆菌(L. mucosae)、鼠乳杆菌(L. murinus)、内氏乳杆菌(L. nagelii)、那慕氏乳杆菌(L. namurensis)、南特港乳杆菌(L. nantensis)、寡发酵乳杆菌(L.oligofermentans)、口腔乳杆菌(L. oris)、面包乳杆菌(L. panis)、美洲虎乳杆菌(L. pantheris)、类短乳杆菌(L. parabrevis)、类布氏乳杆菌(L. parabuchneri)、类干酪乳杆菌(L. paracasei)、类丘状菌落乳杆菌(L. paracollinoides)、类谷糠乳杆菌(L. parafarraginis)、类高加索酸奶粒乳杆菌(L. parakefiri)、类消化乳杆菌(L. paralimentarius)、类植物乳杆菌(L. para 植物arum)、戊糖乳杆菌(L. pentosus)、恶味乳杆菌(L. perolens)、植物乳杆菌、桥乳杆菌(L. pontis)、L. protectus、鹦鹉乳杆菌(L. psittaci)、蛋白原酶乳杆菌(L. rennini)、路氏乳杆菌(L. reuteri)、鼠李糖乳杆菌(L. rhamnosus)、龈沟乳杆菌(L. rimae)、罗氏乳杆菌(L. rogosae)、罗西氏乳杆菌(L. rossiae)、瘤胃乳杆菌(L. ruminis)、神话猪乳杆菌(L. saerimneri)、清酒乳杆菌(L. sakei)、唾液乳杆菌(L. salivarius)、旧金山乳杆菌(L. sanfranciscensis)、红条乳杆菌(L. satsumensis)、嗜黑麦乳杆菌(L. secaliphilus)、沙氏乳杆菌(L. sharpeae)、白面粉乳杆菌(L. siliginis)、斯比氏乳杆菌(L. spicheri)、斯瓦比乳杆菌(L. suebicus)、泰国乳杆菌(L. thailandensis)、厄尔纳拉乳杆菌(L. ultunensis)、牛粪乳杆菌(L. vaccinostercus)、***乳杆菌(L. vaginalis)、费尔斯莫尔德镇乳杆菌(versmoldensis)、酒乳杆菌(L. vini)、犊牛乳杆菌(L. vitulinus)、玉米乳杆菌(L. zeae)和老面乳杆菌(L. zymae)。
在一个特定的实施方案中,乳酸杆菌属的物种是植物乳杆菌。
本发明的这个方面的有益细菌可产生发酵产物。发酵产物的实例包括但不限于益生元(pre-biotics)、生物燃料、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、酒精燃料、蛋白、重组蛋白、维生素、氨基酸、有机酸(例如乳酸、丙酸、乙酸、琥珀酸、苹果酸、谷氨酸、天冬氨酸和3-羟基丙酸)、酶、抗原、抗生素、有机化学品、生物修复处理、防腐剂和代谢产物。
因此,有益细菌可经基因改造来表达有益多肽。
有益多肽可为细胞内多肽(例如,细胞质蛋白)、跨膜多肽或分泌的多肽。蛋白质的异源生产在研究和工业环境中得到了广泛的应用,例如,用于生产治疗剂、疫苗、诊断剂、生物燃料和许多其他感兴趣的应用。可通过使用主题组合物和方法产生的示例性治疗蛋白包括但不限于某些天然的和重组的人类激素(例如,胰岛素、生长激素、胰岛素-样生长因子1、促卵泡激素和绒毛膜***)、造血蛋白(例如,红细胞生成素、C-CSF、GM-CSF和IL-11)、凝血和止血蛋白(例如,组织纤溶酶原激活剂及活化蛋白C)、免疫蛋白(如白细胞介素)、抗体和其他酶(如脱氧核糖核酸酶I)。可由主题组合物和方法生产的示例性疫苗包括但不限于针对各种流感病毒的疫苗(例如,甲型、乙型和丙型及对每一型的不同血清型,例如甲型流感病毒的H5N2、H1N1、H3N2)、HIV、肝炎病毒(例如,甲型、乙型、丙型或丁型肝炎)、莱姆病和人***瘤病毒(HPV)。异源生产的蛋白诊断剂的例子包括但不限于分泌素、促甲状腺激素(TSH)、HIV抗原和丙型肝炎抗原。
由异源多肽产生的蛋白或肽可包括但不限于细胞因子、趋化因子、淋巴因子、配体、受体、激素、酶、抗体和抗体片段以及生长因子。受体的非限制性实例包括TNF I型受体、IL-1 II型受体、IL-1受体拮抗剂、IL-4受体和任何化学或基因修饰的可溶性受体。酶的实例包括乙酰胆碱酯酶,乳糖酶,活化蛋白,因子VII,胶原酶(例如,由Advance BiofacturesCorporation以Santyl的名义销售);β-半乳糖苷酶(例如,由Genzyme以Fabrazyme的名义销售);阿法链道酶(dornase-alpha) (例如,由Genentech以Pulmozyme的名义销售);阿替普酶(alteplase) (例如,由Genentech以Activase的名义销售);聚乙二醇化-天冬酰胺酶(例如,由Enzon以Oncaspar的名义销售);天冬酰胺酶(例如,由Merck以Elspar的名义销售);和伊米苷酶(imiglucerase) (例如,由Genzyme以Ceredase的名义销售)。特定多肽或蛋白的实例包括但不限于粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、集落刺激因子(CSF)、干扰素β (IFN-β)、干扰素γ (IFNγ)、干扰素γ诱导因子I (IGIF)、转化生长因子β (IGF-β)、RANTES (在激活时调节,正常的T-细胞表达并可能分泌),巨噬细胞炎性蛋白(例如,MIP-1-α和MIP-1-β)、Leishmnania伸长引发因子(LEIF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、肿瘤坏死因子(TNF)、生长因子,例如,表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子-2 (NT-2)、神经营养因子-3 (NT-3)、神经营养因子-4 (NT-4)、神经营养因子-5 (NT-5)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、睫状神经营养因子(CNTF)、TNF α II型受体、红细胞生成素(EPO)、胰岛素和可溶性糖蛋白例如,gp120和gp160糖蛋白。gp120糖蛋白是人免疫缺陷病毒(WIV)包膜蛋白,而gp160糖蛋白是gp120糖蛋白的已知前体。其他实例包括分泌素、奈西利肽(人B-型利钠肽(hBNP))和GYP-I。
预期的用于表达人干扰素β 1b的细菌包括例如大肠杆菌。
预期的用于表达人干扰素γ的细菌包括例如大肠杆菌。
预期的用于表达人生长激素的细菌包括例如大肠杆菌。
预期的用于表达人胰岛素的细菌包括例如大肠杆菌。
预期的用于表达白细胞介素II的细菌包括例如大肠杆菌。
依据特定的实施方案,有益多肽是抗体(例如Humira、Remicade、Rituxan、Enbrel、Avastin、Herceptin)。
预期的用于表达抗体的细菌包括例如大肠杆菌、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、枯草芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)。
本发明预期的其他有益细菌包括用作细菌疫苗的那些细菌。本发明预期的示例性疫苗包括但不限于Virotif Berna疫苗(Vivotif Berna Vaccine) (伤寒疫苗,活的)、Prevnar 13 (肺炎球菌13-价疫苗)、Menactra (脑膜炎双球菌缀合疫苗)、ActHIB (B型嗜血杆菌缀合(prp-t)疫苗)、Bexsero (乙型脑膜炎双球菌疫苗)、Biothrax (吸附的炭疽疫苗)、Hiberix (B型嗜血杆菌缀合(prp-t)疫苗)、HibTITER (B型嗜血杆菌缀合(hboc)疫苗)、液体PedvaxHIB (B型嗜血杆菌缀合(prp-omp)疫苗)、MenHibrix (B型嗜血杆菌缀合(hboc)疫苗/脑膜炎双球菌缀合疫苗)、Menomune A / C / Y / W-135 (脑膜炎双球菌多糖疫苗)、Menveo (脑膜炎双球菌缀合疫苗)、Pneumovax 23 (肺炎球菌23-多价疫苗)、Prevnar (肺炎球菌7-价疫苗)、Te Anatoxal Berna (破伤风类毒素)、Tetanus ToxoidAdsorbed (破伤风类毒素)、TheraCys (bcg)、Tice BCG (bcg)、Trumenba (乙型脑膜炎双球菌疫苗)、Typhim Vi (伤寒疫苗,灭活的)、Vaxchora (霍乱疫苗,活的)和Vivotif Berna(伤寒疫苗,活的)。
其他预期的有益细菌是那些在生物修复中有用的细菌。这样的修复包括重金属污染、化学污染、辐射污染和烃污染。
可用于生物修复的细菌实例列于本文下面:
恶臭假单胞菌:恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)是一种革兰氏阴性土壤细菌,它参与甲苯的生物修复,甲苯是油漆稀释剂的一种成分。它还能在受污染的土壤中降解萘,其是一种石油精炼的产物。
芳香性脱氯单胞菌:芳香性脱氯单胞菌(Dechloromonas aromatica)是一种棒状细菌,其能氧化包括苯甲酸盐(酯)、氯苯酸盐(酯)和甲苯在内的芳烃,将反应与氧、氯酸盐或硝酸盐的还原偶联。它是唯一能在厌氧条件下氧化苯的生物。由于苯的高污染倾向,特别是在地下水和地表水中,芳香性脱氯单胞菌(D. aromatic)对这种物质的原位生物修复是特别有用的。
硝化细菌和反硝化细菌:工业生物修复被用来清洁废水。大多数处理***依靠微生物活性来去除不需要的无机氮化合物(即氨、亚硝酸盐、硝酸盐)。氮的去除是一个涉及硝化和反硝化的两阶段过程。在硝化过程中,铵被欧洲亚硝化单胞菌(Nitrosomonas europaea)等生物氧化为亚硝酸盐。然后,亚硝酸盐被汉氏硝化细菌(Nitrobacter hamburgensis)等微生物进一步氧化为硝酸盐。在厌氧条件下,铵氧化过程中产生的硝酸盐被脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)等微生物用作末端电子受体。结果是氮气(N2)。通过这一过程,铵和硝酸盐这两种对自然水体富营养化负有责任的污染物得到了修复。
耐辐射奇异球菌:耐辐射奇异球菌(Deinococcus radiodurans)是一种耐辐射嗜极端细菌(extremophile bacterium),其经基因工程改造为用于溶剂和重金属的生物修复。耐辐射奇异球菌的工程菌株已被证明能在放射性混合废物环境中降解离子汞和甲苯。
在厌氧条件下,铵氧化过程中产生的硝酸盐被脱氮副球菌等微生物用作末端电子受体。结果是二氮气体(dinitrogen gas)。通过这一过程,铵和硝酸盐这两种对自然水体富营养化负有责任的污染物得到了修复。
甲基叔丁基醚降解菌:甲基叔丁基醚降解菌(Methylibium petroleiphilum) (正式称为PM1菌株)是一种能够生物修复甲基叔丁基醚(MTBE)的细菌。PM1利用该污染物作为唯一的碳源和能源来降解MTBE。
泊库岛食烷菌:泊库岛食烷菌(Alcanivorax borkumensis)是一种海洋杆状细菌,它消耗烃,如燃料中的烃,并产生二氧化碳。它在被石油破坏的环境中迅速增长,并被用来帮助清理墨西哥湾中来自深水地平线漏油的超过830,000加仑的石油。其他预期的可用来清除油污的细菌包括南极嗜冷菌(Colwellia)和海王星菌属(Neptuniibacter)。
如所提及的,本发明的这个方面的方法预期了培养有益细菌与产生物膜细菌。
如本文所用的术语“生物膜”指包含(例如,嵌入或包封)在它们已经产生的细胞外聚合物质的基质中的细菌群落。典型地,与自由漂浮的浮游细菌相比,生物膜中存在的细菌在生长速率和基因转录方面表现出改变的表型。可存在于生物膜中的细胞外聚合物质的实例包括胞外多糖(例如由epsA-O操纵子的产物合成的那些)和淀粉样蛋白纤维(例如由tapA-sipW-tasA操纵子编码的那些)。因此,基质典型地包含细胞外DNA和蛋白,以及碳水化合物。
应该意识到,产生物膜细菌也可以是有益细菌。
产生物膜细菌通常属于与被掺入到生物膜中的有益细菌不同的目和/或属。因此,产生物膜细菌和有益细菌可属于不同的菌株、物种、属和/或目。
优选地,产生物膜细菌是非致病的(即不对人类造成身体伤害或引起疾病)。
产生物膜细菌的任何数量的菌株可在本发明这个方面的共培养物中培养。在一个实施方案中,不超过500个不同的菌株的产生物膜细菌在单一培养物中培养,不超过250个不同的菌株的产生物膜细菌在单一培养物中培养,不超过100个不同的菌株的产生物膜细菌在单一培养物中培养,不超过90个不同的菌株的产生物膜细菌在单一培养物中培养,不超过80个不同的菌株的产生物膜细菌在单一培养物中培养,不超过70个不同的菌株的产生物膜细菌在单一培养物中培养,不超过60个不同的菌株的产生物膜细菌在单一培养物中培养,不超过50个不同的菌株的产生物膜细菌在单一培养物中培养,不超过40个不同的菌株的产生物膜细菌在单一培养物中培养,不超过30个不同的菌株的产生物膜细菌在单一培养物中培养,不超过20个不同的菌株的产生物膜细菌在单一培养物中培养,不超过10个不同的菌株的产生物膜细菌在单一培养物中培养,不超过9个不同的菌株的产生物膜细菌在单一培养物中培养,不超过8个不同的菌株的产生物膜细菌在单一培养物中培养,不超过7个不同的菌株的产生物膜细菌在单一培养物中培养,不超过6个不同的菌株的产生物膜细菌在单一培养物中培养,不超过5个不同的菌株的产生物膜细菌在单一培养物中培养,不超过4个不同的菌株的产生物膜细菌在单一培养物中培养,不超过3个不同的菌株的产生物膜细菌在单一培养物中培养,不超过2个不同的菌株的产生物膜细菌在单一培养物中培养,或每个单一培养物中只培养1株的产生物膜细菌。
本发明这一方面的单一培养物的产生物膜细菌菌株可属于单一物种或可属于多个物种。优选地,培养物的产生物膜细菌菌株属于单一物种的细菌。在其他实施方案中,多个物种的产生物膜细菌在单一培养物中培养。优选不超过10个不同物种的产生物膜细菌在单一培养物中培养,不超过9个不同物种的产生物膜细菌在单一培养物中培养,不超过8个不同物种的产生物膜细菌在单一培养物中培养,不超过7个不同物种的产生物膜细菌在单一培养物中培养,不超过6个不同物种的产生物膜细菌在单一培养物中培养,不超过5个不同物种的产生物膜细菌在单一培养物中培养,不超过4个不同物种的产生物膜细菌在单一培养物中培养,不超过3个不同物种的产生物膜细菌在单一培养物中培养,不超过2个不同物种的产生物膜细菌在单一培养物中培养,或每个单一培养物中只培养1个物种的产生物膜细菌。
在一个实施方案中,产生物膜细菌属于芽孢杆菌属。
如本文所用的,"芽孢杆菌属"包括本领域技术人员已知的所有成员,包括但不限于枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌(B. Lentus)、短芽孢杆菌(B. Brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B. Stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B. Alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B. Amyloliquefaciens)、克劳氏芽孢杆菌(B. Clausii)、耐盐芽孢杆菌(B. Halodurans)、巨大芽孢杆菌(B. Megaterium)、凝结芽孢杆菌(B. Coagulans)、环状芽孢杆菌(B. Circulans)、灿烂芽孢杆菌(B. Lautus)和苏云金芽孢杆菌(B. Thuringiensis)。已认识到芽孢杆菌属继续进行分类重组。因此,意欲使该属包括已重新分类的物种,包括但不限于这样的生物如嗜热脂肪芽孢杆菌,其现在称为"嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)"。在氧存在下产生抗性内孢子被认为是芽孢杆菌属的定义性特征,但是这一特征也适用于最近命名的脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)、兼性芽孢杆菌属(Amphibacillus)、解硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus)、厌氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、线芽孢杆菌属(Filobacillus)、纤细芽孢杆菌属(Gracilibacillus)、嗜盐芽孢杆菌属(Halobacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、盐芽孢杆菌属(Salibacillus)、耐热芽孢杆菌属(Thermobacillus)、解脲芽孢杆菌属(Ureibacillus)和枝芽孢杆菌属(Virgibacillus)。
在一个实施方案中,产生物膜细菌属于枯草芽孢杆菌物种。
本发明预期的枯草芽孢杆菌的示例性菌株包括但不限于副地衣芽孢杆菌MS303、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis) MS310、副地衣芽孢杆菌S127、枯草芽孢杆菌MS1577和NCIB3610。
依据特定的实施方案,产生物膜细菌不包含蜡样芽孢杆菌物种。
为了产生共培养物,通常将有益培养物和产生生物膜的培养物分开培养,以产生初始培养物。通常选择初始培养物的培养基和条件以优化每种细菌的生长。
预期的初始培养物包括干燥的初始培养物、脱水的初始培养物、冷冻的初始培养物或浓缩的初始培养物。
初始培养物生长至少2小时、4小时、8小时、12小时,直到繁殖足够数量的细菌。
依据特定的实施方案,所述方法包括共培养的方法,由此有益细菌属于乳酸杆菌属(例如植物乳杆菌物种),而产生物膜细菌属于芽孢杆菌属(例如枯草芽孢杆菌物种)。
选择有益细菌与产生物膜细菌的共培养方法,使得能够繁殖两种类型的微生物,并将这两种微生物掺入到生物膜中。
在一个实施方案中,共培养在通常用来培养有益细菌的生长基质中(或其上)执行。生长基质可以是固体或液体培养基。
可用来培养细菌的生长基质的实例包括但不限于MRS培养基、LB培养基、TBS培养基、酵母提取物、大豆蛋白胨、酪蛋白蛋白胨和肉类蛋白胨。
培养基的进一步的实例列于本文的下表1中。
表1
因此,例如在有益细菌属于乳酸杆菌属(例如植物乳杆菌物种)和产生物膜细菌属于芽孢杆菌属(例如枯草芽孢杆菌物种)的情况下,共培养可在包含LBGM、牛奶或MRS的生长基质中进行。能用来生成本发明的共培养物的其他培养基包括MSgg极限培养基(Shemesh, M.等人 (2010). J Bacteriol 192, 6352-6356); 富含乳糖的LB: Duanis-Assaf D.等人(2016) Front. Microbiol. 6:1517; 加入丁酸的LB: Pasvolsky R.,等人, Int. J.Food Microbiol. 181C:19-27。典型地,选择促进将这两种不同的细菌掺入生物膜中的培养条件。
因此,依据本发明的另一个方面,提供一种选择有利于制备细菌组合物的试剂或培养条件的方法,该方法包括在所述试剂的存在下或在所述培养条件下,使有益细菌与产生物膜细菌在生长基质中共培养,以生成包含有益细菌和产生物膜细菌的生物膜,其中生物膜性质的变化表明该试剂或培养条件有利于制备细菌组合物。
可改变的示例性共培养条件包括进行培养的表面的性质(例如固体表面的表面化学,包括但不限于官能团、静电电荷、涂层;表面粗糙度,表面形貌,包括但不限于沟槽、腔、脊、孔、六边形填充(HP)柱、由HP柱包围的等边三角形和Sharklet形貌等)。固体表面可具有限定的几何形状和/或形貌,使得促进有益细菌的包封/掺入到生物膜中。此外,固体表面可具有限定的几何形状和/或形貌,使得促进特定厚度的生物膜的生成。本发明所预期的其他形貌特征见述于Graham and Cady, Coatings, 2014, 4, 37-59页,其内容通过引用并入本文。
能在其上进行培养的示例性固体表面包括广泛的基质,从各种高分子材料(硅酮、聚苯乙烯、聚氨酯和环氧树脂)到金属和金属氧化物(硅、钛、铝、二氧化硅和金)。制作技术(软光刻和双铸成型技术、微接触印刷技术、电子束光刻技术、纳米压印、光刻技术、电沉积方法等)可以在这些材料上进行,以改变固体表面的形貌。
可改变的其他共培养条件包括但不限于环境参数,例如pH、营养素浓度、有益细菌:产生物膜细菌之间的比例和温度。
在一个实施方案中,共培养在生物反应器中进行。
如本文所用,术语“生物反应器”指适于支持本发明的生物膜的装置。
生物反应器通常包括用于生物膜的一个或多个支撑物,该生物膜可在支撑物上形成膜,且其中支撑物适于提供显著的表面积,以加强生物膜的形成。本发明的生物反应器可适用于连续的生产量。
应该意识到,当生物膜在生物反应器***中生成,共培养的条件可以通过改变***的微流体(例如剪切应力)来改变。
如所提及的,选择可使生物膜的性质发生有利变化的试剂或条件。在一个实施方案中,该性质是生物膜的量。在一个实施方案中,该性质是生物膜的厚度。在另一个实施方案中,该性质是生物膜的密度。在还一个实施方案中,该性质是生物膜形成的速率。在又一个实施方案中,该性质是掺入到生物膜中的有益细菌的量。在又一个实施方案中,该性质是对温度和/或pH的抗性。
在又一个实施方案中,该性质是在一段时间内有益细菌从生物膜释放的量。当需要控制有益细菌的释放时,这可为特别相关的。例如,在生物膜中掺入有益于皮肤、头皮或牙科应用的细菌可为有利的,其中为了最大治疗效果选择从生物膜释放有益细菌的速率。
本发明人现在已经发现,当在MRS中培养时,将生长基质的pH改变到高于6促进利用KinD-Spo0A途径的细菌(例如属于芽孢杆菌属,例如枯草芽孢杆菌物种)被掺入到生物膜中。
在一个实施方案中,在LBGM、牛奶或MRS (且更特别是MRS)中,或在LBGM、牛奶或MRS (且更特别是MRS)上进行的属于乳酸杆菌属(例如植物乳杆菌物种)的有益细菌和属于芽孢杆菌属(例如枯草芽孢杆菌物种)的产生物膜细菌的共培养在6.5和9、6.5和8、6.5和7.5、6.8和9、6.8和8、6.8和7.5之间的pH下进行。
本发明的这个方面的共培养可在起着增加细菌繁殖和/或增强生物膜形成的额外试剂的存在下进行。这样的试剂包括例如乙偶姻。
可改变乙偶姻的量和添加时机,以促进最佳的生物膜产生。在一个实施方案中,使用约0.01-5%乙偶姻。在另一个实施方案中,使用约0.01-4 %乙偶姻。在另一个实施方案中,使用约0.01-3 %乙偶姻。在另一个实施方案中,使用约0.01-2 %乙偶姻。在另一个实施方案中,使用约0.01-1 %乙偶姻。在另一个实施方案中,使用约0.01-0.5 %乙偶姻。
因此,本发明人预期一种包括乙偶姻、包含芽孢杆菌的生物膜和培养基的培养物。在一个实施方案中,培养基是在表1中提及的培养基(例如LB)。
在一个实施方案中,使用约0.05-5 %乙偶姻。在另一个实施方案中,使用约0.05-4%乙偶姻。在另一个实施方案中,使用约0.05-3 %乙偶姻。在另一个实施方案中,使用约0.05-2 %乙偶姻。在另一个实施方案中,使用约0.05-1 %乙偶姻。在另一个实施方案中,使用约0.05-0.5 %乙偶姻。
在一个实施方案中,使用约0.1-5 %乙偶姻。在另一个实施方案中,使用约0.1-4 %乙偶姻。在另一个实施方案中,使用约0.1-3 %乙偶姻。在另一个实施方案中,使用约0.1-2%乙偶姻。在另一个实施方案中,使用约0.1-1 %乙偶姻。在另一个实施方案中,使用约0.1-0.5 %乙偶姻。
本发明的这个方面的共培养物繁殖的时间长度足以产生生物膜,该生物膜掺入了有益细菌和成生物膜细菌二者。
依据一个实施方案,使共培养物生长至有益细菌的最大平台生长阶段,在此时,它们可为了最大程度的生物膜生产而被收获。
依据另一个实施方案,使共培养物生长至产生物膜细菌的最大平台生长阶段,在此时,它们可为了最大程度的生物膜生产而被收获。
因此,细菌可培养至少3小时、至少6小时、至少12小时、至少24小时、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更长的时间。在一个实施方案中,细菌培养不超过1周、2周、3周、4周、5周或6周。
一旦繁殖有足够量的有益细菌(并包封在生物膜中),生物膜就被收获(即从生长基质移去)。
在与生长基质分离后,生物膜(和/或掺入其中的细菌)可经受干燥(即脱水)、冷冻、喷雾干燥或冷冻干燥。优选地,以能够保留细菌的存活力的方式处理生物膜。
因此,依据本发明的另一个方面,提供一种可依据本文描述的方法获得的细菌组合物。
产生物膜细菌以103-1015个菌落形成单位/克细菌组合物(例如益生素组合物)的量存在于细菌组合物中。
组合物中的非细胞材料(例如胞外多糖和/或淀粉样蛋白纤维)的量(以重量计)可高于细胞材料(例如细菌细胞)的量(以重量计)。例如,组合物中的非细胞材料(例如胞外多糖和/或淀粉样蛋白纤维)的重量可高于组合物中的细胞材料(例如细菌细胞)的重量至少5%、10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 %或100 %。
组合物中的非细胞材料(例如胞外多糖和/或淀粉样蛋白纤维)的量(以重量计)可以低于细胞材料(例如细菌细胞)的量(以重量计)。例如,组合物中的细胞材料(例如细菌细胞)的重量可以高于组合物中的非细胞材料(例如胞外多糖和/或淀粉样蛋白纤维)的重量至少5 %、10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 %或100 %。
因此,本文描述的组合物中非细胞材料(例如胞外多糖):细菌细胞的重量比可在99:1-1:99之间。在一些实施方案中,本文描述的组合物中非细胞材料(例如胞外多糖):细菌细胞的重量比可在99:1-50:50之间。在一些实施方案中,本文描述的组合物中非细胞材料(例如胞外多糖):细菌细胞的重量比可在99:1-70:30之间。
在一个实施方案中,细菌组合物是益生素组合物。
在一些实施方案中,益生素组合物包含约103至1015个菌落形成单位("CFU")的产生物膜微生物/克最终产物。在一些实施方案中,益生素组合物包含约104至约1014 CFU的产生物膜微生物/克最终产物。在一些实施方案中,益生素组合物包含约105至约1015 CFU的产生物膜微生物/克最终产物。在一些实施方案中,益生素组合物包含约106至1011个菌落形成单位的产生物膜微生物/克最终产物。在一些实施方案中,益生素组合物包含约102至约105个菌落形成单位的产生物膜微生物/克最终产物。
应该意识到,组合物的至少20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90%或更多的有益细菌存活(即繁殖)。而且,组合物的至少20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90%或更多的产生物膜细菌存活(即繁殖)。
依据特定的实施方案,细菌组合物是益生素组合物。
可存在于益生素组合物中的示例性有益细菌是属于乳酸杆菌属(如上面所描述的)那些细菌。
益生素组合物可包含额外的有益细菌例如属于双歧杆菌属的那些。预期可存在于本发明这个方面的益生素组合物中的双歧杆菌属的物种包括但不限于长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、两岐双岐杆菌(Bifidobacterium bifidum)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、青少年双歧杆菌(Bifidobacterium adolecentis)、乳酸双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)和动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)。在一些实施方案中,益生素组合物包含属于乳酸杆菌属的物种例如植物乳杆菌和至少两个选自以下长双歧杆菌、两岐双岐杆菌、短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、青少年双歧杆菌、乳酸双歧杆菌和动物双歧杆菌的微生物。
在一个实施方案中,本文公开的细菌组合物呈现为适合给予组合物至哺乳动物受试者的任何形式。在一些实施方案中,组合物呈现片剂、散剂或液体剂的形式。如果作为散剂提供,则特别预期将散剂与合适的液体(例如,液体奶制品、水果或蔬菜汁、混合水果或蔬菜汁产品等)合并。
在一些实施方案中,本文公开的细菌组合物在给予抗生素药物之前、同时或之后给予受试者。共培养的条件可使得生成的生物膜可在机体内释放有益细菌,从而它们不经受抗生素药物活性。
在一些实施方案中,本文描述的细菌组合物被配制为局部给予 - 例如以霜剂、凝胶、洗剂、香波、染发剂。细菌组合物可给予皮肤或头皮。细菌组合物对于牙科应用可为有用的。对于这样的应用,它们可给予牙龈。
在一些实施方案中,本文描述的组合物掺入食品中。如本文所用的术语"食品"指任何含有营养素的物质,所述营养素可以被生物体摄取来产生能量、促进健康/健康状况、刺激生长和维持生命。如本文所用的术语"富集的食品"指经过改良以包括含有本文描述的组合物的组合物的食品,其提供供给营养素的基本功能之外的益处,例如促进健康/健康状况和/或预防/减轻/治疗疾病的性质。
益生素组合物能掺入任何食品中。示例性食品包括但不限于蛋白粉末(餐后奶昔(meal shake))、烘焙食品(蛋糕、曲奇、饼干、面包、烤饼和松饼)、乳制品(包括但不限于奶酪、酸奶、奶油冻、米饭布丁、慕斯蛋糕、冰淇淋、冷冻酸奶、冷冻奶油)、甜点(包括但不限于冰冻果子露、果汁冰糕、水冰、格兰尼它冰糕(granita)和冷冻水果泥)、煎饼(spreads)/人造黄油、意大利面产品和其他谷物产品、膳食替代产品、营养棒、什锦杂果(trail mix)、格兰诺拉麦片、饮料(包括但不限于思慕雪(smoothie)、水或乳饮料和大豆基饮料)和早餐型谷类食品,如燕麦片。对于饮料,本文描述的益生素组合物可呈现为溶液、悬浮液、乳液或固体。
在一个实施方案中,富集的食品是膳食替代产品。如本文所用的术语"膳食替代产品"指一种旨在代替正常膳食而食用的富集食品。旨在构成替代膳食的营养棒和饮料是膳食替代产品的类型。该术语也包括作为膳食替代减重或体重控制计划的一部分而食用的产品,例如不旨在由其自身替换整顿饭的零食产品,但可与其他此类产品一起使用以代替膳食,或拟在计划内以其他方式使用。这些后者产品的卡路里含量一般在每餐50至500千卡范围内。
在另一个实施方案中,食品是膳食补充品。如本文所用的术语"膳食补充品"指口服的含有旨在补充饮食的"膳食成分"的物质。术语"膳食成分"包括但不限于包含本文描述的益生素组合物的组合物以及维生素、矿物质、草药或其他植物成分、氨基酸,以及诸如酶、器官组织、腺体和代谢产物等的物质。
在还一个实施方案中,食品是医疗食品。如本文所用的术语"医疗食品"指以下食物:其配制为在医生的监督下完全消耗或给予,且旨在用于疾病或病症的特定饮食管理,对于所述疾病或病症,以公认的科学原理为基础,通过医学评估确定了不同的营养要求。
众所周知,向动物饲料中添加益生素微生物可以提高动物效率和健康。具体例子包括增加体重与饲料摄入比(饲料效率)、提高平均日增重、提高产奶量和改善奶牛的乳成分,如在美国专利号5,529,793和5,534,271中描述的。给予益生素生物也可以降低牛的致病生物发生率,如在美国专利号7,063,836中报告的。
因此,依据另一个实施方案,本文描述的益生素组合物能掺入动物饲料中。
在一个实施方案中,益生素组合物被设计为用于在整个喂饲期内连续或定期给予至瘤胃、盲肠或肠道的发酵场所,以减少腹泻的发生率和严重程度和/或整体健康状况。在这个实施方案中,益生素组合物可以引入到动物的瘤胃、盲肠和/或肠道中。
在还一个实施方案中,本文描述的益生素组合物被掺入药物产品或组合物中。药物组合物包含预防或治疗有效量的本文描述的组合物,且通常包含一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂(其在下文讨论)。
本公开内容预期了本文描述的细菌组合物的制剂,其在一些实施方案中被制成粉末、压片、包封或以别的方式配制为用于口服给予。组合物可作为药物组合物、营养食品组合物(例如,膳食补充品)或作为食物或饮食添加剂提供,如根据美国食品和药物管理局(U.S. Food and Drug Administration)定义的。上述组合物的剂型没有特别的限制。例如,液体溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、缓释制剂、散剂、栓剂、脂质体、微粒剂、微囊剂、无菌的等渗水性缓冲液等都被预期为合适的剂型。
组合物典型地包括一种或多种合适的稀释剂、填充剂、盐、崩解剂、粘合剂、润滑剂、助流剂、湿润剂、控释基质、色素、食用香料、载体、赋形剂、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、商用助剂和/或其他的本领域已知的添加剂。
可使用任何药学上可接受的(即,本领域已知的无菌和可接受的无毒的)液体、半固体或固体稀释剂,其用作药学溶媒、赋形剂或介质。示例性稀释剂包括但不限于聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯、硬脂酸镁、磷酸钙、矿物油、可可脂和可可油、对羟基苯甲酸甲酯和丙酯、滑石粉、藻酸盐、碳水化合物,特别是甘露醇、α-乳糖、无水乳糖、纤维素、蔗糖、葡萄糖、山梨醇、改性右旋糖、***胶和淀粉。
药学上可接受的填充剂可包括例如乳糖、微晶纤维素、磷酸二钙、磷酸三钙、硫酸钙、葡萄糖、甘露醇和/或蔗糖。包括三磷酸钙、碳酸镁和氯化钠在内的盐也可用作药物组合物的填充剂。
粘合剂可被用来将组合物保持在一起以形成坚硬的片剂。示例性粘合剂包括来自有机产品的材料,如***树胶、黄蓍胶、淀粉和明胶。其他合适的粘合剂包括甲基纤维素(MC)、乙基纤维素(EC)和羧甲基纤维素(CMC)。
在一些实施方案中,富集食品还包含生物利用度增强剂,其作用是增加机体对可吸附天然产物的吸收。生物利用度增强剂可以是天然的或合成的化合物。在一个实施方案中,包含本文描述的组合物的富集食品还包含一种或多种生物利用度增强剂,以提高生物活性天然产物的生物利用度。
天然的生物利用度增强剂包括姜、香菜提取物、胡椒提取物和壳聚糖。生姜中的活性化合物包括6-姜酚和6-shogoal。香菜菜也可用作生物利用度增强剂(美国专利申请2003/022838)。胡椒碱(Piperine)是源自胡椒(胡椒(Piper nigrum)或荜茇(Piperlongum))中的化合物,其用作生物利用度增强剂(见美国专利号5,744,161)。胡椒碱可以商标名BioperineRTM市售获得(Sabinsa Corp., Piscataway, N.J.)。在一些实施方案中,天然的生物利用度增强剂以基于富集食品总重量的约0.02%至约0.6%重量的量存在。
合适的合成生物利用度增强剂的实例包括但不限于表面活性剂,包括由PEG-酯组成的那些,例如可以以下商标名市售获得:GelucireRTM、LabrafilRTM、LabrasolRTM、LauroglycolRTM、Pleurol OleiqueRTM (Gattefosse Corp., Paramus, N.J.)和CapmulRTM(Abitec Corp., Columbus, Ohio)。
组合物的量和给予方案是基于与给予目的有关的各种因素,例如人或动物年龄、性别、体重、激素水平或者人或动物的其他营养需要。在一些实施方案中,组合物以约0.001mg/kg体重至约1 g/kg体重的量给予哺乳动物受试者。
一个典型的方案可包括多个剂量的组合物。在一个实施方案中,组合物每日一次给予。组合物可在任何时间给予个体。在一些实施方案中,组合物可在用餐的同时、或之前或用餐时给予。
在一些实施方案中,本发明的这个方面的细菌组合物被配制为用作农产品。细菌组合物可添加到农业载体中,如土壤或植物生长培养基中。可使用的其他农业载体包括肥料、植物基油、保湿剂或其组合。或者,农业载体可以是固体,例如硅藻土、壤土、二氧化硅、藻酸盐、粘土、膨润土、蛭石、种子壳、其他植物和动物产品或者组合,包括颗粒、小丸或悬浮液。任何上述成分的混合物也被预期是载体,例如但不限于在壤土、沙子或粘土等中的pesta (面粉和高岭土粘土)、琼脂或面粉基颗粒。制剂可包括培养的生物的食物来源,如大麦、大米或其他生物材料,例如种子、叶、根、植物元素、甘蔗渣、谷物加工的壳或茎秆、建筑工地垃圾中的地面植物材料或木材、来自纸张、织物或木材回收的锯屑或小纤维。其他合适的制剂将本领域技术人员已知的。
在一个实施方案中,农业制剂包含肥料。优选地,肥料是不使细菌组合物的存活力降低超过20 %、30 %、40 %、50 %或更多的肥料。
在一些情况下,农业制剂中含有除草剂、杀线虫剂、杀昆虫剂、植物生长调节剂、杀鼠药和营养素是有利的。这样的试剂理想地与应用该制剂的植物相容(例如,它不应有害于植物的生长或健康)。此外,试剂理想地不引起人、动物或工业用途的安全问题(例如,不存在安全问题,或化合物足够不稳定,以致源自植物的商品植物产品含有可忽略量的化合物)。
包含本发明的生物膜的农业制剂典型地含有在约0.1-95%重量之间,例如,在约1%和90%之间,在约3%和75%之间,在约5%和60%之间,在约10%和50%湿重之间的本发明的掺入生物膜的有益细菌群。优选制剂含有至少约102 CFU或孢子/ml制剂,至少约103 CFU或孢子/ml制剂,至少约104 CFU或孢子/ml制剂,至少约105 CFU或孢子/ml制剂,至少约106 CFU或孢子/ml制剂,或至少约107 CFU或孢子/ml制剂。
本发明人还预期,本文公开的农业组合物可包含在进一步包含促进植物生长的试剂的制品中。
试剂可以与生物膜在单个组合物中一起配制,或备选地可单独包装,但在一个容器中。
合适的试剂是如本文上面描述的。其他合适的试剂包括肥料、农药(除草剂、杀线虫剂、杀真菌剂和/或杀昆虫剂)、植物生长调节剂、杀鼠药和营养素,下文将对此作进一步说明。
在一个实施方案中,促进植物生长的试剂缺乏抗细菌活性。
如本文所用的术语“约”指± 10 %。
术语"含有"、"包含"、"包纳"、"包括"、“具有”和它们的变化形式是指"包括但不限于"。
术语“由…组成”意指“包括并限于”。
术语"基本上由…组成"意指组合物、方法或结构可以包括另外的成分、步骤和/或部分,但仅仅是在上述另外的成分、步骤和/或部分并不实质上改变所要求保护的组合物、方法或结构的基本和新颖特征的情况下。
如在本文中使用的,除非上下文另有明确规定,单数形式"一个"、"一种"和"该"包括复数指称。例如,术语"化合物"或"至少一种化合物"可包括多种化合物,包括它们的混合物。
在整个本申请中,可以以范围格式来呈现本发明的各种实施方案。应当理解,范围格式的描述仅是为了方便和简洁,而不应被视为是对本发明范围的硬性限制。因此,范围的描述应被视为已具体公开了所有可能的子范围以及范围内的个体数值。例如,范围如1至6的描述应被视为已具体公开了子范围如1-3、1-4、1-5、2-4、2-6、3-6等,以及在范围内的个体数值,例如1、2、3、4、5和6。其适用无关于范围的宽度。
每当在本文中指示数值范围时,意指包括在指示的范围内的任何引用数字(分数或整数)。短语“在第一指示数字和第二指示数字之间的一个或多个范围”和“由第一指示数字“至”第二指示数字的一个或多个范围”在本文中可互换使用,并且意在包括第一和第二指示数字以及其间的所有分数和整数。
如本文所用的术语"方法"是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序,包括但不限于由化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业者已知的那些方式、手段、技术和程序,或容易由已知的方式、手段、技术和程序开发的那些方式、手段、技术和程序。
如本文所用的,术语“治疗”包括消除(abrogating)、基本上抑制、减缓或逆转病症的进展,基本上改善病症的临床或美学症状,或基本上预防病症的临床或美学症状的出现。
要意识到,为简洁起见而在分开的实施方案上下文中描述的本发明的各特征也可在单个实施方案中组合提供。相反,为简洁起见而在单个实施方案上下文中描述的本发明的各特征也可分开地提供,或以任何适当的子组合或以在本发明任何其他描述的实施方案中合适的方式提供。在各实施方案的上下文中描述的某些特征不应被视为这些实施例的必要特征,除非实施方案没有这些要素是无效的。
如上文描述的和如在以下权利要求书部分中要求保护的本发明的各实施方案和方面得到以下实施例的实验支持。
实施例
现参照以下实施例,其连同以上描述一起,以非限制性的方式来说明本发明。
通常,本文中使用的术语和在本发明中采用的实验室程序包括分子技术、生物化学技术、微生物学技术和重组DNA技术。在文献中充分解释了这样的技术。参见,例如,"分子克隆:实验室手册(Molecular Cloning: A laboratory Manual)" Sambrook等人,(1989); "分子生物学的当前方案(Current Protocols in Molecular Biology)"Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel等人, "分子生物学的当前方案(Current Protocols in Molecular Biology)", John Wiley and Sons, Baltimore,Maryland (1989); Perbal, "分子克隆的实践指导(A Practical Guide to MolecularCloning)", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson等人, "重组DNA(Recombinant DNA)", Scientific American Books, New York; Birren等人 (eds) "基因组分析:实验室手册丛书(Genome Analysis: A Laboratory Manual Series)", Vols.1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998);阐述于美国专利号4,666,828、4,683,202、4,801,531、5,192,659和5,272,057中的方法;"细胞生物学:实验室手册(Cell Biology: A Laboratory Handbook)", Volumes I-III Cellis, J. E., ed.(1994); "动物细胞培养 –基础技术手册(Culture of Animal Cells - A Manual ofBasic Technique)" by Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), 第3版; "免疫学的当前方案(Current Protocols in Immunology)" Volumes I-III Coligan J. E., ed.(1994); Stites等人 (eds), "基础和临床免疫学(Basic and Clinical Immunology)"(第8版), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell和Shiigi (eds), "细胞免疫学的选择方法(Selected Methods in Cellular Immunology)", W. H. Freeman和Co.,New York (1980)中的方法;可利用的免疫测定广泛描述于专利和科技文献中,参见例如美国专利号3,791,932、3,839,153、3,850,752、3,850,578、3,853,987、3,867,517、3,879,262、3,901,654、3,935,074、3,984,533、3,996,345、4,034,074、4,098,876、4,879,219、5,011,771和5,281,521;"寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)" Gait, M. J., ed.(1984); “核酸杂交(Nucleic Acid Hybridization)" Hames, B. D.,和Higgins S. J.,eds. (1985); "转录和翻译(Transcription and Translation)" Hames, B. D.,和Higgins S. J., eds. (1984); "动物细胞培养(Animal Cell Culture)" Freshney, R.I., ed. (1986); "固定化细胞和酶(Immobilized Cells and Enzymes)" IRL Press,(1986); "分子克隆的实践指导(A Practical Guide to Molecular Cloning)" Perbal,B., (1984)和"酶学方法(Methods in Enzymology)" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR方案:方法和应用的指导(PCR Protocols: A Guide To Methods AndApplications)", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak等人, "蛋白质纯化和表征的策略-实验室课程手册(Strategies for Protein Purification andCharacterization - A Laboratory Course Manual)" CSHL Press (1996);它们均以引用方式结合于本文,如同在此全文示出一样。在本文件中提供了其他一般参考文献。其中的程序被认为是在本领域中众所周知的,并为方便读者而提供。其中包含的所有信息通过引用结合于本文。
实施例1
生物膜形成
材料和方法
菌株和生长条件:本研究所用的益生素细菌菌株为植物乳杆菌。这种菌株通常是在MRS(Man, Rogosa & Sharpe)肉汤或者使用1.5%琼脂固化的MRS肉汤(DifcoTM)中培养。枯草芽孢杆菌野生菌株NCIB3610及其衍生物通常在LB (每升10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、5 gNaCl)肉汤或使用1.5%琼脂固化的LB中培养。在使用它们前,使植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌在硬琼脂平板上分别生长48 h或过夜,二者均是在37℃。每个菌株的初始培养物使用单个细菌菌落制备,将植物乳杆菌接种到5 mL MRS肉汤中持续8 h而不搅动,并于37℃以150rpm将枯草芽孢杆菌接种到LB培养基持续5小时,直至达到大约1.5的OD600。对于共培养实验,使用MRS培养基(pH 7),因为发现枯草芽孢杆菌能有效地促进生物膜形成并适合于枯草芽孢杆菌和益生素乳酸菌(LAB)的共培养物培养。使枯草芽孢杆菌细胞与等量的植物乳杆菌细胞混合至108个细胞/mL每种菌株的最终浓度,然后以1:100稀释至MRS (pH 7)中。混合培养物中的细胞于37℃以50 rpm厌氧孵育7-8 h。
于30℃,枯草芽孢杆菌的单物种生物膜在MRS (Hy-lab)培养基中或在以不同比例(1:5、1:2、5:1)补充有LB的MRS中生成。为了确定芽孢杆菌菌株形成生物膜的最佳条件,使用1M NaOH将MRS的pH逐渐从6上升至8。本研究所用的所有菌株列于表2中,并且都是同基因的,除非另有说明。
表2
菌株 | 基因型 |
NCIB3610 | 能够形成稳健生物膜的枯草芽孢杆菌的未驯化的野生型菌株 |
RL4566 | <i>ΔkinA::tet</i> |
RL4563 | <i>ΔkinB::kan</i> |
RL4565 | <i>ΔkinC::cat</i> |
RL4569 | <i>ΔkinD::mls</i> |
RL4570 | <i>ΔkinE::mls</i> |
RL4573 | <i>ΔkinA::tet</i>, <i>ΔkinB::kan</i> |
RL4577 | <i>ΔkinC::cat</i>, <i>ΔkinD::mls</i> |
RL4620 | <i>Δspo0A:kan</i> |
RL4582 | 在3610, Spec<sup>R</sup>中的<i>amyE</i>基因座的P<sub><i>tapA</i></sub>-<i>lacZ</i> |
YC668 | <i>ΔabrB::kan</i> |
副地衣芽孢杆菌MS303 | <i></i> |
地衣芽孢杆菌MS310 | <i></i> |
地衣芽孢杆菌S127 | <i></i> |
枯草芽孢杆菌MS1577 | <i></i> |
蜡样芽孢杆菌10987 | <i></i> |
菌落和菌膜生物膜形成分析:为了菌落结构分析,将3 μL初始培养物点种到MRS琼脂平板或对照 LB上,并于30℃孵育72 h。为了菌膜形成分析,将初始培养物以1:100稀释到12-孔平板中的3.5 mL MRS肉汤或对照 LB中,并于30℃不搅动情况下孵育48 h。使用带有axiocam ERc 5s相机的Zeiss Stemi 2000-C显微镜(Zeiss, Germany)拍摄图像。
β-半乳糖苷酶测定:从在30℃、固体培养基上的LB、以不同的比例(1:1、1:5和5:1)补充有MRS的LB或者pH调节至7的MRS中生长的菌落收获细胞,并重悬于磷酸缓冲盐水(PBS)溶液中。生物膜菌落中典型的长束状细胞链使用温和声处理来破坏。细胞样品的光密度(OD)被归一化为PBS中1.0的OD600。收集1毫升的细菌细胞悬液并依据标准程序测定。
植物乳杆菌在共培养物中生长期间的生长曲线分析:枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌的过夜培养物分别在LB或MRS中生长至静止期,并以1:100稀释到具有升高的pH (高达7)的25 mL改良MRS肉汤中。如上所述生成的共培养物样品于37℃和150 rpm下需氧生长8 h。也准备了枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌的单物种培养物,并用作对照样品。每小时从每个培养物中收集1 mL,用于通过菌落形成单位(CFU)计数法进行微生物计数。这是通过使用PBS缓冲液制作适当的稀释物,然后在MRS琼脂上铺板来进行的。将平板于37℃需氧孵育48 h。
使用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察形成生物膜的细胞:使植物乳杆菌细胞与GFP缺陷的枯草芽孢杆菌(YC161)或CFP缺陷的枯草芽孢杆菌(YC189)在改良MRS肉汤中,在如上所述的共培养物中生长。作为单物种培养物生长的每种细菌的细胞悬液用作对照样品。收集1毫升的每种培养物并以5000 rpm离心2分钟。除去上清液后,用1 mL PBS缓冲液洗涤细胞,然后进行离心(5000 rpm,2分钟),重悬在100 µl的相同缓冲液中。从每个样品取出5 µl置于显微镜下的载玻片上,并在透射光显微镜下用Nomarski微分干涉相差(DIC)观察。
扫描电镜(SEM)分析:将如上所述生长的共培养物的细胞放置在涂有聚赖氨酸的载玻片上过夜。此后,用DDW洗涤载玻片两次以除去未贴壁细胞和剩余培养基。使载玻片暴露于40 μl 4%甲醛并于室温下孵育15 min。载玻片使用DDW再洗涤1次,并用SEM分析。
热和冷处理后存活率的分析:将如上所述生成的共培养物样品于37℃和50 rpm下需氧生长7-8 h。作为单一培养物生长的植物乳杆菌细胞被用作对照。取出样品进行测试例如热或冷处理。在处理之前和之后取出样品,声处理以破坏生物膜束(时间:20 sec,脉冲:10 sec,停顿:5 sec,Amp: 30 %)并在MRS琼脂平板上进行CFU计数。
植物乳杆菌在体外消化***中通过过程中的存活分析:为了研究植物乳杆菌在胃肠道中通过过程中的的存活能力,在单一培养物和与枯草芽孢杆菌细胞的共培养物中的植物乳杆菌样品使用体外消化模型(Minekus等人, 2014)监测4 h。为模拟胃消化阶段,将来自每个样品的5 mL等分悬液与模拟胃液(SGF)按1:1混合,直至最终体积为10 mL。加入猪胃蛋白酶(SIGMA P9700)以获得在最终消化混合物中的2000 U mL-1,接着加入CaCl2获得在最终消化混合物中的0.075 mM。用1M HCl将pH降至3.0,并将样品置于带有磁力搅拌器的37℃水浴中2 h。将每个样品分配到2个管中,各自含有5 mL。将50µl PMSF (苯甲基磺酰氟;SIGMA P7626)加入到1个管中以终止反应,然后对植物乳杆菌的存活性进行检查。将另一管用于下一个消化阶段 – 肠。为模拟肠消化阶段,使2.5 mL胃食糜与模拟肠液(SIF)按1:1混合至最终体积5mL。加入1M NaOH以中和该混合物至pH 7.0,将胰酶添加到消化混合物中,以达到最终混合物中的以下活性:猪胰蛋白酶(SIGMA T0303) (100 U mL-1)、牛胰凝乳蛋白酶(SIGMA C4129) (25 U mL-1)、猪胰腺α淀粉酶(SIGMA A3176) (200 U mL-1)、猪胰腺脂肪酶(SIGAM L3126) (2000 U mL-1)。此外,加入胆汁盐(SIGMA T4009)以获得在最终混合物中的10 mM的最终浓度,然后将样品再孵育2.5 h。在胃和肠阶段后从每个样品收集1毫升,使用如上所述的CFU计数法确定存活的植物乳杆菌细胞数目。
结果
在共培养物中枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌相互生长的***开发
先前已表明,生物膜对各种不利的环境条件有增加的耐受性,这显然是由于细胞外基质的产生(Friedman, Kolter, & Branda, 2005)。本发明人因此假设,由健壮的形成生物膜的细菌枯草芽孢杆菌产生的细胞外基质可在共培养物生物膜***中的生长过程中对其他物种例如益生菌提供增加的保护。为此,开发了专门的培养基,其中植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌能够在共培养物中生长。已发现通过改变MRS的pH至pH 7,可使这些细菌在共培养物中生长。如在图13中所示,共培养物培养对植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌生长没有影响(与它们在纯培养物中的生长比较),表明在给定条件下这些细菌之间没有拮抗的相互作用。令人惊讶的是,发现MRS培养基的改良促进枯草芽孢杆菌的强生物膜形成(图2)。因为枯草芽孢杆菌似乎对酸性pH敏感,所以将用于共培养物培养的MRS培养基的pH逐渐升高,以寻找适合芽孢杆菌生长的pH值。pH从6增加至8导致菌落和菌膜生物膜的生物膜表型的稳健性成比例增加(图2)。当pH调节至6时,观察到在固体MRS培养基上的弱生长且在液体培养基中未观察到生长。当pH调节至6.5时,不仅观察到细菌在固体和液体MRS中生长,而且令人惊讶的是,在固体培养基上观察到生物膜形成的开始。在pH增加至7和8后,在这两种生长设定中都观察到极其稳健的生物膜表型。其次,对枯草芽孢杆菌在MRS (pH 7)和LB中的的生长速率进行了比较。如在图13中可以见到的,与LB相比,在MRS中微生物生长初期观察到稍微的延迟。然而,与LB比较,在MRS中生长的枯草芽孢杆菌细胞在之后注意到更高的生长速率。
修饰的MRS培养基促进通过KinD-Spo0A途径的生物膜形成和基质基因表达
为评价MRS培养基在促进生物膜发展和基质基因表达中的潜力,LB培养基(通常用来培养枯草芽孢杆菌)富集有不同量的MRS (1:1、1:5和5:1)。生物膜表型与MRS浓度的增加之间显示出正比关系(图3)。也使用tapA和eps操纵子研究了增加的MRS浓度对枯草芽孢杆菌中基质基因表达的影响,因为它们的产物是细胞外基质的主要成分。已发现tapA的表达随着LB中MRS浓度而成比例地增加(图4)。eps的表达与MRS的浓度成比例地增加,直至80% MRS,而对于100% MRS则检测到表达下降(图5)。
其次,本发明人测定了,MRS是否通过先前对枯草芽孢杆菌描述的Kin-Spo0A途径引发生物膜形成(Shemesh和Chai, 2013 Journal of Bacteriology, 2013, Vol 195,No.12 2747-2754页)。他们测试了不同的枯草芽孢杆菌突变体的生物膜形成(ΔkinA、Δ kinB、ΔkinC、ΔkinD、ΔkinE、ΔkinAB、ΔkinCD、Δspo0A、ΔepsΔtasA)或过度产生生物膜(ΔabrB)。首先,他们确定了缺乏组氨酸激酶的突变体的生物膜表型,这些激酶负责感知诱导生物膜形成的环境信号。他们发现,任一种激酶的单一突变体在生物膜表型上没有显示出明显的缺陷,但是ΔkinC和ΔkinD突变体与对照相比,显示生物膜的形成略有下降(图14)。然而,ΔkinCD双突变体显示生物膜表型完全废除(图5A)。在另一方面,ΔkinAB的双重突变不防止生物膜形成,但是观察到生物膜表型的一些改变(在菌落型生物膜的情况下)。主转录调节剂spo0A的突变以及eps和tasA的双重突变完全废除了生物膜形成(图5A)。转录抑制子ΔabrB的突变与对照WT细胞比较,未导致生物膜形成的额外的增加(图5B)。这一结果再次强调了枯草芽孢杆菌WT细胞在改良MRS培养基中生长过程中基质生产的显著增加。
为了研究MRS的生物膜促进作用是否在芽孢杆菌物种之间保守,测试了其他枯草芽孢杆菌菌株以及其他芽孢杆菌物种。如通过皱褶的菌落(图6)和稳健的浮游菌膜(图7)所判断的,观察到生物膜促进作用。
枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌在共培养物中的生长导致双物种生物膜发育
改良MRS培养基用于通过共培养荧光标记的组成型地表达GFP的枯草芽孢杆菌细胞(YC161)与植物乳杆菌细胞来研究双物种生物膜。使用CLSM观察生成的生物膜。如可在图8A(顶部小图)中见到的,生成的生物膜由荧光和非-荧光细胞二者组成。植物乳杆菌细胞被枯草芽孢杆菌细胞环绕,枯草芽孢杆菌细胞彼此附着而形成生物膜相关结构(束)。这在图8B中得到进一步说明,该图说明了枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌在LBGM培养基中共培养的生物膜。
因为枯草芽孢杆菌中的生物膜形成取决于细胞外基质的合成,所以本发明人试图确定细胞外基质的产生是否在双物种生物膜发育过程中发生。用tapA-sipW-tasA (负责枯草芽孢杆菌中生物膜基质的蛋白质组分合成的操纵子)的启动子与编码青色荧光蛋白的cfp基因(YC189)的转录融合,对形成的生物膜中基质基因的表达水平进行了分析,如前所述(Shemesh, Kolter, & Losick, 2010, J Bacteriol 192, 6352-6356) (P tapA -cfp)。观察到CFP的显著表达,表明tapA-sipW-tasA操纵子被激活,因此在双物种生物膜中诱导了基质的产生(图8,底部小图)。为确定植物乳杆菌细胞是否可被源自枯草芽孢杆菌生物膜形成的胞外聚合物所围绕,使用SEM分析了双物种生物膜(图9)。获得的图像(图9C)证实生物膜的3-维和异质结构的形成,其中植物乳杆菌细胞似乎被掺入到由枯草芽孢杆菌产生的细胞外基质中。重要的是,作为单一培养物生长的枯草芽孢杆菌细胞也形成具有同质结构特征的生物膜,其中细胞的长丝通过细胞外基质结合在一起(图9A)。相反,植物乳杆菌细胞在单物种培养物中不能形成显著的生物膜。上述观察结果表明,由枯草芽孢杆菌细胞产生的细胞外基质可与植物乳杆菌细胞共享,因而为它们提供可能的针对环境压力的保护。
双物种生物膜有利于植物乳杆菌在有害环境下的存活
为了确定由枯草芽孢杆菌在共培养物生物膜中产生的基质是否可为植物乳杆菌提供对抗不利环境条件的防卫,在热处理期间(模拟工业加工的条件,如巴氏杀菌)以及在冷冻期间(模拟贮存条件的条件)测试植物乳杆菌细胞的存活。对于热处理巴氏杀菌,使在共培养物生物膜中生长的植物乳杆菌细胞暴露于63℃的加热1和3 min。对于冷处理,于4℃,将在共培养物生物膜中生长的植物乳杆菌细胞贮存达21天。在单物种培养物中生长的植物乳杆菌细胞用作对照。热处理1和3 min后,在共培养物生物膜中生长的植物乳杆菌细胞分别导致存活的植物乳杆菌细胞的数目约1.25 Log CFU/mL和1.06 Log CFU/mL的增加(与对照比较) (图10)。此外,冷处理试验结果表明,在共培养物生物膜中生长的植物乳杆菌细胞在整个贮存条件下受到更多保护,表明其存活力增加了约0.44-0.89 Log CFU/mL (图10)。
在双物种生物膜形成过程中产生的细胞外基质有利于植物乳杆菌在热处理过程中的存活
为进一步证明细胞外基质有利于植物乳杆菌增加对不利环境条件的抵抗,生成了植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌突变菌株(生物膜形成缺陷(ΔepsΔtasA)或过度产生生物膜基质(ΔabrB))的共培养物。使共培养物经受热处理巴氏杀菌。在单物种培养物和与野生型枯草芽孢杆菌的共培养物中生长的植物乳杆菌细胞用作对照。如在图11A中所示,与ΔepsΔ tasA双突变体细胞一起生长的植物乳杆菌细胞与在单物种培养物中生长的植物乳杆菌比较,未显示其存活水平有显著的差异。然而,观察到在与野生型枯草芽孢杆菌的共培养物中生长的植物乳杆菌细胞存活的显著增加。引人关注的是,与在单一培养物中生长的植物乳杆菌的存活率比较,观察到在ΔabrB突变细胞的存在下生长的植物乳杆菌细胞的存活率约1.78 Log CFU/mL的增加。
在另一个实验中,样品在30℃、20 rpm下在牛奶中生长18小时。此后将它们于63℃热处理1-3 min。对照样品未经热处理。存活的植物乳杆菌细胞的数目使用CFU-方法确定。*p<0.05。如在图11B中说明的,枯草芽孢杆菌生物膜有利于植物乳杆菌在牛奶中加热过程中的存活。
在形成双物种生物膜期间产生的细胞外基质有利于植物乳杆菌在类似人消化***的条件下的存活
为了研究植物乳杆菌在胃肠道中通过期间的存活能力,使用体外消化模型检查了植物乳杆菌细胞的存活率(图12)。在模拟的胃条件下孵育2 h后,与单一培养物的植物乳杆菌细胞比较,观察到在与枯草芽孢杆菌的共培养物生物膜中生长的植物乳杆菌细胞约0.86 LogCFU/mL的存活细胞浓度增加。此后,在模拟的肠条件下孵育细胞2 h,与游离的活的植物乳杆菌细胞比较,对于受生物膜保护的植物乳杆菌细胞观察到约0.9 Log CFU/mL的存活细胞浓度增加。
实施例2
乙偶姻增强生物膜形成
食品通常富含不同的食物添加剂,其可以改善产品的感官特性和感觉特性。在这些添加剂中存在重要的小分子,如乙偶姻,它们可以改善不同食品的风味。乙偶姻是一种广泛存在于自然界中的中性分子。一些微生物、高等植物、昆虫和高等动物有合成乙偶姻的能力。这些添加剂可以影响许多与人类健康相关的细菌的生理,并影响被称为生物膜的细菌细胞的多细胞群落的发育。生物膜形成依赖于细胞外基质的合成,细胞外基质将组成细胞保持在一起。在枯草芽孢杆菌(一种益生菌)中,基质有两种主要成分,即通过epsA-O操纵子的产物合成的胞外多糖和由tapA-sipW-tasA操纵子编码的淀粉样蛋白纤维。
结果
如在图15A-C中说明的,乙偶姻在枯草芽孢杆菌中引起生物膜束的形成。在乙偶姻不存在的情况下,当在LB培养基中生长时未观察到生物膜形成(图15A)。图16A-B说明,乙偶姻在枯草芽孢杆菌中引起菌落型生物膜的形成。负责枯草芽孢杆菌中基质生产的tapA操纵子的转录显示被乙偶姻高度上调(图17A-D)。
结果表明,枯草芽孢杆菌的细胞在乙偶姻的存在下生长过程中发育成复杂的束。细胞响应乙偶姻而表达高水平的细胞外基质成分,它们对生物膜的形成至关重要。
虽然已连同其具体实施方案一起描述了本发明,但明显的是,对于本领域技术人员而言,许多备选、改进和变化将是显而易见的。因此,其旨在涵盖落入所附权利要求书的精神和宽范围内的所有这样的备选、改进和变化。
在本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请的全部内容以引用方式结合于本说明书,结合程度如同各个个体的出版物、专利或专利申请具体地和单独地指明通过引用结合到本文中。另外,在本申请中任何参考文献的引用或识别不应被理解为承认这样的参考文献可作为本发明的现有技术。就使用的章节标题来说,它们不应该被视为一定是限制性的。
Claims (36)
1.一种制备细菌组合物的方法,所述方法包括:
(a) 在产生生物膜的条件下,在生长基质中体外共培养有益细菌与产生物膜细菌,所述生物膜包含所述有益细菌和所述非致病细菌;和
(b) 将所述生物膜与所述生长基质分离,从而制备所述细菌组合物。
2.权利要求1的方法,其中所述产生物膜细菌是非致病细菌。
3.权利要求1或2的方法,其中所述产生物膜细菌属于芽孢杆菌属。
4.权利要求3的方法,其中所述产生物膜细菌属于枯草芽孢杆菌(B. subtilis)物种。
5.权利要求1的方法,其中所述有益细菌是益生菌。
6.权利要求1的方法,其中所述有益细菌经基因修饰以表达治疗性多肽。
7.权利要求5的方法,其中所述益生菌属于乳杆菌目。
8.权利要求5或7的方法,其中所述产生物膜细菌属于枯草芽孢杆菌物种。
9.权利要求5或7的方法,其中所述益生菌属于植物乳杆菌(L. plantarum)物种。
10.权利要求1的方法,其中所述有益细菌被用于生物修复。
11.权利要求1的方法,其中所述产生物膜细菌表达KinD-Spo0A途径的基因。
12.权利要求1-9中任一项的方法,其中所述生长基质包含生长培养基。
13.权利要求12的方法,其中所述生长培养基选自LB、LBGM、牛奶和MRS。
14.权利要求1的方法,其中当所述产生物膜细菌属于芽孢杆菌属和所述有益细菌属于乳杆菌目时,所述生长基质是LBGM、牛奶或MRS。
15.权利要求11或14的方法,其中所述生长基质是MRS。
16.权利要求14或15的方法,其中所述条件包括约6.5-8的pH。
17.权利要求16的方法,其中所述条件包括6.8-7.5的pH。
18.权利要求1-17中任一项的方法,其中所述生长基质包含乙偶姻。
19.权利要求1-18中任一项的方法,其还包括在所述分离后使所述生物膜脱水。
20.权利要求1-19中任一项的方法,其中所述有益细菌包含不超过50种细菌物种。
21.权利要求1-20中任一项的方法,其中所述产生物膜细菌是单一物种的产生物膜细菌。
22.一种细菌组合物,其依据权利要求1-19中任一项的方法获得。
23.权利要求22的细菌组合物,其中所述组合物中至少50%的细菌存活。
24.权利要求22的细菌组合物,其包含不超过50种细菌物种的有益细菌。
25.权利要求22或24的细菌组合物,其包含单一物种的非致病细菌。
26.权利要求22的细菌组合物,其是可食用的。
27.权利要求22的细菌组合物,其是益生菌组合物。
28.权利要求22或26的细菌组合物,其被配制为散剂、液体剂或片剂。
29.一种食物/饲料产品,其包含权利要求27的细菌组合物。
30.一种改善或保持受试者健康的方法,所述方法包括给予所述受试者治疗有效量的权利要求27的益生素组合物,从而改善或保持所述受试者的健康。
31.一种选择有利于制备细菌组合物的试剂或培养条件的方法,所述方法包括在所述试剂的存在下或在所述培养条件下,在生长基质中共培养有益细菌与产生物膜细菌,以生成包含所述有益细菌和所述产生物膜细菌的生物膜,其中所述生物膜性质的变化表明所述试剂或培养条件有利于制备所述细菌组合物。
32.权利要求31的方法,其中所述产生物膜细菌属于芽孢杆菌属。
33.权利要求32的方法,其中所述产生物膜细菌属于枯草芽孢杆菌物种。
34.权利要求33的方法,其中所述有益细菌是益生菌。
35.权利要求34的方法,其中所述益生菌属于乳杆菌目。
36.权利要求31的方法,其中所述试剂改变***的培养基的pH。
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