JP6996075B2 - 食中毒原因菌の迅速検出方法 - Google Patents
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Description
特に、1mg/ml以上のウシ血清アルブミン、グリセロール、グリコールおよびゼラチンの少なくとも1つをPCR反応液中に用いることにより、検体由来の阻害物質に対する耐性が上がり、より効率よく検出可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
項1.試料中のサルモネラ菌、腸管出血性大腸菌、赤痢菌の3菌種を同時にPCR反応により検出する食中毒原因菌の検出方法であって、蛍光プローブの蛍光波長の違いによって、菌種の違いを識別することが可能であることを特徴とする食中毒原因菌の検出方法。
項2.内部標準遺伝子をさらに含み、試料中のサルモネラ菌、腸管出血性大腸菌、赤痢菌の3菌種と内部標準遺伝子を、蛍光プローブの蛍光波長の違いによって識別することが可能であることを特徴とする項1に記載の食中毒原因菌の検出方法。
項3.検出対象が、10種以上の便から採取した便検体からなるプール検体である項1または2に記載の食中毒原因菌の検出方法。
項4.40分以内にPCR反応が終了することを特徴とする項1から3のいずれかに記載の食中毒原因菌の検出方法。
項5.試料が85℃以上で加熱処理されたサンプルである、項1から4のいずれかに記載の食中毒原因菌の検出方法。
項6.サルモネラ菌のinvA遺伝子を検出するためのプライマーセットであり、配列番号1から3より選択されるいずれかの塩基配列の少なくとも15塩基を含む、任意の2つのプライマーからなる第一のプライマーセットと、
腸管出血性大腸菌のvtx1遺伝子を検出するためのプライマーセットであり、配列番号4から7より選択されるいずれかの塩基配列の少なくとも15塩基を含む、任意の2つのプライマーからなる第二のプライマーセットと、
腸管出血性大腸菌のvtx2遺伝子を検出するためのプライマーセットであり、配列番号8から11より選択されるいずれかの塩基配列の少なくとも15塩基を含む、任意の2つのプライマーからなる第三のプライマーセット、および、
赤痢菌のipaH遺伝子を検出するためのプライマーセットであり、配列番号12から14より選択されるいずれかの塩基配列の少なくとも15塩基を含む、任意の2つのプライマーからなる第四のプライマーセットと、のうちから選択される少なくともいずれか一つのプライマーセットを含むことを特徴とする食中毒原因菌の検出用試薬。
項7.第一のプライマーセット、第二のプライマーセット、第三のプライマーセットおよび第四のプライマーセットのうち、いずれか2つを含むことを特徴とする項6に記載の食中毒原因菌の検出用試薬。
項8.第一のプライマーセット、第二のプライマーセット、第三のプライマーセットおよび第四のプライマーセットのうち、いずれか3つを含むことを特徴とする項6に記載の食中毒原因菌の検出用試薬。
項9.第一のプライマーセット、第二のプライマーセット、第三のプライマーセットおよび第四のプライマーセットのすべてを含むことを特徴とする項6に記載の食中毒原因菌の検出用試薬。
項10.サルモネラ菌のinvA遺伝子を検出するための蛍光プローブであり、配列番号15の塩基配列の少なくとも15塩基を含む第一の蛍光プローブと、
腸管出血性大腸菌のvtx1遺伝子を検出するための蛍光プローブであり、配列番号16の塩基配列の少なくとも15塩基を含む第一の蛍光プローブと、
腸管出血性大腸菌のvtx2遺伝子を検出するための蛍光プローブであり、配列番号17の塩基配列の少なくとも15塩基を含む第一の蛍光プローブ、および、
赤痢菌のipaH遺伝子を検出するための蛍光プローブであり、配列番号18の塩基配列の少なくとも15塩基を含む第一の蛍光プローブとを含むことを特徴とする項6から9のいずれかに記載の食中毒原因菌の検出用試薬。
項11.PCR反応液に、DNAポリメラーゼを含み、DNAポリメラーゼがTaq、Tth、またはそれらの変異体から選択されることを特徴とする項6から10のいずれかに記載の食中毒原因菌の検出用試薬。
項12.PCR反応液に、ウシ血清アルブミン、グリセロール、グリコールおよびゼラチンよりなる群から選択された少なくとも1つを含むことを特徴とする項6から11のいずれかに記載の食中毒原因菌用試薬。
・ 糞便懸濁処理液の調製
ヒト糞便検体を10%(重量%)となるように懸濁した検体を、等量ずつ50検体混合し、プール糞便を作製した。このプール糞便を95℃で10分間熱処理し、12,000rpmで5分間遠心した。この上清に各食中毒原因菌DNAを添加し、試料として使用した。
以下に示す組成のPCR反応液を作製し、試料からの食中毒原因菌の検出を行った。
1xBuffer (Blend Taq(登録商標)添付バッファー(東洋紡))
3mg/ml BSA
各0.2mM dATP,dGTP,dCTP,dTTP
1%ゼラチン
0.1unit/μl rTth DNA polymerase(東洋紡)
0.02μg/μl 抗Tth抗体
プライマー液 (表1)
プローブ液 (表1)
前記反応液18μlを、(1)で調製した各試料2μlに添加した。これを以下の温度サイクルで反応した。63℃の伸長ステップで蛍光値の読取を行った。
94℃ 20秒、
94℃ 2秒-63℃ 5秒 10サイクル
94℃ 2秒-63℃ 5秒 35サイクル(蛍光値の読み取り)
サルモネラ菌をCy5チャンネル、腸管出血性大腸菌をROXチャンネル、赤痢菌をHEXチャンネル、内部標準遺伝子をFAMチャンネルでそれぞれ検出した。
上記PCR反応時間は38分であった。増幅曲線を図1に示す。サルモネラ菌、腸管出血性大腸菌、赤痢菌の各遺伝子を同時に検出することができた。
(1)反応液の調製
ヒト糞便検体を10%(重量%)となるように懸濁した検体を、等量ずつ50検体混合し、プール糞便を作製した。このプール糞便を95℃で10分間熱処理し、12,000rpmで5分間遠心した。この上清に各食中毒原因菌DNAを添加し、試料として使用した。
以下に示す組成のPCR反応液を作製し、試料からの食中毒原因菌の検出を行った。
1xBuffer (Blend Taq(登録商標)添付バッファー(東洋紡))
3mg/ml BSA
各0.2mM dATP,dGTP,dCTP,dTTP
1%ゼラチン
0.1unit/μl rTth DNA polymerase(東洋紡)
0.02μg/μl 抗Tth抗体
プライマー液 (表2)
プローブ液 (表2)
前記反応液18μlを、(1)で調製した各試料2μlに添加した。これを以下の温度サイクルで反応した。
94℃ 20秒、
94℃ 2秒-63℃ 5秒 10サイクル
94℃ 2秒-63℃ 5秒 35サイクル(蛍光値の読み取り)
サルモネラ菌をCy5チャネンル、腸管出血性大腸菌をFAMチャンネル、赤痢菌をHEXチャンネル、内部標準遺伝子をROXチャンネルでそれぞれ検出した。
上記PCR反応時間は38分であった。増幅曲線を図2に示す。この結果、サルモネラ菌、腸管出血性大腸菌、赤痢菌の各遺伝子を同時に検出できた。
(1)反応液の調製
ヒト糞便検体を10%(重量%)となるように懸濁した検体を、等量ずつ50検体混合し、プール糞便を作製した。このプール糞便を95℃で10分間熱処理し、12,000rpmで5分間遠心した。この上清にサルモネラ菌DNAを添加し、試料として使用した。
(2-1)反応液
以下に示す組成のPCR反応液を作製し、試料からのサルモネラ菌の検出を行った。
1xBuffer (Blend Taq(登録商標)添付バッファー(東洋紡))
各0.2mM dATP,dGTP,dCTP,dTTP
1%ゼラチン
0.1unit/μl rTth DNA polymerase(東洋紡)
0.02μg/μl 抗Tth抗体
プライマー液 (表1)
プローブ液 (表1)
(2-2)添加剤の条件
条件1 BSAなし
条件2 1mg/mL BSA
条件3 3mg/mL BSA
(3)反応
前記反応液18μlを、(1)で調製した各試料2μlに添加した。これを以下の温度サイクルで反応した。
94℃ 20秒、
94℃ 2秒-63℃ 5秒 10サイクル
94℃ 2秒-63℃ 5秒 35サイクル(蛍光値の読み取り)
増幅曲線を図3及び図4に示す。図3ではBSAを添加していない条件1と比較して、条件2及び条件3とBSAの添加量に従ってCq値が改善している様子がわかる。また、図4ではBSAの添加量に従って蛍光強度が改善していることがわかる。
(1) 反応液の調製
以下に示す組成のPCR反応液を作成し、試料からの食中毒原因菌の検出を行った。
1xBuffer (Blend Taq(登録商標)添付バッファー(東洋紡))
3mg/ml BSA
各0.2mM dATP,dGTP,dCTP,dTTP
1%ゼラチン
0.1unit/μl rTth DNA polymerase(東洋紡)
0.02μg/μl 抗Tth抗体
プライマー液 (表1)
プローブ液 (表1)
前記反応液16μlに、サルモネラ菌、腸管出血性大腸菌、赤痢菌から選ばれる2種の菌のDNAを、それぞれを1000コピー、10コピー、各2μlずつ添加した。これを以下の温度サイクルで反応した。63℃の伸長ステップで蛍光値の読取を行った。
94℃ 20秒、
94℃ 2秒-63℃ 5秒 10サイクル
94℃ 2秒-63℃ 5秒 35サイクル(蛍光値の読み取り)
サルモネラ菌をCy5チャンネル、腸管出血性大腸菌をROXチャンネル、赤痢菌をHEXチャンネル、内部標準遺伝子をFAMチャンネルでそれぞれ検出した。
増幅曲線を図5に示す。この結果、すべての組み合わせにおいて1000コピーと10コピーを同時に、且つ蛍光波長の違いによって分離して検出することが確認できた。
Claims (4)
- 以下の第一のプライマーセット、第二のプライマーセット、第三のプライマーセットおよび第四のプライマーセットを含むことを特徴とする食中毒原因菌の検出用試薬:
サルモネラ菌のinvA遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、
(1)配列番号1に示される塩基配列若しくはその相補鎖である塩基配列の少なくとも15塩基を含むプライマー及び配列番号3に示される塩基配列若しくはその相補鎖である塩基配列の少なくとも15塩基を含むプライマーを含み、一方のプライマーが他方のプライマーのDNA伸長生成物に対して相補的であるプライマーセット、又は
(2)配列番号2に示される塩基配列若しくはその相補鎖である塩基配列の少なくとも15塩基を含むプライマー及び配列番号4に示される塩基配列若しくはその相補鎖である塩基配列の少なくとも15塩基を含むプライマーを含み、一方のプライマーが他方のプライマーのDNA伸長生成物に対して相補的であるプライマーセットのいずれか或いは両方を含む第一のプライマーセット;
腸管出血性大腸菌のvtx1遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、
(3)配列番号6に示される塩基配列若しくはその相補鎖である塩基配列の少なくとも15塩基を含むプライマー及び配列番号7に示される塩基配列若しくはその相補鎖である塩基配列の少なくとも15塩基を含むプライマーを含み、一方のプライマーが他方のプライマーのDNA伸長生成物に対して相補的であるプライマーセット、又は
(4)配列番号5に示される塩基配列若しくはその相補鎖である塩基配列の少なくとも15塩基を含むプライマー及び配列番号8に示される塩基配列若しくはその相補鎖である塩基配列の少なくとも15塩基を含むプライマーを含み、一方のプライマーが他方のプライマーのDNA伸長生成物に対して相補的であるプライマーセットのいずれか或いは両方を含む第二のプライマーセット;
腸管出血性大腸菌のvtx2遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、
(5)配列番号9に示される塩基配列若しくはその相補鎖である塩基配列の少なくとも15塩基を含むプライマー及び配列番号10に示される塩基配列若しくはその相補鎖である塩基配列の少なくとも15塩基を含むプライマーを含み、一方のプライマーが他方のプライマーのDNA伸長生成物に対して相補的であるプライマーセット、又は
(6)配列番号10に示される塩基配列若しくはその相補鎖である塩基配列の少なくとも15塩基を含むプライマー及び配列番号11に示される塩基配列若しくはその相補鎖である塩基配列の少なくとも15塩基を含むプライマーを含み、一方のプライマーが他方のプライマーのDNA伸長生成物に対して相補的であるプライマーセットのいずれか或いは両方を含む第三のプライマーセット;および、
赤痢菌のipaH遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、
(7)配列番号12に示される塩基配列若しくはその相補鎖である塩基配列の少なくとも15塩基を含むプライマー及び配列番号13に示される塩基配列若しくはその相補鎖である塩基配列の少なくとも15塩基を含むプライマーを含み、一方のプライマーが他方のプライマーのDNA伸長生成物に対して相補的であるプライマーセット、又は
(8)配列番号13に示される塩基配列若しくはその相補鎖である塩基配列の少なくとも15塩基を含むプライマー及び配列番号14に示される塩基配列若しくはその相補鎖である塩基配列の少なくとも15塩基を含むプライマーを含み、一方のプライマーが他方のプライマーのDNA伸長生成物に対して相補的であるプライマーセットのいずれか或いは両方を含む第四のプライマーセット。 - サルモネラ菌のinvA遺伝子を検出するための蛍光プローブであって、第一のプライマーセットとして、前記(1)のプライマーセットを使用する場合に用いられる配列番号15の塩基配列又はその相補鎖である塩基配列の少なくとも15塩基を含む蛍光プローブ又は前記(2)のプライマーセットを使用する場合に用いられる配列番号16の塩基配列又はその相補鎖である塩基配列の少なくとも15塩基を含む蛍光プローブである、第一の蛍光プローブと、
腸管出血性大腸菌のvtx1遺伝子を検出するための蛍光プローブであり、配列番号17の塩基配列又はその相補鎖である塩基配列の少なくとも15塩基を含む第二の蛍光プローブと、
腸管出血性大腸菌のvtx2遺伝子を検出するための蛍光プローブであって、第三のプライマーセットとして、前記(5)のプライマーセットを使用する場合に用いられる配列番号19の塩基配列又はその相補鎖である塩基配列の少なくとも15塩基を含む蛍光プローブ又は前記(6)のプライマーセットを使用する場合に用いられる配列番号18の塩基配列又はそれらの相補鎖である塩基配列の少なくとも15塩基を含む蛍光プローブである、第三の蛍光プローブ、および、
赤痢菌のipaH遺伝子を検出するための蛍光プローブであり、配列番号20の塩基配列又はその相補鎖である塩基配列の少なくとも15塩基を含む第四の蛍光プローブのうちから選択される少なくともいずれか一つの蛍光プローブを含むことを特徴とする請求項1に記載の食中毒原因菌の検出用試薬。 - PCR反応液に、DNAポリメラーゼを含み、DNAポリメラーゼがTaq、Tth、またはそれらの変異体から選択されることを特徴とする請求項1又は2に記載の食中毒原因菌の検出用試薬。
- PCR反応液に、ウシ血清アルブミン、グリセロール、グリコールおよびゼラチンよりなる群から選択された少なくとも1つを含むことを特徴とする請求項1から3のいずれかに記載の食中毒原因菌の検出用試薬。
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