JP6728657B2 - 核酸増幅法 - Google Patents
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Description
〔項1〕PCRにより核酸を増幅する工程において、異なる熱変性温度を含む2種類以上の熱サイクルを有し、かつ、核酸増幅工程における後の熱サイクルの熱変性温度が、先の熱サイクルの熱変性温度と同じ温度であるか又は低い温度であることを特徴とする核酸増幅方法。
〔項2〕以下の工程(a)及び(b)を含み、かつ、工程(a)及び(b)を併せた熱サイクル数が30回から50回であることを特徴とする項1に記載の核酸増幅方法。
(a)90℃から100℃の間の変性温度を含む熱サイクルを少なくとも5回以上繰り返す工程
(b)工程(a)続く熱サイクルであって、工程(a)の熱変性温度より2℃から10℃低い熱変性温度を含む熱サイクルを5回以上繰り返す工程
〔項3〕以下の工程(c)をさらに含み、かつ、工程(a)、(b)及び(c)を併せた熱サイクル数が30回から50回であることを特徴とする項2に記載の核酸増幅方法。
(c)工程(b)に続く熱サイクルであって、工程(b)の熱変性温度より1℃以上低い熱変性温度を含む熱サイクルを5回以上繰り返す工程
〔項4〕最も高い熱変性温度と最も低い熱変性温度との差が5℃から10℃となる熱サイクルを有することを特徴とする項1から3のいずれかに記載の核酸増幅方法。
〔項5〕核酸増幅方法がマルチプレックスPCRである項1から4のいずれかに記載の核酸増幅法。
〔項6〕核酸増幅の試料が生体由来である項1から5のいずれかに記載の核酸増幅法。
〔項7〕核酸増幅の試料が核酸抽出を行うことなく得られた試料である項6に記載の核酸増幅法。
〔項8〕試料が便検体である項6又は7に記載の核酸増幅法。
〔項9〕サルモネラ菌、腸管出血性大腸菌、赤痢菌からなる群より選択される少なくとも1つの細菌が保有する遺伝子を標的核酸とする項1から8のいずれかに記載の核酸増幅法。
また、例えば検便検査では50検体を1プールとして解析を行うため、実質的には(96×50×n)個、すなわち(4800×n)個も処理可能な検体数が増えることになる。また、複数台のサーマルサイクラ―を保有している検査センターでは、さらに効率化に顕著な効果ができる。例えば、3台のサーマルサイクラ―を保有している場合、(96×3×n)個、すなわち(288×n)個の処理数が増分となり、50検体をプールした場合に、実質的には(4800×3×n)個、すなわち(14400×n)個も処理可能な検体数が増えることになる。
本発明における熱サイクルは、初期のサイクル反応では熱変性温度を比較的高く設定して行い、サイクルが進行するにしたがって、熱変性温度を段階的に下げていくことを特徴とする方法である。
(a)90℃から100℃、より好ましくは94℃から98℃の間の変性温度を含む熱サイクルを少なくとも5回以上繰り返す工程
(b)工程(a)続く熱サイクルであって、工程(a)の熱変性温度より2℃から10℃、
より好ましくは3℃から7℃低い熱変性温度を含む熱サイクルを5回以上繰り返す工程
(c)工程(b)に続く熱サイクルであって、工程(b)の熱変性温度より1℃以上、好ましくは2℃以上、より好ましくは3℃以上低い熱変性温度を含む熱サイクルを5回以上繰り返す工程
また、工程(c)の後に、工程(c)の熱変性温度より1℃以上低い熱変性温度を含む熱サイクルを5回以上繰り返してもよい。
サルモネラ菌遺伝子、腸管出血性大腸菌(EHEC)、赤痢菌のゲノムDNAをそれぞれ用いた。また陰性検体である糞便検体を10%程度となるように水で懸濁し、50個をプールした。プールした検体を95℃、5分間熱処理、遠心分離後の上清液を糞便サンプルとして以下の検討に用いた。
調製したサンプルをThermal Cycler Dice(登録商標)II(タカラバイオ製)にて通常サイクル(94℃ 20秒、94℃ 2秒−55℃ 5秒−68℃ 5秒 40サイクル、融解曲線解析 0.5℃/Step)で解析を実施した。
実施例1と同じ検体、PCR反応組成を用い、本発明の特徴である熱変性を段階的に下げるサイクルにて検出を行った。反応サイクルは本発明の熱変性温度を段階的に下げるサイクル(94℃ 20秒、94℃ 2秒−55℃ 5秒−68℃ 5秒 5サイクル、87℃ 2秒−55℃ 5秒−68℃ 5秒 35サイクル、融解曲線解析 0.5℃/Step)にて解析を実施した。
実施例1と同じPCR組成を用い、低温熱変性サイクルにて検出を行った。検体は、サルモネラ菌、腸管出血性大腸菌、赤痢菌のゲノムDNAと、検体の代わりに水を用いたものを対象として行った。反応サイクルは87℃ 20秒、94℃ 2秒−55℃ 5秒−68℃ 5秒 40サイクル、融解曲線解析 0.5℃/Stepにて解析を実施した。
Claims (10)
- PCRにより核酸を増幅する工程において、異なる熱変性温度を含む3種類以上の熱サイクルを有し、かつ、核酸増幅工程における後の熱サイクルの熱変性温度が、先の熱サイクルの熱変性温度と同じ温度であるか又は低い温度であることを特徴とする核酸増幅方法。
- 少なくとも以下の工程(a)及び(b)を含み、かつ、工程(a)及び(b)を併せた熱サイクル数が30回から50回であることを特徴とする請求項1に記載の核酸増幅方法。
(a)90℃から100℃の間の変性温度を含む熱サイクルを少なくとも5回以上繰り返す工程
(b)工程(a)に続く熱サイクルであって、工程(a)の熱変性温度より2℃から10℃低い熱変性温度を含む熱サイクルを5回以上繰り返す工程 - 以下の工程(c)をさらに含み、かつ、工程(a)、(b)及び(c)を併せた熱サイクル数が30回から50回であることを特徴とする請求項2に記載の核酸増幅方法。
(c)工程(b)に続く熱サイクルであって、工程(b)の熱変性温度より1℃以上低い熱変性温度を含む熱サイクルを5回以上繰り返す工程 - 最も高い熱変性温度と最も低い熱変性温度との差が5℃から10℃となる熱サイクルを有することを特徴とする請求項1から3のいずれかに記載の核酸増幅方法。
- 全熱サイクル数が35回から45回であることを特徴とする請求項1から4のいずれかに記載の核酸増幅方法。
- 核酸増幅方法がマルチプレックスPCRである請求項1から5のいずれかに記載の核酸増幅法。
- 核酸増幅の試料が生体由来である請求項1から6のいずれかに記載の核酸増幅法。
- 核酸増幅の試料が核酸抽出を行うことなく得られた試料である請求項7に記載の核酸増幅法。
- 試料が便検体である請求項7又は8に記載の核酸増幅法。
- サルモネラ菌、腸管出血性大腸菌、赤痢菌からなる群より選択される少なくとも1つの細菌が保有する遺伝子を標的核酸とする請求項1から9のいずれかに記載の核酸増幅法。
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