JP6990921B2 - How to induce upper motor neurons - Google Patents

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関連出願Related application

本出願は、２０１６年３月１５日付け出願の日本国特許出願２０１６－５０４７７号の優先権を主張しており、ここに折り込まれるものである。 This application claims the priority of Japanese Patent Application No. 2016-50477 filed on March 15, 2016 and is incorporated therein.

本発明は、多能性幹細胞から上位運動ニューロンを製造する方法に関する。本発明はまた、上位運動ニューロンに変換可能な多能性幹細胞に関する。 The present invention relates to a method for producing upper motor neurons from pluripotent stem cells. The present invention also relates to pluripotent stem cells that can be transformed into upper motor neurons.

一般に、疾患研究は細胞モデルが確立すると加速される。適用できる解析手法が大幅に増え、治療薬のスクリーニング速度も飛躍的に上昇するからである。特に、疾患の原因となる細胞が体内から非侵襲的な方法では採取できない細胞、及び／又は***能のない細胞である場合には、疾患の細胞モデルを得ることの意義は非常に大きい。
ニューロンはそのような細胞の代表であり、特定のニューロンが変性することで発症する神経変性疾患は、細胞モデルの恩恵が特に大きい疾患と考えられている。なかでも、アルツハイマー型認知症、パーキンソン症、及び筋萎縮性側索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis;ALS）は、社会の高齢化とともに患者数が急増しており、研究の加速化が切望されている。In general, disease research is accelerated once a cell model is established. This is because the number of applicable analysis methods will increase significantly, and the screening speed of therapeutic drugs will increase dramatically. In particular, when the cells causing the disease are cells that cannot be collected from the body by a non-invasive method and / or cells that are incapable of dividing, it is very significant to obtain a cell model of the disease.
Neurons are representative of such cells, and neurodegenerative diseases caused by the degeneration of specific neurons are considered to be particularly beneficial to cell models. Among them, Alzheimer-type dementia, Parkinson's disease, and amyotrophic lateral sclerosis (ALS) are rapidly increasing in the number of patients with the aging of society, and acceleration of research is eagerly desired. ..

これらの疾患の細胞モデル作製に近年大きく貢献しているのが、多能性幹細胞又は体細胞を目的の細胞に分化誘導するDirected differentiation法である。ニューロンを生じるDirected differentiation法には、多能性幹細胞をモルフォゲン（morphogen）等の外的シグナルに晒すことでニューロンへ分化誘導する方法と、多能性幹細胞又は体細胞に特定の遺伝子を導入して発現させることでニューロンへ分化誘導する方法が知られている（非特許文献１）。 In recent years, a major contribution to the creation of cell models for these diseases is the Directed differentiation method, which induces differentiation of pluripotent stem cells or somatic cells into target cells. The Directed differentiation method that produces neurons includes a method of inducing differentiation of pluripotent stem cells into neurons by exposing them to external signals such as morphogen, and a method of introducing a specific gene into pluripotent stem cells or somatic cells. A method of inducing differentiation into neurons by expressing it is known (Non-Patent Document 1).

外的シグナルによって分化誘導する方法は、多能性幹細胞を胎生期の神経発生と似た環境に置くことで、神経分化を担う遺伝子発現を誘導する方法である。胎生期の神経発生では、発生の進行と伴に変化し続ける外的環境からのフィードバック（外的シグナル）を受けながら様々な転写因子が連続的に発現することで、神経系を構成する多種多様な細胞が産生される。そのため、この方法では特定の種類のニューロンのみを分化誘導することは難しく、通常さまざまなサブタイプのニューロンを含むヘテロな細胞集団が得られる。また、機能的に成熟したニューロンを得るには、発生期と同様に数カ月という長い時間を要する（例として、非特許文献２）。 The method of inducing differentiation by an external signal is a method of inducing gene expression responsible for neural differentiation by placing pluripotent stem cells in an environment similar to embryonic neurogenesis. In embryonic neurogenesis, various transcription factors are continuously expressed while receiving feedback (external signals) from the external environment that continues to change as the development progresses, resulting in a wide variety of nervous system constituents. Cells are produced. Therefore, it is difficult to induce differentiation of only a specific type of neuron by this method, and a heterogeneous cell population containing various subtypes of neurons is usually obtained. In addition, it takes a long time of several months to obtain a functionally mature neuron as in the developmental stage (for example, Non-Patent Document 2).

これに対し、特定の遺伝子発現によって分化誘導する方法（前記外的シグナルによる方法と区別するために、Neuronal induction法と呼ばれる場合がある）は、主に特定の転写因子を発現させることで、神経分化を担う遺伝子発現プログラムの一部を強制的に実行させる方法である。そのため、この方法では分化の方向性を制御できる可能性が考えられるが、該方法を用いて目的の種類のニューロンを優先的に分化誘導できた例は非常に少ない。多能性幹細胞における遺伝子発現の効果は、従来法で得られた知見から予測することが困難だからである。なお、この方法では一般に分化に要する時間が短縮されて、数日から数週間で成熟したニューロンが得られる。 On the other hand, the method of inducing differentiation by expressing a specific gene (sometimes called the Neuronal induction method to distinguish it from the method using the external signal) is mainly by expressing a specific transcription factor. This is a method for forcibly executing a part of the gene expression program responsible for differentiation. Therefore, it is possible that this method can control the direction of differentiation, but there are very few cases in which the target type of neuron can be preferentially induced to differentiate using this method. This is because it is difficult to predict the effect of gene expression on pluripotent stem cells from the findings obtained by conventional methods. It should be noted that this method generally shortens the time required for differentiation, and mature neurons can be obtained in a few days to a few weeks.

Neuronal induction法によって目的のニューロンを分化誘導した貴重な成功例として、ヒト多能性幹細胞、ヒト及びマウスの線維芽細胞、及びマウスのアストロサイトにAscl1、Lmx1A、及びNurr1遺伝子を導入し発現させることで、約2-3週間で中脳黒質のドーパミン作動性ニューロンを分化誘導した例が報告されている（例として、非特許文献４、５）。中脳黒質のドーパミン作動性ニューロンはパーキンソン症で選択的に障害されるニューロンであり、当該方法を用いてパーキンソン症の細胞モデルが得られることが期待されている。 As a valuable successful example of inducing differentiation of target neurons by the Neuronal induction method, the Ascl1, Lmx1A, and Nurr1 genes are introduced and expressed in human pluripotent stem cells, human and mouse fibroblasts, and mouse astrocytes. An example of inducing differentiation of dopaminergic neurons in the substantia nigra of the midbrain in about 2-3 weeks has been reported (for example, Non-Patent Documents 4 and 5). Dopaminergic neurons in the substantia nigra of the midbrain are neurons that are selectively impaired in Parkinson's disease, and it is expected that a cellular model of Parkinson's disease can be obtained using this method.

また、ヒト及びマウスの多能性幹細胞にNgn2遺伝子を導入し発現させると、90％以上の細胞が大脳皮質のグルタミン酸作動性ニューロン（さらに詳しくは、皮質第2層及び3層の錐体細胞）に約1-2週間で分化することが報告されている（非特許文献３、特許文献１）。大脳皮質のグルタミン酸作動性ニューロンは、アルツハイマー型認知症において広域に障害されるニューロンである。当該方法を用いて家族性患者由来人工多能性幹細胞から作製されたニューロンは、該患者のAβプロセシング異常を再現し得ることから（特許文献１）、アルツハイマー型認知症の細胞モデルとして期待されている。 In addition, when the Ngn2 gene is introduced and expressed in human and mouse pluripotent stem cells, more than 90% of the cells are glutamate-operated neurons in the cerebral cortex (more specifically, pyramidal cells in the second and third layers of the cortex). It has been reported that differentiation occurs in about 1-2 weeks (Non-Patent Document 3, Patent Document 1). Glutamic acid-operated neurons in the cerebral cortex are widely impaired neurons in Alzheimer's disease. Neurons prepared from induced pluripotent stem cells derived from familial patients using this method can reproduce Aβ processing abnormalities in the patients (Patent Document 1), and are therefore expected as a cell model for Alzheimer-type dementia. There is.

そして、ALSについても、Neuronal induction法を用いて細胞モデルを作製する試みが行われている。ALSは、大脳皮質運動野の第5層に存在する上位運動ニューロンと、脊髄に存在する下位運動ニューロンが選択的に変性する疾患である。前記上位運動ニューロンは、下位運動ニューロン、又は、橋及び延髄の神経核に投射しており、下位運動ニューロンに投射する経路（皮質脊髄路）が四肢の随意運動を制御し、橋及び延髄に投射する経路（皮質延髄路）が嚥下と舌の動き等を制御している。上位・下位いずれの運動ニューロンが先に変性するかは患者によって異なるが、一方から始まった変性は他方へと伝播するため、最終的に両経路が侵されて患者は死に至る（非特許文献６）。 As for ALS, attempts are being made to create a cell model using the Neuronal induction method. ALS is a disease in which upper motor neurons in the fifth layer of the motor area of the cerebral cortex and lower motor neurons in the spinal cord are selectively degenerated. The upper motor neurons project to the lower motor neurons or the nerve nuclei of the pons and medulla oblongata, and the pathways projecting to the lower motor neurons (corticospinal tract) control the voluntary movements of the limbs and project to the pons and medulla oblongata. The route (corticobulbar tract) controls swallowing and tongue movement. Whether the upper or lower motor neuron degenerates first depends on the patient, but since the degeneration that started from one propagates to the other, both pathways are finally affected and the patient dies (Non-Patent Document 6). ).

これまで、下位運動ニューロンについては、マウス及びヒト多能性幹細胞にLhx3、Ngn2、及びIsl1の3遺伝子を（特許文献１）、マウスの線維芽細胞にAscl1、Brn2、Myt1l、Lhx3、Hb9、Isl1、Ngn2の7遺伝子を、ヒト線維芽細胞に前記7遺伝子にNeuroD1を加えた8遺伝子を導入して発現させることで（非特許文献７）、約1-3週間で作製できることが報告されている。
しかしながら、上位運動ニューロンを分化誘導する方法はまだ知られていない。Neuronal induction法に限らず、外的シグナルを用いた分化誘導法においても、成熟した上位運動ニューロンが分化誘導できた例は報告されていない。So far, for lower motor neurons, the three genes Lhx3, Ngn2, and Isl1 have been used for mouse and human pluripotent stem cells (Patent Document 1), and Ascl1, Brn2, Myt1l, Lhx3, Hb9, and Isl1 have been used for mouse fibroblasts. , It has been reported that 7 genes of Ngn2 can be produced in about 1-3 weeks by introducing and expressing 8 genes in which NeuroD1 is added to the above 7 genes into human fibroblasts (Non-Patent Document 7). ..
However, a method for inducing differentiation of upper motor neurons is not yet known. Not only the Neuronal induction method but also the differentiation induction method using an external signal has not been reported to be able to induce differentiation of mature upper motor neurons.

よって、ALSの病態を真に理解し有効な治療法を開発するために、in vitroで上位運動ニューロンを分化誘導する方法が求められていた。 Therefore, in order to truly understand the pathophysiology of ALS and develop an effective treatment method, a method for inducing differentiation of upper motor neurons in vitro has been sought.

WO2014/148646WO2014 / 148646

Ho S.-M., et al, Biomarker Insight, 10(S1):31-41, 2015Ho S.-M., et al, Biomarker Insight, 10 (S1): 31-41, 2015 Mariani J., et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 109:12770-12775, 2012Mariani J., et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 109: 12770-12775, 2012 Zhang Y., et al, Neuron, 78:785-798, 2013Zhang Y., et al, Neuron, 78: 785-798, 2013 Caiazzo M., et al, Nature, 476:224-227, 2011Caiazzo M., et al, Nature, 476: 224-227, 2011 Theka I., et al, Stem Cell Trans. Med., 2:473-479, 2013Theka I., et al, Stem Cell Trans. Med., 2: 473-479, 2013 Gordon P.H., Aging Dis., 4:295-310, 2013Gordon P.H., Aging Dis., 4: 295-310, 2013 Son E.Y., et al, Cell Stem Cell, 9:205-218, 2011Son E.Y., et al, Cell Stem Cell, 9: 205-218, 2011 Bertrand N., et al, Nature Rev. Neurosci., 3:517-530, 2002Bertrand N., et al, Nature Rev. Neurosci., 3: 517-530, 2002 Arlotta P., et al, Neuron, 45:207-221, 2005Arlotta P., et al, Neuron, 45: 207-221, 2005 Woodworth M.B., et al, Cell, 151:918-918.e1, 2012Woodworth M.B., et al, Cell, 151: 918-918.e1, 2012 Chanda S., et al, Stem Cell Reports, 3:282-296, 2014Chanda S., et al, Stem Cell Reports, 3:282-296, 2014 Egawa N., et al, Science Translational Medicine, 4:145ra104, 2012Egawa N., et al, Science Translational Medicine, 4: 145ra104, 2012 Vierbuchen T., et al, Nature, 463:1035-1041, 2010Vierbuchen T., et al, Nature, 463: 1035-1041, 2010 Pang Z.P., et al, Nature, 476:220-223, 2011Pang Z.P., et al, Nature, 476: 220-223, 2011 Yoo A.S., et al, Nature, 476:228-231, 2011Yoo A.S., et al, Nature, 476: 228-231, 2011

本発明は、上記従来技術が抱える事情を鑑みてなされたものであり、多能性幹細胞から上位運動ニューロンを製造する方法の提供を目的とする。さらに、本発明は、上位運動ニューロンに変換可能な多能性幹細胞の提供を目的とする。 The present invention has been made in view of the circumstances of the above-mentioned prior art, and an object of the present invention is to provide a method for producing an upper motor neuron from pluripotent stem cells. Furthermore, it is an object of the present invention to provide pluripotent stem cells that can be converted into upper motor neurons.

本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、ヒト由来人工多能性幹細胞にNgn2及びFezl遺伝子を導入して発現させると、約80%の細胞が3週間後には機能的な錐体細胞に分化することを見出した。そして、当該錐体細胞の約20％の細胞は、大脳皮質第5層と運動野のマーカー遺伝子を発現し、培養下で下位運動ニューロンに投射してシナプスを形成できること、すなわち、機能的な上位運動ニューロンであることを明らかにした。
さらに、家族性ALS患者由来人工多能性幹細胞から上記方法により製造した上位運動ニューロンは、ALSに特徴的な病的性質（TDP-43タンパクの細胞内凝集等）を自発的に生じることが見出された。
これらの知見に基づいて、本発明を完成するに至った。As a result of diligent studies to solve the above problems, the present inventors introduced and expressed the Ngn2 and Fezl genes in human-derived induced pluripotent stem cells, and about 80% of the cells were functional after 3 weeks. It was found that it differentiates into various pyramidal cells. Approximately 20% of the pyramidal cells express the marker genes in the 5th layer of the cerebral cortex and the motor cortex, and can project to lower motor neurons in culture to form synapses, that is, functional upper motor neurons. It was revealed that it is a motor neuron.
Furthermore, it was found that upper motor neurons produced from induced pluripotent stem cells derived from familial ALS patients spontaneously develop pathological properties characteristic of ALS (such as intracellular aggregation of TDP-43 protein). It was issued.
Based on these findings, the present invention has been completed.

すなわち、本発明は、以下を包含する。
[１] 多能性幹細胞に外来性のNgn2及びFezlを発現させて培養する工程を含む、多能性幹細胞から錐体細胞を製造する方法。
[２] 前記外来性のNgn2及びFezlを薬剤応答性プロモーターで発現させる、前記[１]に記載の方法。
[３] 前記外来性のNgn2及びFezlを2A配列を用いてポリシストロニックに発現させる、前記[１]又は[２]に記載の方法。
[４] 前記培養期間が21日間以上である、前記[１]－[３]のいずれかに記載の方法。
[５] 前記錐体細胞が上位運動ニューロンである、前記[１]－[４]のいずれかに記載の方法。
[６] Ngn2をコードする外来性核酸及びFezlをコードする外来性核酸を染色体内に含む多能性幹細胞。
[７] 前記Ngn2をコードする外来性核酸及びFezlをコードする外来性核酸が、薬剤応答性プロモーターに機能的に接合された核酸である、前記[６]に記載の多能性幹細胞。
[８] 前記Ngn2をコードする外来性核酸及びFezlをコードする外来性核酸が、2A配列を介して連結されている、前記[６]又は[７]に記載の多能性幹細胞。
[９] 前記多能性幹細胞が、ヒト由来人工多能性幹細胞である、前記[６]－[８]のいずれかに記載の多能性幹細胞。
[１０] 前記ヒトが、筋萎縮性側索硬化症患者である、前記[９]に記載のヒト由来人工多能性幹細胞。
[１１] 前記[５]に記載された方法で製造された上位運動ニューロンをシナプス前細胞、下位運動ニューロンをシナプス後細胞とするシナプス結合を含む培養物。
[１２] 前記下位運動ニューロンが、多能性幹細胞から製造された下位運動ニューロンである、前記[１１]に記載の培養物。
[１３] 前記下位運動ニューロンが、多能性幹細胞に外来性のLhx3、Ngn2、及びIsl1を発現させて製造された下位運動ニューロンである、前記[１２]に記載の培養物。
[１４] 下記工程を含む、筋萎縮性側索硬化症の予防又は治療薬のスクリーニング方法；
（１）家族性ALS患者由来人工多能性幹細胞に外来性のNgn2及びFezlを発現させて培養して、該多能性幹細胞から上位運動ニューロンを製造する工程、
（２）（１）で得られた上位運動ニューロンを、被験物質と接触させる工程、
（３）（２）で被験物質と接触させた上位運動ニューロン、及び接触させなかった上位運動ニューロン（すなわち、対照細胞）を培養し、神経突起長、凝集化したTDP-43タンパク量、又はGPR50の発現量を測定する工程、
（４）前記被験物質と接触させた上位運動ニューロンの神経突起長もしくはGPR50の発現量が対照細胞の該値よりも高値である被験物質、又は、前記被験物質と接触させた上位運動ニューロンにおける凝集化したTDP-43タンパク量が対照細胞の該値よりも低値である被験物質を、筋萎縮性側索硬化症の予防又は治療薬として選択する工程。That is, the present invention includes the following.
[1] A method for producing pyramidal cells from pluripotent stem cells, which comprises a step of expressing and culturing exogenous Ngn2 and Fezl in pluripotent stem cells.
[2] The method according to the above [1], wherein the exogenous Ngn2 and Fezl are expressed by a drug-responsive promoter.
[3] The method according to the above [1] or [2], wherein the exogenous Ngn2 and Fezl are polycistronically expressed using a 2A sequence.
[4] The method according to any one of [1]-[3] above, wherein the culture period is 21 days or more.
[5] The method according to any one of [1]-[4] above, wherein the pyramidal cell is an upper motor neuron.
[6] Pluripotent stem cells containing an exogenous nucleic acid encoding Ngn2 and an exogenous nucleic acid encoding Fezl in the chromosome.
[7] The pluripotent stem cell according to the above [6], wherein the exogenous nucleic acid encoding Ngn2 and the exogenous nucleic acid encoding Fezl are nucleic acids functionally conjugated to a drug-responsive promoter.
[8] The pluripotent stem cell according to the above [6] or [7], wherein the exogenous nucleic acid encoding Ngn2 and the exogenous nucleic acid encoding Fezl are linked via a 2A sequence.
[9] The pluripotent stem cell according to any one of [6]-[8] above, wherein the pluripotent stem cell is a human-derived induced pluripotent stem cell.
[10] The human-derived induced pluripotent stem cell according to the above [9], wherein the human is a patient with amyotrophic lateral sclerosis.
[11] A culture containing synaptic connections, wherein the upper motor neuron is a presynaptic cell and the lower motor neuron is a postsynaptic cell produced by the method described in [5] above.
[12] The culture according to [11] above, wherein the lower motor neuron is a lower motor neuron produced from pluripotent stem cells.
[13] The culture according to [12] above, wherein the lower motor neuron is a lower motor neuron produced by expressing exogenous Lhx3, Ngn2, and Isl1 in pluripotent stem cells.
[14] A method for screening a preventive or therapeutic agent for amyotrophic lateral sclerosis, which comprises the following steps;
(1) A step of expressing exotic Ngn2 and Fezl in induced pluripotent stem cells derived from familial ALS patients and culturing them to produce upper motor neurons from the pluripotent stem cells.
(2) The step of bringing the upper motor neuron obtained in (1) into contact with the test substance,
(3) The upper motor neurons that were contacted with the test substance in (2) and the upper motor neurons that were not contacted (that is, control cells) were cultured, and the neurite length, aggregated TDP-43 protein amount, or GPR50. Step of measuring the expression level of
(4) Aggregation in the test substance in which the nerve protrusion length of the upper motor neuron in contact with the test substance or the expression level of GPR50 is higher than the value in the control cell, or in the upper motor neuron in contact with the test substance. A step of selecting a test substance having a TDP-43 protein amount lower than that of a control cell as a prophylactic or therapeutic agent for amyotrophic lateral sclerosis.

本発明により、多能性幹細胞から上位運動ニューロンを製造する方法と、上位運動ニューロンに変換可能な多能性幹細胞が提供される。さらに、本発明により、ALSの上位運動ニューロンモデルと皮質脊髄路モデルが提供される。 The present invention provides a method for producing upper motor neurons from pluripotent stem cells and pluripotent stem cells that can be converted into upper motor neurons. Further, the present invention provides an upper motor neuron model and a corticospinal tract model of ALS.

下記図面において、“DOX＋”は後述するDOX含有培地で培養された細胞、“DOX－”はDOX不含培地で培養された細胞を表す。また、図中の“Tuj1”は、抗β-III tubulin抗体であるTuj1抗体を用いて免疫染色したことを表す。 In the drawings below, "DOX +" represents cells cultured in a DOX-containing medium described later, and "DOX-" represents cells cultured in a DOX-free medium. In addition, "Tuj1" in the figure indicates that immunostaining was performed using the Tuj1 antibody, which is an anti-β-III tubulin antibody.

マウスES細胞株（KH2株）、及び、テトラサイクリン応答性プロモーターに制御される外来性Brn2、Ascl1、及びMyt1l遺伝子を染色体内に有するKH2株（BAM安定導入株；Clone 1、2）に対し、DOX含有／不含培地で培養して72時間後に、β-III tubulin免疫染色とDAPI染色を行った蛍光顕微鏡イメージである。DOX for mouse ES cell line (KH2 line) and KH2 line (BAM stable introduction line; Clone 1, 2) having exogenous Brn2, Ascl1 and Myt1l genes regulated by tetracycline-responsive promoter in the chromosome. It is a fluorescence microscope image which performed β-III tubulin immunostaining and DAPI staining 72 hours after culturing in the containing / non-containing medium. 図２A:テトラサイクリン応答性プロモーターに制御される外来性Ngn2及びFezl遺伝子を染色体内に有する201B7（NF安定導入株）に対し、DOX含有培地で培養後7日目に、β-III tubulinとhNucに対する二重免疫染色を行った蛍光顕微鏡イメージである。図２B：解析方法を説明する工程表である。図２C：DOX含有培地で培養後7日目のNF安定導入株に対してβ-III tubulin・CaMKII二重免疫染色とDAPI染色（図２C）を行い、同視野において、β-III tubulin免疫染色とDAPI染色のシグナル（左パネル）、CaMKII免疫染色とDAPI染色のシグナル（図２C、中央パネル）、β-III tubulin・CaMKII二重免疫染色とDAPI染色のシグナル（図２C、右パネル）をそれぞれマージした蛍光顕微鏡イメージである。図２D：テトラサイクリン応答性プロモーターに制御される外来性Fezl遺伝子を染色体に有する201B7株（F安定導入株）に対し、DOX含有培地で培養後7日目にDAPI染色（青色）を行い、mCherryの蛍光（赤色）とマージさせた蛍光顕微鏡イメージである。FIG. 2A: For 201B7 (NF stable introduction strain) having exogenous Ngn2 and Fezl genes regulated by the tetracycline-responsive promoter in the chromosome, against β-III tubulin and hNuc on the 7th day after culturing in a DOX-containing medium. It is a fluorescence microscope image which performed double immunostaining. FIG. 2B: A process chart illustrating an analysis method. Fig. 2C: β-III tubulin / CaMKII double immunostaining and DAPI staining (Fig. 2C) were performed on the NF stable-introduced strain 7 days after culturing in a DOX-containing medium, and β-III tubulin immunostaining was performed in the same field. And DAPI staining signal (left panel), CaMKII immunostaining and DAPI staining signals (Fig. 2C, center panel), β-III tubulin / CaMKII double immunostaining and DAPI staining signals (Fig. 2C, right panel), respectively. It is a merged fluorescence microscope image. Figure 2D: 201B7 strain (F stable introduction strain) having an exogenous Fezl gene regulated by a tetracycline-responsive promoter on its chromosome was stained with DAPI (blue) on the 7th day after culturing in a DOX-containing medium, and mCherry. It is a fluorescence microscope image merged with fluorescence (red). NF安定導入株から分化した上位運動ニューロンに対し、分化誘導から7日目（図３A）、及び21日目（図３B）に、全細胞パッチクランプ法を用いてカレントインジェクション後に測定されたNa／K電流（Na／K currents）、活動電位（Action potentials）、及び、シナプス後電流（Postsynaptic currents）を示す。Na / measured after current injection using the whole cell patch clamp method on the 7th day (Fig. 3A) and 21st day (Fig. 3B) from the induction of differentiation of the upper motor neurons differentiated from the NF stable introduction strain. K currents (Na / K currents), action potentials, and postsynaptic currents (Postsynaptic currents) are shown. NF安定導入株から分化誘導後7日目のニューロン（DOX＋）に対し、大脳皮質第5層のマーカー遺伝子（Ctip2、TLE4、ER81、Sox5）、運動野のマーカー遺伝子（Crim1、Diap3、Igfbp4）、前頭葉のマーカー遺伝子（Robo1、PCDH17）、及び錐体細胞のマーカー遺伝子（OTX1、CaMKII）の発現をreal-time PCR法を用いて解析した結果を表す。Marker genes for the 5th layer of the cerebral cortex (Ctip2, TLE4, ER81, Sox5), marker genes for the motor field (Crim1, Diap3, Igfbp4), for neurons (DOX +) on the 7th day after induction of differentiation from the NF stable introduction strain. The results of analysis of the expression of the frontal lobe marker gene (Robo1, PCDH17) and the pyramidal cell marker gene (OTX1, CaMKII) using the real-time PCR method are shown. NF安定導入株から分化誘導後21日目のニューロン（DOX＋）に対し、Crim1及びCaMKIIの発現量をreal-time PCR法を用いて解析した結果（図５A）、Crim1・β-III tubulin二重免疫染色とDAPI染色（図５B、左パネル）、及び、CaMKII・β-III tubulin二重免疫染色とDAPI染色（図５B、右パネル）を行った結果を表す。Results of analysis of Crim1 and CaMKII expression levels in neurons (DOX +) 21 days after induction of differentiation from NF stable-introduced strains using real-time PCR (Fig. 5A), Crim1 and β-III tubulin double The results of immunostaining and DAPI staining (Fig. 5B, left panel) and CaMKII / β-III tubulin double immunostaining and DAPI staining (Fig. 5B, right panel) are shown. 図６A：上位運動ニューロン（緑色）が下位運動ニューロン（赤色）に投射して形成されるシナプス構造の模式図である。図６B、C：NF安定導入株から分化した上位運動ニューロン（GFPを発現）が、LNI安定導入株から分化した下位運動ニューロン（TdTOMATOを発現）に投射し、シナプスを形成していることを示す蛍光顕微鏡イメージである。分化誘導から14日目にvGLT1に対する免疫染色を行い、同視野についてのTOMATO／EGFP／vGLT1の三重イメージ（図６B、Cの左パネル）、TOMATO／vGLT1二重イメージ（図６Bの右パネル及び図６Cの中央パネル）を表す。図６Cの右パネルは図６C左パネル中で四角で囲んだ領域の拡大図である。図中のバーは10μmを表す。FIG. 6A: FIG. 6A is a schematic diagram of a synaptic structure formed by projecting an upper motor neuron (green) onto a lower motor neuron (red). FIG. 6B, C: Upper motor neurons differentiated from the NF stable introduction strain (expressing GFP) project to lower motor neurons (expressing TdTOMATO) differentiated from the LNI stable introduction strain to form synapses. It is a fluorescence microscope image. Immunostaining for vGLT1 was performed on the 14th day after the induction of differentiation, and a triple image of TOMATO / EGFP / vGLT1 (left panel of FIGS. 6B and C) and a double image of TOMATO / vGLT1 (right panel and figure of FIG. 6B) for the same visual field were performed. 6C center panel). The right panel of FIG. 6C is an enlarged view of the area surrounded by a square in the left panel of FIG. 6C. The bar in the figure represents 10 μm. 家族性ALS患者由来iPS細胞株から外来性Ngn2及びFezlの発現により分化したニューロンに対し、TDP-43・SMI-32で二重免疫染色（図７A）、TDP-43・SMI-32二重免疫染色とDAPI染色（図７B）を行った蛍光顕微鏡イメージを表す。Double immunostaining with TDP-43 / SMI-32 (Fig. 7A) and TDP-43 / SMI-32 double immunostaining against neurons differentiated by the expression of exogenous Ngn2 and Fezl from iPS cell lines derived from familial ALS patients. Represents a fluorescence microscope image with staining and DAPI staining (FIG. 7B). 家族性ALS患者由来iPS細胞株から分化した上位運動ニューロンの神経突起の伸展を観察した蛍光顕微鏡イメージである。右パネル中の矢印は、伸長停止した神経突起を表す。It is a fluorescence microscope image which observed the extension of the neurite of the upper motor neuron differentiated from the iPS cell line derived from the familial ALS patient. The arrows in the right panel represent neurites that have stopped stretching. 家族性ALS患者由来iPS細胞株から分化した上位運動ニューロン（ALS-UMN：赤丸）、及び201B7 NF安定発現株から分化した上位運動ニューロン（Control-UMN：水色丸）に対し、シングルセルRNA-sequencing法を行いてGPR50の発現量を解析した結果を表す。Single-cell RNA-sequencing for upper motor neurons (ALS-UMN: red circles) differentiated from familial ALS patient-derived iPS cell lines and upper motor neurons (Control-UMN: light blue circles) differentiated from 201B7 NF stable expression strains The result of analyzing the expression level of GPR50 by the method is shown.

以下に、本発明の好適な実施形態について詳述する。
本明細書では、遺伝子から生じる転写物のヌクレオチド配列（NM_～）、及びタンパクのアミノ酸配列（NP_～）の情報として、NCBI(National Center for Biotechnology Information)データベースに登録されている標準配列（Reference Sequence）のIDを記載する。複数の標準配列が登録されているものについても一配列のみを記載するが、当該記載は例示であり、記載された配列への限定を意味するものではない。なお、本明細書では特に断りがない限り、遺伝子のOfficial symbol及びIDはヒト遺伝子のものを表す。Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in detail.
In the present specification, the standard sequence (Reference Sequence) registered in the NCBI (National Center for Biotechnology Information) database is used as information on the nucleotide sequence (NM_ ~) of the transcript generated from the gene and the amino acid sequence (NP_ ~) of the protein. ) ID. Only one sequence is described for those in which a plurality of standard sequences are registered, but the description is an example and does not mean limitation to the described sequence. Unless otherwise specified in the present specification, the official symbol and ID of a gene represent those of a human gene.

１．上位運動ニューロンを含む錐体細胞の製造方法
本発明により、多能性幹細胞に外来性のNgn2及びFezlを発現させて培養することで、多能性幹細胞から上位運動ニューロンを含む錐体細胞を製造する方法が提供される。当該方法では、約80%という高効率で多能性幹細胞を錐体細胞へと分化させることができ、そのうちの約20％が上位運動ニューロンである。1. 1. Method for Producing Upper Motor Neuron-Containing Pyramid Cells According to the present invention, pluripotent stem cells are cultured by expressing exogenous Ngn2 and Fezl to produce upper motor neuron-containing pyramidal cells from pluripotent stem cells. A way to do it is provided. With this method, pluripotent stem cells can be differentiated into pyramidal cells with a high efficiency of about 80%, of which about 20% are upper motor neurons.

＜外来性のNgn2及びFezl＞
本発明においてNgn2とは、Ngn2（Official symbol:NEUROG2、Official full name:neurogenin 2）遺伝子及びNgn2タンパクのことである。Ngn2タンパク（例として、ヒト：NP_076924、マウス：NP_033848）は、Activator-typeの塩基性helix-loop-helix型転写因子（bHLH因子）であり、神経幹細胞を神経細胞へと分化誘導するプロニューラル因子の一つである（非特許文献８）。
本発明においてFezlとは、Fezl（Official symbol:FEZF2、Official full name:FEZ family zinc finger 2）遺伝子及びFezlタンパクのことである。Fezlタンパク（例として、ヒト：NP_060478、マウス：NP_536681）は、zinc finger型転写因子であり、大脳皮質第5層及び6層に細胞体が存在し、皮質外に投射する錐体細胞（subcerebral projection neuron）の細部系譜で特異的に発現することが知られている（非特許文献９、１０）。<Exotic Ngn2 and Fezl>
In the present invention, Ngn2 refers to the Ngn2 (Official symbol: NEUROG2, Official full name: neurogenin 2) gene and the Ngn2 protein. The Ngn2 protein (eg, human: NP_076924, mouse: NP_033848) is an Activator-type basic helix-loop-helix transcription factor (bHLH factor), a pronerve factor that induces the differentiation of neural stem cells into neurons. (Non-Patent Document 8).
In the present invention, Fezl refers to a Fezl (Official symbol: FEZF2, Official full name: FEZ family zinc finger 2) gene and a Fezl protein. The Fezl protein (eg, human: NP_060478, mouse: NP_536681) is a zinc finger-type transcription factor with cell bodies in layers 5 and 6 of the cerebral cortex, and pyramidal cells that project outside the cortex (subcerebral projection). It is known that it is specifically expressed in the detailed genealogy of neuron) (Non-Patent Documents 9 and 10).

本発明において外来性のNgn2及びFezlとは、内在性のNgn2及びFezlではないことを意味する。よって、外来性のNgn2及びFezlの発現とは、外部から細胞内に導入された核酸（具体的には、Ngn2をコードする核酸及びFezlをコードする核酸）からNgn2及びFezlが発現すること、又は、外部から細胞内にNgn2タンパク及びFezlタンパクが導入されることを指す。 In the present invention, exogenous Ngn2 and Fezl mean that they are not endogenous Ngn2 and Fezl. Therefore, the expression of exogenous Ngn2 and Fezl means that Ngn2 and Fezl are expressed from nucleic acids introduced into cells from the outside (specifically, nucleic acids encoding Ngn2 and nucleic acids encoding Fezl), or , Refers to the introduction of Ngn2 protein and Fezl protein into cells from the outside.

前記Ngn2をコードする核酸としては、例えば、標準配列として登録されているNM_009718（マウス）、NM_024019（ヒト）、又はこれらの転写派生体（transcript variant）のヌクレオチド配列を有する核酸が挙げられる。また、前記標準配列及び転写派生体の配列を有する核酸に、ストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができる程度の相補性を有する核酸であってもよい。そして、Fezlをコードする核酸としては、例えば、標準配列として登録されているNM_080433（マウス）、NM_018008（ヒト）、又はこれらの転写派生体（transcript variant）のヌクレオチド配列を有するDNA等が挙げられる。また、前記標準配列及び転写派生体の配列を有する核酸に、ストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができる程度の相補性を有する核酸であってもよい。 Examples of the nucleic acid encoding Ngn2 include NM_009718 (mouse) and NM_024019 (human) registered as standard sequences, or nucleic acids having a nucleotide sequence of a transcription derivative thereof (transcript variant). Further, the nucleic acid may have complementarity to the extent that it can hybridize to the nucleic acid having the standard sequence and the sequence of the transcription derivative under stringent conditions. Examples of the nucleic acid encoding Fezl include NM_080433 (mouse) and NM_018008 (human) registered as standard sequences, or DNA having a nucleotide sequence of a transcription derivative thereof. Further, the nucleic acid may have complementarity to the extent that it can hybridize to the nucleic acid having the standard sequence and the sequence of the transcription derivative under stringent conditions.

前記ストリンジェントな条件は、Berger and Kimmel（1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol.152, Academic Press, San Diego CA）に教示されるように、複合体或いはプローブを結合する核酸の融解温度（Tm）に基づいて決定することができる。例えばハイブリダイズ後の洗浄条件として、通常「1×SSC、0.1％SDS、37℃」程度の条件を挙げることができる。相補鎖はかかる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダイズ状態を維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、より厳しいハイブリダイズ条件として「0.5×SSC、0.1％SDS、42℃」程度の洗浄条件、さらに厳しくは「0.1×SSC、0.1％SDS、65℃」程度の洗浄条件で洗浄しても正鎖と相補鎖とがハイブリダイズ状態を維持する条件を挙げることができる。具体的には、このような相補鎖として、対象の正鎖の塩基配列と完全に相補的な関係にある塩基配列からなる鎖、並びに該鎖と少なくとも90％、好ましくは95％以上、より好ましくは97％以上、いっそう好ましくは98％以上、特に好ましくは99％以上の同一性を有する塩基配列からなる鎖を例示することができる。 The stringent conditions are as taught by Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol.152, Academic Press, San Diego CA) to thaw the nucleic acid that binds the complex or probe. It can be determined based on temperature (Tm). For example, as cleaning conditions after hybridization, conditions of about "1 x SSC, 0.1% SDS, 37 ° C." can be mentioned. It is preferable that the complementary strand maintains a hybridized state with the positive strand of interest even when washed under such conditions. Although not particularly limited, cleaning is performed under stricter hybridization conditions of "0.5 x SSC, 0.1% SDS, 42 ° C", and more severely, cleaning conditions of "0.1 x SSC, 0.1% SDS, 65 ° C". However, the condition that the normal chain and the complementary chain maintain the hybridized state can be mentioned. Specifically, as such a complementary chain, a chain consisting of a base sequence having a completely complementary relationship with the base sequence of the positive chain of interest, and at least 90%, preferably 95% or more, more preferably the chain. Can exemplify a chain consisting of a base sequence having 97% or more, more preferably 98% or more, particularly preferably 99% or more identity.

前記Ngn2をコードする核酸及びFezlをコードする核酸は、一本鎖及び二本鎖のいずれでもよく、DNA及びRNAのいずれでも良い。また、DNA/RNAキメラ、DNA-RNAハイブリットであってもよい。このうち、好ましくは二本鎖DNA、又は一本鎖RNAである。 The nucleic acid encoding Ngn2 and the nucleic acid encoding Fezl may be either single-stranded or double-stranded, and may be either DNA or RNA. Further, it may be a DNA / RNA chimera or a DNA-RNA hybrid. Of these, double-stranded DNA or single-stranded RNA is preferable.

前記Ngn2をコードする核酸及びFezlをコードする核酸は、Ngn2及びFezlを発現させるための制御配列を含むことができ、当該制御配列としては、例えば、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイト等の配列が挙げられる。また、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子(例えば、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など）、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子などの選択マーカー配列、及び、蛍光タンパク質、βグルクロニダーゼ(GUS)、FLAGなどのレポーター遺伝子配列等を含んでいてもよい。 The nucleic acid encoding Ngn2 and the nucleic acid encoding Fezl can contain a control sequence for expressing Ngn2 and Fezl, and the control sequence includes, for example, a promoter, an enhancer, a ribosome binding sequence, a terminator, and polyadenylation. An arrangement of sites and the like can be mentioned. Also, if necessary, selectable marker sequences such as drug resistance genes (eg, canamycin resistance gene, ampicillin resistance gene, puromycin resistance gene, etc.), thymidine kinase gene, diphtheriatoxin gene, etc., and fluorescent protein, β-glucuronidase (GUS). ), FLAG and other reporter gene sequences may be included.

前記Ngn2をコードする核酸及びFezlをコードする核酸は、Ngn2及びFezlがポリシストロニックに発現するように、IRES又は2Aコード配列（以降、2A配列と略記する）を介して機能的に連結されていてもよい。特に、2A配列を用いて連結された場合には、当該2種類のタンパクの同時且つ等モル発現が可能となるため（Nat. Biotech., 5, 589-594, 2004）、本発明において特に好ましい。当該2A配列はいずれのウイルス由来のものを用いてもよいが、好適には口蹄病ウイルス（FMDV）の2A配列である（J. General Virology, 89, 1036-1042, 2008）。 The nucleic acid encoding Ngn2 and the nucleic acid encoding Fezl are functionally linked via an IRES or a 2A coding sequence (hereinafter abbreviated as 2A sequence) so that Ngn2 and Fezl are expressed polycistronically. You may. In particular, when linked using a 2A sequence, simultaneous and equimolar expression of the two proteins is possible (Nat. Biotech., 5, 589-594, 2004), which is particularly preferable in the present invention. .. The 2A sequence may be derived from any virus, but is preferably the 2A sequence of foot-and-mouth disease virus (FMDV) (J. General Virology, 89, 1036-1042, 2008).

前記Ngn2をコードする核酸及びFezlをコードする核酸が一本鎖の場合には、安定性の向上を目的として、修飾ヌクレオチド（ヌクレオチド類似体を含む）を好適に含むことができる。そのような修飾ヌクレオチドの例としては、糖修飾リボヌクレオチド（例として、2’-フルオロ、2’-O-メチル、又は2’-O-メトキシエチル修飾されたリボヌクレオチド等）、骨格修飾リボヌクレオチド（例として、S化ヌクレオチド（Phosphorothioate）等）、及び塩基修飾リボヌクレオチド（例として、5-（2-アミノ）プロピルウリジン、5-ブロモウリジン等）、及び、ヌクレオチド類似体（2’,4’-BNA(bridge nucleic acid)/LNA(Locked Nucleic Acid)（Koshkin et al., J. American Chemical Society, 120:13252-13253, 1998）、ENA(2’-O,4’-C-Ethylene-bridged Nucleic Acids）（WO2000/047599）等)等が挙げられる。これらの修飾ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体はいずれも公知技術であり、オリゴ核酸の生体内安定性を向上させる方法として汎用されている（Summerton and Weller, Antisense Nuc. Acid Drug Dev., 7:187-195(1997)；Hyrup et al., Bioorgan.Med.Chem.,4:5-23(1996)、参照）。 When the nucleic acid encoding Ngn2 and the nucleic acid encoding Fezl are single-stranded, modified nucleotides (including nucleotide analogs) can be suitably contained for the purpose of improving stability. Examples of such modified nucleotides include sugar-modified ribonucleotides (eg, 2'-fluoro, 2'-O-methyl, or 2'-O-methoxyethyl-modified ribonucleotides, etc.), skeletal-modified ribonucleotides. (For example, S-modified nucleotides (Phosphorothioate), etc.), and base-modified ribonucleotides (eg, 5- (2-amino) propyluridine, 5-bromouridine, etc.), and nucleotide analogs (2', 4', etc.). -BNA (bridge nucleic acid) / LNA (Locked Nucleic Acid) (Koshkin et al., J. American Chemical Society, 120: 13252-13253, 1998), ENA (2'-O, 4'-C-Ethylene-bridged) Nucleic Acids) (WO2000 / 047599), etc.). Both of these modified nucleotides and nucleotide analogs are known techniques and are widely used as methods for improving the in vivo stability of oligonucleic acids (Summerton and Weller, Antisense Nuc. Acid Drug Dev., 7: 187-195. (1997); see Hyrup et al., Bioorgan. Med. Chem., 4: 5-23 (1996)).

＜外来性Ngn2及びFezlの導入＞
Ngn2をコードする核酸及びFezlをコードする核酸を多能性幹細胞に導入する方法は特に限定されないが、例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体などのベクターに導入した形態で、リポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクションなどの手法によって多能性幹細胞内に導入することができる。
ウィルスベクターとしては、レトロウィルスベクター、レンチウィルスベクター、アデノウィルスベクター、アデノ随伴ウィルスベクター、センダイウィルスベクター等が例示される。また、人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体（HAC）、酵母人工染色体（YAC）、細菌人工染色体（BAC、PAC）等が挙げられる。プラスミドとしては、哺乳動物用プラスミド全般を使用することができる。なお、前記Ngn2及びFezlを発現させるための制御配列、選択マーカー配列、及び、レポーター遺伝子配列等は、ベクターによって供給されてもよい。<Introduction of exogenous Ngn2 and Fezl>
The method for introducing the nucleic acid encoding Ngn2 and the nucleic acid encoding Fezl into pluripotent stem cells is not particularly limited, but for example, in the form introduced into a vector such as a virus, a plasmid, or an artificial chromosome, lipofection, liposome, microinjection, etc. It can be introduced into pluripotent stem cells by the above method.
Examples of the virus vector include a retro virus vector, a lentivirus vector, an adenovirus vector, an adeno-associated virus vector, and a Sendai virus vector. Examples of the artificial chromosome vector include a human artificial chromosome (HAC), a yeast artificial chromosome (YAC), and a bacterial artificial chromosome (BAC, PAC). As the plasmid, a general mammalian plasmid can be used. The control sequence for expressing Ngn2 and Fezl, the selectable marker sequence, the reporter gene sequence, and the like may be supplied by a vector.

前記ベクターは、前記Ngn2をコードする核酸及びFezlをコードする核酸を多能性幹細胞の染色体に効率良く挿入するためのトランスポゾン配列を有していることが好ましい。本発明に用いることができるトランスポゾン配列は特に限定されないが、好適なものとして、piggyBacトランスポゾンのトランスポゾン配列が挙げられる（Yusa M., et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 108:1531-1536, 2011）。前記Ngn2をコードする核酸及びFezlをコードする核酸が２つのトランスポゾン配列の間に挿入されたベクターを、該トランスポゾン配列に対応するトランスポゼース（piggyBacトランスポゾン配列に対しては、piggyBacトランスポゼース）を前記細胞内で発現し得る態様でコードする核酸とともに細胞に導入することで、該トランスポゾン配列に挟まれた領域（前記Ngn2をコードする核酸及びFezlをコードする核酸を含む領域）が染色体内に挿入された細胞を効率よく得ることができる。 The vector preferably has a transposon sequence for efficiently inserting the nucleic acid encoding Ngn2 and the nucleic acid encoding Fezl into the chromosome of a pluripotent stem cell. The transposon sequence that can be used in the present invention is not particularly limited, but a suitable one is a transposon sequence of piggyBac transposon (Yusa M., et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 108: 1531. -1536, 2011). A vector in which the nucleic acid encoding Ngn2 and the nucleic acid encoding Fezl are inserted between two transposon sequences is used, and a transposase corresponding to the transposon sequence (piggyBac transpozes for the piggyBac transposon sequence) is applied to the cells. By introducing into a cell together with a nucleic acid encoding in an expressible manner, a cell in which a region sandwiched between the transposon sequences (a region containing the nucleic acid encoding Ngn2 and the nucleic acid encoding Fezl) is inserted into the chromosome is inserted. It can be obtained efficiently.

前記Ngn2をコードする核酸及びFezlをコードする核酸が1本鎖の場合には、例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクションなどの手法によって多能性幹細胞に導入してもよい。細胞内における当該発現レベルを維持するために、複数回、例えば、２回、３回、４回、又は５回等導入を行っても良い。 When the nucleic acid encoding Ngn2 and the nucleic acid encoding Fezl are single-stranded, they may be introduced into pluripotent stem cells by, for example, electroporation, lipofection, or microinjection. In order to maintain the expression level in the cells, the introduction may be performed a plurality of times, for example, twice, three times, four times, or five times.

外来性Ngn2及びFezlをタンパクの形態で導入する場合には、例えば、リポフェクション、及びマイクロインジェクションなどの手法によって導入することができる。その際、細胞膜透過性ペプチド（例えば、HIV由来のTAT及びポリアルギニン）との融合タンパクの状態で導入してもよい。細胞内における前記外来性のNgn2及びFezlタンパク量を維持するために、複数回、例えば、２回、３回、４回、又は５回等導入を行っても良い。 When introducing exogenous Ngn2 and Fezl in the form of proteins, they can be introduced by methods such as lipofection and microinjection, for example. At that time, it may be introduced in the state of a fusion protein with a cell membrane permeable peptide (for example, HIV-derived TAT and polyarginine). In order to maintain the amount of the exogenous Ngn2 and Fezl proteins in the cells, the introduction may be performed a plurality of times, for example, twice, three times, four times, or five times.

＜外来性Ngn2及びFezlの発現＞
前記Ngn2をコードする核酸及びFezlをコードする核酸からの当該Ngn2及びFezlの発現は、誘導可能なプロモーターに制御されることが好ましい。誘導可能なプロモーターの例としては、薬剤応答性プロモーターが挙げられ、その好適な例として、テトラサイクリン応答性プロモーター（tetO配列が7回連続したテトラサイクリン応答配列（TRE）を有するCMV最小プロモーター）が挙げられる。該プロモーターは、リバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子（rtTA；reverse tetR（rTetR）とVP16ADから構成される融合タンパク質)の発現下において、テトラサイクリン又はその誘導体が供給されることにより活性化されるプロモーターである。よって、テトラサイクリン応答性プロモーターを用いて発現誘導を行う場合には、前記活性化因子を発現する様式を併せ持つベクターを用いることが好ましい。前記テトラサイクリンの誘導体としては、ドキシサイクリン（doxycycline、本願では以降、DOXと略記する）を好適に用いることができる。<Expression of exogenous Ngn2 and Fezl>
Expression of the Ngn2 and Fezl from the Ngn2-encoding nucleic acid and the Fezl-encoding nucleic acid is preferably regulated by an inducible promoter. Examples of inducible promoters include drug-responsive promoters, and suitable examples thereof include tetracycline-responsive promoters (CMV minimal promoters having a tetracycline-responsive sequence (TRE) with seven consecutive tetO sequences). .. The promoter is a promoter activated by supply of tetracycline or a derivative thereof under the expression of a reverse tetracycline-regulated transactivator (rtTA; a fusion protein composed of reverse tetR (rTetR) and VP16AD). be. Therefore, when inducing expression using a tetracycline-responsive promoter, it is preferable to use a vector having a mode of expressing the activator. As the derivative of the tetracycline, doxycycline (hereinafter abbreviated as DOX in the present application) can be preferably used.

上記以外の薬剤応答性プロモーターを用いた発現誘導系としては、エストロゲン応答性プロモーターを用いた発現誘導システム（例として、WO2006/129735）、RSL1によって誘導されるプロモーターを用いたRheoSwitch哺乳類誘導性発現システム（New England Biolabs社）、cumateによって誘導されるプロモーターを用いたQ-mateシステム（Krackeler Scientific社）又はCumate誘導性発現システム（National Research Council(NRC)社）、及びエクジソン応答性配列を有するプロモーターを用いたGenoStat誘導性発現システム(Upstate cell signaling solutions社）等が挙げられる。
上述したような薬剤応答性プロモーターを用いる場合には、当該プロモーターの活性化を誘導し得る薬剤（例えば、前記テトラサイクリン応答性プロモーターを含むベクターの場合には、テトラサイクリン又はDOX）を培地に所望の期間添加し続けることで、外来性Ngn2及びFezlの発現を維持することができる。そして、培地から当該薬剤を除去する（例えば、該薬剤を含まない培地に置換する）ことで、前記遺伝子の発現を停止させることが可能である。Expression-inducing systems using drug-responsive promoters other than the above include expression-inducing systems using estrogen-responsive promoters (eg WO2006 / 129735) and RheoSwitch mammalian-induced expression systems using RSL1-induced promoters. (New England Biolabs), Q-mate system using a promoter induced by cumate (Krackeler Scientific) or Cumate-induced expression system (National Research Council (NRC)), and promoters with ecdison-responsive sequences. Examples thereof include the GenoStat inducible expression system (Upstate cell signaling solutions) used.
When a drug-responsive promoter as described above is used, a drug capable of inducing activation of the promoter (for example, tetracycline or DOX in the case of a vector containing the tetracycline-responsive promoter) is used as a medium for a desired period. By continuing to add, the expression of exogenous Ngn2 and Fezl can be maintained. Then, by removing the drug from the medium (for example, replacing it with a medium containing no such drug), it is possible to stop the expression of the gene.

さらに、前記Ngn2及びFezlの発現誘導は、前記Ngn2をコードする核酸及びFezlをコードする核酸を構成的プロモーターに機能的でない形で接合させておき、所望の時期に当該接合状態を機能的な接合状態に変換することで行ってもよい。このような例としては、前記構成的プロモーターと前記遺伝子をコードする配列の間に、LoxP配列で挟まれた特定の配列（例えば、薬剤耐性遺伝子をコードする配列や転写終結を誘導する配列）を配しておき、所望の時期にCreを作用させて前記LoxP配列で挟まれた配列を除去することで、前記接合状態を機能的な接合状態に変換する方法等が挙げられる。さらに、前記LoxP配列の代わりにFRT配列又はトランスポゾン配列（例として、piggyBacトランスポゾン配列）を、前記Creの代わりにFLP(flipase)又は当該トランスポゾン（例として、piggyBacトランスポゾン）を用いてもよい。
上記目的で用いることができる構成的プロモーターとしては、SV40プロモーター、 LTRプロモーター、CMV（cytomegalovirus)プロモーター、RSV（Rous sarcoma virus)プロモーター、MoMuLV（Moloney mouse leukemia virus） LTR、HSV-TK（herpes simplex virus thymidine kinase）プロモーター、EF-αプロモーター、及びCAGプロモーター等が挙げられる。
上記のようにCre、FLP、トランスポゾンを用いて接合状態を変換することで発現誘導を行った場合には、所望の期間経過後に再度Cre、FLP、トランスポゾンを作用させて前記配列（LoxP配列、FRT配列、又はトランスポゾン配列）で挟まれた配列を除去することで、前記遺伝子の発現を停止させることもできる。Further, in the induction of Ngn2 and Fezl expression, the nucleic acid encoding Ngn2 and the nucleic acid encoding Fezl are bound to the constitutive promoter in a non-functional manner, and the joining state is functionally joined at a desired time. It may be done by converting it into a state. As such an example, a specific sequence sandwiched between LoxP sequences (for example, a sequence encoding a drug resistance gene or a sequence inducing transcription termination) between the constitutive promoter and the sequence encoding the gene may be used. Examples thereof include a method of converting the junction state into a functional junction state by arranging the sequences and allowing Cre to act at a desired time to remove the sequence sandwiched between the LoxP sequences. Further, an FRT sequence or a transposon sequence (for example, a piggyBac transposon sequence) may be used instead of the LoxP sequence, and FLP (flipase) or the transposon (for example, a piggyBac transposon) may be used instead of the Cre.
Constitutive promoters that can be used for the above purposes include SV40 promoter, LTR promoter, CMV (cytomegalovirus) promoter, RSV (Rous sarcoma virus) promoter, MoMuLV (Moloney mouse leukemia virus) LTR, and HSV-TK (herpes simplex virus thymidine). kinase) promoter, EF-α promoter, CAG promoter and the like can be mentioned.
When the expression is induced by converting the conjugation state using Cre, FLP, and transposon as described above, Cre, FLP, and transposon are allowed to act again after the desired period has elapsed, and the above-mentioned sequence (LoxP sequence, FRT) is allowed to act again. It is also possible to stop the expression of the gene by removing the sequence sandwiched between the sequence or the transposon sequence).

また、別の態様として、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウィルスベクター、センダイウイルスベクターやプラスミド、エピソーマルベクター等の容易に細胞内から消失させ得るベクターを用いることで、前記遺伝子の発現期間を制御することも可能である。 Further, as another embodiment, the expression period of the gene is controlled by using a vector that can be easily eliminated from the cell, such as an adenovirus vector, an adeno-associated virus vector, a Sendai virus vector, a plasmid, or an episomal vector. Is also possible.

上位運動ニューロンを含む錐体細胞の製造において、外来性Ngn2及びFezlの発現は3日間以上維持されることが好ましく、4日間、5日間、6日間、7日間のいずれにおいても本発明の効果を奏することができ、特に好ましくは7日間である。前記発現を維持する期間が長期になることで上位運動ニューロン及び錐体細胞の製造に不利益を生じることはないが、好ましくは3日以上14日以下、特に好ましくは7日以上14日以下である。 In the production of pyramidal cells containing upper motor neurons, the expression of exogenous Ngn2 and Fezl is preferably maintained for 3 days or longer, and the effect of the present invention is exhibited in any of 4 days, 5 days, 6 days, and 7 days. It can be played, especially preferably for 7 days. Prolonged period of maintenance of the expression does not cause any disadvantage in the production of upper motor neurons and pyramidal cells, but is preferably 3 days or more and 14 days or less, and particularly preferably 7 days or more and 14 days or less. be.

＜多能性幹細胞＞
本発明において、多能性幹細胞とは、生体に存在するすべての細胞に分化可能な多能性を有し、かつ、増殖能を併せもつ幹細胞のことである。例として、以下に限定するものではないが、胚性幹細胞（embryonic stem cell；ES細胞）、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹細胞（nuclear transfer embryonic stem cell；ntES細胞）、***幹細胞（spermatogonial stem cell；GS細胞）、胚性生殖細胞（embryonic germ cell；EG細胞）、人工多能性幹細胞（pluripotent stem cell；iPS細胞）、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞（Muse細胞）等が挙げられる。これらのうち、本発明に好適な多能性幹細胞は、ES細胞及びiPS細胞であり、特に好ましくはiPS細胞である。<Pluripotent stem cells>
In the present invention, the pluripotent stem cell is a stem cell having pluripotency capable of differentiating into all cells existing in a living body and also having proliferative ability. Examples include, but are not limited to, embryonic stem cells (ES cells), embryonic stem cells derived from cloned embryos obtained by nuclear transplantation (nuclear transfer embryonic stem cells; ntES cells), and sperm stem cells (ES cells). spermatogonial stem cells (GS cells), embryonic germ cells (EG cells), artificial pluripotent stem cells (iPS cells), cultured fibroblasts and pluripotent cells derived from bone marrow stem cells (Muse) Cells) and the like. Of these, pluripotent stem cells suitable for the present invention are ES cells and iPS cells, and iPS cells are particularly preferable.

iPS細胞は、特定の初期化因子をDNA又はタンパク質の形態で体細胞に導入することで作製され得る、ES細胞とほぼ同等の特性（例えば、分化多能性と自己複製による増殖能）を有する体細胞由来の人工幹細胞である（K. Takahashi and S. Yamanaka（2006） Cell, 126:663-676; K. Takahashi et al.（2007), Cell, 131:861-872; J. Yu et al.（2007), Science, 318:1917-1920; Nakagawa, M.ら,Nat. Biotechnol. 26:101-106（2008)；国際公開WO 2007/069666）。初期化因子は、ES細胞に特異的に発現している遺伝子、その遺伝子産物もしくはnon-cording RNA又はES細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子、その遺伝子産物もしくはnon-cording RNA、あるいは低分子化合物によって構成されてもよい。初期化因子に含まれる遺伝子として、例えば、Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3又はGlis1等が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626、WO 2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO 2010/111409、WO 2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、Huangfu D, et al.（2008), Nat. Biotechnol., 26: 795-797、Shi Y, et al.（2008), Cell Stem Cell, 2: 525-528、Eminli S, et al.（2008), Stem Cells. 26:2467-2474、Huangfu D, et al.（2008), Nat Biotechnol. 26:1269-1275、Shi Y, et al.（2008), Cell Stem Cell, 3, 568-574、Zhao Y, et al.（2008), Cell Stem Cell, 3:475-479、Marson A,（2008), Cell Stem Cell, 3, 132-135、Feng B, et al.（2009), Nat Cell Biol. 11:197-203、R.L. Judson et al.,（2009), Nat. Biotech., 27:459-461、Lyssiotis CA, et al.（2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:8912-8917、Kim JB, et al.（2009), Nature. 461:649-643、Ichida JK, et al.（2009), Cell Stem Cell. 5:491-503、Heng JC, et al.（2010), Cell Stem Cell. 6:167-74、Han J, et al.（2010), Nature. 463:1096-100、Mali P, et al.（2010), Stem Cells. 28:713-720、Maekawa M, et al.（2011), Nature. 474:225-9.に記載の組み合わせが例示される。
当業者は上記刊行物を参照することにより、本発明に好適に使用できる遺伝子を適宜選択し、周知の方法に従ってiPS細胞を製造することができる。iPS cells have characteristics similar to ES cells (eg, pluripotency and self-renewal proliferation ability) that can be produced by introducing specific reprogramming factors into somatic cells in the form of DNA or protein. Somatic cell-derived artificial stem cells (K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126: 663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131: 861-872; J. Yu et al (2007), Science, 318: 1917-1920; Nakagawa, M. et al., Nat. Biotechnol. 26: 101-106 (2008); International Publication WO 2007/069666). Reprogramming factors are genes that are specifically expressed in ES cells, their gene products or non-cording RNAs, or genes that play an important role in maintaining undifferentiated ES cells, their gene products or non-cording RNAs, or It may be composed of low molecular weight compounds. Genes contained in the reprogramming factor include, for example, Oct3 / 4, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Klf4, Klf2, c-Myc, N-Myc, L-Myc, Nanog, Lin28, Fbx15, ERas, ECAT15. -2, Tcl1, beta-catenin, Lin28b, Sall1, Sall4, Esrrb, Nr5a2, Tbx3, Glis1, etc. are exemplified, and these initialization factors may be used alone or in combination. The combinations of initialization factors include WO2007 / 069666, WO2008 / 118820, WO2009 / 007852, WO2009 / 032194, WO2009 / 058413, WO2009 / 057831, WO2009 / 075119, WO2009 / 079007, WO2009 / 091659, WO2009 / 101084, WO2009 / 101407, WO2009 / 102983, WO2009 / 114949, WO2009 / 117439, WO2009 / 126250, WO2009 / 126251, WO2009 / 126655, WO2009 / 157593, WO2010 / 009015, WO2010 / 033906, WO2010 / 033920, WO2010 / 042800, WO2010 / 050626, WO 2010/056831, WO2010 / 068955, WO2010 / 098419, WO2010/102267, WO 2010/111409, WO 2010/111422, WO2010 / 115050, WO2010 / 124290, WO2010 / 147395, WO2010 / 147612, Huangfu D, et al. 2008), Nat. Biotechnol., 26: 795-797, Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 2: 525-528, Eminli S, et al. (2008), Stem Cells. 26: 2467 -2474, Huangfu D, et al. (2008), Nat Biotechnol. 26: 1269-1275, Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3, 568-574, Zhao Y, et al. (2008) ), Cell Stem Cell, 3: 475-479, Marson A, (2008), Cell Stem Cell, 3, 132-135, Feng B, et al. (2009), Nat Cell Biol. 11: 197-203, RL Judson et al., (2009), Nat. Biotech., 27: 459-461, Lyssiotis CA, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci US A. 106: 8912-8917, Kim JB, et al. (2009), Nature. 461: 649-643, Ichida JK, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5: 491-503, Heng JC, et al. (2010), Cell Stem Cell. 6 : 167-74, Han J, et al. (2010), Nature. 463: 1096-100, Mali P, et al. (2010), Stem Cells. 28: 713-720, Maekawa M, et al. (2011) ), Nature. 474: 225-9.
Those skilled in the art can appropriately select genes that can be suitably used for the present invention and produce iPS cells according to well-known methods by referring to the above publications.

また、本発明には、既に樹立された多能性幹細胞株を好適に用いることができ、市販のマウス及びヒトのES細胞株及びiPS細胞株を用いてもよい。ヒトES細胞株としては、例えば、KhES-1(HES0001)、KhES-2(HES0002)、及びKhES-3(HES0003)株等が、理化学研究所バイオリソースセンターから入手可能である（細胞開発材料室；http://cell.brc.riken.jp/ja/）。健常者から樹立されたiPS細胞株としては、例えば、201B7（HPS0063）、253G1（HPS0002）、409B2（HPS0076）、及び454E2（HPS0077）株等、ALS患者から樹立されたiPS細胞株としては、例えば、本発明者によって樹立されたCiRA0021（HPS0327）、CiRA0022（HPS0290）、CiRA0023（HPS0291）、CiRA0024（HPS0292）、CiRA0025（HPS0293）、及びCiRA0026（HPS0294）等が、いずれも前記センターから入手可能である。上記株名の後ろのカッコ内の英数字は寄託番号を表す。また、米国コリエル インスティチュート（Coriell Institute；https://catalog.coriell.org）からも、各種多能性細胞株が入手可能である。 In addition, pluripotent stem cell lines that have already been established can be preferably used in the present invention, and commercially available mouse and human ES cell lines and iPS cell lines may be used. As human ES cell lines, for example, KhES-1 (HES0001), KhES-2 (HES0002), KhES-3 (HES0003) strains and the like are available from RIKEN BioResource Center (Cell Development Materials Room; http://cell.brc.riken.jp/ja/). Examples of iPS cell lines established from healthy subjects include 201B7 (HPS0063), 253G1 (HPS0002), 409B2 (HPS0076), and 454E2 (HPS0077) strains, and examples of iPS cell lines established from ALS patients include. , CiRA0021 (HPS0327), CiRA0022 (HPS0290), CiRA0023 (HPS0291), CiRA0024 (HPS0292), CiRA0025 (HPS0293), CiRA0026 (HPS0294), etc. established by the present inventor are all available from the center. .. The alphanumerical characters in parentheses after the strain name indicate the deposit number. Various pluripotent cell lines are also available from the Coriell Institute (https://catalog.coriell.org) in the United States.

本発明に係る上位運動ニューロンを含む錐体細胞の製造に用いることができる多能性幹細胞は、疾患モデルの作製という観点から、疾患患者から樹立されたiPS細胞、疾患の原因遺伝子が導入された健常者由来多能性幹細胞、又は、疾患の原因遺伝子を機能的に欠失した健常者由来多能性幹細胞等であってよい。当該疾患モデルの作製に好適な多能性幹細胞については、「３．疾患モデル提供」で詳しく説明する。 In the pluripotent stem cells that can be used for the production of pyramidal cells including superior motor neurons according to the present invention, iPS cells established from disease patients and disease-causing genes were introduced from the viewpoint of creating a disease model. It may be a pluripotent stem cell derived from a healthy person, a pluripotent stem cell derived from a healthy person functionally deleted from the causative gene of the disease, or the like. Pluripotent stem cells suitable for producing the disease model will be described in detail in "3. Providing the disease model".

＜培養方法＞
外来性のNgn2及びFezlが導入され、且つ、該Ngn2及びFezlを発現する多能性幹細胞は、ニューロンへの分化誘導に適した培地（本書では以降、神経分化用培地と呼ぶ）中で培養されることが好ましい。そのような培地としては、基本培地のみ、又は、神経栄養因子を添加した基本培地を用いることができる。本発明における神経栄養因子とは、神経細胞の生存と機能維持に重要な役割を果たしている膜受容体のリガンドであり、例えば、Nerve Growth Factor（NGF）、Brain-derived Neurotrophic Factor（BDNF）、Neurotrophin 3（NT-3）、Neurotrophin 4/5（NT-4/5）、Neurotrophin 6（NT-6）、basic FGF、acidic FGF、FGF-5、Epidermal Growth Factor（EGF）、Hepatocyte Growth Factor（HGF）、Insulin、Insulin Like Growth Factor 1（IGF 1）、Insulin Like Growth Factor 2（IGF 2）、Glia cell line-derived Neurotrophic Factor（GDNF）、TGF-b2、TGF-b3、Interleukin 6（IL-6）、Ciliary Neurotrophic Factor（CNTF）及びLIF等が挙げられる。このうち、本発明において好ましい神経栄養因子は、GDNF、BDNF、及びNT-3である。前記基本培地としては、例えば、Glasgow's Minimal Essential Medium(GMEM)培地、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium（EMEM)培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium(DMEM)培地、Ham's F12(F12)培地、Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12(DMEM/F-12)培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、Neurobasal Medium培地（Lifetechnologies社）、及びこれらの混合培地等が挙げられる。基本培地には血清が含まれていてもよく、含まれていなくても（すなわち、無血清）良い。培地には、必要に応じて、例えば、Knockout Serum Replacement(KSR)(ES細胞培養時のFBSの血清代替物)、N2 supplement（Invitrogen）、B27 supplement（Invitrogen）、アルブミン、トランスフェリン、アポトランスフェリン、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール、3'-チオールグリセロール等の1以上の血清代替物を添加することができ、また、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、Glutamax（Invitrogen）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、セレン酸、プロゲステロン及びプトレシン等の1以上の物質を添加してもよい。<Culture method>
Pluripotent stem cells into which exogenous Ngn2 and Fezl are introduced and expressing the Ngn2 and Fezl are cultured in a medium suitable for inducing differentiation into neurons (hereinafter referred to as a medium for nerve differentiation in this document). Is preferable. As such a medium, only the basal medium or the basal medium to which a neurotrophic factor is added can be used. The neurotrophic factor in the present invention is a ligand for a membrane receptor that plays an important role in the survival and function maintenance of nerve cells, and is, for example, Nerve Growth Factor (NGF), Brain-derived Neurotrophic Factor (BDNF), Neurotrophin. 3 (NT-3), Neurotrophin 4/5 (NT-4 / 5), Neurotrophin 6 (NT-6), basic FGF, acidic FGF, FGF-5, Epidermal Growth Factor (EGF), Hepatocyte Growth Factor (HGF) , Insulin, Insulin Like Growth Factor 1 (IGF 1), Insulin Like Growth Factor 2 (IGF 2), Glia cell line-derived Neurotrophic Factor (GDNF), TGF-b2, TGF-b3, Interleukin 6 (IL-6), Examples include Ciliary Neurotrophic Factor (CNTF) and LIF. Of these, the preferred neurotrophic factors in the present invention are GDNF, BDNF, and NT-3. Examples of the basic medium include Glassgow's Minimal Essential Medium (GMEM) medium, IMDM medium, Medium 199 medium, Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) medium, αMEM medium, Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) medium, Ham's F12 (F12). Examples thereof include medium, Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM / F-12) medium, RPMI 1640 medium, Fischer's medium, Neurobasal Medium medium (Lifetechnologies), and a mixed medium thereof. The basal medium may or may not contain serum (ie, serum-free). The medium may include, for example, Knockout Serum Replacement (KSR) (FBS serum replacement during ES cell culture), N2 supplement (Invitrogen), B27 supplement (Invitrogen), albumin, transferase, apotransferase, fatty acids, as needed. , Invitrogen, collagen precursors, trace elements, 2-mercaptoethanol, 1 or more serum substitutes such as 3'-thiolglycerol, lipids, amino acids, L-glutamine, Glutamax (Invitrogen), One or more substances such as non-essential amino acids, vitamins, growth factors, low molecular weight compounds, antibiotics, antioxidants, pyruvate, buffers, inorganic salts, selenic acid, progesterone and putresin may be added.

本発明では、神経分化用培地として、DMEM/F12培地とNeurobasal Medium培地を体積比１：１で混合した混合培地に、N2 supplement、B27 supplement、BDNF、GDNF、及びNT3を添加した培地を好適に用いることができる。 In the present invention, as a medium for nerve differentiation, a medium obtained by adding N2 supplement, B27 supplement, BDNF, GDNF, and NT3 to a mixed medium in which DMEM / F12 medium and Neurobasal Medium medium are mixed at a volume ratio of 1: 1 is preferably used. Can be used.

前記外来性Ngn2及びFezlを発現する多能性幹細胞の培養は、単独で（すなわち、他種細胞の非存在下で）行うことができるが、上位運動ニューロンへの分化効率を向上させるために、グリア細胞の共存下で行ってもよい。本発明においてグリア細胞とは、神経系を構成する非神経細胞を指し、マイクログリア、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、上衣細胞、およびシュワン細胞等が例示される。このうち、本発明において最も好ましいグリア細胞はアストロサイトである。 Pluripotent stem cells expressing the exogenous Ngn2 and Fezl can be cultured alone (ie, in the absence of allogeneic cells), but in order to improve the efficiency of differentiation into upper motor neurons. It may be performed in the coexistence of glial cells. In the present invention, glial cells refer to non-neuronal cells constituting the nervous system, and examples thereof include microglia, astrocytes, oligodendrocytes, ependymal cells, and Schwann cells. Of these, the most preferable glial cell in the present invention is astrocyte.

本発明では、前記外来性Ngn2及びFezlが導入された多能性幹細胞をグリア細胞（特に好ましくは、アストロサイト）のフィーダー層上に播種／培養し、前記外来性遺伝子の発現誘導を行うことが好ましい。本発明に用いるグリア細胞は、ヒト、マウスいずれのものでもよく、入手し易さの点からはマウスのグリア細胞が好適である。
グリア細胞は、当業者に周知の方法に従い、マウス胎児又は新生児の脳から容易に調製することができる（例として、Jacquier A., et al, Hum. Mol. Genet., 18:2127-2139, 2009参照）。各社から市販されている製品を用いてもよく、また、細胞バンクからも入手可能である（例として、国立研究開発法人 医薬基盤・健康・栄養研究所のJCRB細胞バンク（http://cellbank.nibiohn.go.jp/）のMA-89（寄託番号：IFO50293））。In the present invention, pluripotent stem cells into which the exogenous Ngn2 and Fezl have been introduced can be seeded / cultured on a feeder layer of glial cells (particularly preferably astrocytes) to induce the expression of the exogenous gene. preferable. The glial cells used in the present invention may be either human or mouse, and mouse glial cells are preferable from the viewpoint of easy availability.
Glial cells can be readily prepared from mouse fetal or neonatal brains according to methods well known to those of skill in the art (eg, Jacquier A., et al, Hum. Mol. Genet., 18: 2127-2139, See 2009). Products commercially available from various companies may be used, and they are also available from cell banks (for example, JCRB Cell Bank of the National Institutes of Biomedical Innovation, Health and Nutrition (http://cellbank.). MA-89 (deposit number: IFO50293) of nibiohn.go.jp/).

前記外来性Ngn2及びFezlを発現する多能性幹細胞を培養して上位運動ニューロンに分化誘導する際の培養温度は特に限定されないが、約30-40℃、好ましくは約37℃である。CO2含有空気の雰囲気下での培養が好ましく、CO2濃度は好ましくは約2-5％である。The culture temperature at the time of culturing the pluripotent stem cells expressing the exogenous Ngn2 and Fezl to induce differentiation into upper motor neurons is not particularly limited, but is about 30-40 ° C, preferably about 37 ° C. Culturing in an atmosphere of CO 2 -containing air is preferable, and the CO 2 concentration is preferably about 2-5%.

＜錐体細胞及び上位運動ニューロン＞
錐体細胞は、大脳皮質と海馬に存在するグルタミン酸作動性の興奮性ニューロンである。錐体細胞は、形態的及び生理学的な特徴からさまざまなサブタイプに分類されており、それぞれが機能的にも異なる役割を果たしていると考えられている。<Pyramid cells and upper motor neurons>
Pyramidal cells are glutamatergic excitatory neurons located in the cerebral cortex and hippocampus. Pyramidal cells are classified into various subtypes based on their morphological and physiological characteristics, and each is thought to play a different functional role.

本発明では、“β-III tubulin又はMAP2（microtubule-associated protein 2）陽性の突起（神経突起と呼ぶ場合がある）を少なくとも１以上有する細胞”を“ニューロン”と定義する。そして、本発明における“錐体細胞”とは、“前記ニューロンの定義を満たし、さらに錐体細胞のマーカー遺伝子を１以上発現する細胞”と定義される。前記錐体細胞のマーカー遺伝子としては、例えば、CaMKII(calcium/calmodulin-dependent protein kinase II；ヒト：NM_015981、NP_057065、マウス：NM_177407、NP_803126)、OTX1（orthodenticle homeobox 1；NM_014562、NP_055377）等が挙げられる。
本明細書では、“前記錐体細胞の定義を満たす細胞であって、さらにシナプス形成能を獲得した細胞”を、機能的な分化が完了した錐体細胞という意味で、“成熟した錐体細胞”と呼ぶ。In the present invention, "a cell having at least one β-III tubulin or MAP2 (microtubule-associated protein 2) positive protrusion (sometimes called a neurite)" is defined as a "neuron". The "pyramidal cell" in the present invention is defined as "a cell that satisfies the definition of the neuron and further expresses one or more marker genes of the pyramidal cell". Examples of the marker gene for pyramidal cells include CaMKII (calcium / calmodulin-dependent protein kinase II; human: NM_015981, NP_057065, mouse: NM_177407, NP_803126), OTX1 (orthodenticle homeobox 1; NM_014562, NP_055377) and the like. ..
In the present specification, "a cell that satisfies the definition of the pyramidal cell and has acquired a synaptogenic ability" is referred to as a "mature pyramidal cell" in the sense of a pyramidal cell that has completed functional differentiation. Call it.

大脳の上位運動ニューロンは、大脳皮質運動野の第5層に細胞体が存在し、脊髄全角の下位運動ニューロン、又は、橋及び延髄の神経核に投射する大型の錐体細胞に代表される。本発明では、“前記ニューロンの定義を満たす細胞であって、さらに、
大脳皮質第5層のマーカー遺伝子を１以上発現し、且つ、運動野のマーカー遺伝子を1以上発現する細胞、又は、
大脳皮質第5層のマーカー遺伝子もしくは運動野のマーカー遺伝子を1以上発現し、且つ、細胞体の直径が15μm以上（さらに好ましくは、20μm以上）の細胞”、
を“上位運動ニューロン”と定義する。Upper motor neurons of the cerebrum have cell bodies in the fifth layer of the motor area of the cerebral cortex, and are represented by lower motor neurons of the full angle of the spinal cord or large pyramidal cells that project to the nucleus of the pons and medulla oblongata. In the present invention, "a cell satisfying the definition of the neuron, and further
Cells that express one or more marker genes in the fifth layer of the cerebral cortex and one or more marker genes in the motor field, or
A cell that expresses one or more marker genes in the fifth layer of the cerebral cortex or a marker gene in the motor field and has a cell body diameter of 15 μm or more (more preferably 20 μm or more).
Is defined as "upper motor neuron".

前記大脳皮質第5層のマーカー遺伝子としては、例えば、Ctip2（Couptf-interacting protein 2、別名としてB-cell CLL/lymphoma 11B；NM_138576、NP_612808）、TLE4（transducin like enhancer of split 4；NM_001282748、NP_001269677）、ER81（ets variant 1；NM_004956、NP_004947）、Sox5（SRY-box 5；NM_006940、NP_008871）等が挙げられる。また、前記運動野のマーカー遺伝子としては、例えば、Crim1（cysteine rich transmembrane BMP regulator 1 (chordin-like)；NM_016441、NP_057525）、Diap3（diaphanous related formin 3；NM_001042517、NP_001035982）、Igfbp4（insulin like growth factor binding protein 4；NM_001552、NP_001543）等が挙げられる。
本明細書では、“前記上位運動ニューロンの定義を満たす細胞であって、さらに、下位運動ニューロンに対して自身をシナプス前細胞とするシナプス結合を形成し得る細胞”を、機能的な分化が完了した上位運動ニューロンという意味で“成熟した上位運動ニューロン”と呼ぶ。Examples of the marker gene of the fifth layer of the cerebral cortex include Ctip2 (Couptf-interacting protein 2, also known as B-cell CLL / lymphoma 11B; NM_138576, NP_612808), TLE4 (transducin like enhancer of split 4; NM_001282748, NP_001269677). , ER81 (ets variant 1; NM_004956, NP_004947), Sox5 (SRY-box 5; NM_006940, NP_008871) and the like. The marker genes for the motor cortex include, for example, Crim1 (cysteine rich transmembrane BMP regulator 1 (chordin-like); NM_016441, NP_057525), Diap3 (diaphanous related formin 3; NM_001042517, NP_001035982), Igfbp4 (insulin like growth factor). Binding protein 4; NM_001552, NP_001543) and the like.
In the present specification, functional differentiation of "a cell satisfying the definition of the upper motor neuron and capable of forming a synaptic connection with the lower motor neuron as a presynaptic cell" is completed. It is called a "mature upper motor neuron" in the sense that it is an upper motor neuron.

本発明において錐体細胞を製造するとは、前記錐体細胞の定義を満たす細胞を50%以上、好ましくは60%以上、さらに好ましくは70％以上含有する細胞集団を得ることを意味する。また、上位運動ニューロンを製造するとは、前記上位運動ニューロンの定義を満たす細胞を5%以上、好ましくは10%以上、さらに好ましくは15%以上含有する細胞集団を得ることを意味する。なお、本発明において、“上位運動ニューロンを含む錐体細胞を製造する方法”は、“上位運動ニューロンを製造する方法”と同義である。 Producing pyramidal cells in the present invention means obtaining a cell population containing 50% or more, preferably 60% or more, more preferably 70% or more of cells satisfying the definition of pyramidal cells. Further, producing an upper motor neuron means obtaining a cell population containing 5% or more, preferably 10% or more, more preferably 15% or more of cells satisfying the definition of the upper motor neuron. In the present invention, "a method for producing a pyramidal cell containing an upper motor neuron" is synonymous with "a method for producing an upper motor neuron".

２．上位運動ニューロンに変換可能な多能性幹細胞
本発明の第2の態様として、上位運動ニューロンに変換可能な多能性幹細胞が提供される。前記外来性Ngn2及びFezlが導入された多能性幹細胞は、該Ngn2及びFezlを発現することで、約80％という高効率で錐体細胞に変換され、さらに、約16％（すなわち、前記錐体細胞の約20％）という効率で上位運動ニューロンに変換され得る細胞である。これまで、錐体細胞に変換可能な多能性幹細胞として、外来性遺伝子としてAscl1のみ（非特許文献１１）又はNgn2のみ（非特許文献３、特許文献１）が導入された多能性幹細胞が報告されているが、いずれも上位運動ニューロンを生じ得ることは示されていない。
よって、本発明に係る外来性Ngn2及びFezlが導入された多能性幹細胞は、上位運動ニューロンに変換可能であることが確認された初めての多能性幹細胞である。2. 2. Pluripotent stem cells that can be converted into upper motor neurons As a second aspect of the present invention, pluripotent stem cells that can be converted into upper motor neurons are provided. The pluripotent stem cells into which the exogenous Ngn2 and Fezl have been introduced are converted into pyramidal cells with a high efficiency of about 80% by expressing the Ngn2 and Fezl, and further, about 16% (that is, the pyramids). It is a cell that can be converted into an upper motor neuron with an efficiency of about 20% of somatic cells). So far, pluripotent stem cells into which only Ascl1 (Non-Patent Document 11) or Ngn2 (Non-Patent Document 3 and Patent Document 1) have been introduced as pluripotent genes that can be converted into pyramidal cells have been introduced. Although reported, none have been shown to be able to give rise to upper motor neurons.
Therefore, the pluripotent stem cells into which the exogenous Ngn2 and Fezl according to the present invention have been introduced are the first pluripotent stem cells confirmed to be able to be converted into upper motor neurons.

本発明に係る上位運動ニューロンに変換可能な多能性幹細胞は、前記外来性Ngn2及びFezlを発現誘導可能な様式で染色体内に保持していることが好ましい。これにより、所望の時期に前記多能性幹細胞から上位運動ニューロンを製造することができ、さらに、当該多能性幹細胞を細胞株として安定に維持できるようになる。当該発現誘導可能な様式としては、例えば、前記＜外来性Ngn2及びFezlの発現制御＞の項で説明した種々の様式を用いることができる。本発明においては、前記外来性Ngn2及びFezlをコードする核酸が発現誘導可能なプロモーターに機能的に接合された様式が好ましく、当該プロモーターとしては、薬剤応答性プロモーターが好ましい。 It is preferable that the pluripotent stem cells that can be converted into upper motor neurons according to the present invention retain the exogenous Ngn2 and Fezl in the chromosome in a manner that can induce expression. As a result, upper motor neurons can be produced from the pluripotent stem cells at a desired time, and the pluripotent stem cells can be stably maintained as a cell line. As the mode in which the expression can be induced, for example, various modes described in the above section <Control of expression of exogenous Ngn2 and Fezl> can be used. In the present invention, a mode in which the nucleic acids encoding exogenous Ngn2 and Fezl are functionally conjugated to a promoter capable of inducing expression is preferable, and a drug-responsive promoter is preferable as the promoter.

本発明に係る上位運動ニューロンに変換可能な多能性幹細胞は、ヒトを含む動物に多能性幹細胞の状態で投与し、その後分化誘導することで、該投与部位において上位運動ニューロンに変換させることが可能である（特許文献１参照）。当該投与部位としては、大脳皮質が好ましく、さらに好ましくは大脳皮質第5層である。このように、本発明に係る上位運動ニューロンに変換可能な多能性幹細胞は、疾患等で失われた上位運動ニューロンを補充するための細胞製剤として用いてもよい。 The pluripotent stem cells that can be converted into upper motor neurons according to the present invention are administered to animals including humans in the state of pluripotent stem cells, and then differentiated to be converted into upper motor neurons at the administration site. Is possible (see Patent Document 1). The administration site is preferably the cerebral cortex, and more preferably the fifth layer of the cerebral cortex. As described above, the pluripotent stem cells that can be converted into the upper motor neurons according to the present invention may be used as a cell preparation for replenishing the upper motor neurons lost due to a disease or the like.

３．皮質脊髄路モデルの提供
本発明の第3の態様として、上位運動ニューロンが下位運動ニューロンに投射した皮質脊髄路の細胞モデルが提供される。
これまで、動物組織から神経連絡を保ったままのニューロンを培養下に移す技術としてスライスカルチャー法が知られているが、該方法では脳と脊髄のような異なる組織にまたがる神経結合を温存することは（少なくとも現時点では）不可能である。また、実験動物の脳及び脊髄から上位・下位運動ニューロンを採取して共培養することは可能だが、培養下で両運動ニューロン間の神経連絡を再構築できた例は、哺乳類では報告されていない。
このように、ヒトを含む哺乳類では、皮質脊髄路の培養モデル（細胞モデル）を作製することは極めて困難であった。3. 3. Provision of a corticospinal tract model As a third aspect of the present invention, a cell model of a corticospinal tract projected from an upper motor neuron onto a lower motor neuron is provided.
Until now, the slice culture method has been known as a technique for transferring neurons that maintain neural communication from animal tissues into culture, but this method preserves nerve connections that span different tissues such as the brain and spinal cord. Is impossible (at least at the moment). In addition, although it is possible to collect upper and lower motor neurons from the brain and spinal cord of experimental animals and co-culture them, no case has been reported in mammals in which the neural communication between both motor neurons could be reconstructed in culture. ..
Thus, in mammals including humans, it was extremely difficult to create a culture model (cell model) of the corticospinal tract.

本発明に係る方法を用いて製造された上位運動ニューロンは、下位運動ニューロンと共培養することで、上位運動ニューロンをシナプス前細胞、下位運動ニューロンをシナプス後細胞とするシナプス結合を形成することができる細胞である。よって、当該シナプス結合を含む培養物は、哺乳類における初めての皮質脊髄路細胞モデルである。 Upper motor neurons produced using the method according to the present invention can form synaptic connections with upper motor neurons as presynaptic cells and lower motor neurons as postsynaptic cells by co-culturing with lower motor neurons. It is a cell that can be formed. Thus, the culture containing the synaptic connections is the first corticospinal tract cell model in mammals.

前記下位運動ニューロンは、多能性幹細胞から外的シグナルによって分化誘導する方法（例として、非特許文献１２）、多能性幹細胞に外来性Lhx3、Ngn2、及びIsl1を発現させて分化誘導する方法（特許文献１）、体細胞にAscl1、Brn2、Myt1l、Lhx3、Hb9、Isl1、Ngn2、NeuroD1を発現させて分化誘導する方法（非特許文献７）等によって製造することができる。このうち、短期間で下位運動ニューロンを安定して製造できることから、多能性幹細胞に外来性Lhx3、Ngn2、及びIsl1を発現させて分化誘導する方法が好ましい。例えば、外来性Lhx3、Ngn2、及びIsl1を発現誘導可能な態様で染色体に含む多能性幹細胞と、本発明に係る上位運動ニューロンに変換可能な多能性幹細胞とを共培養し、各々を分化誘導することで、上位運動ニューロンが下位運動ニューロンに投射したシナプス結合を含む培養物を短期間（目安として、前記分化誘導から2－3週間程度）で容易に得ることが可能である。さらに、前記2種類の多能性幹細胞における外来性遺伝子が同じシステムによって発現制御されていると、両多能性幹細胞の分化誘導を一括して制御できるため、一段と好適である。当該目的に好適に用いることができる発現制御システムとしては、前述した薬剤プロモーターによる発現制御システムが挙げられる。 The lower motor neuron is a method of inducing differentiation from pluripotent stem cells by an external signal (for example, Non-Patent Document 12), a method of expressing foreign Lhx3, Ngn2, and Isl1 in pluripotent stem cells to induce differentiation. (Patent Document 1), Ascl1, Brn2, Myt1l, Lhx3, Hb9, Isl1, Ngn2, NeuroD1 can be expressed in somatic cells to induce differentiation (Non-Patent Document 7). Of these, a method of inducing differentiation by expressing exogenous Lhx3, Ngn2, and Isl1 in pluripotent stem cells is preferable because lower motor neurons can be stably produced in a short period of time. For example, pluripotent stem cells containing exogenous Lhx3, Ngn2, and Isl1 in a chromosome in an inducible manner and pluripotent stem cells that can be converted into upper motor neurons according to the present invention are co-cultured and differentiated from each other. By inducing, it is possible to easily obtain a culture containing synaptic connections projected by the upper motor neuron onto the lower motor neuron in a short period of time (as a guide, about 2 to 3 weeks after the differentiation induction). Furthermore, if the expression of exogenous genes in the two types of pluripotent stem cells is controlled by the same system, the induction of differentiation of both pluripotent stem cells can be collectively controlled, which is more preferable. Examples of the expression control system that can be suitably used for this purpose include the above-mentioned expression control system using a drug promoter.

本発明に係る皮質脊髄路モデルは、これまで分子レベルでの解析が困難であった、上位運動ニューロンの下位運動ニューロンへの投射機構や情報伝達機構の解析系として用いることができる。 The corticospinal tract model according to the present invention can be used as an analysis system for the projection mechanism and signal transmission mechanism of upper motor neurons to lower motor neurons, which has been difficult to analyze at the molecular level.

４．疾患モデルの提供
本発明の第4の態様として、上位運動ニューロンの異常を伴う疾患の細胞モデルが提供される。当該細胞モデルは、本発明に係る上位運動ニューロンを製造する方法を、上位運動ニューロンが障害される疾患の患者由来iPS細胞、又は、該患者に由来する遺伝子変異を導入された多能性幹細胞に適用することで得ることが可能である。
前記疾患としては、筋萎縮性側索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis;ALS）、原発性側索硬化症（Primary lateral sclerosis;PLS）等が挙げられる。このうち、ALSについては、これまでに多数の家族性患者／家系が報告されており、当該患者／家系において見出された遺伝子変異の情報が英国King’s College London大学の公開データベース“ALSOD:The Amyotrophic Lateral Sclerosis Online Database”（http://alsod.iop.kcl.ac.uk）から入手可能である。
なお、本発明における“健常者”とは、上位運動ニューロンが障害される疾患に罹患していない者の意である。4. Providing a Disease Model As a fourth aspect of the present invention, a cell model of a disease associated with an abnormality in upper motor neurons is provided. In the cell model, the method for producing an upper motor neuron according to the present invention is applied to iPS cells derived from a patient with a disease in which the upper motor neurons are impaired, or pluripotent stem cells into which a gene mutation derived from the patient has been introduced. It can be obtained by applying.
Examples of the disease include amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and primary lateral sclerosis (PLS). Of these, for ALS, a large number of familial patients / families have been reported so far, and information on gene mutations found in the patients / families is available in the public database “ALSOD: The Amyotrophic” of King's College London University in the United Kingdom. It is available from the Lateral Sclerosis Online Database ”(http://alsod.iop.kcl.ac.uk).
The "healthy person" in the present invention means a person who does not suffer from a disease in which upper motor neurons are impaired.

前記疾患患者由来iPS細胞としては、家族性患者から樹立されたiPS細胞が好ましい。家族性ALS患者の例としては、SOD1（superoxide dismutase 1, soluble；NM_000454）、TDP-43（NM_007375、NP_031401）、FUS（FUS RNA binding protein；NM_004960）、ALS2（NM_020919）、ADAR2（adenosine deaminase, RNA-specific, B1；NM_001112）、C9orf72（chromosome 9 open reading frame 72；NM_14500）、GRN（granulin；NM_002087）、PFN1（profilin 1；NM_005022）、EPHA4（EPH receptor A4；NM_001304537）、ERBB4（erb-b2 receptor tyrosine kinase 4、NM_005235）、ANG（Homo sapiens angiogenin, ribonuclease, RNase A family, 5；NM_001145）、UBQLN2（ubiquilin 2；NM_013444）、HNRNPA2B1（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2/B1、NM_031243）、又はOPTN（optineurin 1、NM_001008211）遺伝子に変異を有する患者が挙げられる。このうち、SOD1、TDP-43、及びFUS遺伝子変異は患者数が多いことから、本発明に好適に用いることができる。 As the iPS cells derived from the disease patient, iPS cells established from familial patients are preferable. Examples of familial ALS patients include SOD1 (superoxide dismutase 1, soluble; NM_000454), TDP-43 (NM_007375, NP_031401), FUS (FUS RNA binding protein; NM_004960), ALS2 (NM_020919), ADAR2 (adenosine deaminase, RNA). -specific, B1; NM_001112), C9orf72 (chromosome 9 open reading frame 72; NM_14500), GRN (granulin; NM_002087), PFN1 (profilin 1; NM_005022), EPHA4 (EPH receptor A4; NM_001304537), ERBB4 (erb-b2 receptor) tyrosine kinase 4, NM_005235), ANG (Homo sapiens angiogenin, ribonuclease, RNase A family, 5; NM_001145), UBQLN2 (ubiquilin 2; NM_013444), HNRNPA2B1 (heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2 / B1, NM_031243), or OPTN (optineur) NM_001008211) Examples include patients with gene mutations. Of these, SOD1, TDP-43, and FUS gene mutations can be suitably used in the present invention because of the large number of patients.

前記患者に由来する遺伝子変異を導入された多能性幹細胞は、前記疾患患者で同定された変異型遺伝子を導入、又は、当該内在性遺伝子を機能的に欠失した多能性幹細胞であってよい。また、この目的に用いる多能性幹細胞は、健常人に由来する多能性幹細胞であることが好ましい。
例えば、ALSを引き起こすことが知られるSOD1、TDP-43、及びFUS遺伝子変異の多くは機能獲得型変異であるため、当該遺伝子変異の導入は、該変異型遺伝子を健常者由来多能性幹細胞に導入して行ってもよい。前記変異型遺伝子を多能性幹細胞に導入する方法は特に限定されず、例えば、＜外来性Ngn2及びFezlの導入＞の項で説明した方法を用いてもよい。
一方でALSを引き起こす遺伝子変異には機能喪失型変異も知られており（例として、ALS2及びADAR2遺伝子変異）、これらの遺伝子変異の導入は、内在性遺伝子の機能破壊（すなわち、knockout）であってよい。前記遺伝子の機能破壊は当業者に周知の方法を用いて行うことができ、例えば、CRISPR-Cas9システム（Gaj T., et al, Trends Biotechnol., 31:397-405, 2013; Doudna J.A., et al, Science, 346, no.6213, 2014）、及び、TALエフェクターヌクレアーゼ（Transcription Activator-Like Effector Nuclease;TALEN）システム（Miller J.C., et al, Nat. Biotechnol., 29:143-148, 2011）等を用いてもよい。The pluripotent stem cell into which the gene mutation derived from the patient has been introduced is a pluripotent stem cell into which the mutant gene identified in the disease patient has been introduced or the endogenous gene has been functionally deleted. good. Further, the pluripotent stem cell used for this purpose is preferably a pluripotent stem cell derived from a healthy person.
For example, since many of the SOD1, TDP-43, and FUS gene mutations known to cause ALS are gain-of-function mutations, the introduction of the gene mutation transfers the mutant gene to a healthy person-derived pluripotent stem cell. You may introduce it. The method for introducing the mutant gene into pluripotent stem cells is not particularly limited, and for example, the method described in the section <Introduction of exogenous Ngn2 and Fezl> may be used.
On the other hand, loss-of-function mutations are also known as gene mutations that cause ALS (eg, ALS2 and ADAR2 gene mutations), and the introduction of these gene mutations is the functional disruption of endogenous genes (ie, knockout). It's okay. The functional disruption of the gene can be performed using methods well known to those of skill in the art, eg, the CRISPR-Cas9 system (Gaj T., et al, Trends Biotechnol., 31: 397-405, 2013; Doudna JA, et. al, Science, 346, no.6213, 2014), and TAL effector nuclease (Transcription Activator-Like Effector Nuclease; TALEN) system (Miller JC, et al, Nat. Biotechnol., 29: 143-148, 2011), etc. May be used.

前記疾患患者に由来するiPS細胞、又は、前記疾患患者で同定された変異型遺伝子を導入もしくは対応する野生型遺伝子を機能的に破壊した健常者由来多能性幹細胞に、外来性Ngn2及びFezlを導入し発現させることで、該疾患に特徴的な病的性質を備えた上位運動ニューロンを得ることが可能である。 Exotic Ngn2 and Fezl were added to iPS cells derived from the diseased patient or pluripotent stem cells derived from healthy subjects into which the mutant gene identified in the diseased patient was introduced or the corresponding wild-type gene was functionally disrupted. By introducing and expressing it, it is possible to obtain superior motor neurons having the pathogenic properties characteristic of the disease.

前記方法を用いて作製された上位運動ニューロンは、そのまま該疾患の上位運動ニューロンモデルとして用いてもよく、また、下位運動ニューロンと共培養してシナプス結合（上位運動ニューロンをシナプス前細胞、下位運動ニューロンをシナプス後細胞とするシナプス結合）を形成させた状態で用いてもよい。 The upper motor neuron produced by the above method may be used as it is as an upper motor neuron model of the disease, or may be co-cultured with a lower motor neuron to form a synaptic connection (upper motor neuron is used as a presynaptic cell or a lower motor). It may be used in a state where neurons are formed into postsynaptic cells (synaptic connections).

５．薬剤スクリーニング方法の提供
本発明の第5の態様として、上位運動ニューロンの異常を伴う疾患に対する予防又は治療薬をスクリーニングする方法が提供される。当該方法は、前述した疾患モデル（上位運動ニューロンモデル、皮質脊髄路モデル等）に対し、被験物質の効果を解析する工程を含むことを特徴とする。5. Providing a Drug Screening Method As a fifth aspect of the present invention, a method for screening a prophylactic or therapeutic drug for a disease associated with an abnormality in upper motor neurons is provided. The method is characterized by including a step of analyzing the effect of the test substance on the above-mentioned disease model (upper motor neuron model, corticospinal tract model, etc.).

前記スクリーニング方法は、例えば、下記工程（１）－（４）を含む方法であってよい。
（１）家族性ALS患者由来人工多能性幹細胞に外来性のNgn2及びFezlを発現させて培養して、該多能性幹細胞から上位運動ニューロンを製造する工程、
（２）（１）で得られた上位運動ニューロンを、被験物質と接触させる工程、
（３）（２）で被験物質と接触させた上位運動ニューロン、及び接触させなかった上位運動ニューロン（すなわち、対照細胞）を培養し、神経突起長、凝集化したTDP-43タンパク量、又はGPR50の発現量を測定する工程、
（４）前記被験物質と接触させた上位運動ニューロンの神経突起長、もしくはGPR50の発現量が対照細胞の該値よりも高値である被験物質、又は、前記被験物質と接触させた上位運動ニューロンにおける凝集化したTDP-43タンパク量が対照細胞の該値よりも低値である被験物質を、筋萎縮性側索硬化症の予防又は治療薬として選択する工程。The screening method may be, for example, a method including the following steps (1)-(4).
(1) A step of expressing exotic Ngn2 and Fezl in induced pluripotent stem cells derived from familial ALS patients and culturing them to produce upper motor neurons from the pluripotent stem cells.
(2) The step of bringing the upper motor neuron obtained in (1) into contact with the test substance,
(3) The upper motor neurons that were contacted with the test substance in (2) and the upper motor neurons that were not contacted (that is, control cells) were cultured, and the neurite length, aggregated TDP-43 protein amount, or GPR50. Step of measuring the expression level of
(4) In a test substance in which the nerve protrusion length of the upper motor neuron in contact with the test substance or the expression level of GPR50 is higher than the value in the control cell, or in the upper motor neuron in contact with the test substance. A step of selecting a test substance having an aggregated TDP-43 protein amount lower than that of a control cell as a prophylactic or therapeutic agent for amyotrophic lateral sclerosis.

＜被験物質＞
本発明のスクリーニング方法に供される被験物質としては、例えば、タンパク質、ペプチド、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、合成低分子化合物、天然化合物、細胞抽出物、植物抽出物、動物組織抽出物、血漿、海洋生物由来の抽出物、細胞培養上清、及び微生物発酵産物等が挙げられる。これらの物質は新規なもの、公知なもののいずれでもよい。<Test substance>
The test substances used in the screening method of the present invention include, for example, proteins, peptides, antibodies, non-peptide compounds, synthetic compounds, synthetic low molecular weight compounds, natural compounds, cell extracts, plant extracts, and animal tissue extracts. , Plasma, extracts from marine organisms, cell culture supernatants, microbial fermented products and the like. These substances may be new or known.

本発明において、上位運動ニューロンと被験物質との接触は、上位運動ニューロンを含む培養系の培養液に被験物質を添加して行うことができる。当該接触させる期間は、前記指標の変化が確認できる期間であれば特に限定されないが、例えば、１日以上、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上、７日以上であってよく、より好ましくは２日間である。接触期間の終了は、例えば、当該培地を被験物質を含まない培地に交換することで行うことができる。添加する被験物質の濃度は、化合物の種類（溶解性、毒性等）によって適宜調節可能である。 In the present invention, the contact between the upper motor neuron and the test substance can be performed by adding the test substance to the culture medium of the culture system containing the upper motor neuron. The contact period is not particularly limited as long as the change in the index can be confirmed, but for example, 1 day or more, 2 days or more, 3 days or more, 4 days or more, 5 days or more, 6 days or more, 7 days. The above may be sufficient, and more preferably 2 days. The end of the contact period can be achieved, for example, by exchanging the medium with a medium containing no test substance. The concentration of the test substance to be added can be appropriately adjusted depending on the type of the compound (solubility, toxicity, etc.).

＜予防及又は治療薬の選択＞
本発明に係るスクリーニング方法では、上位運動ニューロンの神経突起長、凝集化したTDP-43タンパク量、及びGPR50の発現量から選ばれる１以上の値を指標として、被験物質を選別してもよい。具体的には、前記被験物質と接触させた上位運動ニューロンにおける神経突起長又はGPR50発現量の値が被験物質と接触させなかった上位運動ニューロン（対照細胞）の該値よりも高い場合、又は、前記被験物質と接触させた上位運動ニューロンにおける凝集化したTDP-43タンパク量の値が対照細胞の該値よりも低い場合に、当該被験物質をALSの予防又は治療薬として選択することができる。なお、本発明における予防及び／又は治療薬は、シード化合物となるものも含めた意である。<Selection of preventive or therapeutic drugs>
In the screening method according to the present invention, a test substance may be selected using a value of 1 or more selected from the neurite length of upper motor neurons, the amount of aggregated TDP-43 protein, and the expression level of GPR50 as an index. Specifically, when the value of the nerve protrusion length or GPR50 expression level in the upper motor neuron contacted with the test substance is higher than the value in the upper motor neuron (control cell) not contacted with the test substance, or When the value of aggregated TDP-43 protein in the upper motor neurons contacted with the test substance is lower than that in the control cell, the test substance can be selected as a prophylactic or therapeutic agent for ALS. The preventive and / or therapeutic agent in the present invention is intended to include those that serve as seed compounds.

神経突起の伸展不良は、これまで作製された多くの神経変性疾患モデルにおいて、障害されるニューロンに共通してみられる性質である。そのため、神経突起の伸展不良は、ニューロンの脆弱性の指標として広く用いられている。
TDP-43タンパクは、健常人では主に核内に局在するが、ALS患者では核から細胞質に移行して（細胞質で）凝集することが知られており、当該移行と凝集体の形成がALS発症に深く関わると考えられている。
GPR50の発現量がALS患者で有意に低下することは、本願において初めて明らかにされたことである。Poor neurite outgrowth is a common property of impaired neurons in many neurodegenerative disease models created so far. Therefore, poor neurite outgrowth is widely used as an indicator of neuronal vulnerability.
The TDP-43 protein is mainly localized in the nucleus in healthy subjects, but it is known that in ALS patients, it translocates from the nucleus to the cytoplasm and aggregates (in the cytoplasm), and the translocation and the formation of aggregates occur. It is thought to be deeply involved in the onset of ALS.
It is the first time in this application that the expression level of GPR50 is significantly reduced in ALS patients.

前記神経突起長の計測は、当業者に周知の方法を用いて行うことができ、例えば、細胞画像解析装置（インセルアナライザー）を用いて自動的に計測してもよい。また、前記凝集化したTDP-43タンパク量も当業者に周知の方法を用いて測定することができ、例えば、DAPI核染色とTDP-43に対する免疫染色を行い、DAPI核染色のシグナルとマージしないTDP-43シグナル量として、細胞画像解析装置を用いて自動的に計測してもよい。さらに、前記GPR50発現量も当業者に周知の方法を用いて測定することができ、例えば、蛍光標識されたプローブを用いたin situ hybridizationを行い、該シグナルを細胞画像解析装置を用いて自動的に計測する方法等が挙げられる。 The neurite length can be measured by a method well known to those skilled in the art, and may be automatically measured by using, for example, a cell image analyzer (incell analyzer). The amount of aggregated TDP-43 protein can also be measured using a method well known to those skilled in the art, for example, DAPI nuclear staining and immunostaining for TDP-43 are performed without merging with the signal of DAPI nuclear staining. The amount of TDP-43 signal may be automatically measured using a cell image analyzer. Furthermore, the GPR50 expression level can also be measured by a method well known to those skilled in the art, for example, in situ hybridization using a fluorescently labeled probe is performed, and the signal is automatically transmitted using a cell image analyzer. The method of measurement and the like can be mentioned.

本発明においては、前記被験物質と接触させた上位運動ニューロンの指標の値が、対照細胞の該値と比べて、1.5倍以上、1.6倍以上、1.7倍以上、1.8倍以上、1.9倍以上、2倍以上、2.5倍以上又は3倍以上である場合に“高値”と判断してもよい。また、前記被験物質と接触させた上位運動ニューロンの指標の値が、対照細胞の該値と比べて、80％、70％、60％、50％、又は40％以下である場合に“低値”と判断してもよい。なお、本発明における前記対照細胞には、有効性がないことが確認されている薬剤と接触させた上位運動神経細胞も含まれる。 In the present invention, the index value of the upper motor neuron in contact with the test substance is 1.5 times or more, 1.6 times or more, 1.7 times or more, 1.8 times or more, 1.9 times or more, as compared with the value of the control cell. If it is 2 times or more, 2.5 times or more, or 3 times or more, it may be judged as "high price". Further, when the value of the index of the upper motor neuron contacted with the test substance is 80%, 70%, 60%, 50%, or 40% or less of the value of the control cell, it is "low value". You may judge. The control cells in the present invention also include upper motor neurons that have been contacted with a drug that has been confirmed to be ineffective.

以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。最初に、下記実施例で用いた材料及び基本的な実験手法について説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but it goes without saying that the present invention is not limited thereto. First, the materials and basic experimental methods used in the following examples will be described.

＜ヒトiPS細胞株＞
以下の実施例では、特に断りがない限り、ヒトiPS細胞として、京都大学iPS細胞研究所の山中伸弥博士より分与された201B7株を用いた（Takahashi K, et al, Cell, 131:861-72, 2007）。201B7株は健常者より樹立されたiPS細胞株で、理化学研究所バイオリソースセンター細胞開発材料室からも入手可能である（寄託番号HPS0063）。また、TDP-43遺伝子にG298S変異を有する家族性ALS患者より樹立したiPS細胞株（実施例３で使用）は、米国コリエル インスティチュートから入手したND32947E18株を用いた。<Human iPS cell line>
In the following examples, unless otherwise specified, the 201B7 strain distributed by Dr. Shinya Yamanaka of the Center for iPS Cell Research and Application, Kyoto University was used as human iPS cells (Takahashi K, et al, Cell, 131: 861-). 72, 2007). The 201B7 strain is an iPS cell line established by healthy subjects and is also available from the Cell Development Materials Office, RIKEN BioResource Center (deposit number HPS0063). As the iPS cell line (used in Example 3) established from a familial ALS patient having a G298S mutation in the TDP-43 gene, the ND32947E18 strain obtained from the Coriel Institute in the United States was used.

＜外来性核酸＞
以下の実施例では、外来性遺伝子として下記のマウスcDNAを用いた；
Ngn2（NM_009718）、Fezl（NM_080433）、Brn2（NM_008899）、Ascl1（NM_008553）、Myt1l（NM_001093775）、Lhx3（NM_001039653）、Isl1（NM_021459AC）。<Foreign nucleic acid>
In the following examples, the following mouse cDNA was used as the exogenous gene;
Ngn2 (NM_009718), Fezl (NM_080433), Brn2 (NM_008899), Ascl1 (NM_008553), Myt1l (NM_001093775), Lhx3 (NM_001039653), Isl1 (NM_021459AC).

＜手法１：多能性幹細胞の培養と外来遺伝子の発現誘導＞
ヒト由来NF安定導入株は、Accutase（Innovative Cell Technologies社）処理によって単一細胞に解離させた後、matrigel（BD Biosciences社製）でコートされたプラスチックプレート、又は、アストロサイトが培養されたプラスチックプレートに、約2×105 cell/wellの細胞密度で播種した。使用した培地は、神経分化用培地（1% N2 supplement（Invitrogen社）、2% B27 supplement（Invitrogen社）、10ng/ml BDNF（R&D Systems社）、10ng/ml GDNF（R&D Systems社）、及び10ng/ml NT3（R&D Systems社）が添加された、DMEM/F12培地とNeurobasal Medium培地の混合培地（混合体積比は１：１、いずれもLife Technologies社）である。なお、前記アストロサイトは生後1日目の野生型マウス（C57BL/6J）の大脳皮質より文献（Jacquier A., et al, Hum. Mol. Genet., 18:2127-2139, 2009）に記載の方法で調製し、10日間培養して単層（フィーダー層）にした。
翌日、培地を1μg/ml DOX（Clontech社）を添加した神経分化用培地（以降、DOX含有培地と呼ぶ）に置換して、当該外来性遺伝子の発現を誘導した。その後は、2日置きに培地を半量ずつ交換した。<Method 1: Culture of pluripotent stem cells and induction of expression of foreign genes>
Human-derived NF stable-introduced strains are dissociated into single cells by Accutase (Innovative Cell Technologies) treatment and then coated with matrigel (BD Biosciences) or a plastic plate in which astrocytes are cultured. Was seeded at a cell density of about 2 × 10 5 cell / well. The media used were nerve differentiation medium (1% N2 supplement (Invitrogen), 2% B27 supplement (Invitrogen), 10ng / ml BDNF (R & D Systems), 10ng / ml GDNF (R & D Systems), and 10ng. It is a mixed medium of DMEM / F12 medium and Neurobasal Medium medium to which / ml NT3 (R & D Systems) is added (mixed volume ratio is 1: 1, both are Life Technologies). The astrosite is 1 after birth. Prepared from the cerebral cortex of day wild mice (C57BL / 6J) by the method described in the literature (Jacquier A., et al, Hum. Mol. Genet., 18: 2127-2139, 2009) and cultured for 10 days. And made it a single layer (feeder layer).
The next day, the medium was replaced with a medium for neural differentiation (hereinafter referred to as DOX-containing medium) supplemented with 1 μg / ml DOX (Clontech) to induce the expression of the foreign gene. After that, the medium was changed by half every two days.

［比較例１］多能性幹細胞に導入する遺伝子の検討（１）
胎生期の大脳皮質の神経発生では、脳室帯で神経幹細胞が***と分化を繰り返してニューロン（厳密には、ニューロンへと分化が方向付けられた細胞）を生じ、該ニューロンは将来の定住場所に向かって移動しながら特定のサブタイプのニューロンへと分化する。前記ニューロンへの分化の方向付けにはNgn2又はAscl1の発現が重要であり、その後様々な転写因子が連続して協調的に働くことでサブタイプが決定すると考えられている（非特許文献１０）。
これまでの研究により、Ngn2を多能性幹細胞に単独で導入・発現させると、ほぼすべての細胞が大脳皮質第2及び3層のグルタミン酸作動性ニューロンへと分化し（非特許文献３）、Ascl1を単独で導入・発現させると、グルタミン酸作動性ニューロンだけでなく、GABA作動性ニューロンを含むさまざまなサブタイプのニューロンを生じることが報告されている（非特許文献１１）。そこで、Ascl1の単独発現によって得られる細胞集団の中に上位運動ニューロンが含まれていることを期待して、KH2株（正常マウスES細胞株）及び201B7株にAscl1をコードする核酸を導入・発現させて、得られた細胞を免疫染色法を用いて解析した。しかしながら、各々の細胞株について約200,000個の細胞を解析しても、前記上位運動ニューロンの定義を満たす細胞は見出されなかった（データは非開示）。[Comparative Example 1] Examination of genes to be introduced into pluripotent stem cells (1)
During embryonic cerebral cortex neurogenesis, neural stem cells divide and differentiate repeatedly in the ventricular zone to give rise to neurons (strictly speaking, cells whose differentiation is directed to neurons), which are the future settlement sites. It differentiates into specific subtypes of neurons as it moves toward. It is considered that the expression of Ngn2 or Ascl1 is important for the direction of differentiation into neurons, and then the subtype is determined by the continuous and cooperative action of various transcription factors (Non-Patent Document 10). ..
According to previous studies, when Ngn2 was introduced and expressed alone in pluripotent stem cells, almost all cells differentiated into glutamate-operated neurons in the second and third layers of the cerebral cortex (Non-Patent Document 3), and Ascl1 It has been reported that when is introduced and expressed alone, not only glutamate-operated neurons but also various subtypes of neurons including GABAergic neurons are produced (Non-Patent Document 11). Therefore, with the expectation that upper motor neurons are included in the cell population obtained by the sole expression of Ascl1, the nucleic acid encoding Ascl1 was introduced and expressed in the KH2 strain (normal mouse ES cell line) and the 201B7 strain. The resulting cells were analyzed using immunostaining. However, analysis of about 200,000 cells for each cell line did not find any cells that met the definition of upper motor neurons (data not disclosed).

Neuronal induction法は2009年に最初の成功例が報告された新しい手法であり、その実績はまだ非常に少ない。現時点において、Neuronal induction法によって大脳皮質を構成するニューロンを分化誘導した例は、前述した非特許文献３、１２、特許文献１の他には、Brn2、Ascl1、Myt1lの3遺伝子（合わせて“BAM因子”と呼ばれている）を導入・発現させた例（例として、非特許文献１３）、前記BAM因子にNueroD1を追加して導入・発現させた例（非特許文献１４）、Ascl1、Myt1l、NeuroD、miR-9/9、及びmiR-124を導入・発現させた例（非特許文献１５）に代表される。
そこで、多能性幹細胞にBAM因子を導入・発現させて得られるニューロンのなかに、上位運動ニューロンが含まれるかどうかを解析した。The Neuronal induction method is a new method for which the first successful case was reported in 2009, and its achievements are still very few. At present, examples of inducing differentiation of neurons constituting the cerebral cortex by the Neuronal induction method include the above-mentioned Non-Patent Documents 3 and 12 and Patent Document 1, as well as the three genes Brn2, Ascl1, and Myt1l (collectively, "BAM". An example in which (called a factor) is introduced / expressed (for example, Non-Patent Document 13), an example in which NueroD1 is added to the BAM factor and introduced / expressed (Non-Patent Document 14), Ascl1, Myt1l. , NeuroD, miR-9 / 9, and miR-124 are introduced and expressed (Non-Patent Document 15).
Therefore, we analyzed whether upper motor neurons are included in the neurons obtained by introducing and expressing BAM factors in pluripotent stem cells.

＜BAM発現ベクターの作製＞
pDEST31発現ベクター（Invitrogen Life Technologies社製）をベースとして、Brn2、Ascl1、及びMyt1lをコードする核酸が2A配列を介して連結され、その下流にIRES配列を介してmCherryをコードする核酸が連結された核酸が、テトラサイクリン応答性プロモーターに機能的に接合された発現カセット（以降、BAM発現カセットと呼ぶ）を含むベクター（以降、BAM発現ベクターと呼ぶ）を作製した。よって、当該発現カセットからは、テトラサイクリン又はその誘導体に応答して、Brn2、Ascl1、Myt1l、及びmCherryがポリシストロニックに発現する。なお、前記BAM発現ベクターにおいて、前記BAM発現カセットは2つのFrt配列の間に挿入されている。<Preparation of BAM expression vector>
Based on the pDEST31 expression vector (manufactured by Invitrogen Life Technologies), the nucleic acids encoding Brn2, Ascl1, and Myt1l were ligated via the 2A sequence, and the nucleic acid encoding mCherry was ligated downstream thereof via the IRES sequence. A vector (hereinafter referred to as a BAM expression vector) containing an expression cassette (hereinafter referred to as a BAM expression cassette) in which the nucleic acid was functionally conjugated to a tetracycline-responsive promoter was prepared. Thus, Brn2, Ascl1, Myt1l, and mCherry are polycistronically expressed from the expression cassette in response to tetracyclines or their derivatives. In the BAM expression vector, the BAM expression cassette is inserted between two Frt sequences.

＜BAM安定導入株の作製と解析＞
前記BAM発現ベクターをflipaseをコードする核酸とともに、エレクトロポレーション法を用いてKH2株に導入した。KH2株は、ColA1座の下流にFrt配列を有し、内在性のR26プロモーターの制御下でリバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子であるM2rtTAを発現するマウスES細胞株である（Beard C, et al., Genesis 2006;44:23-28）。前記導入細胞に対して薬剤セレクションを行い、前記BAM発現カセットが染色体に挿入された細胞を選別して株化した。当該株化細胞に対して免疫染色を行い、未分化細胞のマーカー遺伝子（NANOG及びSSEA1）の発現を維持している細胞株をさらに選別して、クローン１及びクローン８を得た。<Preparation and analysis of BAM stable introduction strain>
The BAM expression vector was introduced into the KH2 strain using an electroporation method together with a nucleic acid encoding flipase. The KH2 strain is a mouse ES cell line that has a Frt sequence downstream of the ColA1 locus and expresses M2rtTA, a reverse tetracycline-regulated transactivator, under the control of the endogenous R26 promoter (Beard C, et al). ., Genesis 2006; 44: 23-28). Drug selection was performed on the introduced cells, and cells into which the BAM expression cassette was inserted into the chromosome were selected and established. The cell lines were immunostained, and cell lines that maintained the expression of marker genes (NANOG and SSEA1) in undifferentiated cells were further selected to obtain clone 1 and clone 8.

前記クローン１及び８を0.25% trypsinを用いて単一細胞に解離させた後、matrigel-coatedプラスチックプレート上に播種した。翌日、培地をDOX含有培地に置換して、BAM因子の発現を誘導した。誘導開始から72時後に、β-III tubulinに対する免疫染色を行った結果を図１に示す。前記ニューロンの定義を満たす細胞は観察されたが、前記上位運動ニューロンの定義を満たす細胞は見出されなかった（約20,000細胞の解析結果）。 The clones 1 and 8 were dissociated into single cells using 0.25% trypsin and then seeded on a matrigel-coated plastic plate. The next day, the medium was replaced with a DOX-containing medium to induce the expression of BAM factor. FIG. 1 shows the results of immunostaining for β-III tubulin 72 o'clock after the start of induction. Although cells satisfying the definition of the above neurons were observed, no cells satisfying the definition of the upper motor neurons were found (analysis results of about 20,000 cells).

よって、BAM因子を多能性幹細胞に導入し発現させても、上位運動ニューロンはほとんど生じないことが確認された。すなわち、これまで知られているNeuronal induction法では、上位運動ニューロンは実質的に分化誘導されないことが明らかとなった。 Therefore, it was confirmed that even if BAM factor is introduced into pluripotent stem cells and expressed, upper motor neurons are hardly generated. That is, it was clarified that the upper motor neurons were not substantially induced to differentiate by the previously known Neuronal induction method.

［実施例１］多能性幹細胞に導入する遺伝子の検討（２）
これまで、主にマウスを用いた解析により、サブタイプ決定期に上位運動ニューロンの細胞系譜（将来上位運動ニューロンになる細胞）で発現する遺伝子が多数同定されている。なかでも、非特許文献９では、2種類の錐体細胞（皮質第5層に存在し、右脳に投射するCallosal projection neuron、及び、視覚野に存在し、視蓋前域に投射するCorticotectal projection neuron）をコントロールとした詳細な解析を行い、サブタイプ決定期の初期にはSox5、Ctip2、Clim1等、中期にはCrim1、mu-crystallin等、後期にはencephalopsin、csmn1、cadherin22、pcp4、netrin-G1等の遺伝子が上位運動ニューロンの細胞系譜で有意に発現上昇することを報告している。さらに、発生期を通して上位運動ニューロンで発現する遺伝子として、fezl、cadherin13等を、また、Callosal projection neuronとの比較において上位運動ニューロンの細胞系譜に特異的な遺伝子として、lgfbp4、diap3、S100a10等を報告している。なお、fezl及びcadherin13は、上位運動ニューロンに限らず、皮質第5層に存在する他の皮質下投射ニューロン（例として、Corticotectal projection neuron）でも発現することが知られている（非特許文献１０）。[Example 1] Examination of genes to be introduced into pluripotent stem cells (2)
So far, many genes expressed in the cell lineage of upper motor neurons (cells that will become upper motor neurons in the future) have been identified by analysis mainly using mice. Among them, in Non-Patent Document 9, two types of pyramidal cells (Callosal projection neuron existing in the 5th layer of the cortex and projecting to the right brain, and Corticotectal projection neuron existing in the visual cortex and projecting to the pretectal area). ) Is used as a control for detailed analysis, sox5, Ctip2, Clim1, etc. in the early stage of subtype determination, Crim1, mu-crystallin, etc. in the middle stage, encephalopsin, csmn1, cadherin22, pcp4, netrin-G1 in the latter stage. It has been reported that genes such as these are significantly upregulated in the cell lineage of upper motor neurons. Furthermore, we report fezl, cadherin13, etc. as genes expressed in upper motor neurons throughout the developmental stage, and lgfbp4, diap3, S100a10, etc. as genes specific to the cell lineage of upper motor neurons in comparison with Callosal projection neurons. is doing. It is known that fezl and cadherin 13 are expressed not only in upper motor neurons but also in other subcortical projection neurons (for example, Corticotectal projection neurons) existing in the 5th layer of the cortex (Non-Patent Document 10). ..

本発明者は、サブタイプ決定期の上位運動ニューロンで発現することが報告された上記遺伝子について検討を行った。そして、意外にも、Ngn2とFezlを組み合わせた場合に、多能性幹細胞を錐体細胞に高効率で分化誘導できることを見出した。以下に、用いた解析手法を説明する。 The present inventor investigated the above genes reported to be expressed in upper motor neurons in the subtyping phase. Surprisingly, they found that pluripotent stem cells can be highly efficiently induced to differentiate into pyramidal cells when Ngn2 and Fezl are combined. The analysis method used will be described below.

＜NF発現ベクターの作製＞
PB-TAC-ERNベクター（Tanaka A., et al, PLoS One, 8:e61540, 2013参照）をベースとして、Ngn2をコードする核酸とFezlをコードする核酸が2A配列を介して連結され、下流にIRES配列を介してmCherryをコードする核酸が連結された核酸が、テトラサイクリン応答性プロモーターに機能的に接合された発現カセット（以降、NF発現カセットと呼ぶ）を含むベクター（以降、NF発現ベクターと呼ぶ）を作製した（特許文献１参照）。前記NF発現カセットからは、テトラサイクリン又はその誘導体に応答して、Ngn2、Fezl、及びmCherryがポリシストロニックに発現する。さらに、前記NF発現ベクターはrtTA-NeoR発現カセット（＝EF1αプロモーターの制御下にrtTAとneomycin耐性遺伝子をポリシストロニックに発現する発現カセット）を有し、前記NF発現カセットとrtTA－NeoR発現カセットからなる2つの発現カセットの前後にpiggyBacトランスポゾンの逆向き反復配列を有している。
コントロールとして、前記NF発現カセットからNgn2をコードする核酸が欠失したベクター（以降、F発現ベクターと呼ぶ）も作製した。当該F発現ベクターからは、テトラサイクリン又はその誘導体に応答して、Fezl及びmCherryがポリシストロニックに発現する。<Preparation of NF expression vector>
Based on the PB-TAC-ERN vector (see Tanaka A., et al, PLoS One, 8: e61540, 2013), the nucleic acid encoding Ngn2 and the nucleic acid encoding Fezl are linked via the 2A sequence and downstream. A vector (hereinafter referred to as NF expression vector) containing an expression cassette (hereinafter referred to as NF expression cassette) in which a nucleic acid encoding mCherry is ligated via an IRES sequence is functionally conjugated to a tetracycline-responsive promoter. ) (See Patent Document 1). From the NF expression cassette, Ngn2, Fezl, and mCherry are polycistronically expressed in response to tetracycline or its derivatives. Furthermore, the NF expression vector has an rtTA-NeoR expression cassette (= an expression cassette that polycistronically expresses rtTA and neomycin resistance genes under the control of the EF1α promoter), and is derived from the NF expression cassette and the rtTA-NeoR expression cassette. It has a reverse repeat sequence of piggyBac transposon before and after the two expression cassettes.
As a control, a vector lacking the nucleic acid encoding Ngn2 (hereinafter referred to as F expression vector) was also prepared from the NF expression cassette. From the F expression vector, Fezl and mCherry are polycistronically expressed in response to tetracycline or its derivatives.

＜NF安定導入株の作製＞
前記NF発現ベクターを、piggyBacトランスポゼースをコードする核酸とともに、エレクトロポレーション法を用いて201B7株に導入した。その後、neomycin（50μg/ml）を含む培地で培養して、前記２つの発現カセットが染色体に挿入された細胞を選別し、株化した。さらに、前記株化細胞に対して免疫染色を行い、未分化細胞のマーカー遺伝子（NANOG及びSSEA1）の発現を維持している細胞株（以降、NF安定導入株と呼ぶ）を選別した。
また、前記F発現ベクターについても、同じ手法を用いて安定導入株（以降、F安定導入株と呼ぶ）を作製した。<Preparation of NF stable introduction strain>
The NF expression vector was introduced into the 201B7 strain using the electroporation method together with the nucleic acid encoding piggyBac transposase. Then, the cells were cultured in a medium containing neomycin (50 μg / ml), and the cells in which the two expression cassettes were inserted into the chromosomes were selected and established. Furthermore, immunostaining was performed on the strained cells, and cell lines (hereinafter referred to as NF stable introduction strains) maintaining the expression of marker genes (NANOG and SSEA1) of undifferentiated cells were selected.
For the F expression vector, a stable introduction strain (hereinafter referred to as F stable introduction strain) was prepared by using the same method.

＜NF安定導入株の解析＞
（１）免疫学的解析
前記NF安定導入株を前記手法１に従ってアストロサイトのフィーダー層上に播種し、翌日、外来性Ngn2及びFezlの発現を誘導した（図２B）。発現誘導から7日後の細胞に対し、β-III tubulinに対するTuji抗体と、ヒト特異的Nuc抗体（←hNuc抗体とは何でしょうか？）で二重免疫染色した結果を図２Aに示す。ほぼ全てのhNuc陽性細胞（すなわち、ヒト細胞）において、β-III tubulinの発現が認められた。当該β-III tubulin陽性細胞では細胞体が肥厚して神経突起が長く伸展しており、典型的なニューロンの形態を呈していた。
よって、NF安定導入株において外来性Ngn2及びFezlの発現を誘導すると、約7日後にはほぼすべての細胞がニューロンに分化することが明らかとなった。<Analysis of NF stable introduction strain>
(1) Immunological analysis The NF stable-introduced strain was seeded on the feeder layer of astrocytes according to the method 1 and the expression of exogenous Ngn2 and Fezl was induced the next day (FIG. 2B). Figure 2A shows the results of double immunostaining of cells 7 days after the induction of expression with Tuji antibody against β-III tubulin and human-specific Nuc antibody (← What is hNuc antibody?). Expression of β-III tubulin was observed in almost all hNuc-positive cells (that is, human cells). In the β-III tubulin-positive cells, the cell body was thickened and the neurites were elongated, showing a typical neuronal morphology.
Therefore, it was clarified that when the expression of exogenous Ngn2 and Fezl was induced in the NF stable-introduced strain, almost all cells differentiated into neurons after about 7 days.

次に、β-III tubulinとCaMKIIに対する免疫染色、及び、DAPIによる核染色を行った（図２C）。図２Cの右パネルは、β-III tubulinのシグナル（赤色）、CaMKIIAのシグナル（緑色）、及びのDAPI核染色のシグナル（青色）をマージさせたイメージである。β-III tubulin陽性細胞の約80％は、CaMKII陽性であった。
よって、NF安定導入株から外来性Ngn2及びFezlの発現により分化したニューロンの約80％は、錐体細胞であることが明らかとなった。Next, immunostaining for β-III tubulin and CaMKII and nuclear staining with DAPI were performed (Fig. 2C). The right panel of FIG. 2C is an image in which the β-III tubulin signal (red), the CaMKIIA signal (green), and the DAPI nuclear staining signal (blue) are merged. About 80% of β-III tubulin-positive cells were CaMKII-positive.
Therefore, it was clarified that about 80% of the neurons differentiated by the expression of exogenous Ngn2 and Fezl from the NF stable introduction strain are pyramidal cells.

さらに、前記F安定導入株についても、外来性Fezlの発現を誘導し、7日後に同様の解析を行った。しかしながら、F安定導入株では、β-III tubulin、CaMKIIいずれの発現も確認されず、細胞体は扁平なままで、突起伸展も観察されなかった（図2Dの右パネル）。 Furthermore, the expression of exogenous Fezl was also induced in the F stable-introduced strain, and the same analysis was performed 7 days later. However, in the F stable introduction strain, neither β-III tubulin nor CaMKII expression was confirmed, the cell body remained flat, and no protrusion extension was observed (right panel in Fig. 2D).

以上より、多能性幹細胞にNgn2とFezlを導入して発現させると、7日後には約80％の細胞が錐体細胞に分化するが、Fezlのみを発現させてもニューロンに分化誘導されないことが示された。 Based on the above, when Ngn2 and Fezl are introduced into pluripotent stem cells and expressed, about 80% of the cells differentiate into pyramidal cells after 7 days, but expression of Fezl alone does not induce differentiation into neurons. It has been shown.

（２）電気生理学的解析
発現誘導から7日後のNF安定導入株に対し、全細胞パッチクランプ法を用いてニューロンとしての機能的な成熟度を解析した。典型的な測定結果を図３Aに示す。測定した全ての細胞において、Na/K電流及び活動電位が観察されたが、シナプス電流は観察されなかった。よって、発現誘導から7日後のNF安定導入株では、電位依存性Naチャネル及びKチャネルが発現して活動電位を生じることができるが、シナプスはまだ形成していないことがわかった。
次に、発現誘導から21日後のNF安定導入株に対して同じ解析を行った。その結果、測定したすべての細胞において、活動電位とシナプス電流が記録された（図３B）。(2) Electrophysiological analysis The functional maturity of neurons was analyzed using the whole cell patch clamp method for NF stable-introduced strains 7 days after the induction of expression. Typical measurement results are shown in FIG. 3A. Na / K currents and action potentials were observed in all measured cells, but no synaptic currents were observed. Therefore, it was found that in the NF stable introduction strain 7 days after the induction of expression, voltage-gated Na channels and K channels could be expressed to generate action potentials, but synapses were not yet formed.
Next, the same analysis was performed on the NF stable-introduced strain 21 days after the induction of expression. As a result, action potentials and synaptic currents were recorded in all measured cells (Fig. 3B).

以上の結果より、多能性幹細胞にNgn2とFezlを導入して発現させると、約80％の細胞が錐体細胞へと分化誘導され、21日後には機能的に成熟した錐体細胞になることが示された。 From the above results, when Ngn2 and Fezl are introduced into pluripotent stem cells and expressed, about 80% of the cells are induced to differentiate into pyramidal cells, and after 21 days, they become functionally mature pyramidal cells. Was shown.

［実施例２］分化誘導されたニューロンのサブタイプ解析
外来性Ngn2とFezlの発現によって多能性幹細胞から分化誘導されるニューロンのサブタイプを解析した。
（１）大脳皮質第5層及び運動野のマーカー遺伝子の発現解析
前記NF安定導入株を前記手法１に従ってmatrigel-coatedプラスチックプレート上に播種し、翌日外来性Ngn2及びFezlの発現を誘導した。発現誘導から7日後の細胞を回収してRNAを抽出し、real-time PCR法を用いて種々の遺伝子の発現量を解析した。結果を図４に示す。分化誘導した細胞（DOX＋）では、分化誘導しなかったコントロール細胞（DOX不含培地で７日間培養した細胞；DOX－）と比べて、錐体細胞のマーカー遺伝子（OTX1及びCaMKII）、大脳皮質第5層のマーカー遺伝子（Ctip2、TLE4、ER81、及びSox5）、及び前頭野のマーカー遺伝子（SPGAP1、Robo1、及びPCDH17）の発現がいずれも大幅に増加していた。さらに、運動野のマーカー遺伝子（Crim1、Diap3、Igfbp4）のうち、Crim1とDiap3の発現が大幅に増加し、Igfbp4の発現も僅かながら増加していた（図３）。[Example 2] Subtype analysis of differentiation-induced neurons We analyzed the subtypes of neurons that are induced to differentiate from pluripotent stem cells by the expression of exogenous Ngn2 and Fezl.
(1) Expression analysis of marker genes in the 5th layer of the cerebral cortex and the motor cortex The NF stable-introduced strain was seeded on a matrigel-coated plastic plate according to the above method 1 to induce the expression of exogenous Ngn2 and Fezl the next day. After 7 days from the induction of expression, cells were collected, RNA was extracted, and the expression levels of various genes were analyzed using the real-time PCR method. The results are shown in FIG. In the differentiation-induced cells (DOX +), the marker genes (OTX1 and CaMKII) of pyramidal cells and the cerebral cortex number were compared with the control cells (cells cultured for 7 days in a DOX-free medium; DOX-) that did not induce differentiation. Expression of the five-layer marker genes (Ctip2, TLE4, ER81, and Sox5) and the frontal area marker genes (SPGAP1, Robo1, and PCDH17) were all significantly increased. Furthermore, among the marker genes (Crim1, Diap3, Igfbp4) in the motor cortex, the expression of Crim1 and Diap3 was significantly increased, and the expression of Igfbp4 was also slightly increased (Fig. 3).

よって、当該細胞集団には、上位運動ニューロンに分化した細胞が含まれていることが示唆された。特に、上位運動ニューロンへのサブタイプ決定期の初期に発現することが知られるSox5、及びCtip2の発現が非常に高いことから、上位運動ニューロンへの分化成熟途上にある細胞が多く含まれることが強く示唆された。 Therefore, it was suggested that the cell population contained cells differentiated into upper motor neurons. In particular, since the expression of Sox5 and Ctip2, which are known to be expressed in the early stage of subtyping of upper motor neurons, is very high, many cells in the process of differentiation and maturation into upper motor neurons may be contained. It was strongly suggested.

続いて、発現誘導から21日後のNF安定導入株からRNAを抽出して、Crim1（運動野マーカー）とCaMKII（錐体細胞マーカー）の発現量を解析した。分化誘導しなかった細胞（DOX－）と比べて、分化誘導した細胞（DOX＋）では、Crim1のmRNA量が約2.8倍、CaMKIIのmRNA量は約149倍に増加していた（図５A）。
さらに、発現誘導から21日後の細胞に対し、Crim1とβ-III tubulin（図５B）、及びCaMKIIとβ-III tubulin（図５C）に対する二重免疫染色を行った。図５B及び図５Cにおいて、β-III tubulin陽性細胞はいずれも肥厚した細胞体と長い神経突起を有しており、ニューロンに分化したことがわかる。そして、図５Cではβ-III tubulin陽性細胞のほぼすべてがCaMKII陽性であることから、ニューロンに分化した細胞のほぼすべてが錐体細胞であることが確認された。これに対し、図５Bでは、β-III tubulin陽性細胞の一部（約20％）がCrim1陽性であり、該二重陽性細胞の細胞体の直径はいずれも15μm以上であった（図５B）。さらに、前記Crim1陽性細胞は、Ctip2（第5層マーカー）で免疫染色した場合にもすべて陽性であった（データは非開示）。Subsequently, RNA was extracted from the NF stable introduction strain 21 days after the induction of expression, and the expression levels of Crim1 (motor field marker) and CaMKII (pyramidal cell marker) were analyzed. Compared with the cells that did not induce differentiation (DOX-), the amount of mRNA of Crim1 increased about 2.8 times and that of CaMKII increased about 149 times in the cells that induced differentiation (DOX +) (Fig. 5A).
Furthermore, cells 21 days after the induction of expression were subjected to double immunostaining for Crim1 and β-III tubulin (Fig. 5B) and CaMKII and β-III tubulin (Fig. 5C). In FIGS. 5B and 5C, it can be seen that the β-III tubulin-positive cells both had thickened cell bodies and long neurites, and differentiated into neurons. In FIG. 5C, almost all β-III tubulin-positive cells were CaMKII-positive, confirming that almost all the cells differentiated into neurons were pyramidal cells. In contrast, in FIG. 5B, some β-III tubulin-positive cells (about 20%) were Crim1-positive, and the diameters of the cell bodies of the double-positive cells were all 15 μm or more (FIG. 5B). .. Furthermore, the Crim1-positive cells were all positive when immunostained with Ctip2 (layer 5 marker) (data not disclosed).

よって、NF安定導入株からNgn2及びFezlの発現によって分化した錐体細胞の一部（約20％）は、上位運動ニューロンであることが明らかとなった。 Therefore, it was clarified that some of the pyramidal cells (about 20%) differentiated by the expression of Ngn2 and Fezl from the NF stable introduction strain are upper motor neurons.

（２）下位運動ニューロンとのシナプス形成能の解析
前記上位運動ニューロンの機能的な成熟度を調べるために、下位運動ニューロンとのシナプス形成能を解析した。
＜LNI安定導入株の改変＞
下位運動ニューロンのリソースとして、本発明者が特許文献１において作製した“MN化因子導入－ヒト正常対照由来iPS細胞”の株化細胞を用いた。当該細胞株（本明細書では以降、LNI安定導入株と呼ぶ）は、前記NF安定発現株作製と同じ手法により、テトラサイクリン又はその誘導体に応答してLhx3、Ngn2、及びIsl1をポリシストロニックに発現する発現カセットが染色体に挿入された201B7株である。当該LNI安定導入株は、DOX処理により、約14日で機能的に成熟した下位運動ニューロンを生じることができる（特許文献１）。
このLNI安定導入株に、HB9プロモーターによって発現制御されるTdTOMATOをコードするレンチウイルスを感染させて、下位運動ニューロンに分化するとTdTOMATOの蛍光（赤色）を発するように改変した。(2) Analysis of synaptogenic ability with lower motor neurons In order to investigate the functional maturity of the upper motor neurons, the synaptogenic ability with lower motor neurons was analyzed.
<Modification of LNI stable introduction strain>
As a resource for the lower motor neurons, the cell line of "MN-forming factor-introduced-iPS cells derived from normal human control" prepared by the present inventor in Patent Document 1 was used. The cell line (hereinafter referred to as LNI stable introduction strain) expresses Lhx3, Ngn2, and Isl1 polycistronically in response to tetracycline or a derivative thereof by the same method as the preparation of the NF stable expression strain. The expression cassette is the 201B7 strain inserted into the chromosome. The LNI stable-introduced strain can generate functionally mature lower motor neurons in about 14 days by DOX treatment (Patent Document 1).
This stable LNI-introduced strain was infected with a lentivirus encoding TdTOMATO whose expression is regulated by the HB9 promoter, and modified to emit TdTOMATO fluorescence (red) when differentiated into lower motor neurons.

＜NF安定導入株の改変＞
実施例１で作製したNF安定導入株に、CaMKIIプロモーターによって発現制御されるEGFPをコードするレンチウイルスを感染させて、錐体細胞に分化するとEGFPの蛍光（緑色）を発するように改変した。<Modification of NF stable introduction strain>
The NF stable-introduced strain prepared in Example 1 was infected with a lentivirus encoding EGFP whose expression is regulated by the CaMKII promoter, and modified to emit EGFP fluorescence (green) when differentiated into pyramidal cells.

＜上位・下位運動ニューロンの共培養系の作製と解析＞
前記レンチウイルス感染から4時間後の改変LNI安定導入株及び改変NF安定導入株を、前記手法１に従ってアストロサイトのフィーダー層上に播種した。翌日、培地をDOX含有培地に置換して、それぞれの外来遺伝子の発現を誘導した。発現誘導から2週間後に細胞を固定し（４％PFA使用）、グルタミン酸作動性ニューロンのマーカーであるvGLT1（vesicular glutamate transporter 1）に対する免疫染色を行った。vGLT1は、グルタミン酸作動性ニューロンのシナプス小胞の膜上に局在し、グルタミン酸を該小胞内に運び入れるトランスポーターである。通常、成熟したグルタミン酸作動性ニューロンの神経終末には多数のシナプス小胞が集積するため、vGLT1はシナプス部位を検出するマーカーとして汎用されている。
前記共培養系に対して蛍光顕微鏡観察を行い、赤色で視覚化された下位運動ニューロンと、緑色で視覚化され且つ細胞体の直径が15μm以上である上位運動ニューロンが接触している部位を探索した（図６A参照）。図６B及びCに、下位運動ニューロンの細胞体及び／又はその神経突起に、上位運動ニューロンの神経突起が接触している部位のイメージを示す。<Creation and analysis of co-culture system of upper and lower motor neurons>
The modified LNI stable-introduced strain and the modified NF stable-introduced strain 4 hours after the lentivirus infection were inoculated on the feeder layer of astrocytes according to the above method 1. The next day, the medium was replaced with a DOX-containing medium to induce the expression of each foreign gene. Two weeks after the induction of expression, cells were fixed (using 4% PFA) and immunostained for vGLT1 (vesicular glutamate transporter 1), which is a marker for glutamate-operated neurons. vGLT1 is a transporter that localizes on the membrane of synaptic vesicles of glutamate-operated neurons and carries glutamanate into the vesicles. Normally, vGLT1 is widely used as a marker for detecting synaptic sites because a large number of synaptic vesicles accumulate at the nerve endings of mature glutamatergic neurons.
Fluorescence microscopy was performed on the co-culture system to search for a site where the lower motor neurons visualized in red and the upper motor neurons visualized in green and having a cell body diameter of 15 μm or more are in contact with each other. (See Fig. 6A). 6B and 6C show images of sites where the neurites of upper motor neurons are in contact with the cell bodies of lower motor neurons and / or their neurites.

図６Bの左パネルでは、下位運動ニューロンの細胞体と神経突起（赤色）に、上下異なる方向から伸展してきた緑色の長い神経突起（異なる上位運動ニューロンに由来する神経突起）が接触しており、当該接触部位及びその近傍にはvGLT1のドット状シグナル（青色）が複数認められる。青色のシグナルを見やすくするために、TdTOMATOシグナル（赤色）とvGLT1シグナル（青色）だけを重ね合わせたイメージが図６Bの右パネルである。当該右パネルでは、前記上位運動ニューロンの神経突起と下位運動ニューロンが接触していた部位及びその近傍に、前記左パネルよりも多くの青色ドット（vGLT1のシグナル）が認められた。
図６Cは、図６Bとは別の視野において、下位運動ニューロンの神経突起に、視野の左側から伸展してきた上位運動ニューロンの神経突起が接触した部位のTdTOMATO／EGFP／vGLT1三重イメージ（左パネル）、及びTdTOMATO／vGLT1二重イメージ（中央パネル）である。右パネルは、左パネルにおいて四角で囲んだ領域（接触部）を拡大した三重イメージで、上位運動ニューロンの神経突起（緑色）のうち、下位運動ニューロンと接触している先端部分にvGLT1のドット状シグナル（青色）が集積していることがわかる。In the left panel of FIG. 6B, the cell body of the lower motor neuron and the neurite (red) are in contact with a long green neurite (neurite derived from a different upper motor neuron) extending from different directions. Multiple vGLT1 dot-like signals (blue) are observed in and near the contact site. The right panel of FIG. 6B is an image in which only the TdTOMATO signal (red) and the vGLT1 signal (blue) are superimposed to make the blue signal easier to see. In the right panel, more blue dots (vGLT1 signal) were observed than in the left panel at the site where the neurites of the upper motor neurons and the lower motor neurons were in contact with each other and in the vicinity thereof.
FIG. 6C is a TdTOMATO / EGFP / vGLT1 triple image (left panel) of the site where the neurites of the lower motor neurons are in contact with the neurites of the upper motor neurons extending from the left side of the field in a different field of view from that of FIG. 6B. , And TdTOMATO / vGLT1 dual image (center panel). The right panel is a triple image of the area (contact area) surrounded by a square in the left panel. Of the neurites (green) of the upper motor neuron, the tip of the neuron that is in contact with the lower motor neuron has a vGLT1 dot shape. It can be seen that the signals (blue) are accumulated.

よって、NF安定導入株から、外来性Ngn2及びFezlの発現により、下位運動ニューロンを標的としてシナプス結合を形成できるニューロン、すなわち、上位運動ニューロンとして機能的に成熟したニューロンが分化誘導されることが示された。 Therefore, it is shown from the NF stable introduction strain that the expression of exogenous Ngn2 and Fezl induces differentiation of neurons capable of forming synaptic connections targeting lower motor neurons, that is, neurons functionally mature as upper motor neurons. Was done.

以上の結果より、多能性幹細胞にNgn2及びFezlを導入して発現させることで、約3週間後には機能的な上位運動ニューロンが製造できることが示された。 From the above results, it was shown that functional upper motor neurons can be produced after about 3 weeks by introducing and expressing Ngn2 and Fezl in pluripotent stem cells.

さらに、上記結果より、外来性Ngn2及びFezlが導入された多能性幹細胞と、外来性Lhx3、Ngn2、及びIsl1が導入された多能性幹細胞を共培養し、前記全外来性遺伝子の発現を誘導することで、上位運動ニューロンをシナプス前細胞、下位運動ニューロンをシナプス後細胞とするシナプス結合を含む培養系（すなわち、皮質脊髄路モデル）が得られることが示された。 Furthermore, based on the above results, pluripotent stem cells into which exogenous Ngn2 and Fezl were introduced and pluripotent stem cells into which exogenous Lhx3, Ngn2, and Isl1 were introduced were co-cultured to express the expression of all foreign genes. It was shown that induction results in a culture system (ie, corticospinal tract model) containing synaptic connections with upper motor neurons as presynaptic cells and lower motor neurons as postsynaptic cells.

［実施例３］ALSモデル上位運動ニューロンの作製
ALS患者由来iPS細胞から本発明に係る方法で上位運動ニューロンを製造して、当該ニューロンの性質を解析した。
＜ALS-iPSC NF安定導入株の作製と分化誘導＞
TDP-43遺伝子にG298S変異を有する家族性ALS患者の体細胞から本発明者が樹立したiPS細胞株（非特許文献１２参照、本明細書では以降、“ALS-iPSC”と呼ぶ）に、実施例１と同じ手法を用いて、前記NF発現カセットが染色体に挿入された安定導入株（以降、ALS-iPSC NF安定導入株と呼ぶ）を作製した。
前記ALS-iPSC NF安定発現株を前記手法１に従ってアストロサイトのフィーダー層上に播種し、翌日外来性Ngn2及びFezlの発現を誘導した。なお、コントロールとして、実施例１で201B7株から作製したNF安定発現株を用いた。[Example 3] Preparation of ALS model upper motor neuron
Upper motor neurons were produced from iPS cells derived from ALS patients by the method according to the present invention, and the properties of the neurons were analyzed.
<Preparation of stable introduction strain of ALS-iPSC NF and induction of differentiation>
Performed on an iPS cell line established by the present inventor from somatic cells of a familial ALS patient having a G298S mutation in the TDP-43 gene (see Non-Patent Document 12, hereinafter referred to as "ALS-iPSC" in the present specification). Using the same method as in Example 1, a stable introduction strain in which the NF expression cassette was inserted into a chromosome (hereinafter referred to as ALS-iPSC NF stable introduction strain) was prepared.
The ALS-iPSC NF stable expression strain was inoculated on the feeder layer of astrocytes according to the above method 1 to induce the expression of exogenous Ngn2 and Fezl the next day. As a control, the NF stable expression strain prepared from the 201B7 strain in Example 1 was used.

＜ALS-iPSC NF安定導入株の解析＞
これまで、ALSモデル動物及び家族性ALS患者由来iPS細胞から分化誘導された下位運動ニューロンを用いた解析により、ALSを発症する下位運動ニューロンに特徴的な異常（病態）が複数報告されている。そのうち、本来核タンパクであるTDP-43タンパクの細胞質への移行と凝集化は、孤発性ALS患者の剖検組織でも頻繁に観察されることから、家族性・孤発性を問わずALSの発症機序に深く関わると考えられている（参照：Scotter E.L., et al, Neurotherapeutics, 12:352-363, 2015）。また、神経突起の伸展不良は、変性し易い（脆弱な）ニューロンに広く認められる特徴である。
そこで、前記ALS-iPSC NF安定発現株から得られる上位運動ニューロンについて、これらの病的性質の有無を解析した。<Analysis of ALS-iPSC NF stable introduction strain>
So far, analysis using lower motor neurons induced to differentiate from ALS model animals and iPS cells derived from familial ALS patients has reported multiple abnormalities (pathological conditions) characteristic of lower motor neurons that develop ALS. Of these, the transfer and aggregation of TDP-43 protein, which is originally a nuclear protein, to the cytoplasm is frequently observed in autopsy tissues of sporadic ALS patients, so that ALS develops regardless of familial or sporadic. It is believed to be deeply involved in the mechanism (see: Scotter EL, et al, Neurotherapeutics, 12: 352-363, 2015). In addition, poor neurite outgrowth is a widely recognized feature of degenerative (fragile) neurons.
Therefore, we analyzed the presence or absence of these pathological properties of the upper motor neurons obtained from the ALS-iPSC NF stable expression strain.

（１）TDP-43タンパクの細胞質移行と凝集化の有無
発現誘導から28日後の細胞に対し、TDP-43に対する抗体及びSMI-32抗体を用いた二重免疫染色を行った（図７A）。コントロールから分化誘導された上位運動ニューロン（以降、Control-UMNと呼ぶ）では、TDP-43（緑色）とSMI-32（赤色）のシグナルがマージした領域（黄色）はほとんど観察されないが（図７Aの左パネル）、ALS-iPSC NF安定発現株から分化誘導された上位運動ニューロン（以降、ALS-UMNと呼ぶ）では、黄色の領域を有する細胞が多数観察された（図７Aの右パネル）。さらに、DAPI核染色との三重イメージでは（図７B）、Control-UMNでは核内にのみTDP-43のドット状シグナルが観察されたのに対し（図７B、左パネル）、ALS-UMNでは核内だけでなく細胞質にも複数のTDP-43ドット状シグナルが観察された（図７B、右パネル）。
よって、前記家族性ALS患者由来iPSCから外来性Ngn2及びFezlの発現によって分化した上位運動ニューロンでは、自発的にTDP-43タンパクが細胞質に移行して凝集化することが示された。(1) Presence or absence of cytoplasmic translocation and aggregation of TDP-43 protein Two cells 28 days after the induction of expression were subjected to double immunostaining using an antibody against TDP-43 and an SMI-32 antibody (Fig. 7A). In the upper motor neurons (hereinafter referred to as Control-UMN) induced to differentiate from the control, the region (yellow) where the signals of TDP-43 (green) and SMI-32 (red) are merged is hardly observed (Fig. 7A). (Left panel), in the upper motor neurons (hereinafter referred to as ALS-UMN) differentiated from the ALS-iPSC NF stable expression strain, a large number of cells having a yellow region were observed (right panel in FIG. 7A). Furthermore, in the triple image with DAPI nuclear staining (Fig. 7B), the dot-shaped signal of TDP-43 was observed only in the nucleus in Control-UMN (Fig. 7B, left panel), whereas in ALS-UMN, the nucleus was observed. Multiple TDP-43 dot-like signals were observed not only in the inside but also in the cytoplasm (Fig. 7B, right panel).
Therefore, it was shown that the TDP-43 protein spontaneously migrates to the cytoplasm and aggregates in the upper motor neurons differentiated by the expression of exogenous Ngn2 and Fezl from the iPSC derived from the familial ALS patient.

（２）神経突起の伸展不良の有無
突起進展の様子を生きたまま観察できるように、前記ALS-iPSC NF安定発現株に、CaMKIIプロモーターによって発現制御されるEGFPをコードするレンチウイルス（実施例２で使用したものと同じ）を感染させて、錐体細胞に分化するとEGFPの蛍光（緑色）を発するように改変した。
前記手法１に従ってアストロサイトのフィーダー層上に播種し、翌日に外来性Ngn2及びFezlの発現を誘導して蛍光顕微鏡観察を行った。すると、発現誘導から14日目以降に、細胞体の直径が15μm以上の錐体細胞において、神経突起の先端（すなわち、成長円錐）が縮小して突起伸展が停止する現象が頻繁に観察された（図８、右パネル中の矢印）。これに対し、前記コントロールから分化誘導されたニューロンでは、28日後まで解析しても突起の伸展停止は観察されなかった（図８、左パネル）。さらに、上記異常が認められた錐体細胞では、大脳皮質第5層のマーカー遺伝子の発現が確認された。
よって、前記家族性ALS患者由来iPSCから外来性Ngn2及びFezlの発現によって分化した上位運動ニューロンは、神経突起を伸展させる能力が低いことがわかった。(2) Presence or absence of neurite outgrowth A lentivirus encoding EGFP whose expression is controlled by the CaMKII promoter in the ALS-iPSC NF stable expression strain so that the state of neurite outgrowth can be observed alive (Example 2). (Same as the one used in) was infected and modified to emit EGFP fluorescence (green) when differentiated into pyramidal cells.
The seeds were seeded on the feeder layer of astrocytes according to the above method 1, and the expression of exogenous Ngn2 and Fezl was induced the next day and observed with a fluorescence microscope. Then, after 14 days from the induction of expression, the phenomenon that the tip of the neurite (that is, the growth cone) contracted and the projection extension stopped was frequently observed in the pyramidal cell having a cell body diameter of 15 μm or more. (Fig. 8, arrow in the right panel). On the other hand, in the neurons induced to differentiate from the control, no stop of extension of the processes was observed even after 28 days (Fig. 8, left panel). Furthermore, the expression of the marker gene in the 5th layer of the cerebral cortex was confirmed in the pyramidal cells in which the above abnormality was observed.
Therefore, it was found that the upper motor neurons differentiated by the expression of exogenous Ngn2 and Fezl from the iPSC derived from the familial ALS patient have a low ability to extend neurites.

以上の結果より、ALS患者由来iPSCに外来性Ngn2及びFezlを発現させて得られる上位運動ニューロンは、ALSに特徴的な病的性質を備えた脆弱なニューロンであることが明らかとなった。よって、当該上位運動ニューロンは、ALSのモデル上位運動ニューロンになり得ることが示された。 From the above results, it was clarified that the upper motor neurons obtained by expressing exogenous Ngn2 and Fezl in iPSC derived from ALS patients are fragile neurons having the pathogenic properties characteristic of ALS. Therefore, it was shown that the upper motor neuron can be a model upper motor neuron of ALS.

［実施例４］新規ALSマーカーの同定
実施例３で作製したALSモデル上位運動ニューロンにおいて、特異的に発現量が変化する遺伝子を探索した。
前記ALS-iPSC NF安定導入株及びコントロールNF安定導入株を実施例３と同じ方法を用いて分化誘導し、28日後に上位運動ニューロンに分化した細胞を選んでシングルセルRNA-sequencing法を行った（Illimina社のHiSeq 2500 Sequencing Systemを用いて、100-cycle Single-Read modeで解析）。当該ALS-UMN及びControl-UMN間で遺伝子発現パターンを比較した結果、ALS-UMNでは発現が検出されない遺伝子として、GPR50（Official symbol:G protein-coupled receptor 50、NM_004224）が見出された（図８）。GPR50は、Gタンパク質共役受容体の一種で、これまで大鬱病性障害や双極性障害等の精神疾患と遺伝的相関が報告されているが（Thomson PA., et al, Mol. Psychiatry, 10:470-478, 2005）、運動ニューロン疾患との関わりを示唆する知見はない。図８に示されるように、Control-UMNでは解析した細胞の約80%においてGPR50の強いシグナルが検出されたのに対し、ALS-UMNでは解析した細胞すべてにおいてGPR50のシグナルは検出されなかった。
よって、GPR50の発現消失は、ALSのマーカーとなり得ることが示された。[Example 4] Identification of a novel ALS marker In the ALS model upper motor neuron prepared in Example 3, a gene whose expression level changes specifically was searched for.
The ALS-iPSC NF stable-introduced strain and the control NF stable-introduced strain were induced to differentiate using the same method as in Example 3, and after 28 days, cells differentiated into upper motor neurons were selected and subjected to a single-cell RNA-sequencing method. (Analysis in 100-cycle Single-Read mode using Illimina's HiSeq 2500 Sequencing System). As a result of comparing the gene expression patterns between the ALS-UMN and Control-UMN, GPR50 (Official symbol: G protein-coupled receptor 50, NM_004224) was found as a gene whose expression was not detected in ALS-UMN (Fig.). 8). GPR50 is a type of G protein-coupled receptor that has been reported to be genetically correlated with psychiatric disorders such as major depressive disorder and bipolar disorder (Thomson PA., Et al, Mol. Psychiatry, 10 :. 470-478, 2005), no findings suggesting a link to motor neuron disease. As shown in FIG. 8, Control-UMN detected a strong signal of GPR50 in about 80% of the analyzed cells, whereas ALS-UMN did not detect a strong signal of GPR50 in all the analyzed cells.
Therefore, it was shown that the loss of GPR50 expression can be a marker for ALS.

これまで、家族性ALS患者から同定された遺伝子変異を導入することで様々なALSモデルマウスが作製され、下位運動ニューロンの変性に関する様々な知見が得られている（参照：McGoldrick P., et al, Biochim. Biophys. Acta. Sci., USA, 1832:1421-1436, 2013）。しかしながら、解剖学的な差異によりマウスにはヒトのような皮質脊髄路が存在しないため、モデルマウスを用いて上位運動ニューロンの変性機構や上位・下位運動ニューロン間の変性伝播機構を研究することはできなかった。ましてや、上位運動ニューロンに対して生存促進や変性阻止作用を直接奏し得る薬剤をスクリーニングする手段は存在しなかった。
本発明に係る多能性幹細胞は、当該外来性遺伝子の発現を誘導するだけで機能的な上位運動ニューロンへと変換され、下位運動ニューロンと神経結合を形成し得る細胞である。よって、本発明に係る上位運動ニューロンモデルと皮質脊髄路モデルの普及により、ALSを含む上位運動ニューロン疾患の治療方法と治療薬の研究が大幅に加速されることが期待される。So far, various ALS model mice have been generated by introducing gene mutations identified from familial ALS patients, and various findings regarding the degeneration of lower motor neurons have been obtained (see: McGoldrick P., et al). , Biochim. Biophys. Acta. Sci., USA, 1832: 1421-1436, 2013). However, because mice do not have a corticospinal tract like humans due to anatomical differences, it is not possible to study the degenerative mechanism of upper motor neurons and the degenerative propagation mechanism between upper and lower motor neurons using model mice. could not. Furthermore, there was no means to screen for drugs that could directly exert survival-promoting and degeneration-inhibiting effects on upper motor neurons.
The pluripotent stem cell according to the present invention is a cell that can be converted into a functional upper motor neuron and form a neural connection with a lower motor neuron only by inducing the expression of the foreign gene. Therefore, it is expected that the widespread use of the upper motor neuron model and the corticospinal tract model according to the present invention will significantly accelerate the research of therapeutic methods and agents for upper motor neuron diseases including ALS.

Claims (13)

多能性幹細胞に外来性のNgn2及びFezlを発現させて培養する工程を含む、多能性幹細胞から上位運動ニューロンを製造する方法であって、
前記多能性幹細胞が人工多能性幹細胞であり、
前記上位運動ニューロンがCtip2を発現するものである、方法。 A method for producing upper motor neurons from pluripotent stem cells, which comprises the step of expressing and culturing exogenous Ngn2 and Fezl in pluripotent stem cells .
The pluripotent stem cells are artificial pluripotent stem cells.
A method in which the upper motor neurons express Ctip2 . 前記外来性のNgn2及びFezlを薬剤応答性プロモーターで発現させる、請求項１に記載の方法。 The method of claim 1, wherein the exogenous Ngn2 and Fezl are expressed on a drug responsive promoter. 前記外来性のNgn2及びFezlを2A配列を用いてポリシストロニックに発現させる、請求項１又は２に記載の方法。 The method of claim 1 or 2, wherein the exogenous Ngn2 and Fezl are polycistronically expressed using a 2A sequence. 前記培養期間が21日間以上である、請求項１～３のいずれかに記載の方法。 The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the culture period is 21 days or more. Ngn2をコードする外来性核酸及びFezlをコードする外来性核酸を染色体内に含む多能性幹細胞。 Pluripotent stem cells containing an exogenous nucleic acid encoding Ngn2 and an exogenous nucleic acid encoding Fezl in the chromosome. 前記Ngn2をコードする外来性核酸及びFezlをコードする外来性核酸が、薬剤応答性プロモーターに機能的に接合された核酸である、請求項５に記載の多能性幹細胞。 The pluripotent stem cell according to claim 5 , wherein the exogenous nucleic acid encoding Ngn2 and the exogenous nucleic acid encoding Fezl are nucleic acids functionally ligated to a drug-responsive promoter. 前記Ngn2をコードする外来性核酸及びFezlをコードする外来性核酸が、2A配列を介して連結されている、請求項５又は６に記載の多能性幹細胞。 The pluripotent stem cell according to claim 5 or 6 , wherein the exogenous nucleic acid encoding Ngn2 and the exogenous nucleic acid encoding Fezl are linked via a 2A sequence. 前記多能性幹細胞が、ヒト由来人工多能性幹細胞である、請求項５～７のいずれかに記載の多能性幹細胞。 The pluripotent stem cell according to any one of claims 5 to 7 , wherein the pluripotent stem cell is a human-derived induced pluripotent stem cell. 前記ヒトが、筋萎縮性側索硬化症患者である、請求項８に記載のヒト由来人工多能性幹細胞。 The human-derived induced pluripotent stem cell according to claim 8 , wherein the human is a patient with amyotrophic lateral sclerosis. 請求項１に記載された方法で製造された上位運動ニューロンをシナプス前細胞、下位運動ニューロンをシナプス後細胞とするシナプス結合を含む培養物。 A culture comprising synaptic connections, wherein the upper motor neuron is a presynaptic cell and the lower motor neuron is a postsynaptic cell produced by the method according to claim 1 . 前記下位運動ニューロンが、多能性幹細胞から製造された下位運動ニューロンである、請求項１０に記載の培養物。 The culture according to claim 10 , wherein the lower motor neuron is a lower motor neuron produced from pluripotent stem cells. 前記下位運動ニューロンが、多能性幹細胞に外来性のLhx3、Ngn2、及びIsl1を発現させて製造された下位運動ニューロンである、請求項１１に記載の培養物。 The culture according to claim 11 , wherein the lower motor neuron is a lower motor neuron produced by expressing exogenous Lhx3, Ngn2, and Isl1 in pluripotent stem cells. 下記工程を含む、筋萎縮性側索硬化症の予防又は治療薬のスクリーニング方法；
（１）家族性ALS患者由来人工多能性幹細胞に外来性のNgn2及びFezlを発現させて培養して、該多能性幹細胞から上位運動ニューロンを製造する工程、ここで、前記上位運動ニューロンはCtip2を発現するものである、
（２）（１）で得られた上位運動ニューロンを、被験物質と接触させる工程、
（３）（２）で被験物質と接触させた上位運動ニューロン、及び接触させなかった上位運動ニューロン（すなわち、対照細胞）を培養し、神経突起長、凝集化したTDP-43タンパク量、又はGPR50の発現量を測定する工程、
（４）前記被験物質と接触させた上位運動ニューロンの神経突起長もしくはGPR50の発現量が対照細胞の該値よりも高値である被験物質、又は、前記被験物質と接触させた上位運動ニューロンにおける凝集化したTDP-43タンパク量が対照細胞の該値よりも低値である被験物質を、筋萎縮性側索硬化症の予防又は治療薬として選択する工程。
Screening method for preventive or therapeutic agents for amyotrophic lateral sclerosis, including the following steps;
(1) A step of expressing exogenous Ngn2 and Fezl in induced pluripotent stem cells derived from familial ALS patients and culturing them to produce upper motor neurons from the pluripotent stem cells , wherein the upper motor neurons are It expresses Ctip2 ,
(2) The step of bringing the upper motor neuron obtained in (1) into contact with the test substance,
(3) The upper motor neurons that were contacted with the test substance in (2) and the upper motor neurons that were not contacted (that is, control cells) were cultured, and the neurite length, aggregated TDP-43 protein amount, or GPR50. Step of measuring the expression level of
(4) Aggregation in the test substance in which the nerve protrusion length of the upper motor neuron in contact with the test substance or the expression level of GPR50 is higher than the value in the control cell, or in the upper motor neuron in contact with the test substance. A step of selecting a test substance having a TDP-43 protein amount lower than that of a control cell as a prophylactic or therapeutic agent for amyotrophic lateral sclerosis.
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