JP6980218B2 - How to introduce Cas9 protein into fertilized mammalian eggs - Google Patents
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Description
本発明は、Ｃａｓ９タンパク質を哺乳動物の受精卵に導入する方法に関する。本発明は、また、上記方法を利用して、Ｃａｓ９タンパク質を含む哺乳動物の受精卵を製造すること、哺乳動物の受精卵でゲノム編集を行うこと、ゲノム編集された哺乳動物の受精卵を作製すること、または、遺伝子改変動物を作製することに関する。 The present invention relates to a method of introducing Cas9 protein into a fertilized mammalian egg. The present invention also uses the above method to produce a fertilized animal egg containing the Cas9 protein, to perform genome editing on the fertilized animal egg, and to produce a genome-edited fertilized animal egg. Or making genetically modified animals.
遺伝子改変動物は、現在、医学および生物学を含む様々な研究分野において、生物の基本的メカニズムの解明のために、あるいは、ヒトの疾患のモデルとして、使用されている。迅速な遺伝子改変動物の作製手段として、ＺＦＮ（ジンクフィンガーヌクレアーゼ（Zinc-Finger Nucleases））、ＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（Transcription Activator-Like Effector Nucleases））およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（群生性等間隔短回文反復関連システム（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat-Associated System））などの人工制限酵素を利用する系が、近年注目を集めている。これらの新しい技術はゲノム編集と呼ばれ、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を利用せずに、幅広い生物のゲノムを改変することを可能にした。 Genetically modified animals are currently used in various research fields, including medicine and biology, to elucidate the basic mechanisms of living organisms or as models of human disease. ZFNs (Zinc-Finger Nucleases), TALENs (Transcription Activator-Like Effector Nucleases) and CRISPR / Cas systems (population, etc.) are used as means for producing rapidly genetically modified animals. Systems that utilize artificial restriction enzymes, such as the Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat-Associated System, have been attracting attention in recent years. These new technologies, called genome editing, have made it possible to modify the genomes of a wide range of organisms without the use of embryonic stem cells (ES cells) or induced pluripotent stem cells (iPS cells).
ゲノム編集による遺伝子改変動物の作製は、通常、前核期胚に人工制限酵素の遺伝子をマイクロインジェクションすることにより行われる。マウスのゲノム編集も、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡ（ガイドＲＮＡ）、または、これらのＲＮＡを発現するプラスミドを受精卵の細胞質または前核に１つずつマイクロインジェクションすることにより実施されてきた（非特許文献１）。現在はこの方法が主流であるが、細胞の損傷を防ぐには、熟練された手技を要する。さらに、マイクロインジェクションでは、専用の機械を使用して前核期胚に１つずつ遺伝子を注入しなければならず、かなりの時間を必要とする。ブタ、ウシ、ヒツジ等の大型動物の遺伝子改変には、遺伝子改変されたドナー細胞を使用する体細胞核移植（ＳＣＮＴ）が現在最も広範に使用されているが、エピジェネティック修飾の初期化が不完全であるために出産前または後に仔が死亡することがあり、成功率は低い。 The production of genetically modified animals by genome editing is usually performed by microinjecting a gene for an artificial restriction enzyme into a pronuclear stage embryo. Genome editing in mice has also been performed by microinjecting Cas9 mRNA and gRNA (guide RNA), or plasmids expressing these RNAs, into the cytoplasm or pronucleus of fertilized eggs one by one (Non-Patent Document 1). ). Currently, this method is the mainstream, but it requires skillful techniques to prevent cell damage. In addition, microinjection requires the injection of genes one by one into pronuclear stage embryos using a dedicated machine, which requires a considerable amount of time. Somatic cell nuclear transfer (SCNT) using genetically modified donor cells is currently the most widely used for genetic modification of large animals such as pigs, cattle, and sheep, but the initialization of epigenetic modifications is incomplete. Because of this, the offspring may die before or after childbirth, and the success rate is low.
エレクトロポレーションは、目的の遺伝子またはタンパク質を、細胞または組織に導入するのに有用な手段であり、多くの生物種で幅広く用いられてきた。マウスでは、この技法は、胎児および出生後の個体の脳、精巣および筋肉を含む様々な組織に使用されてきた。エレクトロポレーションにより哺乳動物の受精卵に遺伝子を導入したことが数例報告されており、最近、ラットまたはマウス受精卵へのエレクトロポレーションによるＣａｓ９ ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡの導入が報告された（特許文献２、非特許文献２および３）。
Electroporation is a useful means for introducing a gene or protein of interest into a cell or tissue and has been widely used in many species. In mice, this technique has been used on a variety of tissues, including the brain, testis and muscles of fetal and postnatal individuals. Several cases have been reported in which genes were introduced into fertilized mammalian eggs by electroporation, and recently, introduction of Cas9 mRNA and gRNA by electroporation into fertilized rat or mouse eggs was reported (Patent Document 2). , Non-Patent
本発明者らは、鋭意研究の末、エレクトロポレーションにより、哺乳動物の受精卵にＣａｓ９タンパク質を導入できることを見出し、本発明を完成した。 After diligent research, the present inventors have found that the Cas9 protein can be introduced into fertilized mammalian eggs by electroporation, and completed the present invention.
本発明は、哺乳動物の受精卵にＣａｓ９タンパク質を導入する方法であって、
（ａ）エレクトロポレーション用電極の間に、Ｃａｓ９ タンパク質を含む溶液および受精卵の混合物を置くこと、
（ｂ）電極間に電圧をかけること、
の各段階を含む方法を提供する。
The present invention is a method for introducing Cas9 protein into fertilized mammalian eggs.
(A) Place a mixture of a solution containing Cas9 protein and a fertilized egg between the electrodes for electroporation,
(B) Applying voltage between the electrodes,
Provide a method including each stage of.
本発明は、また、Ｃａｓ９タンパク質を含む哺乳動物の受精卵の製造方法であって、
（ａ）エレクトロポレーション用電極の間に、Ｃａｓ９ タンパク質を含む溶液および受精卵の混合物を置くこと、
（ｂ）電極間に電圧をかけること、
の各段階を含む方法を提供する。
The present invention is also a method for producing a fertilized mammalian egg containing Cas9 protein.
(A) Place a mixture of a solution containing Cas9 protein and a fertilized egg between the electrodes for electroporation,
(B) Applying voltage between the electrodes,
Provide a method including each stage of.
本発明は、また、哺乳動物の受精卵でゲノム編集を行う方法であって、
（ａ）エレクトロポレーション用電極の間に、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよび核酸分子を含む溶液並びに受精卵の混合物を置くこと、ここで、核酸分子は、ｃｒＲＮＡ（CRISPR RNA）およびｔｒａｃｒＲＮＡ（trans-activating CRISPR RNA）の組合せまたはｇＲＮＡである、
（ｂ）電極間に電圧をかけること、
の各段階を含む方法を提供する。
The present invention is also a method for performing genome editing on fertilized mammalian eggs.
(A) Place a solution containing Cas9 mRNA and nucleic acid molecules and a mixture of fertilized eggs between the electrodes for electroporation, where the nucleic acid molecules are crRNA (CRISPR RNA) and tracrRNA (trans-activating CRISPR RNA). Combination or gRNA,
(B) Applying voltage between the electrodes,
Provide a method including each stage of.
本発明は、また、ゲノム編集された哺乳動物の受精卵の作製方法であって、
（ａ）エレクトロポレーション用電極の間に、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよび核酸分子を含む溶液並びに受精卵の混合物を置くこと、ここで、核酸分子は、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの組合せまたはｇＲＮＡである、
（ｂ）電極間に電圧をかけること、
の各段階を含む方法を提供する。
The present invention is also a method for producing a fertilized egg of a mammal whose genome has been edited.
(A) A solution containing Cas9 mRNA and a nucleic acid molecule and a mixture of fertilized eggs are placed between the electrodes for electroporation, where the nucleic acid molecule is a combination of crRNA and tracrRNA or gRNA.
(B) Applying voltage between the electrodes,
Provide a method including each stage of.
本発明は、また、上記の方法で得られる受精卵をレシピエント動物に移植することを含む、遺伝子改変動物の作製方法を提供する。 The present invention also provides a method for producing a genetically modified animal, which comprises transplanting a fertilized egg obtained by the above method into a recipient animal.
本発明により、哺乳動物の受精卵にＣａｓ９ タンパク質を導入すること、Ｃａｓ９タンパク質を含む哺乳動物の受精卵を製造すること、哺乳動物の受精卵でゲノム編集を行うこと、ゲノム編集された哺乳動物の受精卵を作製すること、または、遺伝子改変動物を作製することができる。 According to the present invention, Cas9 protein is introduced into a fertilized animal egg, a fertilized animal egg containing the Cas9 protein is produced, genome editing is performed on a fertilized animal egg, and a genome-edited mammal is used. A fertilized egg can be produced, or a genetically modified animal can be produced.
特に具体的な定めのない限り、本明細書で使用される用語は、有機化学、医学、薬学、発生生物学、細胞生物学、分子生物学、微生物学等の分野における当業者に一般的に理解されるとおりの意味を有する。以下にいくつかの本明細書で使用される用語についての定義を記載するが、これらの定義は、本明細書において、一般的な理解に優先する。 Unless otherwise specified, the terms used herein are generally used by those skilled in the art in the fields of organic chemistry, medicine, pharmacy, developmental biology, cell biology, molecular biology, microbiology, etc. It has the meaning as understood. The following are definitions of some terms used herein, but these definitions supersede the general understanding herein.
本明細書では、数値が「約」の用語を伴う場合、その値の±１０％の範囲を含むことを意図する。数値の範囲は、両端点の間の全ての数値および両端点の数値を含む。範囲に関する「約」は、その範囲の両端点に適用される。従って、例えば、「約２０〜３０」は、「２０±１０％〜３０±１０％」を含むものとする。 As used herein, when a number is accompanied by the term "about", it is intended to include a range of ± 10% of that value. The range of numbers includes all numbers between the endpoints and the numbers at the endpoints. The "about" for a range applies to both ends of the range. Therefore, for example, "about 20 to 30" is assumed to include "20 ± 10% to 30 ± 10%".
エレクトロポレーション
本発明で使用するエレクトロポレーターは、電気パルスの発生装置を意味し、本発明の段階（ａ）および（ｂ）を実施できるものであればどのようなものでもよい。エレクトロポレーターは、例えば、BioRad社、BTX社、BEX社、Intracel社、Eppendorf社などから購入できる。
Electroporation The electroporator used in the present invention means an electric pulse generator, and may be any device as long as it can carry out the steps (a) and (b) of the present invention. Electroporators can be purchased from, for example, BioRad, BTX, BEX, Intracel, Eppendorf and others.
本発明において、「エレクトロポレーション用電極」は、従来のエレクトロポレーション法において使用されるあらゆる電極を含む。例えば、白金、金、アルミニウムなどの金属からなる電極が挙げられる。通常、２本の電極が約０.２５ｍｍないし約１０ｍｍ、例えば約０.５ｍｍないし約４ｍｍまたは約１ｍｍないし約２ｍｍのギャップをあけて配置され、そのギャップにＣａｓ９ タンパク質を含む溶液および受精卵の混合物を置くことができる。電極は、混合物を入れるための容器と組み合わせたキュベット電極であってもよい。エレクトロポレーション用電極は、例えば、BioRad社、BTX社、BEX社、Intracel社、Eppendorf社などから購入できる。 In the present invention, the "electroporation electrode" includes any electrode used in conventional electroporation methods. For example, an electrode made of a metal such as platinum, gold, or aluminum can be mentioned. Usually, two electrodes are placed with a gap of about 0.25 mm to about 10 mm, for example about 0.5 mm to about 4 mm or about 1 mm to about 2 mm, in which a mixture of a solution containing Cas9 protein and a fertilized egg. Can be placed. The electrode may be a cuvette electrode in combination with a container for containing the mixture. Electroporation electrodes can be purchased from, for example, BioRad, BTX, BEX, Intracel, Eppendorf and the like.
本発明の段階（ａ）において、Ｃａｓ９ タンパク質を含む溶液は、Ｃａｓ９ タンパク質を、例えば、約３ｎｇ／μｌ以上、約５ｎｇ／μｌ以上、約１０ｎｇ／μｌ以上、約２０ｎｇ／μｌ以上、約３０ｎｇ／μｌ以上、約４０ｎｇ／μｌ以上、約５０ｎｇ／μｌ以上、約７０ｎｇ／μｌ以上または約１００ｎｇ／μｌ以上、かつ、約５０００ｎｇ／μｌ以下の濃度で、例えば、約３ｎｇ／μｌないし約５０００ｎｇ／μｌ、約５ｎｇ／μｌないし約２０００ｎｇ／μｌ、約１０ｎｇ／μｌないし約１０００ｎｇ／μｌ、約２０ｎｇ／μｌないし約５００ｎｇ／μｌ、約３０ｎｇ／μｌないし約２００ｎｇ／μｌ、約４０ｎｇ／μｌないし約１５０ｎｇ／μｌまたは約５０ｎｇ／μｌないし約１００ｎｇ／μｌの濃度で含む。本発明のある実施態様では、溶液は約５０ｎｇ／μｌまたは約１００ｎｇ／μｌのＣａｓ９ タンパク質を含む。一定の電気条件下では、一般的に、溶液中のＣａｓ９ タンパク質の濃度が高いほど、タンパク質導入量は多くなる。 In step (a) of the present invention, the solution containing Cas9 protein contains Cas9 protein, for example, about 3 ng / μl or more, about 5 ng / μl or more, about 10 ng / μl or more, about 20 ng / μl or more, about 30 ng / μl. At a concentration of about 40 ng / μl or more, about 50 ng / μl or more, about 70 ng / μl or more or about 100 ng / μl or more, and about 5000 ng / μl or less, for example, about 3 ng / μl to about 5000 ng / μl, about 5 ng / μl to about 2000 ng / μl, about 10 ng / μl to about 1000 ng / μl, about 20 ng / μl to about 500 ng / μl, about 30 ng / μl to about 200 ng / μl, about 40 ng / μl to about 150 ng / μl or about Included at a concentration of 50 ng / μl to about 100 ng / μl. In one embodiment of the invention, the solution comprises about 50 ng / μl or about 100 ng / μl of Cas9 protein. Under constant electrical conditions, the higher the concentration of Cas9 protein in solution, the higher the amount of protein introduced.
本発明の段階（ａ）において、Ｃａｓ９ タンパク質を含む溶液は、エレクトロポレーションに使用できる任意の溶液にＣａｓ９ タンパク質を溶解したものである。エレクトロポレーションに使用できる溶液は、エレクトロポレーションを実施する間に受精卵が生存できる培地またはバッファーであればよく、例えば、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ、ＰＢＳ、ＨＢＳ、ＨＢＳＳ、Ｈａｎｋｓ、ＨＣＭＦなどの培地またはバッファーが含まれる。好ましくは、溶液は血清を含まない。 In step (a) of the present invention, the solution containing Cas9 protein is a solution of Cas9 protein in any solution that can be used for electroporation. The solution that can be used for electroporation may be a medium or buffer in which the fertilized egg can survive during the electroporation, for example, a medium such as Opti-MEM I, PBS, HBS, HBSS, Hanks, HCMF or the like. Contains a buffer. Preferably, the solution is serum-free.
本発明の段階（ａ）において、Ｃａｓ９ タンパク質を含む溶液および受精卵の混合物をエレクトロポレーション用電極の間に置く。Ｃａｓ９ タンパク質を含む溶液および受精卵を予め混合したものを電極間に添加しても、Ｃａｓ９ タンパク質を含む溶液および受精卵を別々に電極間に添加してもよい。混合物は、上記電極のギャップを満たす体積で、例えば、約１μｌないし約５０μｌ、好ましくは約１.５μｌないし約１５μｌ、より好ましくは、約２μｌないし約１０μｌの体積で使用する。本発明のある実施態様では、混合物の体積は約５μｌである。 In step (a) of the present invention, a mixture of a solution containing Cas9 protein and a fertilized egg is placed between the electrodes for electroporation. A premixed solution containing Cas9 protein and a fertilized egg may be added between the electrodes, or a solution containing Cas9 protein and a fertilized egg may be added separately between the electrodes. The mixture is used in a volume that fills the gap between the electrodes, eg, about 1 μl to about 50 μl, preferably about 1.5 μl to about 15 μl, more preferably about 2 μl to about 10 μl. In one embodiment of the invention, the volume of the mixture is about 5 μl.
受精卵に導入されるＣａｓ９ タンパク質の量はエレクトロポレーションの電圧および通電時間に伴って増加するが、電圧が高すぎると、あるいは、通電時間が長すぎると、受精卵の生存率が低下する傾向がある。電圧と通電時間は、哺乳動物の種とＣａｓ９タンパク質の濃度に応じて、適宜調整され得る。本発明の段階（ｂ）において、電圧は電極間距離１ｍｍ当たり、例えば、約１５Ｖないし約５５Ｖ、約１５Ｖないし約５０Ｖ、約２０Ｖないし約５０Ｖまたは約２５Ｖないし約４０Ｖ、例えば、約１５Ｖ、約２０Ｖ、約２５Ｖ、約３０Ｖ、約３５Ｖ、約４０Ｖ、約４５Ｖまたは約５０Ｖである。本発明の段階（ｂ）において、通電時間は、例えば、約２ｍｓｅｃないし約３５ｍｓｅｃ、約２ｍｓｅｃないし約２５ｍｓｅｃ、約２ｍｓｅｃないし約２２ｍｓｅｃ、約２.５ｍｓｅｃないし約１８ｍｓｅｃ、または約２ｍｓｅｃないし約１５ｍｓｅｃ、例えば、約２．５ｍｓｅｃ、約３ｍｓｅｃ、約３．５ｍｓｅｃ、約４．５ｍｓｅｃ、約５ｍｓｅｃ、約５．５ｍｓｅｃ、約６ｍｓｅｃ、約７ｍｓｅｃ、約８ｍｓｅｃ、約９ｍｓｅｃ、約１０ｍｓｅｃ、約１１ｍｓｅｃ、約１２ｍｓｅｃ、約１３ｍｓｅｃ、約１４ｍｓｅｃ、約１６ｍｓｅｃまたは約１８ｍｓｅｃである。 The amount of Cas9 protein introduced into the fertilized egg increases with the voltage of electroporation and the energization time, but if the voltage is too high or the energization time is too long, the survival rate of the fertilized egg tends to decrease. There is. The voltage and energization time can be adjusted as appropriate depending on the species of the mammal and the concentration of Cas9 protein. In step (b) of the present invention, the voltage is, for example, about 15V to about 55V, about 15V to about 50V, about 20V to about 50V or about 25V to about 40V, for example, about 15V, about 20V per 1mm distance between electrodes. , About 25V, about 30V, about 35V, about 40V, about 45V or about 50V. In step (b) of the present invention, the energization time is, for example, about 2 msec to about 35 msec, about 2 msec to about 25 msec, about 2 msec to about 22 msec, about 2.5 msec to about 18 msec, or about 2 msec to about 15 msec, for example. About 2.5msec, about 3msec, about 3.5msec, about 4.5msec, about 5msec, about 5.5msec, about 6msec, about 7msec, about 8msec, about 9msec, about 10msec, about 11msec, about 12msec, about 13msec, It is about 14 msec, about 16 msec or about 18 msec.
本発明のある実施態様では、電圧と通電時間の積の値が、電極間距離１ｍｍ当たり約９９０Ｖｍｓｅｃ以下、さらに好ましくは約６３０Ｖｍｓｅｃ以下、より好ましくは約３３０Ｖｍｓｅｃ以下であるように電圧と通電時間を設定する。電圧と通電時間の積の値は、Ｃａｓ９タンパク質濃度が高いほど低くすることができる。本発明のある実施態様では、電圧と通電時間の積の値が、電極間距離１ｍｍ当たり約０.９Ｖｍｓｅｃ以上、好ましくは約１２Ｖｍｓｅｃ以上であるように電圧と通電時間を設定する。例えば、タンパク質濃度が約５０μｇ／ｍｌの場合、電圧と通電時間の積の値は、約９０Ｖｍｓｅｃ以上、好ましくは約１２０Ｖｍｓｅｃ以上である。 In one embodiment of the present invention, the voltage and the energization time are set so that the value of the product of the voltage and the energization time is about 990 Vmsec or less, more preferably about 630 Vmsec or less, and more preferably about 330 Vmsec or less per 1 mm of the distance between the electrodes. do. The value of the product of voltage and energization time can be lowered as the Cas9 protein concentration increases. In one embodiment of the present invention, the voltage and the energization time are set so that the value of the product of the voltage and the energization time is about 0.9 Vmsec or more, preferably about 12 Vmsec or more per 1 mm of the distance between the electrodes. For example, when the protein concentration is about 50 μg / ml, the value of the product of the voltage and the energization time is about 90 Vmsec or more, preferably about 120 Vmsec or more.
例えば、電圧は電極間距離１ｍｍ当たり約１５Ｖないし約５０Ｖであり、通電時間は約２ｍｓｅｃないし約３５ｍｓｅｃであり、電圧と通電時間の積の値は、電極間距離１ｍｍ当たり約９０Ｖｍｓｅｃないし約９９０Ｖｍｓｅｃである。別の例では、電圧は電極間距離１ｍｍ当たり約１５Ｖないし約５０Ｖであり、通電時間は約２ｍｓｅｃないし約２２ｍｓｅｃであり、電圧と通電時間の積の値は、電極間距離１ｍｍ当たり約９０Ｖｍｓｅｃないし約３３０Ｖｍｓｅｃである。これらの例において、溶液中のＣａｓ９ タンパク質濃度は約５０ｎｇ／μｌ以上であり得る。 For example, the voltage is about 15 V to about 50 V per 1 mm distance between the electrodes, the energization time is about 2 msec to about 35 msec, and the product value of the voltage and the energization time is about 90 Vmsec to about 990 Vmsec per 1 mm distance between the electrodes. .. In another example, the voltage is about 15V to about 50V per 1mm distance between electrodes, the energization time is about 2msec to about 22msec, and the product of voltage and energization time is about 90Vmsec to about 90Vmsec per 1mm distance between electrodes. It is 330 Vmsec. In these examples, the Cas9 protein concentration in solution can be greater than or equal to about 50 ng / μl.
段階（ｂ）における電圧は一定であっても、変動してもよい。本発明のある実施態様では、段階（ｂ）における電圧は一定である。その場合、エレクトロポレーターとして、従来のスクエアパルス式エレクトロポレーターを使用できる。 The voltage in step (b) may be constant or variable. In one embodiment of the invention, the voltage in step (b) is constant. In that case, a conventional square pulse type electroporator can be used as the electroporator.
本発明のある実施態様では、電圧を複数のパルスに分けてかける。電圧を複数のパルスに分けてかける場合、通電時間は、各パルスの時間の合計である。例えば、電圧を２回ないし１５回または３回ないし１１回のパルスに分けてかける。本発明のある実施態様では、電圧を３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回または１１回のパルスに分けてかける。各パルスの時間は、例えば、約０.０１ｍｓｅｃ〜約３３ｍｓｅｃ、約０.０５ｍｓｅｃ〜約１２ｍｓｅｃ、約０.１ｍｓｅｃ〜約１０ｍｓｅｃ、約０.３ｍｓｅｃ〜約７ｍｓｅｃ、約０.４ｍｓｅｃないし約５ｍｓｅｃ、約０.５ｍｓｅｃないし約３ｍｓｅｃ、例えば、約０.５ｍｓｅｃ、約１ｍｓｅｃ、約２ｍｓｅｃまたは約３ｍｓｅｃである。各パルス間の間隔は、例えば、約０.５ないし約５００ｍｓｅｃ、好ましくは約５ないし約２５０ｍｓｅｃ、より好ましくは約１０ないし約１５０ｍｓｅｃ、さらに好ましくは約８０ないし約１２０ｍｓｅｃである。本発明のある実施態様では、パルス間の間隔は約９７ｍｓｅｃである。
本発明において、電圧を複数のパルスに分けてかける場合、各パルスの大きさは同じであっても、異なっていてもよい。
In one embodiment of the invention, the voltage is applied in multiple pulses. When the voltage is divided into a plurality of pulses, the energization time is the sum of the times of each pulse. For example, the voltage is applied in 2 to 15 or 3 to 11 pulses. In one embodiment of the invention, the voltage is applied in 3 times, 4 times, 5 times, 6 times, 7 times, 8 times, 9 times, 10 times or 11 times. The time of each pulse is, for example, about 0.01 msec to about 33 msec, about 0.05 msec to about 12 msec, about 0.1 msec to about 10 msec, about 0.3 msec to about 7 msec, about 0.4 msec to about 5 msec, about 0. It is .5 msec to about 3 msec, for example, about 0.5 msec, about 1 msec, about 2 msec or about 3 msec. The interval between each pulse is, for example, about 0.5 to about 500 msec, preferably about 5 to about 250 msec, more preferably about 10 to about 150 msec, and even more preferably about 80 to about 120 msec. In one embodiment of the invention, the spacing between pulses is about 97 msec.
In the present invention, when the voltage is divided into a plurality of pulses and applied, the magnitude of each pulse may be the same or different.
本発明において、電圧を複数のパルスに分けてかける場合、各パルスの方向は同じであってもよく、少なくとも１つのパルスの方向が他のパルスと逆であってもよい。また、両方向のパルスを用いる場合、各方向のパルスはいかなる順序であってもよい。例えば、一方向のパルスを連続してかけた後に逆方向のパルスをかけてもよく、各方向のパルスを交互にかけてもよく、各方向のパルスをランダムにかけてもよい。「逆方向のパルス」は、２本のエレクトロポレーション用電極の一方を陽極とし、他方を陰極とするパルスに対して、陽極と陰極を入れ替えた場合のパルスを意味する。 In the present invention, when the voltage is divided into a plurality of pulses, the direction of each pulse may be the same, and the direction of at least one pulse may be opposite to that of the other pulse. Further, when the pulses in both directions are used, the pulses in each direction may be in any order. For example, a pulse in one direction may be continuously applied and then a pulse in the opposite direction may be applied, a pulse in each direction may be applied alternately, or a pulse in each direction may be applied randomly. The "pulse in the opposite direction" means a pulse in which the anode and the cathode are exchanged with respect to a pulse in which one of the two electrodes for electroporation is an anode and the other is a cathode.
ゲノム編集
本発明において、「ゲノム編集」は、人工制限酵素を使用して哺乳動物細胞の１つまたはそれ以上の遺伝子を改変することを意味する。ゲノム編集により、対立遺伝子の一方または両方が改変される。本発明では、細菌由来のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用してゲノム編集を行う。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の詳細は、例えば、Wang, H. et al., Cell, 153, 910-918 (2013) および米国特許第８６９７３５９号に記載されており、これらの文献を引用により本明細書の一部とする。
Genome Editing In the present invention, "genome editing" means modifying one or more genes of a mammalian cell using an artificial restriction enzyme. Genome editing modifies one or both of the alleles. In the present invention, genome editing is performed using a CRISPR / Cas system derived from bacteria. Details of the CRISPR / Cas system are described, for example, in Wang, H. et al., Cell, 153, 910-918 (2013) and US Pat. No. 8,695,359, which are cited herein by reference. Be a part.
一般的に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系によるゲノム編集には、エンドヌクレアーゼのＣａｓ９タンパク質およびｇＲＮＡが必要である。ｇＲＮＡは、細菌のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを組み合わせて１つのキメラＲＮＡにしたものである。従って、ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの標的配列特異性と、Ｃａｓ９タンパク質の足場となるｔｒａｃｒＲＮＡの特性を併せ持つ。ｇＲＮＡとＣａｓ９が細胞内に存在すると、ゲノム内の標的配列が永続的に改変され得る。 In general, genome editing with the CRISPR / Cas system requires the Cas9 protein and gRNA of endonucleases. The gRNA is a combination of bacterial crRNA and tracrRNA into one chimeric RNA. Therefore, gRNA has both the target sequence specificity of crRNA and the characteristics of tracrRNA that serves as a scaffold for Cas9 protein. The presence of gRNA and Cas9 in the cell can permanently alter the target sequence in the genome.
ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９タンパク質複合体は、ｇＲＮＡ配列とゲノムＤＮＡ内の標的配列との相補的塩基結合により、標的配列にリクルートされる。ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９タンパク質複合体が標的配列に結合するためには、ゲノム内の標的配列は、標的配列の直後にＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ（Protospacer Adjacent Motif））配列を含まなければならない。ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９タンパク質複合体の標的配列への結合は、Ｃａｓ９タンパク質をゲノム内の標的配列に局在化させ、Ｃａｓ９タンパク質はＤＮＡの両方の鎖を切断し、ＤＳＢ（二本鎖切断（Double Strand Break））を引き起こす。ＤＳＢは、ＮＨＥＪ（非相同末端結合（Non-Homologous End Joining））ＤＮＡ修復経路、または、ＨＤＲ（相同組換え修復）経路により修復され得る。ＮＨＥＪ修復経路は、ＤＳＢの部位にしばしば塩基の挿入／欠損を与え、それはフレームシフトおよび／または停止コドンをもたらし、標的遺伝子のオープンリーディングフレームを破壊し得る。ＨＤＲ経路は、ＤＳＢを修復するために、修復鋳型の存在を必要とする。ＨＤＲでは、修復鋳型の配列が、切断された標的配列に忠実に複写される。修復鋳型とＨＤＲを利用して、標的遺伝子に所望の変異を導入できる。 The gRNA / Cas9 protein complex is recruited to the target sequence by complementary base binding between the gRNA sequence and the target sequence in the genomic DNA. In order for the gRNA / Cas9 protein complex to bind to the target sequence, the target sequence in the genome must contain the PAM (Protospacer Adjacent Motif) sequence immediately after the target sequence. Binding of the gRNA / Cas9 protein complex to the target sequence localizes the Cas9 protein to the target sequence in the genome, where the Cas9 protein breaks both strands of DNA and DSBs (Double Strand Break). ))cause. DSBs can be repaired by the NHEJ (Non-Homologous End Joining) DNA repair pathway or the HDR (Homologous Recombination Repair) pathway. The NHEJ repair pathway often results in base insertion / deletion at the site of the DSB, which results in frameshifts and / or stop codons, which can disrupt the open reading frame of the target gene. The HDR pathway requires the presence of a repair template to repair the DSB. In HDR, the sequence of the repair template is faithfully copied to the cleaved target sequence. Repair templates and HDR can be used to introduce the desired mutation into the target gene.
Ｃａｓ９タンパク質
野生型Ｃａｓ９タンパク質は、ＲｕｖＣおよびＨＮＨの２つの機能的ヌクレアーゼドメインを有し、これらは各々、ＤＮＡの二本鎖の異なる鎖を切断する。これらのドメインの両方が活性である場合、Ｃａｓ９タンパク質はゲノムＤＮＡにＤＳＢ（二本鎖切断）を引き起こす。ＲｕｖＣまたはＨＮＨのいずれかの触媒活性のみを有するＣａｓ９タンパク質も開発されている。この場合、Ｃａｓ９タンパク質は標的ＤＮＡのいずれかの鎖のみを切断する。例えば、スタフィロコッカス・ピオゲニス（Streptococcus pyogenes）由来のＣａｓ９タンパク質のＲｕｖＣドメインは、Ｄ１０Ａ変異により不活性化され、ＨＮＨドメインはＨ８４０Ａ変異により不活性化される。
Cas9 protein Wild-type Cas9 protein has two functional nuclease domains, RuvC and HNH, each of which cleaves different strands of DNA. When both of these domains are active, the Cas9 protein causes DSBs (double-strand breaks) in genomic DNA. Cas9 proteins with only the catalytic activity of either RuvC or HNH have also been developed. In this case, the Cas9 protein cleaves only one strand of the target DNA. For example, the RuvC domain of the Cas9 protein from Streptococcus pyogenes is inactivated by the D10A mutation and the HNH domain is inactivated by the H840A mutation.
Ｃａｓ９タンパク質のＤＮＡ結合活性は、そのヌクレアーゼ活性から独立している。ヌクレアーゼ活性を担うＲｕｖＣおよびＨＮＨが不活性であり、Ｃａｓ９タンパク質がヌクレアーゼ活性を全く持たない場合でも、Ｃａｓ９タンパク質はｇＲＮＡ依存的にＤＮＡに結合する能力を保持する。従って、ヌクレアーゼとして不活性なＣａｓ９タンパク質（ｄＣａｓ９タンパク質）を、分子生物学的ツールとして利用することができる。例えば、ｇＲＮＡを利用してｄＣａｓ９タンパク質を既知の転写調節ドメインに結合させることにより、遺伝子の発現を活性化または抑制する転写レギュレーターとして利用することができる。例えば、転写活性化因子と融合させたｄＣａｓ９タンパク質は、標的配列の転写を活性化できる。逆に、ｄＣａｓ９タンパク質のみが標的配列に結合すると、転写を抑制し得る。遺伝子のプロモーターに近い領域にあるｇＲＮＡ標的配列を選択することにより、様々な遺伝子の転写を調節することができる。あるいは、クロマチン免疫沈降などにおいて、エピトープタグに融合させたｄＣａｓ９タンパク質を、任意のゲノムＤＮＡ配列を標的とするｇＲＮＡと共に使用することにより、ゲノムＤＮＡを精製できる。ＧＦＰ、ｍｃｈｅｒｒｙなどの蛍光タンパク質マーカーと融合させたｄＣａｓ９タンパク質を、任意のゲノムＤＮＡ配列を標的とするｇＲＮＡと組み合わせて、生きている細胞で検出可能なＤＮＡ標識として使用することもできる。 The DNA-binding activity of the Cas9 protein is independent of its nuclease activity. Even when RuvC and HNH, which are responsible for nuclease activity, are inactive and Cas9 protein has no nuclease activity, the Cas9 protein retains its ability to bind to DNA in a gRNA-dependent manner. Therefore, the Cas9 protein (dCas9 protein), which is inert as a nuclease, can be used as a molecular biological tool. For example, by using gRNA to bind the dCas9 protein to a known transcriptional regulatory domain, it can be used as a transcriptional regulator that activates or suppresses gene expression. For example, the dCas9 protein fused with a transcriptional activator can activate transcription of the target sequence. Conversely, if only the dCas9 protein binds to the target sequence, it can suppress transcription. Transcription of various genes can be regulated by selecting gRNA target sequences that are located near the promoter of the gene. Alternatively, genomic DNA can be purified by using the dCas9 protein fused to the epitope tag, such as in chromatin immunoprecipitation, with a gRNA that targets any genomic DNA sequence. The dCas9 protein fused with fluorescent protein markers such as GFP and mcherry can also be used as a detectable DNA label in living cells in combination with a gRNA that targets any genomic DNA sequence.
本発明において、「Ｃａｓ９タンパク質」は、ｇＲＮＡ依存的にＤＮＡに結合する能力を有するタンパク質を意味し、ＲｕｖＣおよびＨＮＨヌクレアーゼ活性の両方を有するものも、ＲｕｖＣおよびＨＮＨヌクレアーゼ活性のいずれかまたは両方を有さないものも含まれる。Ｃａｓ９タンパク質のＤＮＡ結合活性およびヌクレアーゼ活性は、例えば、引用により本明細書の一部とするSamuel H. Sternberg et al., Nature 507, 62-67 (2014) に記載の方法により測定できる。 In the present invention, "Cas9 protein" means a protein having the ability to bind to DNA in a gRNA-dependent manner, and those having both RuvC and HNH nuclease activity also have RuvC and / or HNH nuclease activity. Some do not. The DNA binding activity and nuclease activity of the Cas9 protein can be measured, for example, by the method described in Samuel H. Sternberg et al., Nature 507, 62-67 (2014), which is incorporated herein by reference.
本発明のある実施態様では、Ｃａｓ９タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ系を有する細菌に由来するものである。ＣＲＩＳＰＲ系を有することが知られている細菌には、アエロピュルム属（Aeropyrum）、ピュロバクルム属（Pyrobaculum）、スルフォロブス属（Sulfolobus）、アルカエオグロブス属（Archaeoglobus）、ハロアーキュラ属（Halocarcula）、メタノバクテリウム属（Methanobacteriumn）、メタノコックス属（Methanococcus）、メタノサルキナ属（Methanosarcina）、メタノピュルス属（Methanopyrus）、ピュロコックス属（Pyrococcus）、ピクロフィルス属（Picrophilus）、テルモプラズマ属（Thermoplasma）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）、ストレプトマイセス属（Streptomyces）、アクウィフェクス属（Aquifex）、ポルフィロモナス属（Porphyromonas）、クロロビウム属（Chlorobium）、サーマス属（Thermus）、バシラス属（Bacillus）、リステリア属（Listeria）、スタフィロコッカス属（Staphylococcus）、クロストリジウム属（Clostridium）、サーモアナエロバクター属（Thermoanaerobacter）、マイコプラズマ属（Mycoplasma）、フソバクテリウム属（Fusobacterium）、アゾアルカス属（Azoarcus）、クロモバクテリウム属（Chromobacterium）、ナイセリア属（Neisseria）、ニトロソモナス属（Nitrosomonas）、デスルフォビブリオ属（Desulfovibrio）、ジオバクター属（Geobacter）、マイクロコッカス属（Micrococcus）、カンピロバクター属（Campylobacter）、ウォリネラ属（Wolinella）、アシネトバクター属（Acinetobacter）、エルウィニア属（Erwinia）、エスケリキア属（Escherichia）、レジオネラ属（Legionella）、メチロコッカス属（Methylococcus）、パスツレラ属（Pasteurella）、フォトバクテリウム属（Photobacterium）、サルモネラ属（Salmonella）、ザントモナス属（Xanthomonas）、エルシニア属（Yersinia）、トレポネーマ属（Treponema）およびテルモトガ属（Thermotoga）などに属する細菌が含まれる。例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、スタフィロコッカス・ピオゲニス、ナイセリア・メニンギティディス（Neisseria meningitidis）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）、トレポネーマ・デンティコラ（Treponema denticola）などの細菌に由来するものである。 In one embodiment of the invention, the Cas9 protein is derived from a bacterium having a CRISPR system. Bacteria known to have the CRISPR system include Aeropyrum, Pyrobaculum, Sulfolobus, Archaeoglobus, Halocarcula, and Metanobacterium. (Methanobacteriumn), Methanococcus, Methanosarcina, Methanopyrus, Pyrococcus, Picrophilus, Thermoplasma, Corynebacterium Mycobacterium, Streptomyces, Aquifex, Porphyromonas, Chlorobium, Thermus, Bacillus, Listeria (Listeria), Staphylococcus, Clostridium, Thermoanaerobacter, Mycoplasma, Fusobacterium, Azoarcus, Chromobacterium. ), Neisseria, Nitrosomonas, Desulfovibrio, Geobacter, Micrococcus, Campylobacter, Wolinella, Acinetobacter (Acinetobacter), Erwinia, Escherichia, Legionella, Methylococcus, Pasteurella, Photobacterium, Salmonella, Zantmonella Bacteria belonging to the genus (Xanthomonas), Yersinia (Yersinia), Treponema (Treponema) and Thermotogae (Thermotoga) are included. For example, the Cas9 protein is derived from bacteria such as Staphylococcus pyogenis, Neisseria meningitidis, Streptococcus thermophilus, and Treponema denticola.
本発明のある実施態様では、Ｃａｓ９タンパク質は、他のタンパク質またはペプチドとの融合タンパク質であり得る。他のタンパク質またはペプチドには、例えば、蛍光タンパク質、転写調節因子、エピトープタグ、タンパク質精製用タグ、核移行シグナルペプチドなどが含まれる。 In one embodiment of the invention, the Cas9 protein can be a fusion protein with another protein or peptide. Other proteins or peptides include, for example, fluorescent proteins, transcriptional regulators, epitope tags, protein purification tags, nuclear localization signal peptides and the like.
本発明のある実施態様では、Ｃａｓ９タンパク質は、図１に示す配列番号１ないし４のいずれかのアミノ酸配列に約８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、Ｃａｓ９タンパク質のｇＲＮＡ依存的ＤＮＡ結合活性を有し、場合によりＲｕｖＣヌクレアーゼ活性およびＨＮＨヌクレアーゼ活性のいずれかまたは両方を有するタンパク質であり得る。例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、配列番号１ないし４のいずれかのアミノ酸配列を含むか、または、配列番号１ないし４のいずれかのアミノ酸配列からなる。あるいは、Ｃａｓ９タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列に約８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、Ｃａｓ９タンパク質のｇＲＮＡ依存的ＤＮＡ結合活性を有し、場合によりＲｕｖＣおよび／またはＨＮＨヌクレアーゼ活性を有するタンパク質であり得る。例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含むか、または、配列番号１のアミノ酸配列からなる。配列番号１ないし４は、各々、スタフィロコッカス・ピオゲニス、ナイセリア・メニンギティディス、ストレプトコッカス・サーモフィラス、トレポネーマ・デンティコラ由来のＣａｓ９タンパク質のアミノ酸配列である。 In one embodiment of the invention, the Cas9 protein comprises an amino acid sequence having about 80% or more sequence identity to any of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 4 shown in FIG. 1 and is gRNA dependent on the Cas9 protein. It can be a protein having a specific DNA binding activity and optionally one or both of RuvC nuclease activity and HNH nuclease activity. For example, the Cas9 protein comprises or consists of any of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 4. Alternatively, the Cas9 protein comprises an amino acid sequence having about 80% or more sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and has a gRNA-dependent DNA binding activity of the Cas9 protein, optionally RuvC and / or HNH. It can be a protein with nuclease activity. For example, the Cas9 protein comprises or consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. SEQ ID NOs: 1 to 4 are amino acid sequences of Cas9 proteins derived from Staphylococcus pyogenis, Neisseria meningitidis, Streptococcus thermophilus, and Treponema denticola, respectively.
本発明のある実施態様では、Ｃａｓ９タンパク質は、配列番号１ないし４のいずれかのアミノ酸配列に、約８０％以上、例えば約８５％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９７％以上、より好ましくは約９８％以上、より好ましくは約９９％以上、より好ましくは約９９.５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。アミノ酸配列同一性は、配列を最適にアライメントした場合に、２つの配列において同一であるアミノ酸残基の割合を意味する。従って、例えば、９０％アミノ酸配列同一性とは、最適にアライメントされた２つのアミノ酸配列において９０％のアミノ酸が同一であることを意味する。アミノ酸配列のアライメントおよび同一性の計算の方法は当業者に周知であり、例えば、BLAST等のプログラムを利用することができる。 In one embodiment of the invention, the Cas9 protein is added to any of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 4 by about 80% or more, such as about 85% or more, preferably about 90% or more, more preferably about 95% or more. , More preferably about 97% or more, more preferably about 98% or more, more preferably about 99% or more, more preferably about 99.5% or more, containing an amino acid sequence having sequence identity. Amino acid sequence identity means the proportion of amino acid residues that are identical in the two sequences when the sequences are optimally aligned. Thus, for example, 90% amino acid sequence identity means that 90% of the amino acids are identical in the two optimally aligned amino acid sequences. Methods of amino acid sequence alignment and calculation of identity are well known to those of skill in the art and, for example, programs such as BLAST can be utilized.
Ｃａｓ９タンパク質は、当分野で公知のいかなるペプチド合成の技法によっても調製でき、特に、化学合成または遺伝子組換え技法を利用して調製できる。当業者は、例えば、配列番号１ないし４に基づいてＣａｓ９タンパク質を調製できる。あるいは、購入できるＣａｓ９タンパク質を使用してもよい。Ｃａｓ９タンパク質は、例えば、タカラバイオ社、New England BioLabs、thermofisher、ToolGen、PNA bio等から購入し得る。 Cas9 protein can be prepared by any peptide synthesis technique known in the art, especially by utilizing chemical synthesis or genetic recombination techniques. One of ordinary skill in the art can prepare Cas9 protein based on, for example, SEQ ID NOs: 1 to 4. Alternatively, Cas9 protein that can be purchased may be used. Cas9 protein can be purchased from, for example, Takara Bio, New England BioLabs, thermofisher, ToolGen, PNA bio and the like.
本発明のある実施態様では、Ｃａｓ９ タンパク質を含む溶液は、１種またはそれ以上の核酸分子を含み、当該核酸分子がＣａｓ９ タンパク質と共に受精卵に導入される。核酸分子は、例えば、ｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡまたはｓｓＯＤＮであり得、ｇＲＮＡ単独、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの組合せ、ｇＲＮＡおよびｓｓＯＤＮの組合せ、または、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｓｓＯＤＮの組合せを使用できる。 In one embodiment of the invention, the solution containing the Cas9 protein comprises one or more nucleic acid molecules, which are introduced into the fertilized egg together with the Cas9 protein. The nucleic acid molecule can be, for example, gRNA, crRNA, tracrRNA or ssODN, and gRNA alone, a combination of crRNA and tracrRNA, a combination of gRNA and ssODN, or a combination of crRNA, tracrRNA and ssODN can be used.
本発明のある実施態様では、溶液中のｇＲＮＡの濃度は、約１０〜約１０００ｎｇ／μｌ、約５０〜約５００ｎｇ／μｌまたは約１００〜約３００ｎｇ／μｌ、例えば約２００ｎｇ／μｌであり得る。本発明のある実施態様では、溶液中のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの濃度は、各々、約１０〜約１０００ｎｇ／μｌ、約５０〜約５００ｎｇ／μｌまたは約１００〜約３００ｎｇ／μｌ、例えば約２００ｎｇ／μｌであり得る。溶液中のｓｓＯＤＮの濃度は、約１０〜約１０００ｎｇ／μｌ、約５０〜約５００ｎｇ／μｌまたは約１００〜約３００ｎｇ／μｌ、例えば約２００ｎｇ／μｌであり得る。 In one embodiment of the invention, the concentration of gRNA in solution can be from about 10 to about 1000 ng / μl, from about 50 to about 500 ng / μl or from about 100 to about 300 ng / μl, such as about 200 ng / μl. In one embodiment of the invention, the concentrations of crRNA and tracrRNA in solution are about 10 to about 1000 ng / μl, about 50 to about 500 ng / μl or about 100 to about 300 ng / μl, eg, about 200 ng / μl, respectively. possible. The concentration of ssODN in the solution can be about 10 to about 1000 ng / μl, about 50 to about 500 ng / μl or about 100 to about 300 ng / μl, for example about 200 ng / μl.
ｇＲＮＡ
ゲノム編集には、標的特異的なｇＲＮＡが必要である。本発明において、「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」は、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡが融合した人工１本鎖ＲＮＡを意味する。ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの間にリンカー配列が存在してもよい。Ｃａｓ９タンパク質はｇＲＮＡの存在下で標的特異的にゲノムＤＮＡに結合できる。
gRNA
Genome editing requires target-specific gRNAs. In the present invention, "guide RNA" or "gRNA" means an artificial single-stranded RNA in which crRNA and tracrRNA are fused. A linker sequence may be present between crRNA and tracrRNA. The Cas9 protein can bind to genomic DNA in a target-specific manner in the presence of gRNA.
ｃｒＲＮＡは、細菌の内在性ＲＮＡに由来し、ｇＲＮＡの配列特異性を担う。本発明において、ｃｒＲＮＡは、ゲノムＤＮＡ内の標的配列またはそれに相補的な配列を含む。標的配列としては、ゲノムＤＮＡ内で、その直後にＰＡＭ配列を有するヌクレオチド配列を選択する。標的配列は、ゲノムＤＮＡのいずれの鎖にあってもよい。標的配列の選択および／またはｇＲＮＡの設計に利用できる数々のツール、および、バイオインフォマティックスにより予想された様々な種の様々な遺伝子についての標的配列のリストを利用することができ、例えば、引用により本明細書の一部とするFeng Zhang lab's Target Finder、Michael Boutros lab's Target Finder (E-CRISP)、RGEN Tools: Cas-OFFinder、CasFinder: Flexible algorithm for identifying specific Cas9 targets in genomes、CRISPR Optimal Target Finder などが挙げられる。 The crRNA is derived from the endogenous RNA of the bacterium and is responsible for the sequence specificity of the gRNA. In the present invention, the crRNA includes a target sequence in genomic DNA or a sequence complementary thereto. As the target sequence, a nucleotide sequence having a PAM sequence immediately after that in the genomic DNA is selected. The target sequence may be on any strand of genomic DNA. A number of tools available for target sequence selection and / or gRNA design, as well as a list of target sequences for different genes of different species predicted by bioinformatics, eg, citations. Feng Zhang lab's Target Finder, Michael Boutros lab's Target Finder (E-CRISP), RGEN Tools: Cas-OFFinder, CasFinder: Flexible algorithm for identifying specific Cas9 targets in genomes, CRISPR Optimal Target Finder, etc. Can be mentioned.
Ｃａｓ９タンパク質がＤＮＡに結合するためには、ゲノムＤＮＡ内の標的配列は、標的配列の直後にＰＡＭ配列を有する必要がある。ＰＡＭ配列は、ゲノムＤＮＡ内の標的配列の直後に存在するが、ｇＲＮＡ内の標的配列の直後には存在しない。Ｃａｓ９タンパク質は、標的配列の直後にＰＡＭ配列を有するいかなるＤＮＡ配列にも結合できる。ＰＡＭ配列は、Ｃａｓ９タンパク質が由来する細菌の種により異なる。最も広く使用されているＣａｓ９タンパク質はスタフィロコッカス・ピオゲニスに由来し、対応するＰＡＭ配列は、標的配列の３’末端の直後に位置するＮＧＧの配列である。様々な細菌の種とＰＡＭ配列の組合せが知られており、例えば、ナイセリア・メニンギティディス：ＮＮＮＮＧＡＴＴ、ストレプトコッカス・サーモフィラス：ＮＮＡＧＡＡ、トレポネーマ・デンティコラ：ＮＡＡＡＡＣなどが挙げられる。これらの配列において、Ｎは、Ａ、Ｔ、ＧおよびＣのいずれかの塩基を示す。 In order for the Cas9 protein to bind to DNA, the target sequence in genomic DNA must have a PAM sequence immediately after the target sequence. The PAM sequence is present immediately after the target sequence in the genomic DNA, but not immediately after the target sequence in the gRNA. The Cas9 protein can bind to any DNA sequence that has a PAM sequence immediately after the target sequence. The PAM sequence depends on the bacterial species from which the Cas9 protein is derived. The most widely used Cas9 protein is derived from Staphylococcus pyogenis, and the corresponding PAM sequence is the sequence of NGG located immediately after the 3'end of the target sequence. Combinations of various bacterial species and PAM sequences are known, such as Neisseria meningitidis: NNNNGATT, Streptococcus thermophilus: NNAGAA, Treponema denticola: NAAAAC and the like. In these sequences, N represents any of the bases A, T, G and C.
ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの一部と相補的に結合し、ヘアピン構造を形成する。この構造がＣａｓ９に認識され、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびＣａｓ９の複合体が形成される。従って、ｔｒａｃｒＲＮＡはｇＲＮＡのＣａｓ９タンパク質結合能力を担う。ｔｒａｃｒＲＮＡは、細菌の内在性ＲＮＡに由来し、細菌の種によって異なる配列を有する。本発明のｔｒａｃｒＲＮＡは、上記のＣＲＩＳＰＲ系を有することが知られている細菌のものであり得、好ましくは、ゲノム編集に使用するｔｒａｃｒＲＮＡとＣａｓ９タンパク質は、同じ細菌の種に由来する。例えば、スタフィロコッカス・ピオゲニス、ナイセリア・メニンギティディス、ストレプトコッカス・サーモフィラス、トレポネーマ・デンティコラのｔｒａｃｒＲＮＡを使用できる。 The tracrRNA binds complementarily to a portion of the crRNA to form a hairpin structure. This structure is recognized by Cas9 and a complex of crRNA, tracrRNA and Cas9 is formed. Therefore, tracrRNA is responsible for the Cas9 protein binding capacity of gRNA. TracrRNA is derived from the endogenous RNA of the bacterium and has different sequences depending on the species of the bacterium. The tracrRNA of the present invention can be of a bacterium known to have the above CRISPR system, preferably the tracrRNA and Cas9 protein used for genome editing are derived from the same bacterial species. For example, tracrRNAs of Staphylococcus pyogenis, Neisseria meningitidis, Streptococcus thermophilus, Treponema denticola can be used.
所望のｇＲＮＡ配列を有するＤＮＡをインビトロ転写用ベクターにクローニングし、インビトロで転写することにより、ｇＲＮＡを得ることができる。適するインビトロ転写用ベクターは、当業者に公知である。また、ｇＲＮＡの標的配列以外の配列を含むインビトロ転写用ベクターが当分野で公知である。標的配列のオリゴヌクレオチドを合成し、そのようなベクターに挿入し、インビトロ転写することにより、ｇＲＮＡを得ることができる。そのようなベクターには、例えば、addgene から購入できる、pUC57-sgRNA expression vector、pCFD1-dU6:1gRNA、pCFD2-dU6:2gRNA pCFD3-dU6:3gRNA、pCFD4-U6:1_U6:3tandemgRNAs、pRB17、pMB60、DR274、SP6-sgRNA-scaffold、pT7-gRNA、DR274、pUC57-Simple-gRNA backbone、並びに、Origene社から購入できるpT7-Guide-IVTが含まれる。インビトロ転写の方法は、当業者に公知である。 A gRNA can be obtained by cloning a DNA having a desired gRNA sequence into a vector for in vitro transcription and transcribing it in vitro. Suitable in vitro transcription vectors are known to those of skill in the art. In vitro transcription vectors containing sequences other than the target sequence of gRNA are known in the art. GRNAs can be obtained by synthesizing oligonucleotides of the target sequence, inserting them into such vectors, and transcribing them in vitro. Such vectors include, for example, pUC57-sgRNA expression vector, pCFD1-dU6: 1gRNA, pCFD2-dU6: 2gRNA pCFD3-dU6: 3gRNA, pCFD4-U6: 1_U6: 3tandemgRNAs, pRB17, pMB60, DR274, which can be purchased from addgene. , SP6-sgRNA-scaffold, pT7-gRNA, DR274, pUC57-Simple-gRNA backbone, as well as pT7-Guide-IVT available from Origene. Methods of in vitro transcription are known to those of skill in the art.
ｇＲＮＡの代わりに、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの組合せを使用してもよい。ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの組合せを使用する場合、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは各々分離したＲＮＡ分子であり、これらの重量比は１：１０〜１０：１、例えば１：１であり得る。 A combination of crRNA and tracrRNA may be used instead of gRNA. When using a combination of crRNA and tracrRNA, crRNA and tracrRNA are separate RNA molecules, respectively, and their weight ratio can be 1:10 to 10: 1, for example 1: 1.
ＨＤＲ（相同組換え修復）
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系では、また、ＨＤＲを利用して、標的配列の特定のヌクレオチドを改変することもできる。ＨＤＲによりゲノムＤＮＡ配列内のヌクレオチドを改変するためには、ＨＤＲの際に、所望の配列を含むＤＮＡ修復鋳型が存在しなければならない。本発明のある実施態様では、ＤＮＡ修復鋳型として、ｓｓＯＤＮ（一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド）を用いることができる。ｓｓＯＤＮは、ＤＳＢの上流および下流の配列に高い相同性を有する。各相同性領域の長さと位置は導入しようとする改変のサイズに依存する。適する鋳型の存在下で、ＨＤＲは、Ｃａｓ９タンパク質によるＤＳＢの部位で、特定のヌクレオチドを改変できる。ｓｓＯＤＮを設計する際には、修復された遺伝子がＣａｓ９タンパク質により切断されないように、ｓｓＯＤＮが、直後にＰＡＭ配列を有する標的配列を含まないように設計する。例えば、ＰＡＭ配列に対応する配列をｓｓＯＤＮ中では別の配列にすることにより、ｓｓＯＤＮがＣａｓ９タンパク質により切断されないようにできる。ｓｓＯＤＮの設計方法の詳細は、例えば、引用により本明細書の一部とするYang, H. et al., Cell, 154(6), 1370-9 (2013) に記載されている。ｓｓＯＤＮは、通常、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９遺伝子またはタンパク質と共に細胞に導入される。
HDR (Homologous Recombination Repair)
In the CRISPR / Cas system, HDR can also be utilized to modify specific nucleotides in the target sequence. In order for HDR to modify a nucleotide in a genomic DNA sequence, a DNA repair template containing the desired sequence must be present during HDR. In one embodiment of the invention, ssODN (single-stranded oligodeoxynucleotide) can be used as a DNA repair template. ssODN has high homology to the sequences upstream and downstream of the DSB. The length and location of each homology region depends on the size of the modification to be introduced. In the presence of a suitable template, HDR can modify specific nucleotides at the site of DSB by the Cas9 protein. When designing the ssODN, the ssODN is designed so that the repaired gene is not cleaved by the Cas9 protein and the ssODN does not immediately contain a target sequence having a PAM sequence. For example, the sequence corresponding to the PAM sequence can be set to another sequence in ssODN so that the ssODN is not cleaved by the Cas9 protein. Details of the ssODN design method are described, for example, in Yang, H. et al., Cell, 154 (6), 1370-9 (2013), which is incorporated herein by reference. ssODN is usually introduced into cells along with gRNA and Cas9 gene or protein.
本発明において、エレクトロポレーションされた受精卵、または、当該受精卵に由来する細胞の少なくとも１個において、ｇＲＮＡの存在下でゲノム中の少なくとも１つの標的遺伝子のゲノム編集が起こり得る。本発明のある実施態様では、本発明の方法は、ゲノム編集が起こったことを確認する段階をさらに含む。ゲノム編集が起こったことは、当分野で知られている様々な方法により確認できる。例えば、標的遺伝子の表現型が知られている場合に、その表現型の変化を検出することにより、あるいは、受精卵または受精卵から発生した胚の細胞において、標的配列を含むゲノムＤＮＡの配列を解読することにより確認できる。ＨＤＲの場合は、ｓｓＯＤＮに制限酵素切断部位を組み込むことにより、ＲＦＬＰ（制限断片長多型）で評価することも可能である。これらの方法は、当分野で周知である。 In the present invention, genome editing of at least one target gene in the genome can occur in the presence of gRNA in the electroporated fertilized egg or at least one cell derived from the fertilized egg. In certain embodiments of the invention, the method of the invention further comprises confirming that genome editing has occurred. The occurrence of genome editing can be confirmed by various methods known in the art. For example, if the phenotype of the target gene is known, the sequence of genomic DNA containing the target sequence can be obtained by detecting the change in the phenotype, or in the cells of the fertilized egg or the embryo developed from the fertilized egg. It can be confirmed by decoding. In the case of HDR, it is also possible to evaluate by RFLP (restricted fragment length polymorphism) by incorporating a restriction enzyme cleavage site into ssODN. These methods are well known in the art.
本発明において、「哺乳動物」は、哺乳綱に分類されるあらゆる生物を含む。哺乳動物は、例えば、霊長目（例えば、サル、ヒトなど）、齧歯目（例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスターなど）、鯨偶蹄目（例えば、ブタ、イノシシ、ウシ、ヒツジ、ヤギ）、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギなどを含む。ある実施態様では、哺乳動物は非ヒト哺乳動物である。ある実施態様では、哺乳動物は齧歯目、特にマウスである。ある実施態様では、哺乳動物は鯨偶蹄目、特にブタである。 In the present invention, "mammal" includes any organism classified in the class Mammal. Mammals include, for example, primates (eg, monkeys, humans, etc.), rodents (eg, mice, rats, guinea pigs, hamsters, etc.), artiodactyla (eg, pigs, wild boars, cows, sheep, goats), Includes horses, dogs, cats, rabbits, etc. In certain embodiments, the mammal is a non-human mammal. In some embodiments, the mammal is a rodent, especially a mouse. In one embodiment, the mammal is Cetartiodactyla, in particular a pig.
本発明において、「受精卵」は、受精後の卵または胚を意味し、受精卵（１細胞期）および２細胞期から胚盤胞期までの発生初期胚を含む。受精卵は、体内または体外で受精した受精卵であり得、卵子または受精卵として冷凍保存されたものであってもよい。受精卵の調製、培養および保存の方法は、当分野で公知である。好ましくは、エレクトロポレーションに使用する前に、エレクトロポレーション用の溶液で受精卵を洗浄し、培養培地を除去する。本発明のある実施態様では、受精卵は、１細胞期ないし桑実胚期、好ましくは１細胞期ないし８細胞期、より好ましくは１細胞期ないし４細胞期、より好ましくは１細胞期ないし２細胞期、例えば１細胞期のものである。本発明のある実施態様では、受精の約６時間後以降、好ましくは約９時間後以降、より好ましくは約１２時間後以降にエレクトロポレーションを実施する。本発明のある実施態様では、受精の約６時間〜約２０時間後、好ましくは約９時間〜約１６時間後、より好ましくは約１１時間〜１４時間後、例えば約１２時間〜１３時間後にエレクトロポレーションを実施する。受精卵は、通常、透明帯と呼ばれる保護膜を有する。透明帯は、酸性タイロード液、グルタチオン等の薬剤による処理により除去または薄化できるが、本発明の方法においては、透明帯は除去または薄化しても、しなくてもよい。好ましくは、薬剤処理により透明帯を除去または薄化していない受精卵を使用する。本発明において、「透明帯を除去または薄化していない受精卵」は、透明帯を除去または薄化するための薬剤による処理を受けていない受精卵を意味する。透明帯を除去または薄化するための薬剤には、酸性タイロードおよびグルタチオンが含まれるが、これらに限定されない。 In the present invention, "fertilized egg" means an egg or embryo after fertilization, and includes a fertilized egg (1 cell stage) and an early developmental embryo from the 2 cell stage to the blastocyst stage. The fertilized egg may be a fertilized egg fertilized in or out of the body, and may be an egg or one frozen and stored as a fertilized egg. Methods of preparing, culturing and storing fertilized eggs are known in the art. Preferably, the fertilized egg is washed with a solution for electroporation and the culture medium is removed prior to use for electroporation. In one embodiment of the invention, the fertilized egg is in the 1-cell stage to the morula stage, preferably the 1-cell stage to the 8-cell stage, more preferably the 1-cell stage to the 4-cell stage, and more preferably the 1-cell stage to 2 cells. It is in the cell stage, for example, the one-cell stage. In one embodiment of the invention, electroporation is performed after about 6 hours of fertilization, preferably after about 9 hours, more preferably after about 12 hours. In one embodiment of the invention, the electro is about 6 to about 20 hours after fertilization, preferably about 9 to about 16 hours, more preferably about 11 to 14 hours, for example about 12 to 13 hours. Carry out poration. Fertilized eggs usually have a protective membrane called the zona pellucida. The zona pellucida can be removed or thinned by treatment with a chemical such as an acidic tie load solution or glutathione, but in the method of the present invention, the zona pellucida may or may not be removed. Preferably, fertilized eggs that have not had their zona pellucida removed or diluted by chemical treatment are used. In the present invention, "fertilized egg without removing or thinning the zona pellucida" means a fertilized egg that has not been treated with a drug for removing or thinning the zona pellucida. Agents for removing or diluting the zona pellucida include, but are not limited to, acidic tielords and glutathione.
本発明のある実施態様は、エレクトロポレーションされた受精卵を培養し、受精卵の生存を確認する段階を含む。受精卵の培養方法は、当業者に周知である。受精卵の生存は、エレクトロポレーション後に受精卵の少なくとも１回の細胞***が起こったことを観察することにより確認できる。 One embodiment of the present invention comprises culturing an electroporated fertilized egg and confirming the survival of the fertilized egg. Methods of culturing fertilized eggs are well known to those skilled in the art. Survival of the fertilized egg can be confirmed by observing at least one cell division of the fertilized egg after electroporation.
本発明のある実施態様では、ゲノム編集された哺乳動物の受精卵を得ることができる。本発明のある実施態様は、また、本発明の方法で得られる受精卵をレシピエント動物に移植することを含む遺伝子改変動物の作製方法を提供する。レシピエント動物は、通常、受精卵と同じ動物種の偽妊娠状態のメスであり、その卵管に受精卵を移植する。受精卵（胚）の発生段階によっては、子宮に移植する場合もあり得る。受精卵を移植されたレシピエント動物は、遺伝子改変動物を出産することができる。遺伝子改変動物の作製方法は当業者に公知であり、例えば、引用により本明細書の一部とするManipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Fourth Edition (Cold Spring Harbor Press) に記載の方法を用いる。 In one embodiment of the invention, a genome-edited mammalian fertilized egg can be obtained. One embodiment of the present invention also provides a method for producing a genetically modified animal, which comprises transplanting a fertilized egg obtained by the method of the present invention into a recipient animal. The recipient animal is usually a pseudopregnant female of the same animal species as the fertilized egg, and the fertilized egg is transplanted into the oviduct. Depending on the developmental stage of the fertilized egg (embryo), it may be transplanted into the uterus. Recipient animals transplanted with fertilized eggs can give birth to genetically modified animals. Methods for producing genetically modified animals are known to those of skill in the art, and for example, the method described in Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Fourth Edition (Cold Spring Harbor Press), which is a part of the present specification by reference, is used.
本発明により、エレクトロポレーションで、Ｃａｓ９ タンパク質を哺乳動物の受精卵に導入することができる。エレクトロポレーションの利点は、胚の生存率が高いこと、および、特別な手技を必要とせず、時間のかからない技術であることである。１００個の受精卵の細胞質または前核にｍＲＮＡまたはタンパク質をマイクロインジェクションする場合、熟練者であっても１時間以上を要するが、エレクトロポレーションは、これを数分で、単純な作業で、達成できる。加えて、市販のエレクトロポレーションシステムの価格は、マイクロインジェクションシステムよりも一般的に安い。さらに、Ｃａｓ９ タンパク質をエレクトロポレーションすると、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡをエレクトロポレーションするよりもゲノム編集の効率がよい。このことは、穏やかなエレクトロポレーション条件の選択を可能にし、胚の生存率をさらに高めることができる。従って、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系によるゲノム編集およびこれを利用した遺伝子改変動物の作製の効率を高め、迅速化し、コストを低減することに貢献し得る。 According to the present invention, Cas9 protein can be introduced into fertilized mammalian eggs by electroporation. The advantages of electroporation are high embryo viability and a time-saving technique that does not require any special procedure. Microinjecting mRNA or protein into the cytoplasm or pronucleus of 100 fertilized eggs requires more than an hour, even for a skilled person, but electroporation achieves this in minutes and with a simple task. can. In addition, commercial electroporation systems are generally cheaper than microinjection systems. In addition, electroporation of Cas9 protein is more efficient in genome editing than electroporation of Cas9 mRNA. This allows selection of mild electroporation conditions and can further enhance embryo viability. Therefore, the present invention can contribute to increasing the efficiency, speeding up, and reducing the cost of genome editing by the CRISPR / Cas system and the production of genetically modified animals using the same.
実施例１ マウス受精卵のゲノム編集
実施例１−１ Ｃａｓ９タンパク質のエレクトロポレーションによるｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子のゲノム編集
Ｃａｓ９タンパク質
タカラバイオ Guide-it（商標）sgRNA Screening Kit（631440）に含まれるＣａｓ９タンパク質を使用した（配列番号５）。これは、Streptococcus pyogenesに由来するＣａｓ９タンパク質と核移行シグナルおよびＨＡタグの融合タンパク質であり、Nature Biotechnology, vol.31, (3) 230-232 に記載の方法により製造されたものである（Supplementary Methods / Supplementary Figure 1 参照）。
Example 1 Genome editing of fertilized mouse eggs
Example 1-1 Genome editing of mCherry gene by electroporation of Cas9 protein
Cas9 protein The Cas9 protein contained in the Takara Bio Guide-it ™ sgRNA Screening Kit (631440) was used (SEQ ID NO: 5). It is a fusion protein of Cas9 protein derived from Streptococcus pyogenes and a nuclear translocation signal and HA tag, and was produced by the method described in Nature Biotechnology, vol.31, (3) 230-232 (Supplementary Methods). / See Supplementary Figure 1).
ｇＲＮＡの調製
ｍＣｈｅｒｒｙ中の標的配列（５’−ＧＧＣＣＡＣＧＡＧＴＴＣＧＡＧＡＴＣＧＡＧＧＧ−３’（配列番号６）およびその相補的配列）を含むオリゴヌクレオチド対をアニーリングし、ｐＤＲ２７４ベクター（addgene）のＢｓａＩ制限酵素部位に挿入した。ＤｒａＩによる切断後、MEGAshortscript T7 Transcription Kit（Ambion、オースティン、テキサス州、米国）を使用してｇＲＮＡを合成した。合成したｇＲＮＡは、フェノールクロロホルムイソアミルアルコール抽出およびイソプロパノール沈殿により精製した。沈殿したｇＲＮＡをＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉに２〜４μｇ／μｌの濃度で溶解し、使用するまで−２０℃で保存した。ｇＲＮＡを吸光光度計およびアガロースゲル電気泳動で定量した。
Preparation of gRNA An oligonucleotide pair containing the target sequence (5'-GGCCACGAGTTCGAGAGTCGAGGG-3'(SEQ ID NO: 6) and its complementary sequence) in mCherry was annealed and inserted into the BsaI restriction enzyme site of the pDR274 vector (addgene). After cleavage by DraI, gRNA was synthesized using MEGAshortscript T7 Transcription Kit (Ambion, Austin, Texas, USA). The synthesized gRNA was purified by phenol chloroform isoamyl alcohol extraction and isopropanol precipitation. The precipitated gRNA was lysed in Opti-MEM I at a concentration of 2-4 μg / μl and stored at −20 ° C. until use. The gRNA was quantified by an absorptiometer and agarose gel electrophoresis.
受精卵
Ｒｏｓａ２６遺伝子座にＨｉｓｔｏｎ２ｂ（Ｈ２ｂ）−ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子を有する受精卵（引用により本明細書の一部とするAbe et al., Genesis 49, 579-590 (2011)）を使用した。この受精卵から発生した胚では、Ｒｏｓａ２６プロモーターの制御下でＨ２ｂ−ｍＣｈｅｒｒｙが遍在性に発現され、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光が観察される。Ｈ２ｂ−ｍＣｈｅｒｒｙを標的とするゲノム編集が起こり、遺伝子が破壊されると、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光は消失する。
A fertilized egg having the Histon2b (H2b) -mCherry gene at the Rosa26 locus (Abe et al., Genesis 49, 579-590 (2011), which is incorporated herein by reference) was used. In embryos developed from this fertilized egg, H2b-mCherry is ubiquitously expressed under the control of the Rosa26 promoter, and mCherry fluorescence is observed. When genome editing targeting H2b-mCherry occurs and the gene is disrupted, mCherry fluorescence disappears.
ＩＣＲ（日本ＳＬＣ）のメスを、Ｒ２６−Ｈ２ｂ−ｍＣｈｅｒｒｙのオス（RIKEN CDB、日本）と交配させ、卵管からＥ０.５で受精卵を回収した（Ｅの後の数字は、受精後の日数を示す。Ｅ０.５は、腟栓を確認した日の暗期の中間点から１２時間後である。）。１％ヒアルロニダーゼ／Ｍ２培地（Sigma）でインキュベートすることにより、受精卵を覆っている卵丘細胞を除去した。回収した受精卵を、エレクトロポレーションに使用するまで、ＫＳＯＭ培地（アーク・リソース、日本）中で培養した。 Females of ICR (Japan SLC) were mated with males of R26-H2b-mChary (RIKEN CDB, Japan), and fertilized eggs were collected from the oviduct at E0.5 (the number after E is the number of days after fertilization). E0.5 is 12 hours after the midpoint of the dark period on the day when the vaginal plug was confirmed). Cumulus cells covering the fertilized eggs were removed by incubation with 1% hyaluronidase / M2 medium (Sigma). The recovered fertilized eggs were cultured in KSOM medium (Ark Resources, Japan) until used for electroporation.
エレクトロポレーション
白金ブロック電極（長さ：１０ｍｍ、幅：３ｍｍ、高さ：０.５ｍｍ、ギャップ：１ｍｍ）（株式会社ベックス（以下、BEXと称する）、東京、日本）を外注して使用した（図２ａ）。CUY21EDIT II（BEX）（図２ａ右）に接続した白金ブロック電極（図２ｃ）を、実体顕微鏡（図２ａ左）にセットした。図２ｂは、図２ａの四角で囲んだ部分の拡大図である。このシステムを使用して、約４０個〜５０個の受精卵を同時に処理できる。エレクトロポレーションに先立ち、マウスの受精卵を手技により一列に並べた。図２ｄは、電極間のギャップに置かれた受精卵の顕微鏡像である。ＫＳＯＭ培地中で培養されている受精卵をＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ（Life technologies）で３回洗浄し、血清含有培地を除去した。次いで、Ｃａｓ９タンパク質（１００ｎｇ／μｌ）およびｇＲＮＡ（２００ｎｇ／μｌ）を含有するＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ溶液（５μｌ）を満たした白金ブロック電極のギャップに受精卵を並べ、様々な条件でエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションの後、すぐに受精卵を電極から回収し、Ｍ２培地で４回、ＫＳＯＭ培地で２回洗浄した。次いで、受精卵を、ＫＳＯＭ培地中、３７℃で、５％ＣＯ２インキュベーター内で、胚盤胞期（Ｅ４.５）まで培養した。
Electroporation platinum block electrodes (length: 10 mm, width: 3 mm, height: 0.5 mm, gap: 1 mm) (BEX Co., Ltd. (hereinafter referred to as BEX), Tokyo, Japan) were outsourced and used ( FIG. 2a). The platinum block electrode (Fig. 2c) connected to the CUY21EDIT II (BEX) (Fig. 2a right) was set in a stereomicroscope (Fig. 2a left). FIG. 2b is an enlarged view of a portion surrounded by a square in FIG. 2a. This system can be used to process about 40 to 50 fertilized eggs simultaneously. Prior to electroporation, fertilized mouse eggs were manually lined up. FIG. 2d is a microscopic image of a fertilized egg placed in the gap between the electrodes. Fertilized eggs cultured in KSOM medium were washed 3 times with Opti-MEM I (Life technologies) to remove serum-containing medium. Next, fertilized eggs were placed in the gaps of platinum block electrodes filled with Opti-MEM I solution (5 μl) containing Cas9 protein (100 ng / μl) and gRNA (200 ng / μl), and electroporation was performed under various conditions. rice field. Immediately after electroporation, fertilized eggs were collected from the electrodes and washed 4 times with M2 medium and 2 times with KSOM medium. The fertilized eggs were then cultured in KSOM medium at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator until the blastocyst stage (E4.5).
蛍光シグナルの検出
ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光のシグナル強度を測定した。蛍光シグナルは、Ａ１共焦点顕微鏡（ニコン、日本）により検出した。
Detection of Fluorescence Signal The signal intensity of mCherry fluorescence was measured. The fluorescence signal was detected by an A1 confocal microscope (Nikon, Japan).
結果を図３に示す。図３左はＤＡＰＩ染色を、図３右は同一視野のｍＣｈｅｒｒｙ蛍光を示す。１０Ｖ（３ｍｓｅｃのパルス＋９７ｍｓｅｃの間隔）×±３（±３は、両方向からのパルスを交互に３回ずつ与えたことを示す）のエレクトロポレーション条件では、全ての割球で蛍光が観察された（各パネル左上）。１５Ｖ（３ｍｓｅｃのパルス＋９７ｍｓｅｃの間隔）×±３では、一部の割球で蛍光が消失した（各パネル右上）。２０Ｖ（３ｍｓｅｃのパルス＋９７ｍｓｅｃの間隔）×±３（各パネル左下）および２５Ｖ（３ｍｓｅｃのパルス＋９７ｍｓｅｃの間隔）×±３（各パネル右下）では、全ての割球で蛍光が消失した。Ｃａｓ９タンパク質のエレクトロポレーションによりゲノム編集を実施でき、エレクトロポレーションの電圧が高いほど、Ｃａｓ９タンパク質の導入効率は高いことが示された。 The results are shown in FIG. The left side of FIG. 3 shows DAPI staining, and the right side of FIG. 3 shows mCherry fluorescence in the same field of view. Fluorescence was observed in all blastomeres under electroporation conditions of 10 V (3 msec pulse + 97 msec interval) x ± 3 (± 3 indicates that pulses from both directions were given three times alternately). (Upper left of each panel). At 15 V (pulse of 3 msec + interval of 97 msec) × ± 3, fluorescence disappeared in some blastomeres (upper right of each panel). At 20 V (3 msec pulse + 97 msec interval) x ± 3 (lower left of each panel) and 25 V (3 msec pulse + 97 msec interval) x ± 3 (lower right of each panel), fluorescence disappeared in all blastomeres. Genome editing can be performed by electroporation of Cas9 protein, and it was shown that the higher the voltage of electroporation, the higher the efficiency of introducing Cas9 protein.
実施例１−２ Ｃａｓ９タンパク質とＣａｓ９ ｍＲＮＡのエレクトロポレーションによるゲノム編集の比較
Ｃａｓ９タンパク質のエレクトロポレーションによるマウス受精卵のゲノム編集を、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡの場合と比較した。
Example 1-2 Comparison of genome editing by electroporation of Cas9 protein and Cas9 mRNA Genome editing of fertilized mouse eggs by electroporation of Cas9 protein was compared with that of Cas9 mRNA.
Ｃａｓ９ ｍＲＮＡの調製
ｈＣａｓ９プラスミド（ｐＸ３３０）は、Addgene（ケンブリッジ、マサチューセッツ州、米国）から購入した。ｐＸ３３０から切り出したｈＣａｓ９を、ｐＳＰ６４ベクター（Promega）のＳＰ６プロモーターの下流につなぎ（ｐＳＰ６４−ｈＣａｓ９）、ｍＲＮＡ合成に使用した。ｐＳＰ６４−ｈＣａｓ９を、ＸｂａＩにより直鎖状にした。直鎖状プラスミドを鋳型として、インビトロＲＮＡ転写キット（mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit, Ambion, オースティン、テキサス州、米国）を使用して、ｈＣａｓ９のｍＲＮＡを合成した。
Preparation of Cas9 mRNA The hCas9 plasmid (pX330) was purchased from Addgene (Cambridge, Mass., USA). hCas9 excised from pX330 was linked downstream of the SP6 promoter of the pSP64 vector (Promega) (pSP64-hCas9) and used for mRNA synthesis. pSP64-hCas9 was linearized with XbaI. Using a linear plasmid as a template, hCas9 mRNA was synthesized using an in vitro RNA transcription kit (mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit, Ambion, Austin, Texas, USA).
実施例１−１と同様に、Ｃａｓ９タンパク質（１００ｎｇ／μｌ）またはＣａｓ９ ｍＲＮＡ（４００ｎｇ／μｌ）およびｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子を標的とするｇＲＮＡ（２００ｎｇ／μｌ）を、Ｈ２ｂ−ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子を有するＥ０.５のマウス受精卵に、エレクトロポレーションにより導入した。エレクトロポレーション条件は、３０Ｖ（３ｍｓｅｃのパルス＋９７ｍｓｅｃの間隔）×７回であった。受精卵をインビトロで胚盤胞期（Ｅ４.５）まで培養し、ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子の配列をダイレクトシーケンス法により決定した。配列解読は、BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit ver. 3.1 および ABI 3500 Genetic Analyser （Applied Biosystems, フォスターシティ、カリフォルニア州、米国）を使用して行った。 Similar to Example 1-1, E0.5 mice carrying the H2b-mCherry gene with Cas9 protein (100 ng / μl) or Cas9 mRNA (400 ng / μl) and gRNA (200 ng / μl) targeting the mCherry gene. It was introduced into a fertilized egg by electroporation. The electroporation condition was 30 V (pulse of 3 msec + interval of 97 msec) × 7 times. Fertilized eggs were cultured in vitro until the blastocyst stage (E4.5), and the sequence of the mCherry gene was determined by the direct sequencing method. Sequencing was performed using the BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit ver. 3.1 and the ABI 3500 Genetic Analyser (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
結果を図４に示す。Ｃａｓ９タンパク質を導入した胚では、配列解読の結果は単一の波形で得られた（図４上）。このことは、胚のすべての割球においてｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子が同じ配列を有することを示し、１細胞期にゲノム編集が起こったことを示唆する。一方、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを導入した胚では、配列解読の結果は複数の波形を含むモザイク状であった（図４下）。このことは、配列が異なるｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子を有する割球が胚盤胞に存在することを示し、２細胞期以降にゲノム編集が起こったことを示唆する。これらの結果は、エレクトロポレーションによりＣａｓ９タンパク質を受精卵に導入すると、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを導入するよりも早い発生段階でゲノム編集が起こることを示す。 The results are shown in FIG. In embryos into which Cas9 protein was introduced, the result of sequencing was obtained with a single waveform (Fig. 4, top). This indicates that the mCherry gene has the same sequence in all blastomeres of the embryo, suggesting that genome editing occurred at the one-cell stage. On the other hand, in embryos into which Cas9 mRNA was introduced, the result of sequencing was a mosaic containing multiple waveforms (Fig. 4, bottom). This indicates that blastomeres having the mCherry gene with a different sequence are present in the blastocyst, suggesting that genome editing occurred after the two-cell stage. These results indicate that when Cas9 protein is introduced into a fertilized egg by electroporation, genome editing occurs at an earlier developmental stage than when Cas9 mRNA is introduced.
実施例２ ブタ受精卵のゲノム編集
実施例２−１ ブタ受精卵へのＣａｓ９ ｍＲＮＡのエレクトロポレーションによるゲノム編集
屠畜場にて屠殺されたブタ（三元交雑種；ランドレース×大ヨークシャー×デュロック）より卵巣を採取し、３０℃の生理食塩水（０.９％ＮａＣｌ）中に保存し１時間以内に実験室に持ち帰った。直径２−６ｍｍの卵胞より卵丘細胞−卵母細胞複合体（ＣＯＣｓ）を採取し、３９℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２条件下で４４時間成熟培養を行った。成熟培養には Earle's 塩含有 tissue culture medium 199 (TCM 199; Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA) に１０％（ｖ／ｖ）ブタ卵胞液、０.６ｍＭシステイン、５０μＭピルビン酸ナトリウム、２ｍｇ／ｍｌ Ｄ−ソルビトール、５０μＭ β−メルカプトエタノール、および５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを添加した成熟培地を用いた。成熟培養開始２２時間は１０ＩＵ／ｍｌウマ絨毛性ゴナドトロピン（ｅＣＧ）および１０ＩＵ／ｍｌヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）を添加した成熟培地にて培養し、その後ＣＯＣｓをｅＣＧおよびｈＣＧ非添加の成熟培地中に移し、２２時間培養を行った。
Example 2 Genome editing of fertilized pig eggs
Example 2-1 Genome editing by electroporation of Cas9 mRNA to fertilized pig eggs Oves were collected from pigs slaughtered at a slaughterhouse (Landrace x Large White pig x Duroc) at 30 ° C. It was stored in physiological saline (0.9% NaCl) and brought back to the laboratory within 1 hour. Cumulus cell-oocyte complexes (COCs) were collected from follicles with a diameter of 2-6 mm and matured and cultured for 44 hours under the conditions of 39 ° C, 5% CO 2 , and 5% O 2. For mature culture, Earle's salt-containing tissue culture medium 199 (TCM 199; Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA) with 10% (v / v) porcine follicle fluid, 0.6 mM cysteine, 50 μM sodium pyruvate, 2 mg / ml Mature medium supplemented with D-sorbitol, 50 μM β-mercaptoethanol, and 50 μg / ml gentamicin was used. For 22 hours after the start of maturation culture, the cells were cultured in a mature medium supplemented with 10 IU / ml horse chorionic gonadotropin (eCG) and 10 IU / ml human chorionic gonadotropin (hCG), and then COCs were added to the mature medium without eCG and hCG. It was transferred and cultured for 22 hours.
成熟培養後、成熟卵を体外受精培地（ＰＦＭ；機能性ペプチド研究所，山形）で洗浄後、体外受精に供した。凍結***を融解後、６ｍｌのＰＦＭで洗浄し、***濃度を５×１０６個／ｍｌに調節した。希釈***中に成熟卵を移し、３９℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２条件下で１２時間媒精を行った。媒精終了後、卵周囲の卵丘細胞と***をピペッティング操作により除去し、受精卵を得た。受精卵は直ちにエレクトロポレーションに使用した。 After maturation culture, mature eggs were washed with in vitro fertilization medium (PFM; Functional Peptide Research Institute, Yamagata) and then subjected to in vitro fertilization. After thawing the frozen semen, it was washed with 6 ml of PFM to adjust the sperm concentration to 5 × 10 6 cells / ml. Mature eggs were transferred into diluted semen and fertilized for 12 hours under the conditions of 39 ° C, 5% CO 2 , and 5% O 2. After completion of insemination, cumulus cells and sperms around the egg were removed by pipetting to obtain a fertilized egg. Fertilized eggs were immediately used for electroporation.
肢の発生に必須であるＦＧＦ１０遺伝子を標的とした（引用により本明細書の一部とするSekine, K. et al., Nature Genetics 21, 138-141(1999)）。図５ａは、ＦＧＦ１０遺伝子第３エキソンにあるｇＲＮＡ標的配列（大文字）およびＰＡＭ配列（ＣＴＴ、大文字、下線）を含む、ブタＦＧＦ１０遺伝子座のゲノム構造を示す。ＦＧＦ１０中の標的配列（５’−ＧＧＡＡＡＡＧＧＡＧＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧ−３’（配列番号７）およびその相補的配列）を含むオリゴヌクレオチド対（図１３）をアニーリングし、ｐＤＲ２７４ベクター（addgene）のＢｓａＩ制限酵素部位に挿入した。ＤｒａＩによる切断後、MEGAshortscript T7 Transcription Kit（Ambion、オースティン、テキサス州、米国）を使用してｇＲＮＡを合成した。ｇＲＮＡを、フェノールクロロホルムイソアミルアルコール抽出およびイソプロパノール沈殿により精製した。沈殿したｇＲＮＡをＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉに溶解した。ｇＲＮＡを吸光光度計およびアガロースゲル電気泳動で定量し、使用するまで−３０℃で保存した。
We targeted the FGF10 gene, which is essential for limb development (Sekine, K. et al.,
実施例１と同様のエレクトロポレーションシステムを用いて、電圧を３０Ｖに維持し、様々なエレクトロポレーションのパルス時間（１−３ｍｓ）およびパルスの回数（３−７回）で、パルス間隔を９７ｍｓｅｃとして、ブタの受精卵に、４００ｎｇ／μｌのＣａｓ９ｍ ＲＮＡ（実施例１参照）および２００ｎｇ／μｌのＦＧＦ１０を標的とするｇＲＮＡを、体外受精開始の１３時間後に導入した。エレクトロポレーション後、受精卵をＰＺＭ−５培地（機能性ペプチド研究所、山形）にて３日間発生培養を行った。続いて、ＰＢＭ培地（機能性ペプチド研究所、山形）にて４日間の発生培養を行い、胚盤胞を得た。
Using the same electroporation system as in Example 1, the voltage was maintained at 30 V and the pulse interval was 97 msec with various electroporation pulse times (1-3 ms) and number of pulses (3-7 times). As a result, 400 ng / μl Cas9m RNA (see Example 1) and 200 ng / μl FGF10-targeted gRNA were introduced into fertilized
胚盤胞を５０ｍＭ ＮａＯＨ溶液中でボイルし、ゲノムを調製した。中和後、ブタＦＧＦ１０Ｆｗｄ（５’−ＣＣＡＴＣＣＣＡＴＴＴＧＡＴＣＴＧＣＴＴ−３’（配列番号８））およびＲｅｖ（５’−ＣＴＴＣＡＡＣＴＧＧＣＡＧＣＡＣＡＡＴＧ−３’（配列番号９））を特異的プライマーとして使用して、ｇＲＮＡ標的に隣接するゲノム領域をＰＣＲにより増幅させた。ＰＣＲ産物をｐＭＤ２０（Takara Bio）プラスミドにクローニングした。１２種以上のプラスミドを単離し、標的ゲノム領域を配列解読した。図５ｂは、ＰＣＲ増幅産物中に検出されるＦＧＦ１０標的領域における変異配列の頻度を示す。インデルの頻度は、パルス時間と回数の増加に伴って増加した。図５ｃは、各条件でエレクトロポレーションされた胚の胚盤胞形成率を示す（片側ＡＮＯＶＡを使用して＊Ｐ＜０.０５、エラーバーは平均±標準誤差を示す）。３ｍｓｅｃのパルス×５回を超えると胚盤胞形成率の低下が顕著であった。 Blastocysts were boiled in 50 mM NaOH solution to prepare the genome. After neutralization, porcine FGF10Fwd (5'-CCATCCCATTTGATCTGCTT-3'(SEQ ID NO: 8)) and Rev (5'-CTTCAACTGGCAGCACAATG-3' (SEQ ID NO: 9)) are used as specific primers to flank the gRNA target. The genomic region was amplified by PCR. The PCR product was cloned into a pMD20 (Takara Bio) plasmid. More than 12 plasmids were isolated and the target genomic region was sequenced. FIG. 5b shows the frequency of mutant sequences in the FGF10 target region detected in the PCR amplification product. The frequency of indels increased with increasing pulse time and frequency. FIG. 5c shows the blastocyst formation rate of embryos electroporated under each condition (* P <0.05 using one-sided ANOVA, error bars indicate mean ± standard error). When the pulse of 3 msec x 5 times was exceeded, the decrease in the blastocyst formation rate was remarkable.
同様にして、エレクトロポレーションに適する時期を調べた。体外受精開始の１１、１３、１９、２１および２３時間後にエレクトロポレーションした。ゲノム編集の効率はいずれも同等であったが、胚盤胞形成率は１３時間後が比較的良好であった（図６、片側ＡＮＯＶＡを使用して＊Ｐ＜０.０５、エラーバーは平均±標準誤差を示す）。従って、以後の実験では、体外受精開始の１３時間後にエレクトロポレーションを行った。 Similarly, the appropriate time for electroporation was investigated. Electroporation was performed 11, 13, 19, 21 and 23 hours after the start of in vitro fertilization. The efficiency of genome editing was similar in all cases, but the blastocyst formation rate was relatively good after 13 hours (Fig. 6, using one-sided ANOVA * P <0.05, error bars averaged). ± Shows standard error). Therefore, in the subsequent experiments, electroporation was performed 13 hours after the start of in vitro fertilization.
実施例２−２ ブタ受精卵へのＣａｓ９タンパク質のエレクトロポレーションによるゲノム編集
Ｃａｓ９タンパク質のブタ受精卵へのエレクトロポレーションにより、ゲノム編集を実施できるか否かを調べた。実施例１と同様に、タカラバイオ Guide-it（商標）sgRNA Screening Kit（631440）に含まれるＣａｓ９タンパク質を使用した（配列番号５）。実施例２−１と同様に、ただし、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡの代わりにＣａｓ９タンパク質（５０ｎｇ／μｌ）を、２００ｎｇ／μｌのＦＧＦ１０遺伝子を標的とするｇＲＮＡと共に、様々な電気的条件でのエレクトロポレーションによりブタ体外受精卵に導入し、胚盤胞まで培養し、ゲノム編集の効率を調べた。結果を図７に示す。図中、○は標的ゲノムの配列に変異が観察されたことを示し、×は、変異が観察されなかったことを示し、×＊は、胚盤胞が形成されなかったことを示す。この結果は、Ｃａｓ９タンパク質のエレクトロポレーションにより、ブタ受精卵の遺伝子をゲノム編集できることを示す。
Example 2-2 Genome Editing by Electroporation of Cas9 Protein to Fertilized Pig Egg It was investigated whether or not genome editing can be performed by electroporation of Cas9 protein to fertilized pig egg. As in Example 1, the Cas9 protein contained in Takara Bio Guide-it ™ sgRNA Screening Kit (631440) was used (SEQ ID NO: 5). Similar to Example 2-1 but pigs by electroporation under various electrical conditions with Cas9 protein (50 ng / μl) instead of Cas9 mRNA, along with gRNA targeting the FGF10 gene at 200 ng / μl. It was introduced into an in vitro fertilized egg, cultured to scutellum, and the efficiency of genome editing was investigated. The results are shown in FIG. In the figure, ◯ indicates that a mutation was observed in the sequence of the target genome, × indicates that no mutation was observed, and × * indicates that a blastocyst was not formed. This result indicates that the gene of fertilized pig egg can be genome-edited by electroporation of Cas9 protein.
実施例２−３ Ｃａｓ９タンパク質とＣａｓ９ ｍＲＮＡのエレクトロポレーションによるゲノム編集の比較
実施例２−１および２−２と同様に、エレクトロポレーション条件を３０Ｖ（１ｍｓｅｃのパルス＋９７ｍｓｅｃの間隔）×５回に固定し、４００ｎｇ／μｌのＣａｓ９ｍＲＮＡまたは５０ｎｇ／μｌのＣａｓ９タンパク質を、２００ｎｇ／μｌのＦＧＦ１０遺伝子を標的とするｇＲＮＡと共にブタ体外受精卵に導入し、ゲノム編集の効率および胚盤胞形成率を比較した。図８ａは、ＦＧＦ１０標的領域におけるインデルの頻度を示し、図８ｂは、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡまたはＣａｓ９タンパク質をエレクトロポレーションされたブタ受精卵の胚盤胞形成率を示す（片側ＡＮＯＶＡを使用して＊Ｐ＜０.０５、エラーバーは平均±標準誤差を示す）。胚盤胞形成率は両者で同等であったが、ゲノム編集の効率はタンパク質の方が高かった。
Example 2-3 Comparison of genome editing by electroporation of Cas9 protein and Cas9 mRNA Similar to Examples 2-1 and 2-2, the electroporation condition was set to 30 V (1 msec pulse + 97 msec interval) x 5 times. Immobilized, 400 ng / μl Cas9 mRNA or 50 ng / μl Cas9 protein was introduced into pig in vitro fertilized eggs with gRNA targeting the 200 ng / μl FGF10 gene, and the efficiency of genome editing and the rate of cyst formation were compared. .. FIG. 8a shows the frequency of indels in the FGF10 target region, and FIG. 8b shows the cyst formation rate of fertilized porcine eggs electroporated with Cas9 mRNA or Cas9 protein (using unilateral ANOVA * P <. 0.05, error bars indicate mean ± standard error). The blastocyst formation rate was similar in both cases, but the efficiency of genome editing was higher in the protein.
実施例２−４ Ｃａｓ９タンパク質のエレクトロポレーションによるＭＳＴＮ遺伝子のゲノム編集
ミオスタチン（ＭＳＴＮ）遺伝子を標的としてゲノム編集を行った。これは、筋形成の負の制御因子をコードし、その破壊は、ブタ、ウシおよびヒツジにおいて、骨格筋の肥大という単純な形質を示す（Qian, L. et al., Sci Rep 5, 14435, doi:10.1038/srep14435 (2015) および Rao, S. et al., Mol Reprod Dev, doi:10.1002/mrd.22591 (2015)）。実施例２−１と同様に、ＭＳＴＮ第１エキソンの様々な部位を標的とするｇＲＮＡを調製した。図９は、ＭＳＴＮ遺伝子座のゲノム構造およびＭＳＴＮ遺伝子第１エキソンのｇＲＮＡ標的配列のリストを示す。実施例２−２と同様に、５０ｎｇ／μｌのＣａｓ９タンパク質および２００ｎｇ／μｌのｇＲＮＡを、３０Ｖ（１ｍｓｅｃのパルス＋９７ｍｓｅｃの間隔）×５回の条件でブタ受精卵にエレクトロポレーションし、胚盤胞期まで培養した。
Example 2-4 Genome editing of the MSTN gene by electroporation of Cas9 protein Genome editing was performed targeting the myostatin (MSTN) gene. It encodes a negative regulator of myogenesis, the destruction of which exhibits the simple trait of skeletal muscle hypertrophy in pigs, cattle and sheep (Qian, L. et al.,
４〜５個の胚盤胞を５０ｍＭ ＮａＯＨ溶液中でボイルし、ゲノムを調製した。中和後、ｇＲＮＡ標的に隣接するゲノム領域をＰＣＲにより増幅させた。以下の特異的プライマーを使用した：ブタＭＳＴＮ Ｆｗｄ（５’−ＡＴＧＣＡＡＡＡＡＣＴＧＣＡＡＡＴＣＴＡＴＧ−３’（配列番号１０））およびＲｅｖ（５’−ＴＧＴＡＧＧＣＡＴＧＧＴＡＡＴＧＡＴＣＧ−３’（配列番号１１））。ＰＣＲ産物をｐＭＤ２０（TakaraBio）プラスミドにクローニングした。１２種以上のプラスミドを単離し、標的ゲノム領域の配列を決定した。 4-5 blastocysts were boiled in 50 mM NaOH solution to prepare the genome. After neutralization, the genomic region adjacent to the gRNA target was amplified by PCR. The following specific primers were used: Pig MSTN Fwd (5'-ATGCAAAAAACTGCAAATTCATG-3'(SEQ ID NO: 10)) and Rev (5'-TGTAGGCATGGTAATGATCG-3' (SEQ ID NO: 11)). The PCR product was cloned into a pMD20 (TakaraBio) plasmid. More than 12 plasmids were isolated and the target genomic region was sequenced.
図１０は、各標的領域のＰＣＲ増幅産物中の変異の頻度を示す。７種の試験したｇＲＮＡのうち、２種（ｇＲＮＡ６および７）を用いた場合にゲノム編集効率が高く、１種（ｇＲＮＡ１）で中程度であった（図１０ａ）。残りの４種のｇＲＮＡを用いると、ゲノム編集効率は低かった（図１０ｂ）。図１１は、エレクトロポレーションされた胚の胚盤胞形成率を示す（エラーバーは平均±標準誤差を示す）。胚盤胞形成率は、ｇＲＮＡ間で同等であった。 FIG. 10 shows the frequency of mutations in the PCR amplification product of each target region. Of the seven gRNAs tested, two (gRNA6 and 7) had high genome editing efficiency and one (gRNA1) was moderate (FIG. 10a). Genome editing efficiency was low when the remaining 4 types of gRNA were used (Fig. 10b). FIG. 11 shows the blastocyst formation rate of electroporated embryos (error bars indicate mean ± standard error). Blastocyst formation rates were comparable among gRNAs.
同様に、１個の胚盤胞からゲノムを調製し、各胚盤胞の配列を分析した。２−４種の変異配列を有し、野生型配列を有さない胚盤胞と、変異型と野生型の両方の配列を様々な割合で有する胚盤胞が見られた（表７）。この結果は、エレクトロポレーションによるＣａｓ９タンパク質の導入によりブタの各種遺伝子のゲノム編集が可能であることを示唆する。 Similarly, a genome was prepared from one blastocyst and the sequence of each blastocyst was analyzed. Blastocysts with 2-4 mutant sequences and no wild-type sequences and blastocysts with both mutant and wild-type sequences in varying proportions were found (Table 7). This result suggests that the introduction of Cas9 protein by electroporation enables genome editing of various genes in pigs.
表７：ＭＳＴＮ変異体の配列分析
実施例２−５ エレクトロポレーションによりＣａｓ９タンパク質を導入したブタ受精卵からの変異個体の作製
エレクトロポレーションによりＣａｓ９タンパク質を導入したブタ受精卵から、変異個体を作製できるか否かを調べた。実施例２−４と同様に、Ｃａｓ９タンパク質およびｇＲＮＡ１、６または７のいずれかをブタ受精卵にエレクトロポレーションにより導入した。発情期を同調させた２匹の未経産雌豚（レシピエント）を、Onishi, A. et al., Science 289, 1188-1190 (2000) に記載の通りに、胚移植用に調製した。エレクトロポレーションの約１２時間後に、１細胞期ないし２細胞期の胚をレシピエントの卵管に移植した。移植した胚の数は、片側の卵管に１００個（約２００個／匹）であった。２匹のうち１匹が妊娠し、受精卵移植の１１１日後に１０匹の子ブタを出産した。１匹（１０％）は出生後すぐに死亡した。
Example 2-5 Preparation of mutant individual from fertilized pig egg into which Cas9 protein was introduced by electroporation It was investigated whether or not a mutant individual could be prepared from fertilized pig egg into which Cas9 protein was introduced by electroporation. Similar to Example 2-4, Cas9 protein and either
実施例２−４と同様に、耳生検からゲノムＤＮＡを調製し、ＭＳＴＮ遺伝子に変異が導入されたか否かを分析した。標的部位に隣接するＭＳＴＮゲノム領域の配列解読により、１０匹のうち９匹（９０％）がＭＳＴＮ遺伝子に変異を有することが判明した（表８）。それらのうち２匹には野生型配列が検出されなかった（子ブタ＃３および＃４）。これは、それらが両アレルのＭＳＴＮ遺伝子に変異を有することを示す。他の子ブタは、ゲノムの７−７９％に変異を有した。
Genomic DNA was prepared from ear biopsy in the same manner as in Example 2-4, and it was analyzed whether or not a mutation was introduced into the MSTN gene. Decoding of the MSTN genomic region adjacent to the target site revealed that 9 out of 10 (90%) had mutations in the MSTN gene (Table 8). No wild-type sequences were detected in two of them (
子ブタ＃４（両アレル変異体）をさらに分析した。麻酔下で胸最長筋から筋肉生検を単離した。M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent (Life Technologies）を使用して総タンパク質を抽出し、ＢＣＡタンパク質定量用試薬（Thermo Scientific）を使用して定量した。全てのタンパク質抽出物を同じ濃度（２.２ｍｇ／ｍｌ）に希釈した。酵素結合免疫吸着測定キット（R&D Systems, Minneapolis, MN）で、製造業者のプロトコールに従ってＭＳＴＮタンパク質の量を測定した。プロペプチドＭＳＴＮ（Prospec, East Brunswick, NJ）およびＭＳＴＮタンパク質（和光純薬工業、大阪、日本）を各々負および正の対照として使用した。図１２ａは、ＭＳＴＮ変異ブタの胸最長筋におけるＭＳＴＮタンパク質の発現を示す。ＭＳＴＮタンパク質発現は両アレル変異体では検出されず（＃４）、一方、同月齢の野生型子ブタでは、強い発現が検出された。これは、ＭＳＴＮエキソン１に導入されたインデルがフレームシフトを引き起こし、機能的ＭＳＴＮタンパク質の合成を不可能にしたことを示す。
Piglet # 4 (both allelic variants) was further analyzed. A muscle biopsy was isolated from the longissimus muscle of the chest under anesthesia. Total protein was extracted using M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent (Life Technologies) and quantified using BCA protein quantification reagent (Thermo Scientific). All protein extracts were diluted to the same concentration (2.2 mg / ml). The amount of MSTN protein was measured with an enzyme-bound immunoadsorption measurement kit (R & D Systems, Minneapolis, MN) according to the manufacturer's protocol. Propeptide MSTN (Prospec, East Brunswick, NJ) and MSTN protein (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan) were used as negative and positive controls, respectively. FIG. 12a shows the expression of MSTN protein in the longissimus thoracic muscle of MSTN mutant pigs. MSTN protein expression was not detected in both allelic variants (# 4), while strong expression was detected in wild-type piglets of the same age. This indicates that the indel introduced into
外見の分析では、両アレル変異体の子ブタ（＃４）は、野生型対照（ＷＴ）と比較して臀部が太っており、筋肉量が多かった（図１２ｂ）。 Appearance analysis showed that piglets of both allelic variants (# 4) had thicker buttocks and more muscle mass compared to wild-type controls (WT) (FIG. 12b).
４０日齢の両アレル変異体（＃４）および野生型から単離された胸最長筋を組織化学的分析に付した。筋肉サンプルを１０％中性緩衝ホルマリン液（和光純薬工業）中で固定し、パラフィンに包埋した。パラフィン切片（１０μｍ）を調製し、ヘマトキシリン・エオシン染色した。結果を図１２ｃに示す（スケールバーは２００μｍである）。子ブタ＃４の筋肉量は野生型よりも多かった。これは、ＭＳＴＮ変異動物に一般的に見られる形質である。 Both 40-day-old allelic variants (# 4) and longissimus thoracic muscle isolated from wild-type were subjected to histochemical analysis. The muscle sample was fixed in a 10% neutral buffered formalin solution (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and embedded in paraffin. Paraffin sections (10 μm) were prepared and stained with hematoxylin and eosin. The results are shown in FIG. 12c (scale bar is 200 μm). Piglet # 4 had more muscle mass than the wild type. This is a trait commonly found in MSTN mutants.
ミオシンの免疫組織化学的分析により、骨格筋の筋繊維のタイプを調べた。４０日齢の子ブタから得られた胸最長筋をドライアイスアセトン（−７８℃）で凍結させた。骨格筋の筋繊維のタイプを判定するために、クリオスタットミクロトーム（サクラファインテック、東京、日本）を使用して凍結切片を切り、免疫組織化学に付した。それぞれＩ型およびＩＩ型筋繊維の特異的マーカーである抗遅筋型（cloneM8421, 1:400, Sigma）および抗速筋型（clone M4276, 1:200, Sigma）ミオシン重鎖モノクローナル抗体で切片を免疫染色した。ヒストファインシンプルステインＭＡＸ−ＰＯ（Ｍ）（ニチレイ、東京、日本）を二次抗体として使用した。各筋肉タイプの割合を、胸最長筋の各切片でデジタル顕微鏡（ＶＨＸ−５０００、キーエンス、大阪、日本）で測定した。結果を図１２ｄ−ｆに示す。両アレル変異体（＃４）では遅筋の数が少なく、過去の報告と一致した（Girgenrath, S., Song, K. & Whittemore, L. A., Muscle Nerve 31, 34-40 (2005)）。 The type of muscle fiber in skeletal muscle was investigated by immunohistochemical analysis of myosin. The longissimus thoracic muscle obtained from a 40-day-old piglet was frozen with dry ice acetone (-78 ° C). Frozen sections were cut using a cryostat microtome (Sakura Finetech, Tokyo, Japan) and subjected to immunohistochemistry to determine the type of muscle fibers in skeletal muscle. Sections with anti-slow muscle type (clone M8421, 1: 400, Sigma) and anti-fast muscle type (clone M4276, 1: 200, Sigma) myosin heavy chain monoclonal antibodies, which are specific markers for type I and type II muscle fibers, respectively. Immunostained. Histofine Simple Stain MAX-PO (M) (Nichirei, Tokyo, Japan) was used as a secondary antibody. The proportion of each muscle type was measured with a digital microscope (VHX-5000, Keyence, Osaka, Japan) on each section of the longissimus chest muscle. The results are shown in FIG. 12df. Both allelic variants (# 4) had lower numbers of slow muscles, consistent with previous reports (Girgenrath, S., Song, K. & Whittemore, L.A., Muscle Nerve 31, 34-40 (2005)).
これらの結果は、受精卵にＣａｓ９タンパク質およびｇＲＮＡをエレクトロポレーションで導入することにより、変異動物を作製できることを示す。 These results indicate that mutant animals can be produced by electroporation of Cas9 protein and gRNA into fertilized eggs.
Claims (22)
（ａ）エレクトロポレーション用電極の間に、Ｃａｓ９ タンパク質を含む溶液および受精卵の混合物を置くこと、ここで、溶液中のＣａｓ９ タンパク質濃度は３ｎｇ／μｌないし５０００ｎｇ／μｌであり、受精卵は、透明帯を除去も薄化もしていない、非ヒト哺乳動物の受精卵である、
（ｂ）電極間に電圧をかけること、ここで、電圧は電極間距離１ｍｍ当たり１５Ｖないし５０Ｖであり、電圧と通電時間の積の値は、電極間距離１ｍｍ当たり９０Ｖｍｓｅｃないし９９０Ｖｍｓｅｃである、
の各段階を含み、
段階（ｂ）において、一定の電圧をかけるか、または、電圧を一方向のパルスでかけることを特徴とする、方法。 A method of introducing Cas9 protein into fertilized eggs of non-human mammals.
(A) Place a mixture of a solution containing Cas9 protein and a fertilized egg between the electrodes for electroporation, where the Cas9 protein concentration in the solution is 3 ng / μl to 5000 ng / μl and the fertilized egg is A fertilized egg of a non-human mammal that has neither zona pellucida removed nor thinned.
(B) Applying a voltage between the electrodes, where the voltage is 15 V to 50 V per 1 mm distance between the electrodes, and the value of the product of the voltage and the energization time is 90 Vmsec to 990 Vmsec per 1 mm distance between the electrodes.
Including each stage of
A method comprising applying a constant voltage or applying a voltage in a unidirectional pulse in step (b).
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