JP2002524054A - How to perform gene transfer - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】 本発明は、核酸および核を、受精卵に共挿入することにより、トランスジェニック動物およびトランスジェニック細胞を作製する方法を提供する。好ましくは、共挿入はマイクロインジェクションにより行い、そしてより好ましくは圧電性駆動（piezo-electrically actuated）マイクロインジェクションにより行う。トランスジーン（tg）を発現する胚は、ここで未受精マウス卵母細胞に***頭部および緑色蛍光タンパク質（GFP）あるいはβ-ガラクトシダーゼレポーターのいずれかをコードする外来性DNAとともに共注入することにより作製される。マイクロインジェクションされた卵母細胞を、分化細胞または幹細胞に発生させることができ、in vitroで胚に発生させた後に宿主代理母に移植することができ、あるいは宿主代理母に直接移植することもできる。胚発生は出産まで生じて、その結果、子孫の特徴（表現型）を変化することができ、そしてその結果その子孫に伝達される、トランスジェニック性修飾を子孫が有することができる。 (57) [Summary] The present invention provides a method for producing a transgenic animal and a transgenic cell by co-inserting a nucleic acid and a nucleus into a fertilized egg. Preferably, co-insertion is performed by microinjection, and more preferably, by piezo-electrically actuated microinjection. Embryos expressing the transgene (tg) are then co-injected into unfertilized mouse oocytes with sperm heads and exogenous DNA encoding either green fluorescent protein (GFP) or the β-galactosidase reporter. It is made. Microinjected oocytes can be developed into differentiated cells or stem cells, can be transferred to host surrogates after in vitro embryo development, or can be directly transplanted to host surrogates . Embryogenesis occurs until birth, so that the progeny can have transgenic modifications that can change the characteristics (phenotype) of the progeny and are thus transmitted to the progeny.
Description
【０００１】 本発明の出願は、少なくとも一つのカラーの図面を含有する。カラー図面を有
する本特許のコピーは、請求をし、そして必要な費用を払えば、米国特許商標庁
が提供するだろう。[0001] The present application contains at least one drawing executed in color. Copies of this patent with color drawing (s) will be provided by the USPTO upon request and payment of the necessary fee.
【０００２】 発明の背景 全動物および植物（あるいはそれらの胚性前駆動物）の特徴を規定された方法
で修飾することができることが望ましい。このことを達成するために選択される
方法は、遺伝子転移として知られている。本明細書で使用される“遺伝子転移”
は、ゲノムの修飾をして、結果として新規に導入されたDNA配列を保持する様に
する方法である。本方法は、一般的には、外来性あるいはトランスジーン（tg）
DNA配列をゲノムに融合させることを必要とする。DNA配列は、所望の特徴をコー
ドすることができ、それによりゲノム修飾を保持するいずれかのトランスジェニ
ック動物（あるいは植物）は、それにより賦与された1またはそれ以上の新規の
特徴を有することができる。理想的には、そのようなゲノム修飾は、生殖系列を
介して遺伝性であり、それによりゲノム修飾が子孫に、そしてその後トランスジ
ェニック生物の系統に沿って垂直的に伝達されうる。所定のトランスジェニック
生物体内のすべての細胞がtgを含有することがしばしば好ましい；このことは、
遺伝子転移を介して達成することができる。トランスジェニック動物および植物
は、農業、医薬、そして生物活性化合物（ニュートラシューティカル（neutrace
utical）および医薬組成物）の産生において大きな潜在的な有用性を有している
。例えば、その細胞表面にヒト主要組織適合性タンパク質を発現するトランスジ
ェニックブタを作製することにより、異種移植におけるこれらの動物の有用性に
寄与することができる。BACKGROUND OF THE INVENTION It is desirable to be able to modify the characteristics of all animals and plants (or their embryonic progenitors) in a defined manner. The method chosen to achieve this is known as gene transfer. "Gene transfer" as used herein
Is a method of modifying a genome so that a newly introduced DNA sequence is retained as a result. The method generally involves exogenous or transgene (tg)
It requires that the DNA sequence be fused to the genome. The DNA sequence can encode a desired characteristic, so that any transgenic animal (or plant) that carries the genomic modification may have one or more novel characteristics conferred thereby. it can. Ideally, such genomic modifications are inherited through the germline, so that the genomic modifications can be transmitted vertically to progeny and then along the line of the transgenic organism. It is often preferred that all cells in a given transgenic organism contain tg;
It can be achieved via gene transfer. Transgenic animals and plants are used in agriculture, medicine, and bioactive compounds (neutraceuticals (neutrace).
utical) and pharmaceutical compositions). For example, creating transgenic pigs that express human major histocompatibility proteins on their cell surface can contribute to the usefulness of these animals in xenografts.
【０００３】 現在のところ、動物における遺伝子転移の方法は、いくつか存在する。最初に
広く使用されるようになった前核マイクロインジェクション法は、1980年代初期
にマウスで開発された、tg DNAを1細胞期胚の前核の一つに注入することを含む
方法である。この方法の最初の報告において（Gordon, J.W., Scangos, G.A., P
lotkin, D.J., Barbosa, J.A. and Ruddle, F.H., Proceedings of the Nationa
l Academy of Science USA 77, 7380 (1980)）、2/78（＜3％）の新生児がtg DN
Aを有していた（すなわち、トランスジェニック動物となった）。改善されて、
前核マイクロインジェクションによるマウスの遺伝子転移の効率は、現在では典
型的には約15％の値まで増加した。しかしながら、その他の種、例えば畜牛、ヒ
ツジ、ブタおよびヤギ（これらは商業的種の例だが）、における対応する効率は
、非常に低い（ほぼ1％）。このことは、マウス1細胞期胚を入手しそして利用す
る点で、他の種の1細胞期胚を入手しそして利用することの困難性と比較して、
かなり容易であることを反映しているようである。マウス1細胞期胚とは異なり
、商業的種の1細胞期胚は、標準的な光学顕微鏡で観察した場合、（その脂質含
量が高いため）不透明である。このことは、前核マイクロインジェクション法の
大きな障害である。前核マイクロインジェクション法では卵の特定のコンパート
メント（すなわち前核）中に正確にインジェクション針を挿入することが要求さ
れており、そして前核の位置を特定しなければならず、したがって見えないとい
けないからである。この問題を回避する努力には、さらに低速遠心分離の工程を
含む。[0003] At present, there are several methods of gene transfer in animals. The first widely used pronuclear microinjection method, developed in mice in the early 1980s, involves the injection of tg DNA into one of the pronuclei of one-cell stage embryos. In the first report of this method (Gordon, JW, Scangos, GA, P
lotkin, DJ, Barbosa, JA and Ruddle, FH, Proceedings of the Nationa
l Academy of Science USA 77, 7380 (1980)), 2/78 (<3%) newborns are tg DN
A (ie, became a transgenic animal). Improved,
The efficiency of gene transfer in mice by pronuclear microinjection has now typically increased to values of about 15%. However, the corresponding efficiencies in other species, such as cattle, sheep, pigs and goats, which are examples of commercial species, are very low (approximately 1%). This means that obtaining and utilizing mouse one-cell stage embryos, compared to the difficulty of obtaining and utilizing one-cell stage embryos of other species,
It seems to reflect that it is fairly easy. Unlike mouse one-cell embryos, one-stage embryos of commercial species are opaque when viewed under standard light microscopy (due to their high lipid content). This is a major obstacle to pronuclear microinjection. Pronuclear microinjection requires that the injection needle be inserted exactly into a particular compartment (ie, the pronucleus) of the egg, and that the pronucleus must be located and therefore visible Because. Efforts to circumvent this problem further include the step of low speed centrifugation.
【０００４】 前核マイクロインジェクションによる遺伝子転移は、今までのところでは、い
わばランダムな組み込み部位の性質および宿主ゲノム中に組み込まれるコピー数
のためtg挿入の成果を調節しまたは予想することが可能になっていない。組み込
みの成果を超えるより大きな調節は、ゲノム標的化された、相同組換えをするこ
とができる構築物をトランスフェクトした（マウス）胚性幹（ES）細胞株を使用
することにより、達成することができる。トランスフェクトしたES細胞株をin v
itroで選択しそして特性決定して、構築物組み込み部位を確認することができる
。その後、このような遺伝子標的化ES細胞を有する胚の再構築を使用して、キメ
ラ子孫を作製することができる。ゲノム修飾のこの方法は、現在のところ、確立
した生殖系列に寄与できるES細胞が存在している一つの種、すなわちマウスに限
定されており、その他の種での応用については示されていない。[0004] Gene transfer by pronuclear microinjection has so far made it possible to modulate or predict the outcome of tg insertion due to the nature of the random integration site and the number of copies integrated into the host genome. is not. Greater regulation beyond the outcome of integration can be achieved by using a (mouse) embryonic stem (ES) cell line transfected with a genome-targeted, homologous recombination construct. it can. Transfected ES cell line in v
Selection and characterization can be performed in itro to confirm the construct integration site. Thereafter, reconstitution of embryos with such gene-targeted ES cells can be used to generate chimeric progeny. This method of genomic modification is currently limited to one species, ES, for which there are ES cells capable of contributing to the established germline, and has not been demonstrated for application in other species.
【０００５】 哺乳動物生殖系列を修飾するために利用することができるストラテジーにおけ
る制限は、別の方法についての研究に燃料を注いだ。これらには、卵母細胞また
は前移植胚に感染するための組換えレトロウィルス、複製欠損アデノウィルス媒
介性送達システム、およびin vitro受精の間のDNAの送達のための乗り物として
の***、を使用することが含まれる。この最後のアプローチにおいて、生きた精
子をin vitroで卵母細胞中に組換えDNAを導入するためのベクターとして使用す
る；このシステムは、遺伝子転移の方法としてその効率に関してかなりの論争を
引き起こした。この現象の生物学は、ほとんど特徴付けられておらず、そしてそ
の信頼性の低さのために限定的にしか使用されていない。[0005] The limitations in strategies available to modify the mammalian germline have fueled research on alternative methods. These use recombinant retroviruses to infect oocytes or pretransplanted embryos, replication-defective adenovirus-mediated delivery systems, and sperm as a vehicle for delivery of DNA during in vitro fertilization. It is included. In this last approach, live sperm is used as a vector to introduce recombinant DNA into oocytes in vitro; this system has raised considerable controversy over its efficiency as a method of gene transfer. The biology of this phenomenon has been poorly characterized and has been used only to a limited extent due to its unreliability.
【０００６】 第二中期のマウス卵母細胞中への細胞質内***インジェクション（ICSI）によ
り、インジェクションの時点では、***頭部に自動力がないという点で“死んだ
”と考えられているものの、***頭部が全発生を支持できることが以前に報告さ
れた；より重要なことに、膜を破壊された***もまた、全発生を支持することが
できる（Perry, A.C.F., Wakayama, T. and Yanagimachi, R., Biology of Repr
oduction 60, 747 (1999)）。***膜を裏打ちする構造は、生物学全般を通じて
非常に保存されている。そのような構造の主要なタンパク質構成要素（核および
核周囲マトリックスに優勢である）は、正に荷電した塩基性タンパク質である。
このことから、このような構造が、たとえばDNAおよびRNAを含む核酸などのポリ
アニオンと静電相互作用を支持しうることが示唆される。これらの特徴は、本明
細書中に記載する遺伝子転移の新規な方法を開発する際に使用された。この方法
は、既存の方法を越える以下のような顕著な利点を提供する：この方法では高い
効率でトランスジェニック子孫を得る；さまざまな種由来のトランスジェニック
動物を作製する際に使用することができる；そのフレキシビリティーにより、幅
広いスペクトルのさまざまなタイプのtgおよびその他の分子を導入することが可
能になる；未受精卵の生物学を操作することができる；全ゲノムの内部で部位特
異的修飾を行う遺伝子ターゲティングとして既知の遺伝子転移イベントのサブセ
ットを支持すべきである。本発明の方法は、以下で記載する。[0006] Although cytoplasmic sperm injection (ICSI) into mouse oocytes in the second metaphase is considered "dead" in that at the time of injection, the sperm head lacks motive force, It has been previously reported that sperm heads can support full development; more importantly, sperm with disrupted membranes can also support full development (Perry, ACF, Wakayama, T. and Yanagimachi , R., Biology of Repr
oduction 60, 747 (1999)). The structures that line the sperm membrane are highly conserved throughout biology. The major protein component of such a structure, which is predominant in the nuclear and perinuclear matrix, is a positively charged basic protein.
This suggests that such structures may support electrostatic interactions with polyanions, such as nucleic acids, including DNA and RNA. These features have been used in developing the novel methods of gene transfer described herein. This method offers the following significant advantages over existing methods: obtaining transgenic offspring with high efficiency; can be used in generating transgenic animals from various species Its flexibility allows the introduction of a wide spectrum of different types of tg and other molecules; it can manipulate the biology of unfertilized eggs; site-specific modifications within the entire genome Should support a subset of known gene transfer events for gene targeting. The method of the invention is described below.
【０００７】 発明の概要 本発明は、未成熟卵母細胞、未受精卵母細胞あるいは脱核卵母細胞（以下で“
卵母細胞”と呼ぶ）中にトランスジーン（tg）核酸物質（NA）をインジェクショ
ンすることによりあるいは事前に核と混合したtg NAを共インジェクションする
ことにより、植物あるいは動物などの生物の細胞またはin vitroで培養した細胞
中に、tg NAを導入するための方法を提供する。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention relates to immature, unfertilized or enucleated oocytes (hereinafter referred to as "
By injecting a transgene (tg) nucleic acid substance (NA) into the oocyte, or by co-injecting tg NA premixed with the nucleus to produce cells or organisms of organisms such as plants or animals. Provided is a method for introducing tgNA into cells cultured in vitro.
【０００８】 本発明の一態様において、未受精卵母細胞は減数***第二中期（met II）で捕
捉されている。met II卵母細胞は、通常は哺乳動物における受精に関与するステ
ージである。本発明はさらに、内在する核構成要素を含有する細胞中にtg NAを
導入し、その後発生を活性化することを提供する。In one embodiment of the invention, the unfertilized oocyte is captured at metaphase II (met II). The met II oocyte is the stage normally involved in fertilization in mammals. The present invention further provides for introducing the tgNA into cells containing endogenous nuclear components and subsequently activating development.
【０００９】 本明細書中で使用するように、“トランスジーンNA”（あるいは“tg NA”）
という用語は、卵母細胞中に導入してそれまでは宿主ゲノムに対して天然であっ
たゲノム配列中に変化を誘導し、それによりそのゲノムを変化させることができ
る、いずれかの核酸またはその誘導体を含むことを企図している。一態様におい
て、tg NAは、デオキシリボース核酸、DNAである。本明細書中で使用される“核
”という用語は、出産およびその後まで胚発生を完全にするために必要とされる
核全体あるいは核の一部分について言及する。好ましい一態様において、核は精
子細胞の核である。As used herein, “transgene NA” (or “tg NA”)
The term is used to refer to any nucleic acid or its nucleic acid that can be introduced into an oocyte and induce a change in a genomic sequence that was previously native to the host genome, thereby altering that genome. It is intended to include derivatives. In one embodiment, the tg NA is a deoxyribose nucleic acid, DNA. As used herein, the term "nucleus" refers to the entire nucleus or a portion of the nucleus that is required for complete birth and thereafter embryonic development. In a preferred embodiment, the nucleus is the nucleus of a sperm cell.
【００１０】 本発明はさらに、tg NAを核とともに共挿入することによりトランスジェニッ
ク動物を作製する方法を提供する。本方法において、たとえば核とtg NAとを一
緒に混合することにより、核をtg NAに曝露する。一態様において、核は、***
の膜を除去しあるいは破壊した***の核である。本発明は、膜破壊の様々な手順
を見込んでいる。[0010] The present invention further provides a method of producing a transgenic animal by co-inserting tgNA with the nucleus. In this method, the nucleus is exposed to tg NA, for example, by mixing the nucleus and tg NA together. In one embodiment, the nucleus is a sperm nucleus that has had its sperm membrane removed or disrupted. The present invention contemplates various procedures for film disruption.
【００１１】 本発明の好ましい態様において、核をマイクロインジェクションにより卵母細
胞に挿入し、より好ましくは圧電性駆動マイクロインジェクションにより挿入す
る。圧電性駆動ピペットを使用することにより（従来のものとは対照的に）、マ
イクロインジェクション方法が容易になり、そして迅速化される。この結果細胞
の傷害が減少し、胚の生存率が増加する。この方法により再構成された細胞を発
生させることができる。一態様において、発生は、比較的同質の細胞集団を産生
する（たとえば幹細胞）。更なる態様において、in vitroで培養することにより
再構成された細胞を胚盤胞（blastcyst）まで発生させ、そして生じた胚を胚発
生においてこのステージにあるかまたはそれ以前のステージにある適当な代理母
に移植して全発生を行わせる。In a preferred embodiment of the invention, the nucleus is inserted into the oocyte by microinjection, more preferably by piezo-electrically driven microinjection. The use of a piezo-electrically driven pipette (as opposed to the conventional one) facilitates and speeds up the microinjection method. This results in reduced cell damage and increased embryo viability. Reconstituted cells can be generated by this method. In one aspect, development produces a relatively homogeneous population of cells (eg, stem cells). In a further embodiment, culturing in vitro causes the reconstituted cells to develop into blastcysts and the resulting embryos to be at this stage or at an earlier stage in embryonic development. Transplant into a surrogate mother for all outbreaks.
【００１２】 われわれは本明細書中で、***頭部をtg NAとともに共挿入することにより生
成した、生きたトランスジェニック子孫を作出することを示す。われわれは、子
孫においてtgが存在することだけでなく、子孫の特徴を変更させるように発現し
ていることも示す。本発明の別の好ましい態様において、その膜を破壊した***
頭部が高い効率で遺伝子転移を促進することを、われわれは示す。膜破壊は、界
面活性剤で***を処理することを含む様々な方法によりあるいは凍結もしくは凍
結乾燥により、達成することができる。***頭部の膜損傷により、本方法におい
て使用するのに適した***細胞となることが示される。ここでわれわれは、膜損
傷された***頭部を含む***頭部を使用して、本発明の原理を説明する。本発明
の一態様において、膜への損傷により、tg DNAが、核周囲マトリックス（***の
場合）、核マトリックス、クロマチン、そしてゲノムDNAなどを含むが、これら
には限定されない、亜核要素に対してアクセスしやすくなる。[0012] We show herein to create live transgenic offspring, generated by co-inserting sperm heads with tg NA. We show not only that tg is present in progeny, but also that it is expressed to alter progeny characteristics. In another preferred embodiment of the present invention, we show that sperm heads whose membrane has been disrupted promote gene transfer with high efficiency. Membrane disruption can be achieved by various methods, including treating the sperm with a detergent, or by freezing or lyophilization. Sperm head membrane damage is shown to result in sperm cells suitable for use in the present method. Here we illustrate the principles of the present invention using sperm heads, including membrane-damaged sperm heads. In one embodiment of the present invention, damage to the membrane causes the tg DNA to bind to subnuclear elements, including but not limited to perinuclear matrix (for sperm), nuclear matrix, chromatin, and genomic DNA, etc. Access.
【００１３】 一態様において、tg NAは、容易に検出可能である表現型マーカーをコードす
る、直線状DNA断片である。このようなDNAと核との共挿入の結果物であるトラン
スジェニック胚およびトランスジェニック子孫は、容易に検出可能な様式でそれ
らの特徴（表現型）を変化することができるゲノム変異を保有する。適した容易
に検出可能なマーカーの具体例として、ホタルルシフェラーゼ（Luc）、Escheri
chia coliのβ-ガラクトシダーゼ（LacZ）、およびAequoria victoriaの緑色蛍
光タンパク質（GFP）が含まれる。[0013] In one embodiment, the tgNA is a linear DNA fragment that encodes a phenotypic marker that is readily detectable. Transgenic embryos and progeny that are the result of such co-insertion of DNA and nucleus carry genomic mutations that can alter their characteristics (phenotype) in a readily detectable manner. Examples of suitable easily detectable markers include firefly luciferase (Luc), Escheri
chia coli β-galactosidase (LacZ) and Aequoria victoria green fluorescent protein (GFP).
【００１４】 好ましくは、tg NAを核と混合した後、マイクロピペットを使用して共インジ
ェクションする。別の好ましい態様において、共インジェクションは、減数***
第二中期（met II）に捕捉された卵母細胞中に行う。われわれはここで、Aequor
ia victoriaの緑色蛍光タンパク質（GFP）あるいはEscherichia coliのβ-ガラ
クトシダーゼ（LacZ）のいずれかをコードするDNAを使用して、本発明の方法に
より生成されたトランスジェニック胚において、tgが高い頻度で発現することを
示すことにより、本発明の原理を説明する。別の態様において、tg NAは、哺乳
動物、酵母あるいは細菌性人工染色体（それぞれMAC、YAC、およびBAC）などの
人工染色体に対応する（Schindelhauer, D.Bioessays 21, 76 (1999)；Peterson
, K.R. Methods in Enzymology 306, 186 (1999)；Kim, U.J., Birren, B.W., S
lepak, T., Mancino, V., Boysen, C., Kang, H.L., Simon, M.I. and Shizuya,
H. Genomics 34,213 (1996)）。本発明の更なる態様において、tg NAは、メッ
センジャーRNA（mRNA）などのリボース核酸（RNA）、あるいはRNA-DNAヘテロ二
重鎖（少なくともひとつのミスマッチを保有するキメラ）、もしくはペプチド核
酸に対応する。Preferably, the tgNA is mixed with the nucleus and then co-injected using a micropipette. In another preferred embodiment, the co-injection is performed in oocytes captured during metaphase II (met II). We are here, Aequor
tg is frequently expressed in transgenic embryos generated by the method of the invention using DNA encoding either ia victoria green fluorescent protein (GFP) or Escherichia coli β-galactosidase (LacZ) The principle of the present invention will be described below. In another embodiment, the tg NA corresponds to an artificial chromosome such as a mammalian, yeast or bacterial artificial chromosome (MAC, YAC, and BAC, respectively) (Schindelhauer, D. Bioessays 21, 76 (1999); Peterson
, KR Methods in Enzymology 306, 186 (1999); Kim, UJ, Birren, BW, S
lepak, T., Mancino, V., Boysen, C., Kang, HL, Simon, MI and Shizuya,
H. Genomics 34,213 (1996)). In a further embodiment of the invention, the tgNA corresponds to a ribose nucleic acid (RNA), such as a messenger RNA (mRNA), or an RNA-DNA heteroduplex (a chimera carrying at least one mismatch), or a peptide nucleic acid. .
【００１５】 このように本発明は、核をtg DNAとともに未受精卵に共インジェクションする
ことにより、トランスジェニック子孫を作製するための効率的な方法を提供する
。本発明はすべての生物に対して適用可能であり、そして未受精卵中に核を挿入
することにより作製することができるあるいは作製されうる分化した細胞および
幹細胞を回収することに適用可能である。この中には、両生類、魚類、鳥類（た
とえば家禽、七面鳥、ガチョウなど）および哺乳動物（たとえば霊長類、ヒツジ
、ウシ、ブタ、クマ、ヤギ、ネコ、イヌ、ウマそしてネズミなど）（これらには
限定されない）に由来する細胞の核が含まれる。本発明の一態様において、核は
***由来のものである。***核の血のつながりの濃い（germane）特性は保存さ
れている（Kimura, Y., Yanagimachi, R., Kuretake, S., Bortkiewicz, H., Pe
rry, A.C.F. and Yanagimachi, H. Biology of Reproduction 58, 1407 (1998)
）。[0015] Thus, the present invention provides an efficient method for producing transgenic progeny by co-injecting nuclei with tg DNA into unfertilized eggs. The present invention is applicable to all organisms, and is applicable to recovering differentiated cells and stem cells that can or can be produced by inserting a nucleus into an unfertilized egg. These include amphibians, fish, birds (eg, poultry, turkeys, geese, etc.) and mammals (eg, primates, sheep, cows, pigs, bears, goats, cats, dogs, horses, and rats) (including Nuclei of cells derived from (but not limited to). In one aspect of the invention, the nucleus is from sperm. The sperm nucleus germane properties of the nucleus are preserved (Kimura, Y., Yanagimachi, R., Kuretake, S., Bortkiewicz, H., Pe
rry, ACF and Yanagimachi, H. Biology of Reproduction 58, 1407 (1998)
).
【００１６】 マイクロインジェクションによるtg DNA／核物質の共導入は、人工的にあるい
はin vitroを介してのいずれかで促進される細胞融合を必要とする発明と比較し
て、時空的に特徴的である（Lavitrano, M., Camaioni, A., Fazio, V.M., Dolc
i, S., Farace, M.G. and Spadafora, C. Cell 57, 717 (1989)）。一態様にお
いて、マイクロインジェクション法は、第一に核（およびNA）の選択、そして続
いて卵母細胞の細胞膜を破裂することによる卵母細胞中へのその蓄積を必要とす
る。The co-introduction of tg DNA / nuclear material by microinjection is spatio-temporally distinctive compared to inventions requiring cell fusion promoted either artificially or in vitro. (Lavitrano, M., Camaioni, A., Fazio, VM, Dolc
i, S., Farace, MG and Spadafora, C. Cell 57, 717 (1989)). In one embodiment, the microinjection method requires firstly the selection of the nucleus (and NA) and its subsequent accumulation in the oocyte by rupture of the cell membrane of the oocyte.
【００１７】 本発明の方法によりtg DNAと核を共インジェクションすることには、核が生存
細胞から得られたものであることを必要としない。このことにより、本発明の方
法はさらに、生きた***をtg DNAと混合すること（in vivoもしくはin vitroで
）により例示され、そして受精を介してDNAを導入するように使用される請求項
から区別される。さらに、本発明の方法に従うtg DNAと膜を破壊された細胞から
得た核を共インジェクションすることは、この手順の成果に対して効率的であり
うる試薬の正確な徐放性の共導入を見込んでいる。このような試薬には、酵素、
抗体、または組換えおよび／または胚発生を修飾して、遺伝子転移を促進するよ
うな薬理学的シグナルトランスダクション阻害剤を含んでいてもよい。卵母細胞
中への試薬の導入は、tg NAと核との共導入の前、その間、もしくはその後に行
うことができる。[0017] Co-injecting nuclei with tg DNA according to the methods of the present invention does not require that the nuclei be obtained from living cells. By this, the method of the invention is further exemplified by mixing live sperm with tg DNA (in vivo or in vitro) and from the claims used to introduce DNA via fertilization. Be distinguished. Furthermore, co-injection of tg DNA and nuclei obtained from membrane-disrupted cells according to the method of the present invention provides for precise, sustained release co-introduction of reagents that may be efficient for the outcome of this procedure. I expect. Such reagents include enzymes,
Antibodies or pharmacological signal transduction inhibitors that modify recombination and / or embryonic development to promote gene transfer may be included. The introduction of the reagent into the oocyte can be performed before, during, or after the co-introduction of tgNA and the nucleus.
【００１８】 発明の詳細な説明 本発明は、組み込まれたトランスジーンを保有する細胞を生成するための特徴
的なセットの方法を記載する。本発明の方法には、以下の工程：（I）外来性、t
g NAの核構成要素（染色体を含む、核またはその部分）に対する曝露；（II）tg
NA-核混合物またはtg NAの、未受精卵へのマイクロインジェクション；（III）
得られた細胞の発生、を含む。発生は、胚あるいは代理母に胚移植することによ
る個体のための分化した細胞あるいは幹細胞を産生するためでありうる。われわ
れはここで、個々の工程をより詳細に提示し、そしてそれぞれの工程が本発明に
おいて互いに関してどのように明確に配置されているかを示す。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention describes a characteristic set of methods for generating cells that carry an integrated transgene. The method of the present invention comprises the following steps: (I) exogenous, t
g Exposure to nuclear components of NA (nucleus or part thereof, including chromosomes); (II) tg
Microinjection of NA-nuclear mixture or tg NA into unfertilized eggs; (III)
Development of the resulting cells. Development can be to produce differentiated cells or stem cells for the individual by embryo transfer to an embryo or surrogate mother. We now present the individual steps in more detail and show how each step is clearly arranged with respect to each other in the present invention.
【００１９】 I. 外来性、tg NAの核構成要素に対する曝露 本発明は、外来性のtg NAを核構成要素に対して曝露し、その後マイクロイン
ジェクションすることを見込んでいる。核は、体細胞またはその他の細胞に由来
していてもよい。外来性のtg NAは、エレクトロポレーション、リポフェクショ
ン、トランスフェクション、混合またはマイクロインジェクションにより例示さ
れるが、これらには限定されない方法により、導入することができ、その後核挿
入する。これらの方法は、当該技術分野において周知である。I. Exposure of exogenous, tg NA to the nuclear component The present invention contemplates exposing exogenous tg NA to the nuclear component, followed by microinjection. The nucleus may be derived from somatic cells or other cells. Exogenous tgNA can be introduced by methods such as, but not limited to, electroporation, lipofection, transfection, mixing or microinjection, followed by nuclear insertion. These methods are well-known in the art.
【００２０】 本発明の一態様において、トライトンX-100、（3-〔3-クロルアミドプロピル
）ジメチルアンモニオ〕1-プロパンスルホネート）（CHAPS）、ドデシル硫酸ナ
トリウム（SDS）、ラウリル硫酸ナトリウム（SLS）、混合アルキルトリメチルア
ンモニウムブロミド（ATAB）などの、しかしこれらには限定されない、界面活性
剤で処理することにより破壊したその膜を非トランスジェニック***とともに磨
砕することにより、pCX-EGFP DNAの断片（実施例1および2を参照）を、氷上また
は25℃で30-180秒間混合した。本発明の更なる態様において、***膜の破壊は、
凍結／融解または凍結-乾燥によった。これらの方法により、***に対して十分
な損傷を引き起こし、一定比率の集団の頭部を切断する。膜損傷の程度は、次の
順に増加する：新しく単離された***＜トライトンX-100＜凍結／融解＜凍結-乾
燥。In one embodiment of the present invention, Triton X-100, (3- [3-chloroamidopropyl) dimethylammonio] 1-propanesulfonate) (CHAPS), sodium dodecyl sulfate (SDS), sodium lauryl sulfate (SLS) ), Fragments of pCX-EGFP DNA by triturating the membrane with non-transgenic sperm, such as, but not limited to, mixed alkyltrimethylammonium bromide (ATAB), which has been disrupted by treatment with a detergent. (See Examples 1 and 2) were mixed on ice or at 25 ° C. for 30-180 seconds. In a further aspect of the invention, disruption of the sperm membrane comprises:
By freeze / thaw or freeze-dry. These methods cause sufficient damage to sperm and cut off a proportion of the population's head. The degree of membrane damage increases in the following order: freshly isolated sperm <Triton X-100 <freeze / thaw <freeze-dry.
【００２１】 本発明の方法が以前の方法を超える顕著な利点を可能にする一つの方法は、tg
NAの選択を施すことである。tg NAには、一本鎖もしくは二本鎖のRNAもしくはD
NA、キメラへテロ二重鎖（たとえばRNA-DNAハイブリッド、以下を参照）、およ
び染色体などの比較的大きな分子種、が含まれうる。本発明の一態様において、
NAは大きなDNA分子（たとえば50キロ塩基対（kb）から＞1メガ塩基対）に対応し
てもよい。大きなDNA分子の例としては、哺乳動物、酵母および細菌の人工染色
体（それぞれ、MAC、YAC、そしてBAC）などの人工染色体が含まれるが、これら
には限定されない。このような大分子は、（小分子と比較して）損傷を受けやす
く、特にマイクロ操作中にはそうである。したがって、本発明の一態様において
提供される、膜をチャレンジした***頭部とやさしく混合する工程は、インジェ
クション手順中に（i）それらを***頭部の比較的大量な保護的構造と結合させ
、そして（ii）それらを化学的もしくは物理的力（たとえば剪断力）などに供さ
れないようにすること、により、大きなDNA分子を安定化させやすいようであり
、それにより成功率を上昇させる。One way in which the method of the present invention allows significant advantages over previous methods is that tg
It is to make a choice of NA. tgNA includes single- or double-stranded RNA or D
Larger species, such as NAs, chimeric heteroduplexes (eg, RNA-DNA hybrids, see below), and chromosomes, can be included. In one embodiment of the present invention,
NAs may correspond to large DNA molecules (eg, 50 kilobase pairs (kb) to> 1 megabase pairs). Examples of large DNA molecules include, but are not limited to, artificial chromosomes such as mammalian, yeast, and bacterial artificial chromosomes (MAC, YAC, and BAC, respectively). Such large molecules are susceptible to damage (compared to small molecules), especially during micromanipulation. Thus, the step of gently mixing the membrane with the challenged sperm head, provided in one aspect of the invention, comprises: (i) binding them to the relatively large amount of protective structure of the sperm head during the injection procedure; And (ii) making them less susceptible to chemical or physical forces (eg, shearing forces), thereby likely to stabilize large DNA molecules, thereby increasing the success rate.
【００２２】 本発明の方法が以前の方法を超える顕著な利点を可能にする更なる様式は、本
発明の方法が、未受精（met II）卵母細胞の細胞質の新規な特性を保有すること
ができる手段を提供することである。特に、met II卵母細胞中へのマイクロイン
ジェクションによる核の脱濃縮は、ゲノムDNAが相対的に曝露され、そしてそれ
によりより反応性になる状況を提供する（Perry, A.C.F., Wakayama, T. and Ya
nagimachi, R. Biology of Reproduction 60, 747 (1999)に記載される）。さら
に、マウスmet II卵母細胞に損傷を受けた48℃に加熱した***をインジェクショ
ンすることにより結果として組換えが生じ、二中心（すなわち転位したもの）、
無中心そして環状の染色体および染色体断片を生成するため（Ward, W.S., Perr
y, A.C.F., and Balhorn, R. Biology of Reproduction、発行のために受理）、
met II卵母細胞は、組換え原性（recombinogenic）因子を含有する。本発明の方
法は、このように、たとえばキメラプラスト（chimaeroplast）におけるように
、相同組換えを介しておよび／またはDNA修復の原因であるリクルート因子によ
り遺伝子ターゲティングを提供する（以下を参照）。一態様において、本発明は
、部位特異的および非部位特異的組換え促進剤を核-NA混合物中に含ませること
により増強される、そのような組換えを可能にする。このような剤には、Escher
ichia coli RecAタンパク質、ヒトRecA対応物質、HsDmc-1、たとえばバクテリオ
ファージT4遺伝子32産物などの一本鎖DNA結合たんぱく質、部位特異的リコンビ
ナーゼ（たとえば、CreやFlpリコンビナーゼ）などが含まれるが、これらには限
定されない。更なる態様においては、使用されるNAは、ゲノムに対してもともと
少数（通常は1）のゲノム座位の広範囲の配列（extensive sequence）と適合す
る広範囲の配列を含有する遺伝子ターゲティングDNA構築物である。遺伝子ター
ゲティングベクターの設計分類は（たとえば胚性幹細胞中で“ノックアウト”遺
伝子について使用する場合）、十分に確立されており、そして当該技術分野にお
いて既知である。A further mode in which the method of the present invention allows significant advantages over previous methods is that the method of the present invention possesses novel cytoplasmic properties of unfertilized (met II) oocytes Is to provide a means that can be used. In particular, de-enrichment of nuclei by microinjection into met II oocytes provides a situation where genomic DNA is relatively exposed and thereby more reactive (Perry, ACF, Wakayama, T. and Ya
nagimachi, R. Biology of Reproduction 60, 747 (1999)). In addition, injection of sperm heated to 48 ° C. that has been damaged in mouse met II oocytes results in recombination, resulting in two centers (ie, transposed),
To generate acentric and circular chromosomes and chromosome fragments (Ward, WS, Perr
y, ACF, and Balhorn, R. Biology of Reproduction, accepted for publication),
met II oocytes contain recombinogenic factors. The method of the invention thus provides for gene targeting via homologous recombination and / or by a recruitment factor responsible for DNA repair, as in, for example, chimaeroplast (see below). In one embodiment, the present invention allows for such recombination to be enhanced by including site-specific and non-site-specific recombination enhancers in the nuclear-NA mixture. Such agents include Escher
Includes ichia coli RecA protein, human RecA counterpart, HsDmc-1, single-stranded DNA binding proteins such as bacteriophage T4 gene 32 product, site-specific recombinases (eg, Cre and Flp recombinases), and the like. Is not limited. In a further embodiment, the NA used is a gene targeting DNA construct that contains a wide range of sequences that match the extensive sequence of a few (usually one) genomic loci originally to the genome. The design classification of gene targeting vectors (eg, when used for “knockout” genes in embryonic stem cells) is well established and known in the art.
【００２３】 ここで記載する本発明の方法は、さらに、そのようなNAがキメラプラストに対
応することを可能にする。一態様において、これらの分子は、短い（＜100ヌク
レオチド）のRNA-DNAヘテロ二重鎖であり（たとえば、Yoon, K., Cole-Strauss,
A. and Kmiec, E.B. Proceedings of the National Academy of Sciences USA
93, 2071 (1996)）、それには中央部分付近に1〜3塩基のミスマッチがある以外
は、ほぼ完全のゲノム配列の相補鎖を含有する。このような分子は、細胞性のDN
A修復機構に指向して、ゲノム配列中にミスマッチを導入することができる。本
発明のこの態様において、DNA修復機構は卵母細胞中に存在し、それにより部位
特異的変異を、met II卵母細胞中への核-キメラプラストの共インジェクション
、もしくは核の不存在下でのキメラプラストのインジェクションの最中またはそ
の後に、導入することができる。The methods of the invention described herein further allow such NAs to correspond to chimeric plasts. In one embodiment, these molecules are short (<100 nucleotides) RNA-DNA heteroduplexes (eg, Yoon, K., Cole-Strauss,
A. and Kmiec, EB Proceedings of the National Academy of Sciences USA
93, 2071 (1996)), which contains a nearly complete complement of the genomic sequence, except for a 1-3 base mismatch near the center. Such a molecule is a cellular DN
A mismatch can be introduced into the genomic sequence, directed toward the A repair mechanism. In this embodiment of the invention, the DNA repair mechanism is present in the oocyte, thereby causing site-specific mutations in the co-injection of nucleus-chimeric plasts into met II oocytes, or in the absence of nuclei. During or after injection of the chimeric plast.
【００２４】 本発明には、混合の最中にさらに物質を添加することも含めることが可能であ
る。これらには、ヌクレアーゼ活性の修飾剤（たとえば、エチレンジアミンテト
ラ酢酸（EDTA）、アウリントリカルボン酸（aurintricalboxylic acid）、制限
エンドヌクレアーゼなど）、アポトーシスの修飾剤（たとえば、アウリントリカ
ルボン酸など）、タンパク質融解の修飾剤（ロイペプチン、E.64など）、および
DNA結合タンパク質（たとえばプロタミン、トポイソメラーゼなど）が含まれう
るが、これらには限定されない。本発明の一態様において、核の不存在下におい
て追加的剤をtg NAに混合する。この場合、ゲノムは、たとえば（脱核に続いて
）核移植により体細胞の核を受容した脱核met II卵母細胞の場合あるいは非脱核
met II卵母細胞の場合におけるように、tg NAをマイクロインジェクションした
卵母細胞中にすでに存在する核により提供される。当業者に既知の方法により、
（サイトカラシンB、サイトカラシンDなどの細胞質***ブロック剤の存在下で）
無性生殖原性剤（parthenogenetic agents）を使用して、これらの細胞を活性化
して、人工的に発生を行わせる。The present invention can include the addition of additional substances during mixing. These include modifiers of nuclease activity (eg, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), aurintricalboxylic acid, restriction endonucleases, etc.), modifiers of apoptosis (eg, aurintricarboxylic acid, etc.), modification of protein melting Agents (leupeptin, E.64, etc.), and
DNA binding proteins (eg, protamine, topoisomerase, etc.) can be included, but are not limited to. In one embodiment of the invention, the additional agent is mixed with the tgNA in the absence of a nucleus. In this case, the genome may be either in the case of enucleated met II oocytes that have received somatic cell nuclei by nuclear transfer (following enucleation) or non-enucleated
As in the case of met II oocytes, tg NA is provided by nuclei already present in microinjected oocytes. By methods known to those skilled in the art,
(In the presence of cytokinesis blocking agents such as cytochalasin B and cytochalasin D)
These cells are activated using parthenogenetic agents to cause development to occur artificially.
【００２５】 核-NA混合物を一定時間保持して、核-NA結合を可能にする。一態様において、
少なくとも30秒で結合が生じる。混合物は、その後、マイクロインジェクション
のために顕微鏡ステージに移動する。更なる態様において、マイクロインジェク
ションは、核をNAに曝露してから1時間以内に行われる。The core-NA mixture is held for a period of time to allow core-NA binding. In one aspect,
Bonding occurs in at least 30 seconds. The mixture is then moved to a microscope stage for microinjection. In a further embodiment, the microinjection is performed within one hour of exposing the nucleus to NA.
【００２６】 II. tg NA-核混合物またはtg NAの、未受精卵へのマイクロインジェクション tg NAに曝露された核を、マイクロインジェクションにより未受精卵に挿入す
る。核-NA混合物を、マイクロインジェクションユニットの顕微鏡ステージ上の
小滴に移し、それにより混合物をインジェクションのためにマイクロインジェク
ション針中に集める。一態様において、操作を補助するため、ポリビニルピロリ
ドンの溶液を核-NA混合物に添加する。インジェクションすべきtg NA−核サンプ
ルを、インジェクションピペット中に吸引して回収する。本発明の好ましい態様
において、マイクロインジェクション針は、圧駆動型である。好ましい圧電性駆
動ユニットは、Prime Tech Ltd.（つくば、茨城県、日本）およびEppendorf Sci
entific（New York, USA）より販売されており、供給者の指示書に従って使用す
る。ユニットは、圧電性パルスを送って、高度にコントロールされすばやい様式
で非常に短い距離（0.5μmのオーダー）で接触するようにマイクロインジェクシ
ョンピペットチップを進めることができる。それぞれのパルスの強度および間隔
（コントロールユニットにより変化しうるが、典型的には強度については1〜5、
スピードについては1〜16の値）を適用して、卵母細胞の透明帯（zona pellucid
a）を通ってチップを進める（この間、保持ピペットから軽く吸引して、卵母細
胞を固定する）。ピペットチップを卵母細胞の細胞膜に並置して、卵母細胞の細
胞膜に深く陥入するまで進める（卵母細胞の反対表面まで）。少数（典型的には
1回）の圧パルス（典型的には強度1〜4、速度1）を適用する際に、細胞膜を突き
刺し、tg NA-核またはtg NAを卵母細胞の細胞質に放出することができる。一態
様において、インジェクションを、その末端付近に水銀を含有する、端がそろっ
たホウ珪酸塩ガラス針（典型的な内径が4.5〜10μm）を介して行う；水銀は、圧
駆動性針チップのモーメントおよびコントロールを増大する。別のマイクロイン
ジェクション変法を使用して、tg NAおよび／または核を挿入することができ、
この方法にはYanagidaら（Yanagida, K., Yanagimachi, R., Perreault, S.D. a
nd Kleinfeld, R.G. Biology of Reproduction 44, 44 (1991)）の記載中に例示
されているような従来からのピペットが含まれる。II. Microinjection of tg NA-nuclear mixture or tg NA into unfertilized eggs Nuclei exposed to tg NA are inserted into unfertilized eggs by microinjection. The nucleus-NA mixture is transferred to droplets on the microscope stage of a microinjection unit, thereby collecting the mixture into a microinjection needle for injection. In one embodiment, a solution of polyvinylpyrrolidone is added to the core-NA mixture to aid in operation. The tg NA-nucleus sample to be injected is collected by aspiration into an injection pipette. In a preferred embodiment of the present invention, the microinjection needle is pressure driven. Preferred piezoelectric drive units are Prime Tech Ltd. (Tsukuba, Ibaraki, Japan) and Eppendorf Sci.
Commercially available from entific (New York, USA) and used according to the supplier's instructions. The unit can send piezoelectric pulses to advance the microinjection pipette tip to make contact in a highly controlled and fast manner at very short distances (on the order of 0.5 μm). Intensity and interval of each pulse (can vary with control unit, but typically 1-5 for intensity,
Apply a value of 1-16 for speed) and the zona pellucid
Advance the tip through a) (while gently aspirating from the holding pipette to fix the oocytes). The pipette tip is juxtaposed to the cell membrane of the oocyte and advanced until it deeply invades the cell membrane of the oocyte (to the opposite surface of the oocyte). A small number (typically
Upon application of one) pressure pulse (typically intensity 1-4, velocity 1), it can pierce the cell membrane and release tg NA-nuclei or tg NA into the cytoplasm of the oocyte. In one embodiment, the injection is performed through a well-rounded borosilicate glass needle (typically 4.5-10 μm inside diameter) containing mercury near its end; the mercury is the moment of the pressure-driven needle tip And increase control. Another variant of microinjection can be used to insert the tg NA and / or nucleus,
This method involves Yanagida et al. (Yanagida, K., Yanagimachi, R., Perreault, SD a
nd Kleinfeld, RG Biology of Reproduction 44, 44 (1991)) and include conventional pipettes.
【００２７】 核のインジェクションは、同一種由来の卵母細胞中あるいは別種由来の卵母細
胞中に行ってもよい。さらに、本発明の方法により、卵母細胞、脱核卵母細胞、
あるいはin vitroで成熟した***前卵母細胞を含む未成熟（たとえば胚胞ステー
ジ）卵母細胞中に、NAインジェクション、あるいはNA-核共インジェクションが
可能になる。卵母細胞のin vitro成熟（IVM）は、成熟卵母細胞の供給源が限定
されておりあるいは存在しない場合に好ましく、卵母細胞をマイクロインジェク
ションのためにより適した状態にする剤の存在下で存在してもよい。ウシ卵母細
胞IVMは、WO98/07841中に記載されており、そしてマウス卵母細胞についてはEpp
igとTelfer（Methods in Enzymology 225, 77, Academic Press (1993)）中に記
載されている。成熟卵母細胞は、連続的に性腺刺激ホルモンあるいはその他のホ
ルモンを適用することにより（たとえば、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンおよび妊
馬血清性腺刺激ホルモンを連続的に投与することにより）、過***を誘導するこ
とにより得ることができ、そしてそれに引き続き外科的に卵巣を採取する（たと
えばネコの場合発情期（estrous）の開始から80〜84時間後、ウシの場合には72
〜96時間後、マウスの場合には13〜15時間後）。The injection of the nucleus may be performed in an oocyte from the same species or in an oocyte from another species. Further, according to the method of the present invention, oocytes, enucleated oocytes,
Alternatively, NA injection or NA-nucleus co-injection becomes possible in immature (eg, blastocyst stage) oocytes, including preovulatory oocytes matured in vitro. In vitro maturation (IVM) of oocytes is preferred when the source of mature oocytes is limited or absent, in the presence of agents that render the oocytes more suitable for microinjection. May be present. Bovine oocyte IVM is described in WO98 / 07841 and Epp for mouse oocytes.
ig and Telfer (Methods in Enzymology 225, 77, Academic Press (1993)). Mature oocytes can be treated with continuous gonadotropin or other hormones (eg, by continuous administration of human chorionic gonadotropin and pregnant mare serum gonadotropin) to prevent superovulation. The ovaries can be obtained by induction and subsequent surgical removal of the ovaries (eg, 80-84 hours after the onset of estrous in cats, 72 in cows).
~ 96 hours, 13-15 hours for mice).
【００２８】 本発明の更なる態様において、NA-曝露した核は、二倍体体細胞から採取し、
そして染色体を除去した卵母細胞（脱核した卵母細胞）の細胞質中に挿入する；
卵母細胞の脱核の方法は、当業者に周知であり、そしてたとえばWakayamaら（Wa
kayama, T., Perry, A.C.F., Johnson, K., Zuccotti, M. and Yanagimachi, R.
Nature 394 369 (1998)）中で使用されている。核は、たとえばトリプシン（0.
025％）およびエチレンジアミンテトラ酢酸（EDTA；0.75 mM）の混合物で処理す
ることにより、分散させた細胞から回収する。たとえば、既知の方法に従って、
Sr2+、エタノールあるいは電気パルスなど（これらには限定されない）の刺激を
使用して、細胞を人工的に刺激して、再構成の後0〜6時間後に発生を開始させる
。本発明の方法を両生類、魚類、鳥類（たとえば、家禽、七面鳥、ガチョウなど
）、哺乳動物（たとえば、霊長類、ヒツジ、ウシ、ブタ、クマ、ヤギ、ネコ、イ
ヌ、ウマそしてネズミなど）から採取した核に適用し、in vivoあるいはin vitr
oで増殖させる。[0028] In a further embodiment of the invention, the NA-exposed nuclei are obtained from diploid cells,
And inserted into the cytoplasm of the chromosome-removed oocyte (enucleated oocyte);
Methods for enucleation of oocytes are well known to those skilled in the art and are described, for example, in Wakayama et al.
kayama, T., Perry, ACF, Johnson, K., Zuccotti, M. and Yanagimachi, R.
Nature 394 369 (1998)). The nucleus is, for example, trypsin (0.
025%) and treated with a mixture of ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA; 0.75 mM) from the dispersed cells. For example, according to known methods,
The cells are artificially stimulated using a stimulus such as, but not limited to, Sr 2+ , ethanol or an electrical pulse to initiate development 0-6 hours after reconstitution. The method of the present invention can be obtained from amphibians, fish, birds (eg, poultry, turkeys, geese, etc.), mammals (eg, primates, sheep, cows, pigs, bears, goats, cats, dogs, horses and rats, etc.). In vivo or in vitr
Propagate with o.
【００２９】 本発明の更なる態様において、核はたとえば膜をチャレンジした***頭部など
の***頭部の内部に含有されている。***頭部のインジェクションは、出産に至
るまでの完全な発生のために十分なインジェクションされた卵母細胞を、当業者
に既知の手順により発生途中の胚を代理母に移植することにより、効率よく活性
化する。***頭部は、熱または卵母細胞を活性化させる能力を除去するその他の
剤で処理することができ、その場合、卵母細胞を活性化刺激物質に供した後に、
マイクロインジェクションし、発生を誘導する。***は、両生類、魚類、鳥類、
（たとえば、家禽、七面鳥、ガチョウなど）、哺乳動物（たとえば、霊長類、ヒ
ツジ、ウシ、ブタ、クマ、ヤギ、ネコ、イヌ、ウマそしてネズミなど）に由来し
ていてもよい。In a further aspect of the invention, the nucleus is contained within a sperm head, such as a membrane-challenged sperm head. Injection of the sperm head is efficiently performed by implanting oocytes, which have been injected enough for complete development until childbirth, into a surrogate mother, by developing embryos according to procedures known to those skilled in the art. Activate. The sperm head can be treated with heat or other agents that remove the ability to activate the oocyte, in which case after subjecting the oocyte to an activation stimulant,
Microinject and induce development. Sperm, amphibians, fish, birds,
(Eg, poultry, turkeys, geese, etc.), and mammals (eg, primates, sheep, cows, pigs, bears, goats, cats, dogs, horses, and rats).
【００３０】 本発明の方法は、広い幅のインジェクションピペットチップ径を可能にする。
遺伝子転移についての以前の方法は、大きなDNA断片（たとえば、ウィルスベク
ターを使用するような場合）を導入することができないだけでなく、その導入に
はかなりの技術的困難性も伴っているようだった。たとえば前核マイクロインジ
ェクションは、人工染色体の高粘度の調製物には適していない；使用される先の
細いピペット（1〜2μmのチップ径）を介したインジェクションは困難であり、
そしてしばしばDNA分子を剪断し、結果として失敗する。さらに、ハンドリング
が難しく、そのような細いチップはほとんど使用しない場合でもより粘着性にな
りやすい。これとは対照的に、ここで記載される本発明の方法において使用され
るピペットは、典型的にはチップ径が＞5μmである。比較的大きなチップ径であ
ることから、（i）一部には針があまり粘着性にならないという理由で、粘性の
高いDNA溶液をより容易に取り扱うことができ、そして（ii）剪断力の程度を減
少させることができる；すなわち、大きなDNA分子が剪断により損傷を受けやす
い。The method of the present invention allows for a wide injection pipette tip diameter.
Previous methods for gene transfer not only failed to introduce large DNA fragments (such as when using viral vectors), but their introduction also appeared to involve considerable technical difficulties. Was. For example, pronuclear microinjection is not suitable for high-viscosity preparations of artificial chromosomes; injection via the tapered pipettes used (1-2 μm tip diameter) is difficult,
And often they shear DNA molecules, resulting in failure. In addition, handling is difficult and such thin tips tend to be more sticky even when they are rarely used. In contrast, pipettes used in the methods of the invention described herein typically have a tip diameter> 5 μm. Due to the relatively large tip diameter, (i) the viscous DNA solution can be more easily handled, in part because the needle is less sticky, and (ii) the degree of shear Can be reduced; that is, large DNA molecules are susceptible to damage by shearing.
【００３１】 本発明の方法の更なる利点は、卵母細胞中の正確な場所に材料を注入する必要
がないことである。このことは、前核マイクロインジェクションの場合と対照的
である。この利点は、卵母細胞の細胞質の脂質含量が豊富であり、そしてそのた
めに光学顕微鏡では不透明であるような種、たとえば、多くの商業種および系統
の卵母細胞など、には特に意味がある。このように、本発明の方法は、マイクロ
インジェクションの間、マイクロインジェクションピペットチップと卵母細胞細
胞質との空間的な関係を正確に認識する必要がない。A further advantage of the method of the present invention is that it is not necessary to inject material into precise locations in the oocyte. This is in contrast to the case of pronuclear microinjection. This advantage is particularly significant for species that are rich in the cytoplasmic lipid content of the oocyte and are therefore opaque under light microscopy, such as many commercial species and strains of oocytes . Thus, the method of the present invention does not need to accurately recognize the spatial relationship between the microinjection pipette tip and the oocyte cytoplasm during microinjection.
【００３２】 本発明の方法により、共インジェクションする核が存在しない場合、tg NAを
注入することが可能になる。一態様において、tg NAはまず***由来の塩基性タ
ンパク質（たとえばプロタミン、核周辺構成要素）など（これらには限定されな
い）のNAを安定化する構成要素とともに混合される。この場合、インジェクショ
ンは、核を保有する細胞中に行う。この様な細胞は、met II卵母細胞（この場合
、得られた胚は無性生殖が可能である）あるいは脱核met II卵母細胞（この場合
、体細胞あるいはその他の核を、胚をクローン性に誘導することを報告するWaka
yamaら（Wakayama, T., Perry, A.C.F., Johnson, Z., Zuccotti, M. and Yanag
imachi, R. Nature 394 369 (1998)）に記載されたように核移植を通じて移植し
た）により例示される。既知の方法に従って、Sr2+、エタノールあるいは電気パ
ルスなど（これらには限定されない）の刺激を使用して、卵母細胞を人工的に刺
激して、発生を開始する。The method of the present invention allows for the injection of tgNA in the absence of co-injected nuclei. In one embodiment, tg NA is first mixed with components that stabilize NA, such as, but not limited to, sperm-derived basic proteins (eg, protamine, perinuclear components). In this case, the injection is performed in cells that carry the nucleus. Such cells can be met II oocytes (where the resulting embryos are capable of asexual reproduction) or enucleated met II oocytes (where somatic cells or other nuclei can Waka reports inducing clonality
yama et al. (Wakayama, T., Perry, ACF, Johnson, Z., Zuccotti, M. and Yanag
imachi, R. Nature 394 369 (1998)). According to known methods, oocytes are artificially stimulated using stimuli such as, but not limited to, Sr 2+ , ethanol or electrical pulses to initiate development.
【００３３】 III. 得られた細胞の発生 マイクロインジェクションした細胞を、in vitroで適切な培養条件に取り出す
ことにより、あるいは適切な代理母により、発生をさせる。ある場合には、細胞
を培養して胚に発生させることが好ましく、そして本発明の更なる態様において
は、胚の発生を記載できるようにin vitroで培養された胚を調べて、そしてtg発
現を決定することが好ましい。このように、本発明の方法は、その発現が胚を殺
すことなくモニターできるようなtgを含有する場合、トランスジェニック胚の選
択的な移植を可能にする。これは、CMV-IEエンハンサー／トリβアクチンプロモ
ーター組み合わせの場合と同様に、その発現を初期胚において駆動するGFPの場
合にも当てはまる。発現は、単に長波長（480 nm）紫外線UV照射機のもとで簡単
に胚を視覚化することにより、モニターすることができる。長波長UV光への曝露
は最小限にし、その損傷が胚のその後の発生を害しうるような、胚に対するUV損
傷の可能性を低減する。III. Development of the obtained cells The microinjected cells are developed in vitro by removing them to appropriate culture conditions or by a suitable surrogate mother. In some cases, it is preferred that the cells be cultured to develop into embryos, and in a further embodiment of the invention, embryos cultured in vitro are examined to describe embryonic development and tg expression. Is preferably determined. Thus, the methods of the present invention allow for the selective transfer of transgenic embryos, provided that they contain a tg whose expression can be monitored without killing the embryo. This is true for GFP, which drives its expression in early embryos, as well as for the CMV-IE enhancer / avian β-actin promoter combination. Expression can be monitored simply by simply visualizing the embryos under a long wavelength (480 nm) UV UV irradiator. Exposure to long wavelength UV light is minimized, reducing the likelihood of UV damage to the embryo, such damage could impair the subsequent development of the embryo.
【００３４】 胚培養および胚移植の方法は、当業者に周知である。選択的あるいは非選択的
な（すなわち、必ずしもtg発現に基づいていない）代理母への胚移植の後、妊娠
を出産まで維持し、その結果生きたトランスジェニック子孫を誕生させる。子孫
におけるtgの組み込みの確認は、サザンブロッティングおよびポリメラーゼ連鎖
反応を含む当業者に周知である方法を使用することにより、ゲノムDNAの物理的
解析により行う。子孫におけるトランスジーンの発現は、特性追跡（すなわち、
表現型決定）または免疫学的に組織を解析するかあるいはノザンブロッティング
などのmRNA解析方法を行うことにより、識別することができる。トランスジェニ
ック仔におけるGFPの異所性発現は、新生児子孫の皮膚を長波長UVにより光らせ
て調べることにより、容易に識別することができる。[0034] Methods for embryo culture and embryo transfer are well known to those skilled in the art. Following embryo transfer to a surrogate mother, either selective or non-selective (ie, not necessarily based on tg expression), the pregnancy is maintained until birth, resulting in the production of live transgenic offspring. Confirmation of tg integration in the progeny is performed by physical analysis of genomic DNA by using methods well known to those skilled in the art, including Southern blotting and polymerase chain reaction. Expression of the transgene in progeny is monitored by trait tracking (ie,
(Phenotyping) or by analyzing the tissue immunologically or by performing an mRNA analysis method such as Northern blotting. Ectopic expression of GFP in transgenic offspring can be easily identified by examining the skin of neonatal offspring by illuminating with long-wave UV.
【００３５】[0035]
以下の実施例は、本発明の領域に限定することを求めず、本発明の方法を説明
することを意図している。The following examples are not intended to limit the scope of the invention, but are intended to illustrate the method of the invention.
【００３６】 試薬 全ての化合物は、他の記述がないかぎり、Sigma chemical Co（St Louis, MO
）より購入された。Reagents All compounds were, unless otherwise stated, Sigma chemical Co (St Louis, MO).
).
【００３７】 動物 卵母細胞ドナー（B6D2F1）、***ドナー（B6D2F1）、および仮親（foster mot
hers）(ICR)は、ハワイ大学の実験動物科のガイドラインの範囲内に維持され、
また、それらは、the Institute of Laboratory Resources National Reseach C
ouncilの研究動物保護および使用委員会により、準備された(DHEW 公布番号[NIH
] 80-23, 1985改訂)。動物取り扱いプロトコールはハワイ大学の動物保護および
使用委員会により、レビューされ、また、改善された。Animal Oocyte donor (B6D2F1), sperm donor (B6D2F1), and foster mot
hers) (ICR) is maintained within the University of Hawaii guidelines for laboratory animals,
Also, they are the Institute of Laboratory Resources National Reseach C
ouncil, prepared by the Research Animal Care and Use Committee (DHEW promulgation number [NIH
80-23, 1985). The animal handling protocol was reviewed and improved by the University of Hawaii Animal Care and Use Committee.
【００３８】 卵母細胞の調製 妊馬血清性腺刺激ホルモンを投与し（primed）（5 IU）、過***処理した、4-
10週齢の雌B6D2F1マウスに、5 IUヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（hCG）を腹腔内
投与し14.5-16時間後の卵管から、成熟卵母細胞を回収した。卵丘細胞塊は、室
温で5-10分間、0.1％(w/v)ウシ精巣ヒアルロニダーゼ（300 U/mg, ICN Biomedic
als, Costa Mesa, CA）を含むCZB-H（20 mM HEPES, pH 7.4で緩衝化したCZB；Ch
atot, C.L., Lewis, J. L., Torres I. and Ziomek, C. A. Biology of Reprodu
ction 42 432 [1990] を）中で、すみやかに処理し、分散させた。卵丘細胞を含
まない卵母細胞を、CZB-H中で4回洗浄し、その後、37℃、5％（空気中v/v）CO2
に平衡化したミネラルオイル（Squibb and Sons, Princeton, NJ）下の、CZB一
滴に移した。Preparation of Oocytes Pregnant mare serum gonadotropin was primed (5 IU) and superovulated.
10-week-old female B6D2F1 mice were intraperitoneally administered with 5 IU human chorionic gonadotropin (hCG), and mature oocytes were collected from oviducts 14.5-16 hours later. Cumulus cell mass was grown at room temperature for 5-10 minutes at 0.1% (w / v) bovine testicular hyaluronidase (300 U / mg, ICN Biomedic).
als, Costa Mesa, CA), CZB-H buffered with 20 mM HEPES, pH 7.4; Ch
atot, CL, Lewis, JL, Torres I. and Ziomek, CA Biology of Reprodu
ction 42 432 [1990], which was promptly processed and dispersed. Oocytes without cumulus cells were washed four times in CZB-H, then at 37 ° C, 5% (v / v in air) CO 2
Was transferred to a drop of CZB under mineral oil (Squibb and Sons, Princeton, NJ) equilibrated in.
【００３９】 マウス卵および胚の操作 マウスの卵への***頭部の、圧電性駆動マイクロインジェクションは、Kimura
Y.およびYanagimachi, R.（Biology of Reproduction 52, 709 (1995)）により
記述された。インジェクションは通常、hCG投与後18-19時間内に達成された。注
射針チップの直径は典型的な例では5μmであった。少量の水銀を試験溶液（通常
1個の***頭部を含む）に放出し（expulsion）、次に試験溶液をピペットに引き
入れた。これは、水銀の境界の前に、試験溶液がピペットを満たし、また、その
ため、それ以上希釈されないことを確実にした。マイクロインジェクションごと
に、約1 plの等量を、卵細胞質に移した。注入された卵母細胞は、操作培地（CZ
B-H）中で約2-10分間維持し、その後、37℃、5％（空気中v/v）CO2に平衡化した
ミネラルオイル下のCZBに移した。適当な場合、卵母細胞を、注入後すぐに、37
℃、5％（空気中v/v）CO2に平衡化したミネラルオイル下の、Ca2+を含まない、6
.7 mM SrCl2を含むCZB中で45-60分間インキュベートすることにより、人工的に
活性化した。この回の後、卵を短時間フレッシュなCZB中で洗浄し、フレッシュ
なCZBに移して、インキュベーションを続けた。in vitroにおける胚の培養は、C
ZB中で4日間まで行った。2細胞胚（約１日培養後）あるいは、桑実胚／胞胚（2.
5-3.5日培養後）を、マイクロインジェクションの晩に精管切除された同系の雄
と交尾させた、偽妊娠アルビノICR/CD1マウスの卵管に移植した。in vitro操作
の結果である出生は、従って、その黒眼および被毛色で特徴付けられた。Manipulation of Mouse Eggs and Embryos Piezoelectrically driven microinjection of sperm heads into mouse eggs was performed by Kimura.
Y. and Yanagimachi, R. (Biology of Reproduction 52, 709 (1995)). Injections were usually achieved within 18-19 hours after hCG administration. The diameter of the needle tip was typically 5 μm. Add a small amount of mercury to the test solution (usually
(Including one sperm head), and then the test solution was drawn into a pipette. This ensured that the test solution filled the pipette before the mercury boundary and was therefore not diluted further. For each microinjection, about 1 pl equivalent was transferred to egg cytoplasm. The injected oocytes were placed in conditioned medium (CZ
BH) for about 2-10 minutes, then transferred to CZB under mineral oil equilibrated to 37 ° C., 5% (v / v in air) CO 2 . If appropriate, oocytes can be removed immediately after injection.
5% (v / v in air) under mineral oil equilibrated to 5% CO 2 , Ca 2+ free, 6
By incubation in CZB 45-60 minutes containing .7 mM SrCl 2, were artificially activated. After this round, the eggs were briefly washed in fresh CZB, transferred to fresh CZB and incubation continued. Culture of embryos in vitro
I went up to 4 days in ZB. 2-cell embryo (after about 1 day culture) or morula / blastula (2.
5-3.5 days of culture) were implanted into the oviducts of pseudopregnant albino ICR / CD1 mice mated with syngeneic males vasectomized the night of microinjection. Births resulting from in vitro manipulations were therefore characterized by their black eye and coat color.
【００４０】 実施例１ ***核の調製、およびマイクロインジェクション マイクロインジェクションのための、B6D2F1マウス第II中期卵母細胞の単離お
よび培養は、本質的に前に記述した通りに行った。***は成熟B6D2F1雄マウスか
ら、400μl CZB培地中に回収した。***のトライトンX-100抽出による単離は、
核単離培地（NIM:125 mM KCl、2.6 mM NaCl、7.8 mM Na2HPO4、1.4 mM KH2PO4、
3.0 mM EDTA; pH 7.45）中、0-1℃において、二つの精巣上体尾をきれいに切断
し、結果として得られる***懸濁液をろ過して、最終量が900μlになるようにし
た。卵母細胞の、圧電性駆動マイクロインジェクション、および37℃、5％（空
気中v/v）CO2に平衡化したミネラルオイル下のCZB中における胚の培養は、他に
詳細を示した。マイクロインジェクションでは、圧電性ピペット駆動装置に取り
付けられたピペットで***頭部を吸引し、卵母細胞ごとに１回インジェクション
した。インジェクション後すぐに溶解した卵母細胞は廃棄した。適当な場合、精
子の中片部の領域に単一圧電パルスを適用することにより、尾部から頭部を外し
た。この方法そのものは、膜を破壊し、このように、ここで使用される‘フレッ
シュな’***と、以前の報告のin vitroの受精により遺伝子転移を促進する生き
ている***との違いを示している。我々は、インジェクションごとにピペット内
から約1 plが排出されたと推定する。Example 1 Preparation of Sperm Nuclei and Microinjection The isolation and culture of B6D2F1 mouse metaphase II oocytes for microinjection was performed essentially as described previously. Sperm was recovered from adult B6D2F1 male mice in 400 μl CZB medium. Isolation of sperm by Triton X-100 extraction
Nuclear isolation medium (NIM: 125 mM KCl, 2.6 mM NaCl, 7.8 mM Na 2 HPO 4 , 1.4 mM KH 2 PO 4 ,
The two epididymal tails were cut cleanly at 0-1 ° C in 3.0 mM EDTA; pH 7.45), and the resulting sperm suspension was filtered to a final volume of 900 μl. Piezoelectrically driven microinjection of oocytes and culture of embryos in CZB under mineral oil equilibrated to 37 ° C., 5% (v / v in air) CO 2 showed other details. In microinjection, the sperm head was aspirated with a pipette attached to a piezoelectric pipette drive and injected once for each oocyte. Lysed oocytes were discarded immediately after injection. Where appropriate, the head was dislodged from the tail by applying a single piezoelectric pulse to the area of the sperm midpiece. The method itself disrupts the membrane, thus demonstrating the difference between the 'fresh' sperm used here and the live sperm that promotes gene transfer by in vitro fertilization as reported earlier. I have. We estimate that about 1 pl was ejected from within the pipette per injection.
【００４１】 実施例２ 混合による、GFPあるいはβ-ガラクトシダーゼの***核への曝露：トランスジ
ェニック胚の作製 ここで使用した、プラスミドpCX-EGFPの大きな（3.5 kb）SalG I-BamH I断片
は、強力なCMV-IE/トリβ-アクチンエンハンサー-プロモーターの組み合わせ（N
iwa, H., Yamamura, K. and Miyazaki, J. Gene 108, 193 [1991]）から発現さ
れる、GFP遺伝子を含むが、真核細胞の複製開始点は欠如している（Zhang, G.,
Vanessa, G. and Kain, S. R. Biochemical and Biophysical Research Communi
cations 227, 707 [1996]; Takada, T., Iida, K., Awaji, T., Itoh, K., Taka
hashi, R., Shibui, A., Yoshida, K., Sugano, S. and Tsujimoto, G. Nature
Biotechnology 15, 458 [1997]）。***核は、さらなる調製はせずに（‘フレッ
シュな’）pCX-EGFP断片と混合したか、あるいは、３つの膜破壊プロトコール；
凍結融解（Wakayama, T., Whittingham, D. G. and Yanagimachi, R. Journal o
f Fertility and Reproduction 112, 11 [1998]）、凍結乾燥（Wakayama, T. an
d Yanagimachi, R. Nature Biotechnology 16, 639 [1998]）、またはトライト
ンX-100抽出の中の１つを行った後、混合した。トライトンX-100抽出では、100
μl 0.5%（NIM中v/v）トライトンX-100を900μl***NIM懸濁液（実施例１参照）
に加え、氷上で30秒間、すりつぶして混合した。2℃、20000 gで1分間遠心して
細胞を沈澱させ、2 ml氷冷NIMで完全に再び懸濁し、2℃、20000 gで２分間遠心
して再度沈澱させた。この最終沈澱を400μlのCZBあるいはNIMに懸濁した。マイ
クロインジェクションに先立って、1μlのDNA断片を9μlの***懸濁液（CZBある
いはNIM中に2-5×105の***を含む）とピペッティングにより混合し、DNA断片の
終濃度を7 ng/μlとした。DNA/***混合液を、室温（約25℃）あるいは氷上で、
1分間インキュベートした。その後、ポリビニルピロリドン（PVP;平均Mr 360,00
0）溶液と混合して、終濃度約10％（W/V）PVPとなるようにし、マイクロインジ
ェクション用の顕微鏡ステージにのせた。全てのインジェクションは、室温、CZ
B-H中で、***-DNA混合から1時間以内、あるいは、***-トライトンX-100混合か
ら1時間以内で行った。Example 2 Exposure of GFP or β-galactosidase to sperm nuclei by mixing: Generation of transgenic embryos The large (3.5 kb) SalG I-BamHI fragment of plasmid pCX-EGFP used here was highly potent. CMV-IE / Avian β-actin enhancer-promoter combination (N
iwa, H., Yamamura, K. and Miyazaki, J. Gene 108, 193 [1991]), containing the GFP gene, but lacking the eukaryotic origin of replication (Zhang, G. ,
Vanessa, G. and Kain, SR Biochemical and Biophysical Research Communi
cations 227, 707 [1996]; Takada, T., Iida, K., Awaji, T., Itoh, K., Taka
hashi, R., Shibui, A., Yoshida, K., Sugano, S. and Tsujimoto, G. Nature
Biotechnology 15, 458 [1997]). The sperm nuclei were mixed without further preparation ('fresh') with the pCX-EGFP fragment, or three membrane disruption protocols;
Freezing and thawing (Wakayama, T., Whittingham, DG and Yanagimachi, R. Journal o
f Fertility and Reproduction 112, 11 [1998]), freeze drying (Wakayama, T. an
d Yanagimachi, R. Nature Biotechnology 16, 639 [1998]), or Triton X-100 extraction, followed by mixing. 100% for Triton X-100 extraction
μl 0.5% (v / v in NIM) Triton X-100 in 900 μl sperm NIM suspension (see Example 1)
And ground on ice for 30 seconds to mix. The cells were pelleted by centrifugation at 20000 g for 1 minute at 2 ° C, completely resuspended in 2 ml ice-cold NIM, and re-precipitated by centrifugation at 20000 g for 2 minutes at 2 ° C. This final precipitate was suspended in 400 μl of CZB or NIM. Prior to microinjection, 1 μl of the DNA fragment was mixed with 9 μl of sperm suspension (containing 2-5 × 10 5 sperm in CZB or NIM) by pipetting to a final concentration of 7 ng / DNA fragment. μl. Place the DNA / sperm mixture at room temperature (about 25 ° C) or on ice.
Incubated for 1 minute. Thereafter, polyvinylpyrrolidone (PVP; average Mr 360,00
0) The mixture was mixed with the solution so as to have a final concentration of about 10% (W / V) PVP, and was placed on a microscope stage for microinjection. All injections are at room temperature, CZ
In BH, the reaction was performed within 1 hour after sperm-DNA mixing, or within 1 hour after sperm-Triton X-100 mixing.
【００４２】 マイクロインジェクション後3-3.5日の胚を、蛍光顕微鏡によりFITCフィルタ
ーとUV光源（480 nm）を使用して、GFPの発現を調べた。これは、蛍光でない（
すなわちGFPを発現していない）、弱い蛍光の、そして、強い蛍光の胚、および
モザイクの胚（蛍光の細胞と、蛍光でない細胞の両方を含む）の明確な判別が可
能であり、適宜それらを評価した。Embryos 3-3.5 days after microinjection were examined for GFP expression by fluorescence microscopy using a FITC filter and a UV light source (480 nm). This is not fluorescent (
That is, they do not express GFP), weakly and strongly fluorescent embryos, and mosaic embryos (including both fluorescent and non-fluorescent cells). evaluated.
【００４３】 本発明の方法を例証する類似の実験は、異なるtg NAを用いた。SalG I、ある
いは、Xho IおよびSalG Iのどちらかによる消化で直鎖状にした、pxCANLacZのla
cZを含む精製した断片を、それぞれ4.5、および9 ng/μlの濃度で***と混合し
、先に記載の通り、マイクロインジェクションした。pxCANLacZのXho I-SalG I
断片は真核細胞の複製開始点を欠如していたが、両方のlacZ断片は同様の結果を
示した。pxCANLacZがコードするβ-ガラクトシダーゼは、核移行シグナルを含む
。３日目の胚のpxCANLacZ β-ガラクトシダーゼの発現の評価を、1％(v/v)ホル
ムアルデヒド、0.2％(v/v)グルタルアルデヒド、5 mg/ml ウシ血清アルブミン（
BSA）を含有するリン酸緩衝溶液、pH 7.6（PBS）中、室温で5分間固定した後、
行った。固定した胚をBSA（5 mg/ml）を含有するPBS中で十分に洗浄し、そして5
mg/ml BSA、4 mM フェリシアン化カリウム、4 mMフェロシアン化カリウム、2 m
M MgCl2、および1 mg/ml 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラ
ノシド（X-gal）を含むPBS中、37℃で5分間インキュベートすることにより染色
した。光学顕微鏡により、胚を調べ、評価した。A similar experiment illustrating the method of the present invention used a different tgNA. PxCANLacZ la, linearized by digestion with either SalG I or Xho I and SalG I
Purified fragments containing cZ were mixed with sperm at concentrations of 4.5 and 9 ng / μl, respectively, and microinjected as described above. pxCANLacZ's Xho I-SalG I
Although the fragments lacked the eukaryotic origin of replication, both lacZ fragments showed similar results. The β-galactosidase encoded by pxCANLacZ contains a nuclear localization signal. Evaluation of the expression of pxCANLacZ β-galactosidase in embryos on day 3 was determined using 1% (v / v) formaldehyde, 0.2% (v / v) glutaraldehyde, 5 mg / ml bovine serum albumin (
After fixation for 5 minutes at room temperature in a phosphate buffer solution containing BSA), pH 7.6 (PBS),
went. The fixed embryos are thoroughly washed in PBS containing BSA (5 mg / ml), and
mg / ml BSA, 4 mM potassium ferricyanide, 4 mM potassium ferrocyanide, 2 m
Stained by incubating at 37 ° C. for 5 minutes in PBS containing M MgCl 2 and 1 mg / ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) . The embryos were examined and evaluated by light microscopy.
【００４４】 以下の表１に示した結果は、本発明の方法が高効率でトランスジェニック胚を
生み出したことを例証する。この方法により、pCX-EGFP DNA断片濃度が、50 pg/
μlではないが、500 pg/μlの場合、検出可能なtgを発現した胚を得た。このこ
とは、この方法が、インジェクション当たり約15-150分子と同程度少量に相当す
る平均DNA濃度において、感度が高いことを示唆する。The results, shown in Table 1 below, demonstrate that the method of the present invention produced transgenic embryos with high efficiency. By this method, the pCX-EGFP DNA fragment concentration was increased to 50 pg /
At 500 pg / μl, but not μl, embryos that expressed detectable tg were obtained. This suggests that the method is sensitive at average DNA concentrations corresponding to as little as about 15-150 molecules per injection.
【００４５】[0045]
【表１】 *同じ列中の、aおよびbの上付き文字がある値を比較する場合、それらは有意に
異なる（P<0.05）。同列中のcのついた値は、有意な差はない。+ 外因性DNA断片は、pCX-EGFP-BamH I-SalG I、あるいは、pxCANLacZ- SalG I、S
alG I-Xho I、または、Xho Iであった。断片は***頭部と5-10 ng/lのDNA濃度で
混合された。最後の3行を除いて（実施例Xを参照）、外因性DNAは、実施例２に
記載の通り、***と混合した後、注入した。 †***の処理は、実施例1に記載の通りである。洗浄サンプル、あるいは非洗浄
サンプルの調製は、実施例４に記載される。陰性対照として、全ての実験は、NI
MまたはCZBのみと混合した適切な***調製液のフレッシュなアリコートの同日の
インジェクションを含み、培養の後、‘偽陽性’の発現は検出されなかった。連
続したインジェクションは、対ごとに30-90分、間隔をあけ、実施例Xに記載の通
り、凍結融解法（同日の陽性対照である、先にDNAと混合した凍結融解***の共
インジェクションでは、胚の75％の蛍光の卵割球が得られた）により、頭部を調
製した。tg DNAのみのインジェクションは、実施例Xにより、単為生殖の活性化
に従った。 §tg発現；-、陰性；+、陽性；+/-、+および-の両方の細胞を含むm-b（モザイク
）。[Table 1] * When comparing values with a and b superscripts in the same column, they are significantly different (P <0.05). Values with c in the same row are not significantly different. + Exogenous DNA fragment is pCX-EGFP-BamHI-SalGI or pxCANLacZ-SalGI, S
alG I-Xho I or Xho I. The fragments were mixed with sperm heads at a DNA concentration of 5-10 ng / l. Except for the last three lines (see Example X), exogenous DNA was injected after mixing with sperm as described in Example 2.処理 Sperm processing is as described in Example 1. Preparation of washed or unwashed samples is described in Example 4. As a negative control, all experiments were performed with NI
Included the same day injection of a fresh aliquot of the appropriate sperm preparation mixed with M or CZB alone, and after culture no 'false positive' expression was detected. Successive injections were spaced 30-90 minutes apart for each pair and, as described in Example X, the freeze-thaw method (co-injection of the same day positive control, frozen-thawed sperm previously mixed with DNA, A blastomere with a fluorescence of 75% of the embryos was obtained). Injection of tg DNA alone followed the activation of parthenogenesis according to Example X. § tg expression;-, negative; +, positive; mb (mosaic) containing both +/-, + and-cells.
【００４６】 実施例３ １回の操作におけるGFPおよびβ-ガラクトシダーゼの二重tg胚の作製（１回注
入二重遺伝子転移） １回注入二重遺伝子転移を使用して、以下の修飾により、実施例１に記載の１
回マイクロインジェクションの後、二つのtgを共発現する胚を作製した。***頭
部を、2.5 ng/μl pCX-EGFP SalG I-BamH I断片、および2.5 ng/μl pCX-LacZ S
alG I-Pst I断片を含むDNA溶液とともに共インジェクションした。pCX-LacZ は
、EGFP遺伝子を、β-ガラクトシダーゼをコードする遺伝子に置き換えたpCX-EGF
Pの誘導体である。in vitroの培養の後、実施例１、および２にそれぞれ記載の
通り、まず、胚のGFP発現を評価し、次にβ-ガラクトシダーゼの発現を評価した
。写真撮影のため、胚を顕微鏡スライドとカバースリップの間にマウントし、La
cZの発現を示すための固定、および染色より前に、発育とGFPの発現を示す像を
とった。Example 3 Generation of double tg embryos of GFP and β-galactosidase in one operation (single injection double gene transfer) Using single injection double gene transfer, the following modifications were performed. 1 described in Example 1
After one round of microinjection, embryos co-expressing the two tgs were generated. Sperm heads were ligated with 2.5 ng / μl pCX-EGFP SalG I-BamHI fragment and 2.5 ng / μl pCX-LacZ S
Co-injection was performed with a DNA solution containing the alG I-Pst I fragment. pCX-LacZ is a pCX-EGF in which the EGFP gene has been replaced with a gene encoding β-galactosidase.
It is a derivative of P. After in vitro culture, the GFP expression in embryos was first evaluated and then the expression of β-galactosidase was evaluated as described in Examples 1 and 2, respectively. For photography, mount embryos between microscope slides and coverslips and
Images showing development and GFP expression were taken prior to fixation and staining to show cZ expression.
【００４７】 実施例４ tg NA核混合液の洗浄によるGFP tg胚の作製 各洗浄実験において、***懸濁液は、pCX-EGFP DNAと混合し、1分間インキュ
ベーションした後、すぐに２つの5μlのアリコートに分けた。一方のアリコート
（洗浄した***）は、50μlの氷冷した、フレッシュなCZBあるいはNIMとよく混
合することにより希釈し、洗浄した。次に両方のアリコートを2℃、20000 gで2
分間沈澱させた。洗浄した***のアリコートの上清を注意深く除き、5μlのフレ
ッシュなCZBあるいはNIMに換えた。二番目のアリコートの上清は、それ自身の沈
澱を懸濁するのに使用した（この試料はそのため非洗浄であった）。表１に示さ
れた結果は、マイクロインジェクションの前に、in vitroにおいて核とNAが会合
する能力を強く示唆している。Example 4 Preparation of GFP tg embryos by washing the tgNA nucleus mixture In each washing experiment, the sperm suspension was mixed with pCX-EGFP DNA and incubated for 1 minute, immediately followed by two 5 μl aliquots. Divided into aliquots. One aliquot (washed sperm) was diluted by washing well with 50 μl of ice-cold, fresh CZB or NIM and washed. Then aliquot both at 2 ° C, 20000 g
Settled for minutes. The supernatant of the washed sperm aliquot was carefully removed and replaced with 5 μl of fresh CZB or NIM. The supernatant of the second aliquot was used to suspend its own precipitate (this sample was therefore unwashed). The results shown in Table 1 strongly suggest the ability of the nucleus to associate with NA in vitro prior to microinjection.
【００４８】 実施例５ GFP tg 新生仔（pups）の作製および確認、およびそのトランスジェニックの
性質の確認 tg DNA構築物のゲノムへの組み込みが生存している子孫において証明されるか
どうかを決定するため、３つの膜破壊方法のうちの一つを行なった***頭部を、
pCX-EGFP DNAとともに共インジェクションし、結果として得られた胚をin vitro
において約3.5日まで（桑実胚-胞胚期まで）培養し、次に胚を非選択的に（すな
わち蛍光に基づかずに）代理母に移植した。tg組み込みの表現形解析は、長波長
UV下で新生仔を調査して行った。高い割合（17-21％）の子孫が、皮膚で認めら
れるGFPの発現に関してはトランスジェニックであり（下記表２）、この効率は
、***調製に用いられる、膜破壊の方法には依存しなかった。接合体の出産間で
の発生の割合は、膜破壊した***頭部の３つの群のそれぞれと比較できた（12-1
4％）。Example 5 Generation and Confirmation of GFP tg Neonates (pups) and Confirmation of Their Transgenic Properties To determine whether integration of the tg DNA construct into the genome is demonstrated in living offspring Sperm head that performed one of the three membrane destruction methods
Co-injected with pCX-EGFP DNA and the resulting embryos
At about 3.5 days (to morula-blastula stage), and then embryos were transferred non-selectively (ie, not based on fluorescence) to surrogates. Expression analysis of tg built-in
Newborns were examined under UV and performed. A high percentage (17-21%) of progeny are transgenic for expression of GFP found in the skin (Table 2 below), and this efficiency is independent of the method of membrane disruption used for sperm preparation. Was. The incidence of zygotes between births could be compared with each of the three groups of sperm heads with membrane disruption (12-1).
Four%).
【００４９】[0049]
【表２】 *各行は、膜を破壊した***頭部とプラスミドpCX-EGFPの断片とを共インジェク
ションした卵母細胞から作製した、胚および新生仔の発生を記録している。a 値に有意な差はない。 ¶m-b、桑実胚-胞胚。括弧内の値は移植した胚のレシピエントとして使われた代
理母の数を示す。 §Tg発現；+、皮膚に異所性にGFPを発現している陽性の新生仔。[Table 2] * Each row records the development of embryos and neonates made from oocytes co-injected with sperm heads with disrupted membranes and fragments of plasmid pCX-EGFP. There is no significant difference in a values. ¶Mb, morula-blastula. The values in parentheses indicate the number of surrogate mothers used as recipients of the transferred embryos. §Tg expression; + , positive neonates expressing ectopic GFP in the skin.
【００５０】 さらなる実験において、実施例２の方法により、pCX-LacZにさらされた、膜を
破壊された***頭部のマイクロインジェクションにより、一つのβ-ガラクトシ
ダーゼを発現している新生仔が誕生した。β-ガラクトシダーゼ（LacZ）の発現
は、実施例２の方法により、続く尾先端のバイオプシーの固定およびX-Gal染色
により証明された。これは、本発明の方法が一つのtgタイプに限定されないこと
を証明し、また、この方法の多様なtgヘの適応性を示している。In a further experiment, a newborn expressing one β-galactosidase was born by microinjection of the membrane disrupted sperm head exposed to pCX-LacZ by the method of Example 2. . Expression of β-galactosidase (LacZ) was demonstrated by the method of Example 2, followed by fixation of the tail tip biopsy and X-Gal staining. This proves that the method of the present invention is not limited to one tg type, and also shows the adaptability of the method to various tg.
【００５１】 3から6週齢の、無作為に選択した緑の新生仔およびその緑ではない同腹子から
の、尾先端のバイオプシーは、全ゲノムDNAの抽出に使用した。尾の写真撮影は4
80/40 nmフィルターを装着した蛍光立体顕微鏡下で行った。サザン分析において
、試料あたり10μgのゲノムDNAをEcoR Iで消化し、pCX-EGFPの733 bp EcoR I DN
A断片をプローブとした。反応あたり1μgのゲノムDNAを用いる、PCRによるGFP遺
伝子の検出のために使用したオリゴヌクレオチドプライマーは、正方向（フォワ
ード）（TTGAATTCGC CACCATGGTG AGC）、および逆方向（リバース）（TTGAATTCT
T ACTTGTACAG CTCGTCC）であった。反応パラメーターは、95℃、9分（1サイクル
）：94℃45秒、60℃30秒、72℃45秒（40サイクル）であった。電気泳動により分
離した反応産物は、臭化エチジウム染色により可視化した。Tail tip biopsies from 3-6 week old, randomly selected green neonates and their non-green littermates were used for extraction of total genomic DNA. 4 tail photography
This was performed under a fluorescent stereo microscope equipped with an 80/40 nm filter. For Southern analysis, 10 μg of genomic DNA per sample was digested with EcoR I and the 733 bp EcoR I DN of pCX-EGFP was digested.
The fragment A was used as a probe. The oligonucleotide primers used for detection of the GFP gene by PCR, using 1 μg of genomic DNA per reaction, were forward (TTGAATTCGC CACCATGGTG AGC) and reverse (TTGAATTCT)
T ACTTGTACAG CTCGTCC). Reaction parameters were 95 ° C, 9 minutes (1 cycle): 94 ° C for 45 seconds, 60 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 45 seconds (40 cycles). Reaction products separated by electrophoresis were visualized by ethidium bromide staining.
【００５２】 サザンブロッティングあるいはPCRによる尾先端ゲノムDNAの物理的分析により
、最初、表現形では陰性と評価されたがバイオプシーを行った尾先端でGFPの発
現が示された一匹を含む、緑の蛍光を示す全ての始祖動物系統（すなわち、第一
世代トランスジェニック動物）が、tgを持っていることが示された。３匹の場合
においては、おそらく、tgの組み込み座が局所的なcis活性化エレメントであっ
たために発現しなかったことにより、検出可能な緑蛍光は欠いている始祖動物に
おいて、PCRによりtgが証明された。サザン分析により、始祖動物におけるtgコ
ピー数は≦1-＞50の範囲であることが示され、この結果は前核マイクロインジェ
クション後のtg組み込みパターンと類似している。ゲノムのpCX-EGFP DNAの物理
的特徴付け、およびGFP発現の効率の両方は、tg DNAが組み込みにおいて著しい
再配列を受けなかったことを示す。[0052] Physical analysis of tail genomic DNA by Southern blotting or PCR indicated that green phenotypes, including one that initially evaluated phenotypically negative but showed GFP expression at the tail tip that underwent biopsy, All founder animal lines showing fluorescence (ie, first generation transgenic animals) were shown to have a tg. In three cases, PCR demonstrated tg in founder animals lacking detectable green fluorescence, probably due to lack of expression due to the integration site of tg being a local cis-activating element. Was done. Southern analysis showed that tg copy numbers in the founder ranged from ≤1 to> 50, a result similar to the tg integration pattern after pronuclear microinjection. Both physical characterization of genomic pCX-EGFP DNA, and the efficiency of GFP expression, indicate that tg DNA did not undergo significant rearrangement upon integration.
【００５３】 無作為に選択したGFPを発現している12の始祖動物（8匹の雌マウス、4匹の雄
マウス；表２、および類似した系列由来）を、非トランスジェニック動物と交配
し、１匹の場合（雌マウス）を除く全てにおいて同腹子を得た。受精した11匹の
始祖動物のうち、8匹が皮膚に27-50％（平均=40％）の頻度で異所性にGFPを発現
する新生仔を産んだ。tg遺伝形質のパターンは、ほとんどの場合において、単一
座GFP遺伝子のメンデルの生殖細胞系の伝達と矛盾しなかった。Twelve randomly selected GFP-expressing founder animals (8 female mice, 4 male mice; from Table 2, and similar lines) were bred to non-transgenic animals, Litters were obtained in all but one case (female mouse). Of the eleven founder animals that fertilized, eight gave birth to ectopically expressing GFP neonates with a frequency of 27-50% (mean = 40%) on the skin. The pattern of the tg genotype was in most cases consistent with Mendelian germline transmission of the single locus GFP gene.
【００５４】 実施例６ 遺伝子転移のモニターへのCre-lox系の使用 トランスジェニック個体の生涯を通じた持続的なtg発現の必然性なしに、tg組
み込みを目的として、本発明の方法により作製した胚を評価することが望ましい
。これは、内部リボソーム進入部位（internal ribosome entry site、IRES）を
含むtgベクターの使用により、達成され得る。実施例１に記載の通り、マイクロ
インジェクションにより胚を作製する。DNA構築物は、実施例２の強力なCMV-IE/
トリβ-アクチンエンハンサー-プロモーターの組み合わせから発現する、loxサ
イトで両側を挟まれた、GFP遺伝子を含む。このエンハンサー-プロモーターは全
ての所定のtgのプログラム化された発現を駆動するのに十分な、第二のエレメン
トと隣接している。GFPオープンリーディングフレームは、所定のtgオープンリ
ーディングフレームと隣接し、IRESにより隔てられる。tg DNA構築物を膜を破壊
した***と混合し、例えば、発生の原腸形成段階で機能するグースコイド（goos
ecoid）遺伝子プロモーターの制御下で、Creリコンビナーゼを発現する系統の第
II中期卵母細胞に、共インジェクションする。それにより、その段階でCMV-IE/
トリβ-アクチンエンハンサー-プロモーターエレメントが削り取られる。胚をin
vitroにおいて約3.5日まで（桑実胚-胞胚期まで）培養し、代理母に選択的に（
すなわち蛍光に基づいて）移植することにより、それらの完全な生育が可能にな
る。Example 6 Use of the Cre-lox System to Monitor Gene Transfer [0054] Embryos generated by the methods of the present invention for tg integration without the necessity of sustained tg expression throughout the life of transgenic individuals It is desirable to evaluate. This can be achieved by using a tg vector containing an internal ribosome entry site (IRES). As described in Example 1, an embryo is prepared by microinjection. The DNA construct is a potent CMV-IE /
Contains the GFP gene, flanked by lox sites, expressed from the avian β-actin enhancer-promoter combination. This enhancer-promoter is flanked by a second element, sufficient to drive the programmed expression of all given tgs. The GFP open reading frame is adjacent to a given tg open reading frame and is separated by an IRES. The tg DNA construct is mixed with membrane-disrupted spermatozoa and, for example, gooscoids (goos
ecoid) under the control of the gene promoter, a strain expressing Cre recombinase.
Co-inject into II metaphase oocytes. As a result, CMV-IE /
The avian β-actin enhancer-promoter element is removed. Embryo in
Culture in vitro for up to about 3.5 days (up to the morula-blastula stage) and selectively serve as surrogates (
Transplanting (ie, based on fluorescence) allows their complete growth.
【００５５】 実施例７ ***核を用いないtg DNAのマイクロインジェクションは、***核成分が、tg D
NAを組み換えに適する（recombinogenic）形態に維持することを示唆する。Example 7 Microinjection of tg DNA without using sperm nuclei showed that the sperm nucleus component was tg D
Suggests that the NA be maintained in a recombinogenic form.
【００５６】 NA組み込みが卵母細胞の中で（すなわち、マイクロインジェクションの後に）
起こりうるかどうかを調べるために、我々は***頭部とpCX-EGFP DNAを、インジ
ェクション前に混合せずに、連続的にインジェクションした（表１）。我々は、
たとえ陽性対照の胚（表１の通り、凍結-融解***頭部-pCX-EGFP共インジェクシ
ョン）の75％が蛍光を示しても、外因性tg（GFP）DNAの発現を認めることが一貫
してできなかった。[0056] NA incorporation in oocytes (ie, after microinjection)
To see if this could happen, we injected sperm heads and pCX-EGFP DNA sequentially without mixing before injection (Table 1). we,
Even if 75% of the positive control embryos (frozen-thawed sperm head-pCX-EGFP co-injection as shown in Table 1) showed fluorescence, the expression of exogenous tg (GFP) DNA was consistently observed. could not.
【００５７】 プラスミドpCX-EGFPのSalG I-BamH I断片のフレッシュな希釈液（NIM中7 ng/
μl）を等量のPVP 20％(w/v)と混合し、卵細胞当たり、約1 plインジェクション
した。室温で5-10分間の回復時間の後、卵母細胞をCa2+を含まない、10 mM SrCl 2 、および細胞質***阻害剤サイトカラシンBを5μg/ml含むCZBに移し、37℃、6
時間インキュベーションした（Bos-Mikich, A., Whittingham, D. G. and Jones
, K. T. Developmental Biology 182, 172 [1997]）。その後、CZBに移し、標準
胚培養条件下でインキュベーションを続けた。実施例２に記載の通り、3.5日後
に胚のGFP発現を評価した。***頭部との共インジェクションと対照的に、同量
のGFP tg DNAのみのインジェクションは、完全な（good）単為生殖の発育を排除
しなかった(インジェクションを生き残った卵母細胞の98％は桑実胚-胞胚期まで
生育した)。さらに、結果として得られた胚は、観測可能なtg発現を示さなかっ
た（表１）。つまり、***頭部が不在のとき、tg発現、あるいは、転写的に活性
状態のtg DNAの染色体上での存続が、ほとんどあり得なかった。A fresh dilution of the SalGI-BamHI fragment of plasmid pCX-EGFP (7 ng / NIM
μl) with an equal volume of PVP 20% (w / v) and inject about 1 pl per egg cell
did. After a recovery time of 5-10 minutes at room temperature, the oocytes are2+Without 10 mM SrCl Two , And the cytokinesis inhibitor cytochalasin B to CZB containing 5 μg / ml, 37 ° C., 6
(Bos-Mikich, A., Whittingham, D.G. and Jones
, K. T. Developmental Biology 182, 172 [1997]). After that, transfer to CZB
Incubation was continued under embryo culture conditions. After 3.5 days as described in Example 2
Embryos were evaluated for GFP expression. Same amount, as opposed to co-injection with sperm head
Injection of GFP tg DNA alone eliminates good parthenogenetic development
Did not (98% of the oocytes surviving the injection were morula-blastocyst stage)
Grew). Furthermore, the resulting embryos do not show observable tg expression
(Table 1). In other words, when the sperm head is absent, tg expression or transcriptionally active
Chromosomal persistence of the state's tg DNA was almost impossible.
【００５８】 我々は、***頭部-pCX-EGFP共インジェクション後には、GFP陽性および陰性の
両方の卵割球（+/-桑実胚-胚胞）を含む、モザイクの胚を認めたが、pCX-EGFP D
NAのみのインジェクションの後にはなかった（実施例２；表１参照）。このよう
な+/-モザイクの頻度は、tg DNA組み込みが、インジェクション後の初めのS期の
後まで時々遅延したことを示す。tg DNAを***頭部とともに共インジェクション
しなければ、この遅延した組み込みは、見たところでは起こらなかった。このこ
との一つの説明は、***が誘導した物質が、早期の胚の中で外因性のDNAを安定
化し、その結果、組み込みの遅延が促進されたということであり、このような物
質が存在しなければ（例えば単為生殖において）、外因性DNAは組み込まれる前
に分解するだろう。We observed mosaic embryos after sperm head-pCX-EGFP co-injection, containing both GFP-positive and -negative blastomeres (+/- morula-germinal germ). pCX-EGFP D
It was not after the injection of NA alone (Example 2; see Table 1). The frequency of such +/- mosaics indicates that tg DNA integration was sometimes delayed until after the first S phase after injection. Unless tg DNA was co-injected with the sperm head, this delayed integration apparently did not occur. One explanation for this is that sperm-derived substances stabilize exogenous DNA in early embryos, resulting in an accelerated delay in integration. If not (eg, in parthenogenesis), the exogenous DNA will degrade before integration.
本発明は、添付する図面に関して以下に詳細に記載する。 The present invention is described in detail below with reference to the accompanying drawings.
【図１】 図1は、実施例1により、無傷（“新鮮”）な（A）またはその膜
をトライトンX-100で破壊した（B）、その膜を凍結融解により破壊した（C）、
あるいはその膜を凍結乾燥により破壊した（D）、マウス***の頭部を通す代表
的な矢状断面を示す。略語は、以下の通りである：ac、先体キャップ；eq、赤道
セグメント；pa、後先体領域；である。細胞膜および先体膜（赤道領域の膜を除
く）は存在しないかまたは破壊されている。破壊は、先体キャップの膜で最もは
っきりしている。FIG. 1 shows that intact (“fresh”) (A) or its membrane was disrupted with Triton X-100 (B), its membrane was disrupted by freeze-thawing (C) according to Example 1,
Alternatively, a representative sagittal section through the head of a mouse sperm is shown, in which the membrane was broken by lyophilization (D). Abbreviations are as follows: ac, acrosome cap; eq, equatorial segment; pa, posterior acrosome region. Cell membranes and acrosome membranes (except those in the equatorial region) are absent or disrupted. The destruction is most pronounced in the acrosome cap membrane.
【図２】 図2は、単回ショット二重遺伝子転移により作製されたトランス
ジェニック胚を示す。卵母細胞を、実施例3により、pCX-LacZおよびpCX-EGFP tg
DNAの混合物とあらかじめインキュベートした***でマイクロインジェクション
した。パネルは、（A）未染色、（B）長波長（480 nm）UV光下でのGFP発現、そ
して（C）β-ガラクトシダーゼについてX-Galで染色したもの、についてのHoffm
an変調位相差顕微鏡により視覚化した3.5日目の同一の胚（×400）を示す。FIG. 2 shows transgenic embryos generated by single shot double gene transfer. Oocytes were isolated from pCX-LacZ and pCX-EGFP tg according to Example 3.
Microinjected with sperm pre-incubated with the mixture of DNA. Panels show Hoffm for (A) unstained, (B) GFP expression under long wavelength (480 nm) UV light, and (C) stained with X-Gal for β-galactosidase.
The same embryo at day 3.5 (x400) visualized by an modulation phase contrast microscope is shown.
【図３】 図3は、トランスジェニック創始動物および非トランスジェニッ
ク対照からの尾切除片バイオプシーの解析を示す。（A）非トランスジェニック(
a；マウス＃16）およびトランスジェニック緑色蛍光（b；マウス＃3）系統由来
の尾切除片の蛍光ステレオ顕微鏡（×40）。緑色蛍光皮膚を、非緑色体毛に対し
て視覚化することができた。（B）pCX-EGFP断片をプローブとして使用する、対
照B6D2F1（0）、＃3（5-9）、＃19（＞50）、＃28（5-9）および＃41（2）由来
の全DNAのサザンブロット解析（カッコ内は、ゲノムあたりの推定tgコピー数を
示す）。（C）＃16、＃17、＃30、＃36、＃47、＃49、対照B6D2F1、＃3、＃19、
＃28、＃41由来の全DNAのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）解析。実施例5を参照。FIG. 3 shows an analysis of tail resection biopsies from transgenic founders and non-transgenic controls. (A) Non-transgenic (
a; Fluorescence stereomicroscopy (x40) of tail excisions from a; mouse # 16) and transgenic green fluorescent (b; mouse # 3) lines. Green fluorescent skin could be visualized against non-green hair. (B) from controls B6D2F 1 (0), # 3 (5-9), # 19 (> 50), # 28 (5-9) and # 41 (2) using the pCX-EGFP fragment as a probe Southern blot analysis of total DNA (in brackets indicate estimated tg copy number per genome). (C) # 16, # 17 , # 30, # 36, # 47, # 49, control B6D2F 1, # 3, # 19 ,
Polymerase chain reaction (PCR) analysis of total DNA from # 28, # 41. See Example 5.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (72)発明者 若山 輝彦 アメリカ合衆国ハワイ州96822，ホノルル， ドール・ストリート 2640，アパートメン ト ビー−５ Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA80 CA04 CA11 DA02 EA04 FA02 FA06 FA10 GA01 GA12 GA18 4B065 AA91X AA91Y AB01 BA04 CA60 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification FI FI Theme Court II (Reference) C12R 1:91) C12R 1:91) (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, SD, SL, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AE, AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV , MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZA, ZW (72) Inventor Teruhiko Wakayama 96822, Hawaii, United States, Honolulu, Doll Street 2640, Apartment Be-5 F-term (reference) 4B024 AA20 BA80 CA04 CA11 DA02 EA04 FA02 FA06 FA10 GA01 GA12 GA18 4B065 AA91X AA91Y AB01 BA04 CA60
Claims (90)
程： （a） 細胞の核を核酸（NA）に曝露すること、 （b） 曝露した核を回収すること、 （c） 曝露された核の染色体を含み、そしてNAの少なくとも一部分をさらに
含む、曝露された核の少なくとも部分を、卵母細胞（oocyte）中に挿入すること
、 （d） 卵母細胞を発生させること、 を含む、前記方法。1. A method for producing a transgenic cell, comprising the steps of: (a) exposing the nucleus of a cell to nucleic acid (NA); (b) recovering the exposed nucleus; (c) Inserting at least a portion of the exposed nucleus into an oocyte, comprising the chromosome of the exposed nucleus and further comprising at least a portion of the NA; (d) generating an oocyte; The above method, comprising:
程： （a） 核を核酸（NA）に曝露すること、 （b） 工程（a）の核を回収すること、 （c） 曝露された核の染色体を含み、そしてNAの少なくとも一部分をさらに
含む、曝露された核の少なくとも部分を、脱核した卵母細胞（oocyte）中に挿入
すること、 （d） 卵母細胞を発生させること、 を含む、前記方法。2. A method for producing a transgenic cell, comprising the steps of: (a) exposing nuclei to nucleic acid (NA); (b) recovering nuclei in step (a); Inserting the at least part of the exposed nucleus into the enucleated oocyte, which comprises the chromosome of the exposed nucleus and further comprises at least a part of the NA; Generating.
。3. The method according to claim 1, wherein the nucleus is obtained from cells of the whole organism.
項の方法。6. The method according to claim 1, wherein the nucleus is collected from a mammalian cell.
Term method.
、請求項１〜６のいずれか１項の方法。7. The method according to claim 1, wherein the nuclei are recovered using a microinjection pipette.
より、核をNAに曝露する、請求項１〜７のいずれか１項の方法。8. The method of any one of claims 1 to 7, wherein the nucleus is exposed to the NA by mixing the NA with all or a portion of the cell containing the nucleus.
求項１〜８のいずれか１項の方法。9. The method according to claim 1, wherein the nucleus is exposed to the NA by introducing the NA into whole cells.
方法。10. The method according to claim 1, wherein the nucleus is collected from a somatic cell.
９のいずれか１項の方法。11. The nucleus of a germ cell (gamete) progenitor cell.
The method according to any one of claims 9 to 13.
方法。12. The method according to claim 1, wherein the nucleus is a germ cell nucleus.
工程： （a） ***を核酸（NA）に曝露すること、 （b） 曝露した***を回収すること、 （c） ***の染色体を含み、そしてNAの少なくとも一部分をさらに含む、精
子の少なくとも部分を、卵母細胞（oocyte）中に挿入すること、 （d） 卵母細胞を発生させること、 を含む、前記方法。15. A method for producing a transgenic cell, comprising the steps of: (a) exposing sperm to nucleic acid (NA); (b) recovering the exposed sperm; Inserting said at least a portion of sperm into an oocyte, comprising the chromosome, and further comprising at least a portion of the NA, (d) generating an oocyte.
法。16. The method of claim 14, wherein the sperm membrane has been disrupted.
たは１７の方法。19. The method of claim 16 or claim 17, wherein the method of disrupting involves exposure to a surfactant.
１９の方法。22. The method of claim 19, wherein the surfactant is triton X-100.
により、***をNAに曝露する、請求項１４〜２２のいずれか１項の方法。23. The method of any one of claims 14 to 22, wherein the sperm is exposed to NA by introducing the NA into all or a portion of the nucleus containing sperm.
により、***をNAに曝露する、請求項１４〜２３のいずれか１項の方法。24. The method of any one of claims 14 to 23, wherein the sperm is exposed to NA by mixing the NA with all or a portion of the nucleus containing sperm.
か１項の方法。25. The method according to any one of claims 14 to 24, wherein the sperm is a mammalian sperm.
、ヤギ、ネコ、イヌ、ウマそしてネズミからなるセットのメンバーである、請求
項６または２５の方法。26. The method of claim 6 or 25, wherein the mammal is a member of the set consisting of all primates, sheep, cows, pigs, bears, goats, cats, dogs, horses and rats.
ョン、エレクトロポレーション、またはトランスフェクションなどの方法により
達成する、請求項９または２３の方法。27. The method of claim 9 or 23, wherein the step of introducing is accomplished by a method such as lipofectin, microinjection, electroporation, or transfection.
３の方法。28. The method according to claim 9, wherein the step of introducing is achieved by mixing.
Method 3.
。29. The method of claim 28, wherein the mixing is performed using a pipette tip.
いずれか１項の方法。31. The method according to any one of claims 1 to 30, wherein the NA is deoxyribonucleic acid (DNA).
方法。34. The method according to any one of claims 31 to 33, wherein the DNA is linear.
いずれか１項の方法。35. The method according to any one of claims 31 to 34, wherein the DNA contains a reporter gene.
する、請求項３５の方法。36. The method of claim 35, wherein said reporter gene encodes green fluorescent protein (GFP).
より駆動されるレポーター遺伝子をコードする、請求項３５または３６の方法。37. The method of claim 35 or 36, wherein the DNA encodes a reporter gene whose expression is driven by a promoter element that functions in the early embryo.
含有するベクター上に位置する、請求項３５〜３７のいずれか１項の方法。38. The method according to any one of claims 35 to 37, wherein the reporter gene is located on a vector containing an internal ribosome entry site (IRES).
有する、請求項３８の方法。39. The method of claim 38, wherein the IRES vector contains a second cloned coding sequence.
素を含む、請求項３５〜３９のいずれか１項の方法。40. The method of any one of claims 35 to 39, wherein the reporter gene comprises a promoter element adjacent to the lox site.
ターに近接する、請求項４０の方法。41. The method of claim 40, wherein the promoter element adjacent to lox is adjacent to a tissue-specific promoter.
ous recombination）が可能なターゲティング構築物である、請求項３２〜４１
のいずれか１項の方法。42. The method wherein the DNA is homologously recombined with the native complementary genomic sequence (homologous recombination).
42-41 is a targeting construct capable of ous recombination).
The method according to any one of the preceding claims.
はそれ以上の変異を含有する、請求項４２の方法。43. The method of claim 42, wherein the targeting construct contains one or more mutations to the native genomic sequence.
方法。44. The method according to any one of claims 32-43, wherein the DNA is a chromosome.
５の方法。46. The artificial chromosome of claim 4, wherein the artificial chromosome is a bacterial artificial chromosome (BAC).
Method 5.
の方法。47. The artificial chromosome of the present invention is the yeast artificial chromosome (YAC).
the method of.
４５の方法。48. The method of claim 45, wherein the artificial chromosome is a mammalian artificial chromosome (MAC).
ずれか１項の方法。49. The method of any one of claims 32-48, wherein the DNA contains a single-stranded component.
れか１項の方法。50. The method of any one of claims 32-49, wherein the DNA is covalently modified.
求項５０の方法。51. The method of claim 50, wherein the DNA is covalently modified to contain a peptide moiety.
か１項の方法。52. The method according to any one of claims 1 to 31, wherein the nucleic acid is a ribonucleic acid (RNA).
法。55. The method of any one of claims 52 to 54, wherein the RNA is circular.
方法。56. The method of any one of claims 52 to 54, wherein the RNA is linear.
れか１項の方法。57. The method of any one of claims 52 to 56, wherein the RNA is covalently modified.
求項５７の方法。58. The method of claim 57, wherein the RNA is covalently modified to contain a peptide moiety.
。59. The method of any one of claims 1-31, wherein the NA is chimeric.
。60. The method of claim 59, wherein the chimera comprises a DNA-RNA heteroduplex.
チ塩基を含有するキメラプラスト（chimaeraplast）である、請求項６０の方法
。61. The method of claim 60, wherein the chimeric DNA-RNA heteroduplex is a chimaeraplast containing at least one mismatched base.
む、請求項１〜６１のいずれか１項の方法。62. The method of any one of claims 1 to 61, wherein the NA comprises a plurality of previously non-covalently linked molecular tumors.
のいずれか１項の方法。63. The exposure to NA for at least 30 minutes.
The method according to any one of the preceding claims.
れか１項の方法。64. The method according to any one of claims 1 to 63, wherein the exposure to NA is performed at 0 to 100 ° C.
１項の方法。65. The method of any one of claims 1 to 64, wherein the exposing to NA is on ice.
項１〜６５のいずれか１項の方法。66. The method according to any one of claims 1 to 65, wherein the exposure to NA is performed in the presence of an NA binding protein.
。67. The method of claim 66, wherein the NA binding protein promotes recombination.
ゼ（recombinase）、一本鎖DNA結合タンパク質、RNA結合タンパク質、逆転写酵
素、トポイソメラーゼ、エンドヌクレアーゼ、相同性組換えを促進するリコンビ
ナーゼ、からなるリストから採取される、請求項６７の方法。68. A protein that promotes recombination is a site-specific recombinase, a single-stranded DNA binding protein, an RNA binding protein, a reverse transcriptase, a topoisomerase, an endonuclease, a recombinase that promotes homologous recombination, 68. The method of claim 67, wherein the method is taken from a list consisting of:
６８のいずれか１項の方法。69. The method of claim 1, wherein the step of inserting is performed in the cytoplasm of the oocyte.
68. The method of any one of 68.
請求項１〜６９のいずれか１項の方法。70. The insertion step is performed by microinjection.
70. The method of any one of claims 1-69.
ically actuated）マイクロインジェクションである、請求項７０の方法。71. The microinjection is performed by a piezoelectric drive (piezo-electr).
71. The method of claim 70, wherein the method is ically actuated microinjection.
、請求項１〜７１のいずれか１項の方法。72. The method of any one of claims 1 to 71, wherein the oocytes are captured at the second metaphase of somatic cell division (met II).
。73. The method of claim 72, wherein the second metaphase oocyte is recovered after ovulation.
の方法。75. The method of any one of claims 1 to 74, wherein the oocyte is immature.
。76. The method of claim 75, wherein said immature oocytes are cultured in vitro.
を作製する、請求項７５または７６の方法。77. The method of claim 75 or 76, wherein the immature oocyte is cultured in vitro to produce a second metaphase oocyte.
させる工程をさらに含む、請求項１〜７７のいずれか１項の方法。78. The method of any one of claims 1 to 77, further comprising the step of activating the oocyte before, during, or after the inserting step.
剤に曝露することにより、卵母細胞を活性化させる、請求項７６の方法。79. The method of claim 76, wherein the oocyte is activated by applying one or more electrical pulses or by exposing to an activating agent.
代理レシピエントに対して胚を移植するというサブ工程をさらに含み、そこで胚
を生存能力のある胎児に発生させる、請求項８３の方法。84. The step of developing an embryo to produce a child further comprises the sub-step of transferring the embryo to a female surrogate recipient, wherein the embryo is developed into a viable fetus. 84. The method of claim 83.
多数のトランスジェニック細胞。85. Made by the method of any one of claims 1 to 84,
Many transgenic cells.
トランスジェニック動物。86. Produced by the method of any one of claims 1 to 85,
Transgenic animals.
ネコ、イヌ、ウマそしてネズミなどからなるセットから選択される、請求項８７
の方法。88. The mammal comprises a primate, sheep, cow, pig, bear, goat,
87. A member selected from the set consisting of cats, dogs, horses, rats and the like.
the method of.
の結果、部位特異的ゲノム変異を含有する、トランスジェニック動物。90. A transgenic animal produced by the method of any one of claims 1 to 84, thereby containing a site-specific genomic mutation.
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